HU214364B - Eljárás rekombináns adenovírus vakcinák előállítására - Google Patents
Eljárás rekombináns adenovírus vakcinák előállítására Download PDFInfo
- Publication number
- HU214364B HU214364B HU9302285A HU9302285A HU214364B HU 214364 B HU214364 B HU 214364B HU 9302285 A HU9302285 A HU 9302285A HU 9302285 A HU9302285 A HU 9302285A HU 214364 B HU214364 B HU 214364B
- Authority
- HU
- Hungary
- Prior art keywords
- env
- gag
- recombinant
- hiv
- adenovirus
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 18
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title description 15
- 229940021704 adenovirus vaccine Drugs 0.000 title description 3
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 claims abstract description 61
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 claims abstract description 28
- 230000024932 T cell mediated immunity Effects 0.000 claims abstract description 8
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims abstract description 8
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 claims abstract description 4
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 claims abstract description 4
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 35
- 241000713772 Human immunodeficiency virus 1 Species 0.000 claims description 23
- 241000725303 Human immunodeficiency virus Species 0.000 claims description 21
- 108010078428 env Gene Products Proteins 0.000 claims description 7
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 7
- 101710177291 Gag polyprotein Proteins 0.000 claims description 6
- 241000701096 Human adenovirus 7 Species 0.000 claims description 3
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 claims description 3
- 108700004026 gag Genes Proteins 0.000 claims description 3
- 101150098622 gag gene Proteins 0.000 claims description 3
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 claims description 3
- 101710125418 Major capsid protein Proteins 0.000 claims description 2
- 101710172711 Structural protein Proteins 0.000 claims description 2
- 108700004025 env Genes Proteins 0.000 claims description 2
- 101150030339 env gene Proteins 0.000 claims description 2
- 101150059999 pro gene Proteins 0.000 claims description 2
- 210000002845 virion Anatomy 0.000 claims description 2
- 241001135569 Human adenovirus 5 Species 0.000 claims 1
- 241001135572 Human adenovirus E4 Species 0.000 claims 1
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 claims 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 abstract description 8
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 abstract 1
- 238000004061 bleaching Methods 0.000 abstract 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 abstract 1
- 239000000829 suppository Substances 0.000 abstract 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 51
- 241000282579 Pan Species 0.000 description 34
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 28
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 27
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 24
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 21
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 21
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 19
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 19
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 19
- 241000282577 Pan troglodytes Species 0.000 description 18
- 230000036436 anti-hiv Effects 0.000 description 18
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 17
- 208000031886 HIV Infections Diseases 0.000 description 16
- 230000004044 response Effects 0.000 description 12
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 12
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 10
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 10
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 10
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 9
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 9
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 description 8
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 7
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 7
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 7
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 7
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 7
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 7
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 6
- 210000003608 fece Anatomy 0.000 description 6
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 6
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 6
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 5
- 229940037003 alum Drugs 0.000 description 5
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 5
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 5
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 5
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 5
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 5
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 5
- 239000002356 single layer Substances 0.000 description 5
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 4
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 4
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 4
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 4
- 230000002550 fecal effect Effects 0.000 description 4
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 4
- 239000000047 product Substances 0.000 description 4
- 210000003296 saliva Anatomy 0.000 description 4
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 4
- 208000030507 AIDS Diseases 0.000 description 3
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 3
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 3
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 3
- 102100034349 Integrase Human genes 0.000 description 3
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 3
- NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N Sulfur Chemical compound [S] NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000700618 Vaccinia virus Species 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 230000005875 antibody response Effects 0.000 description 3
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 3
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 3
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 description 3
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 3
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 3
- 239000011593 sulfur Substances 0.000 description 3
- 229910052717 sulfur Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 3
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 3
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010001258 Adenoviral infections Diseases 0.000 description 2
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 2
- 229920000623 Cellulose acetate phthalate Polymers 0.000 description 2
- 241001200329 Chanda Species 0.000 description 2
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 2
- 101710121417 Envelope glycoprotein Proteins 0.000 description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 2
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 2
- 108010048209 Human Immunodeficiency Virus Proteins Proteins 0.000 description 2
- 241000598171 Human adenovirus sp. Species 0.000 description 2
- 108091092195 Intron Proteins 0.000 description 2
- 241000422980 Marietta Species 0.000 description 2
- 108020005187 Oligonucleotide Probes Proteins 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 2
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 2
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 2
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 2
- 230000003263 anti-adenoviral effect Effects 0.000 description 2
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 2
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 2
- 229940081734 cellulose acetate phthalate Drugs 0.000 description 2
- 230000002920 convulsive effect Effects 0.000 description 2
- 238000013480 data collection Methods 0.000 description 2
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 2
- 239000007903 gelatin capsule Substances 0.000 description 2
- 230000028996 humoral immune response Effects 0.000 description 2
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 2
- 210000000936 intestine Anatomy 0.000 description 2
- 239000010410 layer Substances 0.000 description 2
- 230000021633 leukocyte mediated immunity Effects 0.000 description 2
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 2
- 230000001589 lymphoproliferative effect Effects 0.000 description 2
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- PGSADBUBUOPOJS-UHFFFAOYSA-N neutral red Chemical compound Cl.C1=C(C)C(N)=CC2=NC3=CC(N(C)C)=CC=C3N=C21 PGSADBUBUOPOJS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 2
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 2
- 239000002751 oligonucleotide probe Substances 0.000 description 2
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 2
- 230000002787 reinforcement Effects 0.000 description 2
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 2
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 2
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 1
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 1
- 206010002091 Anaesthesia Diseases 0.000 description 1
- 201000001178 Bacterial Pneumonia Diseases 0.000 description 1
- 208000035143 Bacterial infection Diseases 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 210000004366 CD4-positive T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- 201000009030 Carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 231100000023 Cell-mediated cytotoxicity Toxicity 0.000 description 1
- 206010057250 Cell-mediated cytotoxicity Diseases 0.000 description 1
- 108700010070 Codon Usage Proteins 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- 239000003298 DNA probe Substances 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- 101710091045 Envelope protein Proteins 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 208000037357 HIV infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 229940033330 HIV vaccine Drugs 0.000 description 1
- 108010065155 Human Immunodeficiency Virus env Gene Products Proteins 0.000 description 1
- 108010086541 Human Immunodeficiency Virus gag Gene Products Proteins 0.000 description 1
- SNDPXSYFESPGGJ-UHFFFAOYSA-N L-norVal-OH Natural products CCCC(N)C(O)=O SNDPXSYFESPGGJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010058467 Lung neoplasm malignant Diseases 0.000 description 1
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 1
- NTIZESTWPVYFNL-UHFFFAOYSA-N Methyl isobutyl ketone Chemical compound CC(C)CC(C)=O NTIZESTWPVYFNL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000011887 Necropsy Methods 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 108010019160 Pancreatin Proteins 0.000 description 1
- 102000057297 Pepsin A Human genes 0.000 description 1
- 108090000284 Pepsin A Proteins 0.000 description 1
- 101710188315 Protein X Proteins 0.000 description 1
- 206010037660 Pyrexia Diseases 0.000 description 1
- 108700005075 Regulator Genes Proteins 0.000 description 1
- 206010038687 Respiratory distress Diseases 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 241000193998 Streptococcus pneumoniae Species 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- 108010008038 Synthetic Vaccines Proteins 0.000 description 1
- 108020005202 Viral DNA Proteins 0.000 description 1
- 238000013019 agitation Methods 0.000 description 1
- 238000007605 air drying Methods 0.000 description 1
- 230000037005 anaesthesia Effects 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 230000002238 attenuated effect Effects 0.000 description 1
- 208000022362 bacterial infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 238000004166 bioassay Methods 0.000 description 1
- 230000008512 biological response Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 230000035584 blastogenesis Effects 0.000 description 1
- 238000004820 blood count Methods 0.000 description 1
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 1
- 230000005890 cell-mediated cytotoxicity Effects 0.000 description 1
- 208000019065 cervical carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 210000003756 cervix mucus Anatomy 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 230000000120 cytopathologic effect Effects 0.000 description 1
- 210000001151 cytotoxic T lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 1
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 238000007598 dipping method Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 1
- 238000001943 fluorescence-activated cell sorting Methods 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 235000011389 fruit/vegetable juice Nutrition 0.000 description 1
- 210000004051 gastric juice Anatomy 0.000 description 1
- 238000003304 gavage Methods 0.000 description 1
- JFCQEDHGNNZCLN-UHFFFAOYSA-N glutaric acid Chemical compound OC(=O)CCCC(O)=O JFCQEDHGNNZCLN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 1
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 1
- 208000033519 human immunodeficiency virus infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 238000010255 intramuscular injection Methods 0.000 description 1
- 239000007927 intramuscular injection Substances 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 1
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 1
- 201000005296 lung carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 229910000402 monopotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019796 monopotassium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 229940126578 oral vaccine Drugs 0.000 description 1
- 229940055695 pancreatin Drugs 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 229940111202 pepsin Drugs 0.000 description 1
- 210000003819 peripheral blood mononuclear cell Anatomy 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 150000003013 phosphoric acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 1
- 230000002516 postimmunization Effects 0.000 description 1
- GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M potassium dihydrogen phosphate Chemical compound [K+].OP(O)([O-])=O GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 230000009696 proliferative response Effects 0.000 description 1
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 229940124551 recombinant vaccine Drugs 0.000 description 1
- 210000002345 respiratory system Anatomy 0.000 description 1
- 208000023504 respiratory system disease Diseases 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 238000013207 serial dilution Methods 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 1
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 1
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 238000005728 strengthening Methods 0.000 description 1
- 229940031000 streptococcus pneumoniae Drugs 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 1
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 208000011580 syndromic disease Diseases 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 1
- 238000002604 ultrasonography Methods 0.000 description 1
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 1
- 238000011121 vaginal smear Methods 0.000 description 1
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
- C12N15/86—Viral vectors
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
- A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
- A61P31/18—Antivirals for RNA viruses for HIV
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/10011—Adenoviridae
- C12N2710/10311—Mastadenovirus, e.g. human or simian adenoviruses
- C12N2710/10341—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
- C12N2710/10343—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
- C12N2740/00011—Details
- C12N2740/10011—Retroviridae
- C12N2740/16011—Human Immunodeficiency Virus, HIV
- C12N2740/16111—Human Immunodeficiency Virus, HIV concerning HIV env
- C12N2740/16134—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
- C12N2740/00011—Details
- C12N2740/10011—Retroviridae
- C12N2740/16011—Human Immunodeficiency Virus, HIV
- C12N2740/16211—Human Immunodeficiency Virus, HIV concerning HIV gagpol
- C12N2740/16234—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Virology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Oncology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- AIDS & HIV (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
Abstract
A találmány tárgya eljárás élő rekőmbináns adenővírűst – amelyben aviriőn szerkezeti prőtein a rekőmbináns adenővírűs előállításáraalkalmazőtt natív adenővírűséval azőnős, és amelybe az 1-es típűsúhűmán imműnhiány vírűs antigént kódőló gén van beépítve – tartalmazóvakcina előállítására, antitestek vagy sejt-mediálta imműnitáskialakítására 1-es típűsú hűmán imműnhiány vírűssal zemben melegvérűemlősökben, őly módőn, hőgy a vakcinát egy vagy több szőkásőssegédanyaggal együtt intranazális, intraműszkűláris vagy szűbkűtánmódőn adagőlható dózisfőrmává alakítják. ŕ
Description
A találmány tárgya eljárás élő rekombináns adenovírus vakcinák előállítására, amelyek intranazális, intramuszkuláris vagy szubkután módon adagolhatok.
Az orvosbiológiai kutatások egyik fő célja a vírusos megbetegedések elleni védelem biztosítása immunizáció útján. Egyik megközelítés szerint a fenti célra elölt vakcinákat alkalmaznak. Az elölt vakcinából azonban nagy anyagmennyiségek kellenek ahhoz, hogy elegendő antigén anyag maradjon vissza. Ezenkívül az elölt vakcinák gyakran nemkívánatos termékekkel szennyeződnek előállításuk során. A heterológ élő vakcinák - genetikailag megfelelően átalakított adenovírus alkalmazásával, amely maga is egy vakcina - kiváló immunogénnek tűnnek [Chanok R., JAMA 195, 151 (1967)]. A találmány vektorként adenovírust alkalmazó vakcinákra vonatkozik.
A jelenleg forgalomban lévő adenovakcinák élő, fertőző adenovírust tartalmaznak, bélben oldódó bevonattal ellátott dózisformában. A vakcinálandó páciensnek történő beadagoláskor a vírus átjut a felső légúti rendszeren (ahol a betegséget kiváltó fertőzés valószínűleg létrejöhet), és a bélben válik szabaddá. A bélben a vírus a bélfalban reprodukálódik, ahol - noha nem képes adenovírális fertőzést kiváltani - adenovírus antitestek keletkezését indukálja, ily módon immunitást biztosít az adenovírális fertőzések ellen. Találmányunk értelmében az élő, fertőző adenovírust genetikailag úgy módosítjuk, hogy más, betegséget okozó organizmusok által termelt antigéneket kódoló géneket tartalmazzanak. Felszabadulása után a vírus reprodukálódik, és egymástól függetlenül expresszálja mind az adenovírális antigént, mind a patogén antigént, ezáltal antitest-képződést vagy sejtmediálta immunitást indukál mind az adenovírus, mind az egyéb, betegséget okozó organizmus ellen. Élő vírus alatt - az elölt vírussal ellentétben - olyan vírust értünk, amely önmagában, vagy egyéb genetikai anyaggal együtt képes azonos utódok létrehozására. Fertőző alatt azt értjük, hogy képes a virális genomot a sejtekbe bejuttatni.
Roy [80, 806 számú európai szabadalmi leírás (1983)] javasolt egy eljárást mikrobák által okozott betegségek elleni immunitás biztosítására egy idegen gént tartalmazó mikroba adagolásával, amely gén egy olyan másik mikroba antigénjét expresszálja, amellyel szemben az immunitás fennáll. Azt is leírta, hogy az előnyös orális készítmények bélben oldódó bevonattal vannak ellátva. Dulbecco olyan rekombináns adenovírus vakcinákat javasolt, amelyekben az adenovírus felületi proteinje úgy van módosítva, hogy szerkezetében tartalmazza egy idegen protein egy szegmensét, amely az állatnak való adagolás után a kívánt bilógiai választ kiváltja [WO 83/02393 számon publikált nemzetközi szabadalmi leírás (1983)]. Davis rekombináns adenovírusokból származó orális vakcinákat ismertetett (2166349 B számú nagy-britanniai szabadalmi leírás).
Az 1-es típusú humán immunhiány vírust (HIV-1) etiológiailag kapcsolatba hozzák a szerzett immunhiány szindrómával (AIDS) és hasonló betegségekkel [BarreSinoussi F., Science 220, 868 (1983); Gallo R., Science 224, 500 (1984); Popovic M„ Science 224, 497 (1984);
Samgadharan M., Science 224, 506 (1984)]. Az AIDS napjainkban világméretű járvány, amely ellen jelenleg nincs vakcina vagy gyógymód. A vakcina kifejlesztésére irányuló kutatások középpontjában a burok (env) glikoprotein áll, mint lehetséges antigén, amely védő immunitást biztosíthat. A tisztított gp 120 elleni antiszérumok in vitro képesek semlegesíteni a HIV-l-et [Crowl R., Cell 41, 979 (1985); Putnesy S„ Science 234, 1392 (1986); Ho D., J. Virol. 61, 2024 (1987); Nara P., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 3797 (1987)]. A HIV-1 burok-antigént különböző expressziós rendszerekben előállították, többek között Escherichia coliban [Crowl R., Cell 41, 979 (1985); Chang T., Bio/Technology 3, 905 (1985); Dawson G., J. Infect. Dis. 157, 149 (1988)], valamint emlős sejtekben [Chakrabarti S., Natúré 320, 535 (1986); Devar R., J. Virol. 63, 129 (1989); Rekosh D., Proc Natl. Acad. Sci. USA 85, 334 (1988); Whealy M., J. Virol. 62, 4185 (1988)], élesztő [Barr P., Vaccine 5, 90 (1987)]; és rovarsejtekben [Hu S., Natúré 328, 721 (1978); Rusche J., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 6294(1987)].
A teljes HIV-1 env glikoproteint [Hu S., J. Virol. 61, 3617 (1987)] vagy a tisztított rekombináns gp 120 env glikoproteint [Berman P., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 5200 (1988)] expresszáló élő rekombináns vacciniavírust mint lehetséges vakcinát csimpánzokban értékelték ki. A fenti vakcinákkal végzett aktív immunizálás jó sejt-mediálta immunválaszt és citotoxikus T-sejt aktivitást indukált az env antigénnel szemben [Zarling J., J. Immunoi. 139, 988 (1987)]. Minden kísérleti állat szerokonverziót mutatott ELISA és Western biot vizsgálatban. Azonban az immunizált csimpánzokban nem fejlődött ki HIV-1-gyei szembeni semlegesítő antitest-titer, vagy a titer alacsony volt. Élő vírussal történő fertőzés ellen nem adtak védelmet ezek a vakcinák a csimpánzoknak. Típus-specifikus, HIV-l-et semlegesítő antitesteket találtak csimpánzokban a fertőzés korai szakaszában egy, a gp 120 C-terminális részében elhelyezkedő variábilis dómén (V3) ellen [Goudsmit J., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 4478 (1988)]. A rovarsejtekben termelt rekombináns gp 120 szintén indukált humorális immunválaszt kecskében [Rusche J., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 6294 (1987)]. Zagury [Natúré 332, 728 (1988)] kimutatta az anamnesztikus humorális és celluláris immunreakciót is emberben, egy gp 160-at expresszáló rekombináns vakcinavírus [Chakrabarti S., Natúré 320, 535 (1986); Hahn B., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 4813 (1985)] alkalmazásával. Kimutatták mind a csoport-specifikus sejt-mediálta immunitást, mind a sejtmediálta citotoxicitást fertőzött T4 sejtek ellen. Ezek az eredmények azt jelzik, hogy HIV-1 elleni immunállapot alakítható ki emberben env-alapú rekombináns vakcina alkalmazásával. Újabban Desrosiers kimutatta, hogy a teljes inaktivált majom immunhiány vírussal (SIV) végzett vakcinálás képes védeni a majmokat az élő SIV fertőzéssel szemben [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 6353 (1989)]. A fenti eredmények alapján remélhető, hogy a humán AIDS vírus, a HIV-1 elleni védelemre is lehet vakcinát találni.
Chanda ismertette a HIV-1 burok-glikoproteinek
HU 214 364 Β nagymértékű expresszióját rév gén jelenlétében, helperindependens 7-es típusú adenovírus rekombinánsok alkalmazásával [Virology 175, 535 (1990)]. Vemon ismertette egy rekombináns adenovírus vektor rendszerben felhalmozódott, HIV-1 gag-tartalmú részecskék ultraszerkezetét [J. Gén. Virology 72, 1243 (1991)]. Vemon ismertette az Ad7-rev-gag és Ad4-rev-gag HIV1 rekombináns adenovírusok előállítását is.
A találmány tárgya eljárás élő rekombináns adenovírust - amelyben a virion szerkezeti protein a rekombináns adenovírus előállítására alkalmazott natív adenovíruséval azonos, és amely az 1 -es típusú humán immunhiány vírus antigént kódoló gént tartalmazza - tartalmazó vakcina előállítására, antitestek vagy sejt-mediálta immunitás kialakítására 1-es típusú humán immunhiány vírussal szemben melegvérű emlősökben, oly módon, hogy a vakcinát intranazális, intramuszkuláris vagy szubkután módon adagolható dózisformává alakítjuk.
Noha a leírásban specifikusan a 4-es, 5-ös és 7-es típusú adenovírust ismertetjük, a találmány értelmében bármilyen típusú élő, fertőző adenovírus alkalmazható. Ezenkívül, noha a leírásban specifikusan olyan adenovírusokat ismertetünk, amelyek egy korai 3-as régió (E3) deléciót tartalmaznak, vektorként gyengített, hőmérséklet-érzékeny léziót, vagy El deléciót tartalmazó adenovírusok is alkalmazhatók.
Egy előnyös kiviteli mód szerint a kezelési eljárás során a rekombináns adenovírust a HIV-1 fertőzésre fogékony emlősnek mind profilaktikusan, mind a Hívnek az állatban való kimutatását követően adagoljuk. Az anti-HIV válasz kiváltására az alábbi rekombináns adenovírusokat tartalmazó vakcinákat adagoljuk az állatoknak:
| Vírus neve | Leíró név | ATCC név |
| Ad7-env | Ad7-tplenv-tplHrev | VR-2299 |
| Ad7-gag | Ad7-tplgag-tplHrev | VR-2393 |
| Ad7-gag-l | Ad7-rev-gag | VR-2392 |
| Ad4-env | Ad4-tplenv-tplHrev | VR-2293 |
| Ad4-gag | Ad4-tplgag-tplHrev | VR-2391 |
| Ad4-gag-l | Ad4-rev-gag | VR-2390 |
| Ad5-env | Ad5-tplenv-tplHrev | VR-2297 |
| Ad5-gag | Ad5-tplgag-tplHrev | VR-2398 |
A fenti táblázatban Ad4, Ad5 és Ad7 az E3 régió delécióját tartalmazó 4-es, 5-ös illetve 7-es típusú humán adenovírust jelenti. Az env a HÍV burok (envelope) glikoproteinre (gp 160) utal. A gag a HTV gag/pro génre utal. Rév a HÍV regulátor génre utal. Hrev a rév gén egy változatára utal, amelyben a nukleotid-szekvenciát a humán génekben gyakran alkalmazott kodonok segítségével megváltoztattuk anélkül, hogy az aminosav-szekvencia megváltozott volna. Tpl - az angol íripartite Zeader rövidítése - a DNS-szálon 5’ irányban található (upstream), három részből álló adenovírus szignálszekvenciát jelenti, amely a rekombináns gének előtt elhelyezkedő első és második szignálból és egy közbeékelődő szekvenciából áll.
Alább részletesen ismertetjük, hogy Ad-HIV rekombináns vírusok intranazális adagolása a vakcinával korábban nem-kezeit csimpánzokban HÍV rekombináns antigének ellen mind elsődleges, mind megerősítő szinten, mind Immorális, mind sejt-mediálta immunválaszt eredményezett. A csimpánzoknak adagolt rekombináns adenovírusokról kimutattuk, hogy antitestet termelnek a HÍV env és gag proteinjei ellen. HIV-specifikus IgG antitesteket mutattunk ki a nazális, nyál és vaginális szekrétiumokban a rekombináns adenovírusok beadását követően, és HIV-re specifikus IgA antitesteket mutattunk ki a nazális és nyál szekrétumban. A rekombináns adenovírusok első sorozatában (Ad7) észleltük a leghosszabban tartó hatást, és ezek indukálták a legjobb anti-Ad antitest-választ. Az eredmények azt is kimutatták, hogy az Ad-HIV vakcinák adagolása intranazális úton felülmúlta rekombináns vírusok bélben oldódó kapszula formában történő adagolását orális úton.
A HÍV antigének elleni optimális immunválaszhoz elsődleges fertőzés és egy heterotípusos rekombináns Ad-HIV-vel megerősítő immunizálás kellett, hogy erős anti-HIV kötő antitesteket kapjunk. Ha a csimpánzoknak Ad-HIV vírusokat elsődlegesen intranazálisan adagoltuk, majd a HIV-1 alegység proteinnel megerősítő immunizálást végeztünk, a csimpánzok a HÍV fertőzésre a semlegesítő antitestek magas titereivel válaszoltak.
Rekombináns adenovírusok előállítása
A találmány szerinti rekombináns adenovírusok egyes képviselőinek előállítását az alábbi példákkal szemléltetjük. A rekombináns vírusokat A549 sejtekben tenyésztettük, majd A549 sejteken titráltuk.
1. példa
Ad7-gag-l előállítása
A HÍV burok-proteint kódoló gént tartalmazó rekombináns adenovírusok előállítása ismert [Chanda P., Virology 175, 535 (1990)]; hasonló eljárást alkalmaztak a gag és pro beépítésére [Vemon S., J. Gén. Virology 72, 1243 (1991)]. Röviden, a HIV-1 LAV törzs [Wain-Hobson S., Cell 40, 9 (1985)] teljes gag és pro kódoló régióját (335 - 2165. bázispár) tartalmazó DNSfragmenst szerkesztettünk - amelyben egyetlen Sál hely van a gag gén AUG kodonja előtt és egy Xbal hely a 2165. bázispámál (bp) - a virális rev-érzékeny elem (rre; 7178-7698. bp) inszertálására. A három HIV-1 szekvenciát tartalmazó, 2,37 kb hosszúságú Sáli fragmenst a 7-es típusú adenovírus (Ad7) fő késői promoterét (MLP), az első és második szignál között egy közbeékelődő szekvenciát tartalmazó háromrészes szignál-szekvenciát (TPL) és egy hexon poliadenilezési helyet (poliA) tartalmazó expressziós egységben lévő Sáli helyre inszertáltuk Chanda [Virology 175, 535 (1990)] eljárása szerint. Az expressziós egységet egy, a HIV-1 rév gént [Feinberg M., Cell 46, 807 (1986); Sodroski J., Natúré 321, 412 (1986)] egy 79,5 és 88,4 térképezési egység (m.u.) közötti deléciós E3 régiójában tartalmazó Ad7 genom [Chanda P., Virology 175, 535 (1990)] jobb vé3
HU 214 364 Β gétől 159 bp-nyira inszertáltuk [Sussenbach: The Adenoviruses, szerk. Ginsberg, Plenum Press, 34-124. oldal (1984)].
2. példa
Ad4-gag-l előállítása
Az 1. példában az Ad7-gag-l rekombináns adenovírus előállítására ismertetett eljárással egy hasonló, az analóg Ad4 szekvenciákat és a három HÍV kódoló régiót tartalmazó expressziós kazettát inszertáltunk egy Ad4 genom jobb végétől 139 bp-nyira lévő helyre, amely a HIV-1 rév gént egy 76 és 86 m.u. közötti E3 delécióban tartalmazza.
3. példa
Ad5-env előállítása
Az Ad5-tplenv-tplHrev a HIV-1 (LAV törzs) gp 160 teljes kódoló szekvenciáját és a rév gén egy Hrev-nek nevezett módosított változatát tartalmazza. Mind az env, mind a rév gént megelőzi egy szintetikus Ad5 háromrészes szignál-szekvencia (Ad5-tpl). Az Ad5-tpl-t kémiai úton szintetizáltuk és pTZ vektorba klónoztuk. Ezután a gp 160 DNS-szekvenciát az Ad5-tpl mögé inszertálva előállítottuk az Ad5-tpl-env/PTZ18R kiónt. A Herv-et (-360 bp) szintén kémiai szintézissel állítottuk elő, ebben a nukleotidszekvenciát az aminosav-szekvencia megváltoztatása nélkül módosítottuk, a kodon-használat segítségével. Erre a homológ rekombináció elkerülése miatt volt szükség, mivel az env és rév génben van néhány azonos szekvencia. Az Ad5-tplenv-hez hasonló módon, a Hrev gént is inszertáltuk a tpl mögé a pTZ 18R vektorba, így kaptuk az Ad5-tplHrev plazmidot. Az Ad5-tpl-Hrev-et tartalmazó teljes szekvenciát kivágtuk, majd az Ad5-tplenv mögé inszertáltuk, így kaptuk az Ad5-tplenv-tplHrev plazmidot. Ezt a plazmidot azután az Ad5 Marietta törzs deléciós E3 régiójába (78,8-85,7 m.u. deléció) inszertáltuk a 78,8 m.u.-nél. Ezt a plazmidot BglI enzimmel linearizáltuk, majd a vad típusú tisztított Ad5 vírusból származó 0-87 m.u. SnaBl fragmenssel elegyítettük. Miután az A549 sejteket a DNS elegyekkel transzfektáltuk, levettük a rekombináns vírus plakkokat, háromszor plakk-tisztítottuk, és genomiális szerkezetüket a fertőzött sejtekből extrahált DNS restrikciós endonukleáz hely analízisével ellenőriztük Hirt [J. Mól. Bioi. 26, 365 (1967)] módszerével.
4. példa
Ad5-gag előállítása
Az Ad5-tplgag-tplHrev a teljes gag és pro régiót, valamint a módosított rév gént, a Hrev-et tartalmazza. A szintetikus Ad5 háromrészes szignálszekvencia egy másolatát a gag és Hrev gének elé inszertáltuk. A virális rev-érzékeny elem (rre; 7178-7698 bp) inszertálására egy, a teljes gag és pro régiót (a HIV-1 LAV törzs 335-2165 bp-ja) tartalmazó DNS-fragmenst szerkesztettünk, amely egyetlen Sáli helyet tartalmaz a gag gén AUG kodonja előtt, és egy Xba helyet a a 2165. bp-nál. Két további plazmidot, az Ad5-tplgag-ot és az Ad5tplHrev-et az Ad5-tplenv-tplHrev előállításával analóg módon szerkesztettük meg. Ezután az AD5-tplHrev fragmenst az Ad5-tplgag mögé inszertálva előállítottuk az Ad5-tplgag-tplHrev plazmidot. Ezután az Ad5tplgag-tplHrev fragmenset egy E3 deléciót (78,8-85,7 m.u. E3 deléció) tartalmazó Ad5 Marietta törzs egyetlen Xbal helyére inszertáltuk, a 78,8 térképezési helyzetben. Ezután az Ad5 szekvenciát tartalmazó kész plazmidterméket linearizáltuk, majd transzfektálás céjából a 0-87 m.u. SnaBl virális fragmenssel elegyítettük. A rekombináns plakkokat levettük, háromszor plakk-tisztítottuk, és a fertőzött sejtekből extrahált DNS Hirt-féle analízisével ellenőriztük.
5. példa
Bélben oldódó bevonatos kapszula előállítása A rekombináns adenovírusokat A549 sejtekben tenyésztettük, és 3 fagyasztás-felolvasztás ciklus után összegyűjtöttük a sejteket. A derített fertőzött sejt lizátumokat liofílizáltuk és 60-100 mg-onként 2. számú zselatin kapszulákba töltöttük, 1 ml-es fecskendőt alkalmazva száraz körülmények között. A kapszulákat 10% cellulóz-acetát-ftalátot tartalmazó 1:1 térfogatarányú aceton/100%-os etanol eleggyel vontuk be oly módon, hogy kézileg mindkét végüket hatszor bemerítettük, és a bemerítések között levegőn szárítottuk. A fenti körülmények között 69-77 mg cellulóz-acetát-ftalátból álló bevonat képződött. A minta kapszulák szimulált gyomornedvvel (0,32% pepszin, 0,2% NaCl, pH 1,2) szembeni ellenállását 37 °C-on 1 órán keresztül vizsgáltuk, VanKel Disintegration Testőr készüléket alkalmazva. A kapszulákat lyukak és repedések szempontjából megvizsgáltuk, majd 10 ml szimulált bélnedvet (1,0% pankreatin, 0,05 mol/1 egybázisú kálium-foszfát, pH 7,5) tartalmazó 15 ml-es kémcsövekbe helyeztük és 37 °Con forgattuk. Az összes vizsgált kapszula 37 °C-on keverés közben 1 órán keresztül rezisztensnek mutatkozott a szimulált gyomomedvvel szemben, és 15 percen belül oldódni kezdett a szimulált bélnedvben. A vírus mennyiségét összefüggő egysejtrétegű A549 sejttenyészeten titráltuk, plakk-vizsgálattal, és a virális DNS stabilitását Hirt analízissel ellenőriztük.
Adagolási rend kezeléskor
A rekombináns adenovírusok HÍV elleni immunogén tulajdonságát csimpánzokon értékeltük ki, három adagolási rend alkalmazásával. Az első adagolási rend szerint a rekombináns adenovírust orálisan adagoltuk bélben oldódó bevonattal ellátott kapszulákban (5. példa) a 0., 7. és 26. héten, majd egy env+gag alegység proteinnel megerősítő immunizálást végeztünk, adjuvánként alumot alkalmazva. A második adagolási rend szerint az első adagolási rend szerint kezelt csimpánzoknak a 46. és 58. héten újabb rekombináns adenovírus megerősítő immunizálást adtunk intranazálisan. A harmadik adagolási rend szerint naiv csimpánzoknak intranazálisan adagoltuk a rekombináns adenovírust a 0., 24. és 52. héten, majd a 72. héten egy env alegység megerősítést adtunk.
Az 1. és 2. adagolási rendet az 1. táblázatban foglaltuk össze.
HU 214 364 Β
1. táblázat
Immunizálás Időpont 1. és 2. csimpánz 3. csimpánz
| 1. adagolási | rend | ||||||
| Első immu-* | 0. hét | 1,5107 | pfu | Ad7-env | 1,5-107 | pfu | Ad7-env |
| nizálás | 2,0-10° | pfu | Ad7-gag-l | ||||
| 1. megerő- | 7. hét | 1,1-101’ | pfu | Ad4-env | 1,1-1010 | pfu | Ad4-env |
| sítés* | 1.O-1O1’ | pfu | Ad4-gag-l | ||||
| 2 . tnegerő- | 26.hét | 7,9-101’ | pfu | Ad5-env | 7,9-1010 | pfu | Ad5-env |
sítés*
3. megerő- 34.hét 200 env 0,2 V 200 /ig env 0,2 % sítés* alumban alumban
500 /xg env 0,2 V alumban
2. adagolási rend
| 1. intra- 46.hét | 1,0-108 | pfu Ad7-env | 1,0*10® pfu Ad7-env |
| nazális | 1,0-108 | pfu Ad7-gag | |
| megerő- | |||
| sítés | |||
| 2.intra- 58.hét | 1,0-108 pfu Ad4-env | 1,0-10® pfu Ad4-env | |
| nazális | 1,0-108 | pfu Ad4-gag |
megerősítés * mindegyik dózist bélben oldódó bevonatos zselatin kapszulában adtuk 3 egymást kővető napon + intramuszkulárisan adagolva
A harmadik adagolási rendet a 2. táblázatban foglaltuk össze.
2. táblázat
| Immunizálás | Időpont | 4. és 5. | csimpánz | 6. csimpánz |
| Első immu-* | 0. hét | 1,0-107 | pfu Ad7-env | 1,5-107 pfu Ad7-env |
| nizálás | 1,0-107 | pfu Ad7-gag | ||
| 1. megerő- | 24.hét | i,o-io7 | pfu Ad4-env | 1,5-107 pfu Ad4-env |
| sítés* | 1,0-107 | pfu Ad4-gag | ||
| 2. megerő- | 52.hét | 1,0-107 ] | pfu Ad5-env | 1,5-107 pfu Ad5-env |
| sítés* | i,o-io7 | pfu Ad5-gag | ||
| 3. megerő- | 75.hét | 200 mg i | snv | |
| sítés* |
* intranazálisan adagolva * intramuszkulárisan adagolva
Immunogenicitás mérése:
kezelés az 1. adagolási rend szerint
Csimpánzok fertőzése
Három csimpánzon (2 hím és 1 nőstény) végeztük a kiértékelést az 1. adagolási rend szerinti kezelést alkalmazva, az állatokat a vizsgálatot megelőzően 4-es és 7-es típusú humán adenovírusokkal szembeni semlegesítő antitestek jelenlétére szűrtük, és negatívnak találtuk. A rekombináns adenovírusokat tartalmazó, bélben oldódó bevonattal ellátott kapszulákat altatás alatt, gyomorszonda segítségével adtuk be, három egymást követő napon. Két csimpánz (1. és 2. számú) mind env, mind gag rekombináns vírust kapott, míg a harmadik (3. számú) csak env rekombináns vírust kapott.
Az env vagy gag gén termékeket tartalmazó adenovirusból származó alegység készítményeket fertőzött A549 sejttenyészetből tisztítottuk [lásd Vemon S., J. Gén. Virol. 72, 1243 (1991); Natuk R., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 7777 (1992)]. A rekombináns antigéneket alum adjuvánssal formáltuk és intramuszukulárisan adagoltuk, dózisonként 200 pg env, illetve 500 pg gag részecskét.
A kísérlet során meghatározott időpontokban teljes vér, szérum és széklet mintákat vettünk. A teljes vért feldolgozva kaptuk a fehérvérsejt populációkat a FACS, HÍV CTL vizsgálathoz (HIV-env, HIV-gag vagy a lac gén termékeket expresszáló rekombináns vacciniavírusok alkalmazva), és a limfoproliferációs vizsgálatokhoz a tisztított HÍV rekombináns gp 160-at, gp 120-at és p24-et. A szérum és a széklet mintákat felhasználásukig -70 °C-on tároltuk.
Rekombináns adenovírusok kimutatása széklet mintában
A csimpánzok széklet mintáit felolvasztottuk, és antibiotikumot tartalmazó DMEM-mel 10 térfogat%-os szuszpenziókat készítettünk belőlük. A derített széklet szuszpenziókat alkalmaztuk a 60 mm-es szövettenyésztő csészékben lévő összefüggő egysejtrétegű A549 sejttenyészet fertőzésére. 1 órás adszorpciós periódus után a meg nem kötött anyagot lemostuk és az egysejtréteget 0,5%os agar felülrétegező tápközeggel felülrétegeztük. A 7-10 nap alatt kialakult plaktokat semleges vörös festéssel tettük láthatóvá, megszámláltuk, és az agaros felső réteget óvatosan eltávolítottuk, vigyázva arra, hogy az egysejtréteget ne zavarjuk fel. A sejtréteget 20-szoros koncentrációjú SSC-ben előáztatott nitrocellulóz szűrő membránokra (Millipore Type HA, 0,45 pm) vittük át, a membránt a sejtrétegre helyeztük, és 2-4 percen keresztül hagytuk érintkezni az egysejtréteggel. A szűrőket lehántottuk, levegőn szárítottuk és 2 órán keresztül vákuumban 80 °C-on melegítettük. A nitrocellulóz szűrőket szobahőmérsékleten kétszer mostuk 3xSSC/0,l% SDS eleggyel, és standard eljárásokat alkalmazva előhibridizáltuk és hibridizáltuk [Poncet D., J. Virol. Methods 26, 27 (1989)]. A hibridizációs pufferhez 32Pjelzett oligonukleotid-próbákat adtunk (1 · 106 cpm) és egy éjszakán keresztül 42 °C-on inkubáltuk. DNS-próbákat állítottunk elő, amellyel detektálni lehetett az Ad4 szálat, Ad5 szálat, Ad7 szálat, HIV-env és HIV-gag specifikus szekvenciákat is [Wain-Hobson, Cell 40, 9 (1985)]. A szűrőket mostuk, autoradiografáltuk és számláltuk a hibridizációs jeleket.
Adenovírus neutralizálási vizsgálat
Kétszeres sorozathígítást készítettünk (1:4 hígításból kiindulva) hővel inaktivált (56 °C, 30 perc) kutya szérumból, 96-rezervoáros mikrotitráló lemezen (0,05 ml/rezervoár), és 0,5 ml, 30-100 TCID50 vírust tartalmazó tápközeggel kevertük 37 °C-on 1 órán keresztül. Minden egyes rezervoárba bemértünk 0,05 ml, 2·ΙΟ4 A549 sejtet tartalmazó tápközeget, és a lemezeket 37 °C-on 5%
HU 214 364 Β
CO2-tartalom mellett 7-10 napon keresztül inkubáltuk. Minden mintát két párhuzamossal vizsgáltunk. A vizsgált szérumban a végpont meghatározására minden egyes vizsgálatnál használtunk vírus és fertőzetlen sejt kontrollt. A titereket azon legalacsonyabb hígítást recip- 5 rókával fejeztük ki, amelynél 50%-os citopatikus hatást észleltünk.
Anti-HIV antitestek kimutatása EL1SA és Western biot módszerrel
Az anti-HIV antitestek kimutatására a HIV-1 antigénre adott csimpánz antitest választ mértük különböző hígításokban, kereskedelmi forgalomban kapható ELISA és Western biot készletek segítségével, a gyártó (DuPont, Wilmington, DE) útmutatásának megfelelően.
Eredmények
Minden majomtól széklet mintát vettünk a vírussal való fertőzést megelőzően, és utána, és - 70 °C-on tároltuk.
Minden egyes mintából 10%-os szuszpenziót készítet- 20 tünk, és ezt alkalmaztuk az összefüggő A549 egysejtréteg fertőzésére. 7-10 nap elteltével a vírus plakkokat semleges vörös festéssel láthatóvá tettük, és az egysejtrétegeket nitrocellulóz membránokra vittük át. A vizsgált mintákat különféle jelzett oligonukleotid próbákkal 25 hibridizálva mutatttuk ki az Ad4, Ad5, Ad7, HIV-env vagy HIG-gag génre specifikus szekvenciákat. A fenti plakk-hibridizációs módszerrel azonosíthatók a specifikus rekombináns Ad-HIV vírusok. A rekombináns vírusok egyike sem ürült a széklettel a fertőzés után 7 napnál 30 tovább. A csúcs-titereket mindig az 1-3 napos mintákban mértük, és igen valószínű, hogy ez a nem abszorbeált vírus inokulumot jelentette. Csimpánzokon AdHBsAg rekombinánsokkal végzett korábbi kísérletek azt mutatták, hogy az Ad-HBsAg rekombinánsok a fér- 35 tőzés után 30-40 napon keresztül kimutathatók. Úgy tűnik, hogy ezek a rekombináns vírusok nem szaporodtak jól in vivő bélben oldódó bevonattal ellátott kapszulákban történő adagolás esetén.
A szerokonverziót az alkalmazott adenovírus vekto- 40 rok szerotípusaira neutralizálási vizsgálattal határoztuk meg. A csimpánzokban használt mindhárom szerotípus ellen igen alacsony - közepes anti-adenovírus szérumtitereket mértünk.
A rekombináns HÍV gén termékekkel szembeni szerokonverziót ELISA vagy Western blotting módszerrel határoztuk meg. Nem mutattunk ki ELISA választ egyik csimpánzban sem az Ad5-env rekombinánssal végzett második megerősítő immunizálást megelőzően. Az Ad5-env fertőzés után 2 héttel a három állat közül 10 kettőben mértünk anti-env választ. A gag és/vagy env preparátumok intramuszkuláris injektálásával enyhe megerősítő hatást lehetett előidézni a három közül egy állatban. A Western biot analízis sokkal érzékenyebbnek tűnt, mint az ELISA, és további előnye, hogy segítségé15 vei ki lehetett mutatni, melyik env és/vagy gag gén termék az, amelyet immunogénként felismertek. Alacsony szérum-antitest titereket mértünk mind az Ad7 rekombinánssal végzett első immunizálás, mind az Ad4 rekombinánssal végzett első megerősítés után. Az env gén termékek elleni szérum-titer jelentős növekedését észleltük az Ad5-env rekombinánssal végzett második megerősítő immunizálás után. Abban a két állatban, amely gag gén termékeket kapott, jelentős növekedést észleltünk az alegység preparátumok beinjektálása után. A HÍV antigénekkel szembeni viszonylag jó Western biot titerek ellenére, a három közül csak egy állat válaszolt semlegesítő antitestekkel. Ez a válasz a 2. számú csimpánzban igen alacsony volt (titer: 10-20). A fenti eredményeket a 3. táblázatban foglaltuk össze.
A sejt-mediálta immunitást csimpánzokból nyert perifériás vér mononukleáris sejtpopulációban mértük. A HIV-specifikus CTL aktivitást vagy a HIV-env gén termékeket, vagy a HIV-gag gén termékeket, vagy a (nem specifikus citotoxicitás kontrolljára) lac gén termékeket expresszáló vaccinavírus rekombinánsokkal fertőzött szingenetikus célsejtek lízisének meghatározásával mértük. A HIV-specifikus CTL-szerű aktivitás meglétét mértük ezen a módon.
A limfoproliferatív vizsgálatokat azért végeztük, hogy meghatározzuk, vajon a tisztított rekombináns env (gp 160, gp 120) vagy gag (p24) készítmények képesek-e
3. táblázat
Az 1. adagolási rend alkalmazásával kapott eredmények
| Csimpánz száma | Rekombináns vírus | Rekombináns vírust | Anti-adeno semlegesítő csúcs-titer | Anti-HIV Western biot | Anti-HIV semlegesítő csúcs-titer | ||
| tartalmazó (nap) | széklet | csúcs- | titerek | ||||
| env | gag | ||||||
| 1. | Ad7-env, Ad7-gag-l | 2,2 | 128 | 20 | <10 | ||
| Ad4-env, Ad4-gag-l | 2,2 | 8 | - | 20 | <10 | ||
| Ad5-env | 7 + | 128 | 100 | - | <10 | ||
| alegység: env+gag | 100 | 1000 | <10 | ||||
| 2 . | Ad7-env, Ad7-gag-l | 3,2 | 64 | - | 20 | <10 | |
| Ad4-env, Ad4-gag-l | 1,7 | 128 | 20 | 100 | <10 | ||
| Ad5-env | 7 + | 64 | 10000 | - | 20 | ||
| alegység: env+gag | 1000 | 10000 | 10 | ||||
| 3. | Ad7-env | 2 | 6 | 20 | N/A* | <10 | |
| Ad4-env | 1 | 128 | 20 | N/A | <10 | ||
| Ad5-env | 7 + | 512 | 1000 | N/A | <10 | ||
| alegység: env | 100 | N/A | <10 |
* N/A: nem alkalmazható
HU 214 364 Β a blasztogenezist stimulálni. Nem mértünk proliferációt az első immunizálás után, és a három állat közül csak egy adott limfoproliferatív választ az Ad4 rekombináns vírusokkal végzett első megerősítést követően. Mindhárom állat proliferatív választ adott a második megerősítő (Ad5-env) és a harmadik megerősítő (alegység preparátumok) immunizálás után.
Immunogenicitás mérése: 2. adagolási rend Csimpánzok immunizálása és adatgyűjtés Három csimpánzt (2 hím és 1 nőstény) - amelyeket előzőleg Ad-HIV rekombináns vírusokkal fertőztünk bélben oldódó bevonattal ellátott kapszulában beadva, és adenovírusból származó gag és/vagy env alegységekkel végeztük a megerősítést (1. adagolási rend) - a 46. héten Ad7-HIV vírusokkal, és 12 hét elteltével (az 58. héten) Ad4-HIV vírusokkal fertőztünk intranazálisan. A rekombináns adenovírusokat foszfát-só pufferrel hígított szövettenyészetben adagoltuk cseppenként az altatott csimpánzok orrlyukába. Két csimpánz (az 1. és 2. számú) mind env, mind gag rekombináns vírust, míg a harmadik (3. számú) csak env rekombináns vírust kapott.
A kísérlet során meghatározott időközökben teljes vér, szérum és széklet mintákat vettünk, és az 1. adagolási rend esetén ismertetett módon feldolgoztuk azokat. Az adenovírus kimutatását a széklet mintákban vagy a nazális kenetben, az adenovírus neutralizálási vizsgálatot és az anti-HIV antitestek kimutatását szintén az 1. adagolási rend esetén ismertetett módon végeztük.
Eredmények
Az első intranazális emlékeztető immunizálásra az Ad7 rekombinánst egyetlen, 1Τ08 pfu/csimpánz dózisban adagoltuk. A vírus beadásának időpontjában a 3., 1. és
2. csimpánz szérumának anti-AD7 semlegesítő titere <4, 8, illetve 64 volt a megelőző orális immunizálás után. A nazális keneteket és a széklet mintákat plakk-hibridizációs módszerrel vizsgáltuk a rekombináns vírus jelenléte szempontjából. Az Ad7-env rekombinánst a nazális kenetben két állatban kimutattuk az immunizálás utáni 7. napig. Az Ad7-env és Ad7-gag rekombináns a széklet mintában a fertőzés utáni 5-12. napig volt jelen. Összefüggés volt az Ad7-tel szembeni szérum titer és a rekombináns vírusok nazális kenetben és széklet mintában való kimutathatósága között. Az a két állat, amelyben az anti-HIV válasz a határértéket elérte, nagymértékben fokozott immunitást mutatott az intranazális megerősítés után. A harmadik állatban a megerősítés hatása kisebb volt. A HÍV elleni semlegesítő antitestek alacsony titerekkel így már mind a három állatban kimutathatóak voltak. Szekréciós antitesteket mutattunk ki azokban a nazális kenet mintákban, amelyek anti-gag és/vagy env-kötő antitesteket tartalmaztak. Ezekben az állatokban az Ad7 rekombináns vírusok intranazális adagolásának eredményeként nem észleltünk légzési megbetegedésre utaló jelet vagy tünetet.
Három hónappal később ezeket a csimpánzokat Ad4 rekombinánsokkal immunizáltuk egyetlen, 1Τ08 pfu/csimpánz/vírus dózisban. Az intranazális fertőzés időpontjában ezen állatokban a megelőző orális immunizálásból származó szérum anti-Ad4 semlegesítő titer 128 és 256 közötti volt. A fertőzés utáni 3. napon a három állat közül kettő (a 2. és 3. számú) kicsit köhögött. A harmadik állat (az 1. számú) az 5. napon bakteriális pneumoniában (Streptococcus pneumoniae-t izoláltunk) elpusztult. A másik két állat rekedt hangokat hallatott meghallgatáskor, és mindkét csimpánzból S. pneumoniae-t izoláltunk. Elkezdtük az antibiotikumos kezelést, és mindkét csimpánz meggyógyult.
A helyzetet utólag megvizsgálva számos megfigyelést tehettünk. Az intranazális adagolás időpontjában az
1. számú csimpánznak már láza volt, és kóros teljes vérképet mutatott. Aránytalan volt a jelenlévő polimorfonukleáris sejtek száma, és az éretlen polimorfonukleáris sejtek mennyisége 5% volt, ez a két információ együtt arra utal, hogy a vírussal való fertőzés előtt már végbement egy erős bakteriális fertőzés. A boncoláskor a tüdőből, májból, lépből és szárúmból vett mintákat mind negatívnak találtuk a fertőző adenovírus jelenléte szempontjából, szövettenyészetben, 3 vak passzálás után érzékeny A549 egysejtrétegen vizsgálva. Hasonló eredményt kaptunk plakk-hibridizációs módszerrel is. A paraffinba ágyazott tüdő és máj mintákat negatívnak találtuk adenovírus antigének jelenléte szempontjából, kereskedelmi forgalomban kapható, adenovírus antigének kimutatására alkalmas immunfluoreszcens készlet alkalmazásával. Zárványtesteket figyeltünk meg H&E-festett tüdő metszetekben. A szakértői vélemény nem volt egybehangzó arra vonatkozóan, hogy ezeket a zárványokat adenovírus okozta-e vagy sem. Néhány hét múlva egy másik csimpánz is ugyanilyen körülmények között pusztult egy ugyanabban a főemlős-centrumban. Noha valószínűleg a rekombináns adenovírusok beadásának csak kis szerepe volt - ha egyáltalán volt - az 1. számú csimpánz halálában, óvatosságból antibiotikumok profilaktikus adagolását javasoltuk a rekombináns adenovírusok intranazális beadása előtt és után.
Az 1. adagolási rend alkalmazásával és a 2. adagolási rend szerint az Ad7 rekombinánsok adagolásával kapott eredményeket a 4. táblázatban foglaltuk össze.
Immunogenicitás meghatározása: 3. adagolási rend Csimpánzok immunizálása és adatgyűjtés Három csimpánzon (2 hím és 1 nőstény) végeztük a kiértékelést a 3. adagolási rend szerinti kezelést alkalmazva, az állatokat a vizsgálatot megelőzően 4-es, 5-ös és 7-es típusú humán adenovirusokkal szembeni semlegesítő antitestek jelenlétére szűrtük, és negatívnak találtuk. Két csimpánz (4. és 5. számú) mind env, mind gag rekombináns vírust, míg a harmadik (6. számú) csak env rekombináns vírust kapott. Az állatokat profilaktikusan antibiotikummal kezeltük, és nem találtunk légzési rendellenességet.
A kísérlet során meghatározott időközökben teljes vér, szérum és széklet mintákat vettünk, és az 1. adagolási rend esetén ismertetett módon feldolgoztuk azokat. Az adenovírus kimutatását a széklet mintákban vagy a nazális kenetben, az adenovírus neutralizálási vizsgála7
HU 214 364 Β
4. táblázat
Az 1. és 2. adagolási rend alkalmazásával kapott eredmények
| Csimpánz Rekombináns | Rekombináns vírust | Anti-adeno | Anti-HIV Western biot | Anti-HIV |
| száma vírus | tartalmazó széklet | semlegesítő | csúcs-titerek | semlegesítő |
| (nap) | csúcs-titer | env gag | csúcs-titer |
| 1. | 1. adagolási rend Ad7-env, Ad7-gag-l Ad4-env, Ad4-gag-l Ad5-env alegység: env+gag 2. adagolási rend Ad7-env, Ad7-gag | 2,2 2,2 7 + 12 | 128 8 128 512 | 100 100 10000 | 20 20 1000 10000 | <10 <10 <10 <10 10 |
| 2 . | 1. adagolási rend Ad7-env, Ad7-gag-l | 3,2 | 64 | 20 | <10 | |
| Ad4-env, Ad4-gag-l | 1,7 | 128 | 20 | 100 | <10 | |
| Ad5-env | 7 + | 64 | 10000 | - | 20 | |
| aleovséq: env+qaq | 1000 | 10000 | 10 | |||
| 2. adagolási rend Ad7-env, Ad7-gag | 9 | 8192 | 1000 | 10000 | 20 | |
| 3 . | 1. adagolási rend Ad7-env | 2 | 6 | 20 | N/A* | <10 |
| Ad4-env | 1 | 128 | 20 | N/A | <10 | |
| Ad5-env | 7 + | 512 | 1000 | N/A | <10 | |
| alegység: env 2. adagolási rend | 100 | N/A | <10 | |||
| Ad7-env | 7 | 256 | 10000 | N/A | 10 |
* N/A: nem alkalmazható tót és az anti-HIV antitestek kimutatását szintén az 1. adagolási rend esetén ismertetett módon végeztük.
Eredmények
Első immunizálás Ad7 rekombinánsokkal
A rekombináns vírusok a fertőzés után 22-34 napon keresztül ürültek a széklettel. Nem találtunk rekombináns vírust a fertőzés után 2 héttel vett nazális szekrétumokban. Az alkalmazott adenovírus vektorok szeroptípusával szembeni szerokonverziót semlegesítési vizsgálattal határoztuk meg. Kiváló anti-adenovírus titereket mértünk mind a három csimpánzban a mindegyik állatban alkalmazott Ad7 szerotípussal szemben. A rekombináns HÍV gén termékek elleni szerokonverziót Western blottinggal határoztuk meg. Az Ad7 rekombinánsokkal végzett első immunizálás után 4 héttel a három csimpánz közül kettőben mértünk anti-env és anti-gag választ. A fertőzés után 20 héttel mind a három állatban mérhető volt a HIV-antigénekkel szembeni antitestek mennyisége. Az első immunizálás utáni első 4 hétben vett nazális kénetekben nem találtunk szekréciós antitesteket. Egyik csimpánzban sem alakult ki kimutatható mennyiségű anti-HIV semlegesítő antitest válasz.
Első megerősítő immunizálás Ad4 rekombinánsokkal A rekombináns Ad4 vírusok a fertőzés után 14 28 napon keresztül ürültek a széklettel. A nazális kenetek vizsgálata azt mutatta, hogy a rekombináns Ad4 vírusok mind a három csimpánzban kimutathatók a fertőzés után legalább 7 napon keresztül. Az intranazális adagolást követően jelentős anti-Ad4 válaszok alakultak ki az Ad4 szerotípus ellen. Ezek nagyságrendje alig volt alacsonyabb, mint az Ad7 rekombináns vírusok ellen mérteké.
Mind a három állatban kiváló megerősítésre adott válaszokat mértünk gag és/vagy env antigének ellen. A 4. és
5. számú csimpánz nazális kenetében alacsony ti terű (1:2) anti-gag és/vagy anti-env válaszokat mértünk. Mégsem mértünk anti-HIV semlegesítő antitestet egyik állatban sem.
Második megerősítő immunizálás
Ad5 rekombinánsokkal
A rekombináns Ad5 vírusok a fertőzés után 8 napon keresztül ürültek a széklettel. Nem tudtunk rekombináns vírust kimutatni a fertőzés után 0, 1 vagy 2 héttel vett nazális kénetekben. Szekréciós IgG és IgA mindhárom állattól vett nazális kenetben mérhető volt. Szekréciós antitesteket mutattunk ki mind a három állattól vett nyál mintában, és az egy nőstény csimpánztól vett vaginális kénetekben. Mind a három csimpánzban kimutattunk anti-HIV típus-specifikus semlegesítő antitesteket.
A 3. adagolási rend esetén kapott eredményeket az 5.
táblázatban foglaltuk össze.
Az Ad5-HTV rekombinánssal végzett intranazális megerősítő immunizálás után a csimpánzok szekrétumaiban kimutatott anti-HIV válaszokat a 6. táblázatban foglaltuk össze.
A találmány értelmében vakcinák előállítására alkalmazható élő rekombináns adenovírusát úgy állíthatjuk elő, hogy egy, melegvérű állatokban egy fertőző organizmus elleni antitestnek megfelelő, vagy egy, melegvé55 rű állatokban fertőző organizmusokkal szembeni sejtmediálta immunitást indukáló antigént kódoló gént egy adenovírusba inszertálunk. Az inszerciót ChandaP.K. és munkatársai által ismertetett eljárással [Virology 175, 535-547 (1990), lásd különösen az 539. oldalt] hajthat60 juk végre.
HU 214 364 Β
5. táblázat
A 3. adagolási rend alkalmazásával kapott eredmények
| Csimpánz Rekombináns | Rekombináns vírust Anti-adeno tartalmazó széklet semlegesíti | Anti-HIV Western biot csúcs-titerek | Anti-HIV semlegesít® csúcs-titer | |||
| száma | vírus | |||||
| (nap) | csúcs-titer | env | gag | |||
| 4. | Ad7-env, Ad7-gag | 22,22 | 1024 | 100 | 1000 | <10 |
| Ad4-env, Ad4-gag | 14,14 | 128 | 10000 | 10000 | <10 | |
| Ad5-env, Ad5-gag | 8,8 | 32 | 10000 | 10000 | 20 | |
| alegység: env | N/A* | N/A | >10000 | 10000 | 640 | |
| 5. | Ad7-env, Ad7-gag | 34,27 | 1024 | 100 | 10000 | <10 |
| Ad4-env, Ad4-gag | 14,14 | 512 | 10000 | 10000 | <10 | |
| Ad5-env, Ad5-gag | 8,8 | 32 | 10000 | 10000 | 20 | |
| alegység: env | N/A | N/A | 1000 | 10000 | 320 | |
| 6. | Ad7-env | 34 | 1024 | 100 | N/A | <10 |
| Ad4-env | 28 | 512 | 10000 | N/A | <10 | |
| Ad5-env | 8 | 32 | 10000 | N/A | 40 | |
| alegység: env | N/A | N/A | >10000 | N/A | 320 |
* N/A: nem alkalmazható
6. táblázat
Szekrétumokban detektált anti-HIV válaszok
| Csimpánz | Felismert | Hetek száma a | Vizsgált | szekrétum | ||||
| száma | antigén | megerősítés után | Nazális | Nvál | Vaginális | |||
| IgA | IgG | IgA | IgG | IgA | IgG | |||
| 4 . | env | 0 | ★ | 360 | ||||
| 1 | 180 | 360 | - | - | - | 90 | ||
| 2 | 180 | 2880 | 20 | 20 | - | 90 | ||
| 4 | 720 | 1440 | - | 20 | - | 360 | ||
| gag | 0 | - | 180 | - | - | - | - | |
| 1 | 360 | 360 | - | 20 | - | 90 | ||
| 2 | 720 | 2880 | - | 20 | - | 90 | ||
| 4 | 720 | 720 | - | 20 | - | 90 | ||
| 5. | env | 0 | - | - | - | N/A+ | N/A | |
| 1 | - | 90 | - | - | N/A | N/A | ||
| 2 | - | 2880 | - | - | N/A | N/A | ||
| 4 | - | 360 | - | - | N/A | N/A | ||
| gag | 0 | - | - | - | - | N/A | N/A | |
| 1 | - | 90 | - | - | N/A | N/A | ||
| 2 | 90 | 1440 | - | - | N/A | N/A | ||
| 4 | - | 360 | - | - | N/A | N/A | ||
| 6. | env | 0 | - | - | - | N/A | N/A | |
| 1 | - | - | - | - | N/A | N/A | ||
| 2 | - | 1440 | 20 | 20 | N/A | N/A | ||
| 4 | 360 | - | N/A | N/A |
s90 nazális és vaginális kenetben és <20 nyál mintában + nem alkalmazható
A találmány szerint alkalmazható élő rekombináns adenovírust plakk-tisztitásal tisztíthatjuk. A vakcina előállítására szükséges vírus mennyiségét megfelelő gazdaszervezetben való replikálással növelhetjük. A replikációt sejttenyészetben hajthatjuk végre. A sejttenyészet 50 sejtjei előnyösen marha vese (BK) vagy humán karcinoma sejtek, előnyösen humán méhnyak-karcinoma sejtek, például a HeLa sejtvonal, vagy humán tüdőkarcinoma sejtek, például az A549 sejtvonal. A vírust - 70 °C-on tárolhatjuk tápközegben, például 5% magza- 55 ti borjú szérumot tartalmazó DMEM-ben.
Intranazális adagolás céljára a vakcina a vírus mellett egy stabilizátort, például SPGA-t (szacharóz, foszfát, glutarát és albumin) és kívánt esetben egy vagy több cukrot tartalmazhat. 60
A találmány előnyösen a főemlősök rendjébe tartozó emlősök (beleértve az embert is) kezelésére alkalmazhatjuk.
Claims (10)
- SZABADALMI IGÉNYPONTOK1. Eljárás élő rekombináns adenovírust - amelyben a virion szerkezeti protein a rekombináns adenovírus előállítására alkalmazott natív adeno vírusé val azonos, és amelybe az 1-es típusú humán immunhiány vírus antigént kódoló gén van beépítve - tartalmazó vakcina előállítására, antitestek vagy sejt-mediálta immunitás kialakítására 1-es típusú humán immunhiány vírussal szemben melegvérű emlősökben, azzal jellemezve, hogy aHU 214 364 Β vakcinát egy vagy több szokásos segédanyaggal együtt, intranazális, intramuszkuláris vagy szubkután módon adagolható dózisformává alakítjuk.
- 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az élő rekombináns adenovírus a 4-es típusú adenovírus, 5-ös típusú adenovírus és 7-es típusú adenovírus közül legalább az egyik, amely adenovírusokból a korai 3-as régió egy génje törölve van.
- 3. A 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az 1-es típusú humán immunhiány vírust kódoló gén az env gén, gag/pro gén, rév gén és módosított Hrev gén közül legalább az egyik.
- 4. A 3. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a rekombináns adenovírus az Ad7-tplenv-tplHrev,Ad7-tplgag-tplHrev, Ad7 -rev-gag, Ad4-tplenv-tplHre v, 15 Ad4-tplgag-tplHrev, Ad4-rev-gag, Ad5-tplenv-tplHrev és Ad5-tplgag-tplHerv adenovírusok közül legalább az egyik.
- 5. Az 1—4. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy egy vagy több 1-es típusú humán immunhiány vírus alegység proteint is adagolunk.
- 6. Az 5. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, 5 hogy az alegység protein env vagy gag, fehérje.
- 7. Az 1-4. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a vakcinát intranazálisan adagolhatóvá formáljuk.
- 8. Az 5. vagy 6. igénypont szerinti eljárás, azzal 10 jellemezve, hogy a vakcinát intranazálisan adagolhatóvá formáljuk.
- 9. Az 1-6. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a vakcinát intramuszkulárisan adagolhatóvá formáljuk.
- 10. Az 1-6. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a vakcinát szubkután módon adagolhatóvá formáljuk.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US92649192A | 1992-08-07 | 1992-08-07 |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| HU9302285D0 HU9302285D0 (en) | 1993-11-29 |
| HUT67302A HUT67302A (en) | 1995-03-28 |
| HU214364B true HU214364B (hu) | 1998-03-30 |
Family
ID=25453282
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| HU9302285A HU214364B (hu) | 1992-08-07 | 1993-08-06 | Eljárás rekombináns adenovírus vakcinák előállítására |
| HU95P/P00643P HU211691A9 (en) | 1992-08-07 | 1995-06-30 | Recombinant adenovirus vaccines |
Family Applications After (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| HU95P/P00643P HU211691A9 (en) | 1992-08-07 | 1995-06-30 | Recombinant adenovirus vaccines |
Country Status (18)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0586076B1 (hu) |
| JP (1) | JP4093597B2 (hu) |
| KR (1) | KR100347219B1 (hu) |
| AT (1) | ATE243755T1 (hu) |
| AU (2) | AU680826B2 (hu) |
| BR (1) | BR9303226A (hu) |
| CA (1) | CA2101463C (hu) |
| DE (1) | DE69333057T2 (hu) |
| DK (1) | DK0586076T3 (hu) |
| ES (1) | ES2201055T3 (hu) |
| FI (1) | FI114318B (hu) |
| HK (1) | HK1009978A1 (hu) |
| HU (2) | HU214364B (hu) |
| IL (1) | IL106508A (hu) |
| MX (1) | MX9304765A (hu) |
| NZ (1) | NZ248328A (hu) |
| PT (1) | PT586076E (hu) |
| ZA (1) | ZA935355B (hu) |
Families Citing this family (18)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| ES2196018T3 (es) * | 1993-08-11 | 2003-12-16 | Wyeth Corp | Vacunas de adenovirus recombinantes. |
| IL113817A (en) * | 1994-06-30 | 2001-03-19 | Merck & Co Inc | Polynucleotide for vaccination against the umbilical cord virus |
| FR2727867B1 (fr) * | 1994-12-13 | 1997-01-31 | Rhone Poulenc Rorer Sa | Transfert de genes dans les motoneurones medullaires au moyen de vecteurs adenoviraux |
| JPH10512243A (ja) * | 1994-12-30 | 1998-11-24 | カイロン コーポレイション | 遺伝子送達ビヒクルの非外傷性投与 |
| KR100464395B1 (ko) * | 1997-10-13 | 2005-02-28 | 삼성전자주식회사 | 반도체소자의비아홀형성방법 |
| EP1200622A4 (en) | 1999-07-06 | 2004-12-22 | Merck & Co Inc | HIV VACCINE COMPRISING A GAG GENE VEHICLE ADENOVIRUS |
| US6733993B2 (en) | 2000-09-15 | 2004-05-11 | Merck & Co., Inc. | Enhanced first generation adenovirus vaccines expressing codon optimized HIV1-gag, pol, nef and modifications |
| US8926987B2 (en) | 2004-11-18 | 2015-01-06 | The Government Of The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services | Replication-competent adenoviral vectors |
| US9132031B2 (en) | 2006-09-26 | 2015-09-15 | Zeltiq Aesthetics, Inc. | Cooling device having a plurality of controllable cooling elements to provide a predetermined cooling profile |
| US20080287839A1 (en) | 2007-05-18 | 2008-11-20 | Juniper Medical, Inc. | Method of enhanced removal of heat from subcutaneous lipid-rich cells and treatment apparatus having an actuator |
| US8523927B2 (en) | 2007-07-13 | 2013-09-03 | Zeltiq Aesthetics, Inc. | System for treating lipid-rich regions |
| US8285390B2 (en) | 2007-08-21 | 2012-10-09 | Zeltiq Aesthetics, Inc. | Monitoring the cooling of subcutaneous lipid-rich cells, such as the cooling of adipose tissue |
| US8603073B2 (en) | 2008-12-17 | 2013-12-10 | Zeltiq Aesthetics, Inc. | Systems and methods with interrupt/resume capabilities for treating subcutaneous lipid-rich cells |
| EP2769703B1 (en) | 2009-04-30 | 2022-04-06 | Zeltiq Aesthetics, Inc. | Device for removing heat from subcutaneous lipid-rich cells |
| BR112012018521A2 (pt) | 2010-01-25 | 2019-09-24 | Zeltiq Aesthetics Inc | aplicadores para uso doméstico para remover de forma não invasiva calor de células subcutâneas ricas em lipídeos por meio de refrigerantes de mudança de fase, e dispositivos, sistemas e métodos associados |
| US8676338B2 (en) | 2010-07-20 | 2014-03-18 | Zeltiq Aesthetics, Inc. | Combined modality treatment systems, methods and apparatus for body contouring applications |
| US10722395B2 (en) | 2011-01-25 | 2020-07-28 | Zeltiq Aesthetics, Inc. | Devices, application systems and methods with localized heat flux zones for removing heat from subcutaneous lipid-rich cells |
| WO2020028472A1 (en) | 2018-07-31 | 2020-02-06 | Zeltiq Aesthetics, Inc. | Methods, devices, and systems for improving skin characteristics |
Family Cites Families (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4925784A (en) * | 1986-04-04 | 1990-05-15 | Hoffmann-La Roche Inc. | Expression and purification of an HTLV-III gag/env gene protein |
| US5585264A (en) * | 1988-07-15 | 1996-12-17 | University Of Saskatchewan | Nucleotide sequences encoding recombinant bovine herpesvirus type-1 GI, GIII and GIV polypeptides |
| GB8919102D0 (en) * | 1989-08-22 | 1989-10-04 | Oxford Virology Ltd | A recombinant adenovirus dna sequence,a recombinant adenovirus expressing the dna sequence and a rhabdovirus vaccine including the recombinant adenovirus |
| AU9179891A (en) * | 1990-12-19 | 1992-07-22 | Epitope, Inc. | Hiv reverse transcriptase vaccine |
| GB9114437D0 (en) * | 1991-07-03 | 1991-08-21 | Health Lab Service Board | Recombinant adenoviruses and the use thereof for detecting the presence in eukaryotic cells of the expression products of specific genes |
-
1993
- 1993-07-23 EP EP93305833A patent/EP0586076B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1993-07-23 DE DE69333057T patent/DE69333057T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1993-07-23 PT PT93305833T patent/PT586076E/pt unknown
- 1993-07-23 ES ES93305833T patent/ES2201055T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1993-07-23 AT AT93305833T patent/ATE243755T1/de not_active IP Right Cessation
- 1993-07-23 DK DK93305833T patent/DK0586076T3/da active
- 1993-07-23 ZA ZA935355A patent/ZA935355B/xx unknown
- 1993-07-28 CA CA002101463A patent/CA2101463C/en not_active Expired - Fee Related
- 1993-07-28 IL IL106508A patent/IL106508A/en not_active IP Right Cessation
- 1993-07-30 BR BR9303226A patent/BR9303226A/pt not_active Application Discontinuation
- 1993-08-04 NZ NZ248328A patent/NZ248328A/en not_active IP Right Cessation
- 1993-08-04 JP JP19341093A patent/JP4093597B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1993-08-05 MX MX9304765A patent/MX9304765A/es not_active IP Right Cessation
- 1993-08-06 KR KR1019930015236A patent/KR100347219B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1993-08-06 FI FI933495A patent/FI114318B/fi active IP Right Grant
- 1993-08-06 AU AU44465/93A patent/AU680826B2/en not_active Ceased
- 1993-08-06 HU HU9302285A patent/HU214364B/hu not_active IP Right Cessation
-
1995
- 1995-06-30 HU HU95P/P00643P patent/HU211691A9/hu unknown
-
1997
- 1997-08-18 AU AU34227/97A patent/AU715190B2/en not_active Ceased
-
1998
- 1998-09-19 HK HK98110746A patent/HK1009978A1/xx not_active IP Right Cessation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CA2101463A1 (en) | 1994-02-08 |
| HK1009978A1 (en) | 1999-06-11 |
| HU211691A9 (en) | 1995-12-28 |
| KR100347219B1 (ko) | 2003-02-25 |
| IL106508A0 (en) | 1993-11-15 |
| FI933495A0 (fi) | 1993-08-06 |
| FI933495A (fi) | 1994-02-08 |
| DE69333057T2 (de) | 2004-07-08 |
| PT586076E (pt) | 2003-11-28 |
| EP0586076A3 (en) | 1994-04-20 |
| IL106508A (en) | 1998-02-22 |
| CA2101463C (en) | 2007-03-13 |
| EP0586076A2 (en) | 1994-03-09 |
| DK0586076T3 (da) | 2003-10-20 |
| DE69333057D1 (de) | 2003-07-31 |
| MX9304765A (es) | 1995-01-31 |
| EP0586076B1 (en) | 2003-06-25 |
| KR940003566A (ko) | 1994-03-12 |
| FI114318B (fi) | 2004-09-30 |
| JPH06165689A (ja) | 1994-06-14 |
| ATE243755T1 (de) | 2003-07-15 |
| HU9302285D0 (en) | 1993-11-29 |
| ES2201055T3 (es) | 2004-03-16 |
| NZ248328A (en) | 1997-05-26 |
| HUT67302A (en) | 1995-03-28 |
| BR9303226A (pt) | 1994-03-08 |
| ZA935355B (en) | 1995-01-23 |
| AU715190B2 (en) | 2000-01-20 |
| AU3422797A (en) | 1997-11-20 |
| AU680826B2 (en) | 1997-08-14 |
| AU4446593A (en) | 1994-02-10 |
| JP4093597B2 (ja) | 2008-06-04 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US6511845B1 (en) | Methods for producing an immune response against HIV-1 | |
| US4920209A (en) | Oral vaccines | |
| HU214364B (hu) | Eljárás rekombináns adenovírus vakcinák előállítására | |
| NATUK et al. | Immunogenicity of recombinant human adenovirus-human immunodeficiency virus vaccines in chimpanzees | |
| US5614404A (en) | Self-assembled, defective, non-self-propagating lentivirus particles | |
| JP4805511B2 (ja) | Ｈｉｖに対する免疫応答における改善、または免疫応答に関する改善 | |
| US5698202A (en) | Replication-defective adenovirus human type 5 recombinant as a rabies vaccine carrier | |
| US5858726A (en) | Self-assembling replication defective hybrid virus particles | |
| US6051410A (en) | Self-assembled, defective, nonself-propagating viral particles | |
| GB2181435A (en) | Vaccines and immunoassays for acquired immune deficiency syndrome | |
| EP0817854A2 (en) | Antigen presentation system based on retrovirus-like particles | |
| WO1991019803A1 (en) | Self assembled, defective, nonself-propagating viral particles | |
| JP2017507672A (ja) | 複製型組み換えアデノウイルスベクター、組成物およびこれらの使用方法 | |
| GB2166349A (en) | Oral vaccines | |
| US20110123485A1 (en) | Viral vectors for delivering vaccines for hiv and other infectious diseases | |
| JP3034025B2 (ja) | 自己アセンブルド欠損非自己増殖性ウイルス粒子 | |
| Zhao et al. | Boosting of SIV-specific immune responses in rhesus macaques by repeated administration of Ad5hr–SIVenv/rev and Ad5hr–SIVgag recombinants | |
| EP0638316B1 (en) | Recombinant adenovirus vaccines | |
| US20030130187A1 (en) | Porcine adenovirus type 3 genome | |
| JP2006503800A (ja) | Ｈｉｖに対する強化された免疫応答を誘導する方法 | |
| AU5190900A (en) | Recombinant adenovirus vaccines | |
| JP2000333678A (ja) | 弱毒生エイズワクチン用の組換えｖｚｖ／ｈｉｖとその作製方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| HMM4 | Cancellation of final prot. due to non-payment of fee |