JP2000333678A - 弱毒生エイズワクチン用の組換えｖｚｖ／ｈｉｖとその作製方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 安全かつ有効な生エイズワクチンの有効成分
として適格の弱毒ウイルスとその製造方法を提供し、エ
イズ蔓延の制圧に寄与する。また、２価の生ワクチンを
提供し予防接種の省力化を図る。 【解決手段】 現行の弱毒生水痘ワクチンの有効成分と
して公認の弱毒ＶＺＶ岡株ゲノムのＴＫ遺伝子内にＨＩ
ＶのＥｎｖ遺伝子を挿入連係し作出された組換えＶＺＶ
／ＨＩＶ岡株とその作製方法。この組換え体を有効成分
として用いる弱毒生エイズワクチン、及びエイズと水痘
に対する免疫を併せて同時に発揮する２価の弱毒生ワク
チン。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は弱毒生エイズワクチンの
有効成分として適格な組換え水痘／ＡＩＤＳウイルスな
いしは組換えＶＺＶ／ＨＩＶとその作製方法に関するも
のであり、これより得られる組換えＶＺＶ／ＨＩＶとそ
の抗原並びに遺伝子ＤＮＡは、エイズの予防と治療に有
用であるのみならず、免疫学的診断剤、遺伝子診断剤、
遺伝子工学試薬等としても利用できる。

【０００２】

【従来の技術】［略記の説明］この明細書で使用する次
の各略記はそれぞれ、（ ）内に記載の用語を意味す
る：ＶＺＶ（水痘ウイルス）、ＨＩＶ（ヒト免疫不全ウ
イルス）、ＳＩＶ（サル免疫不全ウイルス）、ＨＢＶ
（Ｂ型肝炎ウイルス）、ＴＫ（チミジンキナーゼ）、Ｅ
ｎｖ（エンベロープ），ｔｋ（ＴＫ遺伝子）、ｅｎｖ
（Ｅｎｖ遺伝子）、ｇｐ（糖タンパク質）、ｐ（タンパ
ク質）、及びＨＢｓ（ＨＢＶ表面抗原）。 ［ウイルスベクターに関する技術］ワクチニアウイルス
やＶＺＶ等の種々のウイルスゲノムを、異種遺伝子ある
いは外来遺伝子の発現ベクターとして用いる技術開発の
経緯は、本願発明者らによる過去の組換えＶＺＶ／ＨＢ
Ｖに係る特許発明の明細書（米国特許第５，６５３，９
７６号公報、欧州特許第０５１０９９６号公報等）に詳
述されているので省略する。 ［異種遺伝子発現ベクターとしての弱毒ＶＺＶ岡株］Ｖ
ＺＶは通常その感染性が生細胞内でのみ維持される細胞
依存性ウイルス（ｃｅｌｌ−ａｓｓｏｓｉａｔｅｄ ｖ
ｉｒｕｓ）であり、該ウイルスの分離、試験管内での培
養・継代、及び量産はいずれも困難であるため、ＶＺＶ
ワクチン及び診断剤の開発は言うに及ばず、水痘の病原
体としてのＶＺＶの基礎及び臨床研究は躊躇される傾向
にあった。そのため、ＶＺＶの研究は、本発明者の高橋
らが１９７４年に細胞遊離（ｃｅｌｌ−ｆｒｅｅ）の、
生水痘ワクチン用の弱毒ＶＺＶ岡株を確立するまで（Ｔ
ｈｅ Ｌａｎｃｅｔ，２，ｐｐ．１２８８−１２９０，
１９７４；特公昭５１−１９０１８号公報；特公昭５３
−４１２０２号公報；及び米国特許第３，９８５，６１
５号公報）、遅々として進展していなかった。しかし、
上記の弱毒ＶＺＶ岡株を用いる生ワクチンの開発が契機
となり、爾来、世界各地でＶＺＶの基礎と臨床並びに応
用研究が急速に展開され、現在では、この弱毒ＶＺＶ岡
株を有効成分として用いる弱毒生水痘ワクチンが世界各
国で広く実用に供されている［Ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔ
ｓ ｆｏｒ ＶａｒｅｃｅｌｌａＶａｃｃｉｎｅ（Ｌｉ
ｖｅ），Ａｄｏｐｔｅｄ １９８４，Ｒｅｖｉｓｅｄ
１９９３：ＷＨＯ Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ Ｒｅｐｏｒｔ
Ｓｅｒｉｅｓ，Ｎｏ．８４８，ｐｐ．２２−５２（Ａ
ｎｎｅｘ １），１９９４］。また、ＶＺＶの基礎、臨
床、診断、疫学等に係るデータも既に多様に蓄積されて
いる［“Ｖｉｒｏｌｏｇｙ”、第３版、第２巻、第２５
２５−２５８５頁、Ｎ．Ｆｉｅｌｄｓら編、Ｌｉｐｐｉ
ｎｃｏｔｔ− Ｒａｖｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ（Ｕ
ＳＡ）１９９６年発行］。就中、ＶＺＶゲノムの構造解
析に関しては、１９８０年代に入り、遺伝子のクローニ
ングとその発現、遺伝子解析、モノクローナル抗体等の
技術の発展と普及に伴い、ＶＺＶゲノムＤＮＡの制限酵
素地図、全塩基配列決定、ＶＺＶ株間の遺伝子の比較等
（例えば，欧州公開特許第０８３９９１１号公報）によ
り、長足の進歩を遂げている。ところで、上記の文献に
基づくＶＺＶに関するウイルス学上の主な知見は次の通
りである：ＶＺＶ（ｈｕｍａｎ ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕ
ｓ ３，又はｖａｒｉｃｅｌｌａ−ｚｏｓｔｅｒ ｖｉ
ｒｕｓ １）は、エンベロープを有し、分類学的にはヘ
ルペスウイルス科アルファヘルペス亜科Ｖａｒｉｃｅｌ
ｌｏｖｉｒｕｓ属に属する直径が約１８０−２００ｎｍ
のＤＮＡ型ウイルスである。そのゲノムは、長さが約１
２０ｋｂ（ｋｉｌｏｂａｓｅ）の線状の２本鎖ＤＮＡか
らなり、ヌクレオキャブシド内部の直径約７５ｎｍのド
ーナツ状のコアに内在している。このゲノムＤＮＡには
合計７１個のＯＲＦ（ｏｐｅｎ ｒｅａｄｉｎｇ ｆｒ
ａｍｅ）が存在し、５′から３′末端方向に順に１から
７１まで番号が付されている。これ等の遺伝子のうち、
ＯＲＦ３６（又は遺伝子３６）は、チミジンキナーゼを
コードする遺伝子（ｔｋ、即ちＴＫ遺伝子）であり、Ｖ
ＺＶのｉｎ ｖｉｔｒｏ増殖には必須でなく、その長さ
は約１ｋｂで，ＶＺＶゲノム全長のほぼ中央部に位置す
る。 ［外来遺伝子の発現を目的として構築された組換えＶＺ
Ｖ］ＶＺＶのｇｐＩ遺伝子プロモーターの下流領域にＥ
ＢＶ（エプスタイン・バーウイルス）のｇｐ３５０−ｇ
ｐ２２０遺伝子を挿入連係して作出した組換えＶＺＶ
（特開昭６３−１４１５８９号公報又は欧州公開特許第
２６００１２号公報；Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏ
ｌｏｇｙ，６１，１７９６−１８０７，１９８７）、Ｖ
ＺＶのｇｐＩ遺伝子プロモーターの下流にＥＢＶのｇｐ
３５０−ｇｐ２２０遺伝子、又はＨＢＶのＰｒｅＳ１−
ＰｒｅＳ２−ＨＢｓ遺伝子を連結し構築したカセット遺
伝子断片を更にＶＺＶのｔｋ内に挿入連係し、これ等の
ＥＢＶ又はＨＢＶ各遺伝子をＴＫとの融合蛋白として発
現させるよう作成した組換えＶＺＶ［欧州公開特許第２
５１５３４号公報；Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔ
ｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃ
ｉｅｎｃｅｓ（ＵＳＡ），８４，３８９６−３９００，
１９８７］、ＶＺＶのｔｋプロモーターの直接支配下に
ＨＢＶのＰｒｅＳ２（部分）−ＨＢｓを挿入連係し作成
した組換えＶＺＶ（米国特許第５，６５３，９７６号公
報又は欧州特許第０５１０９９６号公報）等が公知であ
る．しかしながら，弱毒生エイズワクチンの有効成分と
して適格な組換えＶＺＶ，即ち、組換えＶＺＶ／ＨＩＶ
は未だ知られていない。 ［エイズの病原体としてのＨＩＶ］最初のエイズ症例が
１９８１年に米国で確認されて以来、１９９８年１１月
１５日現在、報告された全世界のエイズ患者総数は、既
に約２００万例にも達しつつある（ＷＨＯ Ｗｅｅｋｌ
ｙ Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｃｏｒｄ，
Ｎｏ．４８，２７ Ｎｏｖｅｍｂｅｒ １９９８）。エ
イズは，ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）の感染による
ＣＤ４^＋Ｔリンパ球の減少に伴う免疫不全を生じ、種々
の感染因子や悪性腫瘍による日和見疾患をもたらす。ま
た、ＨＩＶ感染による原発性の脳症に伴う痴呆が症例の
半数以上で観察されている。かかるエイズ蔓延の制圧は
人類にとって緊急かつ最重要課題であり、１９８３年に
エイズの病原体ＬＡＶ（又はＨＩＶ）が分離されて以
来、エイズの研究は世界各地で極めて集中的かつ精力的
に展開され既に、これに係る膨大な量のウイルス学的知
見が得られている［“Ｖｉｒｏｌｏｇｙ”、第３版、第
２巻、第２５２５−２５８５頁、Ｎ．Ｆｉｅｌｄｓら
編、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ− Ｒａｖｅｎ Ｐｕｂｌｉ
ｓｈｅｒｓ（ＵＳＡ）１９９６年発行］。上記文献によ
れば、ＨＩＶは、レトロウイル科レンチウイルス属に属
し、ＨＩＶ−１とＨＩＶ−２の２種に大別され、直径が
８０−１００ｎｍの球状であり、エンベロープを有す
る。ＨＩＶゲノムは、約９．７ｋｂの線状単鎖のＲＮＡ
であり、逆転写酵素及びビリオン内部（コア）の構造タ
ンパク質と複合体を形成し、プライマーｔＲＮＡと共に
ウイルス粒子に内在し、ｇａｇ、ｐｏｌ、ｅｎｖ、ｒｅ
ｖ、ｔａｔ、ｎｅｆ等の合計１０種の遺伝子で構成され
ている。基本的には、ウイルス増殖に必須のビリオン構
成成分をコードする３つの主要な遺伝子、即ち、コアの
構造タンパク質（ｐ１７，ｐ２４、及びｐ９）の前駆体
をコードするｇａｇ（ｇｒｏｕｐ−ｓｐｅｃｉｆｉｃａ
ｎｔｉｇｅｎｓ）、３種の酵素（プロテアーゼ、逆転写
酵素、及びインテグラーゼ）の前駆体をコードするｐｏ
ｌ（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）、及びエンベロープ糖タン
パク質（ｇｐ１２０とｇｐ４１）の前駆体をコードする
ｅｎｖ（ｅｎｖｅｌｏｐｅ）の各遺伝子が、５′から
３′方向に，ｇａｇ（隣接領域のコドンが互いに重複）
ｐｏｌ…ｅｎｖの順に並んでいる。これ等のうち、ＨＩ
Ｖ−１のｅｎｖは、株により多少異なるが、８５０−８
８０アミノ酸からなるエンベロープ糖タンパク質（Ｅｎ
ｖ）をコードしている。かかるＥｎｖは、前駆体として
ｇｐ１６０のかたちで発現かつ糖鎖修飾された後、細胞
性プロテアーゼにより，ｇｐ１２０（ｓｕｒｆａｃｅ糖
タンパク質：ＳＵサブユニット）とｇｐ４１（ｔｒａｎ
ｓｍｅｍｂｒａｎ糖タンパク質：ＴＭサブユニット）と
に開裂される。ｇｐ１２０は細胞へのＨＩＶ粒子の吸着
に、また、ｇｐ４１は細胞への該粒子の融合と侵入にそ
れぞれ関与すると考えられている。なお、ｇｐ１２０に
は、Ｎ末端にシグナルペプチド（Ｓ：シグナル発揮の
後、細胞内プロテアーゼで切除される）が、更に、５つ
の高度可変領域（Ｖ１〜Ｖ５：ｈｙｐｅｒｖａｒｉａｂ
ｌｅ）、６つの保存領域、及び４つのＣＤ４結合サイト
（Ｃ：ＣＤ４レセプターへの結合に関与する）がそれぞ
れ存在する。特にＶ３は免疫原性の主要エピトープであ
り、ＨＩＶ株間のＶ３エピトープ変異は細胞への親和性
に影響を及ぼす。また、ｇｐ４１には、Ｎ末端側に融合
ドメイン（Ｆ）が、更に、ロイシンジッパー（Ｚ）、Ｔ
Ｍドメトン、及び２つのレンチウイルス溶解ペプチド
（Ｌ：細胞溶解を生じる）がそれぞれ存在する。上記の
概要をＮからＣ末端方向に左から右へ以下に示す（な
お、☆はＳの切除サイト、また，＊はｇｐ１６０の開裂
サイトを各々意味する）： Ｓ☆−Ｖ１−Ｖ２−Ｃ−Ｖ３−Ｃ−Ｖ４−Ｃ−Ｃ−Ｖ５
−＊ ＊Ｆ−Ｚ−Ｔ−Ｌ−Ｌ ［エイズワクチン］既に前臨床試験あるいは臨床試験に
供されているワクチンとして、例えば、以下に示す種々
の形態のワクチンが知られている［Ｔｈｅ Ｊｏｒｄａ
ｎ Ｒｅｐｏｒｔ ９８，ｐｐ．６６−６９，及びｐ
ｐ．１０９−１１３，１９９８年（米国ＮＩＨ）発
行］。 （ａ）ブユニットワクチン（２２種）：ＨＩＶのｇｐ１
２０，ｇｐ１６０，ｐ２４，逆転写酵素、Ｔａｔ等のＨ
ＩＶサブユニットを用いる； （ｂ）合成ペプチドワクチン（２７種）：Ｖ３、Ｖ２、
ｐ２４−Ｖ３、ＣＤ４結合ドメイン等の合成ペプチドを
用いる； （ｃ）粒子ワクチン（１０種）：不活化ＨＩＶ−１、Ｇ
ａｇ、Ｐｏｌ、Ｅｎｖ、ｐ１７−ｐ２４等の粒子を用い
る； （ｄ）組換え感染性ベクターワクチン（４０種）：Ｇａ
ｇ−Ｖ３、ｇｐ１６０、ｐ２４等の遺伝子を組込んだワ
クチニア、ポリオ、アデノ等のウイルスやサルモネラ、
ＢＣＧ、ラクトコッカス等の組換え体； （ｅ）ＤＮＡワクチン（１１種）：ｇｐ１６０、ｇｐ１
２０、Ｎｅｆ、Ｔａｔ等の遺伝子を組込んだプラスミ
ド； （ｆ）レトロウイルスベクターワクチン（３種）：Ｅｎ
ｖ、Ｒｅｖ等を発現する組換えレトロウイルス、治療
用； （ｇ）ＣＤ４ワクチン（１種）：組換えＣＤ４タンパク
質を免疫原として用いる、治療用； （ｈ）抗イディオタイプワクチン（２種）：抗ｇｐ１２
０や抗ＣＤ４イディオタイプを用いる、治療用； （ｉ）植物生産ワクチン（３種）：Ｖ３、ｇｐ４１等の
遺伝子を植物ウイルスゲノムに組込み、これ等を植物で
培養産生した抗原を用いる； （ｊ）生ワクチン（３種）：弱毒ＨＩＶや組換えＨＩＶ
／ＳＩＶ弱毒株を用いる等々。 これ等のワクチンの効果は、中和抗体やＣＴＬ（ｃｙｔ
ｏｔｏｘｉｃ Ｔ ｌｙｍｐｏｃｙｔｅ）の誘導、Ｔ細
胞のヘルパー活性、Ｋ（キラー）細胞によるＡＤＣＣ
（ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｃｅｌｌ−
ｍｅｄｉａｔｅｄｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ）等の観点
から種々検討されている。しかし、最終の前臨床の動物
実験系は、ＨＩＶ−１ではチンパンジーやオランウータ
ン等の類人猿に、また、ＨＩＶ−２やＳＩＶでもアカゲ
ザル、マカクザル、ブタオザル等の霊長類に限定される
ため、これ等の動物の確保は容易ではなく、その上、こ
れ等の動物、他の実験動物、ｉｎ ｖｉｔｒｏ試験、及
びヒトとの相互の感受性の相違は、予測不能の実験誤差
や誤認判定をもたらすので、かかるワクチンの安全性と
効果の両者の確認は難渋である。なお、いわゆる不活化
ワクチン［上記（ａ）〜（ｃ）及び（ｇ）〜（ｉ）］は
安全ではあるが免疫原性や効果の確保に更なる創意工夫
を要するため、また、ＤＮＡワクチン［上記（ｅ）］は
安全性と効果が共に現状では未知あるいはみ未確定であ
るので，かかるワクチンは未だ実用化の域に達していな
い。更に、弱毒ＨＩＶを有効成分として用いる生エイズ
ワクチン［上記（ｊ）］の開発は、躊躇される。なぜな
ら、ＨＩＶの病原性の発現には長期間を要するので、た
とえ弱毒ＨＩＶ候補株が得られても、その弱毒性の証明
が困難であり、また、潜伏感染の成立と毒性復帰変異の
否定が難渋あるいは不能であり、生ワクチンとしての安
全性の保証が確保され得ない。従って、現状では、かか
る生ワクチンはヒトを対象として使用されるべきではな
いと一般に考えられている。なお、上記（ｄ）と（ｆ）
については、いわゆる組換え体ワクチンとして、以下に
詳述する。 ［組換え体を有効成分として用いる生エイズワクチン］
いわゆる組換え体を有効成分とする生エイズワクチンと
しては、次のものが知られている［Ｔｈｅ Ｊｏｒｄａ
ｎ Ｒｅｐｏｒｔ ９８，ｐｐ．１０９−１１３，１９
９８年（米国ＮＩＨ）発行；及び“Ｖａｃｃｉｎｅ”、
第２版、第８２３−８６６頁、Ｓ．Ａ．ｐｌｏｔｏｋｉ
ｎ及びＥ．Ａ．Ｍｏｒｔｉｍｅｒ著、Ｗ．Ｂ．Ｓａｕｎ
ｄｅｒｓ Ｃｏ．１９９４年発行］：例えば、ＨＩＶの
ｇｐ１２０、ｇｐ１２５、ｇｐ１３０、ｇｐ１６０、Ｇ
ａｇ、Ｐｏｌ、Ｅｎｖ、Ｖ３、ｐ２７、Ｎｅｆ等をコー
ドする遺伝子を組込んだワクチニアウイルス（ＰＣＴ公
表特許ＷＯ ９７／２７３１１号公報）、カナリア痘ウ
イルス（米国特許第５，７６６，５９８号公報、及び米
国特許第５，８６３，５４２号公報）、ＳＩＶ（米国特
許第５，６５４，１９５号公報）、アデノウイルス（欧
州公開特許第０６３８３１６号公報）、ヒトライノウイ
ルス（米国特許第５，７１４，３７４号公報）、ポリオ
ウイルス、メンゴウイルス、マウスメンゴウイルス、イ
ンフルエンザウイルス、ヘネズエラウマ脳炎ウイルス、
セルミキホレストウイルス、水庖性口炎ウイルス、ブル
セラ、サルモネラ、ＢＣＧ、ラクトコッカス、リステリ
ア等の組換体を有効成分として用いる生エイズワクチ
ン。しかし、これ等の組換え体を有効成分として用いる
生ワクチンの安全性と有効性の確認に関する報告、ま
た、市場化の動向は現在いずれも知られていないので、
未だ実用の域には到達していないと判断される。その理
由については、既に前述した。従って、安全かつ有効な
弱毒生ウイズワクチンの実用化は、人類にとって待望か
つ緊急の最重要課題である。

【０００３】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、前述の組
換えＶＺＶ／ＨＢｓ−ＰｒｅＳ２（部分）を完成した１
９９１年以来、そこでの経験を生かすと共に、上述の従
来技術において山積する難点の渦中にあって、実に７年
余にもわたる試行錯誤の結果、弱毒生エイズワクチンの
有効成分として優れて適格な組換えＶＺＶ／ＨＩＶ岡株
を完成した。本発明によれば、ＨＩＶのＥｎｖ抗原を発
現する組換えＶＺＶ／ＨＩＶ岡株とその作製方法、並び
にかかる組換え岡株を培養し製造される弱毒生エイズワ
クチンや診断剤、試薬等が提供される。特筆すべきは、
この発明に係る組換えＶＺＶ／ＨＩＶ岡株ウイルスは、
エイズの予防と治療に適格な生エイズワクチンと、生水
痘ワクチンの両者の機能を同時に併せて発揮することに
ある。以下、その構成につき説明する。

【０００４】［組換えＶＺＶ／ＨＩＶ作出の留意点］こ
の発明の完成に７年余を要した理由としては、特に、後
述するＶＺＶ−ＨＩＶ遺伝子を保有のキメラプラスミド
の構築が極めて困難であったことが上げられる。即ち、
本発明の筆頭発明者の体験によれば、ＶＺＶからクロー
ニングしたｔｋ遺伝子のプローモータ下流にＨＩＶのＥ
ｎｖ遺伝子の制限酵素断片を連係挿入し構築したキメラ
プラスミドを増幅すると、ｅｎｖの制限酵素サイトは維
持されているにも拘らず、その制限酵素断片の全長が短
くなり、目的とするｅｎｖの制限酵素断片の増幅が不可
能であった。例えば、キメラプラスミドを増幅すると、
そこに予め連係挿入した約２．５ｋｂのｅｎｖ制限酵素
断片は、増幅後に短くなり約１ｋｂになった。その理由
は、本発明者らの深い学識経験と遜色のない勤勉を以て
しても、未だ不明である。しかしながら、かかる未踏の
障壁は、挿入連係するｅｎｖ制限酵素断片を短くすると
共に、本発明者らがＶＺＶのＴＫ遺伝子プロモータ下流
にＨＢｓ−ＰｒｅＳ２（部分）を挿入連係し構築したキ
メラプラスミドｐＨＨ（米国特許第５，６５３，９７６
号公報又は欧州特許第０５１０９９６号公報）を用いる
ことにより克服された。例えば、ｐＨＨが保有のＨＢｓ
−ＰｒｅＳ２（部分）遺伝子の領域の制限酵素断片とＨ
ＩＶｅｎｖのそれとを置換することにより解決できる。

【０００５】ＶＺＶの取り扱いに関し、通常のゲノムの
長さが約１０ｋｂである小型ウイルスに比べ、前述の通
り、ＶＺＶは大型であり、その感染性ゲノムは約１２０
ｋｂと極めて長く、斯かるＤＮＡ長鎖は切断され易く不
安定である；また、ＶＺＶは本来、熱に極めて不安定な
細胞依存性ウイルスであり、その感染性維持には−６０
℃以下での保存を必須する等、その取扱い、培養、量産
等が容易ではない；更に、ウイルス培養における１細胞
当たりの感染性ウイルス粒子生産数に関し、他のウイル
スが通常、約１０−１００粒子であるのに対し、ＶＺＶ
では約０．１個と生産収率が極めて低い；等々の理由に
より、ＶＺＶ培養によるゲノムの量産のみならず、試験
研究段階での使用に耐えるＶＺＶ遺伝子ＤＮＡの調製と
クローニングは甚だ困難であり、かつ、産業利用上、質
と量共に適格な組換えＶＺＶを選別採取する確率が極め
て低い。換言すれば、組換えＶＺＶ株の確立には、斯か
る著しく難渋な条件を克服する必要がある。従って，産
業上利用の観点から、量産コストに見合った遺伝子発現
機能を有し、しかも、かかる発現能が継代下で遺伝学的
に安定であり、かつ、生ワクチンの有効成分として適格
な安全性と有効性を兼備した組換えＶＺＶ株の完成に
は、机上の論理を絶する未踏の暗中での模索と綿密な創
意、そして多大の勤勉を要することが理解されるべきで
ある．

【０００６】［ウイルスベクターとしてのＶＺＶ株］本
発明では、安全性、有効性及び均質性を併有する弱毒生
エイズワクチン株ウイルスの作出を主な目的とし、ベク
チターとしてのＶＺＶゲノムにＨＩＶ遺伝子を挿入連係
することにより組換えＶＺＶ／ＨＩＶを構築する。本発
明でよれば、ＶＺＶとして、例えば、岡（ＡＴＣＣ Ｖ
Ｒ−７９５）、Ｗｅｂｓｔｅｒ（ＡＴＣＣ ＶＲ−９１
６）、Ｅｌｌｅｎ（ＡＴＣＣ ＶＲ−５８６）、ＹＳ、
ＹＧ、ｓｃｏｔｔ、河口、Ｄｕｍａｓ等の既存の公知株
（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｖｉｒｏｌ
ｏｇｙ，６７，１８１６−１８２９，１９８６：ウイル
ス，３７，７１−８０，１９８７）の各株や将来分離さ
れるＶＺＶ株等を随意に使用できる。これ等のＶＺＶ株
のうち、試験研究や製造上での取扱いでの安全性の確
保、及び安全性と有効性とを兼備した生ワクチンや診断
剤の提供等の産業上利用を考慮すると、弱毒ＶＺＶ株の
使用が望ましい。特に、上記の主目的の観点から、弱毒
ＶＺＶ岡株は、水痘生ワクチン株［Ｒｅｑｕｉｒｅｍｅ
ｎｔｓ ｆｏｒ Ｖａｒｅｃｅｌｌａ Ｖａｃｃｉｎｅ
（Ｌｉｖｅ），Ａｄｏｐｔｅｄ １９８４，Ｒｅｖｉｓ
ｅｄ １９９３：ＷＨＯ Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ Ｒｅｐ
ｏｒｔＳｅｒｉｅｓ，Ｎｏ．８４８，ｐｐ．２２−５２
（Ａｎｎｅｘ １），１９９４］として、その安全性と
有効性が世界的に確定かつ公認され、現在、世界のレベ
ルで使用されている唯一のＤＮＡ型の弱毒ウイルスであ
るため、外来遺伝子の発現ベクターとして最適である。

【０００７】［ＶＺＶの培養とその宿主細胞の選択］ヒ
ト、サル、モルモット等に由来のＶＺＶ感受性の公知の
細胞を使用できる。これ等の細胞のうち、迷入因子や癌
原性因子の混入の確率、ワクチン用ウイルス株培養の細
胞としての適格性、産生ウイルス量等を考慮すると、生
ワクチン製造用として公認のヒト２倍体細胞、例えば、
ＨＥＬ２９９（ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＣＣＬ １３７）、Ｍ
ＲＣ−５（ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＣＣＬ １１７）、ＷＩ−
３８（ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＣＣＬ ７５）等の使用が望ま
しい。細胞培養の増殖と維持両培地、及びウイルス培養
培地として、市販の合成培地、例えば、１９９培地［Ｄ
ｉｆｃｏ社（米国）製］、ＭＥＭ培地［Ｇｉｂｃｏ社
（米国）製］等を使用できる。かかる培地は使用直前
に、約７％（Ｗ／Ｖ）のＮａＨＣＯ_３水溶液を滴下混合
してｐＨを約６．８−８．０に調整の後、更に、市販の
ウシ胎児血清［例えば、Ｆｌｏｗ社（米国）製］を最終
濃度が約２−１５％（Ｗ／Ｖ）になるよう追加して添加
混合し、培養に供する。ＶＺＶの培養は、予め調製した
細胞培養にそのシードウイルスを接種した後、維持培地
を用いて行う。培養温度は２５−４０℃、好ましくは、
３３−３８℃が推奨される。

【０００８】［ＨＩＶ遺伝子を挿入連係するＶＺＶ遺伝
子の選択］ＨＩＶ遺伝子を挿入連係する際の留意点とし
て、挿入連係されたＶＺＶ遺伝子のプロモーターが機能
できるよう、プロモーターの下流を占めるＯＲＦ領域に
ＨＩＶ遺伝子を挿入連係する；及び翻訳が円滑に進行す
るようＶＺＶ遺伝子とＨＩＶ遺伝子相互のコドンを破壊
することなく挿入連係する等である。また、ＨＩＶ遺伝
子が挿入連係された遺伝子は破壊され本来の機能を発揮
しなくなることがあるので、ウイルスの感染性や増殖性
に影響を及ぼさない遺伝子で、しかも、多量発現能を有
する（プロモーターの強度の強い）遺伝子、例えば、ｔ
ｋやｇｐ遺伝子等の採用が望ましい。特に、弱毒ＶＺＶ
岡株を用いる場合には、遺伝子１４（ｇｐＶ遺伝子）の
欠損又は発現機能の低下（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉ
ｒｏｌｏｇｙ，６４，４５４０−４５４８，１９９０）
が知られているため、この遺伝子の使用は推奨できな
い。また、遺伝子６２の変異は上記の弱毒岡株に特異な
弱毒マーカーであるので（ＰＣＴ公表特許ＷＯ ９７／
４３４２０号公報）、この遺伝子の使用も推奨できな
い。しかし、野生株の遺伝子１４や遺伝子６２の使用は
可能であり、そのプロモーターの下流にＨＩＶ遺伝子を
挿入連係することにより、これ等の遺伝子の破壊や機能
低下の惹起が可能であるので、これより得られる組換え
ＶＺＶは、弱毒ＶＺＶ岡株に類似の弱毒株として極めて
高い有用性が期待される。

【０００９】［ＶＺＶ遺伝子内に挿入連係するＨＩＶ遺
伝子の選択］ＨＩＶのＥｎｖ遺伝子の部分を用いる。ｅ
ｎｖは，分離かつ同定された種々のＨＩＶ株からクロー
ニングし、用いることができる。例えば、ＨＩＶ−１プ
ロゲノムクローンであるｐＮＬ４−３（Ｊｏｕｒｎａｌ
ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，５９，ｐｐ．２４８−２９
１，１９８６；ＧｅｎｅＢａｎｋ，Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ
Ｎｏ．Ｍ１９９２１）、上記ｐＮＬ４−３のｅｎｖの
全長を保有する大腸菌ＪＭ１０９／ｐＮＳ２１０（微工
研条寄第３０２０号）等を利用できる。なお、上記プラ
スミドｐＮＳ２１０が保有のｅｎｖがコードするＥｎｖ
全長のアミノ酸配列は、配列番号１と配列番号２に示す
通りである。ところで、ｅｎｖの部分については以下に
留意し、慎重に選定する必要がある：即ち、作出した組
換えＶＺＶ／ＨＩＶの弱毒生ワクチン株としての安全性
の保証を確保するため、毒性物質、為害作用物質、毒素
等をコードする遺伝子領域が連座しないよう細心の注意
を払い、例えば、細胞へのＨＩＶの吸着や侵入に関与す
る融合ドメインや細胞溶解ペプチドをコードする領域は
制限酵素で切除し、採用しないこと；弱毒組換えＶＺＶ
／ＨＩＶが、ＶＺＶに係る両者の抗原性と免疫原性を併
有し、しかも、予防と治療のための生ワクチンの効果と
てしの中和抗体やＣＴＬの誘導、Ｔ細胞のヘルパー活
性、Ｋ細胞によるＡＤＣＣ等を優れて発揮し、エイズと
水痘に対する同時両免疫が可能な２価生ワクチンの適格
な有効成分として、また、ＨＩＶとＶＺＶ両抗原からな
る診断用の２価抗原として実用に供し得ること。本発明
によれば、以上の条件を満たすＨＩＶｅｎｖの部分とし
ては、少なくとも１つのＣＤ４結合サイトをコードする
と共に、更に、次に示すアミノ酸番号の領域のうち、少
なくとも１つの高度可変領域（Ｖ１〜Ｖ５）、好ましく
は少なくともＶ３をコードする遺伝子断片の採用が望ま
しい。なお、この明細書でのコドン番号（アミノ酸番
号）の記載は、配列番号１の記載に基づき、Ｅｎｖ遺伝
子の開始コドンａｔｇ（メチオニン）を起点、即ち、第
１番コドン（第１番アミノ酸）として序数付けされてい
る。シグナルペプチド（第１番〜第２８番アミノ酸）が
切除された後のｇｐ１２０のＮ末端のコドンａｇｔ（セ
リン）、即ち、配列番号１に基づく第２９番コドン（第
２９番アミノ酸）を起点にしていない。 第１番〜第５０８番 （ｇｐ１２０）； 第１番〜第２８番 （シグナルペプチド）； 第２９番〜第５０８番 （シグナルペプチド切除後の
ｇｐ１２０）； 第１３４番〜第１５１番 （Ｖ１）； 第１８５番〜第１８８番 （Ｖ２）； 第３０３番〜第３０９番 （Ｖ３）； 第３９４番〜第４０１番 （Ｖ４）；及び 第４５８番〜第４６３番 （Ｖ５）。 例えば、ＨＩＶｅｎｖの部分として、第２９番〜第５０
８番、第１３０番〜第４７０番、第１６５番〜第５０３
番、第２９６番〜第４６３番等々の各アミノ酸配列をコ
ードするＨＩＶｅｎｖ断片の採用が適している。但し、
これ等のｅｎｖ断片にのみ限定されず、上記の諸条件を
満たす限り随意に選定かつ採用できる。なお、ＨＩＶ株
が異なる場合、採用するＨＩＶｅｎｖの選定は、その株
の遺伝子解析に基づくＥｎｖのアミノ酸配列と、前述の
配列番号１との間のアミノ酸配列ホモロジーの検索結果
に基づき、ＣＤ４結合サイトと高度可変領域（Ｖ１〜Ｖ
５）をそれぞれ決定することにより行うことができる。

【００１０】［組換えＶＺＶの作製］次の手順で行う。
ＨＩＶ遺伝子を挿入連係しようとするＶＺＶ遺伝子のク
ローニンク；ＨＩＶ遺伝子のクローニング；クローニン
グしたＶＺＶ遺伝子にＨＩＶ遺伝子を挿入連係したキメ
ラプラスミドの構築；斯かるキメラプラスミドとＶＺＶ
ゲノムとの間の組換えによる、組換えＶＺＶ／ＨＩＶの
作出。以下、この順序で説明する。

【００１１】（１）ＶＺＶ遺伝子のクローニング 後述の実施例１に記載の要領でＶＺＶゲノムＤＮＡをそ
の感染細胞から抽出精製の後、このＤＮＡを制限酵素で
消化し、常法のアガロースゲル電気泳動で分画し調製し
たＶＺＶ遺伝子ＤＮＡ断片を、市販又は公知のベクター
とその宿主（Ｐ．Ｈ．Ｐｏｕｗｅｌｓ著，“Ｃｌｏｎｉ
ｎｇ Ｖｅｃｔｏｒ−Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａ
ｎｕａｌ”，全２巻，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ １９８５年発
行）を用いて、ベクターの制限酵素サイトにクローニン
グする。例えば、ＶＺＶのｔｋは、ＶＺＶゲノムを制限
酵素ＳａｃＩで消化して調製したＨ断片（Ｉｎｔｅｒｖ
ｉｒｏｌｏｇｙ，２９，３０１−３１０，１９８８）を
大腸菌プラスミド−ベクターｐＵＣ１２［Ｍｅｔｈｏｄ
ｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．１０１，ｐ
ｐ．２０−７８，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ（米
国）１９８３年発行］のＳａｃＩサイトに挿入連係の
後、これを大腸菌ＪＭ１０９株（ＡＴＣＣ Ｎｏ．５３
３２３）に移入して形質転換させることにより、クロー
ニングできる。また、この工程の簡略化には、既にクロ
ーニング済みのＶＺＶ遺伝子（例えば、Ｊｏｕｒｎａｌ
ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，６７，１８１７−１８２
９，１９８６）を利用できる。

【００１２】（２）ＨＩＶｅｎｖのクローニングとｅｎ
ｖ断片の調製 クローニング済みのｅｎｖを利用できる。ｅｎｖ断片
は、例えば、前述のｐＮＬ４−３やｐＮＳ２１０等が保
有のｅｎｖＤＮＡを鋳型とし、所望のｅｎｖ断片の塩基
配列に基づき合成したプライマーを用いるＰＣＲ法によ
りその断片を増幅の後、これをアガロースゲル電気泳動
にかけ回収することにより調製できる。

【００１３】（３）ＶＺＶ−ＨＩＶ遺伝子のキメラプラ
スミドの構築 上述（１）の要領でＶＺＶ遺伝子をクローニングしたベ
クター内のＶＺＶ遺伝子の下流領域を制限酵素で開裂
し、その開裂サイトに、上記（２）でクローニングした
ＨＩＶ遺伝子を制限酵素により消化し調製したＤＮＡ断
片を挿入連係の後、これを宿主細胞に移入して形質転換
させることにより、ＶＺＶ遺伝子とＨＩＶ遺伝子が連係
のキメラプラスミドを構築することが、論理的には可能
である。しかしながら、これが難渋な場合には、既に作
出済みのキメラプスミド、例えば、ＶＺＶ−ＨＢＶ遺伝
子を保有のｐＨＨ（米国特許第５，６５３，９７６号公
報又は欧州特許第０５１０９９６号公報）のＴＫ遺伝子
の下流にあるＨＢＶ遺伝子を制限酵素で除去した後、そ
の制限酵素サイトに、上記（２）で調製したＨＩＶ遺伝
子のＤＮＡ断片を挿入連係することにより構築できる。

【００１４】（４）組換えＶＺＶ／ＨＩＶの作出 前述のＶＺＶゲノムと上記（３）で調製のキメラプラス
ミドを同時に宿主細胞に導入し、これ等の両者の間で、
組換えを起こさせることにより、組換えＶＺＶを作出す
る。細胞へのＤＮＡの導入には、公知の常法、例えば、
ＤＥＡＥデキストラン法、電気穿孔法、リン酸カルシウ
ム法等を適用できる。リン酸カルシウム法（ｖｉｒｏｌ
ｏｇｙ，５２，４６５−４６７，１９７３）の場合、リ
ン酸イオンとカルシウムイオンの共存下で形成される上
記両ＤＮＡの共沈殿物を調製の後、これを細胞培養に接
触させ、コ・トランスフェクションさせる。また、ＶＺ
Ｖ親株を事前に接種して約２−３時間培養した感染細胞
に、キメラプラスミドＤＮＡのリン酸カルシウム共沈殿
物を滴下し接触させ、該ＤＮＡをＶＺＶ感染細胞に導入
することもできる。次いで、これ等の細胞を培養し、そ
の培養系でＶＺＶゲノムとキメラプラスミド両ＤＮＡの
間で組換えを起こさせ、組換えＶＺＶ／ＨＩＶを作出で
きる。

【００１５】（５）組換えＶＺＶ／ＨＩＶとその培養 本発明により得られる種々の組換えＶＺＶ／ＨＩＶクロ
ーンはいずれも、弱毒ＶＺＶ／ＨＩＶ株であり、生ワク
チンの有効成分として使用できる。例えば、ＶＺＶとＨ
ＩＶ両遺伝子の間の組換えＶＺＶ／ＨＩＶクローンは、
後述の実施例８に記載の通り、ｒＶＡ岡株シリーズと総
称かつ命名された次の２０株からなる：ｒＶＡ１岡株、
以下、ｒＶＡ２、ｒＶＡ３、…ｒＶＡ１９，及びｒＶＡ
２０各岡株。なお、本発明の組換えＶＺＶ／ＨＩＶは、
後述の参考例３に記載の要領で、培養細胞にそのシード
ウイルス、例えば、ｒＶＡ岡株のシードウイルスを接種
し培養できる。その培養上清および感染細胞内には、感
染性の組換えＶＺＶ／ＨＩＶ粒子以外に、組換えＶＺＶ
／ＨＩＶゲノムの発現産物であるＶＺＶ及びＨＩＶの両
抗原が生産される。例えば、上記のｒＶＡ３岡株を培養
すると、組換えＶＺＶ粒子以外に、その培養上清や感染
細胞細胞内にはＶＺＶの可溶性抗原や、ＨＩＶのＥｎｖ
由来抗原がそれぞれ生産される。このように組換えＶＺ
Ｖ／ＨＩＶの培養物中に生産されるウイルス粒子とその
遺伝子ＤＮＡ、並びに抗原類はいずれも、予防あるい治
療用のワクチン、免疫学的診断剤、遺伝子診断剤、又は
遺伝子工学試薬として様々なかたちで、多方面に利用で
きる。

【００１６】［組換えＶＺＶ／ＨＩゲノムＤＮＡの遺伝
子解析］公知の常法、例えば、サザン・ブロット法やＰ
ＣＲ法等により解析できる。即ち、ＶＺＶゲノムを制限
酵素で消化し調製したＤＮＡ断片をアガロースゲル電気
泳動で分画し、これ等の画分をニトロセルロースフィル
ター上に移した後、ＲＩ（ラジオアイソトープ）で標識
のプローブとの間でハイブリダイゼーションを行い、上
記泳動画分の反応像をラジオオートグラフィーにより解
析する。また、ゲノムの特定領域の塩基配列からなるプ
ラマーを用い、ＰＣＲにより増幅した目的領域の遺伝子
ＤＮＡ断片を電気泳動にかけ、それをエチジウムブロマ
イドで染色により分析できる。

【００１７】［組換えＶＺＶＨＩＶ抗原の測定、検出及
び同定］組換えＶＺＶ培養により生産されるウイルス粒
子や各種抗原の測定、検出及び同定は、免疫学や血清診
断で常用されている公知の方法、例えば、抗体でコート
した赤血球をもちいるＲＰＨＡ（逆受身赤血球凝集反
応）法、酵素で標識した抗体を使用するＥＬＩＳＡ（酵
素結合抗体免疫アッセイ）又はＥＩＡ（酵素免疫アッセ
イ）、ＲＩで標識した抗体を用いるＲＩＡ（ラジオ免疫
アッセイ）、ＦＩＴＣ（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ ｉｓ
ｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ）で標識した抗体で感染細胞
を染色し蛍光顕微鏡下で抗原の存在を判定する免疫蛍光
法、また、ＲＩ標識した培地成分を添加混合の培地中で
組換えＶＺＶを培養し調製したＲＩ標識抗原と予め作製
した抗体との間の免疫沈降反応物をＳＤＳ−ＰＡＧＥ
（ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動）にかけ分子量
の大きさにより分画の後、その泳動像をオートラジオグ
フィーで解析する免疫沈降法等の採用が可能である。
尚、この工程を簡略化するため、市販されている種々の
測定キットを使用できる。また、抗原密度は、公知の常
法、例えば、密度勾配平衡遠心法により測定できる。抗
原粒子の形状は、電子顕微鏡で観察できる。

【００１８】［組換えＶＺＶ／ＨＩＶの感染価の測定］
公知の常法、例えば、感染細胞のラウンディングを指標
とするＣＰＥ（細胞変性効果）を光学顕微鏡下で判定す
るＣＰＥ法；ニュートラルレッドとアガロースを含有の
固形培養培地を重層した感染細胞の培養により形成され
る各プラークを１単位とするＰＦＵ（プラーク形成単
位）を肉眼で数えるプラークアッセイ；ホルマリンで固
定した感染細胞をメチレンブルー溶液で染色しＰＦＵを
肉眼で数えるプラークアッセイ；感染細胞が形成するフ
ォーカスの数、ＦＦＵ（フォーカス形成単位）を光学顕
微鏡下で計数するフォーカス法；等を採用できる。

【００１９】［組換えＶＺＶ／ＨＩＶのクローニング］
公知の常法、例えば、感染細胞のクローニングにはフォ
ーカス法、組換えＶＺＶのクローニングにはプラークア
ッセイが採用できる。フォーカスやプラークの採取に
は、ガラス製、プラスチック製、金属製等の円筒細管な
いしはシリンダーを使用できる。クローニングした感染
細胞や組換えＶＺＶ／ＨＩＶは、クローン毎に新鮮な細
胞培養に接種し、ウイルスを培養する。

【００２０】

【組換えＶＺＶ免疫原性の判定】組換えＶＺＶを含有の
溶液をサル、ウサギ、モルモット、マウス等の実験小動
物の皮下に接種の後、これ等の免疫動物を飼育管理す
る。斯かる飼育の間、ウイルス接種後、週又は月単位で
一定期間毎に、例えば、モルモットの場合には、その大
腿部静脈から約３ｍｌの部分採血を行い、その血中抗体
価を測定する。抗体価の測定には、免疫学や血清診断で
常用されている公知の方法、例えば、免疫に使用した抗
原を付着させた赤血球を用いるＰＨＡ（受身赤血球凝集
反応）法、既知の一定量の感染ウイルスとその抗血清と
の間で抗原抗体反応させた後、その感染ウイルス量を５
０％中和減少させる抗血清の最高希釈倍数を、ＣＰＥ法
やプラークアッセイにより測定する中和試験法等を採用
できる。また、遅延型過敏反応あるいは遅延型皮膚過敏
反応により、細胞性免疫を証明できる。これには、例え
ば、マウスやモルモット等での皮内反応を用いる。な
お、皮内反応は、予め抗原で感作した動物において、そ
の抗原に対するＴ細胞が増加（細胞性免疫が成立）して
いる場合には、同じ抗原を皮内接種すると、接種局所に
発赤や硬結が生じるので、その大きさや程度を測定する
ことにより行う。

【００２１】［組換えＶＺＶ／ＨＩＶを有効成分として
含有する生ワクチンの製造］ヒト２倍体細胞培養を用い
て組換えＶＺＶを培養の後、その培養物を、例えば、遠
心法により精製し、組換えＶＺＶ画分を採取する。これ
にワクチン安定化剤としてアミノ酸や糖類等の溶液を添
加混合てし、生ワクチン１ドーズ当たりのウイルス含量
が１，０００ＰＦＵ以上になるよう希釈調整し、生ワク
チンを製造する。生ワクチンは、その一部サンプルにつ
き、厚生省告示第２１７号に規定の生物学的製剤基準
（１９９３年）、例えば、「乾燥弱毒生水痘ワクチ
ン」、「組換え沈降Ｂ型肝炎ワクチン（酵母由来）」
（エイズワクチンの基準が未定であるのでＢ型肝炎ワク
チンの基準の援用かつ併用が考えられる）等に準拠し
て、安全性、有効性及び均質性に関する各種試験検定を
行い、そのワクチンとしての適格性を確認・確定の後、
使用に供する。ワクチンは液状又は乾燥のかたちで提供
される。なお、乾燥ワクチンは、約３−３０ｍｌ容のバ
イヤル瓶又はアンプル中で凍結乾燥され、気密密閉の状
態で提供され、５℃以下に保存する。かかるワクチンの
使用は、これに添付の使用書の記載に従い、使用直前に
滅菌蒸留水で乾燥内容物を完全に再溶解した後、例えば
１ドーズ、０．２〜０．５ｍｌを皮下に接種する。

【００２２】［組換えＶＺＶ／ＨＩＶ抗原を有効成分と
して含有する診断剤の製造］ヒト２倍体細胞培養を用い
て組換えＶＺＶ．ＨＩＶを培養の後、その培養物を、例
えば、遠心法により精製し、組換えＶＺＶ／ＨＩＶ抗原
画分を採取する。その抗原を、例えば、ホルマリン、５
６℃で加熱等により不活化した後、抗原蛋白量が１−１
０μｇ／ｍｌになるよう、例えば、ＰＢＳで希釈調整
し、診断剤を調製する。かかる抗原は、２−５０ｍｌ容
のバイヤル瓶又はアンプル中で密閉され、液状又は乾燥
の状態で提供される。斯かる抗原は、これに添付の使用
書の記載に従い、種々の血清診断、例えば、ＥＬＩＳ
Ａ、ＰＨＡ等の抗原として、また、抗体の作製に使用で
きる。尚、乾燥製品の場合には、蒸留水で乾燥内容物を
完全に再溶解して用いる。以下、本発明の具体例につ
き、参考例及び実施例をあげて説明する。但し、本発明
は、かかる参考例及び実施例にのみ限定されるものでは
ない。

【００２３】

【参考例】参考例１ ［細胞培養とその培地］ヒト２倍体繊維芽細胞、ＭＲＣ
−５を３７℃で培養する。基礎培地としてＭＥＭ培地
［Ｇｉｂｃｏ社（米国）製］を使用した。尚、該基礎培
地は使用直前に７％（Ｗ／Ｖ）ＮａＨＣＯ_３３水溶液を
添加混合し、増殖培地はｐＨ７．４、維持培地はｐＨ
７．８に各々調整した。次いで、市販のウシ胎児血清を
最終濃度が、増殖培地では１０％（Ｖ／Ｖ）、また、維
持培地では３％（Ｖ／Ｖ）になるよう追加混合し使用し
た。

【００２４】参考例２ ［ＶＺＶ培養］参考例１で得たＭＲＣ−５細胞培養に、
ＶＺＶ岡株（ＡＴＣＣ ＶＲ−７９５）シードウイルス
をＭＯＩ（感染多重度）０．０１にて接種の後、３７℃
で３日間。培養した。培地には、参考例１に記載の維持
培地を使用した。ＶＺＶ培養の間、ＶＺＶの増殖に伴い
感染細胞領域が次第に広がった。ＶＺＶ感染細胞は、検
鏡下でラウンディングを呈し、いわゆる、ＣＰＥ（細胞
変性効果）として検出した。即ち、かかるＣＰＥに基づ
く感染細胞の広がりを検鏡下で観察することにより、Ｖ
ＺＶ増殖の程度を判定した。ＣＰＥが細胞培養モノシー
ト全域で認められる時点で、ＶＺＶ培養を終了した。

【００２５】参考例３ ［生水痘ワクチン株の培養］弱毒生水痘ワクチン株であ
る岡株（ＷＨＯ Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ Ｒｅｐｏｒｔ
Ｓｅｒｉｅｓ，Ｎｏ．８４８，ｐｐ．２２−５２（Ａｎ
ｎｅｘ １），１９９４］のシードウイルスを、参考例
２の記載と同様の要領で培養した。培養容器として、培
養面積２１０ｃｍ^２のルー瓶５本を使用した。

【００２６】参考例４ ［ＰＢＳ（リン酸塩緩衝食塩水）の調製］ＮａＣｌを
８．０ｇ、ＫＣｌを０．２ｇ、Ｎａ_２ＨＰＯ_４・１２Ｈ
_２Ｏを２．０ｇ、ＫＨ_２ＰＯ_４を０．２ｇ、ＣａＣｌ_２
を０．１ｇ、及びＭｇＣｌ_２・６Ｈ_２Ｏを０．１ｇ、蒸
留水に溶解して１，０００ｍｌにし、ＰＢＳを調製し
た。また、２価のイオン、ＣａＣｌ_２とＭｇＣｌ_２・６
Ｈ_２Ｏとを含まないＰＢＳ（−）も別途に調製した。

【００２７】

【実施例】実施例１ ［ＶＺＶゲノムＤＮＡの抽出と調製］参考例３で得た岡
水痘ワクチン株の感染細胞を採取した。即ち、ウイルス
培養終了後、培養液を捨て、０．１％（Ｗ／Ｖ）ＥＤＴ
Ａ−２ＮａのＰＢＳ（−）溶液を１６ｍｌ、各ルー瓶に
添加し感染細胞をルー瓶の内壁面から剥離させた後、こ
れ等をプールした。次に、３，０００ｒｐｍ、１０分
間、室温で遠心し、感染細胞のペレットを採取する。こ
れに、０．５％（Ｖ／Ｖ）ＮＰ４０［ＢＤＨ Ｃｈｅｍ
ｉｃａｌｓ社（英国）製］及び１０ｍＭ ＥＤＴＡ−２
Ｎａ含む１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣＩ（ｐＨ８．０）を３
ｍｌを添加し細胞を浮遊させ、室温で３０分間静置して
細胞を溶解させた。次いで、細胞破片を除去するため、
３，０００ｇ、２０分間、４℃で遠心し、その上清を採
取した。この操作を３回繰り返し行い、採取した各上清
をプールした。次いで、この上清を、ＳＷ２７ローター
［Ｂｅｃｋｍａｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社（米国）
製］にて２７，０００ｒｐｍ、１時間、４℃で遠心し、
ペレットを採取した。そのペレットを、２ｍｌのＴＥ液
［１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ（ｐＨ８．０），１ｍＭ
ＥＤＴＡ−２Ｎａ］に浮遊させた後、これにＶＺＶ粒
子可溶化液［１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．
０），１％（Ｗ／Ｖ）ＳＤＳ，１０ｍＭ ＥＤＴＡ−２
Ｎａ，２００μｇ／ｍｌ Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ｋ，
１００μｇ／ｍｌ ＲＮａｓｅ Ａ］２ｍＩを添加混合
し、３７℃で一夜、反応させる。反応終了後、等量の水
飽和フェノール・クロロホルム・イソアミルアルコール
（１：１：１）混合液で２回、ＤＮＡの抽出を行い、水
層を採取した。次に、この水層に２倍量の冷エタノール
を添加混合の後、−２０℃で一夜、静置しＤＮＡを沈殿
させた。このＤＮＡは、遠心により回収の後、上記のＴ
Ｅ液２ｍｌに再浮遊し、ＶＺＶゲノムＤＮＡとして、爾
後の使用に供した。尚、ＤＮＡの濃度は、吸光度ＯＤ
_２６０により決定した。

【００２８】実施例２ ［ＨＩＶ遺伝子ｅｎｖ（１６５−５０３）ＤＮＡの調
製］ｅｎｖ全長を保有のｐＮＳ２１０（微工研条寄第３
０２０号）を鋳型に用い、配列番号１に示すｅｎｖの第
１６５番〜第５０３番コドンのＤＮＡ断端の５′側にＸ
ｈｏＩの、３′側にＳｐｈＩの制限酵素切断配列をそれ
ぞれ加えた配列を、ＰＣＲ法で増幅した後、これを１．
０％（Ｗ／Ｖ）アガロースゲル電気泳動にかけ回収し、
ＨＩＶのＥｎｖアミノ酸番号、第１６５番〜第５０３番
をコードし、かつ、制限酵素ＸｈｏＩとＳｐｈＩの両サ
イトを有するＤＮＡ断片を調製した。

【００２９】実施例３ ［ＨＩＶ遺伝子ｅｎｖ（２９６−４６３）ＤＮＡの調
製］前記の実施例２と同様にして、配列番号１に示すｅ
ｎｖの第２９６番〜第４６３番コドンのＤＮＡ断端の
５′側にＸｈｏＩの、３′側にＳｍａＩの切断配列を各
々加えた配列を、ＰＣＲ法で増幅の後、これをアガロー
スゲル電気泳動で回収し、ＨＩＶのＥｎｖアミノ酸番
号、第２９６番〜第４６３番をコードし、かつ、制限酵
素ＸｈｏＩとＳｍａＩの両サイトを有するＤＮＡ断片を
調製した。

【００３０】実施例４ ［ＨＢＶ遺伝子ＰｒｅＳ２（部分）−ＨＢｓＤＮＡの調
製］ＨＢＶの亜型ａｄｒ株のＰｒｅＳ１−ＰｒｅＳ２−
ＨＢｓ遺伝子をｐＢＲ３２２のＢａｍＨＩサイトにクロ
ーニングしたプラスミドｐＭ１Ｂ１１（微工研条寄第１
０８１号）を制限酵素ＨｐａＩＩで消化した。次いで、
これを０．５％（Ｗ／Ｖ）アガロース電気泳動にかけ、
ＨｐａＩＩ断片を回収の後、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼに
より両末端を平滑末端にした。

【００３１】実施例５ ［ＶＺＶ遺伝子ｔｋＤＮＡのクローニング］実施例１で
得たＶＺＶゲノムＤＮＡを、制限酵素ＳａｃＩで消化
し、これを０．５％（Ｗ／Ｖ）アカロースゲル電気泳動
にかけ、Ｈ断片（Ｉｎｔｅｒｖｉｒｏｌｏｇｙ，２９，
３０１−３１０，１９８８）を回収した。このＤＮＡ断
片を、ＳａｃＩで開裂したプラスミドｐＵＣ１２（Ｍｅ
ｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏ ｌｏｇｙ，第１０１
巻，ｐｐ．２０−７８、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ
［米国］１９８３年発行）に挿入連係の後、大腸菌ＪＭ
１０９株（ＡＴＣＣ Ｎｏ．５３３２３）に移入し、形
質転換させることにより、プラスミドｐＵＣ１２−ｔｋ
を作製した。更に、ｐＵＣ１２−ｔｋを制限酵素Ｅｃｏ
ＲＩとＦｏｋＩで消化の後、１．０％（Ｗ／Ｖ）アカロ
ースゲル電気泳動により回収したＥｃｏＲＩ−ＦｏｋＩ
断片を再度、ｐＵＣ１２にクローニングし、ＶＺＶ遺伝
子ｔｋＤＮＡを保有のプラスミドｐＥＦ６を得た。

【００３２】実施例６ ［ＶＺＶ／ＨＢＶキメラプラスミドｐＨＨの構築］実施
例４で調製したＨＢＶのＨｐａＩＩ断片を、実施例５で
得たｐＥＦ６のｔｋのＨｉｎｃＩＩサイトに挿入連係の
後、これを大腸菌ＪＭ１０９株に移入し形質転換させる
ことにより、キメラ・プラスミドｐＨＨを得た。また、
ＨＢＶ遺伝子ＤＮＡ断片の挿入連係部位の塩基配列を、
７−ＤＥＡＺＡシークエンスキット［宝酒造社（日本）
製］を用いて決定した。その結果、このキメラｐＨＨ
は、ＨＢＶのｐｒｅＳ２−ＨＢｓ遺伝子ＤＮＡの１，０
８０塩基対断片がＶＺＶ遺伝子のＳａｃＩ−ＦｏｋＩ断
片４．８ｋｂの間に挿入連係されており、ＶＺＶｔｋの
真性のプロモーターとエンハンサーの機能下で、ＶＺＶ
ｔｋの真性の開始コドンＡＴＧ（メチオニン）とＨＢＶ
ｐｒｅＳ２遺伝子のＴＣＣ（セリン）とが連係した状態
で転写かつ翻訳され、ＶＺＶ遺伝子ｔｋの発現に代わ
り、ＨＢＶのｐｒｅＳ２の２７個のアミノ酸とＨＢｓ全
長ペプチドとを発現する遺伝子を保有していた。

【００３３】実施例７ ［ＶＺＶ／ＨＩＶキメラプラスミドｐＶＡ１の構築］実
施例２で得たｅｎｖ（１６５−５０３）ＤＮＡを、実施
例６のｐＨＨのＸｈｏＩとＳｐｈＩの切断サイトに挿入
したプラスミドを構築の後、そのＳａｃＩＩとＳｐｈＩ
による断片を切り出し、これをプラスミドＳｓｔＨのＳ
ａｃＩＩとＳｐｈＩの切断サイトに挿入連係し、キメラ
プラスミドｐＶＡ１を構築した。

【００３４】実施例８ ［ＶＺＶ／ＨＩＶキメラプラスミドｐＶＡ２の構築］実
施例３で調製したｅｎｖ（２９６−４６３）ＤＮＡを、
実施例６で得たｐＨＨのＸｈｏＩとＳｍａＩの切断サイ
トに挿入連係し、キメラプラスミドｐＶＡ２を構築し
た。

【００３５】実施例９ ［組換えＶＺＶ／ＨＩＶの作製］実施例１で調製のＶＺ
ＶゲノムＤＮＡ（２．５μｇ／ｍｌ）及び実施例８で構
築したキメラプラスミドｐＶＡ２（２０μｇ／ｍｌ）
を、リン酸カルシウム法（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，５２．４
６５−４６７，１９７３）により、直径６０ｍｍのプラ
スチック製シャーレで培養のＭＲＣ−５細胞にコ・トラ
ンスフェクションさせた。次いで、これを培養し、ＶＺ
Ｖゲノムの導入により形成される各ＶＺＶフォーカスか
ら、感染細胞をシリンダーにより釣り上げた。斯かる感
染細胞をフォーカス毎にそれぞれ、２５ｃｍ^３のプラス
チ製フラスコに培養のＭＲＣ−５細胞に接種し、増殖さ
せた。同時に、感染細胞の一部をフォーカス別にそれぞ
れ、カバースリップ上に培養のＭＲＣ−５細胞に接種し
増殖させた後に、これ等を抗ＨＩＶ−１ｇｐ１２０（ａ
ａ３０７−３２０）モノクローナル抗体［ＡＢＩ（Ａｄ
ｖａｎｃｅｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎ
ｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ（米国）製］を用いる免疫蛍光法
で検鏡した。即ち、各カバースリップ上の細胞を、ＰＢ
Ｓ（リン酸塩緩衝食塩水）で洗浄の後、冷メタノールと
冷アセトンの等量混合液にて−２０℃で５分間、固定
し、脱水させた。次に、マウスの上記モノクローナル抗
体、及びＦＩＴＣで標識の抗マウスＩｇＧ抗体で染色し
た。染色済みの各標本につき、蛍光顕微鏡下で蛍光度を
指標としてＨＢｓ抗原産生の有無と強弱を検定した。そ
の結果、合計１５３個のウイルス株（Ｓ１−Ｓ１５３）
を取得し、これ等のうち、６株が組換えＶＺＶ／ＨＩＶ
クローン候補株として選定された。また、この検定結果
に基づき、上述のフラスコ内で増殖させた感染細胞のう
ち、各組換え体クローン候補株の感染細胞から、細胞遊
離の組換えＶＺＶ／ＨＩＶを調製しの後、使用に供する
まで−７０℃で保存した（Ｊｏｕｒａｎａｌ ｏｆ Ｇ
ｅｎｅｒａｌ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，６１，２５５−２６
９，１９８２）。次いで、直径６０ｍｍのプラスチック
製シャーレに培養のＭＲＣ−５細胞を用いて、上記の組
換えＶＺＶ／ＨＩＶ候補株のうち蛍光度が最高のＳ１４
９につきプラークアッセイを行った。なお、プラークア
ッセイでは、基礎培地として１９９培地（Ｄｉｆｃｏ社
［米国］製）を用い、参考例１の記載と同様にして調製
した維持培地に、アガロースを最終濃度が０．８％（Ｗ
／Ｖ）になるよう添加混合して固型培地を調製した。こ
の培地は、感染細胞モノシートに重層して用いた。感染
培養細胞の染色は、上記の固形培地にニュートラルレッ
ドを最終濃度０．０１％（Ｗ／Ｖ）になるよう添加混合
し調製した培地を更に重層して行った。ウイルス接種
は、シャーレ当たり１〜２個のプーラクが形成されるよ
うウイルス濃度を調整して行った。また、培養は５％
（Ｖ／Ｖ）炭酸ガス保温器内で行い、培養温度等の他の
条件は、参考例３と同じであった。出現したプラークを
各々、個別に、シリンダーで釣り上げることにより、組
換えＶＺＶ／ＨＩＶをクローニングした。得られた組換
えＶＺＶ／ＨＩＶのうちの１クローン（Ｓ１４９Ｃ８）
を、未感染細胞５−１０個に対しクローン感染細胞１個
の割合で接種し、細胞から細胞へ１０代継代した。そし
て、継代第１０代の各感染細胞培養からそれぞれ、細胞
遊離の組換えＶＺＶ／ＨＩＶを調製した。これ等の組換
えＶＺＶ／ＨＩＶにつき、上述と同様に免疫蛍光法で検
定し厳選した結果、ＨＩＶのＥｎｖ抗原を産生する細胞
遊離の組換えＶＺＶ／ＨＩＶを２０クローン分離した。
これ等のクローンをｒＶＡ岡株シリーズとし、このシリ
ーズを構成する２０株について、ｒＶＡ１岡株、ｒＶＡ
２岡株の要領で以下順次、ｒＶＡ３岡株からｒＶＡ２０
岡株まで命名した。また、これ等の２０株では全て、Ｈ
ＩＶのＥｎｖ抗原の同程度の産生が確認されたため、か
かる組換えＶＺＶによるＥｎｖ抗原の産生はいずれも、
ウイルス継代下で遺伝学的に安定かつ良好であると判断
された。以下の実施例では、ｒＶＡ岡株シリーズ中の組
換えＶＺＶ／ＨＩＶ株の代表例として、ｒＶＡ３岡株を
使用する。なお、ｒＶＡ３岡株の親株は、参考例３及び
実施例１に記載の通り、弱毒生水痘ワクチンの有効成分
として現在、使用されている弱毒ＶＺＶ岡株である。

【００３６】実施例１０ ［組換え体ゲノムでのＶＺＶｔｋ／ＨＩＶｅｎｖ両遺伝
子の存在の確認］実施例９で得たｒＶＡ３岡株（組換え
ＶＺＶ／ＨＩＶ岡株）から、実施例１の記載に従ってゲ
ノムを調製し、そのゲノムにおける上記両遺伝子の存在
をＰＣＲ法により確認した。即ち、５′から３′末端方
向に左から右に示す［ｔｋプロモータ］−［ｅｎｖ］−
［ｔｋ］領域の存在は、５′と３′両側が次のｔｋに基
づくプライマーを用いるＰＣＲ Ｃにより確認した： ５′側 ６４６５０−ＣＣＴＣＧＡＣＧＴＡＣＧＴＴＡ
ＴＣＡＡＴ−６４６６９；及び ３′側 ６５８９１−ＣＧＣＧＡＧＴＡＴＧＡＣＡＡＴ
ＧＴＧＴＡ−６５８７２。 また、［ｅｎｖ（３′側領域）］−［ｔｋ］領域の存在
は５′側が次のｅｎｖに基づくプライマーを用いるＰＣ
Ｒ Ｂにより確認した： ５′側 ７１７２−ＡＴＡＧＧＡＡＡＡＡＴＡＧＧＡＡ
ＡＴＡＴＧＡＧＡＧＡＣＡＡＧ ３′側 上記ｔｋの３′側プライマーに同じ。 更に、［ｔｋ−プロモータ］−［ｅｎｖ（５′側領
域）］領域の存在は３′側が次のｅｎｖに基づくプライ
マーを用いるＰＣＲ Ａにより確認した： ５′側 上記ｔｋの５′側プライマーに同じ；及び ３′側 ７５２５−ＧＧＧＴＡＧＴＣＡＣＣＴＧＴＴＴ
ＡＡＴＣＴＡＣＡＡＧ。 なお、上記プライマーに付した数字はそれぞれ塩基番号
を意味し、ＶＺＶｔｋについてはＤａｖｉｄｓｏｎとＳ
ｃｏｔｔ（Ｊｏｕｅｎａｌ ｏｆ ｇｅｎｅｒａｌ Ｖ
ｉｒｏｐｌｏｇｙ，６７，１７５９−１８１６，１９８
６）に、また、ＨＩＶｅｎｖについてＧｅｎｅＢａｎｋ
Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．Ｍ１９９２１に基づいて
いる。これ等のＰＣＲにより得られたＤＮＡ断片は、４
％（Ｗ／Ｖ）アガロースゲル電気泳動にかけ、エチジウ
ムブロマイド染色し分析した。その結果を図１に示す。
これにより、ｒＶＡ３岡株ゲノムにＶＺＶｔｋ／ＨＩＶ
ｅｎｖ両遺伝子の存在することが確認された。

【００３７】実施例１１ ［組換え体が感染した細胞が産生するＶＺＶとＨＩＶ両
抗原の検出と同定］上記両抗原の検出と同定は免疫沈降
法により行った。先ず、参考例１の記載と同様して、直
径１００ｍｍのシャーレ４枚にＭＲＣ−５細胞を培養す
る。各シャーごとに個別に、実施例９で得たｒＶＡ３岡
株（組換えＶＺＶ／ＨＩＶ株）、ｒＶＡ３の親株（生水
痘ワクチン岡株）、及び組換えＶＺＶ／ＨＢＶ岡株（Ｅ
ＣＡＣＣ Ｎｏ．Ｖ９２０１５２３）をそれぞれ接種し
た。残り１枚の細胞培養は、ウイルスを接種せず、Ｍｏ
ｃｋ（疑似対照）の調製に用いた。そして、これ等の各
細胞を、メチオニンを含有しないＭＥＭ培地に５０μＣ
ｉ／ｍｌの［^３５Ｓ］メチオニンとシスティンを添加し
調製した基礎培地を用いて、参考例２の記載と同様に４
時間、培養を行った。次いで、各細胞を剥離し、ＲＩＰ
Ａ緩衝液［２０ｍｌ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．
０），１％（Ｗ／Ｖ）Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００，０．
１％（Ｗ／Ｖ）ＳＤＳ，１５０ｍＭ ＮａＣｌ，及び１
ｍＭ ｐｈｅｎｙｌｍｅｔｈｌｓｕｌｆｏｎｙｌ ｆｒ
ｕｏｒｉｄｅ］と超音波で細胞破砕の後、４０，０００
ｒｐｍで４０分間、遠心し、その上清を採取した。これ
等の各上清（いわゆるｌｙｓａｔｅ）について、ＶＺＶ
に対する抗モルモット血清、及び抗ＨＩＶ−１ｇｐ１２
０（ａａ３０７−３２０）モノクローナル抗体［前記の
ＡＢＩ社（米国）製］を用い、免疫沈降反応させた後、
これ等をＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動にかけ、ラジオオー
トグラフィーを行うことにより解析した。その結果を図
２に示す。ｒＶＡ岡株の感染細胞においてのみＨＩＶの
Ｅｎｖ抗原（３０ｋ）が検出かつ同定され、また、ｒＶ
Ａ３岡株がＥｎｖ抗原とＶＺＶ抗原とを同時に産生する
ことが確認された。

【００３８】実施例１２ ［実施例１１における結果の追加確認］抗ＨＩＶ−１抗
体として、次の３種（３メーカー製）、抗ＨＩＶ−１ｇ
ｐ１２０モノクローナル抗体［Ｃｈｅｍｉｃｏｎ Ｉｎ
ｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｃ．（ＵＳＡ）製］、抗
ＨＩＶ−１ｇｐ１２０モノクローナル抗体［ＶｉｒｏＳ
ｔａｔ（米国）製］、及び抗ＨＩＶ−１ｇｐ１２０ヤギ
抗体［ＯＥＭ Ｃｏｎｃｅｐｔｓ（米国）製］をそれぞ
れ用い、実施例１０と同様にして、組換え体ｒＶＡ岡株
の感染細胞で産生されるＶＺＶとＨＩＶ両抗原の検出と
同定を行い、いずれも、実施例１０の記載と同一の結果
を得た。即ち、ｒＶＡ岡株の感染細胞においてのみＨＩ
ＶのＥｎｖ抗原（３０ｋ）が検出かつ同定され、また、
ｒＶＡ３岡株がＥｎｖ抗原とＶＺＶ抗原とを同時に産生
することが確認された。

【００３９】実施例１３ ［組換えＶＺＶを有効成分として含有する生ワクチンの
試作］培養面積２１０ｃｍ^２のルー瓶２０本のＭＲＣ−
５細胞培養に、実施例９で得たｒＶＡ３岡株シードウイ
ルスを接種の後、参考例３の記載と同様にして培養し
た。培養終了後、培養液を捨て、各ルー瓶内の感染細胞
を２００ｍｌのＰＢＳ（−）にて２回洗浄した。次い
で、２０ｍｌの０．０３％（Ｗ／Ｖ）ＥＤＴＡ−３Ｎａ
を各ルー瓶内の感染細胞に重層し、細胞をルー瓶内壁面
から剥離させ浮遊させる。各ルー瓶内の感染細胞浮遊液
をプールし、２，０００ｒｐｍにて１０分間、４℃で遠
心し、感染細胞のペレットを採取した。これを１００ｍ
ｌのＰＢＳ（−）に再浮遊の後、凍結融解を１回、行
う。次に、氷水浴中で超音波処理（２０ｋＨｚ、１５０
ｍＡ，０．３秒／ｍｌ）した後、３，０００ｒｐｍで２
０分間、４℃で遠心し、細胞遊離ウイルスを含有の上清
を採取し、これを生ワクチン原液とする。この原液から
検定用として３０ｍｌをサンプリングし、残りの原液７
０ｍｌに、ＰＢＳ（−）に溶解したサッカロース及びゼ
ラチン加水分解物をワクチン安定化剤として最終濃度が
５％（Ｗ／Ｖ）及び２．５％（Ｗ／Ｖ）になるよう添加
混合し、１４０ｍｌの生ワクチン最終バルクを調製し
た。この最終バルクから検定用として３０ｍｌをサンプ
リングの後、残りバルクを３ｍｌ容のバイヤル瓶に０．
５ｍｌずつ分注し、凍結乾燥の後、窒素ガスを充填しゴ
ム栓で封をしバイヤル瓶内部を気密密閉した。この生ワ
クチン小分品は、４℃で保存し、使用の直前に注射用蒸
留水０．５ｍｌを添加し乾燥内容物を完全に溶解し用い
た。一方、サンプリングした上記のワクチン原液と最終
バルク、及び小分品２０につき、検定試験を行った。か
かる検定試験は、安全性、有効性及び均質姓を確認し、
生ワクチンとしての適格性を確定するため、厚生省告示
第２１７号に規定の生物学的製剤基準（１９９３年）
「乾燥弱毒生水痘ワクチン」に準拠し、かつ、同じく規
定の基準「組換え沈降Ｂ型肝炎ワクチン（酵母由来）」
をも考慮し、実施した。かかる検定試験の結果、上記の
小分品は、そのウイルス含量が２×１０^４ＰＦＵ（プラ
ーク形成単位）／０．５ｍｌであり、かつ、上記基準に
規定の各種試験に合格したため、適格性な生ワクチンで
あると判定された。

【００４０】実施例１４ ［診断剤用の組換えＶＺＶ抗原の試作］培養面積２１０
ｃｍ^２のルー瓶２０本のＭＲＣ−５細胞培養に、実施例
８で得たｒＶＡ３岡株シードウイルスを接種し、参考例
３の記載と同様にして培養する。１日間培養の後、各ル
ー瓶の培養液を捨て、各ルー瓶内の感染細胞を２００ｍ
ｌのＰＢＳにて２回洗浄した。次いで、フェーノレッド
を抜いた１９９培地［Ｄｉｆｃｏ社（米国）製］を各ル
ー瓶に注入し、更に３日間、３７℃で培養を続ける。培
養終了後、各ルー瓶から培養液を採取し、プールした。
これを３，０００ｒｐｍにて２０分間遠心し、その上清
をミニタン限外濾過機ＭＷ１００００［ミリポア（米
国）製］で、体積を１／２０に濃縮した。次に、この濃
縮液を５６℃で３０分間加熱し、ウイルスを不活化し
た。得られた不活化濃縮液中の組換えＶＺＶ／ＨＩＶの
抗原蛋白含量が５μｇ／ｍｌになるようＰＢＳで希釈調
整し、これを３ｍｌ容のアンプルに２ｍｌずつ分注の
後、熔封し、水痘及びＢ型肝炎の診断剤とした。

【００４１】実施例１５ ［ｒＶＡ３岡株を有効成分として含有する生ワクチンの
免疫原性の判定］モルモットでの皮内反応により行っ
た。抗原として、［Ａ］実施例１３で製造したｒＶＡ岡
株を含有の弱毒生ワクチン，［Ｂ］比較対照としてｒＶ
Ａ岡株の親株を含有の市販の乾燥弱毒生水痘岡株ワクチ
ン（財団法人阪大微生物病研究会製）、及び［Ｃ］ＭＲ
Ｃ−５未感染細胞から実施例１３と同様にして調製した
Ｍｏｃｋワクチン（疑似対照）をそれぞれ用いた。先
ず、ＨＩＶ−１（ＬＡＩ株）感染細胞、即ち、６７％の
割合でｇｐ１２０抗原が検出されるヒトｌｅｕｋｅｍｉ
ａ細胞ＣＭＥ（細胞数５×１０^７）を採取し、５６℃で
３０分間、加熱処理した後、これを５ｍｌのＰＢＳ
（−）に浮遊し、超音波にかけ細胞破砕物を調製した。
次ぎに、この細胞破砕物とＦｒｅｕｎｄ不完全アジュバ
ントとの混合液を調製し、これを、４週令の平均体重２
５０ｇのモルモット３群（１群５匹、合計１５匹）の各
々に０．５ｍｌずつ皮下接種することにより基礎免疫し
た。その接種日から３０日後に、Ａ群５匹の各モルモッ
トに上記［Ａ］を５０，０００ＰＦＵ、皮下接種した。
同様にして、Ｂ群には上記［Ｂ］を５０，０００ＰＦＵ
／モルモット、また、Ｃ群には上記［Ｃ］を１．２５ｍ
ｌ／モルモット、それぞれ皮下接種した。次いで、皮下
接種から３週間後に、ＬＡＩ株感染ＣＥＭ細胞抗原、Ｃ
ＥＭ細胞抗原、及びＶＺＶ抗原を、各モルモットの背部
の２か所／抗原に、０．１ｍｌずつ皮内接種し、その２
４時間後に判定した。なお、ＬＡＩ株感染細胞抗原とし
て、９％の割合でｇｐ１２０抗原が検出されるＣＭＥ
（５×１０゜細胞）を５６℃で３０分間、加熱処理した
後、５ｍｌのＰＢＳ（−）に浮遊し、超音波にかけ、更
に、これを３，０００ｒｐｍで１０分間、低速遠心した
上清を用いた。ＣＥＭ細胞抗原はＣＭＥ（５×１０^７細
胞）から、また、ＶＺＶ抗原はＶＺＶ感染ＭＲＣ−５細
胞から、それぞれ、上記のＬＡＩ株感染細胞抗原と同様
にして調製した。また、上記判定は、皮内接種後２４時
間の各モルモットの接種局所の発赤の長径と短径を測定
することにより行った。各免疫群の皮膚反応の程度は次
式： π×長径ｍｍ×短径ｍｍ／４の平均値±標準誤差 により算出し、免疫群間の有意差はｔ検定により推計し
た。その結果を表１に示す。ｒＶＡ３岡株を有効成分と
する弱毒生ワクチンは、危険率５％以下で、エイズ及び
水痘両者の細胞性免疫を同時に誘導することが確認され
た。

【００４２】

【表１】

【００４３】

【発明の効果】この出願の発明は、安全性と有効性を兼
ね備えた２価の生ワクチン、即ち、弱毒生エイズワクチ
ンと弱毒生水痘ワクチンの両機能を併せて同時に発揮す
る生ワクチンを世界に広く提供し、特に、待望のワクチ
ンによるエイズ予防の実現を確実にする。更に、エイズ
と水痘の２種混合生ワクチンと同等の免疫効果が得られ
るため、これ等の両者の予防を１回接種で達成可能に
し、予防接種における画期的な省力化をもたらす。ま
た、エイズの治療、診断、基礎研究等に係る有力な材料
を提供し、これ等を発展させる。

【００４４】

【配列表】

【図面の簡単な説明】

【図１】ＰＣＲ法で増幅された３領域のＤＮＡの電気泳
動図であり、組換え体ゲノムにおけるＶＺＶｔｋとＨＩ
Ｖｅｎｖ両遺伝子の存在を示す図である。なお、写真下
の長方形図は、ＶＺＶｔｋプロモーターＨＩＶｅｎｖ−
ＶＺＶｔｋからなる組換え遺伝子を表わす模式図であ
り、棒線と実線は、ＰＣＲプライマーＡ，Ｂ及びＣがそ
れぞれ増幅した上記遺伝子の部分の位置を示す。

【図２】免疫沈降反応後のＳＤＳ−ＰＡＧＥにおけるラ
ジオオートグラフイーの図であり、組換え体の感染細胞
で生産されたＶＺＶ抗原、及びＨＩＶのＥｎｖ抗原、特
に、Ｅｎｖ（３０ｋ）抗原の存在を示す。Ｌｙｓａｔ
ｅ：未感染細胞の溶解物、Ａｎｔｉ−ＶＺＶ：抗ＶＺＶ
抗体、Ａｎｔｉ−ＨＩＶｅｎｖ：ＨＩＶのＥｎｖ（第３
０７−３２０番アミノ酸）に対するモクローナル抗体；
Ｍ：未感染細胞抗原、Ｖ：弱毒生水痘ワクチン岡株ウイ
ルス感染細胞抗原、Ｒ：弱毒組換えＶＺＶ／ＨＢＶ感染
細胞抗原、及びＨ：ｒＶＡ岡株（弱毒組換えＶＺＶ／Ｈ
ＩＶ）感染細胞抗原。

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 7/04 Ｃ１２Ｎ 7/04 Ｇ０１Ｎ 33/569 Ｇ０１Ｎ 33/569 Ｈ //(Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ 1:92） Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA14 BA35 CA04 DA03 EA02 FA02 GA11 HA15 4B065 AA93X AA95X AB01 BA02 CA24 CA45 4C085 AA03 AA08 BA69 BA79 CC08 DD62 EE01 4H045 AA10 AA11 AA20 AA30 BA10 CA05 DA86 EA31 FA72 FA74 GA15

Claims (9)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ＶＺＶのＴＫ遺伝子プロモーターの下流
   領域にＨＩＶ遺伝子を挿入連係することを特徴とする組
   換えＶＺＶ／ＨＩＶの作製方法。
2. 【請求項２】 ＶＺＶのＴＫ遺伝子プロモーターの下流
   領域にＨＩＶ遺伝子が挿入連係された組換えＶＺＶ／Ｈ
   ＩＶ。
3. 【請求項３】 ＶＺＶが弱毒生水痘ワクチン用の水痘ウ
   イルス岡株である請求項２に記載の組換えＶＺＶ／ＨＩ
   Ｖ。
4. 【請求項４】 ＨＩＶ遺伝子がＥｎｖ遺伝子の部分であ
   る請求項２又は３にに記載の組換えＶＺＶ／ＨＩＶ。
5. 【請求項５】 ｒＶＡ岡株シリーズを構成する組換えＶ
   ＺＶ／ＨＩＶ群から選ばれる少なくとも１クローンのウ
   イルス株。
6. 【請求項６】 請求項２、３、４、又は５に記載の組換
   えＶＺＶ／ＨＩＶに由来の抗原。
7. 【請求項７】 請求項２、３、４、又は５に記載の組換
   えＶＺＶ／ＨＩＶゲノムＤＮＡ。
8. 【請求項８】 請求項２、３、４、又は５に記載の組換
   えＶＺＶ／ＨＩＶを免疫を奏する量、含有することを特
   徴とする生ワクチン。
9. 【請求項９】 請求項６に記載の抗原を抗原抗体反応を
   呈する量、含有することを特徴とする診断剤。