FI114318B - Menetelmä rekombinanttiadenovirusrokotteiden valmistamiseksi - Google Patents
Menetelmä rekombinanttiadenovirusrokotteiden valmistamiseksi Download PDFInfo
- Publication number
- FI114318B FI114318B FI933495A FI933495A FI114318B FI 114318 B FI114318 B FI 114318B FI 933495 A FI933495 A FI 933495A FI 933495 A FI933495 A FI 933495A FI 114318 B FI114318 B FI 114318B
- Authority
- FI
- Finland
- Prior art keywords
- gag
- hiv
- adenovirus
- recombinant
- tplhrev
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 15
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title description 13
- 229940021704 adenovirus vaccine Drugs 0.000 title description 4
- 230000008569 process Effects 0.000 title description 2
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 claims abstract description 68
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 25
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 claims abstract description 25
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims abstract description 20
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims abstract description 20
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims abstract description 20
- 230000024932 T cell mediated immunity Effects 0.000 claims abstract description 10
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 claims abstract description 7
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims abstract description 7
- 210000002845 virion Anatomy 0.000 claims abstract description 3
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 claims abstract 2
- 241000725303 Human immunodeficiency virus Species 0.000 claims description 37
- 241000713772 Human immunodeficiency virus 1 Species 0.000 claims description 17
- 210000003928 nasal cavity Anatomy 0.000 claims description 11
- 108700004026 gag Genes Proteins 0.000 claims description 8
- 108700004030 rev Genes Proteins 0.000 claims description 7
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 claims description 6
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 claims description 6
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 claims description 6
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 6
- 101150098213 rev gene Proteins 0.000 claims description 6
- 230000036039 immunity Effects 0.000 claims description 5
- 241000598171 Human adenovirus sp. Species 0.000 claims description 4
- 238000003780 insertion Methods 0.000 claims description 4
- 230000037431 insertion Effects 0.000 claims description 4
- 108700005075 Regulator Genes Proteins 0.000 claims description 3
- 230000010076 replication Effects 0.000 claims description 3
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 2
- 101150059999 pro gene Proteins 0.000 claims description 2
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 claims description 2
- 239000003086 colorant Substances 0.000 claims 2
- RYXPMWYHEBGTRV-UHFFFAOYSA-N Omeprazole sodium Chemical compound [Na+].N=1C2=CC(OC)=CC=C2[N-]C=1S(=O)CC1=NC=C(C)C(OC)=C1C RYXPMWYHEBGTRV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- WDVSHHCDHLJJJR-UHFFFAOYSA-N Proflavine Chemical compound C1=CC(N)=CC2=NC3=CC(N)=CC=C3C=C21 WDVSHHCDHLJJJR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- MKUXAQIIEYXACX-UHFFFAOYSA-N aciclovir Chemical compound N1C(N)=NC(=O)C2=C1N(COCCO)C=N2 MKUXAQIIEYXACX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 239000010445 mica Substances 0.000 claims 1
- 229910052618 mica group Inorganic materials 0.000 claims 1
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 claims 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 claims 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 abstract description 18
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 abstract description 6
- 101710172711 Structural protein Proteins 0.000 abstract description 2
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 51
- 241000282579 Pan Species 0.000 description 37
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 35
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 24
- 241000282577 Pan troglodytes Species 0.000 description 18
- 208000031886 HIV Infections Diseases 0.000 description 15
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 14
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 14
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 13
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 13
- 230000036436 anti-hiv Effects 0.000 description 12
- 230000004044 response Effects 0.000 description 12
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 10
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 10
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 10
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 10
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 9
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 8
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 8
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 7
- 210000003608 fece Anatomy 0.000 description 7
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 7
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 7
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 6
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 6
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 description 6
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 6
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 5
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 5
- 229940037003 alum Drugs 0.000 description 5
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 5
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 5
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 5
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 5
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 5
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 5
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 5
- 208000030507 AIDS Diseases 0.000 description 4
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 4
- 230000005875 antibody response Effects 0.000 description 4
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 4
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 4
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 4
- 101150098622 gag gene Proteins 0.000 description 4
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 4
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 4
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 3
- 101710177291 Gag polyprotein Proteins 0.000 description 3
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 3
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 3
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 3
- 108010078428 env Gene Products Proteins 0.000 description 3
- 230000002550 fecal effect Effects 0.000 description 3
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 3
- 230000028996 humoral immune response Effects 0.000 description 3
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 3
- 230000021633 leukocyte mediated immunity Effects 0.000 description 3
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 3
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 3
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 3
- 210000003296 saliva Anatomy 0.000 description 3
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 3
- 238000010998 test method Methods 0.000 description 3
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241001200329 Chanda Species 0.000 description 2
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 2
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 2
- 108700020121 Human Immunodeficiency Virus-1 rev Proteins 0.000 description 2
- 241000701096 Human adenovirus 7 Species 0.000 description 2
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 2
- KDLHZDBZIXYQEI-UHFFFAOYSA-N Palladium Chemical compound [Pd] KDLHZDBZIXYQEI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 241000700618 Vaccinia virus Species 0.000 description 2
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- GAMPNQJDUFQVQO-UHFFFAOYSA-N acetic acid;phthalic acid Chemical compound CC(O)=O.OC(=O)C1=CC=CC=C1C(O)=O GAMPNQJDUFQVQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 2
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 2
- 230000003263 anti-adenoviral effect Effects 0.000 description 2
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 2
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 2
- 238000013480 data collection Methods 0.000 description 2
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 2
- 108700004025 env Genes Proteins 0.000 description 2
- 230000002496 gastric effect Effects 0.000 description 2
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 2
- 238000010255 intramuscular injection Methods 0.000 description 2
- 239000007927 intramuscular injection Substances 0.000 description 2
- 239000010410 layer Substances 0.000 description 2
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- PGSADBUBUOPOJS-UHFFFAOYSA-N neutral red Chemical compound Cl.C1=C(C)C(N)=CC2=NC3=CC(N(C)C)=CC=C3N=C21 PGSADBUBUOPOJS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000001331 nose Anatomy 0.000 description 2
- 210000000496 pancreas Anatomy 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 2
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 2
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 2
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 1
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 1
- 201000001178 Bacterial Pneumonia Diseases 0.000 description 1
- 208000035143 Bacterial infection Diseases 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 241001609030 Brosme brosme Species 0.000 description 1
- 210000004366 CD4-positive T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- 231100000023 Cell-mediated cytotoxicity Toxicity 0.000 description 1
- 206010057250 Cell-mediated cytotoxicity Diseases 0.000 description 1
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 1
- 206010008342 Cervix carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 229920000742 Cotton Polymers 0.000 description 1
- 206010011224 Cough Diseases 0.000 description 1
- 239000003298 DNA probe Substances 0.000 description 1
- 101710091045 Envelope protein Proteins 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 229940033330 HIV vaccine Drugs 0.000 description 1
- MSPSOUKLPSVQMY-UHFFFAOYSA-N Hirtin Natural products CC12C(OC(=O)CC)C(OC(C)=O)C3C4(C)C=CC(=O)C(C)(C(=O)OC)C4=C(O)C(=O)C3(C)C32OC3CC1C=1C=COC=1 MSPSOUKLPSVQMY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010065155 Human Immunodeficiency Virus env Gene Products Proteins 0.000 description 1
- 102100034349 Integrase Human genes 0.000 description 1
- 206010058467 Lung neoplasm malignant Diseases 0.000 description 1
- 241000282553 Macaca Species 0.000 description 1
- 101710125418 Major capsid protein Proteins 0.000 description 1
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 1
- NTIZESTWPVYFNL-UHFFFAOYSA-N Methyl isobutyl ketone Chemical compound CC(C)CC(C)=O NTIZESTWPVYFNL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010019160 Pancreatin Proteins 0.000 description 1
- 102000057297 Pepsin A Human genes 0.000 description 1
- 108090000284 Pepsin A Proteins 0.000 description 1
- 241000288906 Primates Species 0.000 description 1
- 101710188315 Protein X Proteins 0.000 description 1
- 206010037660 Pyrexia Diseases 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 241000193998 Streptococcus pneumoniae Species 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- 241000534944 Thia Species 0.000 description 1
- 208000006105 Uterine Cervical Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 108020005202 Viral DNA Proteins 0.000 description 1
- 230000005856 abnormality Effects 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- 238000013019 agitation Methods 0.000 description 1
- 238000007605 air drying Methods 0.000 description 1
- 230000002924 anti-infective effect Effects 0.000 description 1
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 238000011888 autopsy Methods 0.000 description 1
- 238000000376 autoradiography Methods 0.000 description 1
- 208000022362 bacterial infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 230000008512 biological response Effects 0.000 description 1
- 230000035584 blastogenesis Effects 0.000 description 1
- 210000000601 blood cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 1
- 230000005890 cell-mediated cytotoxicity Effects 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 201000010881 cervical cancer Diseases 0.000 description 1
- 210000003756 cervix mucus Anatomy 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 230000000120 cytopathologic effect Effects 0.000 description 1
- 210000001151 cytotoxic T lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 1
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 1
- 238000007598 dipping method Methods 0.000 description 1
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 101150030339 env gene Proteins 0.000 description 1
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 1
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 1
- 238000001943 fluorescence-activated cell sorting Methods 0.000 description 1
- 210000004051 gastric juice Anatomy 0.000 description 1
- 238000003304 gavage Methods 0.000 description 1
- 239000007903 gelatin capsule Substances 0.000 description 1
- 238000007429 general method Methods 0.000 description 1
- JFCQEDHGNNZCLN-UHFFFAOYSA-N glutaric acid Chemical compound OC(=O)CCCC(O)=O JFCQEDHGNNZCLN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 1
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 1
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 238000009169 immunotherapy Methods 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 208000027866 inflammatory disease Diseases 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 230000002262 irrigation Effects 0.000 description 1
- 238000003973 irrigation Methods 0.000 description 1
- 230000007794 irritation Effects 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 1
- 201000005202 lung cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000020816 lung neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 210000003563 lymphoid tissue Anatomy 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 229940111688 monobasic potassium phosphate Drugs 0.000 description 1
- 235000019796 monopotassium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 210000001989 nasopharynx Anatomy 0.000 description 1
- 231100000344 non-irritating Toxicity 0.000 description 1
- 239000002674 ointment Substances 0.000 description 1
- 229940126578 oral vaccine Drugs 0.000 description 1
- 229910052763 palladium Inorganic materials 0.000 description 1
- 229940055695 pancreatin Drugs 0.000 description 1
- 239000012188 paraffin wax Substances 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 229940111202 pepsin Drugs 0.000 description 1
- 210000003819 peripheral blood mononuclear cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 1
- -1 phosphate-10 Chemical compound 0.000 description 1
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 1
- GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M potassium dihydrogen phosphate Chemical compound [K+].OP(O)([O-])=O GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 210000002345 respiratory system Anatomy 0.000 description 1
- 208000023504 respiratory system disease Diseases 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 239000002356 single layer Substances 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 239000002594 sorbent Substances 0.000 description 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 1
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 1
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 1
- 229940031000 streptococcus pneumoniae Drugs 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 1
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 239000003104 tissue culture media Substances 0.000 description 1
- 210000000689 upper leg Anatomy 0.000 description 1
- 229940125575 vaccine candidate Drugs 0.000 description 1
- 210000001215 vagina Anatomy 0.000 description 1
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 1
- 210000002268 wool Anatomy 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
- C12N15/86—Viral vectors
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
- A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
- A61P31/18—Antivirals for RNA viruses for HIV
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/10011—Adenoviridae
- C12N2710/10311—Mastadenovirus, e.g. human or simian adenoviruses
- C12N2710/10341—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
- C12N2710/10343—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
- C12N2740/00011—Details
- C12N2740/10011—Retroviridae
- C12N2740/16011—Human Immunodeficiency Virus, HIV
- C12N2740/16111—Human Immunodeficiency Virus, HIV concerning HIV env
- C12N2740/16134—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
- C12N2740/00011—Details
- C12N2740/10011—Retroviridae
- C12N2740/16011—Human Immunodeficiency Virus, HIV
- C12N2740/16211—Human Immunodeficiency Virus, HIV concerning HIV gagpol
- C12N2740/16234—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Virology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Zoology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Oncology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- AIDS & HIV (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
Description
114318
Menetelmä rekombinanttiadenovirusrokotteiden valmistamiseksi
Keksinnön taustaa 5 Eräs biolääketieteellisen tutkimuksen tärkeä tavoi te on suojauksen aikaansaaminen virussairautta vastaan im-munoinnin avulla. Yksi lähestymistapa on ollut käyttää tapettuja rokotteita. Tapettua rokotetta varten vaaditaan kuitenkin suuria määriä ainetta riittävän antigeenisen ai-10 nemäärän saamiseksi. Lisäksi tapettuihin rokotteisiin tulee usein epäpuhtauksina mukaan epäsuotavia tuotteita niiden valmistuksen aikana. Vieraslajiset elävät rokotteet, joissa käytetään sopivasti muutettua adenovirusta, joka itse on rokote, vaikuttavat erinomaiselta immunogeeniltä [Chanock, 15 R., JAMA 195 (1967) 151]. Keksintömme koskee menetelmää ro kotteiden valmistamiseksi, jossa menetelmässä käytetään adenovirusta vektorina.
Pian markkinoitava adenorokote käsittää eläviä, tarttuvia adenoviruksia suolistoliukoisessa annostusmuodos-20 sa. Rokotettavalle potilaalle antamisen jälkeen virus kulkeutuu ylähengityselinten ohi (jossa sairauden tuottavan • t · ··· · infektion ajatellaan esiintyvän) ja vapautuu suolessa. Suo- ·.· * lessa virus lisääntyy suolen seinämässä, jossa se siitä huolimatta ettei kykene aiheuttamaan adenovirussairautta, j 25 silti aiheuttaa adenovirusvasta-aineiden muodostumisen ai- kaansaaden siten immuuniuden adenovirussairautta vastaan. Keksinnön mukaisessa menetelmässä käytetään elävää, tarttuvaa adenovirusta, joka on muutettu sisältämään geenejä, jotka koodaavat muiden tautia aiheuttavien organismien 30 tuottamia antigeenejä. Vapautumisen jälkeen virus lisääntyy » · ja ilmentää erikseen sekä adenovirusantigeeniä että taudin-
• I
; *·· aiheuttajan antigeeniä aiheuttaen siten vasta-aineiden muo- » I » dostumisen tai soluvälitteisen immuuniuden sekä adenovirus-. ta että toista taudin aiheuttavaa organismia vastaan. "Elä- » t · 35 väliä viruksella" tarkoitetaan vastakohtana "tapetulle" vi- • · rukselle virusta, joka kykenee joko sellaisenaan tai yhdes- 2 114318 sä lisä-geneettisen aineksen kanssa tuottamaan identtisiä jälkeläisiä. Ilmauksella "tarttuva" tarkoitetaan kykyä toimittaa virusgenomi soluihin.
Roy esittelee EP-patenttijulkaisussa 80 806 (1983) 5 menetelmän immuuniuden tuottamiseksi mikrobisairauksia vastaan antamalla sellaisen vieraan geenin sisältävää mikrobia, joka ilmentää toisen mikrobin antigeeniä, jota toista mikrobia vastaan aikaansaadaan immuniteetti. Hän toteaa, että edulliset oraaliset valmisteet ovat suolistoliukoisia.
10 Dubelcco esittelee rekombinanttiadenovirusrokotteita, joissa adenoviruksen pintaproteiini on muunnettu sisältämään rakenteessaan kappaleen vierasta proteiinia, joka tuottaa halutun biologisen vasteen eläimille annettaessa. [PCT kansainvälinen julkaisu W0 83/02393 (1983)]. Davis esittelee 15 oraalisia rokotteita, jotka on saatu rekombinanttiadenovi-ruksista. [GB-patentti 2 166 349 B].
Ihmisen immuunikatovirus tyyppi 1 (HIV-1) on etio- logisesti liitetty hankittuun immuunikato-oireyhtymään (AIDS) ja siihen liittyviin häiriöihin. [Barre-Sinoussi, 20 F., Science 220 (1983) 868; Gallo, R. , Science 224 (1984) , , 500; Popovic, M., Science 224 (1984) 497; Sarngadharan, M.,
» I
Science 224 (1984) 506] . AIDS on nykyään maailmanlaajuinen • · » ’·' ’ epidemia, jota varten ei nykyään ole rokotetta eikä hoitoa.
• I »
Suurin osa pyrkimyksistä rokotteen kehittämiseksi on kes-S 25 kittynyt kuori (env) -glykoproteiiniin antigeeninä, joka • voisi aikaansaada suojaavan immuuniuden. Puhdistettua gp li : 120:tä vastaan valmistetut antiseerumit kykenevät neutraloimaan HIV-1 :n in vitro. [Crowl, R. , Cell 41 (1985) 979; .k Putney, S., Science 234 (1986) 1392; Ho, D., J. Virol. 61 • * · * ,···. 30 (1987) 2024; Nara, P., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 84 (1987) i * 3797]. HIV-l-kuoriantigeeniä on tuotettu erilaisissa ilmen-: “ tämisjärjestelmissä mukaan lukien Escherichia coli [Crowl,
t « I
R., Cell 41 (1985) 979; Chang, T., Bio/Technology 3 (1985) : 905; Dawson, G., J. Infect. Dis. 157 (1988) 149] samoin 35 kuin myös nisäkäs- [Chakrabarti, S., Nature 320 (1986) 535; * *
Dewar, R., J. Virol. 63 (1989) 129; Rekosh, D., Proc. Natl.
3 114318
Acad. Sei. USA 85 (1988) 334; Whealy, M. , J. Virol. 62 (1988) 4185] hiiva- [Barr, P., Vaccine 5 (1987) 90]ja hyön-teissoluja [Hu, S., Nature 328 (1978) 721; Rusche, J.,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84 (1987) 6294] .
5 Elävää rekombinanttivacciniavirusta, joka ilmentää koko HIV-l-env-glykoproteiinia, [Hu, S., J. Virol. 61 (1987) 3617] tai puhdistettua rekombinantti- gp 120 env -glykoproteiinia [Berman, P., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 (1988) 5200] on arvioitu simpansseissa rokote-ehdokkaina.
10 Aktiivinen immunointi näillä rokotteilla aiheutti hyvän soluvälitteisen immuunivasteen sekä sytotoksisten T-solujen aktiivisuuden env-antigeeniä vastaan [Zarling, J., J. Immunol. 139 (1987) 988]. Kaikilla koe-eläimillä syntyi vasta- aineita rokotteen vaikutuksesta tutkittuna ELISA:n ja Wes- 15 tern blot -analyysin avulla. Kuitenkaan immunoidut simpanssit eivät kehittäneet ollenkaan tai kehittivät ainoastaan alhaisia HIV-l:n vastaisen neutraloivan vasta-aineen tiit-tereitä. Ärsytys elävällä viruksella ei suojannut simpansseja näitä rokotteita vastaan. Simpansseista löytyi varhain 20 infektiossa tyyppispesifisiä HIV-l:tä neutraloivia vasta-aineita gp 120:n C-päätepuoliskossa olevaa vaihtuvaa domee- i · *
: nia (V3) vastaan [Goudsmit, J., Proc. Natl. Acad. Sci. USA
• * · > · * * 85 (1988) 4478] . Hyönteissoluissa valmistetun rekombinant- ti- gp 120:n on myös osoitettu aiheuttavan humoraalisen im- * * 25 muunivasteen vuohissa [Rusche, J., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84 (1987) 6294] . Zagury [Nature 332 (1988) 728] ovat
osoittaneet sekä esitiedollisen humoraalisen että soluvälitteisen immuunireaktion ihmisissä käytettäessä rokotevi-rusrekombinanttia, joka ilmentää gp 160. [Chakrabarti, S., [·»·. 30 Nature 320 (1986) 535; Hahn, B., Proc. Natl. Acad. Sci. USA
I · Ί' 82 (1985) 4813] . Todettiin myös sekä ryhmäspesifinen solu- * « :’·* välitteinen immuniteetti että soluvälitteinen sytotoksisuus infektoituja T4-soluja vastaan. Nämä tulokset osoittavat, . .·. että voidaan aikaansaada immuunitila HIV-l:tä vastaan ihmi- • · · >i>#: 35 sissä käyttämällä rekombinantti-env-perustaista rokotetta.
Desrosiers on hiljattain osoittanut, että rokottaminen 4 114318 inaktivoidulla kokonaisella apinan immuunikatoviruksella (SIV) voi suojata makakeja elävällä SIV:11a ärsyttämistä vastaan. [Proc. Natl. Acad. Sei. USA 86 (1989) 6353]. Nämä tiedot antavat toivoa, että rokotesuojaus ihmisen AIDS-5 virus HIV-1-infektiota vastaan voi olla mahdollinen.
Chanda esittelee HIV-l:n kuoriglykoproteiinien runsaan ilmentymisen rev-geenin läsnä ollessa käytettäessä auttajasta riippumattomia adenovirus tyyppi 7 -rekombi-nantteja. [Virology 175 (1990) 535]. Vernon esittelee HIV- 10 l-gag-.in sisältävien hiukkasten, jotka on koottu rekombi-nanttiadenovirusvektorijärjestelmässä, hienorakenteen karakterisoinnin. [J. Gen. Virology 72 (1991) 1243]. Vernon esittelee myös HIV-l-rekombinanttiadenovirusten Ad7-rev-gag ja Ad4-rev-gag valmistuksen.
15 Keksinnön yhteenveto Tämä keksintö tarjoaa menetelmän rokotteen valmistamiseksi vasta-aineiden tai soluvälitteisen immuniteetin tuottamiseksi tarttuvaa organismia vastaan lämminverisessä nisäkkäässä. Keksinnön mukaisessa menetelmässä valmistetaan 20 replikoimalla tai insertoimalla sopiva geeni adenoviruk- . . seen elävä rekombinattiadenovirus, jossa elävän rekombi- • · * ”·/ nanttiadenoviruksen virionin rakenneproteiini ei ole muut- » · · ’·' ' tunut alkuperäisestä adenoviruksesta, josta rekombinant- ? tiadenovirus on tuotettu, ja joka sisältää geenin, joka • *.· 25 koodaa antigeeniä, joka vastaa mainittuja vasta-aineita ; ’fi tai indusoi mainitun soluvälitteisen immuniteetin, jolloin rekombinanttiadenovirus on Ad7-tplenv-tplHrev, Ad7-tplgag- tplHrev, Ad7-rev-gag, Ad4-tplenv-tplHrev, Ad4-tplgag- tplHrev, Ad4-rev-gag, Ad5-tplenv-tplHrev tai Ad5-tplgag- ,*··. 30 tplHrev (talletettu ATCC talletusnumeroilla VR-2299, VR- 2293, VR-2392, VR-2293, VR-2391, VR-2390, VR-2297 ja vas- : ’* taavasti VR-2298), jolloin Ad4, Ad5 ja Ad7 ovat ihmisen » % » adenoviruksia tyyppi 4, 5 ja 7, joista E3-alue on poistet- . .·. tu, env on HIV-kuoriglykoproteiini (gp 160) -geeni, gag on » » 35 HIV-gag/pro-geeni, rev on HIV-säätelygeeni, Hrev on rev-geenin muutettu versio, jossa nukleotidisekvenssit on muu- 5 114318 tettu muuttamatta aminohapposekvenssiä käyttäen kodoneja, joita usein käytetään ihmisen geeneissä, ja Tpl on vastavirrassa sijaitsevan adenoviruksen kolmiosainen johtose-kvenssi, jossa on välisekvenssi ensimmäisen ja toisen joh-5 tosekvenssin välissä, ja jossa menetelmässä elävää rekom-binanttiadenovirusta käytetään rokotteen valmistuksessa, joka rokote on formuloitu annettavaksi nenäonteloon.
Keksinnön mukaisesti valmistettua rokotetta voidaan antaa sekä ennaltaehkäisevästi HIV-l:lle alttiille nisäk- 10 käälle että immunohoitona sen jälkeen kun HIV on todettu mainitussa nisäkkäässä. Seuraavia rekombinanttiadenoviruk-sia sisältäviä hoito-ohjelmia käytettiin anti-HIV-vasteiden tuottamiseen.
Viruksen 15 nimi Kuvaava nimi ATCC-nimi
Ad7-env Ad7-tplenv-tplHrev VR-2299
Ad7-gag Ad7-tplgag-tplHrev VR-2393
Ad7-gag-l Ad7-rev-gag VR-2392
Ad4-env Ad4-tplenv-tplHrev VR-2293 20 Ad4-gag Ad4-tplgag-tplHrev VR-2391 . , Ad4-gag-l Ad4-rev-gag VR-2390 • > *;;/ Ad5-env Ad5-tplenv-tplHrev VR-2297 *·' ’ Ad5-gag Ad5-tplgag-tplHrev VR-2298
t t I
Viitaten yllä olevaan taulukkoon Ad4, Ad5 ja Ad7 ;".· 25 tarkoittavat vastaavasti ihmisen adenoviruksia tyyppi 4, 5 t · » • *,· ja 7, joista E3-alue on poistettu. Env viittaa HIV-kuori- : : : glykoproteiini (gp 160) -geeniin. Gag viittaa HIV-gag/pro- geeniin. Rev viittaa HIV-säätelygeeniin. Hrev viittaa rev-geenin muutettuun versioon, jossa nukleotidisekvenssit on ,···, 30 muutettu muuttamatta aminohapposekvenssiä käyttäen kodone- ·’ ja, joita usein käytetään ihmisen geeneissä. Tpl viittaa : ’* vastavirrassa sijaitsevaan adenoviruksen kolmiosaiseen joh- tosekvenssiin, jossa on välisekvenssi ensimmäisen ja toisen , johto sekvenssin välissä, jotka sijaitsevat rekombinantti- tl» 35 geenien edessä.
6 114318
Kuten alla on kuvattu yksityiskohtaisesti, Ad-HIV-rekombinanttivirusten antaminen nenäontelon sisään ennestään ärsyttämättömille simpansseille johti sekä humoraali-sen että soluvälitteisen immuunivasteen, jotka oli suunnat-5 tu HIV-rekombinanttiantigeenejä vastaan, sekä alulle panemiseen että tehostukseen. Simpansseille annettujen rekombi-nanttiadenovirusten osoitettiin tuottavan vasta-aineita HIV:n env- ja gag-proteiineja vastaan. HIV:lie spesifisiä IgG-vasta-aineita havaittiin nenä-, sylki- ja emättimen 10 eritteissä rekombinanttiadenovirusten antamisen jälkeen ja HIV:lie spesifisiä IgA-vasta-aineita havaittiin nenä- ja sylkieritteissä. Ensimmäinen ryhmä rekombinanttiviruksia (Ad7) näytti erittyvän pisimmän aikaa ja aiheuttavan parhaan anti-Ad-vasta-ainevasteen. Tulokset osoittivat myös, 15 että Ad-HIV-rokotteiden antaminen nenäontelon sisään oli tehokkaampaa kuin suolistoliukoisten rekombinanttivirusval-misteiden antaminen suun kautta.
Optimaaliset HIV-antigeenejä vastaan suunnatut immuunivasteet vaativat primaarisen infektion ja yhden tehos-20 tusimmunoinnin heterotyyppisellä rekombinantti-Ad-HIV:llä . . voimakkaiden HIV:n vastaisten sitoutuvien vasta-aineiden • · » * · » synnyttämiseksi. Ad-HIV-virusten antaminen nenäontelon si- t » > *·* * sään herätti simpanssit tehokkaasti vastaamaan korkeatiit- » ♦ » ··.; terisillä HIV-l:n vastaisilla neutraloivilla vasta-aineilla : 25 sen jälkeen kun oli annettu myöhempi HIV-1- • 'alayksikköproteiinitehostusimmunointi .
! : : Keksinnön yksityiskohtainen kuvaus
Edustavien rekombinanttiadenovirusten valmistus Seuraavat esimerkit esittävät edustavien tämän kek- * * * * * ,···, 30 sinnön mukaisella menetelmällä valmistettavan rokotteen re- • kombinanttiadenovirusten kokoonpanemisen. Rekombinanttivi- : ** ruksia lisättiin A549-soluissa ja titrattiin sen jälkeen käyttäen A549-soluja.
p > · I i t MM· 7 114318
Esimerkki 1. Ad7-gag-1
Rekombinanttiadenovirusten, jotka sisältävät geenin HIV-kuoriproteiinia varten, kokoonpaneminen on kuvattu [Chanda, P., Virology 175 (1990) 535]; samankaltaista mene-5 telmää käytettiin gag:in ja pro:n liittämiseksi [katso Vernon, S., J. Gen. Virology 72 (1991) 1243] . Lyhyesti kuvat tuna kokoonpantiin DNA-fragmentti, joka sisälsi HIV-1-kannan LAV [Wain-Hobson, S., Cell 40 (1985) 9] kokonaiset gag- ja pro-koodaavat alueet (emäsparit 335 - 2165) ja jos-10 sa oli ainoana esiintyvä Sa/l-kohta gag-geenin AUG-kodonin edessä ja Xbal-kohta emäsparin 2165 kohdalla virus- rev-reagoivan elementin liittämistä varten (rre; emäsparit 7178 - 7698). 2,37 kiloemäksen Sal-fragmentti, joka sisälsi kolme HIV-l-sekvenssiä, sijoitettiin Sal-kohtaan ilmentä-15 miskasettiin, joka sisälsi adenovirus tyyppi 7:n (Ad7) tärkeimmän myöhäisen promoottorin (MLP), kolmiosaisen johtose-kvenssin (TPL), jossa oli välisekvenssi ensimmäisen ja toisen johtosekvenssin välissä, ja heksonipolyadenylaatiokoh-dan (polyA) kuten on kuvattu julkaisussa Chanda [Virology 20 175 (1990) 535] . Kasetti sijoitettiin 159 emäsparin päähän , . Ad7-genomin oikeanpuoleisesta päästä [Sussenbach, The • t «
Adenoviruses, Ginsberg, toim., Plenum Press, s. 34 - 124 • » < *·’ ’ (1984) ] , joka Ad7-genomi sisälsi HIV-l-rev-geenin [Fein- berg, M., Cell 46 (1986) 807; Sodroski, J. , Nature 321 ; 25 (1986) 412] poistetulla [79,5 - 88,4 kartan yksikköä : (m.u.)] E3-alueella [Chanda, P. , Virology 175 (1990) 535].
: l Esimerkki 2. Ad4-gag-l
Noudattaen esimerkissä 1 olevaa menetelmää Ad7-gag-·[· 1-rekombinanttiadenoviruksen kokoonpanemiseksi, samankal- *·. 30 täinen ilmentämiskasetti, joka sisälsi vastaavia Ad4- I i » sekvenssejä ja kolme HIV-koodaavaa aluetta, sijoitettiin ’* kohtaan, joka oli 139 emäsparin päässä Ad4-genomin oikean- puoleisesta päästä, joka Ad4-genomi sisälsi HIV-l-rev:n E3-; deleetiossa välillä 76 - 86 kartan yksikköä.
i < · i * t » ·
» I
8 114318
Esimerkki 3. Ad5-env
Ad5-tplenv-tplHrev sisältää HIV-1 (LAV-kanta) -gpl60:n koko koodaavan sekvenssin ja rev-geenin muunnetun version nimeltä Hrev. Sekä env- että myös rev-geeniä edel-5 tää Ad5- kolmiosaisen johtosekvenssin (Ad5-tpl) synteettinen kopio. Ad5-tpl syntetisoitiin kemiallisesti ja kloonattiin pTZ-vektorissa. Sitten gpl60-DNA-sekvenssi sijoitettiin Ad5-tpl:n taakse, jolloin aikaansaatiin Ad5- tplenv/PTZ18R-klooni. Hrev (noin 360 emäsparia) syntetisoi-10 tiin myös kemiallisesti, jolloin nukleotidisekvenssejä muutettiin aminohapposekvenssiä muuttamatta kodonikäytännön avulla. Tämä tehtiin homologisen rekombinaation välttämiseksi, koska env:in ja rev:in kesken esiintyy joitakin identtisiä sekvenssejä. Vastaavalla tavalla kuin Ad5-15 tplenv-rakennelman tapauksessa, Hrev-geeni sijoitettiin myös tpl:n taakse pTZ18R-vektoriin, jolloin aikaansaatiin plasmidi Ad5-tplHrev. Ad5-tplHrev:in sisältävä koko sekvenssi irroitettiin ja sijoitettiin sitten Ad5-tplenv:n taakse, jolloin aikaansaatiin plasmidi Ad5-tplenv-tplHrev.
: ,·. 20 Tämä plasmidi liitettiin sitten Ad5-Marietta-kannan poiste- tulle E3-alueelle (78,8 - 85,7 kartan yksikön deleetio) * · ' kohdalle 78,8 kartan yksikköä. Tämä plasmidi tehtiin line- aariseksi Bgll-entsyymin avulla ja sekoitettiin sitten 0 - * 1 · • · ; 87 kartan yksikön SnaBl-fragmentin kanssa, joka oli saatu • * * ’t ’ 25 villityyppiä olevasta puhdistetusta Ad5-viruksesta. Sen V ' jälkeen kun A549-soluja oli transfektoitu DNA-seoksilla, rekombinanttivirusplakkeja poimittiin, niille suoritettiin plakkipuhdistus kolme kertaa ja niiden genomirakenteet var-(riistettiin infektoiduista soluista uutetun DNA:n restrik-30 tioendonukleaasikohta-analyysin avulla käyttäen Hirtin me-netelmää [J. Mol. Bio. 26 (1967) 365].
• » • · ·;* Esimerkki 4. Ad5-gag : Ad5-tplgag-tplHrev sisältää koko gag- ja pro-alueen *;··· sekä muunnetun rev-geenin Hrev. Ad5-synteettisen kolmiosai- 35 sen johtosekvenssin kopio sijoitettiin gag- ja Hrev-geenien eteen. Kokoonpantiin DNA-fragmentti, joka sisälsi kokonaan T14316 9 gag- ja pro-alueet (HIV-1:n LAV-kannan emäsparit 335 -2165) ja jossa oli ainoana esiintyvä Sali-kohta gag-geenin AUG-kodonin edessä ja xba-kohta emäsparin 2165 kohdalla, virus-rev-reagoivan elementin sijoittamista varten (rre; 5 emäsparit 7178 - 7698). Kaksi erillistä plasmidia Ad5- tplgag sekä Ad5-tplHrev kokoonpantiin samanlaisella tavalla kuin on kuvattu Ad5-tplenv-tplHrev:iä varten. Sitten Ad5-tplHrev-fragmentti sijoitettiin Ad5-tplgag:in taakse, jolloin aikaansaatiin plasmidi Ad5-tplgag-tplHrev. Sitten 10 fragmentti Ad5-tplgag-tplHrev sijoitettiin Ad5-Marietta-kannan, jossa oli E3-deleetio (78,8 - 85,7 kartan yksikön E3-deleetio) , ainoana esiintyvään Xbal-kohtaan kartan asemaan 78,8. Sitten lopullinen plasmidi, joka sisälsi Ad5-sekvenssin, tehtiin lineaariseksi ja sekoitettiin sitten 15 0 - 87 kartan yksikön SnaBl-virusfragmentin kanssa trans- fektiota varten. Poimittiin rekombinanttiplakkeja, niille suoritettiin plakkipuhdistus kolme kertaa ja ne tarkistettiin infektoiduista soluista uutetun DNA:n Hirt-analyysin avulla.
; 2 0 Esimerkki 5. Suolistoliukoisia kapseleita t I I · ,·>._ Rekombmanttiadenoviruksia kasvatettiin A549- soluissa ja koottiin sen jälkeen kun oli suoritettu 3 jak-soa jäädytys-sulatusta. Kirkastetut infektoitujen solujen * * · ·" solulysaatit lyofilisoitiin ja 60 - 100 mg pakattiin #2 ge- • ·’ 25 latiinikapseleihin käyttäen 1 ml:n ruiskun mäntää kuiva- *.· : tuissa olosuhteissa. Kapselit päällystettiin liuoksella, jossa oli 10 % selluloosa-asetaattiftalaattia asetonis- 'j* sa/100 % etanolia (1 : 1) , kastamalla käsin kumpikin pää 6 kertaa ilmakuivaten kastelujen välissä. 69 - 77 mg sellu-30 loosa-asetaattiftalaattia käsittävä päällyste muodostui • » · näissä olosuhteissa. Testattiin näytekapseleiden kestävyys
• I
’*;·* jäljitellyn mahanesteen suhteen (0,32 % pepsiiniä, 0,2 % ::: NaCl pH 1,2) 37 °C:ssa käyttäen VanKel Disintegration Tes- ·;*·; tor -laitetta 1 tunnin ajan. Kapselit tutkittiin reikien 35 tai säröjen suhteen ja siirrettiin 15 ml:n putkeen, joka sisälsi 10 ml jäljiteltyä suolinestettä (1,0 % pankreatii- 10 114318 nia, 0,05 M yksiemäksistä kaliumfosfaattia pH 7,5), ja pyöritettiin 37 °C:ssa. Kaikki testatut kapselit olivat kestäviä jäljitellyn mahanesteen suhteen 1 tunnin ajan 37 °C:ssa sekoitettaessa ja alkoivat liueta 15 minuutin kuluessa jäl-5 jitellyssä suolinesteessä. Viruksen määrä titrattiin kon-fluenteilla A549-solujen yksisolukerroksilla plakkianalyy-sin avulla ja virus-DNA:n stabiilius varmistettiin Hirt-analyysin avulla.
Hoito-ohjelmia 10 Rekombinanttiadenovirusten immunogeenisyys HIV-.n suhteen arvioitiin simpansseissa käyttäen kolmea hoito-ohjelmaa. Ensimmäisessä ohjelmassa annettiin rekombinant-tiadenovirusta suun kautta suolistoliukoisen kapselin avulla (esimerkki 5) ajankohtina 0, 7 ja 26 viikkoa, mitä seu-15 rasi env + gag-alayksikköproteiinitehoste käyttäen alunaa adjuvanttina. Toisessa ohjelmassa simpansseja, jotka vastaanottivat ohjelman 1, käsiteltiin lisäksi ajankohtina 46 ja 58 viikkoa lisätehostuksilla, jotka käsittivät rekombi-nanttiadenovirusta annettuna nenäontelon sisään. Kolmannes-,·. 20 sa hoito-ohjelmassa annettiin rekombinanttiadenovirusta ne- * i · * 1 $ näontelon sisään ennestään ärsyttämättömille simpansseille • · · * . ajankohtina 0, 24 ja 52 viikkoa, mitä seurasi env- alayksikkötehostus ajankohtana viikon 72 kohdalla.
• 1 · ; Seuraava taulukko esittää pääkohdittain hoito- ·' ·' 25 ohjelmat 1 ja 2.
• » · • · · • · I t • · I · • I » t • 1 1 • · * · • » » • t » 1 · 1 » • · 11 114318
Hoito-ohjelmat 1 ja 2
Immunointi Ajankohta Simpanssit 1 ja 2 Simpanssi 3
Ohjelma 1 primaarinen10 viikkoa 1,5 x 107 pfu Ad7-env 1,5 x 107 pfu Ad7-env 5 2,0 x 109 pfu Ad7-gag-l 1. tehostin1 7 viikkoa 1,1 x 1010 pfu Ad4-env 1,1 x 1010 pfu Ad4-env 1.0 x 1010 pfu Ad4-gag-l 2. tehostin1 26 viikkoa 7,9 x 1010 pfu Ad5-env 7,9 x 1010 pfu Ad5-env 3. tehostin1 34 viikkoa 200 Mg env 0,2 % alunassa 200 Mg env 0,2 % alunassa 10 500 Mg env 0,2 % alunassa
Ohjelma 2 1. tehostin 46 viikkoa 1,0 x 108 pfu Ad7-env 1,0 x 108 pfu Ad7-env nenäonteloon 1,0 x 108 pfu Ad7-gag 2. tehostin 58 viikkoa 1,0 X 108 pfu Ad4-env 1,0 x 108 pfu Ad4-env 15 nenäonteloon 1,0 x 108 pfu Ad4-gag *Kukin annos annettiin suolistoliukoisissa gelatiinikapseleissa 3 peräkkäisenä päivänä.
+Annettu lihakseen.
pfu = plakin muodostava yksikkö j 20 Seuraava taulukko esittää pääkohdittain hoito- , ohjelman 3.
* · · ♦ t !! ! Hoi to-ohjelma 3 • · ,, , Immunointi Ajankohta Simpanssit 4 ja 5 Simpanssi 6 • · » t • 1 25 primaarinen10 viikkoa 1,0 x 107 pfu Ad7-env 1,5 x 107 pfu Ad7-env • 1,0 x 107 pfu Ad7-gag 1. tehostin1 24 viikkoa 1,0 x 107 pfu Ad4-env 1,5 x 107 pfu Ad4-env 1.0 x 107 pfu Ad4-gag • I 2. tehostin152 viikkoa 1,0 x 107 pfu Ad5-env 1,5 x 107 pfu Ad5-env ;·, 3 0 1,0 x 107 pfu Ad5-gag » 1 · *·· 3. tehostin175 viikkoa 0,5 mg env • · • · t . ‘Annettu nenäontelon sisään.
t » » · *Annettu lihakseen.
I pfu = plakin muodostava yksikkö.
12 114318
Immunogeenisyyden mittaus: Hoito-ohjelma 1 Simpanssien rokotukset
Kolme simpanssia (2 urosta ja 1 naaras), jotka oli seulottu negatiivisiksi ihmisen adenovirustyyppien 4 ja 7 5 vastaisten neutraloivien vasta-aineiden läsnäolon suhteen, arvioitiin käyttäen hoito-ohjelmaa 1. Suolistoliukoisia kapseleita, jotka sisälsivät rekombinanttiadenoviruksia, annettiin mahaletkua käyttäen, nukuttaen, kolmena peräkkäisenä päivänä. Kaksi simpanssia (1 ja 2) sai sekä env- että 10 gag-rekombinanttiviruksia, kun taas kolmas simpanssi (3) sai ainoastaan env-rekombinanttiviruksia.
Adenoviruksesta peräisin olevia alayksikkövalmis-teita, jotka sisälsivät env- tai gag-geenien tuotteita, puhdistettiin infektoitujen A549-solujen viljelmistä [katso 15 Vernon, S., J. Gen. Virology 72 (1991) 1243 ja Natuk, R. ,
Proc. Natl. Acad. Sei. USA 89 (1992) 7777]. Rekombinant- tiantigeenejä formuloitiin aluna-adjuvantin kanssa ja annettiin lihakseen 200 μg/annos env- ja 500 Mg/annos gag-hiukkasia.
• 2 0 Kokoveri-, seerumi- ja ulostenäytteitä koottiin eri * * ♦ · ajankohtina kokeen kuluessa. Kokoveri käsiteltiin veren * * · valkosolupopulaatioiden saamiseksi FACS-, HIV-CTL-analyy- t sejä varten (käyttäen rekombinanttivaeeiniaviruksia, jotka * · ) ilmensivät HIV-env-, HIV-gag- tai lac-geenin tuotteita) ja * · \ 25 sellaisia analyysejä varten, jotka koskivat imukudoksen ' laajenemista pudistettua HIV-rekombinantti-gpl60:tä, -gpl20:tä ja -p24:ää vastaan. Seerumi- ja ulostenäytteitä säilytettiin -70 °C:ssa käyttöön asti.
i * I
·,,/ Rekombinanttiadenovirusten osoittaminen ulostenäyt- ;·. 30 teistä t t *
Simpanssien ulostenäytteitä sulatettiin ja valmis- • t T tettiin 10 % (tilavuus/tilavuus) suspensioita antibioottia sisältävään DMEM-elatusaineeseen. Käytettiin kirkastettuja t ulostesuspensioita konfluenttien A549-solujen yksisoluker-35 rosten infektointiin 60 mmm kudosviljelymaljoilla. Yhden tunnin adsorptioajan jälkeen sitoutumaton materiaali pes- 13 114318 tiin pois ja yksisolukerrokset peitettiin 0,5 % agar-peite-elatusaineella. Plakkien annettiin kehittyä 7-10 päivän ajan ja plakit tehtiin näkyviksi neutraalipunavärjäyksen avulla, laskettiin ja agarpeite poistettiin huolellisesti 5 varoen rikkomasta yksisolukerrosta. Solulevy siirrettiin nitroselluloosasuodatinkalvoille (Millipore Type HA, 0,45 Mm) , jotka oli esiliotettu 20X SSC -liuoksessa ja pantiin solukerrokselle ja jätettiin kosketuksiin yksisolukerroksen kanssa 2-4 minuutin ajaksi. Suodattimet kuorittiin pois, 10 ilmakuivattiin ja niitä kuivattiin 2 tunnin ajan tyhjöuu-nissa 80 °C:ssa. Nitroselluloosasuodattimet pestiin kaksi kertaa 3X SSc/0,1 % SDS -liuoksessa huoneenlämpötilassa ja esihybridisoitiin ja hybridisoitiin yleisten menetelmien mukaan [Poncet, D., J. Virol. Methods 26 (1989) 27].
15 32P:lla merkittyjä oligokoettimia lisättiin hybridisaatio-puskuriliuokseen (1 x 106 pulssia minuutissa) ja inkuboi-tiin yön ajan 42 °C:ssa. Oli valmistettu DNA-koettimia, jotka kykenivät osoittamaan joko Ad4-säie-, Ad5-säie-, Ad7-säie-, HIV-env- tai HIV-gag-spesifisiä sekvenssejä. [Wain- , 20 Hobson, Cell 40 (1985) 9] . Suodattimet pestiin, suoritet- * 9 ·; * tiin niiden autoradiografia ja hybridisaatiosignaalit las- '·’ * kettiin.
...: Adenovirusneutralisaatiotestimenetelmiä • · · • V Valmistettiin lämmöllä inaktivoidun (56 °C 30 mi- t ( * | ’ : 2 5 nuutin ajan) koiran seerumin kaksinkertaisten laimennosten sarja (lähtien laimennoksesta 1:4) 96-kuoppaisille mikro-tiitterilevyille (0,05 ml/kuoppa) ja sekoitettiin 0,05 ml:n kanssa elatusainetta, joka sisälsi 30 - 100 TCID50 virusta, • « · * ,···, 1 tunnin ajaksi 37 °C:ssa. Kuhunkin kuoppaan lisättiin 0,05 * · • 30 ml elatusainetta, joka sisälsi 2 x 104 A549-solua, ja levy- : '* jä inkuboitiin 37 °C:ssa 5 % C02-pitoisuudessa 7-10 päi- $ * % ·...’· vän ajan. Kaikista näytteistä tehtiin kaksi rinnakkaista « . koetta. Virus- ja infektoimattomia solukontrolleja sisälly- tettiin kuhunkin määritykseen päätepisteen määrittämiseksi » · 35 koeseerumeissa. Tiitterit ilmaistiin sen alhaisimman lai- 14 114318 mennoksen käänteisarvona, jolla havaittiin 50 % sytopaatti-nen vaikutus.
Anti-HIV-vasta-aineiden osoittaminen ELISA:n ja Western blot-analyysin avulla 5 Simpanssien vasta-ainevasteet HIV-1-antigeenejä vastaan mitattiin testaamalla erilaisia laimennoksia kaupallisten ELISA- ja Western blot-tarvikkeiden avulla valmistajien ohjeiden mukaan (DuPont, Wilmington, DE).
Tulokset 10 Ulosteita koottiin kultakin simpanssilta ennen vi- rusrokotusta ja sen jälkeen ja ne säilytettiin -70 °C:ssa. Kustakin näytteestä valmistettiin 10 % suspensioita ja niitä käytettiin konfluenttien A549-solujen yksisolukerrosten infektointiin. 7-10 päivän kuluttua virusplakkeja identi-15 fioitiin neutraalipunavärjäyksen avulla ja yksisolukerrok-set siirrettiin nitroselluloosakalvoille. Edustavia näytteitä hybridisoitiin erilaisten merkittyjen oligokoettimien kanssa Ad4-, Ad5-, Ad7-, HIV-env- tai HIV-gag-geeneille spesifisten sekvenssien osoittamiseksi. Spesifisten rekom-20 binantti-Ad-HIV-virusten identifiointi voitiin suorittaa ·" * tämän plakkihybridisaatiotekniikan avulla. Yhtäkään rekom- • » · '·* * binanttiviruksista ei erittynyt ulosteisiin kauemmin kuin 7 päivää rokotuksen jälkeen. Huipputiitterit liittyivät aina • *.· 1-3 päivän näytteisiin ja edustivat todennäköisimmin ad- \ 25 sorboitumatonta virusrokotetta. Aikaisemmat simpanssitutki- mukset, joissa oli käytetty Ad-HBsAg-rekombinantteja, olivat osoittaneet, että Ad-HBsAg-rekombinantteja voitiin to-deta 30 - 4 0 päivää rokotuksen jälkeen. Näytti siltä, että ,···, suolistokapseliantamisreittiä käytettäessä nämä rekombi- » · • 3 0 nanttivirukset eivät lisääntyneet hyvin in vivo.
• * : “ Käytettyjen adenovirusvektorien serotyyppiä vastaa- ·...· vien vasta-aineiden syntyminen määritettiin neutralisaatio- . testimenetelmien avulla. Hyvin alhaisia tai pieniä an- • · · tiadenovirusseerumitiittereitä mitattiin kaikille 3 sero- • · 35 tyypille, joita oli käytetty kussakin simpansseista.
15 114318
Vasta-aineiden syntyminen rekombinantti-HIV-geenien tuotteita vastaan määritettiin joko ELISA- tai Western blot -tekniikan avulla. ELISA-vastetta ei todettu missään simpansseista ennen toista tehostusrokotusta Ad5-env-5 rekombinantilla. Kaksi viikkoa Ad5-env-rokotuksen jälkeen anti-env-vasteita voitiin mitata kahdessa kolmesta eläimestä. gag- ja/tai env-valmisteiden injektoinnilla lihakseen oli lievä tehostusvaikutus yhdessä kolmesta eläimestä. Western blot -analyysi näytti olevan paljon herkempi kuin ELI-10 SA, ja sen lisäetuna oli, että se identifioi, mitkä env-ja/tai gag-geenin tuotteet tunnistettiin immunogeenisinä. Alhaisia seerumin vasta-ainetiittereitä mitattiin sekä primaarisen Ad7-rekombinantin antamisen että ensimmäisen tehostuksen Ad4-rekombinanttiviruksilla jälkeen. Merkittävä 15 suureneminen seerumin tiiterissä env-geenin tuotteita vastaan havaittiin toisen tehostusimmunoinnin Ad5-env-rekombinantilla jälkeen. Merkittäviä suurenemisia 2 eläimellä, jotka saivat gag-geenin tuotteita, havaittiin alayk-sikkövalmisteiden injektoinnin jälkeen. Huolimatta suhteel- . . 20 lisen hyvistä HIV-antigeenien vastaisista Western blot * · · • « » *",· -tiittereistä ainoastaan yksi kolmesta eläimestä vastasi • · * *·’ ' seerumin neutraloivien vasta-aineiden avulla. Tämä vaste
« » I
···: simpanssissa 2 oli hyvin alhainen (tiitteri 10 - 20) .
: .· Nämä tulokset on esitetty tiivistelmänä seuraavassa •» * • ',! 25 taulukossa.
• · * » · > · » * » » » i » · 16 114318
Tulokset, jotka on saatu käyttäen hoito-ohjelmaa 1
Rekobinantti- Huippu- Western blot Huippu-
Sim- viruksen antiadeno- -huippu-anti- anti-HIV- panssi Rekorabinantti- erittyminen neutralointi- HIV-tiitterit neutraloin- nro virus ulosteet (pfiiviÄ) tiitteri cnv gag titiitteri 1 Ad7-cnv. Ad7-gag-l 2,2 128 - 20 <10
Ad4-cnv, Ad4-gag-l 2,2 8 - 20 <10
Ad5-cnv 7+ 128 100 - <10 alayksikkö: env + gag 100 1000 <10 2 Ad7-cnv, Ad7-gag-l 3,2 64 - 20 <10
Ad4-env, Ad4-gag-l 1,7 128 20 100 <10
Ad5-cnv 7 + 64 10000 - 20 alayksikkörenv + gag 1000 10000 10 3 Ad7-cnv 2 6 20 N/A* <10
Ad4-cnv 1 128 20 N/A <10
Ad5-cav 7+ 512 1000 N/A <10 alayksikkö:env 100 N/A <10 *N/A= ei käyttökelpoinen
Soluvälitteinen immuniteetti mitattiin periferisen 5 veren yksitumaisten solujen populaatiossa, joka oli saatu simpansseilta. HIV-spesifinen CTL-aktiivisuus mitattiin määrittämällä sellaisten syngeenisten kohdesolujen lyysi, jotka oli infektoitu vacciniavirusrekombinanteilla, jotka ilmentävät joko HIV-env-geenin tuotteita, HIV-gag-geenin * t · : 10 tuotteita tai lac-geenin tuotetta (kontrolli epäspesifisen v · sytotoksisuuden määrittämiseksi) . Vihje HIV-spesifisestä CTL:n kaltaisesta aktiivisuudesta mitattiin tällä tavalla.
: ' : Suoritettiin imukudoksenlaajenemisanalyysejä tar- koituksessa määrittää, kykenivätkö puhdistetut rekombinant- • * .'j'. 15 ti-env (gpl60, gpl20) tai gag (p24) -valmisteet stimuloi maan blastogeneesiä. Lisääntymistä ei mitattu primaarisen t;t rokotteen jälkeen, ja ainoastaan yksi kolmesta eläimestä ’!!! osoitti imukudoksenlaajenemisvastetta sen jälkeen kun oli * % V annettu ensimmäinen tehostus Ad4-rekombinanttiviruksilla.
; 2 0 Kaikki kolme eläintä vastasivat imukudoksenlaajenemisvas- : : teella toisen tehostuksen (Ad5-env) ja kolmannen tehostuk- ’·φ sen (alayksikkövalmisteita) jälkeen.
♦ I ·
Immunogeenisyyden mittaus: hoito-ohjelma 2 Simpanssien rokotukset ja tietojen keräys 25 Kolme simpanssia (2 urosta ja 1 naaras), jotka oli aikaisemmin rokotettu suolistoliukoisissa kapseleissa ole- 17 114318 villa Ad-HIV-rekombinanttiviruksilla ja tehostettu käyttäen adenoviruksesta peräisin olevia gag- ja/tai env-alayksik-köjä (hoito-ohjelma 1) , infektoitiin nenäonteloon antaen Ad7-HIV-viruksilla (viikko 46) ja 12 viikkoa myöhemmin 5 (viikko 58) Ad4-HIV-viruksilla. Rekombinanttiadenoviruksia annettiin kudosviljelyelatusaineessa, joka oli laimennettu fosfaatilla puskuroidulla suolaliuoksella, tipoittain nukutettujen simpanssien sieraimiin. Kaksi simpanssia (numerot 1 ja 2) sai sekä env- että gag-rekombinanttiviruksia, kun 10 taas kolmas simpanssi (numero 3) sai ainoastaan env-rekom-binanttiviruksia.
Kokoveri-, seerumi- ja ulostenäytteitä koottiin eri ajankohtina kokeen kuluessa ja käsiteltiin, kuten on kuvattu ohjelmassa 1. Adenoviruksen osoittaminen ulostenäytteis-15 tä tai nenävanupuikoista, adenovirusneutralisaatiotestime-netelmät ja anti-HIV-vasta-aineiden osoittaminen suoritettiin ohjelmassa 1 kuvattujen menetelmien mukaan.
Tulokset
Ensimmäinen nenäonteloon annettu tehostus Ad7-; 20 rekombinanteilla annettiin yhtenä annoksena, joka käsitti » i * ’!!,* 1 x 108 plakin muodostavaa yksikköä (pfu)/simpanssi. Viruk- • · · • · · * . sen antamisen ajankohtana simpansseilla 3, 1 ja 2 oli ai- «i* kaisemmista oraalisista immunoinneista peräisin oleva see- • · · • ·' rumin anti-Ad7-neutralointitiitteri vastaavasti (4, 8 ja : *.* 25 64. Nenävanupuikot ja ulostenäytteet tutkittiin erittynei- V · den rekombinanttivirusten läsnäolon suhteen plakkihybridi- saatiotekniikan avulla. Rekombinantti-Ad7-env todettiin ne- ·;· nävanupuikoissa 7. päivään infektoinnin jälkeen saakka kah- » · · » i”*. della eläimistä. Rekombinantti-Ad7-env ja -Ad7-gag todet- • · » ..· 30 tiin olevan läsnä ulostenäytteissä 5-12 päivää infektoin- » i • nin jälkeen. Esiintyi korrelaatio Ad7:n vastaisen seerumin • · *···* tiitterin ja kyvyn todeta rekombinanttiviruksia nenä- : vanupuikoissa ja ulostenäytteissä välillä. Kahta eläintä,
Ml ·;··; joilla esiintyi marginaalinen anti-HIV-vasta-ainevaste, 35 avusti suuresti nenäonteloon annettu tehostus. Kolmas eläin • · tehostui vähemmässä määrin. Alhaisen tiitterin omaavia 18 114318 HIV:tä vastaan suunnattuja neutraloivia vasta-aineita voitiin nyt todeta kaikissa kolmessa eläimessä. Sekretorisia vasta-aineita todettiin nenävanupuikkonäytteissä, jotka sisälsivät anti-gag- ja/tai -env- sitovia vasta-aineita. Hen-5 gityssairauden merkkejä tai oireita ei havaittu näissä eläimissä tuloksena Ad7-rekombinanttivirusten antamisesta nenäonteloon.
Kolme kuukautta myöhemmin nämä simpanssit immunoi-tiin Ad4-rekombinanteilla käyttäen yhtä ainoaa annosta, jo-10 ka käsitti 1 x 108 pfu/simpanssi/virus. Näillä eläimillä oli aikaisemmasta oraalisesta immunoinnista peräisin oleva seerumin anti-Ad4-neutralointitiitteri väliltä 128 - 256 nenäonteloon annetun ärsykkeen ajankohtana. Ajankohtana 3 päivää infektoinnin jälkeen kahdella eläimistä (2 ja 3) oli 15 lievä yskä. Kolmas eläin (numero 1) kuoli päivänä 5 bakteerin aiheuttamaan keuhkokuumeeseen (Streptococcus pneumoniae eristettiin). Muut kaksi eläintä osoittivat käheitä ääniä kuuntelussa ja S. pneumoniae eristettiin kummastakin simpanssista. Antibioottihoidot pantiin alulle ja kummatkin ; 2 0 simpanssit toipuivat.
» i t Tämän tilanteen takautuvassa tarkastelussa voitiin • t · • i » ‘ , tehdä useita havaintoja. Nenäonteloon antamisen ajankohtana • · t !”· simpanssilla numero 1 oli jo kuume ja epänoraali täydelli- i i t • ·’ sen verisolujen laskennan tulos. Läsnä oli suhteeton määrä • · · : *.* 25 liuskatumaisia soluja ja 5 %-.n määrä sidesoluja (epäkypsiä V · liuskatumaisia soluja), ja yhdessä nämä tiedot osoittivat, että merkittävä bakteeri-infektio oli meneillään ennen vi-··· rusrokotusta. Ruumiinavausnäytteet, jotka oli otettu keuh-
Mm ;***; kosta, maksasta, pernasta ja seerumista, antoivat kaikki • · · 3 0 negatiivisen testituloksen tarttuvan adenoviruksen läsnä-
• I
olon suhteen kudosviljelyssä käytettäessä kolmea umpimäh- • % ’·* käistä alaviljelmän tekoa alttiiden A549-solujen yksisolu- : kerroksille. Samanlaisia havaintoja saatiin plakkihybridi- • · * ·;··· saatiotekniikkoj en avulla. Keuhkon ja maksan parafiiniin 35 upotetut näytteet antoivat negatiivisen testituloksen adenovirusantigeenien läsnäolon suhteen käytettäessä kau- 19 114318 pallisia immunofluoresointitarvikkeita adenovirusantigeene-jä varten. Solunsisäisiä kappaleita havaittiin H & E -värjätyissä keuhkoleikkeissä. Asiantuntijat olivat erimielisiä siitä, oliko adenovirus aiheuttanut nämä kappaleet 5 vai ei. Useita viikkoja myöhemmin toinen simpanssi koki sa-manalaisen kohtalon samassa kädellisten keskuksessa ja kuo li. Vaikka oli todennäköistä, että rekombinanttiadenovirus-ten antamisella oli ainoastaan toisarvoinen merkitys, mikäli ollenkaan merkitystä, simpanssin numero 1 kuoleman aihe-10 uttamisessa, katsottiin järkeväksi antaa antibiootteja ennaltaehkäisevästi ennen adenovirusrekombinanttien mitään lisäantamista nenäonteloon simpansseille ja tällaisen antamisen jälkeen.
Seuraava taulukko esittää tulokset, jotka on saatu 15 käyttäen hoito-ohjelmaa 1 ja Ad7-rekombinantteja ohjelmassa 2 .
Tulokset, jotka on saatu käyttäen hoito-ohjelmia 1 ja 2 : Rekobinantti- Huippu- Western blot Huippu- ··· · Sint- viruksen antiadeno- -huippu-anti- anti-HIV- panssi Rekorabinantti- erittyminen neutralointi- HIV-tiitterit neutraloin- • · · nro virus ulosteet (päiviä) tiitteri env gag titntteri * · » ...I 1 ohjelma 1
Ad7-cnv, Ad7-gag-l 2,2 128 · 20 <10 I . · Ad4-cnv, Ad4-gag-l 2,2 8 - 20 <10 ·· . Ad5-cnv 7+ 128 100 - <10 • alayksikkö; env ♦ gag 10Q 1000 <J0 ... Ohjelma 2 : : : Ad7-cnv, Ad7-gag 12 512 10000 10000 10 2 Ohjelma 1
Ad7-cnv, Ad7-gag-l 3.2 64 - 20 <10 ··· Ad4-cnv, Ad4-gag-l 1,7 128 20 100 <10 ·1" Ad5-env 7+ 64 10000 - 20 ί : alayksikkö: env + gag 1000 10000 10 1’ Ohjelma 2 ·. Ad7-env, Ad7-gag 9 8192 1000 10000 20 • · • · · • ·.. 3 ohjelma 1 : AU7-CI1V 2 6 20 N/A1 <10
Ad4-Ciiv 1 128 20 N/A <10 . .· Ad5-cnv 7+ 512 1000 N/A <10 alayksikkö, env 100 N/A <10 • Ohjelma 2
Ad7-ciiv 7 256 10000 N/A 10 N/A = ei käyttökelpoinen ,. ”«ie
Iiranunogeenisyyden mittaus: hoito-ohjelma 3 Simpanssien rokotukset ja tietojen keräys
Kolme simpanssia (2 urosta ja 1 naaras), jotka oli seulottu negatiivisiksi ihmisen adenovirustyyppien 4, 5 ja 5 7 vastaisten neutraloivien vasta-aineiden läsnäolon suh teen, arvioitiin käyttäen hoito-ohjelmaa 3. Kaksi simpanssia (numerot 4 ja 5) sai sekä env- että gag-rekombinantti-viruksia, kun taas kolmas simpanssi (numero 6) sai ainoastaan env-rekombinanttiviruksia. Simoansseille annettiin an-10 tibiootteja ennaltaehkäisevästi eikä hengitykseen liittyviä häiriöitä havaittu.
Kokoveri-, seerumi- ja ulostenäytteitä koottiin eri ajankohtina kokeen kuluessa ja käsiteltiin, kuten on kuvattu ohjelmassa 1. Adenoviruksen osoittaminen ulostenäytteis-15 tä tai nenävanupuikoista, adenovirusneutralisaatiokokeet ja anti-HIV-vasta-aineiden osoittaminen suoritettiin ohjelmassa 1 kuvattujen menetelmien mukaan.
Tulokset
Ensimmäinen immunointi Ad7-rekombinanteilla: Rekom-: 20 binanttiviruksia erittyi ulosteisiin 22 - 34 päivän ajan
Mt * infektoinnin jälkeen. Rekombinanttiviruksia ei todettu ne-näeritteissä, jotka oli otettu 2 viikkoa infektoinnin jäi- • · * · keen. Käytettyjen adenovirusvektorien serotyyppiä vastaavi- • t j. en vasta-aineiden syntyminen määritettiin neutralisaatio- * · *..) 25 analyysien avulla. Erinomaisia antiadenovirusseerumitiitte-
• · · t t I
• reitä mitattiin kaikissa 3 simpanssissa Ad7-serotyypeille, joita oli käytetty kussakin simpansseista. Vasta-aineiden syntyminen rekombinantti-HIV-geenien tuotteita vastaan mää- ·...· ritettiin Western blot -analyysin avulla. Neljä viikkoa I*. 30 primaarisen immunoinnin Ad7-rekombinanteilla jälkeen voi- « # .···. tiin anti-env- ja anti-gag-vasteita mitata kahdessa kolmes- k 1 i ·"* ta simpanssista. Ajankohtana 2 0 viikkoa infektoinnin jäi- * · · keen kaikilla 3 eläimellä oli mitattavissa olevia HIV- '}"· antigeenien vastaisia vasta-aineita. Sekretorisia vasta- « 35 aineita ei todettu nenävanupuikoissa, jotka oli otettu ensimmäisen 4 viikon kuluessa primaarisen immunoinnin jäi- 114318 21 keen. Mikään kolmesta simpanssista ei onnistunut tuottamaan todettavissa olevaa anti-HIV- neutraloiva vasta-aine -vastetta.
Ensimmäinen tehostusimmunointi Ad4-rekombinanteil- 5 la: Rekombinantti-Ad4-viruksia erittyi ulosteisiin 14 - 28 päivän ajan infektoinnin jälkeen. Nenävanupuikkojen tutkiminen osoitti, että rekombinantti-Ad4-viruksia voitiin todeta kaikissa 3 simpanssissa vähintään 7 päivän ajan infektoinnin jälkeen. Merkittäviä anti-Ad4-vasteita tuotettiin 10 Ad4-serotyyppiä vastaan nenäonteloon antamisen jälkeen. Suuruus oli hiukan pienempi kuin se, joka mitattiin Ad7-rekombinanttiviruksia vastaan. Erinomaisia tehostusvasteita gag- ja/tai env-antigeenejä vastaan mitattiin kaikissa kolmessa eläimessä. Alhaisen tiitterin omaavia (1:2) anti-gag-15 ja/tai anti-env-vasteita mitattiin simpansseilta 4 ja 5 saaduissa nenävanupuikoissa. Kuitenkaan anti-HIV-neutraloivia vasta-aineita ei mitattu missään eläimistä.
Toinen tehostusimmunointi Ad5-rekombinanteilla: Re-kombinantti-Ad5-viruksia erittyi ulosteisiin 8 päivän ajan 20 infektoinnin jälkeen. Rekombinanttiviruksia ei voitu todeta i · · nenävanupuikoissa ajankohtina 0, 1 tai 2 viikkoa infektoin- :· nin jälkeen. Sekretorista IgG ja IgA voitiin mitata kaikil- ta 3 eläimeltä otetuissa nenävanupuikoissa. Sekretorisia vasta-aineita todettiin kaikilta 3 eläimeltä kootusta syl- ,‘i\ 25 jestä ja yhdeltä naarassimpanssilta otetuista emätin- * » · vanupuikkonäytteistä. Anti-HIV- tyyppispesifisiä neutra- loivia vasta-aineita todettiin kaikissa kolmessa simpans- *!" sissa.
• · *”1 Tiivistelmätaulukkoja: Seuraava taulukko esittää • » l 30 tulokset, jotka on saatu käyttäen hoito-ohjelmaa 3.
• · · • · • · • ·· • · · · · • · · 22 114318
Tulokset, jotka on saatu käyttäen hoito-ohjelmaa 3
Rekobinantti- Huippu- western blot Huippu-
Sim- viruksen antiadeno- -huippu-anti- anti-HIV- panssi Rekombinantti- erittyminen neutralointi- HIV-tiitterit neutraloin- nro virus ulosteet (päiviä) tiitteri env gag titiitten 4 Ad7-cnv, Ad7-gag 22,22 1024 100 1000 <10
Ad4-cnv, Ad4-gag 14,14 128 10000 10000 <10
Ad5-cnv, Adf-gag 8,8 32 10000 10000 20 alayksikkö: env N/A1 N/A >10000 10000 640 5 Ad7-cny, Ad7-gag 34,27 1024 100 10000 <10
Ad4-cnv, Ad4-gag 14,14 512 10000 10000 <10
Ad5-cnv, Ad5-gag 8.8 32. 10000 10000 20 alayksikkö: env N/A N/A 1000 10000 320 6 Ad7-cnv 34 1024 100 N/A <10
Ad4-cnv 28 512 10000 N/A <10
Ad5-cnv 8 32 10000 N/A 40 alayksikkö: env N/A N/A >10000 N/A 320 *N/A = ei käyttökelpoinen 5 Seuraava taulukko esittää tiivistelmänä anti-HIV- vasteet, jotka on todettu simpanssien eritteissä sen jälkeen kun on annettu nenäonteloon tehosteimmunointina Ad5- HIV-rekombinanttej a.
• · • » · • > · M ) | • » · • 1 · • 1 · • · · • · 1 ·
• · I
• · · • · • « • · 1 • · • · • » · • · · • · · • » · * • · · 1 • · · • · • 1 • · · •
• I
• I
• · · • · • · • · ·
• I
· · Φ · » * · · 23 114318
Anti-HIV-vasteita/ jotka on todettu eritteissä viikkoja Analysoitu erite tehos--------—-----;-;—;-
Simpanssi Tunnistettu tuksen nenä sylki emätin
nro antigeeni jälkeen IgA_IgO_IgA IgG_IgA_igG
4 env 0 -1 2 3 360 - - - - 1 180 360 - 90 2 180 2880 20 20 - 90 4 720 1440 - 20 - 360 gag 0 180 - 1 360 360 20 90 2 720 28B0 - 20 - 90 4 720 720 20 90
5 cnv. 0 .... N/A+ N/A
1 90 N/A N/A
2 - 2880 - - N/A N/A
4 - 360 - N/A N/A
gag 0 ... - N/A N/A
1 -90 N/A N/A
2 90 1440 - - N/A N/A
4 360 - N/A N/A
6 cnv 0 .... N/A N/A
1 .... N/A N/A
2 - 1440 20 20 N/A N/A
4 - 360 -_-_N/A N/A
· · 2 • · · * - vastaa vähempää kuin 90 nenä- ja emätinvanupuikoi 11a ja • · · * . 5 vähempää kuin 20 sylkinäytteillä.
• · t ”·· +N/A = ei käyttökelpoinen.
' · · » · .1 Elävä rekombinanttiadenovirus käytettäväksi keksin- V : nön mukaan rokotteiden tuottamista varten voidaan rakentaa 10 sijoittamalla adenovirukseen sellaisen antigeenin koodaava 3 geeni, joka vastaa tarttuvan organismin vastaista vasta- ainetta lämminverisissä eläimissä tai joka aiheuttaa solu- • · · välitteisen immuniteetin tarttuvaa organismia vastaan läm- minverisissä eläimissä. Sijoittaminen voidaan suorittaa, ’·;·1 15 kuten on kuvattu julkaisussa P. K. Chanda et ai., Virology : 175 (1990) 535 - 547, katso erityisesti sivu 539.
» · · ·;··; Keksinnön mukaan käytettävä elävä rekombinant tiadenovirus voidaan puhdistaa plakkipuhdistuksen avulla. Virusmääriä voidaan suurentaa rokotteen tuottamista varten 20 sopivassa isännässä tapahtuvan replikaation avulla. Lisää- 24 114318 minen voidaan suorittaa soluviljelmässä. Soluviljelmän solut ovat edullisesti BK (naudan munuaisen) -soluja tai ihmisen syöpäsoluja, erityisesti ihmisen kohdunkaulasyöpä-soluja, esimerkiksi Hela-solulinjaa, tai ihmisen keuh-5 kosyöpäsoluja, esimerkiksi A549-solulinjaa. Virusta voidaan säilyttää -70 °C:ssa elatusaineissa kuten DMEM-elatus-aineessa, jossa on 5 % sikiökautisen vasikan seerumia.
Nenäonteloon annettava rokote voi sisältää virusta stabiloimisaineen, esimerkiksi SPGA:n (sakkaroosi, fosfaat-10 ti, glutaraatti ja albumiini) ja haluttaessa yhden tai useamman sokerin kanssa.
Keksintöä käytetään edullisesti kädellisten lahkoon kuuluvien nisäkkäiden ihminen mukaan lukien hoitoon.
a » a » I · 1 Φ I · • 1 t · a • i > 1 · 1 » a • · I a » · M | t I » • a » · • a a • · · I t I • · · · • · · • · • · • · · • · • · • a · • · · • · • · a#· a • • a a • a a a a a a
Claims (2)
- 25 114318 Patenttivaatimus Menetelmä rokotteen valmistamiseksi, joka rokote on tarkoitettu vasta-aineiden tai soluvälitteisen immuni-5 teetin tuottamiseksi ihmisen tyypin 1 immuunikatovirusta vastaan nisäkkäässä, tunnettu siitä, että (a) valmistetaan replikoimalla tai insertoimalla sopiva geeni adenovirukseen elävä rekombinattiadenovirus, jossa elävän rekombinanttiadenoviruksen virionin rakenne-10 proteiini ei ole muuttunut alkuperäisestä adenoviruksesta, josta rekombinanttiadenovirus on tuotettu, ja joka sisältää geenin, joka koodaa antigeeniä, joka vastaa mainittuja vasta-aineita tai indusoi mainitun soluvälitteisen immuniteetin, jolloin rekombinanttiadenovirus on Ad7-tplenv-15 tplHrev, Ad7-tplgag-tplHrev, Ad7-rev-gag, Ad4-tplenv- tplHrev, Ad4-tplgag-tplHrev, Ad4-rev-gag, Ad5-tplenv- tplHrev tai Ad5-tplgag-tplHrev (talletettu ATCC talletusnu-meroilla VR-2299, VR-2293, VR-2392, VR-2293, VR-2391, VR- 2390, VR-2297 ja vastaavasti VR-2298), jolloin Ad4, Ad5 ja • 2 0 Ad7 ovat ihmisen adenoviruksia tyyppi 4, 5 ja 7, joista E3- * 1 · alue on poistettu, env on HIV-kuoriglykoproteiini (gp 160) -geeni, gag on HIV-gag/pro-geeni, rev on HIV-säätelygeeni, Hrev on rev-geenin muutettu versio, jossa nukleoti- • · !.| disekvenssit on muutettu muuttamatta aminohapposekvenssiä ’"l' 25 käyttäen kodoneja, joita usein käytetään ihmisen geeneissä, '·* ja Tpl on vastavirrassa sijaitsevan adenoviruksen kolmi osainen johtosekvenssi, jossa on välisekvenssi ensimmäisen ja toisen johtosekvenssin välissä; ja • · · -i 30 (b) elävää rekombinanttiadenovirus ta käytetään ro- • · · |...e kotteen valmistuksessa, joka rokote on formuloitu annetta- • · vaksi nenäonteloon. • · · ♦ · · • · · « · 26 114318
- 1. Förfarande för framställning av ett vaccin, som är avsett att producera antikroppar eller ge cellmedierad 5 immunitet mot humant typ 1 immunbristvirus i ett däggdjur, kännetecknat av att (a) genom replikering eller insertion av en lämp- lig gen i adenovirus framställs ett levande rekombinanta- denovirus, i vilket det levande rekombinantadenovirusets 10 virionstrukturprotein inte har förändrats frän det ur- sprungliga adenoviruset, frän vilket rekombinantadenoviru- set har framställts, och vilket innehäller en gen som ko- dar för en antigen, som motsvarar nämnda antikroppar eller inducerar nämnda cellmedierade immunitet, varvid rekombi- 15 nantadenoviruset är Ad7-tplenv-tplHrev, Ad7-tplgag- tplHrev, Ad7-rev-gag, Ad4-tplenv-tplHrev, Ad4-tplgag- tplHrev, Ad4-rev-gag, Ad5-tplenv-tplHrev eller Ad5-tplgag- tplHrev (deponerad med ATCC-deponeringsnummer VR-2299, VR- : 2393, VR-2392, VR-2293, VR-2391, VR-2390, VR-2297 och re- • · · 20 spektive VR-2298) , varvid Ad4, Ad5 och Ad7 är humana ade- • · novirus av typ 4, 5 och 7, frän vilka E3-omrädet har av- • · · ”1 lägsnats, env är en HIV-skalglykoprotein (gp 160) -gen, • · : ·* gag är en HIV-gag/pro-gen, rev är en HIV-regulatorgen, • · Hrev är en förändrad version av en rev-gen, i vilken nuk-V · 25 leotidsekvenserna har ändrats utan att ändra aminosyrase- kvensen genom användning av kodoner, vilka ofta används i *:* humana gener, och Tpl är en tredelad styrsekvens av mot- ströms beläget adenovirus, vilken uppvisar en mellanse- • · · kvens mellan den första och den andra styrsekvensen; 30 och • ♦ ’···* (b) det levande rekombinantadenoviruset används : vid framställning av ett vaccin, som har formulerats för * · ♦ ·:··· administrering i näshälan.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US92649192A | 1992-08-07 | 1992-08-07 | |
| US92649192 | 1992-08-07 |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| FI933495A0 FI933495A0 (fi) | 1993-08-06 |
| FI933495A FI933495A (fi) | 1994-02-08 |
| FI114318B true FI114318B (fi) | 2004-09-30 |
Family
ID=25453282
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| FI933495A FI114318B (fi) | 1992-08-07 | 1993-08-06 | Menetelmä rekombinanttiadenovirusrokotteiden valmistamiseksi |
Country Status (18)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0586076B1 (fi) |
| JP (1) | JP4093597B2 (fi) |
| KR (1) | KR100347219B1 (fi) |
| AT (1) | ATE243755T1 (fi) |
| AU (2) | AU680826B2 (fi) |
| BR (1) | BR9303226A (fi) |
| CA (1) | CA2101463C (fi) |
| DE (1) | DE69333057T2 (fi) |
| DK (1) | DK0586076T3 (fi) |
| ES (1) | ES2201055T3 (fi) |
| FI (1) | FI114318B (fi) |
| HK (1) | HK1009978A1 (fi) |
| HU (2) | HU214364B (fi) |
| IL (1) | IL106508A (fi) |
| MX (1) | MX9304765A (fi) |
| NZ (1) | NZ248328A (fi) |
| PT (1) | PT586076E (fi) |
| ZA (1) | ZA935355B (fi) |
Families Citing this family (17)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0638316B1 (en) * | 1993-08-11 | 2003-05-28 | Wyeth | Recombinant adenovirus vaccines |
| IL113817A (en) * | 1994-06-30 | 2001-03-19 | Merck & Co Inc | Polynucleotide for vaccination against the umbilical cord virus |
| FR2727867B1 (fr) | 1994-12-13 | 1997-01-31 | Rhone Poulenc Rorer Sa | Transfert de genes dans les motoneurones medullaires au moyen de vecteurs adenoviraux |
| EP0800403A2 (en) * | 1994-12-30 | 1997-10-15 | Chiron Corporation | Non-traumatic administration of gene delivery vehicles |
| KR100464395B1 (ko) * | 1997-10-13 | 2005-02-28 | 삼성전자주식회사 | 반도체소자의비아홀형성방법 |
| CA2378539A1 (en) | 1999-07-06 | 2001-01-11 | Merck & Co., Inc. | Adenovirus carrying gag gene hiv vaccine |
| US6733993B2 (en) | 2000-09-15 | 2004-05-11 | Merck & Co., Inc. | Enhanced first generation adenovirus vaccines expressing codon optimized HIV1-gag, pol, nef and modifications |
| US8926987B2 (en) | 2004-11-18 | 2015-01-06 | The Government Of The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services | Replication-competent adenoviral vectors |
| US9132031B2 (en) | 2006-09-26 | 2015-09-15 | Zeltiq Aesthetics, Inc. | Cooling device having a plurality of controllable cooling elements to provide a predetermined cooling profile |
| US20080287839A1 (en) | 2007-05-18 | 2008-11-20 | Juniper Medical, Inc. | Method of enhanced removal of heat from subcutaneous lipid-rich cells and treatment apparatus having an actuator |
| US8523927B2 (en) | 2007-07-13 | 2013-09-03 | Zeltiq Aesthetics, Inc. | System for treating lipid-rich regions |
| WO2009026471A1 (en) | 2007-08-21 | 2009-02-26 | Zeltiq Aesthetics, Inc. | Monitoring the cooling of subcutaneous lipid-rich cells, such as the cooling of adipose tissue |
| US8603073B2 (en) | 2008-12-17 | 2013-12-10 | Zeltiq Aesthetics, Inc. | Systems and methods with interrupt/resume capabilities for treating subcutaneous lipid-rich cells |
| EP4066797A1 (en) | 2009-04-30 | 2022-10-05 | Zeltiq Aesthetics, Inc. | Device for removing heat from subcutaneous lipid-rich cells |
| MX2012008660A (es) | 2010-01-25 | 2013-02-26 | Zeltiq Aesthetics Inc | Aplicadores de uso para remover de manera no invasiva calor celulas subcutaneas ricas en lipido a traves de enfriadores de cambio de face, y dispositivos, sistemas y metodos asociados. |
| US8676338B2 (en) | 2010-07-20 | 2014-03-18 | Zeltiq Aesthetics, Inc. | Combined modality treatment systems, methods and apparatus for body contouring applications |
| WO2012103242A1 (en) | 2011-01-25 | 2012-08-02 | Zeltiq Aesthetics, Inc. | Devices, application systems and methods with localized heat flux zones for removing heat from subcutaneous lipid-rich cells |
Family Cites Families (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4925784A (en) * | 1986-04-04 | 1990-05-15 | Hoffmann-La Roche Inc. | Expression and purification of an HTLV-III gag/env gene protein |
| US5585264A (en) * | 1988-07-15 | 1996-12-17 | University Of Saskatchewan | Nucleotide sequences encoding recombinant bovine herpesvirus type-1 GI, GIII and GIV polypeptides |
| GB8919102D0 (en) * | 1989-08-22 | 1989-10-04 | Oxford Virology Ltd | A recombinant adenovirus dna sequence,a recombinant adenovirus expressing the dna sequence and a rhabdovirus vaccine including the recombinant adenovirus |
| EP0563323A4 (en) * | 1990-12-19 | 1996-02-28 | Epitope Inc | Hiv reverse transcriptase vaccine |
| GB9114437D0 (en) * | 1991-07-03 | 1991-08-21 | Health Lab Service Board | Recombinant adenoviruses and the use thereof for detecting the presence in eukaryotic cells of the expression products of specific genes |
-
1993
- 1993-07-23 EP EP93305833A patent/EP0586076B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1993-07-23 ZA ZA935355A patent/ZA935355B/xx unknown
- 1993-07-23 AT AT93305833T patent/ATE243755T1/de not_active IP Right Cessation
- 1993-07-23 ES ES93305833T patent/ES2201055T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1993-07-23 PT PT93305833T patent/PT586076E/pt unknown
- 1993-07-23 DK DK93305833T patent/DK0586076T3/da active
- 1993-07-23 DE DE69333057T patent/DE69333057T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1993-07-28 IL IL106508A patent/IL106508A/en not_active IP Right Cessation
- 1993-07-28 CA CA002101463A patent/CA2101463C/en not_active Expired - Fee Related
- 1993-07-30 BR BR9303226A patent/BR9303226A/pt not_active Application Discontinuation
- 1993-08-04 NZ NZ248328A patent/NZ248328A/en not_active IP Right Cessation
- 1993-08-04 JP JP19341093A patent/JP4093597B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1993-08-05 MX MX9304765A patent/MX9304765A/es not_active IP Right Cessation
- 1993-08-06 HU HU9302285A patent/HU214364B/hu not_active IP Right Cessation
- 1993-08-06 KR KR1019930015236A patent/KR100347219B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1993-08-06 FI FI933495A patent/FI114318B/fi active IP Right Grant
- 1993-08-06 AU AU44465/93A patent/AU680826B2/en not_active Ceased
-
1995
- 1995-06-30 HU HU95P/P00643P patent/HU211691A9/hu unknown
-
1997
- 1997-08-18 AU AU34227/97A patent/AU715190B2/en not_active Ceased
-
1998
- 1998-09-19 HK HK98110746A patent/HK1009978A1/xx not_active IP Right Cessation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| MX9304765A (es) | 1995-01-31 |
| PT586076E (pt) | 2003-11-28 |
| HU211691A9 (en) | 1995-12-28 |
| KR100347219B1 (ko) | 2003-02-25 |
| JP4093597B2 (ja) | 2008-06-04 |
| AU3422797A (en) | 1997-11-20 |
| HU9302285D0 (en) | 1993-11-29 |
| ES2201055T3 (es) | 2004-03-16 |
| DE69333057D1 (de) | 2003-07-31 |
| EP0586076A2 (en) | 1994-03-09 |
| HK1009978A1 (en) | 1999-06-11 |
| HU214364B (hu) | 1998-03-30 |
| HUT67302A (en) | 1995-03-28 |
| KR940003566A (ko) | 1994-03-12 |
| IL106508A (en) | 1998-02-22 |
| EP0586076A3 (en) | 1994-04-20 |
| AU715190B2 (en) | 2000-01-20 |
| CA2101463A1 (en) | 1994-02-08 |
| CA2101463C (en) | 2007-03-13 |
| DE69333057T2 (de) | 2004-07-08 |
| BR9303226A (pt) | 1994-03-08 |
| ATE243755T1 (de) | 2003-07-15 |
| FI933495A0 (fi) | 1993-08-06 |
| AU680826B2 (en) | 1997-08-14 |
| IL106508A0 (en) | 1993-11-15 |
| FI933495A (fi) | 1994-02-08 |
| ZA935355B (en) | 1995-01-23 |
| DK0586076T3 (da) | 2003-10-20 |
| JPH06165689A (ja) | 1994-06-14 |
| AU4446593A (en) | 1994-02-10 |
| EP0586076B1 (en) | 2003-06-25 |
| NZ248328A (en) | 1997-05-26 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| FI114318B (fi) | Menetelmä rekombinanttiadenovirusrokotteiden valmistamiseksi | |
| NATUK et al. | Immunogenicity of recombinant human adenovirus-human immunodeficiency virus vaccines in chimpanzees | |
| US6511845B1 (en) | Methods for producing an immune response against HIV-1 | |
| US5614404A (en) | Self-assembled, defective, non-self-propagating lentivirus particles | |
| CH676247A5 (fi) | ||
| WO1991019803A1 (en) | Self assembled, defective, nonself-propagating viral particles | |
| US6051410A (en) | Self-assembled, defective, nonself-propagating viral particles | |
| WO1992003537A1 (en) | Self-assembling replication defective hybrid virus particles | |
| ES2198400T3 (es) | Vector que codifica particulas virales no autopropagantes, defectuosas, auto-ensambladas. | |
| EP0638316B1 (en) | Recombinant adenovirus vaccines | |
| JPH10512151A (ja) | Ｈｔｌｖ抗原を発現する組換え弱毒化ポックスウイルスを含有する免疫原性組成物 | |
| JP2003535577A (ja) | 免疫不全ウイルス用生ウイルスワクチンとしての組換えラブドウイルス | |
| JP2002501369A (ja) | Ｆｉｖワクチン | |
| AU5190900A (en) | Recombinant adenovirus vaccines | |
| Moss | Vaccinia Virus Vectors: Applications to Vaccines | |
| FR2593519A1 (fr) | Vaccin contre le syndrome immunodeficitaire acquis et intermediaires pour la preparation de ce vaccin | |
| WO2002098457A2 (en) | Recombinant rhabdoviruses as live-viral vaccines for immunodeficiency viruses |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| FG | Patent granted |
Ref document number: 114318 Country of ref document: FI |