CZ375296A3 - Polynucleotide and vaccine containing thereof - Google Patents

Description

Oblast techniky

Vynález se týká nukleotidu, schopného vyvolat odpověď imunitního systému, specificky rozpoznávající virus papiilomu a vakciny s obsahem tohoto nukleotidu.

Dosavadní stav techniky

K infekcím virem papillomu (PV) dochází u různých živočichů včetně člověka, ovcí, psů, koček, králíků, opic, hadů a Skotu. Tyto viry infikují epitheliální buňky a v místě infekce obvykle dochází ke vzniku benigních epitheliáiních nebo fibroepitheliálních nádorů. Viry jsou specifické, to znamená, že lidský virus obvykle neinfikuje jiné živočichy.

Viry papillomu je možné klasifikovat do zřetelně odlišných skupin podle hostitele, jehož mohou infikovat. Viry lidského papillomu (HPV) je dále možno rozdělit ještě na více než 60 typů v závislosti na bázi homologie DNA, jak bylo popsáno v souhrnné publikaci Papilloma Viruses and Human Cancer, H. Pfister (ed.), CRC Press Imc., 1990 Papillomaviry jsou rovněž specifické, pokud jde o typ odpovědi, takže neutralizační imunita k infenci určitým typem papillomaviru neznamená současně imunitu proti jinému typu viru.

U člověka způsobují různé typy HPV odlišná onemocnění. HPV typu 1, 2, 3,. 4, 7, 10 a 26 až 29 způsobují tvorbu benigních bradavic u zdravých jedinců i u jedinců s narušeným imunitním systémem. HPV typu 5, 8, 9, 12, 14, 15, 17, až 25, 36 a 46 až 50 způsobují plochá poškození u lidí s narušeným imunitním systémem. HPV typu 6, 11, 34, 39, dl az 44 a 51 až 55 způsobují tvorbu nemaligních kondylomů na sliznici genitálního nebo respiračního systému. HPV typu 16 a 18 vyvolávají epitheliální dysplasii sliznice pohlavních orgánů a jsou spojeny převážně s tvorbou invazivních karcinomů, vznikajících in sítu v pochvě, děložním krčku, vulvě a v analním kanálu.

Imunologické studie u živočichů prokázaly, že tvorba neutralizačních protilátek proti antigenům papillomaviru může zabránit infekci homologním virem. Vývoj účinné vakcíny proti tomuto viru byl zpomalen v důsledku obtíží, které' jsou spojeny s pěstováním těchto virů in vitro. Dále pak byl vývoj účinné vakcíny proti HPV zpomalen skutečností, že neexistuje vhodný živočišný model.

Neutralizace papillomaviru protilátkami je patrně typově specifická a závislá na základních epitopech na povrchu určitého typu viru.

Papillomaviry jsou malé viry velikosti 50 až 60 nm, neopouzdřené DNA viry ve tvaru dvacetistěnu, s kódovými sekvencemi pro až 8 časných a 2 pozdní geny. Otevřené čtecí rámce ORF genomu viru jsou označeny El až Ξ7 a LI a L2, kde E znamená časný a L znamená pozdní. LI a L2 jsou kódové sekvence pro bílkoviny kapsidu víru. Časné geny jsou spojeny s určitou funkcí, například replikací virů a jeho transformací uvnitř buněk.

Bílkovina LI je hlavní bílkovina kapsidu s molekulovou hmotností 55 000 až 60 000. Bílkovina L.2 je bílkovina kapsidu, vyskytující se v menším množství, s předpokládanou molekulovou hmotností 55 000 až 60 000 a zjevnou molekulovou hmotností 75 000 až 100 000 při stanovení elektroforšzou na polyakrylamidovém gelu. Podle imunologických údajů je možno předpokládat, že většina bílkoviny L2 je uložena uvnitř vzhledem k bílkovině LI. Bílkoviny L2 jsou u různých virů vysoce konzervovány, zvláště jde o 10 bazických aminokyselin na C-zakončení. LI ORF je vysoce konzervován u různých papillomavirů.

Geny LI a L2 byly užity pro tvorbu vakcín pro prevenci a léčení infekcí těmito viry u živočichů. Zhou a další, 1991, 1992 klonovaly HPV, geny typu 16, LI a L2 ve vakcinia viru jako vektoru a pak infikovaly rekombinantním vektorem savčí buněčný materiál CV-1 za vzniku částic, podobných viru a označovaných VLP.

Exprese samotné bílkoviny LI nebo samotné bílkoviny L2 nebo dvojí infekce rekombinantním vektorem vaccinia s obsahem genů pro LI a L2 nevyvolala tvorbu těchto částic.

Byly izolovány rekombinanzní LI a L2 papillomaviru Skotu, odvozené od bakterií. Neutralizační séra prozi rekombinanzním bakteriálním bílkovinám reagovaly s nativním virem, pravděpodobně vzhledem k rozdílu mezi nativními a z bakzerií odvozenými bílkovinami však byla neakziviza velmi nízká.

Rekombinanzní baculoviry, u nichž docházelo k expresi HPV6 LI, HPV11 LI, HPV16 LI, KPV13 LI, HPV31 LI nebo KPV16 L2 ORF byly použity k infekci hmyzích buněk SF9 a k produkci bílkovin LI a L2. Analýza Western 31ot prokázala, že bílkoviny LI a L2, odvozené od baculoviru, reagují s protilátkou proti HPV16. Byla rovněž prokázána produkce bílko vin HPV16 LI a HPV16 L2 rekombinantními S. cerevisiae.

Vzhledem k tomu, že cytotoxické lymfocyty (CTL) myší í člověka jsou schopné rozpoznávat epitopy, odvozené od konservovaných vnitřních bílkovin viru a jsou patrně důležitým článkem při imunitní odpovědi proti virům, byly vyvíjeny snahy získat CTL vakciny, schopné zajistit heterologní ochranu proti různým kmenům virů.

Je známo, že CD8⁺CTL ničí buňky, infikované viry, jakmile jejich receptory T-buněk rozpoznají virové peptidy spojené s molekulami MHC skupiny I. Tyto peptidy jsou odvozeny od endogenně synthetizovaných virových bílkovin bez ohledu na uložení nebo na funkci těchto bílkovin ve viru. Při rozpoznávání epitopů konservovaných virových bílkovin je tedy tímto způsobem pomocí CTL možno dosáhnout zkřížené ochrany mezi kmeny. Peptidy, schopné spojení s MHC skupiny I pro rozpoznání pomocí CTL pocházejí z bílkovin, které jsou přítomny nebo procházejí cytoplasmou nebo endoplasmatickým retikulem. Obecně tedy nejsou exogenní bílkoviny, které vstupují do zpracování endosomy (jako je tomu v případě antigenů, spojených s molekulami MHC skupiny II) účinné při vyvolávání odpovědi CD8+CTL.

Snahy dosáhnout CTL odpovědi zahrnovaly použití vektorů, schopných replikace za vzniku bílkovinného antigenu uvnitř buněk nebo se soustředily na zavádění peptidů do cytosolu. Oba tyto přístupy mají svá omezení, která znesnad ňují jejich použití jako vakcin. Vektory pro retroviry jsou omezeny pokud jde o rozměr a strukturu polypeptidů, jejichž exprese je možno dosáhnout ve formě složených bílkovin při zachování schopnosti replikace rekombinantního viru. Účinnost dalších vektorů, například vaccinia pro imunizaci je znesnadněna imunitní odpovědí proti samotnému vektoru. Použití virových vektorů a modifikovaných pathogenů je spojeno s risikem, které brání jejich použití u člověka. Mimoto je výběr peptidových epitopů závislý na struktuře antigenů MHC a peptidové vakciny tedy mohou mít omezenou účinnost vzhledem k různosti haplotypů MHC u běžné populace.

Bylo prokázáno, že nitrosvalové naočkování polynukleotidových konstrukcí, například plasmidů s obsahem kódové DNA pro bílkoviny vede in šitu k produkci bílkovin ve svalových buňkách. Při použití plasmidů s obsahem kódové DNA pro virové vílkoviny je možno vyvolat odpověď ve formě tvorby protilátek, které zajistí homologní ochranu proti následné infekci. Použití polynukleotidových vakcin (PNV) k vyvolání tvorby protilátek může vést k prodloužené tvorbě těchto protilátek stejně jako podávání antigenu, s vhodnou posttranslační modifikací a strukturou nativní bílkoviny (ve srovnání s rekombinantní bílkovinou). Virové bílkoviny, produkované in vivo po imunizaci PNV mohou mít strukturu nativní bílkoviny a mohou tedy vyvolávat produkci protilátek, neutralizujících virus. Vyvolávání odpovědi CTL tímto způsobem poskytuje výhody zkřížené ochrany bez použití živého, potenciálně pathogenního vektoru nebo atenuovaného viru.

Benvenisty a další uvádějí, že může dojít k expresi DNA, vysrážené CaCl₂ a vstřiknuté myším intraperitoneálně, nitrožilně nebo nitrosvalově. V poslední době bylo zjištěno že po nitrosvalovém vstřiknutí vektoru pro expresi DNA myším má za následek příjem DNA svalovými buňkami a expresi bílkoviny, pro niž je tato DNA kódem (J.A.Wolff a další, 1990, G. Ascadi a další, 1991). Bylo prokázáno, že vstřiknuté plasmidy jsou uloženy extrachromosomálně a k jejich replikaci nedochází. Byla popsána také trvalá exprese po vstřiknutí do kosterních svalů krys, ryb a primátů nebo do srdečního svalu krys. Technika použití nukleových kyselin k vyvolání imunity byla popsána v mezinárodní patentové přihlášce W090/11092 (4. října 1990) podle níž byly užity cistě polynukleotidy k vakcinaci obratlovců.

Postup není omezen na vstřikování do svalů.Například po zavedení zlatých mikroprojektilů s povlakem kodové DNA pro růstový hormon skotu (BGH) pod kůži myší došlo u těchto myší k produkci protilátek proti BGH. K transfekci kůže, svalů,tukové tkáně a mléčné žlázy živých zvířat bylo použito zařízení pro vstřikování pod tlakem. Souhrnnou publi6 kácí, týkající se ukládání nukleových kyselin je Donnelly, Ulmer a Liu, The Immunologist, 2:20, 1994.

Vynález si klade za úkol navrhnout postupy pro zavedení nukleových kyselin do živých tkání k vyvolání exprese bílkovin. Jde o postupy pro začlenění virových bílkovin do cest pro zpracování antigenu k získání CTL, specifických pro virus a k získání protilátek. Tímto způsobem je možno získat prostředky pro vyvolání žádoucí profylaktické odpově di na virové pathogeny v případě viru papillomu. Jde zejména o konstrukce kódové DNA pro vírové bílkoviny lidského viru papillomu pro vyvolání specifických CTL a protilátek.

Ochranný účinak Vakcinace s použitím DNA proti násled né infekci virem je možno prokázat imunizací s použitím kódové DNA v plasmidu bez replikace, užije se kódová DNA pro svrchu uvedené virové bílkoviny. Tento postup je výhodný vzhledem k tomu, že se neužívá žádný infekční materiál, neužívají se částice viru a je možno volit určující prvky. Mimoto vzhledem k tomu, že řetězce některých produktů genů jsou konservovány u různých typů viru papillomu, je možné dosáhnout při následné infekci ochrany proti odlišnému typu viru papillomu, který je homologní nebo heterologní vzhledem k viru, z nějž byl získán klonovaný gen.

Podstata vynálezu

Podstatu vynálezu tvoří polynukleotid, tvořený kódovou nukleovou kyselinou pro celý gen nebo část alespoň jednoho genu viru papillomu a schopný vyvolat specifickou imunitní odpověď proti viru papillomu po uložení polynukleotidu do živočišné tkáně in vivo.

Vynález bude dále podrobněji popsán v souvislosti s přiloženými výkresy.

Přehled obrázků na výkresech

Na obr. 1 je schematicky znázorněna tvorba neutralizačních protilátek u králíků po injekci CRPV LI DNA nebo směsi LI a L2 DNA (osa y) a odpovídající titry ELISA.

Na obr. 2 je graficky znázorněna tvorba protilátek po injekčním podání Li DNA. Jsou uvedeny titry ELISA proti LI VLP u králíků po jediné imunizaci odhadem zvolené dávky 1 mg LI DNA. Králíci, jimž byla vstřiknuta kontrolní DNA neprodukovali zjistitelné protilátky proti LI VLP.

Na obr. 3 je znázorněn vliv absorpce LI VLP na antisérum, získané imunizací při použití LI DNA.

A: Normální sérum a imunní sérum absorbované nativními nebo denaturovanými VLP bylo podrobeno zkouškám na schopnost neutralizovat virus. Je uvedena průměrná plocha kondylomů na třech místech 7 týdnů po infekci virem.

B: Imunní králičí sérum z králíků, jimž byla injekčně podána LI DNA bylo sériově absorbováno třikrát na nativní (kruhy) nebo denaturované (čtverce) LI VLP po expresi v rekombinantních kvasinkách Saccharomyces cerevisiae. Po každé sériové absorpci byl podíl séra analyzován na protilátky proti LI VLP, odvozeným od baculoviru, pomocí zkoušky ELISA. Titr při této zkoušce se vyjádří v procentech původního titru ELISA pro neabsorbované sérum.

Na obr. 4 je znázorněn výsledek zkoušky ELISA na protilátky proti CRPV E2 (A) a CRPV E7 (B). Čistá reakční rychlost (rychlost po dávce 4 minus rychlost před imunizací při stejném ředění) v mOD/min je uvedena pro každého králíka.

Konstrukce DNA s obsahem kódu pro produkty genu viru papillomu, schopné exprese po přímém zavedení do živočišných tkání jsou novými profylaktickými a léčebnými prostředky, jimiž je možno dosáhnout ochrany proti infekci virem papillomu .

Vynález uvádí polynukleotidy, které po přímém zavedení do organismu obratlovců, například králíka a člověka vyvolají expresi kódovaných peptidů ve tkáních živočicha.

V případě, že jde o peptid, který se vyskytuje v organismu živočicha pouze v případě infekce, například při infekci virem papillomu, (PV), je imunitní systém živočicha aktivován k ochranné odpovědi, protože tyto exogenní bílkoviny jsou produkovány buňkami hostitele, dochází k jejich zpracování a presentaci hlavním histokompatibilním komplexem (MHC). Toto rozpoznávání je obdobné jako při skutečné infekci organismu. Výsledek, jak bude dále podrobněji uvedeno, jeje vyvolání imunitní odpovědi, která může chránit proti virulentní infekci.

Polynukleotidy jsou nukleové kyseliny, obsahující základní řídící prvky, takže po zavedení do živé buňky obratlovce mohou řídit buněčný mechanismus tak, že vznikají produkty translace, pro něž jsou kódem geny, obsažené v polynukleotidech. Každému odborníkovi jsou z popisu přihlášky žřejmá různá možná provedení vynálezu. Je například možno použtí různé promotory transkripce, terminátory, vektory nebo specifické sekvence genů.

Při zavedení uvedených nukleových kyselin do živočišných tkání in vivo dochází k expresi produktu genu viru papillomu. Například po injekci konstrukce DNA podle vynálezu do svalu králíka dojde k expresi produktu kódového genu a v důsledku toho ke tvorbě neutralizačních protilátek proti viru. Při následné pokusné infekci virem králičího papillo9 mu (CRPV) při použití dávek, které u všech kontrolních králíků vyvolají tvorbu papillomů dochází u očkovaných králíků k podstatně sníženému výskytu papillomů. Uvedeným způsobem je tedy možno připravit vakcinu, použitelnou u člověka k vyvolání odolnosti proti infekci virem papillomů.

Konstrukce DNA s kódovou sekvencí pro bílkoviny viru papillomů vyvolávají u živočichů ochrannou imunitní odpověď. Jak bude dále podrobněji popsáno, tato imunitní odpověď zahrnuje produkci neutralizačních protilátek proti viru a ochranu králíků před infekcí homologním typem viru papillomů.

V jednom z provedení je vakcina tvořena plasmidy s obsahem kódové DNA například pro bílkoviny LI, L2, E2, E4 viru papillomů, jednotlivě nebo ve směsi.

Předpokládané výhody těchto vakcin ve srovnání s dalšími vakcinami budou spočívat například v širším spektru ochrany v důsledku CTL odpovědi, v širším spektru protilátek a v delším trvání ochrany.

V jednom z provedení vynálezu se klonuje sekvence pro bílkovinu LI nebo L2 nebo LI + L2 z HPV typu 6a, 6b, 11, 16 nebo 18, získaná z klinických.izolátů, ve vektoru pro expresi. Vektor obsahuje promotor pro transkripci RNA polymerázy a terminátor transkripce na konci kódové sekvence pro HPV. Jako příklad vhodného promotoru je možno uvést CMV. Jako příklad použitelného terminátoru transkripce lze uvést BGH. Mimoto je možno pro snadnější přípravu farmaceutického prostředku možno do vektoru pro expresi zařadit značení pro odolnost proti antibiotiku, k jehož expresi dochází v E. coli. Může jít o gen pro odolnost proti neomycinu nebo pro odolnost proti jinému antibiotiku. Mimoto pro dosažení vyšší produkce prostředku při fermentaci v prokaryotických organismech je výhodné, aby vektor obsahoval také počátek replikace a byl přítomen ve vysokém počtu kopií. Tyto výhody poskytuje celá řada běžně dodávaných prokaryotických vektorů pro klonování. Je také žádoucí z vektoru odstranit nepodstatné sekvence DNA.

Součást podstaty vynálezu tedy tvoří vektory pro expresi, obsahující kódovou sekvenci pro bílkovinu PV a jsou použitelné jako uminogenní látky. Jde o prostředek pro vyvolání ochranné imunity zkříženého typu bez použití materiálů se samovolnou replikací. Mimoto poskytuje imunizace s použitím DNA ještě řadu dalších výhod. Vakcinace bude použitelná pro nádory i pro infekční organismy vzhledem k tomu, že odpověď CD8⁺CTL je důležitá pro intervenci imunitního systému v obou těchto pathofysiologických pochodech. Znamená to, že vyvolání imunitní odpovědi proti bílkovině, která má základní význam pro transformaci může být účinným prostředkem pro imunotherapii zhoubných nádorů. Mimoto je tvorba protilátek proti bílkovinám po jejich expresi po injekci kódové DNA pro virové bílkoviny je snadným a účinným způsobem vyvolání tvorby protilátek vakcinací.

Produkce a čištění konstrukcí DNA je snadné ve srovnání s tradičním čištěním bílkovin a usnadňuje přípravu kombinovaných vakcin. To znamená, že je možno připravit mnohočetné konstrukce, například konstrukce, obsahující kodové sekvence pro bílkoviny LI a L2 jednoho nebo většího počtu typů HPV a tyto konstrukce mísit a podávat společně. Konečně vzhledem k tomu, že po injekci DNA je možno dlouhodobě udržet expresi bílkoviny, je možno příznivě ovlivnit přetrvávání paměti B- a T- buněk a tím zajistit současně humorální imunitu i imunitu, zprostředkovanou buňkami.

Omezení navrhovaných HPV vakcin zdůrazňuje nutnost vývoje účinnějších prostředků pro prevenci infekce a léčení již vzniklého onemocnění. Vyvolání zlepšené CTL odpovědi proti konservované bílkovině může zajistit dlouhodobou zkříženou imunitu.

Exprese bílkoviny z konstrukcí PNV u králíků byla prokázána detekcí imunitní odpovědi hostitele proti antigenům CRPV. Výsledky těchto pokusů na zvířatech prokazují, že přímá injekce DNA může být postupem pro ochranu člověka proti infekci HPV a náelsnému onemocnění.

Dávky se volí v závislosti na schopnosti vyvolat imunitní odpověď. U člověka budou pravděpodobně účinné dávky v rozmezí 10, 50, 100 až 200 mikrogramů DNA.

Účinnost u člověka byla sledována na dobrovolnících, kterým byla podávána DNA vakcina proti HPV. Složení vakciny, dávky a podávání bylo založeno na svrchu uvedených studiích. Klinická účinnost se uvádí podle počtu infikovaných osob, trvání choroby a stupni onemocnění. Tyto klinické zkoušky se ještě srovnávají s výsledky laboratorních zkoušek.

Molekulární biologie, zabývající se čištěním a přípravou konstrukcí DNA umožnila také výrobu vakciny podle vynálezu. ZAtímco standardní postupy molekulární biologie jsou dostačující pro výrobu vakciny podle vynálezu, specifické navrhované konstrukce jsou novými prostředky, schopnými vyvolat zkříženou ochranu proti různým kmenům.

Množství DNA, schopné exprese, které má být ve vakcině použito bude záviset na promotorech transkripce a translace, použitých v konstrukci a na jejich účinnosti a také na imunogenitě produktu exprese genu. Obecně je možno do svalu podat dávku 1 mikrogram až 1 mg, s výhodou 10 až 300 mikrogramů. Je také možno vakcinu podat podkožně, intradermálně, vstřebáním pokožkou, intraperitoneálně, nitrožilně nebo inhalací. Předpokládá se rovněž možnost přeočkovávání.

Polynukleotidy mohou být čisté, to znamená, že je možno je použít bez dalších bílkovin, pomocných činidel ne12 bo jiných složek, které mohou rovněž ovlivnit imunitní systém příjemnce. V tomto případě je vhodné polynukleotidy podávat ve fysiologicky přijatelném roztoku, například ve sterilním fysiologickém roztoku, popřípadě s přísadou pufru.

Je také možno podávat polynukleotidy spolu s liposomy, napři klad lecitinovými nebo jinými liposomy ve formě směsi DNA a liposomů nebo je možno DNA podávat spolu se známými pomocnými prostředky k zesílení odpovědi imunitního systému, například spolu s bílkovinou nebo jiným nosičem. S výhodou je možno použít také látky, které napomáhají příjmu DNA do buněk, jako jsou vápenaté ionty, virové bílkoviny a další látky pro usnadnění transfekce. TYto látky se obvykle uvádějí jako látky pro usnadnění transfekce a farmaceuticky přijatelné nosiče.

Při imunizaci genem místo produktem genu je možno dosáhnout několika výhod. Jednou z nich je poměrně jednoduchý způsob, kterým je možno uvést do styku nativní nebo téměř nativní antigen s imunitním systémem. Další výhodou imunizace polynukleotidy je schopnost imunogenu vstoupit do mechanismu MHC skupiny I a vyvolat odpověď cytotoxických T-buněk. Vzhledem k tomu, že touto imunizací je možno vyvolat humonální i buněčnou odpověď, spočívá další výhoda v tom, že jde o poměrně jednoduchý postup pro výzkum velkého počtu virových genů a typů viru na jejich schopnost účinku jako vakciny. Imunizace injekcí polynukleotidu rovněž umožňuje tvorbu vícesložkových vakcin míšením různých složek.

Pod pojmem gen se v průběhu přihlášky rozumí část nukleové kyseliny, která je kódem pro určitý polypeptid. Pojem farmaceutický prostředek a vakcina je užíván k označení prostředků pro vyvolání reakce imunitního systému. Také pojmy konstrukce a plasmid se užívají střídavě. Vektor označuje DNA pro klonování genů pro využití podle vynálezu.

Podle vynálezu je tedy možno využít geny PV pro vyvolání imunitní odpovědi in vivo uobratlovce, například u savce včetně člověka tak, že se

a) izoluje alespoň jeden gen PV,

b) tento gen se spojí s regulačními sekvencemi tak, že gen je operativně spojen s řídící sekvencí, která po uložení do živé tkáně řídí počátek transkripce a následnou translaci genu,

c) gen se uloží do živé tkáně a

d) popřípadě se odpověď zvýší dalším genem PV.

V dalším provedení vynálezu je možno dosáhnout ochrany proti heterologním typům PV V tomto případě obsahuje DNA kodové sekvence pro konservovaný epitop PV.

V dalším provedení obsahuje polynukleotidová vakcina kódový řetězec pro jinou bílkovinu PV, například pro LI nebo L2 nebo El až E7 nebo směsi těchto sekvencí.

V dalším provedení vynálezu obsahuje DNA kódové sekvence pro bílkoviny HPV typů 6a, 6b, 11, 16 nebo 18, přičemž konstrukce DNA je schopná exprese in vivo po uložení do živých tkání a vyvolává imunitní odpověď proti produktu exprese, pro nějž je kódem gen HPV. Je také možno připravit směs těchto konstrukcí s polynukleotidy s kódovými sekvencemi pro jiné antigeny, odlišné od HPV.

Jako příklady genů HPV pro zařazení do této konstrukce je možno uvést: V1J-L1, V1J-L2, V1J-E1, V1J-E2, V1J-E3, V1J-E4, V1J-E5, V1J-E6, V1J-E7, V1JE1Í~E4, VIJ-ElE4-L1, V1J-E2-C.

Ve specifických provedeních vynálezu je konstrukce DNA kódem pro bílkovinu CRPV LI a je po uložení do živočiš14 né tkáně in vivo schopná exprese a a vyvolání imunitní odpovědi proti produktu exprese genu CRPV, Předpokládá se rovněž možnost kombinací s polynukleotidy s kódovými řetězci pro jiné antigeny, nepříbuzné CRPV.

Jako příklady genů CRPV pro zařazení do této konstrukce je možno uvést: V1J-L1, V1J-L2, V1J-E1, V1J-E2, V1J-E3, V1J-E4, V1J-E5, V1J-E6, V1J-E7, VlJ-Eli''E4, VI J-El ~E4-L1 , V1J-E2-C.

Farmaceutické prostředky s obsahem DNA je možno připravit známými postupy, například smísením s farmaceuticky přijatelným nosičem. Příklady vhodných nosičů a způsobů zpracování je možno nalézt v souhrnné publikaci Remington s Pharmaceutical Sciences. Uvedené prostředky budou obsahovat účinné množství DNA HPV.

Léčebné nebo diagnostické prostředky podle vynálezu jsou určeny pro léčení i diagnostiku infekcí PV. Účinné množství se bude měnit v závislosti na nejrůznějších faktorech, jako jsou celkový stav, hmotnost, pohlaví a věk. Dalším faktorem může být způsob podání. Obvykle se prostředky budou podávat v dávkách v rozmezí 1 mikrogram až 1 mg.

Farmaceutické prostředky mohou být určeny pro podávání různým způsobem, například podkožně, místně, perorálně a nitrosvalově.

Vakciny podle vynálezu obsahuje DNA HPV s kódovými sekvencemi pro rekombinatní bílkoviny HPV, které obsahují antigenní determinanty, vyvolávající tvorbu neutralizačních protilátek v lidském hostiteli. Vakciny jsou bezpečné a při jejich podávání nehrozí nebezpečí klinické infekce, nemají toxické vedlejší účinky, je možno je podávat účinným způaobem, jsou stálé a jsou kompatibilní s běžnými nosiči pro vakciny.

Vakciny je možno aplikovat různými cestami, například perorálně, parenterálně, podkožně nebo nitrosvalově. Podaná dávka se bude měnit v závislosti na zdravotním stavu, pohlaví, hmotnosti a věku příjemce. Vakcina může být připravena v různých lékových formách, například jako kapsle, suspenze, elixíry nebo roztoky. Může také obsahovat nosiče, přijatelné z imunologického hlediska.

Vakciny jsou podávány v profylakticky nebo léčebně účinném množství, to znamená v množství, schopném vyvolat ochrannou odpověď imunitního systému, Toto množství se může měnit v závislosti na typu PV. Vakciny je možno aplikovat jednorázově nebo opakovaně.

Vynález umožňuje přípravu monovalentních i vícevalentních vakcin pro prevenci infekce PV. Například monovalentní vakcinu HPV typu 15 je možno připravit při použití kódové DNA pro bílkovinu HPV 16 LI nebo L2 nebo LI + L2. Vícevalentní vakcinu je možno připravit smísením uvedených kódových DNA pro bílkoviny LI nebo L2 nebo LI + L2 z různých typů HPV.

DNA je tedy možno využít k vyvolání tvorby protilátek. Pojem protilátka zahrnuje v tomto případě monoklonální i polyklonální protilátky a také jejich fragmenty, jako jsou Fv, Fab a F(ab)2, které jsou schopné vázat antigen nebo hapten

DNA PV a protilátky podle vynálezu je možno použít pro stanovení serotypu infekce HPV nebo CRPV a pro sériové zkoušky HPV. DNA z HPV a CRPV a uvedené protilátky lze zpracovat na zkušební balíčky, určené pro detekci a stanovení serotypu HPV nebo CRPV. Tento balíček bude obsahovat řadu oddílů, v nichž budou uložena reakční činidla, jako DNA HPV nebo protilátka proti HPV pro detekci různých typů HPV. Mimoto může balíček ještě obsahovat značený antigen nebo substrát pro enzym apod.

Praktické provedení vynálezu bude osvětleno následujícími příklady, které však nemají sloužit k omezení rozsahu vynálezu.

Příklady provedení vynálezu příklad 1

Vektory pro produkci vakciny

A) VI: Vektor pro expresi VI byl zkonstruován z plasmidu pCMVIE-AKI-DHRF (Y. Whang a další, J. Virol. 61, 1796, 1987). Geny AKI a DHFR byly odstraněny rozštěpením EcoRI s následujícím navázáním fragmentů. Tento vektor neobsahuje intron A v promotoru CMV a byl proto přidán jako PCR fragment s rozrušeným vnitřním místem Sací (v poloze 1855 podle číslování v publikaci B.S. Chapman a další, Nuc. Acids Res. 19, 3979, 1991. Matricí, použitou pro PCR reakce byl pCMVintA-Lux, vytvořený navázáním fragmentu HindlI a Nhel z pCMV6al20 (podle téže Chypmanovy publikace), který obsahuje promotor/zesilovač hCMV-IEla intron A, do míst působení HindlII a Xba I plasmidu pBL3 za vzniku pCMVIntBL. Fragment genu pro luciferázu s obsahem 1881 párů baží (HindlII-Smal Klenowův fragment) z RSV-Lux (J.R. de Wet a další, Mol. Cell Biol. 7, 725, 1987) byl klonován v místě Sall plasmidu pCMVIntBL po vyplnění Klenowovým fragmentem a zpracování fosfatázou.

Primery, použité k přemostění intronu A:

5'-primer: 5'-CTATATAAGCAGAGCTCGTTTAG-3', řetězec č. 1

3'-primer: 3'-GTAGCAAAGATCTAAGGACGGTGACTGCAG-3' řetězec č. 2

Primery, použití k odstranění místa působení Sací:

positivní primer: 5Č-GTGCGAGCCCAATCTCCACGCTCATTTTCAGACACA TAC-3 , řetězec č. 4 negativní primer: 5Č-GTATGTGTCTGAAAATGAGCGTGGAGATTGGGCTCGCAC-3' , řetězec č. 3

PCR fragment byl rozštěpen enzymy Sací a BglII a uložen do vektoru, rozštěpeného týmiž enzymy.

B) Vektor pro expresi VIJ, řetězec č. 5

Tento vektor byl vytvořen proto, ab.y byly odstraněny promotor a terminátor transkripce z vektoru VI pro jejich uložení definovanějším způsobem za vytvoření kompaktnějšího vektoru a také pro zl^šené čištění plasmidů.

VIJ je odvozen z vektorů VI a pUC19, běžně dodávaného plasmidů. VI byl rozštěpen působením SspI a EcoRI za vzniku dvou fragmentů DNA. Menší z těchto fragmentů, který obsahoval promotor CMVintA a terminátor transkripce pro růstový hormon skotu (BGH), řídící heterologní gen, byl čištěn elektroforézou na agarozovém gelu. Konce tohoto fragmentu byly vyplněny při použití T4 DNA-polymerázy, aby byla usnadněna vazba na další fragment, vyplněný stejným způsobem.

Plasmid pUC19 byl zvolen jako kostra vektoru pro expresi. Je o něm známo, že poskytuje vysoké výtěžky plasmidu, je velmi dobře charakterizován svou sekvencí a funkcí a má velmi malý rozměr. Z tohoto vektoru byl odstraněn celý operon lac, který byl pro tyto účely zbytečný a mohl by snížit výtěžek plasmidů a expresi heterologního genu, částečným rozštěpením enzymem Haell. Zbývající plasmid byl čištěn elektroforézou na agarozovém gelu, zpracován alkalickou fosfatázou z telecích střev a navázán na svrchu popsaný prvek CMVintA/BGH. Byly získány plasmidy s jednou ze dvou možných orientací promotorového prvku v sekvenci pUC. Jeden z těchto plasmidů poskytoval v E. coli daleko vyšší výtěžek DNA a byl označen VIJ. Jeho struktura byla ověřena analýzou sekvence v místech vazby a bylo prokázáno že tento plasmid poskytuje vyšší výtěžky heterologních genů než VI.

C) VIJneo jako vektor pro expresi, řetězec č. 6

Bylo zapotřebí odstranit gen amp , užitý pro selekci bakterií s obsahem VIJ odolností proti antibiotiku vzhledem k tomu, že ampicillin nesmí být užíván ve fermentorech velkých rozměrů pro výrobu produktů pro klinické použití u lidí Gen amp bal z kostry pUC ve VIJ odstraněn rozštěpením enzymy SspI a EamI 1051. Zbývající části plasmidu byly čištěny elektroforézou na agarozovém gelu, zakončení byla vaplněna T4 DNA-polymerázou a pak byl materiál zpracován působením alkalické fosfatázy z telecích střev. Běžně dodávaný gen kan , odvozený z transposonu 903 a obsazený v plasmidu pUC4K byl vyštěpen enzymem Pstl, čištěn elektroforézou na agarozovém gelu a zakončení byla vyplněna T4 DNA-polymerázou. Fragmen byl uložen do kostry VIJ a byly získány plasmidy s genem kan^r v obou orientacích. Tyto plasmidy byly označeny jako V2Jneo/ 1 a 3. Struktura těchto plasmidů byla ověřena analýzou restrikčními enzymy a analýzou sekvence v místech vazby a bylo také prokázáno, že plasmidy poskytují obdobné výtěžky jako plasmid VIJ. Také exprese heterologních genů byla srovnatelná s jejich expresí při použití VIJ. Odhadem byl vybrán plasmid VlJneo3, který bude dále označován pouze jaz Γ ko plasmid VIJneo a který obsahuje gen kan v teze orientaz Γ ci, jakou ma gen amp v konstrukci VIJ.

D) Vektor pro expresi VIJns

Do plasmidu VIJneo bylo uloženo navíc místo působení Sfil k usnadnění integrace. Spojovník Sfil o 13 párech baží, který se běžně dodává (New England BioLabs) byl uložen do místa působení KpnI v sekvenci BGH vektoru. VIJneo byl linea rizován působením KpnI, čištěn na gelu, zakončení byla vyplněna T4 DNA-polymerázou a pak byl materiál navázan na stejným způsobem zpracovaný spojovník Sfil. Izoláty klonů byly vybírány podle analyzy restrikčních míst a byla také ověřena sekvence v oblasti, zahrnující spojovník. Nový vektor byl označen VIJns. Exprese heterologních genů ve VIJns (s obsahem Sfil byla srovnatelná s expresí týchž genů v plasmidu VIJneo (s obsahem KpnI).

Příklad 2

Příprava konstrukcí DNA s kódovou sekvencí pro bílkoviny viru papillomu králíka

Zdrojem DNA CRPV pro všechny klonované geny byl CRPVpLAII. Jde o úplný genom CRPV klonovaný v plasmidu pBR322 v místě Sáli (Nasseri M, Meyers C a Wettstein F.O., 1989 : Genetic analysis of CRPV pathogenesis: The LI open reading frame is dispensable for cellular transformation but is required for papilloma formation, Virology 170, 321-324).

1. VIJns-Ll: Kódová sekvence LI byla vytvořena pomocí PCR při užití CRPV-pLAII DNA jako matrice. Primery PCR byly zkonstruovány s obsahem míst BamHI pro štěpení po čištění PCR-fragmentu na gelu.

Primery, užité k vytvoření kódové oblasti LI:

Negativní primer: 5ŮGGTACAGGATCCACCATGGCAGTGTGGCTGTCTACGCAG 3 Bam HI (řetězec č. 7)

Positivní primer: 5ŮCCACATGGATCCTTAAGTACGTCTCTTGCGTTTAGATC 3' Bam HI (řetězec č. 8)

PCR fragment byl čištěn na gelu, rozštěpen Bam HI a uložen do VIJns po jeho rozštěpení BglII.

2. VIJns-L2: Kódová sekvence L2 byla vytvořena pomocí PCR. Vektor CRPV-pLAII obsahuje gen 12, přerušený místem Sáli, užitým pro uložení CRPV do pBR322. Byla proto vytvořena matrice pro PCR rozštěpením CRPV-pLAII enzymem Sáli s následným uložením DNA CRPV do kruhové formy v místě Sáli. Tato uložená DNA CRPV byla užita jako matrice pro PCR. Byly zkonstruovány PCR primery s obsahem místa působení BamHI pro štěpení po čištění PCR fragmentu na gelu.

Primery, užité k vytvoření kódové oblasti L2:

Negativní primer:5?-GGTACAGGATCCACCATGGTTGCACGGTCACGAAAACGC 3' Bam HI (řetězec č. 9)

Positivní primer: 5Í-CCACATGGATCCTTATTCTGCGTAGACAGCCACACT 3'

Bam HI (řetězec č. 10)

3. VIJns-E2: Kodová oblast E2 byla vytvořena pomocí PCR při použití CRPV-pLAII DNA jsko matrice. PCR primery obsahovaly místa působení BglII pro štěpení po čištění PCRfragmentu na gelu.

Primery, užití k vytvoření kodové oblasti E2:

Negativní primer:5ÍGGTACAAGATCTACCATGGAGGCTCTCAGCCAGCGCTTA 3' Bgl II (řetězec č. 11)

Positivní primer:5ÍCCACATAGATCTCTAAAGCCCATAAAAATTCCCTAAAAAA CAC 3' Bgl II (řetězec č. 12)

4. VIJns-E4: Kódová oblast E4 byla vytvořena pomocí PCR při použití CRPV-pLAII DNA jako matrice. PCR primery obsahovaly místa působení Bgl II pro štěpení po čištěni PCR-fragmentů na gelu.

Primery, užité v vytvoření kódové oblasti E4:

Negativní primer: 5-?GGTACAAGATCTACCATGAGCCATGGACATTGCAGGATAC 3 Bgl II (řetězec č. 13)

Positivní primer: 5-?CCACATAGATCTTTATAAGCTCGCGAAGCCGTCTATTCC 3' (řetězec č. 14)

Bgl II

5. VlJns-E7: Kódová oblast pro E7 byla vytvořena pomocí PCR při použití CRPV-pLAII jako matrice v jednom případě a čištěné DNA z Kreiderova kmene CRPV v dalším případě.

Pro obě matrice byly použity tytéž PCR primery, obsahující místa působení Bgl II pro štěpení po čištění PCR fragmentu na gelu.

Primery, použité pro vytvoření kódové oblasti E7:

Negativní primer:5ÍGGTACAAGATCTACCATGATAGGCAGAACTCCTAAGCTTA 3 Bgl II

Positivní primer:5ÍCCACATAGATCTTCAGTTACAACACTCCGGGCACAC 3'

Bgl II

6. pGEX-2T-E2: Kódová oblast E2 byla vytvořenq pomocí PCR tak jak bylo popsáno v případě VIJns. Fragment byl klonován v pGEX-2T v místě Bam HI k vytvoření fúze ve čtecím rámci s glutathion-S-transferázou (GST). Konstrukce byla použita pro produkci bílkoviny v E. coli.

7. pGEX-2T-E4: Kódová oblast E4byla vytvořena pomocí PCR tak jak bylo popsáno v případě VlJns-E4. Fragment byl klonován v pGEX-2T v místě Bam HI k vytvoření fúze s glutathion-S-transferázou (GST) ve čtecím rámci. Konstrukce byla použita pro produkci bílkoviny v E. coli.

8. pGEX-2T-E7: Kódová oblast E7 byla vytvořena pomocí PCR tak jak bylo popsáno v případě VlJns-E7. Fragment byl klonován v pGEX-2T v místě Bam HI k vytvoření fúze s glutathion-S-transferázou (GST) ve čtecím rámci. Konstrukce byla použita pro produkci bílkoviny v E. coli.

Příklad 3

Čištění plasmidu z E. coli.

Buněčný materiál, obashující konstrukci VIJ byl pěstován přes noc až do nasycení. Pak byl buněčný materiál od22 dělen a rozrušen modifikovaným postupem s použitím SDS za al kalických podmínek podle Sambrook J. Fritsch E.F. a Maniatis T., Molecular Cloning; A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 2. vydání, 1989. Modifikace spočívala v trojnásobném zvýšení objemu při rozrušení buněk a extrakci DNA. DNA byla čištěna při použití gradientu CsCl-EtBr. Ethidiumbromid byl odstraněn extrakcí 1-butanolem. Výsledná DNA byla extrahována směsí fenolu a chloroformu a vysrážena ethanolem. Pak byla DNA uvedena do suspenze v pufru TE (10 mM Tris, 1 mM EDTA) o pH 8 pro trans fekce a 0,9% NaCl pro vstřikování myším. Koncentrace a čistota každé DNA byla stanovena určením hodnoty ^0D260/280‘

Tyto hodnoty byly v rozmezí é 1,8.

Příklad 4

Produkce specifických protilátek proti CRPV in vivo.

Skupinám po pěti králících byla odebrána krev a pak bylo králíkům vstřiknuto 1,2 ml fysiologického roztoku NaCl s obsahem 1 mg VIJns-Ll, VlJns-L2 nebo VIJns-Ll ve směsi s VlJns-L2 (celkem 2 mg) nebo pouze VIJns )kontrolní vektor bez kódové oblasti pro bílkovinu). Materiál byl rovnoměrně rozdělen do šesti oblastí nitrosvalově na obou zadních konče tinách, obou předních končetinách a v bederní oblasti. Tři týdky po počáteční injekci DNA byla králíkům odebrána krev a pak jim byla stejným způsobem aplikována druhá dávka DNA. Čtyři týdny po druhé injekci byla králíkům znovu odebrána krev.

Séra byla analyzována na přítomnost protilátek, neutralizujících virus míšením sériového ředění (vždy lOx) imunního sera s ředěným (1:3) zásobním virem CRPV (Kreiderův kmen). K ředění byla užita Dulbeccova modifikace Eaglova prostředí (DMEM), doplněná 1% sérovým albuminem skotu (BSA).

Zásobní virus CRPV (od Dr Kreidera, Hershey, PA) byl připraven z fragmentů kůže divokých králíků, které byly infikovány CRPV a pak implantovány do ledvinového pouzdra athymických myší. Výsledné kondylomy pak byly homogenizovány a materiál byl vyčeřen za získání zásobního viru. Směs imunního séra a zásobního viru byla inkubována v ledu alespoň 60 minut a pak bylo 50 mikrolitrů každé směsi naneseno na plochu 1 cm oholené skarifikované pokožky hřbetu tří novozélandských bílých králíků. Po sedmi týdnech pak byla vyhodnocena tvorba bradavic u těchto zvířat a byly zaznamenány dva hlavní rozměry elipsovitých útvarů v mm (předozadní a do strany). Z častosti výskytu těchto útvarů při různém ředění byl stanoven koncový titr Reed-Muenchovou interpolací. Pak byly titry neutralizačních protilátek u králíků po podání DNA LI nebo LI + L2 vyneseny na osu y na obr. 1.

Séra králíků, jimž byla podána DNA LI bal vyhodnocena na přítomnost protilátek také zkouškou ELISA. Polystyrénové plotny ELISA byly přes noc povlékány při teplotě 4 °C částečně čištěnou bílkovinou CRPV LI (rekombinantní, odvozenou z kvasinek) v množství 1 mikrogram/vyhloubení. Rekombinantní LI byla připravena v S. cerevisiae a čištěna podle publikace Kirnbauer a další, Proč. Nat. Acad, Sel USA 89:12180-4, 1992 s malými modifikacemi. Byla přidána zředěná séra a směs byla inkubována 1 hodinu při teplotě místnosti za protřepávání na orbitálním třepacím zařízení. Pak byly plotny omyty a byla přidána kozí protilárka proti králičím tkáním, konjugovaná s perocidázou z křenu, IgG (Fc-specifická). Po 1 hodině inkubace za protřepávání byly plotny omyty a byl přidán substrát. Plotny byly odečítány při 450 nm při použití kinetického odečítacího přístroje ELISA (Molecular Devices Corp.) a získané hodnoty byly opraveny s ohledem na pozadí odeětěním hodnoty pro preimunní sérum ve stejném zředění. Titry byly stanoveny interpolací výsledné křivky opravených hodnot proti ředění na lOmOD/min. Titry ELISA pro králíky po podání DNA LI nebo LI + L2 jsou vyneseny na osu x na obr. 1. Z obr.

je zřejmé, že séra 12/13 byla positivní, pokud jde o neutralizační účinnost (log.tiru je =1, tj- positivní pro neředěné sérum)a byla také positivní při zkoušce ELISA na přítomnost protilátek (titr ELISA = 100). Čtyři ze čtyř sér, negativních pokud jde o přítomnost neutralizačních protilátek, měly titr ELISA =350. Všechna séra králíků, jimž byla podána pouze DNA L2 nebo pouze vektor VIJ měla titr ELISA nižší než 100. Z uvedených výsledků je zřejmé, že po podání DNA LI byly získány protilátky, specifické pro CRPV a schopné neutralizovat virus. Titry ELISA přetrvávaly u králíků alespoň 32 týdnů po imunizaci, jak je zřejmé z obr. 2.

Příklad 5

Ochrana králíků proti infekci virulentním CRPV

Králíkům ve skupinách po pěti byl nitrosvalovou injekcí podán 1 mg VIJns-Ll, VlJns-L2, směsi VIJns-Ll a VlJns-L2 (celkem 2 mg) nebo kontrolní vektor VIJns bez kódové sekvence pro bílkovinu. Tři týdny po první injekci DNA byla králíkům podána druhá injekce téže DNA. Čtyři týdny po druhé injekci byli králíci pokusně infikováni CRPV. Bylo naneseno mikrolltrů dvojího ředění zásobního viru (ředění 1:2 nebo 2

1:12 DMEM s 1 % BSA) ve trojím opakování na plochy 1 cm na oholenou akrifikovanou pokožku na hřbetu každého králíka. Séra, odebraná v okamžiku infekce králíkům, jimž byla podána DNA LI nebo LI + L2 obsahovala protilátky proti bílkovině LI (ELISA) a protilátky, neutralizující virus stejně jako svrchu Zvířata byla pozorována ještě 3, 6 a 10 týdnů po infekci a byl sledován vznik bradavic. U králíků, jimž nebyla podána DNA LI se na 51 z 54 míst po infekci CRPV vytvořily bradavice, kdežto u zvířat, kterým byla podána DNA LI se vytvořily bradavice pouze na dvou místech ze 60. Jedna z bradavic, pozorovaných u králíků, imunizovaných DNA LI po třech týdnech opět ustoupila. V tabulce na obr. 5 je uveden výskyt bradavic u králíků po podání CRPV. Je zřejmé, že profylaktická imunizace DNA LI chrání králíky před vznikem bradavic po inekci virulentním CRPV.

Příklad 6

Specifičnost protilátek, vyvolaných podáním DNA LI

Aby bylo možno prokázat, zda ochranné neutralizační protilátky rozpoznávají konformační epitopy na VLP, byly provedeny absorpční pokusy. Absorpce imunního séra na VLP LI (15) odstraní veškeré neutralizační protilátky a účinnost ELISA (Obr. 3A a 3B).Podání CRPV ve směsi s preimunním králičím sérem na skarifikovanou pokožku králíka vyvolá tvorbu kondylomu na všech místech, kdežto nanesení CRPV ve směsi s imunním sérem tvorbu bradavic vůbec nevyvolá. V případě, že se smísí CRPV s imunním sérem, předem absorbovaným na VLP LI, z nějž by tedy měly být neutralizační protilátky odstraněny, na všech místech (3/3) se vytvořily kondylomy. Na druhé straně v případě, že bylo imunní sérum absorbováno na denaturovanou bílkovinu LI (redukce a alkylace v 8M močovině), bylo sérum stále ještě schopné neutralizovar CRPV (obr. 3A) a uchovávalo si svou účinnost při zkoušce ELISA (obr. 3B).

Je tedy zřejmé, že protilátky, neutralizující virus, jejichž tvorba byla vyvolána podáním DNA LI je možno odstranit pouze stykem s LI VLP v nativním stavu, nikoliv však denaturovanou bílkovinou LI. Zkouškou ELISA je zřejmě možno prokázat pouze specifické protilátky, schopné reakce s neporušenou bílkovinou LI VLP vzhledem k tomu, že podle zkoušky ELISA absorpce odpovídá odstranění neutralizačních protilátek, jak je zřejmé z obr. 3B.

Příklad 7

Protilátky, vyvolané podáním DNA E4 a E7

Skupinám po čtyřech novozélandských bílých králících byl nitrosvalově podán vždy 1 mg V1J-E2 nebo V1J-E7 při jedné imunizaci. V týdnech 0, 4, 8 a 20 byly provedeny celkem čtaři imunizace a v týdnu 22 byla odebrána krev. Tvorba protilátek byla považována za důkaz exprese bílkoviny, pro niž byla podaná DNA kódem. Protilátky v sérech byly prokazovány na plotnách ELISA (NUNC Maxisorp), povlečených v množství 1 mikrogram na vyhloubení složenou bílkovinou GST-E2 nebo GST-E7, čištěnou z E. coli po transformaci vektorem pro expresi pGEX s kódovou sekvencí pro CRPV E4 nebo E7 po indukci IPTG. Zkouška ELISA byla provedena způsobem, popsaným v příklasu 3. Čistá reakční rychlost (po dávce 4 minus při použití preimunního séra) v mOD/min je uvedena na obr. 4. Rychlosti vyšší než 10 jsou považovány za positivní. Vzorky s vysokým titrem protilátek mohou mít nižší čistou rychlost při malém zředění vzhledem k přesycení detekčního systému. Z výsledků je zřejmé, že došlo k expresi bílkovin E4 a E7 a tyto bílkoviny byly rozpoznány imunitním systémem příjemce.

Claims (5)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Polynukleotid, tvořený kodovou nukleovou kyselinou pro celý gen nebo část alespoň jednoho genu viru papillomu a schopný vyvolat specifickou imunitní odpověď proti viru papillomu po uložení polynukleotidu do živočišné tkáně in vivo.
2. 2. Polynukleotid podle nároku 1, v němž gen je kódem pro bílkovinu viru papillomu ze skupiny HPV LI, HPV L2,

   HPV El, HPV E2, HPV E
3. 3, HPV E
4. 4, HPV E5, HPV Ξ6, HPV E7,

   CRPV LI, CRPV L2, CRPV El, CRPV E2, CRPV E3, CPRV E4, CRPV E5 CRPV E6, CRPV E7 nebo pro kombinace těchto bílkovin.

   -3-s—Způsob vyvolání—edpovodi—Ímunitníhu systému U’ Ob^ e p i L u p ůíT' v i r u p 4 p i 1 1 tw ®=zi__s_e-1—r—rrr;—ze títí aplikuje aléspon 1 hg' pul^nuklěCTTA dugsodlo nároku T.

   Vakcina proti viru papillomu, vyznačuj íc í se t í m, že obsahuje polynukleotid podle nároku 1.
5. 5. Farmaceutický prostředek pro prevenci nebo léčení infekce virem papillomu, vyznačující se tím, že jako svou účinnou složku obsahuje polynukleotid podle nároku 1 spolu s farmaceutickým nosičem.