ES2618309T3 - Partículas de replicón de alfavirus multi-antigénico y métodos - Google Patents

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Abstract

Un método para preparar una población de partículas de replicón de virus (VRPs) del virus de encefalitis equina venezolana (VEE) que colectivamente codifican y expresan una biblioteca de expresión de un patógeno, parásito o célula tumoral, en donde las partículas con defecto de propagación no pueden producir partículas de progenie debido a la ausencia en el ARN del replicón de al menos una secuencia que codifica para una proteína estructural del virus VEE requerida para el empaquetamiento del ácido nucleico del replicón, comprendiendo dicho método las etapas de: a) introducir una pluralidad de ácidos nucleicos de replicón de VEE en una pluralidad de células, en donde dichas células son permisivas para la replicación y empaquetamiento de VEE, en donde dicho ácido nucleico de replicón de VEE comprende al menos una señal de empaquetamiento de virus VEE y al menos una secuencia codificadora heteróloga expresable a partir de dicho ácido nucleico de replicón de VEE, en donde las secuencias que codifican las proteínas estructurales requeridas para el empaquetamiento del ácido nucleico de replicón se distribuyen entre uno o más ácidos nucleicos colaboradores y el ARN de replicón, y en donde el uno o más ácidos nucleicos colaboradores se seleccionan de entre al menos dos moléculas de ARN colaborador o una molécula de ADN, siempre que se elimine al menos una secuencia codificadora de proteína estructural del ARN de replicón, de tal modo que la partícula de VEE resultante tenga defecto de propagación, y en donde la pluralidad de ácidos nucleicos de replicón de VEE codifican la biblioteca de expresión de un patógeno, parásito o célula tumoral, para producir una pluralidad de células modificadas; b) cultivar dicha pluralidad de células modificadas de la etapa (a) en condiciones que permitan la expresión del uno o más ácidos nucleicos colaboradores, permitiendo la replicación de dicho ácido nucleico de replicón de VEE y el empaquetamiento de dicho ácido nucleico de replicón de VEE para formar VRPs; c) poner en contacto las células modificadas tras la etapa (b) con un medio acuoso que contiene entre 0,2 M y 5 M de una sal para liberar las VRPs al medio acuoso para producir una disolución que contiene VRPs; y d) recolectar las VRPs de la disolución que contiene VRPs de la etapa (c); en donde el ácido nucleico de replicón se introduce en dicha célula hospedante mediante electroporación; y en donde la densidad celular en el ámbito de la electroporación es de 107 a 5 x 108 por mL.

Description

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codificar E3-E2-6k-E1. Adicionalmente, la señal de empaquetamiento o “secuencia de encapsidación” que está presente en el genoma vírico no está presente en todos los ácidos nucleicos colaboradores. Preferiblemente, la señal de empaquetamiento es eliminada de todos los ácidos nucleicos colaboradores.
Estos ARN colaboradores pueden introducirse en las células de varios modos. Pueden expresarse a partir de una o más casetes de expresión que han sido transformadas de forma estable en las células, estableciendo así líneas celulares de empaquetamiento (véase, por ejemplo, la Patente de EE.UU. nº 6.242.259). Alternativamente, los ARNs pueden ser introducidos como moléculas de ARN o ADN en la célula colaboradora sin integrarse en el genoma celular. Los métodos de introducción incluyen electroporación, vectores víricos (p.ej., SV40, adenovirus, nodavirus, astrovirus), y transfección mediada por lípidos. En la invención reivindicada, el método de introducción es la electroporación.
Una alternativa a los ARNs colaboradores múltiples es el uso de una única molécula de ácido nucleico que codifica todas las funciones necesarias para replicar el ARN de replicón vírico y sintetizar los polipéptidos necesarios para empaquetar el ARN de replicón alfaviral en partículas de replicón de alfavirus infecciosas. Esto puede lograrse con una molécula de ARN que determina las funciones necesarias o con una molécula de ADN que determina las funciones necesarias. El ácido nucleico de ADN colaborador individual puede introducirse en la célula de empaquetamiento mediante cualquier medio conocido en la técnica, incluyendo, aunque sin limitación, electroporación, transfección mediada por lípidos, vector vírico (p.ej., adenovirus o SV-40), y transfección mediada por fosfato. En la invención reivindicada, el ADN se introduce mediante métodos basados en electroporación de esta invención, con el voltaje y la capacitancia optimizados para las células y el(los) ácido(s) nucleico(s) que se esté(n) introduciendo. El ADN típicamente es electroporado en las células con un descenso del voltaje y un aumento de la capacitancia, en comparación con lo requerido para la captación de ARN. En todas las electroporaciones, el valor correspondiente al voltaje y la capacitancia deben fijarse para evitar destruir la capacidad de las células de empaquetamiento para producir partículas de alfavirus infecciosas. El ADN fue purificado intensivamente para eliminar contaminantes tóxicos y se concentró hasta aproximadamente 5 mg/mL antes de la electroporación. Generalmente, es preferible concentrar el ADN a entre 1-8 mg/mL, preferiblemente entre 5 y 8 mg/mL. El ADN colaborador está presente en la mezcla de electroporación en aproximadamente 20-500, de forma deseable entre aproximadamente 50 y aproximadamente 300, por ejemplo aproximadamente 150 µg por cada 0,8 mL de mezcla de electroporación, y contiene de 107 a 5x108 células por mL, de forma deseable contiene entre aproximadamente 5x107 y aproximadamente 2x108 células, por ejemplo, aproximadamente 1,2x108 células.
Alternativamente, la función colaboradora, en este formato y bajo un promotor inducible, puede incorporarse al genoma de la célula de empaquetamiento antes de la introducción/expresión del ácido nucleico de replicón de vector de ARN vírico, e inducirse entonces mediante el estímulo apropiado justo antes, simultáneamente, o después de la introducción del replicón de vector de ARN.
De forma ventajosa, el ácido nucleico que codifica las proteínas estructurales de alfavirus, es decir, la cápsida, la glicoproteína E1 y la glicoproteína E2, contiene al menos una mutación atenuante. Las frases “mutación atenuante” y “aminoácido atenuante”, tal como se usan en la presente memoria, significan una mutación de nucleótido o un aminoácido codificado como consecuencia de dicha mutación, que da como resultado una probabilidad disminuida de causar enfermedad en su hospedante (es decir, una pérdida de virulencia), según la terminología estándar en la técnica. Véase, p.ej., B. Davis, et al. Microbiology 132 (3ª ed. 1980), según la mutación sea una mutación de sustitución, o una mutación de eliminación o adición en marco. La frase “mutación atenuante” excluye mutaciones que serían letales para el virus a menos que dicha mutación se use en combinación con una mutación “restaurante” que hace el virus viable, aunque atenuado. En realizaciones específicas, el(los) aminoácido(s) colaborador(es) incluye(n) al menos una mutación atenuante.
Los métodos para identificar mutaciones atenuantes en el genoma de alfavirus son conocidos en la técnica. Olmsted et al. (1984; Science 225: 424) describe un método para identificar mutaciones atenuantes en el virus de Sindbis seleccionando en términos de crecimiento rápido en cultivo celular. Johnston y Smith (1988; Virology 162: 437) describe la identificación de mutaciones atenuantes en VEE aplicando una presión selectiva directa para penetración acelerada de células BHK. En la técnica se han descrito mutaciones atenuantes en alfavirus, p.ej., White et al. 2001
J. Virology 75: 3706; Kinney et al. 1989 Virology 70: 19; Heise et al. 2000 J. Virology 74: 4207; Bernard et al 2000 Virology 276: 93; Smith et al 2001 J. Virology 75: 11196; Heidner y Johnston 1994 J. Virology 68: 8064; Klimstra et al. 1999 J. Virology 73: 10387; Glasgow et al. 1991 Virology 185: 741; Polo y Johnston 1990 J. Virology 64: 4438; y Smerdou y Liljestrom 1999 J. Virology 73: 1092.
En determinadas realizaciones, el ARN de replicón comprende al menos una mutación atenuante. En otras realizaciones específicas, la(s) molécula(s) de ácido nucleico colaborador incluye(n) al menos una mutación atenuante. En la realización que comprende dos moléculas de ácido nucleico colaborador, al menos una molécula incluye al menos una población atenuante, o ambas pueden codificar al menos una mutación atenuante. Alternativamente, el ácido nucleico colaborador, o al menos uno del primer o segundo ácidos nucleicos colaboradores incluye al menos dos, o múltiples, mutaciones atenuantes. Las mutaciones atenuantes apropiadas dependen del alfavirus usado. Por ejemplo, cuando el alfavirus es VEE, las mutaciones atenuantes adecuadas pueden seleccionarse del grupo que consiste en codones en la posición 76 del aminoácido E2 que especifica un aminoácido atenuante, preferiblemente lisina, arginina o histidina como aminoácido 76 de E2; codones en la posición
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120 del aminoácido E2 que especifica un aminoácido atenuante, preferiblemente lisina como aminoácido 120 de E2; codones en la posición 209 del aminoácido E2 que especifica un aminoácido atenuante, preferiblemente lisina, arginina o histidina como aminoácido 209 de E2; codones en la posición 272 del aminoácido E1 que especifica un aminoácido atenuante, preferiblemente treonina o serina como aminoácido 272 de E1; codones en la posición 81 del aminoácido E1 que especifica un aminoácido atenuante, preferiblemente isoleucina o leucina como aminoácido 81 de E1; y codones en la posición 253 del aminoácido E1 que especifica un aminoácido atenuante, preferiblemente serina o treonina como aminoácido 253 de E1. Otras mutaciones atenuantes adicionales incluyen mutaciones de eliminación o sustitución en el dominio de ruptura entre E3 y E2, de tal modo que no se rompa la poliproteína E3/E2; esta mutación en combinación con la mutación en E1-253 es una cepa atenuada preferida para uso en esta invención. De forma similar, las mutaciones presentes en cepas de vacunas vivas existentes, p.ej. la cepa TC83 (véase Kinney et al., 1989, Virology 170: 19-30, particularmente la mutación en el nucleótido 3), también se emplean de forma ventajosa en las partículas purificadas mediante los métodos de esta invención. Un ejemplo de una mutación atenuante en la región no codificadora del ácido nucleico de replicón es la sustitución de A o C en el nucleótido 3 de VEE.
Los ARNs de replicón vírico y colaborador adecuados se describen en la Patente de EE.UU. nº 6.156.558.
Aunque no es parte de la presente invención, el Arbovirus Surafricano nº 86 (S.A. AR86) puede comprender mutaciones atenuantes adecuadas seleccionadas del grupo que consiste en los codones de nsP1 posición de aminoácido 538 que especifica un aminoácido atenuante, preferiblemente isoleucina como nsP1 aminoácido 538; los codones de E2 posición de aminoácido 304 que especifica un aminoácido atenuante, preferiblemente treonina como E2 aminoácido 304; los codones de E2 posición de aminoácido 314 que especifica un aminoácido atenuante, preferiblemente lisina como E2 aminoácido 314; los codones de E2 posición de aminoácido 376 que especifica un aminoácido atenuante, preferiblemente alanina como E2 aminoácido 376; los codones de E2 posición de aminoácido 372 que especifica un aminoácido atenuante, preferiblemente leucina como E2 aminoácido 372; los codones de nsP2 posición de aminoácido 96 que especifica un aminoácido atenuante, preferiblemente glicina como nsP2 aminoácido 96; y los codones de nsP2 posición de aminoácido 372 que especifica un aminoácido atenuante, preferiblemente valina como nsP2 aminoácido 372. Las mutaciones atenuantes útiles en otros alfavirus son conocidas por los especialistas en la técnica.
Las mutaciones atenuantes pueden introducirse en el ácido nucleico llevando a cabo una mutagénesis sito-dirigida, de acuerdo a procedimientos conocidos. Véase Kunkel, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 488 (1985). Alternativamente, se pueden introducir mutaciones en el ácido nucleico reemplazando fragmentos de restricción homólogos, según procedimientos conocidos, o mediante métodos de reacción en cadena de polimerasa mutagénicos.
Una vez se han generado el(los) ácido(s) nucleico(s) colaborador(es) y los ARNs de replicón para uso en la producción de ARPs, son introducidos en células hospedantes adecuadas, de forma deseable mediante electroporación. Los presentes inventores descubrieron que la electroporación llevada a cabo con una densidad celular relativamente elevada permite una captación eficiente de ácido nucleico colaborador y de ARNs de replicón de virus. Los ácidos nucleicos de replicón y colaboradores deberían ser purificados para su uso en electroporación o en otros protocolos de introducción de ácidos nucleicos en células para producción de ARP, pero no es necesario tapar los ARNs colaboradores.
La etapa de producción de las partículas víricas infecciosas en las células también puede llevarse a cabo usando técnicas convencionales. Véase, p.ej., la Patente de EE.UU. nº 5.185.440 a nombre de Davis et al., Publicación PCT nº WO 92/10578 a nombre de Bioption AB, y la Patente de EE.UU. nº 4.650.764 a nombre de Temin et al. (aunque Temin et al., se refiere a retrovirus más que a alfavirus). Las partículas víricas infecciosas pueden producirse mediante técnicas de cultivo celular estándares mejoradas mediante los procedimientos descritos en la presente memoria y/o mediante técnicas de recolección de partículas convencionales, o el procedimiento de lavado de sal descrito en la presente memoria más adelante. El lavado de sal parece mejorar la recuperación de ARP, especialmente cuando existen determinadas cargas superficiales en la superficie del ARP. En el caso de VEE, los residuos de aminoácido en E2-309 y E2-120 proporcionan buenos sitios para introducir una carga positiva.
Los ARNs de replicón vírico codifican múltiples secuencias codificadoras heterólogas que están ligadas operativamente a promotores y otras secuencias requeridas para la expresión transcripcional y traduccional de la secuencia codificadora en la célula hospedante en la que se van a introducir y expresar los ARPs.
Cualesquier aminoácidos que existen en las secuencias de aminoácidos referidas en la especificación presentan sus abreviaturas habituales de una letra y de tres letras utilizadas rutinariamente en la técnica: A, Ala, Alanina; C, Cys, Cisteína; D, Asp, Ácido Aspártico; E, Glu, Ácido Glutámico; F, Phe, Fenilalanina; G, Gly, Glicina; H, His, Histidina; I, Ile, Isoleucina; K, Lys, Lisina; L, Leu, Leucina; M, Met, Metionina; N, Asn, Asparagina; P, Pro, Prolina; Q, Gln, Glutamina; R, Arg, Arginina; S, Ser, Serina; T, Thr, Treonina; V, Val, Valina; W, Try, Triptófano; Y, Tyr, Tirosina.
Tal como se usa en la presente memoria, “expresión” dirigida por una secuencia particular es la transcripción de una secuencia asociada en dirección 3’. Si es apropiado y se desea para la secuencia asociada, el término expresión también abarca la traducción (síntesis de proteína) del ARN transcrito. Alternativamente, se pueden usar diferentes secuencias para dirigir la transcripción y la traducción.
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El ADN genómico (en donde los genes no están interrumpidos por intrones y/o donde no es una proporción significativa del genoma dedicado a secuencias altamente repetidas o no expresadas) o ADNc se clona en una preparación de ácido nucleico de vector vírico preparado adecuadamente para producir una preparación de ácido nucleico de vector recombinante. A continuación la preparación de ácido nucleico de vector recombinante se introduce en células que permitan el empaquetamiento de los ácidos nucleicos de vector recombinante en partículas infecciosas. La preparación de ácido nucleico de vector recombinante puede ser electroporada en células para empaquetamiento junto con ácidos nucleicos colaboradores, ARN o ADN, en una electroporación de densidad celular relativamente alta, p.ej. de aproximadamente 107 a aproximadamente 109 células/mL de mezcla de electroporación. En la invención reivindicada, el ácido nucleico de replicón se introduce en la célula hospedante mediante electroporación, y la densidad celular en el entorno de electroporación es de 107 a 5 x 108 por mL. A continuación las células son cultivadas en medio de cultivo para permitir el empaquetamiento de los ácidos nucleicos de vector recombinante en partículas de replicón vírico.
Después de que los ARPs han sido recolectados de las células mediante lavado con sal, y de forma deseable han sido recolectados del sobrenadante libre de células, los ARPs pueden purificarse parcialmente mediante cromatografía de intercambio iónico.
Los métodos de la presente invención se aplican a ácidos nucleicos de replicón vírico derivados del virus de encefalitis equina venezolano (VEE). Un ejemplo específico de VEE atenuado es la cepa 3014, virus que puede ser purificado, o los ARPs derivados del mismo, usando cromatografía de afinidad de heparina. La cepa de VEE 3042 es otro virus atenuado adecuado para uso en métodos de ARP, pero la cubierta de este virus, o de los ARPs derivados del mismo, no puede purificarse usando cromatografía de afinidad de heparina. Los virus, o los ARPs derivados de los mismos, que portan mutaciones que les confieren capacidad de unión a glucosaminoglucano están particularmente indicados para la purificación mediante la etapa de lavado con sal, y también puede ser purificados adicionalmente usando cromatografía de afinidad de heparina.
Los cánceres (afecciones neoplásicas) de los que pueden obtenerse células para uso en los métodos de la presente invención incluyen carcinomas, sarcomas, leucemias y cánceres derivados de células del sistema nervioso. Éstos incluyen, aunque sin limitación: tumores cerebrales, tales como astrocitoma, oligodendroglioma, ependimoma, méduloblastomas y Tumor Ectodérmico Neural Primitivo (PNET); tumores pancreáticos, tales como adenocarcinomas ductales pancreáticos; tumores de pulmón, tales como adenocarcinomas de célula pequeña y grande, carcinoma de célula escamosa y brocoalveolarcarcinoma; tumores de colon, tales como adenocarcinoma epitelial y metástasis hepática de dichos tumores; tumores hepáticos, tales como hepatoma y colangiocarcinoma; tumores de mama, tales como adenocarcinoma ductal y lobular; tumores ginecológicos, tales como carcinoma escamoso y adenocarcinoma de la cerviz uterina, y adenocarcinoma epitelial uterino y de ovario; tumores de próstata, tales como adenocarcinoma prostático; tumores de vejiga, tales como carcinoma de célula escamosa transicional; tumores del sistema reticuloendotelial (RES), tal como linfoma de células B y T (nodular y difuso), plasmacitoma y leucemia aguda y crónica; tumores de la piel, tal como melanoma; y tumores de tejido blando, tales como sarcoma de tejido blando y leiomiosarcoma.
Los términos “célula neoplásica”, “célula tumoral” o “célula cancerosa”, usadas tanto en singular como en plural, se refieren a células que han sufrido una transformación maligna que las hace dañinas para el organismo hospedante. Las células cancerosas primarias (esto es, las células obtenidas del entorno del sitio de transformación maligna) pueden distinguirse fácilmente de las células no cancerosas mediante técnicas bien establecidas, particularmente mediante examen histológico. La definición de una célula cancerosa, tal como se usa en la presente memoria, incluye no solo una célula cancerosa primaria, sino también cualquier célula derivada de un ancestro de célula cancerosa. Esto incluye células cancerosas metastatizadas, y los cultivos in vitro y las líneas celulares derivadas de células cancerosas. Cuando se hace referencia a un tipo de cáncer que se manifiesta normalmente como un tumor sólido, un tumor “clínicamente detectable” es aquel que es detectable en base a la masa tumoral; p.ej., mediante procedimientos tales como un escáner CAT, imágenes de resonancia magnética (IRM), rayos-X, ultrasonidos o palpación. Los descubrimientos inmunológicos o bioquímicos por sí solos pueden ser insuficientes para cumplir esta definición.
Los patógenos para los cuales las respuestas inmunológicas de antígenos múltiples son ventajosas incluyen patógenos víricos, bacterianos, fúngicos y protozoos. Los virus para los cuales es deseable la inmunidad incluyen, aunque sin limitación, virus de fiebre hemorrágica (tales como el virus del Ébola), virus de inmunodeficiencia (tales como los virus de inmunodeficiencia felina o humana), herpesvirus, coronavirus, adenovirus, poxvirus, retrovirus, aftovirus, nodavirus, picornavirus, ortomixovirus, paramixovirus, rubeola, togavirus, flavivirus, bunyavirus, reovirus, virus oncogénicos tales como retrovirus, alfavirus patogénicos (tales como el virus de bosque Semliki o el virus Sindbis), rinovirus, virus de hepatitis (Grupo B, C, etc.), virus de la gripe, entre otros. Los patógenos bacterianos para los cuales las respuestas inmunes son útiles incluyen, sin limitación, estafilococos, estreptococos, neumococos, salmonela, escherichiae, yersiniae, enterococos, clostridia, corinabacteria, hemófilus, bacteroides, francisela, pasteurelae, brucelae, micobacteriae, bordetela, espirochetes, actinomicetes, clamidiae, micoplasmas, rickettsiae, y otros. Los hongos patogénicos de interés incluye, aunque sin limitación, cándida, criptococos, blastomices, histoplasma, coccidiodes, ficomicetes, tricodermas, aspergili, neumocistis, y otros. Los protozoos para los cuales la inmunidad es útil incluyen, sin limitación, plasmodia, esquistosomas, amebas, giardia, babesia, leismania y otros. Otros parásitos incluyen gusanos redondos, gusanos de gancho y gusanos de cinta, filiaria y otros.
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diferentes determinados mediante valoración de ARP usando ensayos de inmunofluorescencia específicos de cada producto génico.
La Tabla 2 muestra la valoración de ARP multi-antigénicos producidos a partir de un conjunto de ARNs. Las construcciones de replicón de alfavirus que expresan 7 genes heterólogos diferentes (CMV IE1, CMV gB, HA gripe, VIH Pol, VIH Gag, Rat/neu, CAT) fueron linealizadas individualmente con endonucleasa de restricción Not1. Los tránscritos de ARN de cada replicón fueron generados usando ARN polimerasa T7. Los siete productos de transcripción de ARN diferentes fueron mezclados en concentraciones equivalentes y fueron co-electroporados en células VERO con cápsida alfaviral y ARNs colaboradores de glicoproteína. Se produjo una población de ARP que expresaban los 7 antígenos diferentes determinados mediante valoración de ARP usando ensayos de inmunofluorescencia específicos para cada producto génico.
La Tabla 3 proporciona un resumen de respuestas inmunes específicas de antígeno en animales vacunados con ARP multi-antigénico (tal como se muestra en la Figura 1). Las respuestas inmunes específicas de antígeno en forma de inmunidad humoral se miden mediante ELISA y se presentan como título medio geométrico recíproco, o mediante ensayo de transferencia Western blot o IFA y se presentan como la dilución más baja a la que la señal específica de antígeno era detectable. Las respuestas inmunes específicas de antígeno en forma de inmunidad celular se miden mediante detección ELISPOT de células secretoras de IFN-γ y se presentan como linfocitos secretores de IFN-γ específicos de antígeno por cada 106 linfocitos. Los animales que recibieron la preparación ARP multi-antigénica por ruta s.c. ó i.p. de inoculación montaron respuestas inmunes frente a todos los antígenos de la preparación. Como control positivo, un grupo recibió ARP de VIH-Gag y montó respuestas inmunes específicas solo de Gag. Los animales de control negativo no presentaron respuestas detectables a ningún antígeno. Muchas muestras no fueron valoradas hasta el punto final, y se presentan como títulos iguales o superiores al valor dado. Cabe destacar que la respuesta inmune provocada por la proteína de gen Gag de VIH como parte de las preparaciones multiantigénicas fue equivalente en términos humorales y celulares a la proteína Gag de VIH administrada como una única (homogénea) preparación estándar. Esto demuestra que las secuencias codificadoras expresadas como componente de una biblioteca de expresión más grande todavía pueden ser efectivamente inmunogénicas empleando los métodos de esta invención.
Las preparaciones de ARP inmunológicas que comprenden secuencias de nucleótidos expresables que codifican una multiplicidad de determinantes antigénicos de células tumorales, patógenos o parásitos pueden administrarse como parte de un régimen profiláctico, es decir, para reducir la probabilidad de que el humano o animal al cual se administra la preparación padezca la afección neoplásica, la infección de patógeno o la infección parasitaria, o como régimen terapéutico, para aliviar la gravedad de cualquier condición asociada a una afección neoplásica, infección de patógeno o infección parasitaria existentes, o de tal modo que la afección neoplásica, infección de patógeno o infección parasitaria sea prevenida debido a una respuesta inmune generada en el humano o animal al cual se ha administrado la preparación.
Aunque la generación de una respuesta inmune incluye al menos algún nivel de inmunidad protectora dirigida a la célula tumoral (o afección neoplásica), patógeno o parásito, el resultado clínico en el paciente que padece dicha afección neoplásica o infección con un parásito o un patógeno puede mejorar tratando también al paciente con un agente quimioterapéutico adecuado, tal como es conocido en la técnica. Cuando el patógeno es vírico, se puede administrar un compuesto antivírico tal como Aciclovir de forma concomitante con la vacunación de ARP, por ejemplo, en pacientes con infección de herpesvirus, o HAART (terapia anti-retroviral altamente activa) en individuos infectados con VIH. Cuando el patógeno es un patógeno bacteriano, de forma deseable se administra un antibiótico frente al cual la bacteria es susceptible y cuando el patógeno es un hongo de forma deseable se administra un antibiótico antifúngico adecuado. De forma similar, se conocen agentes químicos para el control y/o la erradicación de infecciones parasitarias y se administran de forma ventajosa a pacientes humanos o animales usando dosis y calendarios de dosificación bien conocidos en la técnica. Cuando el paciente padece una afección neoplásica, por ejemplo, un cáncer, la administración de la composición inmunogénica que comprende las ARPs capaces de expresar una multiplicidad de antígenos asociados a cáncer en el paciente al cual se ha administrado de forma deseable viene acompañada de la administración de agente(s) antineoplásico(s), que incluyen, aunque sin limitación, agentes quimioterapéuticos tales como daunorrubicina, taxol, tiorueas, anticuerpos específicos de cáncer ligados a radionucleidos terapéuticos, siempre que el(los) agente(s) no impida(n) la capacidad del paciente de generar una respuesta inmune a los ARPs administrados y a los antígenos cuya expresión dirigen en el paciente.
Las formulaciones farmacéuticas, tales como vacunas u otras composiciones inmunogénicas, pueden comprender una cantidad inmunogénica de las partículas de replicón de alfavirus infecciosas con defecto de propagación en combinación con un vehículo farmacéuticamente aceptable. Una “cantidad inmunogénica” es una cantidad de las partículas de alfavirus infecciosas que es suficiente para evocar una respuesta inmune en el sujeto al cual se administra la formulación farmacéutica. Se cree que una cantidad de entre aproximadamente 101 y aproximadamente 1010 unidades infecciosas por dosis, preferiblemente de 105 a 108, es adecuada, dependiendo de la edad y de la especie del sujeto que vaya a ser tratado. Los ejemplos de vehículos farmacéuticamente aceptables incluyen, aunque sin limitación, agua estéril libre de pirógenos y disolución salina fisiológica libre de pirógenos. Los sujetos a los que pueden administrarse cantidades inmunogénicas de las partículas de alfavirus infecciosas con defecto de propagación descritas en la presente memoria incluyen, aunque sin limitación, sujetos humanos y animales (p.ej., perro, gato, caballo, cerdo, vaca, cabra, conejo, burro, ratón, hámster, mono). También se pueden
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Los siguientes ejemplos se proporcionan con fines ilustrativos, y no pretenden limitar el alcance de la invención según se reivindica en la presente memoria. Se pretende que cualquier variación en los artículos de los ejemplos que imaginen los especialistas esté dentro del alcance de la presente invención según se define en las reivindicaciones anexas a esta descripción.
Ejemplos
Ejemplo 1. Generación de vectores de replicón de alfavirus que expresan una biblioteca de antígenos asociados a tumor.
Las células tumorales se obtienen típicamente de un paciente con cáncer mediante resección, biopsia o muestreo endoscópico; las células puede usarse directamente, almacenarse congeladas o mantenerse o expandirse en cultivo. El ARN es extraído de las células tumorales usando métodos estándar conocidos en la técnica, p.ej., usando reactivos y kits disponibles comercialmente tales como Trizol (Sigma, St. Louis, MO) o el kit de aislamiento de ARN total S.N.A.P. (Invitrogen, Inc., Carlsbad, CA), seguido de purificación de ARNm en oligo (dT)-Sepharose. El ARNm puede enriquecerse adicionalmente en secuencias específicas de tumor mediante hibridación sustractiva o mediante otro método conocido en la técnica. Se sintetiza ADNc de primera cadena usando oligonucleótidos oligo (dT) con un sitio de restricción raro en el extremo 5’. Tras purificación de ADNc, se produce la segunda cadena usando cualquiera de los métodos estándar, p.ej., usando ADN polimerasa I-RNasaH o amplificación no específica. A continuación se liga un adaptador para crear un extremo cohesivo, y se digiere ADN de cadena doble con una endonucleasa de restricción reconocida pocas veces (tal como DraI) en un sitio que ha sido incorporado en el cebador oligo (dT). Este procedimiento crea un ADNc de cadena doble con extremos cohesivos no compatibles adecuado para clonación direccional.
Alternativamente, se puede usar una estrategia descrita en el Ejemplo 2 (más adelante) para la generación de extremos cohesivos para la clonación direccional. En una realización adicional, los extremos cohesivos se pueden unir mediante desoxirribonucleótido transferasa. A continuación se clona el ADNc de doble cadena en un vector de replicón de plásmido o se usa para construir moléculas de replicón recombinantes in vitro de un modo similar al descrito más adelante. Esta estrategia produce moléculas de replicón recombinante que contienen una marca de biotina en los extremos 3’ y un promotor T7 en los extremos 5’, permitiendo de este modo la selección de las moléculas recombinantes y la generación de ARN in vitro usando ARN polimerasa dependiente de ADN T7. Se pueden implementar etapas selectivas adicionales para “reducir por selección” el número de antígenos presentes en la biblioteca de antígenos tumorales. Métodos tales como la hibridación sustractiva y el análisis diferencial son bien conocidos en la técnica (véanse las Patentes de EE.UU. nº 5.958.738, 5.827.658 y 5.726.022 y el documento US2002018766), y se puede implementar un método de selección como éste inmediatamente antes de la clonación en la construcción de replicón de VEE. Esta estrategia sirve para limitar el conjunto de antígenos tumorales a genes expresados exclusivamente o regulados al alza preferencialmente en una célula tumoral. Esta selección sirve para reducir o eliminar la frecuencia y/o la presencia de genes celulares normales en la biblioteca de antígenos. Sin pretender establecer ninguna teoría particular, se cree que los beneficios adicionales incluyen la eliminación de antígenos no específicos de tumor, enfocando la respuesta inmune contra antígenos asociados a tumores, maximizando de este modo la especificidad potencial de la preparación de vacuna y reduciendo el riesgo de inducir respuestas autoinmunes. Esta “reducción por selección” del repertorio de antígenos también es relevante para estrategias de imprimación-recuerdo. En muchos casos, puede ser ventajoso vacunar con un amplio catálogo de antígenos tumorales, y en las posteriores inoculaciones de recuerdo limitar/reducir por selección el número de antígenos de tal modo que el enfoque el sistema inmune de forma efectiva sobre los antígenos específicos. Esto puede realizarse fácilmente realizando una reducción por selección de antígenos basada también en la identificación de a qué antígenos ha respondido el hospedante después de la primera inmunización, y básicamente diseñando a media de este modo cada recuerdo posterior para aumentar la respuesta inmune frente a los antígenos que el hospedante ha demostrado que puede reconocer y para los cuales se ha generado una respuesta inmune.
Ejemplo 2. Generación de vectores de replicón de alfavirus que expresan ADNcs específicos de organismos de enfermedad infecciosas a partir de una muestra de tejido o sangre infectados cuando se conocen las secuencias génicas diana.
Este ejemplo describe la clonación de un repertorio de genes víricos/bacterianos/parasitarios específicos de un individuo con una infección aguda o crónica en casos en los que el gen o genes de interés (es decir, los genes que codifican los restos inmunogénicos que van a ser expresados por los replicones) son adquiridos a partir de un agente de secuencia conocida. Se aísla un ARNm a partir de una muestra de tejido o de sangre siguiendo métodos estandarizados conocidos en la técnica, p.ej., el kit de aislamiento de ARN total S.N.A.P. (Invitrogen, Inc., Carlsbad, CA). Se sintetiza ADNc de primera cadena mediante cualquier método estándar conocido en la técnica, p.ej., con el kit de ciclo de ADNc (Invitrogen, Inc., Carlsbad, CA), o usando una transcriptasa inversa AMV y cebadores aleatorios. El(los) gen(es) de interés es(son) amplificado(s) a partir de ADNc usando cebadores específicos de gen diana, seguido de la purificación del amplicón usando un kit de purificación de PCR (Qiagen Inc., Valencia, CA) o cualquier otro método conocido en la técnica. Este amplicón se puede clonar en el replicón de VEE usando métodos conocidos por los especialistas en la técnica, p.ej., usando clonación G:C, clonación direccional tras digestión de endonucleasa de restricción o métodos de recombinación in vitro tales como Gateway (Invitrogen, Carlsbad, CA) o el sistema de recombinación Cre-lox.
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Aproximadamente 26 h después de la electroporación, el medio de cada matraz fue descartado y reemplazado con 5 mL de una disolución de lavado con sal (NaCl 1 M en tampón de fosfato 20 mM (pH 7,3)). Los matraces fueron incubados a temperatura ambiente durante 10 minutos, el lavado de sal se recolectó y se filtró a través de un filtro de jeringa de 0,2 micrómetros. Se determinó el título de ARP individual en células Vero usando anticuerpos específicos de antígeno mediante métodos de inmunofluorescencia estándares. En la Tabla 1 se muestra el título de cada ARP en el conjunto producido a partir de una única electroporación. El título de la preparación de ARP fue de 4,1 x 109 unidades infecciosas por mL, dando como resultado un total de 8,2 x 1010 i.u. de ARP total generado a partir de una única cubeta de electroporación. En la población de ARP había presentes representantes de los 10 antígenos. Este ejemplo demuestra que no solo se pueden expresar antígenos diferentes múltiples a partir de una única preparación de ARP, sino que el rango de tipo de antígeno puede ser extremadamente variado. En esta preparación, los antígenos fueron derivados de un origen de enfermedad infecciosa vírica (VIH), de origen parasitario (malaria) o de origen canceroso (rat/Neu y antígeno A de cáncer) así como de enzimas (CAT, luciferasa y β-gal).
El segundo método consistió en la generación de tránscritos de ARN para cada vector de replicón, independientemente más que en conjunto. Los 7 vectores de replicón usados en este experimento se enumeran en la Tabla 2. Se combinaron 10 µg de ARN de cada replicón purificado con 30 µg de cada uno de ARN de colaborador-C purificado y ARN de colaborador-GP, para un total de 130 µg de ARN. La mezcla de ARN se electroporó a continuación en 1,0 x 108 células Vero. Las células electroporadas se suspendieron en 200 mL de medio Opti-pro y se sembraron en 2 matraces de cultivo de 300 cm2. Aproximadamente 24 h después de la electroporación se recolectaron los medios de cada matraz y se reemplazaron con 10 mL de lavado de sal (NaCl 1 M en tampón fosfato 20 mM, pH 7,3). Los matraces fueron incubados a temperatura ambiente durante 5 minutos, y se recolectó el lavado con sal. Tanto el medio como el material de lavado con sal fueron filtrados a través de un filtro de jeringa de 0,2 micrómetros. Se valoraron los ARP individuales en el medio y en el lavado con sal en células Vero usando anticuerpos específicos de antígeno para IFA. En la Tabla 2 se muestra el título de cada ARP encontrado en el medio y en el lavado con sal. El título del ARP recuperado en el medio fue de 5,3 x 107 i.u./mL dando como resultado 1,1 x 1010 i.u. de ARP total generado (5,3 x 107 i.u./mL x 200 mL = 1,1 x 1010 i.u.). El título del ARP recuperado en el lavado con sal fue de 4,05 x 109 i.u./mL dando como resultado 8,1 x 1010 i.u. de ARP total generado por cubeta de electroporación individual. El material del lavado con sal y el medio se combinaron para un total de 9,2 x 1010 i.u. de ARP. En la población de ARP había presentes representantes de los 7 antígenos. Los ARP agrupados fueron purificados a continuación en una columna HiTrap Heparin HP de 5 mL (Amersham Bioscience, Uppsala, Suecia) para uso en estudios de vacunación de animales.
Todas las preparaciones de ARP fueron evaluadas mediante ensayos de seguridad estándares para confirmar la ausencia de virus competente de replicación (RCV). Resumidamente, se inocularon 1x108 i.u. de cada preparación en monocapas de células VERO con un m.o.i. de menos de 1 en 1 hora. Se aplicó medio de cultivo a las monocapas de células después de un periodo de infección de 1 hora y las células se cultivaron durante 24 horas. Tras 24 horas se recolectó todo el sobrenadante, se clarificó y aplicó a monocapas de células VERO nuevas durante otras 48 horas. Las monocapas de células fueron monitorizadas para determinar la presencia de cualquier efecto citopático (CPE) indicativo de la presencia de partículas de virus competente de replicación contaminantes. En ninguno de los casos se detectó RCV en las preparaciones de vacuna de ARP multi-antigénicas.
Ejemplo 5. Estudios en animales con partículas de virus multi-antigénicas.
Se obtuvieron ratones BALB/c de cinco a seis semanas de edad de Charles River Laboratories y se aclimataron una semana antes de cualquier procedimiento. Se suministró agua ad libitum a los ratones (ósmosis inversa, 1 ppm de Cl) y una dieta de roedor irradiada estándar (NIH31 modificada e irradiada) que consistió en un 18% de proteína, un 5% de grasa y un 5% de fibra. Los ratones fueron alojados en microaislantes estáticos con un ciclo de luz de 12 horas a 21 – 22 ºC (70 – 72 ºF) y con un 40% -60% de humedad. Todos los estudios con animales cumplieron con las recomendaciones de la “Guide for Care and Use of Laboratory Animals” con respecto a restricciones, cría de animales, procedimientos quirúrgicos, regulación de piensos y fluidos, y cuidados veterinarios. El cuidado de los animales y el programa de uso de animales están acreditados por AAALAC.
Para las inyecciones primarias y de recuerdo, se inocularon grupos de ratones en ambas almohadillas plantares traseras con anestesia de isoflorano con ARP multi-antigénico en diluyente (PBS con un 1% v/v de albúmina de suero humano y un 5% p/v de sacarosa). Se realizaron inyecciones subcutáneas (s.c.) en la almohadilla con una aguja 30.5G y una jeringa Hamilton de 0,10 mL inyectando 20 µL en cada almohadilla. Los animales fueron inoculados en los días 1, 23 y 44. Se obtuvieron muestras de suero mediante sangrado retro-orbital con anestesia de isoflorano antes de la primera inoculación en los días -7 y 0 (pre-sangrado), en los días 30 y 35 (después de la inoculación primaria) y en los días 51 y 56 (7 y 12 días después del recuerdo). Se extrajeron los bazos al menos 7 días después del recuerdo para ensayos ELISPOT de IFN-γ.
Se usó el ensayo de inmunofluorescencia (IFA) de células Vero infectadas con ARP para medir la potencia o el título infeccioso de cada una de las preparaciones de vacuna. Todas las vacunas de ARP fueron valoradas antes de las inoculaciones. En el día de cada inyección los inóculos residuales fueron retro-valorados. Los inóculos de vacuna de ARP se mantuvieron a 4ºC durante el tiempo posterior a la vacunación para mantener el título. Los grupos de ensayo incluyeron las siguientes preparaciones de vacuna: preparaciones de ARP multi-antigénicas de alta dosis y de baja dosis administradas en dosis de 1x108 ó 1x106 i.u., respectivamente. Como control para la monitorización de
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la respuesta inmune en comparación con una única preparación de ARP que expresa un único antígeno de ARP, que expresa solo Gag de VIH fueron administrados en una dosis equivalente al número de ARP de VIH-Gag en la mezcla multi-antigénica. Los animales de control negativo fueron sham inmunizados solo con diluyente.
Ejemplo 6. Medida de respuestas inmunes humorales y celulares tras administración de ARP multi-antigénico.
Detección de anticuerpos específicos de Gag de VIH mediante ELISA. Como recubrimiento de antígeno se usó el elemento aislado recombinante (his)-p55 de VIH-1 subtipo C DU-422, marcado con histidina. Resumidamente, se transfectaron células BHK con ARN de replicón de VEE que expresa his-p55 y se prepararon lisatos de Triton-X 100. La proteína se purificó mediante cromatografía de afinidad de metales, según las recomendaciones de los suministradores.
Los sueros del Día 51 (7 días después del recuerdo) fueron evaluados para determinar la presencia de anticuerpos específicos de Gag mediante un ELISA indirecto estándar. Para la detección de la Ig total específica de Gag, se usó un anticuerpo policlonal secundario que detecta IgM, IgG e IgA para la determinación de punto final de la valoración. Resumidamente, placas ELISA Maxisorp de 96 pocillos (placas multipocillo de poliestireno con superficie modificada para aumentar la afinidad hacia moléculas polares, es decir, los anticuerpos; Nunc, Naperville, IL) fueron recubiertas con 50 µL de tampón de carbonato de sodio 0,05 M, pH 9,6 (Sigma, St. Louis, MO) que contenía 40-80 ng de hisp55 por pocillo. Las placas fueron recubiertas con plástico adhesivo e incubadas durante una noche a 4ºC. Al siguiente día, se descartó el antígeno no ligado y las placas fueron incubadas durante 1 hora con 200 µL de tampón de bloqueo (PBS que contenía un 3% p/v de BSA) a temperatura ambiente. Los pocillos fueron lavados 6 veces con PBS y se añadió a los pocillos recubiertos con antígeno 50 µL/pocillo de suero de ensayo, diluido en serie a la mitad en tampón (PBS con 1% p/v de BSA y 0,05% v/v de Tween 20). Se incluyó anticuerpo monoclonal anti-p24 de ratón (Zeptometrix, Buffalo, NY) en todos los ensayos como control positivo. Los controles negativos de cada ensayo incluyeron blancos (pocillos con todos los reactivos y tratamientos excepto el suero) y sueros pre-sangrados. Las placas fueron incubadas durante una hora a temperatura ambiente, y a continuación se lavaron 6 veces con PBS. A cada pocillo se añadieron 50 µL de anticuerpo secundario poli-isotipo anti-ratón de cabra conjugado a fosfatasa alcalina (AP) (Sigma) diluido hasta una concentración predeterminada en tampón diluyente, y se incubó durante 1 hora a temperatura ambiente. Los pocillos fueron lavados 6 veces con PBS antes de la adición de 100 µL de sustrato de p-nitrofenil fosfato (pNPP) (Sigma). El título ELISA de anticuerpos en suero se definió como la inversa de la dilución de suero más alta que da lugar a una densidad óptica a 405 nm superior o igual a 0,2 por encima del fondo (pocillos del blanco). Las respuestas (inmunes) de anticuerpo positivas fueron detectadas en ratones vacunados con la preparación de ARP multi-antigénica y en ratones que recibieron el ARP VIH-Gag.
Las células secretoras de interferón gamma (IFN-γ) específicas de antígeno Gag y Pol son detectadas mediante Ensayo IFN-γ ELISPOT. Se prepararon suspensiones de célula individual de linfocitos esplénicos de ratones BALB/c inmunizados con ARP mediante disrupción física de la cápsula esplénica en medio R-10 (medio RPMI 1640 suplementado con 100 U/mL de penicilina, 100 µg/mL de estreptomicina, MEM 0,1 mM de disolución de aminoácidos no esenciales, HEPES 0,01 M, glutamina 2 mM y un 10% de suero de ternero fetal inactivado térmicamente). Los linfocitos fueron aislados mediante centrifugación de gradiente de densidad Lympholyte M (Accurate Scientific, Westbury, NY), se lavaron dos veces y se resuspendieron en medio R-10 fresco. Se evaluaron las poblaciones de linfocitos esplénicos totales no separadas.
Se usó un kit IFN-γ ELISPOT (Monoclonal Antibody Technology, Nacka, Suecia) para llevar a cabo el ensayo. Las células viables fueron sembradas en pocillos ELISPOT individuales en una placa ELISPOT Multiscreen Immobilon-P (placa de filtración de 96 pocillos certificada ELISPOT con membranas de PVDF de alta unión a proteína; Millipore, Billerica, MA) que habían sido precubiertas con un anticuerpo monoclonal anti-IFN-γ, e incubadas durante 16-20 horas. Las células fueron eliminadas mediante múltiples lavados con tampón y los pocillos fueron incubados con un anticuerpo monoclonal anti-IFN-γ biotinilado, seguido de lavado e incubación con Complejo de Avidina-Peroxidasa (Kit Vectastain ABC Peroxidase, Vector Laboratories, Burlingame, CA). Después de la incubación, los pocillos fueron lavados e incubados durante 4 minutos a temperatura ambiente con sustrato (comprimidos de Complejo de Avidina-Peroxidasa, Sigma, St. Louis, MO) para facilitar la formación de puntos, que representan las posiciones de las células individuales secretoras de IFN-γ durante el cultivo. Las placas fueron enumeradas mediante análisis automatizado con un sistema Zeiss KS ELISPOT.
Para enumerar las células secretoras de IFN-γ específicas de Gag en linfocitos de ratones inmunizados con construcciones VIH GAG ARP y VIH ARP multi-antigénicas que expresan gag, los linfocitos fueron estimulados con el péptido inmunodominante de VIH-Gag restringido con CD8 H-2Kd, o con un conjunto irrelevante de péptidos Nef (péptido Nef que contiene 10 elementos de 15 unidades que solapan con 11 preparados a partir de cepa DU151 de VIH de subtipo C), durante 16-20 horas (5% de CO2 a 37ºC). El péptido Gag fue evaluado a 10 µg/mL y el control Nef fue evaluado a 20 µg/mL. Las células menos el péptido sirven como control de fondo. Como control positivo, las células fueron estimuladas con 4 µg/mL de concanavalina A durante un periodo de tiempo similar. Los péptidos fueron sintetizados y purificados hasta >90% (New England Peptide, Gardner, MA).
Para enumerar las células secretoras de IFN-γ específicas de Pol en linfocitos de ratones inmunizados con construcciones de ARP multi-antigénicas que expresan pol, se usó el anterior protocolo con las siguientes modificaciones. Recientemente se han identificado epítopos Pol de VIH-1 para células T CD8 y CD4 en el fondo de
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Tabla 1.
Valoración de ARPs multi-antigénicos (Conjunto de 10 construcciones)
Vector de replicón
Título de ARP
CAT (cloranfenicol acetiltransferasa)
3,6 x 108/mL
β-gal
1,3 x 105/mL
Rat/neu
5,2 x 108/mL
Luciferasa
6,8 x 106/mL
PkMSP1-42
4,5 x 108/mL
PyHep17
2,0 x 108/mL
PfAMA1
4,0 x 107/mL
PkCSP
5,7 x 108/mL
VIH Gag
1,5 x 109/mL
Antígeno A de cáncer
4,5 x 108/mL
Total/mL
4,1 x 109/mL
Total de cubeta de electroporación individual
8,2 x 1010
Tabla 2.
Valoración de ARPs multi-antigénicos producidos a partir de un conjunto de siete ARNs
Vector de replicón
Título de ARP en el medio Título de ARP en lavado con sal
CMV IE1
2,9 x 106/mL 1,9 x 108/mL
CMV gB
2,9 x 105/mL 5,8 x 107/mL
Gripe HA
1,3 x 105/mL 1,9 x 107/mL
VIH pol
3,4 x 106/mL 3,3 x 108/mL
VIH Gag
4,2 x 107/mL 2,9 x 109/mL
Rat/neu
1,9 x 106/mL 2,6 x 108/mL
CAT (cloranfenicol acetiltransferasa)
2,3 x 106/mL 2,9 x 108/mL
Total/mL
5,7 x 107/mL 4,1 x 109/mL
Total de cubeta de electroporación individual
1,1 x 1010 8,2 x 1010
Título de ARP agrupado total
9,3 x 1010
Tabla 3.
Respuestas inmunes específicas de antígeno en animales inmunizados con ARPs multi-antigénicos
Grupo devacunación
VIH GAG ELISA VIH GAG ELISPOT VIH POL ELISPOT FLU HA IFA CMV gB Western CAT ELISA Rat/neuELISA CMV IE1 ELISA
ARP Multi-Ag s.c. almohadilla pata
8192 475 614 160ª 80ª 1280ª 1280ª 1280
ARP Multi-Ag i.p.
40960ª 439 105 160ª 80ª 1280ª 320 2560ª
ARP VIH GAG s.c. almohadilla pata
5120 500 0b 10b 10b 10b 10b 10b
Control negativo s.c. almohadilla pata
10b 0b 0b 10b 10b 10b 10b 10b
a Muestras no evaluadas hasta punto final, los títulos reales son iguales o superiores a esta medida. b En el límite de detección del ensayo o por debajo de él.

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