TW202110870A - 經修飾之腺病毒 - Google Patents

經修飾之腺病毒 Download PDF

Info

Publication number
TW202110870A
TW202110870A TW109118370A TW109118370A TW202110870A TW 202110870 A TW202110870 A TW 202110870A TW 109118370 A TW109118370 A TW 109118370A TW 109118370 A TW109118370 A TW 109118370A TW 202110870 A TW202110870 A TW 202110870A
Authority
TW
Taiwan
Prior art keywords
sequence
nucleic acid
vector
acid sequence
antigen
Prior art date
Application number
TW109118370A
Other languages
English (en)
Inventor
卡琳 約斯
希朗 丹尼爾 史卡藍
里奥尼德 吉特林
Original Assignee
美商葛利史東腫瘤科技公司
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 美商葛利史東腫瘤科技公司 filed Critical 美商葛利史東腫瘤科技公司
Publication of TW202110870A publication Critical patent/TW202110870A/zh

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/0005—Vertebrate antigens
    • A61K39/0011—Cancer antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/0005—Vertebrate antigens
    • A61K39/0011—Cancer antigens
    • A61K39/001102—Receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • A61K39/001111—Immunoglobulin superfamily
    • A61K39/001114—CD74, Ii, MHC class II invariant chain or MHC class II gamma chain
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/0005—Vertebrate antigens
    • A61K39/0011—Cancer antigens
    • A61K39/001184—Cancer testis antigens, e.g. SSX, BAGE, GAGE or SAGE
    • A61K39/001189—PRAME
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/3955—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against proteinaceous materials, e.g. enzymes, hormones, lymphokines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C07K14/70539—MHC-molecules, e.g. HLA-molecules
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/525—Virus
    • A61K2039/5256—Virus expressing foreign proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/10011—Adenoviridae
    • C12N2710/10311—Mastadenovirus, e.g. human or simian adenoviruses
    • C12N2710/10334—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/10011—Adenoviridae
    • C12N2710/10311—Mastadenovirus, e.g. human or simian adenoviruses
    • C12N2710/10341—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2710/10343—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/10011—Adenoviridae
    • C12N2710/10311—Mastadenovirus, e.g. human or simian adenoviruses
    • C12N2710/10351—Methods of production or purification of viral material
    • C12N2710/10352—Methods of production or purification of viral material relating to complementing cells and packaging systems for producing virus or viral particles
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/10011—Adenoviridae
    • C12N2710/10311—Mastadenovirus, e.g. human or simian adenoviruses
    • C12N2710/10371—Demonstrated in vivo effect
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
    • C12N2830/001—Vector systems having a special element relevant for transcription controllable enhancer/promoter combination
    • C12N2830/002—Vector systems having a special element relevant for transcription controllable enhancer/promoter combination inducible enhancer/promoter combination, e.g. hypoxia, iron, transcription factor
    • C12N2830/003—Vector systems having a special element relevant for transcription controllable enhancer/promoter combination inducible enhancer/promoter combination, e.g. hypoxia, iron, transcription factor tet inducible
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
    • C12N2830/001—Vector systems having a special element relevant for transcription controllable enhancer/promoter combination
    • C12N2830/005—Vector systems having a special element relevant for transcription controllable enhancer/promoter combination repressible enhancer/promoter combination, e.g. KRAB
    • C12N2830/006—Vector systems having a special element relevant for transcription controllable enhancer/promoter combination repressible enhancer/promoter combination, e.g. KRAB tet repressible
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
    • C12N2830/50—Vector systems having a special element relevant for transcription regulating RNA stability, not being an intron, e.g. poly A signal
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2840/00—Vectors comprising a special translation-regulating system
    • C12N2840/20—Vectors comprising a special translation-regulating system translation of more than one cistron
    • C12N2840/203—Vectors comprising a special translation-regulating system translation of more than one cistron having an IRES

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Abstract

本文揭示包含經修飾之腺病毒之組合物。亦揭示與該等組合物相關之核苷酸、細胞及方法，包括其作為疫苗之用途。本文亦揭示使用TET啟動子系統之病毒載體及具有該等載體之病毒的生產方法。

Description

經修飾之腺病毒
基於腫瘤特異性抗原之治療性疫苗作為下一代個人化癌症免疫療法具有極大的前景。1-3 舉例而言，具有高突變負荷之癌症，諸如非小細胞肺癌(NSCLC)及黑素瘤鑒於新抗原產生之可能性相對較大而係此類療法之尤其有吸引力之目標。4,5 早期證據表明，基於新抗原之疫苗接種可引發T細胞反應6 ，且靶向新抗原之細胞療法可在選定患者之某些情形下引起腫瘤消退7 。
在癌症及感染性疾病情形中之抗原疫苗設計的一個問題為存在之許多編碼突變中之哪一者產生「最佳」治療性抗原，例如可引起免疫性之抗原。
除當前抗原預測方法之挑戰外，對於可用於人類之抗原遞送的可用載體系統亦存在某些挑戰，其中許多源自人類。舉例而言，由於先前的自然暴露，許多人類對人類病毒具有預先存在的免疫性，且此種免疫性可為使用重組人類病毒用於疫苗接種策略中之抗原遞送的主要障礙，諸如在癌症治療或針對感染性疾病之疫苗接種中。儘管在解決上述問題之疫苗接種策略上取得一些進展，但仍需要改進，特別是對於臨床應用，諸如改良之疫苗效力及功效。
一種腺病毒載體，包含：腺病毒主鏈，其包含腺病毒基因組之一或多個基因或調控序列，且其中該腺病毒主鏈包含相對於該腺病毒基因組之部分缺失之E4基因，其中該部分缺失之E4基因包括缺失或部分缺失之E4orf2區及缺失或部分缺失之E4orf3區，及視情況存在之缺失或部分缺失之E4orf4區，且視情況，其中該腺病毒載體進一步包含卡匣，該卡匣包含：(1)至少一個有效負載核酸序列，視情況其中該至少一個有效負載核酸序列編碼多肽，視情況其中該多肽包含抗原，視情況其中該抗原包含：MHC I類抗原決定基、MHC II類抗原決定基、能夠刺激B細胞反應之抗原決定基或其組合，且視情況其中該至少一個有效負載核酸序列進一步包含5'連接子序列及/或3'連接子序列，及視情況其中；(2)可操作地連接於該至少一個有效負載核酸序列之至少一個啟動子序列，(3)視情況存在之至少一個通用的編碼MHC II類抗原之核酸序列；(4)視情況存在之至少一個編碼GPGPG之連接子序列(SEQ ID NO:56)；及(5)視情況存在之至少一個聚腺苷酸化序列。
本文亦揭示一種包含經修飾之ChAdV68序列之黑猩猩腺病毒載體，其中該經修飾之ChAdV68序列包含：(a)以SEQ ID NO:1所示之E4基因序列之部分缺失之E4基因，且其至少缺少以SEQ ID NO:1所示之序列之核苷酸34,916至35,642；及(b)以SEQ ID NO: 1所示之ChAdV68序列之一或多個基因或調控序列，視情況其中該一或多個基因或調控序列包含以SEQ ID NO: 1所示之序列之黑猩猩腺病毒反向末端重複序列(ITR)、E1A、E1B、E2A、E2B、E3、E4、L1、L2、L3、L4及L5基因中之至少一者；且視情況，其中該黑猩猩腺病毒載體進一步包含卡匣，其中該卡匣包含至少一個有效負載核酸序列，且其中該卡匣包含可操作地連接於該至少一個有效負載核酸序列之至少一個啟動子序列。
本文亦揭示一種包含經修飾之ChAdV68序列之黑猩猩腺病毒載體，其中該經修飾之ChAdV68序列包含：(a)以SEQ ID NO:1所示之E4基因序列之部分缺失之E4基因，且其至少缺少以SEQ ID NO:1所示之序列之核苷酸34,916至35,642；(b)以SEQ ID NO:1所示之序列之核苷酸2至34,916，其中該部分缺失之E4基因為該等核苷酸2至34,916之3'，且視情況該等核苷酸2至34,916另外缺少以SEQ ID NO:1所示之序列之核苷酸577至3403，對應於E1缺失，及/或缺少以SEQ ID NO:1所示之序列之核苷酸27,125至31,825，對應於E3缺失；及(c)以SEQ ID NO:1所示之序列之核苷酸35,643至36,518，且其中該部分缺失之E4基因為該等核苷酸35,643至36,518之5'，且視情況，其中該黑猩猩腺苷病毒載體進一步包含卡匣，其中該卡匣包含至少一個有效負載核酸序列，且其中該卡匣包含可操作地連接於該至少一個有效負載核酸序列之至少一個啟動子序列。
本文亦揭示一種黑猩猩腺病毒載體，包含：a. 經修飾之ChAdV68序列，其中該經修飾之ChAdV68序列包含：(i)以SEQ ID NO:1所示之E4基因序列之部分缺失之E4基因，且其至少缺少以SEQ ID NO:1所示之序列的核苷酸34,916至35,642；(ii)以SEQ ID NO:1所示之序列的核苷酸2至34,916，其中該部分缺失之E4基因為該等核苷酸2至34,916之3'，且視情況該等核苷酸2至34,916另外缺少以SEQ ID NO:1所示之序列的核苷酸577至3403，對應於E1缺失，及/或缺少以SEQ ID NO:1所示之序列的核苷酸27,125至31,825，對應於E3缺失；及(iii)及以SEQ ID NO:1所示之序列的核苷酸35,643至36,518，且其中該部分缺失之E4基因為該等核苷酸35,643至36,518之5'，及；b. CMV衍生之啟動子序列；c. SV40聚腺苷酸化信號核苷酸序列；及d. 卡匣，該卡匣包含至少一個至少一個有效負載核酸序列，其編碼：至少一個MHC I類抗原決定基，視情況其中該至少一個MHC I類抗原決定基包含至少2個不同的MHC I類抗原決定基，該至少2個不同的MHC I類抗原決定基彼此線性連接之，且各自視情況包含：(A)使所編碼之肽序列不同於野生型核酸序列編碼之相應肽序列的至少一個改變，其中該不同的MHC I抗原決定基之長度為7-15個胺基酸，(B) N末端連接子，其包含該不同的MHC I抗原決定基之長度為至少3個胺基酸之天然N末端胺基酸序列，(C) C末端連接子，其包含該不同的MHC I抗原決定基之長度為至少3個胺基酸之天然C末端酸序列，或(D)其組合，至少一個MHC II類抗原決定基，視情況其中該至少一個MHC II類抗原決定基包含至少2個不同的MHC II類抗原決定基，至少一個能夠刺激B細胞反應之抗原決定基或其組合，且其中該卡匣經插入ChAdV68之缺失區域內，且該CMV衍生之啟動子序列可操作地連接於該卡匣。
本文亦揭示一種用於刺激個體之免疫反應之方法，該方法包括向該個體投與腺病毒載體，該腺病毒載體包含：腺病毒主鏈，其包含腺病毒基因組之一或多個基因或調控序列，且其中該腺病毒主鏈包含相對於該腺病毒基因組之部分缺失之E4基因，其中該部分缺失之E4基因包含缺失或部分缺失之E4orf2區及缺失或部分缺失之E4orf3區，及視情況存在之缺失或部分缺失之E4orf4區，且其中該腺病毒載體進一步包含卡匣，該卡匣包含：(1)至少一個有效負載核酸序列，視情況其中該至少一個有效負載核酸序列編碼多肽，視情況其中該多肽包含抗原，視情況其中該抗原包含：MHC I類抗原決定基、MHC II類抗原決定基、能夠刺激B細胞反應之抗原決定基或其組合，且視情況其中該至少一個有效負載核酸序列進一步包含5'連接子序列及/或3'連接子序列，及視情況其中；(2)可操作地連接於該至少一個有效負載核酸序列之至少一個啟動子序列，(3)視情況存在之至少一個通用的編碼MHC II類抗原之核酸序列；(4)視情況存在之至少一個編碼GPGPG之連接子序列(SEQ ID NO:56)；及(5)視情況存在之至少一個聚腺苷酸化序列。
本文亦揭示一種用於治療患有疾病之個體之方法，視情況其中該疾病為癌症或感染，該方法包括向該個體投與腺病毒載體，該腺病毒載體包含：腺病毒主鏈，其包含腺病毒基因組之一或多個基因或調控序列，且其中該腺病毒主鏈包含相對於該腺病毒基因組之部分缺失之E4基因，其中該部分缺失之E4基因包含缺失或部分缺失之E4orf2區及缺失或部分缺失之E4orf3區，及視情況存在之缺失或部分缺失之E4orf4區，且其中該腺病毒載體進一步包含卡匣，該卡匣包含：(1)至少一個有效負載核酸序列，視情況其中該至少一個有效負載核酸序列編碼多肽，視情況其中該多肽包含抗原，視情況其中該抗原包含：MHC I類抗原決定基、MHC II類抗原決定基、能夠刺激B細胞反應之抗原決定基或其組合，且視情況其中該至少一個有效負載核酸序列進一步包含5'連接子序列及/或3'連接子序列，及視情況其中；(2)可操作地連接於該至少一個有效負載核酸序列之至少一個啟動子序列，(3)視情況存在之至少一個通用的編碼MHC II類抗原之核酸序列；(4)視情況存在之至少一個編碼GPGPG之連接子序列(SEQ ID NO:56)；及(5)視情況存在之至少一個聚腺苷酸化序列。
本文亦揭示一種刺激個體之免疫反應之方法，該方法包括向該個體投與包含經修飾之ChAdV68序列之腺病毒載體，其中該經修飾之ChAdV68序列包含：(a)以SEQ ID NO:1所示之E4基因序列之部分缺失之E4基因，且其至少缺少以SEQ ID NO:1所示之序列之核苷酸34,916至35,642；及(b)以SEQ ID NO:1所示之ChAdV68序列之一或多個基因或調控序列，視情況其中該一或多個基因或調控序列包含以SEQ ID NO: 1所示之序列之黑猩猩腺病毒反向末端重複序列(ITR)、E1A、E1B、E2A、E2B、E3、E4、L1、L2、L3、L4及L5基因中之至少一者；且其中該黑猩猩腺病毒載體進一步包含卡匣，其中該卡匣包含至少一個有效負載核酸序列，且其中該卡匣包含可操作地連接於該至少一個有效負載核酸序列之至少一個啟動子序列。
本文亦揭示一種用於治療患有疾病之個體之方法，視情況其中該疾病為癌症或感染，該方法包括向該個體投與包含經修飾之ChAdV68序列之腺病毒載體，其中該經修飾之ChAdV68序列包含：(a)以SEQ ID NO:1所示之E4基因序列之部分缺失之E4基因，且其至少缺少以SEQ ID NO:1所示之序列之核苷酸34,916至35,642；及(b)以SEQ ID NO:1所示之ChAdV68序列之一或多個基因或調控序列，視情況其中該一或多個基因或調控序列包含以SEQ ID NO: 1所示之序列之黑猩猩腺病毒反向末端重複序列(ITR)、E1A、E1B、E2A、E2B、E3、E4、L1、L2、L3、L4及L5基因中之至少一者；且其中該黑猩猩腺病毒載體進一步包含卡匣，其中該卡匣包含至少一個有效負載核酸序列，且其中該卡匣包含可操作地連接於該至少一個有效負載核酸序列之至少一個啟動子序列。
本文亦揭示一種產生病毒之方法，其中該方法包括以下步驟：a. 提供包含卡匣之病毒載體，該卡匣包含：(i)至少一個有效負載核酸序列，視情況其中該至少一個有效負載核酸序列編碼多肽，視情況其中該多肽包含抗原，視情況其中該抗原包含：MHC I類抗原決定基、MHC II類抗原決定基、能夠刺激B細胞反應之抗原決定基或其組合，且視情況其中該至少一個有效負載核酸序列進一步包含5'連接子序列及/或3'連接子序列，及視情況其中；(ii)可操作地連接於該至少一個有效負載核酸序列之至少一個啟動子序列，其中該至少一個啟動子為四環素(TET)阻遏蛋白(TETr)控制之啟動子，(iii)視情況存在之至少一個編碼MHC II類抗原之核酸序列；(iv)視情況存在之至少一個編碼GPGPG之連接子序列(SEQ ID NO:56)；及(v)視情況存在之至少一個聚腺苷酸化序列；b. 提供經工程改造以表現該TETr蛋白之細胞；及c. 在足以產生該病毒之條件下使該病毒載體與該細胞接觸。
在一些態樣中，該病毒載體包括黑猩猩腺病毒載體，視情況其中該黑猩猩腺病毒載體為ChAdV68載體。在一些態樣中，相對於使用不具有該TETr控制之啟動子之載體產生之病毒的產生，使用該包含TETr控制之啟動子之載體增加該病毒之產生。在一些態樣中，該產生增加係相對於使用不具有TETr控制之啟動子之載體的產生增加至少1.5倍、至少2倍、至少2.5倍、至少4倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍、至少8倍、至少9倍或至少10倍。在一些態樣中，該產生增加係相對於使用不具有TETr控制之啟動子之載體的產生增加至少15倍、至少20倍、至少25倍、至少30倍、至少35倍、至少40倍、至少50倍、至少60倍、至少70倍、至少80倍、至少90倍或至少100倍。在一些態樣中，相對於使用未經工程改造以表現TETr蛋白之細胞產生之病毒的產生，使用包含TETr控制之啟動子之載體增加病毒之產生。在一些態樣中，該產生增加係相對於使用未經工程改造以表現TETr蛋白之細胞的產生增加至少1.5倍、至少2倍、至少2.5倍、至少4倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍、至少8倍、至少9倍或至少10倍。
本文亦提供一種病毒載體，該病毒載體包含卡匣，該卡匣包含：(i)至少一個有效負載核酸序列，視情況其中該至少一個有效負載核酸序列編碼多肽，視情況其中該多肽包含抗原，視情況其中該抗原包含：MHC I類抗原決定基、MHC II類抗原決定基、能夠刺激B細胞反應之抗原決定基或其組合，且視情況其中該至少一個有效負載核酸序列進一步包含5'連接子序列及/或3'連接子序列，及視情況其中；(ii)可操作地連接於該至少一個有效負載核酸序列之至少一個啟動子序列，其中該至少一個啟動子為四環素(TET)阻遏蛋白(TETr)控制之啟動子，(iii)視情況存在之至少一個編碼MHC II類抗原之核酸序列；(iv)視情況存在之至少一個編碼GPGPG之連接子序列(SEQ ID NO:56)；及(v)視情況存在之至少一個聚腺苷酸化序列。
在一些態樣中，該TETr控制之啟動子包含一或多個TET操縱子(TETo)核酸序列，視情況其中該一或多個TETo核酸序列包含以SEQ ID NO:60所示之核苷酸序列。在一些態樣中，一或多個TETo核酸序列包含2、3、4、5、6、7、8、9或10個或更多個TETo核酸序列，視情況其中TETo核酸序列各自包含以SEQ ID NO:60所示之核苷酸序列。在一些態樣中，2個或更多個TETo核酸序列連接在一起。在一些態樣中，2個或更多個TETo核酸序列直接連接在一起。在一些態樣中，2個或更多個TETo核酸序列係利用連接子序列連接在一起，其中該連接子包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個或更多個核苷酸，且視情況其中該連接子序列包含以SEQ ID NO:61所示之連接子核苷酸序列。在一些態樣中，一或多個TETo核酸序列為啟動子序列之RNA聚合酶結合序列之5'。在一些態樣中，一或多個TETo核酸序列為啟動子序列之RNA聚合酶結合序列之3'。在一些態樣中，至少一個啟動子序列包含CMV、SV40、EF-1、RSV、PGK、HSA、MCK或EBV啟動子序列。在一些態樣中，至少一個啟動子序列為CMV衍生之啟動子序列，視情況其中該CMV啟動子序列包含以SEQ ID NO:64所示之CMV啟動子核苷酸序列。在一些態樣中，CMV衍生之啟動子序列為最小CMV啟動子序列，視情況其中該最小CMV啟動子序列包含如SEQ ID NO:61所示之最小CMV啟動子核苷酸序列。
在一些態樣中，可操作地連接於至少一個有效負載核酸序列之TETr控制之啟動子包含以下式描述之有序序列，自5'至3'包含：(T-LY )X -P-N ， 其中，N包含至少一個有效負載核酸序列之一，視情況其中各N編碼MHC I類抗原決定基、MHC II類抗原決定基、能夠刺激B細胞反應之抗原決定基或其組合，視情況存在至少一個改變，該改變使得所編碼之抗原決定基序列不同於由野生型核酸序列編碼之相應肽序列，P，可操作地連接於至少一個有效負載核酸序列中之至少一者之啟動子序列的RNA聚合酶結合序列，T包括包含以SEQ ID NO:60所示之核苷酸序列之TETo核酸序列，L包含連接子序列，其中對於各X，Y = 0或1，且其中X = 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20。在一些態樣中，可操作地連接於至少一個有效負載核酸序列之TETr控制之啟動子包含以下式描述之有序序列，自5'至3'包含：P-(T-LY )X -N ，其中，N包含至少一個有效負載核酸序列之一，視情況其中各N編碼MHC I類抗原決定基、MHC II類抗原決定基、能夠刺激B細胞反應之抗原決定基或其組合，視情況存在至少一個改變，該改變使得所編碼之抗原決定基序列不同於由野生型核酸序列編碼之相應肽序列，P，可操作地連接於至少一個有效負載核酸序列中之至少一者之啟動子序列的RNA聚合酶結合序列，T包括包含以SEQ ID NO:60所示之核苷酸序列之TETo核酸序列，L包含連接子序列，其中對於各X，Y = 0或1，且其中X = 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20。
在一些態樣中，該TETr控制之啟動子包含：(1)最小CMV啟動子序列；(2) 7個TETo核酸序列，其中該等TETo核酸序列各自包含以SEQ ID NO:60所示之核苷酸序列，且其中該等TETo核酸序列各自利用連接子序列連接在一起，該7個TETo核酸序列為該最小CMV啟動子序列之5'，且視情況其中該TETr控制之啟動子包含以SEQ ID NO:61所示之核苷酸序列。在一些態樣中，該TETr控制之啟動子包含：(1) CMV啟動子序列；(2) 2個TETo核酸序列，其中該等TETo核酸序列各自包含以SEQ ID NO:60所示之核苷酸序列，且其中該等TETo核酸序列各自直接連接在一起，該2個TETo核酸序列為該CMV啟動子序列之3'，且視情況其中該TETr控制之啟動子包含以SEQ ID NO:64所示之核苷酸序列。
在一些態樣中，該病毒載體包含載體主鏈，其中該載體主鏈包含黑猩猩腺病毒載體，視情況其中該黑猩猩腺病毒載體為ChAdV68載體。
在一些態樣中，卡匣包含以下式描述之有序序列，自5'至3'包含：Pa -(L5b -Nc -L3d )X -(G5e -Uf )Y -G3g -Ah ，其中，N包含該至少一個有效負載核酸序列之一，視情況其中各N編碼MHC I類抗原決定基、MHC II類抗原決定基、能夠刺激B細胞反應之抗原決定基或其組合，視情況存在至少一個改變，該改變使得所編碼之抗原決定基序列不同於由野生型核酸序列編碼之相應肽序列，其中c = 1，P包含可操作地連接於該至少一個有效負載核酸序列中之至少一者之至少一個啟動子序列，其中a = 1，L5包含5'連接子序列，其中b = 0或1，L3包含3'連接子序列，其中d = 0或1，G5包含至少一個編碼GPGPG胺基酸連接子之核酸序列之一，其中e = 0或1，G3包含至少一個編碼GPGPG胺基酸連接子之核酸序列之一，其中g = 0或1，U包含至少一個通用的編碼MHC II類抗原之核酸序列之一，其中f = 1，A包含至少一個聚腺苷酸化序列，其中h = 0或1，X = 2至400，其中對於各X，相應之Nc 為有效負載核酸序列，視情況其中對於各X，相應之Nc 為不同的有效負載核酸序列，且Y = 0-2，其中對於各Y，相應之Uf 為通用的編碼MHC II類抗原之核酸序列，視情況其中對於各Y，相應之Uf 為不同之通用的編碼MHC II類抗原之核酸序列。
在一些態樣中，該卡匣進一步包含未在有序序列中編碼之至少一個額外有效負載核酸序列。在一些態樣中，b = 1，d = 1，e = 1，g = 1，h = 1，X = 10，Y = 2，P為CMV衍生之啟動子序列，各N編碼MHC I類抗原決定基、MHC II類抗原決定基、能夠刺激B細胞反應之抗原決定基或其組合，L5編碼抗原決定基之天然N末端胺基酸序列，且其中5'連接子序列編碼長度為至少3個胺基酸之肽，L3編碼抗原決定基之天然C末端胺基酸序列，且其中3'連接子序列編碼長度為至少3個胺基酸之肽，U為PADRE II類序列及破傷風類毒素MHC II類序列中之每一者，且該載體包含經修飾之ChAdV68序列，其中該經修飾之ChAdV68序列包含：(a)以SEQ ID NO:1所示之E4基因序列之部分缺失之E4基因，且其至少缺少以SEQ ID NO:1所示之序列之核苷酸34,916至35,642；(b)以SEQ ID NO:1所示之序列之核苷酸2至34,916，其中該部分缺失之E4基因為該等核苷酸2至34,916之3'，且視情況該等核苷酸2至34,916另外缺少以SEQ ID NO:1所示之序列之核苷酸577至3403，對應於E1缺失，及/或缺少以SEQ ID NO:1所示之序列之核苷酸27,125至31,825，對應於E3缺失；及(c)以SEQ ID NO:1所示之序列的核苷酸35,643至36,518，且其中該部分缺失之E4基因為該等核苷酸35,643至36,518之5'。
在一些態樣中，該載體為黑猩猩腺病毒載體，視情況其中該黑猩猩腺病毒載體為ChAdV68載體。
在一些態樣中，該部分缺失之E4基因包含：A. 以SEQ ID NO:1中所示之E4基因序列，且其至少缺少以SEQ ID NO:1所示之序列的核苷酸34,916至35,642，B. 以SEQ ID NO:1所示之E4基因序列，且其至少缺少以SEQ ID NO:1所示之序列的核苷酸34,916至34,942、核苷酸34,952至35,305、以SEQ ID NO:1所示之序列的核苷酸35,302至35,642，且其中該載體至少包含以SEQ ID NO:1所示之序列的核苷酸2至36,518，C. 以SEQ ID NO:1所示之E4基因序列，且其至少缺少以SEQ ID NO:1所示之序列的核苷酸34,980至36,516，且其中該載體至少包含以SEQ ID NO:1所示之序列的核苷酸2至36,518，D. 以SEQ ID NO:1所示之E4基因序列，且其至少缺少以SEQ ID NO:1所示之序列的核苷酸34,979至35,642，且其中該載體至少包含以SEQ ID NO:1所示之序列的核苷酸2至36,518，E. 至少部分缺失E4Orf2、完全缺失E4Orf3及至少部分缺失E4Orf4之E4缺失，F. 至少部分缺失E4Orf2、至少部分缺失E4Orf3及至少部分缺失E4Orf4之E4缺失，G. 至少部分缺失E4Orf1、完全缺失E4Orf2及至少部分缺失E4Orf3之E4缺失，或H. 至少部分缺失E4Orf2及至少部分缺失E4Orf3之E4缺失。
在一些態樣中，該載體包含以SEQ ID NO: 1所示之ChAdV68序列之一或多個基因或調控序列，視情況其中該一或多個基因或調控序列選自由以下組成之群：以SEQ ID NO: 1所示之序列的黑猩猩腺病毒反向末端重複序列(ITR)、E1A、E1B、E2A、E2B、E3、E4、L1、L2、L3、L4及L5基因。在一些態樣中，該腺病毒主鏈或經修飾之ChAdV68序列在選自由腺病毒E1A、E1B、E2A、E2B、E3、L1、L2、L3、L4及L5基因組成之群的至少一個基因中進一步包含關於腺病毒基因組或關於以SEQ ID NO: 1所示之序列的功能性缺失，視情況其中該腺病毒主鏈或經修飾之ChAdV68序列完全缺失或功能性缺失以下各者：(1) E1A及E1B；或(2) E1A、E1B及E3，關於腺病毒基因組或關於以SEQ ID NO: 1所示之序列，視情況其中該E1基因經由關於以SEQ ID NO: 1所示之序列之至少核苷酸577至3403之E1缺失而功能性缺失，且視情況其中該E3基因經由關於以SEQ ID NO: 1所示之序列之至少核苷酸27,125至31,825之E3缺失而功能性缺失。
在一些態樣中，該卡匣存在且插入該載體中之E1區、E3區及/或允許併入該卡匣之任何缺失AdV區中。
在一些態樣中，該載體係由第一代、第二代或輔助依賴性腺病毒載體中之一者產生。
在一些態樣中，該經修飾之ChAdV68序列包含以SEQ ID NO:1所示之序列的核苷酸2至34,916，其中部分缺失之E4基因為核苷酸2至34,916之3'。在一些態樣中，核苷酸2至34,916缺少以SEQ ID NO:1所示之序列的核苷酸577至3403，對應於E1缺失。在一些態樣中，核苷酸2至34,916關於以SEQ ID NO: 1所示之序列缺少核苷酸456-3014。在一些態樣中，核苷酸2至34,916關於以SEQ ID NO: 1所示之序列缺少核苷酸27,125-31,825，對應於E3缺失。在一些態樣中，核苷酸2至34,916關於以SEQ ID NO: 1所示之序列缺少核苷酸27,816-31,333。在一些態樣中，核苷酸2至34,916缺少以SEQ ID NO:1所示之序列的核苷酸577至3403，對應於E1缺失，且缺少以SEQ ID NO:1所示之序列的核苷酸27,125至31,825，對應於E3缺失。在一些態樣中，核苷酸2至34,916關於以SEQ ID NO: 1所示之序列進一步缺少核苷酸3957-10346、核苷酸21787-23370、核苷酸33486-36193或其組合。
在一些態樣中，至少一個有效負載核酸序列中之至少一者編碼抗原，其中該抗原包含：MHC I類抗原決定基、MHC II類抗原決定基、能夠刺激B細胞反應之抗原決定基或其組合。在一些態樣中，至少一個有效負載核酸序列中之至少一者編碼能夠進行抗原加工為抗原決定基之多肽序列，視情況其中該抗原決定基已知或疑似由MHC I類呈現於細胞表面上，視情況其中該細胞表面為腫瘤細胞表面或受感染細胞表面。
在一些態樣中，至少一個有效負載核酸序列中之至少一者編碼由MHC I類及/或MHC II類呈現於細胞表面上之多肽序列或其部分，視情況其中該細胞表面為腫瘤細胞表面或受感染細胞表面。在一些態樣中，該腫瘤細胞選自由以下組成之群：肺癌、黑素瘤、乳癌、卵巢癌、前列腺癌、腎癌、胃癌、結腸癌、睪丸癌、頭頸癌、胰臟癌、腦癌、B-細胞淋巴瘤、急性骨髓性白血病、慢性骨髓性白血病、慢性淋巴球性白血病、T細胞淋巴球性白血病、非小細胞肺癌及小細胞肺癌，或該受感染細胞選自由以下組成之群：病原體感染細胞、病毒感染細胞、細菌感染細胞、真菌感染細胞及寄生蟲感染細胞，視情況其中該病毒感染細胞選自由以下組成之群：HIV感染細胞、嚴重急性呼吸症候群相關冠狀病毒(SARS)感染細胞、嚴重急性呼吸症候群冠狀病毒2 (SARS-CoV-2)感染細胞、埃博拉病毒感染細胞、B型肝炎病毒(HBV)感染細胞、流感感染細胞及C型肝炎病毒(HCV)感染細胞。
在一些態樣中，該至少一個有效負載核酸序列中之至少一者編碼包含能夠刺激B細胞反應之抗原決定基的多肽序列或其部分，視情況其中該多肽序列或其部分包含經預測或已知能夠由抗體結合之全長蛋白質、蛋白質結構域、蛋白質次單元或抗原片段。
在一些態樣中，該至少一個有效負載核酸序列中之至少一者編碼選自由以下組成之群的感染性疾病生物體肽：病原體衍生肽、病毒衍生肽、細菌衍生肽、真菌衍生肽及寄生蟲衍生肽。在一些態樣中，該至少一個有效負載核酸序列中之至少一者編碼具有至少一個改變之抗原決定基，該改變使得所編碼之抗原決定基序列不同於由野生型核酸序列編碼之相應肽序列。在一些態樣中，該至少一個有效負載核酸序列中之至少一者編碼具有至少一個改變之MHC I類抗原決定基或MHC II類抗原決定基，該改變使得所編碼之肽序列不同於由野生型核酸序列編碼之相應肽序列，視情況其中所編碼之多肽序列或其部分相對於經轉譯之相應野生型核酸序列具有增加之結合親和力、增加之結合穩定性及/或增加之在其相應MHC對偶基因上呈現之可能性。在一些態樣中，該至少一個改變包括點突變、讀框移位突變、非讀框移位突變、缺失突變、插入突變、剪接變異體、基因組重排或蛋白酶體產生之剪接抗原。
在一些態樣中，該至少一個有效負載核酸序列中之至少一者編碼全長蛋白質、蛋白質結構域或蛋白質次單元。在一些態樣中，該至少一個有效負載核酸序列中之至少一者編碼抗體、細胞介素、嵌合抗原受體(CAR)、T細胞受體及基因組編輯系統核酸酶。
在一些態樣中，該至少一個有效負載核酸序列中之至少一者包括非編碼核酸序列。在一些態樣中，該非編碼核酸序列包含RNA干擾(RNAi)聚核苷酸或基因組編輯系統聚核苷酸。
在一些態樣中，該至少一個有效負載核酸序列中之每一者彼此直接連接。在一些態樣中，該至少一個有效負載核酸序列中之至少一者利用編碼連接子之核酸序列連接至不同的有效負載核酸序列。在一些態樣中，該連接子將編碼MHC I類抗原決定基之兩個有效負載核酸序列連接或將編碼MHC I類抗原決定基之第一有效負載核酸序列連接至編碼MHC II類抗原決定基或編碼能夠刺激B細胞反應之抗原決定基序列之第二有效負載核酸序列。在一些態樣中，該連接子選自由以下組成之群：(1)連續甘胺酸殘基，長度為至少2、3、4、5、6、7、8、9或10個殘基；(2)連續丙胺酸殘基，長度為至少2、3、4、5、6、7、8、9或10個殘基；(3)兩個精胺酸殘基(RR)；(4)丙胺酸、丙胺酸、酪胺酸(AAY)；(5)由哺乳動物蛋白酶體有效加工之長度為至少2、3、4、5、6、7、8、9或10個胺基酸殘基的共同序列；及(6)側接源自同源蛋白之抗原且長度為至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20個或2-20個胺基酸殘基的一或多個天然序列。在一些態樣中，該連接子將兩個編碼MHC II類抗原決定基之有效負載核酸序列連接或將編碼MHC II類抗原決定基之第一有效負載核酸序列連接至編碼MHC I類抗原決定基或編碼能夠刺激B細胞反應之抗原決定基序列之第二有效負載核酸序列。在一些態樣中，該連接子包含序列GPGPG。
在一些態樣中，該至少一個有效負載核酸序列中之至少一者可操作地或直接地連接至增強該至少一個有效負載核酸序列之表現、穩定性、細胞運輸、加工及呈現及/或免疫原性，及視情況由該至少一個有效負載核酸序列編碼之多肽之表現、穩定性、細胞運輸、加工及呈現及/或免疫原性的分離或連續序列。在一些態樣中，該分離或連續之序列包含以下中之至少一者：泛素序列；經修飾以增加蛋白酶體靶向之泛素序列，視情況其中該泛素序列在位置76處含有Gly至Ala之取代；免疫球蛋白信號序列，視情況其中該免疫球蛋白信號序列包含IgK；主要組織相容性I類序列；溶酶體相關膜蛋白(LAMP)-1；人類樹突狀細胞溶酶體相關膜蛋白；及主要組織相容性II類序列；視情況其中該經修飾以增加蛋白酶體靶向之泛素序列為A76。
在一些態樣中，該至少一個有效負載核酸序列中之每一者之表現由該至少一個啟動子驅動。
在一些態樣中，該至少一個有效負載核酸序列包括至少2、3、4、5、6、7、8、9或10個有效負載核酸序列。在一些態樣中，該至少一個有效負載核酸序列包括至少11、12、13、14、15、16、17、18、19、20個或至多400個有效負載核酸序列。在一些態樣中，該至少一個有效負載核酸序列包括至少2-400個有效負載核酸序列，且其中該至少一個有效負載核酸序列中之至少一者編碼MHC I類抗原決定基、MHC II類抗原決定基、能夠刺激B細胞反應之抗原決定基或其組合。在一些態樣中，該至少一個有效負載核酸序列包括至少2-400個有效負載核酸序列，且其中，當投與至該個體且經轉譯時，該至少一個有效負載核酸序列中之至少一者編碼於抗原呈現細胞上呈現之抗原，產生靶向該抗原之免疫反應。在一些態樣中，該至少一個有效負載核酸序列包含至少2-400個MHC I類及/或II類抗原編碼核酸序列，其中當投與至該個體且經轉譯時，該等MHC I類或II類抗原中之至少一者呈現於抗原呈現細胞上，產生靶向細胞表面上之該等抗原之至少一者的免疫反應，且視情況其中該至少2-400個MHC I類或II類抗原編碼核酸序列中之每一者之表現由該至少一個啟動子驅動。
在一些態樣中，各MHC I類抗原決定基之長度獨立地介於8至35個胺基酸之間，視情況長度為7-15、9-17、9-25、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34或35個胺基酸。在一些態樣中，存在至少一個通用的編碼MHC II類抗原之核酸序列。在一些態樣中，存在至少一個通用的編碼MHC II類抗原之核酸序列，且包含至少一個包含至少一個改變之通用的編碼MHC II類抗原之核酸序列，該改變使得所編碼之肽序列不同於由野生型核酸序列編碼之相應肽序列。在一些態樣中，該至少一個通用的編碼MHC II類抗原之核酸序列之長度為12-20、12、13、14、15、16、17、18、19、20或20-40個胺基酸。在一些態樣中，存在至少一個通用的編碼MHC II類抗原之核酸序列，且其中該至少一個通用序列包括破傷風類毒素及PADRE中之至少一者。
在一些態樣中，該至少一個啟動子序列為可調控啟動子，視情況其中該可調控啟動子為四環素(TET)阻遏蛋白(TETr)控制之啟動子，視情況其中該可調控啟動子包括在該啟動子之RNA聚合酶結合序列之5'或3'的多個TET操縱子(TETo)序列。多個TET操縱子(TETo)序列為RNA之5'或3'，該至少一個啟動子序列為組成型。多個TET操縱子(TETo)序列為RNA之5'或3'，該至少一個啟動子序列為CMV、SV40、EF-1、RSV、PGK、HSA、MCK或EBV啟動子序列。
在一些態樣中，該卡匣進一步包含可操作地連接於該至少一個有效負載核酸序列中之至少一者的至少一個聚腺苷酸化(polyA)序列，視情況其中該polyA序列位於該至少一個有效負載核酸序列之3'。在一些態樣中，該polyA序列包含SV40或牛生長激素(BGH) polyA序列。
在一些態樣中，該卡匣進一步包含以下中之至少一者：內含子序列，土撥鼠肝炎病毒轉錄後調控元件(WPRE)序列，內部核糖體進入序列(IRES)序列，編碼2A自裂解肽序列之核苷酸序列，編碼弗林蛋白酶裂解位點之核苷酸序列，編碼TEV裂解位點之核苷酸序列，或已知增強可操作地連接於該至少一個有效負載核酸序列中之至少一者之mRNA的核輸出、穩定性或轉譯效率的5'或3'非編碼區中之序列。
在一些態樣中，該卡匣包含報導基因，該報導基因包括但不限於綠色螢光蛋白(GFP)、GFP變異體、分泌之鹼性磷酸酶、螢光素酶或螢光素酶變異體。
在一些態樣中，該載體進一步包含一或多個編碼至少一種免疫調節因子之有效負載核酸序列，視情況其中該至少一種免疫調節因子抑制免疫檢查點分子。在一些態樣中，該免疫調節因子為抗CTLA4抗體或其抗原結合片段、抗PD-1抗體或其抗原結合片段、抗PD-L1抗體或其抗原結合片段、抗4-1BB抗體或其抗原結合片段、或抗OX-40抗體或其抗原結合片段。在一些態樣中，該抗體或其抗原結合片段為Fab片段、Fab'片段、單鏈Fv (scFv)、呈單特異性或連接在一起之多特異性形式的單結構域抗體(sdAb) (例如駱駝科抗體結構域)、或全長單鏈抗體(例如具有藉由可撓性連接子連接之重鏈及輕鏈的全長IgG)。在一些態樣中，該抗體之重鏈及輕鏈序列係由諸如2A之自裂解序列或IRES序列分隔開的連續序列，視情況其中該自裂解序列在該自裂解序列之5'具有弗林蛋白酶裂解位點序列；或該抗體之該等重鏈及輕鏈序列由可撓性連接子，諸如連續甘胺酸殘基連接。在一些態樣中，該免疫調節因子為細胞介素。在一些態樣中，該細胞介素為IL-2、IL-7、IL-12、IL-15或IL-21或其各自變異體中之至少一者。
在一些態樣中，該至少一個有效負載核酸序列中之至少一者藉由執行以下步驟選擇：(a)自腫瘤細胞、受感染細胞或感染性疾病生物體獲得外顯子組、轉錄組或全基因組核苷酸定序資料中之至少一者，其中該核苷酸定序資料用於獲得代表抗原集合中之每一者之肽序列的資料；(b)將各抗原之肽序列輸入至呈現模型中，以產生該等抗原中之每一者由該等MHC對偶基因中之一或多者呈現在細胞表面、視情況腫瘤細胞表面或受感染細胞表面上的數值可能性集合，該數值可能性集合已至少基於所接受之質譜資料進行鑑別；及(c)基於該數值可能性集合選擇該抗原集合之子集以產生一組選擇抗原，該組抗原用於產生該至少一個有效負載核酸序列。
在一些態樣中，該至少一個有效負載核酸序列中之每一者藉由執行以下步驟選擇：(a)自腫瘤細胞、受感染細胞或感染性疾病生物體獲得外顯子組、轉錄組或全基因組核苷酸定序資料中之至少一者，其中該核苷酸定序資料用於獲得代表抗原集合中之每一者之肽序列的資料；(b)將各抗原之肽序列輸入至呈現模型中，以產生該等抗原中之每一者由該等MHC對偶基因中之一或多者呈現在細胞表面、視情況腫瘤細胞表面或受感染細胞表面上的數值可能性集合，該數值可能性集合已至少基於所接受之質譜資料進行鑑別；及(c)基於該數值可能性集合選擇該抗原集合之子集以產生一組選擇抗原，該組抗原用於產生該至少一個有效負載核酸序列中之每一者。在一些態樣中，該組選擇抗原之數目為2-20個。在一些態樣中，該呈現模型表示以下兩者之間的依賴性：(a)該等MHC對偶基因中之一對特定對偶基因及在肽序列之特定位置處之特定胺基酸的存在；及(b)由在該特定位置處包含該特定胺基酸之該肽序列的該對MHC對偶基因中之特定一者呈現在細胞表面、視情況腫瘤細胞表面或受感染細胞表面上的可能性。在一些態樣中，選擇該選擇抗原之集合包括基於該呈現模型選擇相對於未選擇之抗原，呈現在該細胞表面上之可能性增加的抗原。在一些態樣中，選擇該選擇抗原之集合包括基於該呈現模型選擇相對於未選擇之抗原，能夠誘發該個體中之細胞特異性免疫反應之可能性增加的抗原。在一些態樣中，選擇該選擇抗原之集合包括基於該呈現模型選擇相對於未選擇之抗原，能夠由專職抗原呈現細胞(APC)呈現給初始T細胞之可能性增加的抗原，視情況其中該APC為樹突狀細胞(DC)。在一些態樣中，選擇該選擇抗原之集合包括基於該呈現模型，選擇相對於未選擇之抗原經由中心或外周耐受性受抑制之可能性降低的抗原。在一些態樣中，選擇該選擇抗原之集合包括基於該呈現模型選擇相對於未選擇之抗原，能夠誘發對該個體中之正常組織之自身免疫反應的可能性降低之抗原。在一些態樣中，外顯子組或轉錄組核苷酸定序資料係藉由對腫瘤細胞或組織、受感染細胞或感染性疾病生物體進行定序而獲得。在一些態樣中，該定序為下一代定序(NGS)或任何大規模平行定序方法。
在一些態樣中，該卡匣包含由該卡匣中之鄰近序列形成的連接抗原決定基序列。在一些態樣中，至少一個或每個連接抗原決定基序列對MHC之親和力大於500 nM。在一些態樣中，每個連接抗原決定基序列為非自身的。在一些態樣中，該卡匣不編碼非治療性MHC I類或II類抗原決定基，其中預測該非治療性抗原決定基呈現於個體之MHC對偶基因上。在一些態樣中，該經預測之非治療性MHC I類或II類抗原決定基序列為由該卡匣中之鄰近序列形成的連接抗原決定基序列。在一些態樣中，該預測係基於藉由將該等非治療性抗原決定基之序列輸入至呈現模型中而產生的呈現可能性。在一些態樣中，該卡匣中之該至少一個有效負載核酸序列之順序係藉由一系列步驟確定，該等步驟包括：i. 產生一組候選卡匣序列，其對應於該至少一個有效負載核酸序列之不同順序；ii. 對於各候選卡匣序列，基於該候選卡匣序列中非治療性抗原決定基之呈現來確定呈現評分；及iii. 選擇與低於預定臨限值之呈現評分相關的候選卡匣序列作為該卡匣序列。
在一些態樣中，該等MHC I類及/或II類抗原決定基中之每一者經預測或驗證為能夠由存在於至少5%之人類群體中之至少一個HLA對偶基因呈現。在一些態樣中，該等MHC I類及/或II類抗原決定基中之每一者經預測或驗證為能夠由至少一個HLA對偶基因呈現，其中各抗原/HLA對在人類群體中具有至少0.01%之抗原/HLA發生率。在一些態樣中，該等MHC I類及/或II類抗原決定基中之每一者經預測或驗證為能夠由至少一個HLA對偶基因呈現，其中各抗原/HLA對在人類群體中具有至少0.1%之抗原/HLA發生率。在一些態樣中，相對於直接自個體組織或樣品中提取之天然核酸序列，對編碼該多肽之該至少一個有效負載核酸序列進行密碼子優化。
本文亦揭示一種醫藥組合物，其包含本文所述之任何載體及醫藥學上可接受之載劑。在一些態樣中，該組合物進一步包含佐劑。在一些態樣中，該組合物進一步包含免疫調節因子。在一些態樣中，該免疫調節因子為抗CTLA4抗體或其抗原結合片段、抗PD-1抗體或其抗原結合片段、抗PD-L1抗體或其抗原結合片段、抗4-1BB抗體或其抗原結合片段、或抗OX-40抗體或其抗原結合片段。
本文亦揭示一種分離之核苷酸序列，其包含本文所述之任何載體之卡匣及序列SEQ ID NO: 1之基因，視情況其中該基因選自由以下組成之群：以SEQ ID NO: 1所示之序列之黑猩猩腺病毒ITR、E1A、E1B、E2A、E2B、E3、E4、L1、L2、L3、L4及L5基因，且視情況其中該核苷酸序列為cDNA。
本文亦揭示一種分離之細胞，其包含本文所述之任何分離之核苷酸序列，視情況其中該細胞為CHO、HEK293或其變異體、911、HeLa、A549、LP-293、PER.C6或AE1-2a細胞。
亦揭示一種載體，其包含本文所述之任何分離之核苷酸序列。
本文亦揭示一種套組，其包含本文所述之任何載體或組合物及使用說明書。
本文亦揭示一種用於刺激個體之免疫反應之方法，該方法包括向該個體投與本文所述之任何載體或組合物。在一些態樣中，該載體或組合物係肌肉內(IM)、皮內(ID)或皮下(SC)投與。在一些態樣中，該方法進一步包括向該個體投與免疫調節因子，視情況其中該免疫調節因子係在投與該載體或該醫藥組合物之前、同時或之後投與。在一些態樣中，該免疫調節因子為抗CTLA4抗體或其抗原結合片段、抗PD-1抗體或其抗原結合片段、抗PD-L1抗體或其抗原結合片段、抗4-1BB抗體或其抗原結合片段、或抗OX-40抗體或其抗原結合片段。在一些態樣中，該免疫調節因子係靜脈內(IV)、肌肉內(IM)、皮內(ID)或皮下(SC)投與。在一些態樣中，該皮下投藥靠近該載體或該組合物投藥部位或非常接近於一或多個載體或組合物引流淋巴結。
在一些態樣中，該方法進一步包括向該個體投與第二疫苗組合物。在一些態樣中，該第二疫苗組合物係在投與本文所述之任何載體或組合物之前投與。在一些態樣中，該第二疫苗組合物係在投與本文所述之任何載體或組合物之後投與。在一些態樣中，該第二疫苗組合物與本文所述之任何載體或組合物相同。在一些態樣中，該第二疫苗組合物與本文所述之任何載體或組合物不同。在一些態樣中，該第二疫苗組合物包含編碼至少一個有效負載核酸序列之自擴增RNA (samRNA)載體。在一些態樣中，由該samRNA載體編碼之該至少一個有效負載核酸序列與如前述載體技術方案中任一者之至少一個有效負載核酸序列中的至少一者相同。
本文亦揭示一種製造如前述載體技術方案中任一者之載體的方法，該方法包括：獲得包含腺病毒載體或黑猩猩腺病毒載體之質體序列；將該質體序列轉染至一或多個宿主細胞中；及自該一或多個宿主細胞分離該載體。在一些態樣中，該分離包括：溶解該一或多種宿主細胞以獲得包含該載體之細胞溶解物；及自該細胞溶解物及視情況另外自用於培養該一或多種宿主細胞之培養基純化該載體。在一些態樣中，該質體序列係使用以下中之一者產生；在細菌細胞中的DNA重組或細菌重組或全基因組DNA合成或擴增合成之DNA的全基因組DNA合成。在一些態樣中，該一或多種宿主細胞為CHO、HEK293或其變異體、911、HeLa、A549、LP-293、PER.C6及AE1-2a細胞中之至少一者。在一些態樣中，自該細胞溶解物純化該載體涉及層析分離、離心、病毒沈澱及過濾中之一或多者。
本文亦提供一種產生病毒之方法，其中該病毒係使用本文所述之任何載體產生。在一些態樣中，相對於使用不具有部分缺失之E4基因之載體產生之病毒的產生，使用包含該部分缺失之E4基因之該載體增加該病毒之產生。在一些態樣中，相對於使用不具有部分缺失之E4基因之載體產生之病毒的感染單位力價，使用包含該部分缺失之E4基因之該載體增加該病毒之感染單位力價。在一些態樣中，該產生增加係相對於使用不具有該部分缺失之E4基因之載體的產生增加至少1.5倍、至少2倍、至少2.5倍、至少4倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍、至少8倍或至少9倍。在一些態樣中，該產生增加係相對於使用不具有該部分缺失之E4基因之載體的產生增加至少10倍、至少18倍、至少20倍、至少25倍或至少27倍。
相關申請之交叉參考
本申請案主張2019年5月30日申請之美國臨時申請案第62/854,865號之權益，該文獻出於所有目的特此以全文引用之方式併入。序列表
本申請案含有序列表，該序列表已以ASCII格式、以電子方式提交且以全文引用之方式併入本文中。該ASCII複本創建於2019年5月30日，命名為GSO_033PR_Sequence_Listing.txt且大小為422,136位元組。I. 定義
一般而言，申請專利範圍及本說明書中所用之術語意欲解釋為具有一般熟習此項技術者所理解之普通含義。為了更清楚，某些術語定義如下。在普通含義與所提供之定義之間存在矛盾之情況下，將使用所提供之定義。
如本文所用，術語「抗原」為誘發免疫反應之物質。抗原可為新抗原。抗原可為「共有抗原」，其為在特定群體，例如癌症患者或受感染個體之特定群體之間發現之抗原。抗原可與感染性疾病生物體相關或源自感染性疾病生物體。
如本文所用，術語「新抗原」為具有至少一個使其不同於相應野生型抗原之改變的抗原，例如經由腫瘤細胞中之突變或特異性針對腫瘤細胞之轉譯後修飾。新抗原可包括多肽序列或核酸序列。突變可包括讀框移位或非讀框移位插入缺失、誤義或無義取代、剪接位點改變、基因組重排或基因融合、或產生neoORF之任何基因組或表現改變。突變亦可包括剪接變異體。特異性針對腫瘤細胞之轉譯後修飾可包括異常磷酸化。特異性針對腫瘤細胞之轉譯後修飾亦可包括蛋白酶體產生之剪接抗原。參見Liepe 等人, A large fraction of HLA class I ligands are proteasome-generated spliced peptides; Science. 2016 年10月21日;354(6310):354-358。可經由使用各種診斷方法(例如下文進一步描述之患者選擇方法)鑑別個體以進行投藥。
如本文所使用，術語「腫瘤抗原」係存在於個體之腫瘤細胞或組織而非存在於個體之相應正常細胞或組織中，或源自已知或已發現與正常細胞或組織相比在腫瘤細胞或癌組織中具有改變之表現的多肽的抗原。
如本文所使用，術語「基於抗原之疫苗」係基於一或多種抗原(例如複數種抗原)之疫苗組合物。疫苗可為基於核苷酸(例如基於病毒、基於RNA或基於DNA)之疫苗、基於蛋白質(例如基於肽)之疫苗或其組合。
如本文所用，術語「候選抗原」為產生可代表抗原之序列的突變或其他畸變。
如本文所用，術語「編碼區」為編碼蛋白質之基因的部分。
如本文所用，術語「編碼突變」為在編碼區中出現之突變。
如本文所用，術語「ORF」意指開放閱讀框架。
如本文所用，術語「NEO-ORF」為由突變或其他畸變(諸如剪接)產生之腫瘤特異性ORF。
如本文所用，術語「誤義突變」為引起一個胺基酸至另一個胺基酸之取代的突變。
如本文所使用，術語「無義突變」係造成終止密碼子之胺基酸之取代或造成移除典型起始密碼子之突變。
如本文所用，術語「讀框移位突變」為引起蛋白質框架改變之突變。
如本文所用，術語「插入缺失」為一或多個核酸之插入或缺失。
如本文所用，在兩個或更多個核酸或多肽序列之上下文中，術語百分比「一致性」係指當出於最大對應性比較及比對時，兩個或更多個序列或子序列具有指定百分比之相同的核苷酸或胺基酸殘基，如使用下文所描述之序列比較演算法(例如BLASTP及BLASTN或技術人員可用之其他演算法)中之一者或藉由目視檢查所量測。視應用而定，「一致性」百分比可存在於所比較之序列區域上，例如在功能域上，或替代地，存在於有待比較之兩個序列的全長上。
關於序列比較，通常一個序列充當與測試序列比較之參考序列。使用序列比較算法時，將測試及參考序列輸入電腦，必要時指定子序列座標，且指定序列算法程式參數。接著，序列比較算法根據所指定之程式參數來計算測試序列相對於參考序列之序列一致性百分比。可替代地，序列相似性或不相似性可藉由組合存在或不存在特定核苷酸，或對於轉譯序列，在所選擇之序列位置(例如序列基元)處之胺基酸來建立。
比較序列之最佳比對可例如藉由以下進行： Smith 及Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482 (1981)之局部同源性算法；Needleman及Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443 (1970)之同源性比對算法；Pearson及Lipman, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 85:2444 (1988)之相似性搜尋方法；此等算法之電腦化實施方式(Wisconsin Genetics套裝軟體中的GAP、BESTFIT、FASTA及TFASTA，Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, Wis.)；或目視檢查(一般參見Ausubel等人，見下文)。
適合於測定序列一致性百分比及序列相似性之演算法的一個實例為BLAST演算法，其描述於Altschul等人, J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990)中。執行BLAST分析之軟體為可經由國家生物技術資訊中心(National Center for Biotechnology Information)公開獲得。
如本文所用，術語「無終止或通讀」為引起天然終止密碼子移除之突變。
如本文所用，術語「抗原決定基」為通常由抗體或T細胞受體結合之抗原的特異性部分。
如本文所用，術語「免疫原性」為例如經由T細胞、B細胞或兩者引發免疫反應之能力。
如本文所用，術語「HLA結合親和力」、「MHC結合親和力」意指特異性抗原與特異性MHC對偶基因之間結合的親和力。
如本文所用，術語「誘鉺」為用於自樣品富集DNA或RNA之特定序列的核酸探針。
如本文所用，術語「變異體」為個體之核酸與用作對照之參考人類基因組之間的差異。
如本文所用，術語「變異體識別」為通常根據定序之變異體存在的算法確定。
如本文所用，術語「多形現象」為生殖系變異體，亦即在個體之所有攜帶DNA的細胞中發現的變異體。
如本文所用，術語「體細胞變異體」為在個體之非生殖系細胞中產生之變異體。
如本文所用，術語「對偶基因」為基因之形式或基因序列之形式或蛋白質之形式。
如本文所用，術語「HLA型」為HLA基因對偶基因之補體。
如本文所用，術語「無義介導之衰變」或「NMD」為因過早終止密碼子所致的細胞對mRNA之降解。
如本文所用，術語「軀幹突變」為源自腫瘤發展早期且存在於大部分腫瘤細胞中之突變。
如本文所用，術語「亞純系突變」為源自腫瘤發展後期且僅存在於腫瘤細胞子集中之突變。
如本文所用，術語「外顯子組」為編碼蛋白質之基因組的子集。外顯子組可為基因組之集合外顯子。
如本文所用，術語「邏輯回歸」為來自統計之二進制資料的回歸模型，其中因變數等於1之機率的邏輯經模型化為因變數之線性函數。
如本文所用，術語「神經網路」為用於分類或回歸之機器學習模型，其由多層線性變換組成，接著為通常經由隨機梯度下降及反向傳播進行訓練之元素級非線性。
如本文所用，術語「蛋白質組」為由細胞、細胞群或個體表現及/或轉譯之全部蛋白質的集合。
如本文所用，術語「肽組」為由MHC-I或MHC-II在細胞表面上呈現之所有肽的集合。肽組可指細胞或細胞集合(例如腫瘤肽組，意味著構成腫瘤之所有細胞的肽組的聯合)之特性。
如本文所用，術語「ELISPOT」意指酶聯免疫吸附斑點分析，其為用於監測人類及動物中之免疫反應的常用方法。
如本文所用，術語「葡聚糖肽多聚體」為在流式細胞量測術中用於抗原特異性T細胞染色之基於葡聚糖的肽-MHC多聚體。
如本文所用，術語「耐受性或免疫耐受性」為對一或多種抗原(例如自身抗原)免疫無反應性的狀態。
如本文所用，術語「中心耐受性」為藉由缺失自身反應性T細胞純系或藉由促進自身反應性T細胞純系分化成免疫抑制性調控T細胞(Treg)而在胸腺中遭受的耐受性。
如本文所用，術語「外周耐受性」為藉由下調或不激活經受中心耐受性之自身反應性T細胞或促進此等T細胞分化成Treg而在外周遭受的耐受性。
術語「樣品」可包括藉由包括靜脈穿刺、排泄、射精、按摩、活組織檢查、針抽吸、灌洗樣品、刮取、手術切口或干預之手段或此項技術中已知的其他手段自個體獲取之單細胞或多細胞或細胞碎片或體液等分試樣。
術語「個體」涵蓋人類或非人類、無論活體內、離體或活體外、雄性或雌性的細胞、組織或生物體。術語個體包括涵蓋人類之哺乳動物。
術語「哺乳動物」涵蓋人類及非人類，且包括(但不限於)人類、非人類靈長類動物、犬科動物、貓科動物、鼠科動物、牛科動物、馬科動物及豬科動物。
術語「臨床因素」係指個體狀況之量度，例如疾病活動或嚴重程度。「臨床因素」涵蓋個體健康狀況之所有標記，包括非樣本標記，及/或個體之其他特徵，諸如(但不限於)年齡及性別。臨床因素可為可在確定條件下評估來自個體之樣品(或樣品群體)或個體而獲得的評分、值或值集合。臨床因素亦可藉由標記及/或其他參數(諸如基因表現代替物)來預測。臨床因素可包括腫瘤類型、腫瘤亞型及吸菸史。
術語「源自」係指直接自個體組織或樣品(例如，腫瘤細胞、受感染細胞或感染性疾病生物體)，例如經由RT-PCR提取之序列；或藉由對個體組織或樣品進行定序且隨後例如經由此項技術中已知之各種合成或基於PCR之方法，使用定序資料合成核酸序列而獲得之序列資料。「源自」可包括核酸序列變異體，諸如密碼子優化之核酸序列變異體，其編碼與相應之天然核酸序列(諸如相應之天然感染性疾病生物體核酸序列)相同之多肽序列。「源自」亦可包括編碼經修飾之多肽序列之變異體，諸如相對於天然多肽序列(諸如天然感染性疾病生物體多肽序列)具有一或多個(例如1、2、3、4或5個)突變之感染性疾病生物體多肽序列。舉例而言，相對於天然多肽序列，經修飾之多肽序列可具有一或多個錯義突變(例如，工程改造突變)。
術語「α病毒」係指披膜病毒科(Togaviridae)之成員，且為正義單股RNA病毒。α病毒通常分類為舊世界，諸如辛德畢斯(Sindbis)、羅斯河(Ross River)、馬雅羅(Mayaro)、基孔肯雅(Chikungunya)及塞姆利基森林病毒(Semliki Forest virus)，或新世界，諸如東部馬腦炎(eastern equine encephalitis)、奧拉(Aura)、摩根堡(Fort Morgan)、或委內瑞拉馬腦炎(Venezuelan equine encephalitis)及其衍生病毒株TC-83。α病毒通常為自我複製RNA病毒。
術語「α病毒主鏈」係指允許病毒基因組自我複製之α病毒的最小序列。最小序列可包括用於非結構蛋白質介導之擴增的保守序列、非結構蛋白質1 (nsP1)基因、nsP2基因、nsP3基因、nsP4基因及polyA序列，以及用於亞基因组病毒RNA表現之序列，包括26S啟動子元件。
術語「用於非結構蛋白質介導之擴增的序列」包括熟習此項技術者熟知的α病毒保守序列元件(CSE)。CSE包括(但不限於) α病毒5'UTR、51-nt CSE、24-nt CSE 或其他26S亞基因组啟動子序列、19-nt CSE及α病毒3' UTR。
術語「RNA聚合酶」包括催化由DNA模板產生RNA聚核苷酸之聚合酶。RNA聚合酶包括(但不限於)源自噬菌體之聚合酶，包括T3、T7及SP6。
術語「脂質」包括疏水性及/或兩親媒性分子。脂質可為陽離子、陰離子或中性的。脂質可為合成或天然來源的，且在一些情況下為可生物降解的。脂質可包括膽固醇、磷脂、脂質結合物，包括(但不限於)聚乙二醇(PEG)結合物(聚乙二醇化脂質)、蠟、油、甘油酯、脂肪及脂溶性維生素。脂質亦可包括二亞油基甲基-4-二甲基胺基丁酸酯(MC3)及MC3樣分子。
術語「脂質奈米粒子」或「LNP」包括使用含脂質膜圍繞水性內部形成之小泡樣結構，亦稱為脂質體。脂質奈米粒子包括具有藉由界面活性劑穩定之固體脂質核心的基於脂質之組合物。核心脂質可為脂肪酸、醯基甘油、蠟及此等界面活性劑之混合物。生物膜脂質，諸如磷脂、鞘磷脂、膽汁鹽(牛磺膽酸鈉)及固醇(膽固醇)，可用作穩定劑。脂質奈米粒子可使用限定比率之不同脂質分子形成，包括(但不限於)限定比率之一或多種陽離子脂質、陰離子脂質或中性脂質。脂質奈米粒子可將分子囊封在外膜殼內，且隨後可與靶細胞接觸以將囊封之分子遞送至宿主細胞細胞溶質。脂質奈米粒子可用非脂質分子修飾或官能化，包括在其表面上。脂質奈米粒子可為單層或多層。脂質奈米粒子可與核酸複合。單層脂質奈米粒子可與核酸複合，其中核酸在水性內部。多層脂質奈米粒子可與核酸複合，其中核酸在水性內部，或形成或包夾在之間。
縮寫：MHC：主要組織相容複合體；HLA：人類白細胞抗原或人類MHC基因座；NGS：下一代定序；PPV：陽性預測值；TSNA：腫瘤特異性新抗原；FFPE：福馬林固定、石蠟包埋；NMD：無義介導之衰變；NSCLC：非小細胞肺癌；DC：樹突狀細胞。
應注意，除非上下文另外明確規定，否則如本說明書及隨附申請專利範圍中所用，單數形式「一(a/an)」及「該」包括複數個指示物。
除非上下文特別陳述或以其他方式顯而易見，否則如本文中所使用，術語「約」應理解為在此項技術中之正常容限之範圍內，例如在平均值之2個標準差內。約可理解為在陳述值之10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%、0.5%、0.1%、0.05%或0.01%內。除非上下文另有明確說明，否則本文所提供之所有數值均藉由術語約修飾。
本文中未直接定義之任何術語應理解為具有與本發明之技術領域中所理解通常相關的含義。本文論述某些術語，以向從業者描述本發明之態樣的組合物、裝置、方法及其類似物以及如何製造或使用其提供額外的指導。應瞭解，相同事物可以多於一種方式來表達。因此，替代性措辭及同義詞可用於本文所論述之術語中之任何一或多者。重要性將不在於術語是否在本文中詳述或論述。提供一些同義詞或可取代方法、材料及其類似物。除非明確陳述，否則對一個或數個同義詞或等效物的敍述不排除使用其他同義詞或等效物。包括術語實例在內之實例的使用僅用於說明性目的，且不在本文中限制本發明之態樣的範疇及含義。
出於所有目的，在本說明書正文內引用之所有參考文獻、頒佈專利及專利申請案均以全文引用之方式併入本文中。II. 鑑別抗原之方法
用於鑑別抗原(例如源自腫瘤或感染性疾病生物體之抗原)之方法包括鑑別可能呈現在細胞表面上(例如，藉由MHC呈現在腫瘤細胞、受感染細胞或免疫細胞(包括專職抗原呈現細胞，諸如樹突狀細胞)上)，及/或可能具免疫原性的抗原。作為一實例，一個此類方法可包括以下步驟：自腫瘤、受感染細胞或感染性疾病生物體獲得以下中之至少一者：外顯子組、轉錄組或全基因組核苷酸定序及/或表現資料，其中該核苷酸定序資料及/或表現資料用於獲得表示抗原(例如源自腫瘤或感染性疾病生物體之抗原)集合中之每一者之肽序列的資料；將各抗原之肽序列輸入一或多個呈現模型以產生抗原中之每一者由一或多個MHC對偶基因呈現在個體之細胞表面、諸如腫瘤細胞或受感染細胞上的數值可能性集合，該數值可能性集合已至少基於接受之質譜資料鑑別；以及基於該數值可能性集合選擇抗原集合之子集以產生經選擇抗原之集合。
在關於腫瘤疫苗且可改適為感染性疾病疫苗之一個實例中，呈現模型可包含在參考資料集合(亦稱為訓練資料集)上訓練的統計回歸或機器學習(例如深度學習)模型，該參考資料集合包含相應標記集合，其中該參考資料集合獲自複數個不同個體中之每一者，其中視情況一些個體可具有腫瘤，且其中該參考資料集合包含以下中之至少一者：代表來自腫瘤組織之外顯子組核酸序列的資料、代表來自正常組織之外顯子組核酸序列的資料、代表來自腫瘤組織之轉錄組核酸序列的資料、代表來自腫瘤組織之蛋白質組序列的資料、代表來自腫瘤組織之MHC肽組序列的資料以及代表來自正常組織之MHC肽組序列的資料。參考資料可另外包含經工程改造以表現隨後暴露於合成蛋白質之預定MHC對偶基因的單對偶基因細胞株、正常及腫瘤人類細胞株、以及新鮮及冷凍原始樣品的質譜資料、定序資料、RNA定序資料、表現譜資料及蛋白質組學資料，及T細胞分析(例如ELISPOT)。在某些態樣中，該參考資料集合包括每種形式之參考資料。
呈現模型可包含至少部分自該參考資料集合導出的特徵集合，且其中該特徵集合包含對偶基因依賴性特徵及對偶基因非依賴性特徵中之至少一者。在某些態樣中，包括每一特徵。
用於鑑別抗原之方法亦包括藉由鑑別可能呈現在個體之細胞(諸如腫瘤細胞或受感染細胞)之表面上的一或多種抗原產生用於構建個人化疫苗之輸出。作為關於腫瘤疫苗且可改適為感染性疾病疫苗之一實例，一個此類方法可包括以下步驟：自個體之腫瘤細胞及正常細胞獲得外顯子組、轉錄組或全基因組核苷酸定序及/或表現資料中之至少一者，其中該核苷酸定序及/或表現資料用於獲得代表藉由比較來自腫瘤細胞之核苷酸定序及/或表現資料與來自正常細胞之核苷酸定序及/或表現資料鑑別之抗原集合中之每一者的肽序列(例如就新抗原而言，其中各新抗原之肽序列包含至少一個使其不同於相應野生型肽序列之改變或就無突變之抗原而言，其中肽源自已知或已發現與正常細胞或組織相比在腫瘤細胞或癌組織中具有改變表現之任何多肽)，自個體之正常細胞鑑別之肽序列之資料；將抗原中之每一者之肽序列編碼於相應數值載體中，各數值載體包括關於構成肽序列之複數種胺基酸以及肽序列中胺基酸之位置集合之資訊；使用電腦處理器將數值載體輸入深度學習呈現模型以產生抗原集合之呈現可能性的集合，集合中之各呈現可能性代表相應抗原由一或多個II類MHC對偶基因呈現於個體之腫瘤細胞之表面上的可能性，深度學習呈現模型；基於呈現可能性之集合選擇抗原之集合的子集以產生選擇抗原之集合；以及基於所選擇抗原之集合產生用於構建個人化癌症疫苗之輸出。
用於鑑別抗原(包括新抗原)之具體方法為熟習此項技術者已知，例如國際專利申請公開案WO/2017/106638、WO/2018/195357及WO/2018/208856中更詳細描述之方法，該等公開案出於所有目的各自以全文引用的方式併入本文中。
本文中揭示一種治療患有腫瘤之個體之方法，其包含進行本文所述之抗原鑑別方法中之任一者的步驟，且進一步包含獲得包含選擇抗原集合之腫瘤疫苗，及向該個體投與腫瘤疫苗。
本文揭示之方法亦可包括鑑別對子集中之抗原中之至少一者具有抗原特異性的一或多種T細胞。在一些實施例中，鑑別包含在擴增一或多種抗原特異性T細胞之條件下使一或多種T細胞與子集中之一或多種抗原共同培養。在其他實施例中，鑑別包含使一或多種T細胞與包含子集中之一或多種抗原之四聚體在允許T細胞與四聚體之間結合的條件下接觸。在甚至其他實施例中，本文所揭示之方法亦可包括鑑別一或多種經鑑別T細胞之一或多種T細胞受體(TCR)。在某些實施例中，鑑別一或多種T細胞受體包含定序一或多種經鑑別T細胞之T細胞受體序列。本文所揭示之方法可進一步包含基因工程改造複數個T細胞以表現一或多種經鑑別T細胞受體中之至少一者；在擴增該複數個T細胞之條件下培養該複數個T細胞；以及將擴增T細胞浸漬於個體中。在一些實施例中，基因工程改造複數個T細胞以表現一或多種經鑑別T細胞受體中之至少一者包含將一或多種經鑑別T細胞之T細胞受體序列選殖於表現載體中；以及用表現載體轉染該複數個T細胞中之每一者。在一些實施例中，本文所揭示之方法進一步包含在擴增一或多種經鑑別T細胞之條件下培養一或多種經鑑別T細胞；以及將擴增T細胞輸注於個體中。
本文亦揭示一種經分離T細胞，其對子集中之至少一種選擇抗原具有抗原特異性。
本文亦揭示一種用於製造腫瘤疫苗之方法，其包括以下步驟：自個體之腫瘤細胞獲得以下中之至少一者：外顯子組、轉錄組或全基因組腫瘤核苷酸定序及/或表現資料，其中該腫瘤核苷酸定序及/或表現資料用於獲得表示抗原集合中之每一者之肽序列的資料(例如就新抗原而言，其中各新抗原之肽序列包含至少一個使其不同於相應野生型肽序列之改變或就無突變之抗原而言，其中肽源自已知或已發現與正常細胞或組織相比在腫瘤細胞或癌組織中具有改變表現之任何多肽)；將各抗原之肽序列輸入一或多個呈現模型以產生抗原中之每一者由一或多個MHC對偶基因呈現在個體之腫瘤細胞之腫瘤細胞表面上的數值可能性集合，該數值可能性集合已至少基於接受之質譜資料鑑別；以及基於數值可能性集合選擇抗原集合之子集以產生經選擇抗原之集合；以及製備或已製備包含選擇抗原之集合的腫瘤疫苗。
本文亦揭示一種腫瘤疫苗，其包括藉由進行包括以下步驟之方法選擇之經選擇抗原的集合：自個體之腫瘤細胞獲得以下中之至少一者：外顯子組、轉錄組或全基因組腫瘤核苷酸定序及/或表現資料，其中該腫瘤核苷酸定序及/或表現資料用於獲得表示抗原集合中之每一者之肽序列的資料，且其中各抗原之肽序列(例如就新抗原而言，其中各新抗原之肽序列包含至少一個使其不同於相應野生型肽序列之改變或就無突變之抗原而言，其中肽源自已知或已發現與正常細胞或組織相比在腫瘤細胞或癌組織中具有改變表現之任何多肽)；將各抗原之肽序列輸入一或多個呈現模型以產生抗原中之每一者由一或多個MHC對偶基因呈現在個體之腫瘤細胞之腫瘤細胞表面上的數值可能性集合，該數值可能性集合已至少基於接受之質譜資料鑑別；以及基於數值可能性集合選擇抗原集合之子集以產生經選擇抗原之集合；以及製備或已製備包含選擇抗原之集合的腫瘤疫苗。
腫瘤疫苗可包括核酸序列、多肽序列、RNA、DNA、細胞、質體或載體中之一或多者。
腫瘤疫苗可包括在腫瘤細胞表面上呈現之一或多個抗原。
腫瘤疫苗可包括在個體中具有免疫原性之一或多個抗原。
腫瘤疫苗可不包括在個體中誘發針對正常組織之自體免疫反應的一或多個抗原。
腫瘤疫苗可包括佐劑。
腫瘤疫苗可包括賦形劑。
本文所揭示之方法亦可包括基於呈現模型選擇相對於未選擇之抗原在腫瘤細胞表面上呈現之可能性增加的抗原。
本文揭示之方法亦可包括選擇基於呈現模型相對於未選擇之抗原，能夠誘發個體中之腫瘤特異性免疫反應之可能性增加的抗原。
本文揭示之方法亦可包括基於呈現模型選擇相對於未選擇之抗原，能夠由專職抗原呈現細胞(APC)呈現給初始T細胞之可能性增加的抗原，視情況其中該APC係樹突狀細胞(DC)。
本文揭示之方法亦可包括基於呈現模型，選擇相對於未選擇之抗原經由中心或外周耐受性受抑制之可能性降低的新抗原。
本文揭示之方法亦可包括基於呈現模型選擇相對於未選擇之抗原，能夠誘發對個體中之正常組織之自身免疫反應的可能性降低之抗原。
外顯子組或轉錄組核苷酸定序及/或表現資料可藉由對腫瘤組織進行定序而獲得。
定序可為下一代定序(NGS)或任何大規模平行定序方法。
數值可能性集合可藉由至少MHC-對偶基因相互作用特徵來進一步鑑別，該等特徵包含以下中之至少一者：經預測之MHC對偶基因與抗原編碼肽結合之親和力；經預測之抗原編碼肽-MHC複合物之穩定性；抗原編碼肽之序列及長度；如藉由質譜蛋白質組學或其他手段所評定，在來自表現特定MHC對偶基因之其他個體的細胞中呈現具有類似序列之抗原編碼肽的機率；所討論之個體中特定MHC對偶基因之表現量(例如，如藉由RNA-Seq或質譜法所量測)；在表現特定MHC對偶基因之其他不同個體中由特定MHC對偶基因呈現之總體新抗原編碼肽序列獨立性機率；在其他不同個體中由同一家族分子(例如HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DQ、HLA-DR、HLA-DP)中之MHC對偶基因呈現之總體新抗原編碼肽序列獨立性機率。
數值可能性集合進一步藉由至少MHC對偶基因非相互作用特徵來鑑別，該等特徵包含以下中之至少一者：側接其源蛋白質序列內之新抗原編碼肽的C端及N端序列；在新抗原編碼肽中存在蛋白酶裂解基元，視情況根據腫瘤細胞中相應蛋白酶之表現權衡(如藉由RNA-seq或質譜分析所量測)；如在合適細胞類型中量測之源蛋白質之周轉率；源蛋白質之長度，視情況考慮在腫瘤細胞中表現最高之特異性剪接變異體(「同種型」)，如藉由RNA-seq或蛋白質組質譜分析所量測，或如根據在DNA或RNA序列資料中偵測之生殖系或體細胞剪接突變之註解預測；蛋白酶體、免疫蛋白酶體、胸腺蛋白酶體或其他蛋白酶在腫瘤細胞中之表現量(其可藉由RNA-seq、蛋白質組質譜分析或免疫組織化學量測)；新抗原編碼肽之源基因之表現(例如如藉由RNA-seq或質譜分析所量測)；在細胞週期之各階段期間新抗原編碼肽之源基因之典型的組織特異性表現；源蛋白質及/或其結構域之特徵之綜合目錄，如在例如uniProt或PDB http://www.rcsb.org/pdb/home/home.do中可見；描述含有肽之源蛋白質之結構域特性的特徵，例如：第二或第三結構(例如α螺旋相對於β摺疊)；選擇性剪接；在其他不同個體中自相關新抗原編碼肽之源蛋白質呈現肽之機率；由於技術偏差質譜分析將不會偵測或過度表示肽之機率；各種基因模組/路徑之表現，其提供關於腫瘤細胞、基質或腫瘤浸潤性淋巴球(TIL)之狀態的資訊，如藉由RNASeq所量測(其不必含有肽之源蛋白質)；腫瘤細胞中新抗原編碼肽之源基因之複本數；肽與TAP結合之機率或所量測或所預測之肽對TAP 之結合親和力；腫瘤細胞中TAP之表現量(其可藉由RNA-seq、蛋白質組質譜分析、免疫組織化學量測)；存在或不存在腫瘤突變，包括但不限於：已知癌症驅動基因(諸如EGFR、KRAS、ALK、RET、ROS1、TP53、CDKN2A、CDKN2B、NTRK1、NTRK2、NTRK3)，及編碼參與抗原呈現機制之蛋白質的基因(例如B2M、HLAA、HLA-B、HLA-C、TAP-1、TAP-2、TAPBP、CALR、CNX、ERP57、HLA-DM、HLA-DMA、HLA-DMB、HLA-DO、HLA-DOA、HLA-DOB、HLA-DP、HLA-DPA1、HLA-DPB1、HLA-DQ、HLADQA1、HLA-DQA2、HLA-DQB1、HLA-DQB2、HLA-DR、HLADRA、HLA-DRB1、HLA-DRB3、HLA-DRB4、HLA-DRB5或編碼蛋白酶體或免疫蛋白酶體之組分之基因中的任一者)中之驅動突變。呈現依賴於腫瘤中經受功能喪失性突變之抗原呈遞機制之組分的肽具有降低的呈遞機率；存在或不存在功能性生殖系多形現象，包括(但不限於)：在編碼抗原呈遞機制中所涉及之蛋白質的基因(例如B2M、HLA-A、HLA-B、HLA-C、TAP-1、TAP-2、TAPBP、CALR、CNX、ERP57、HLA-DM、HLA-DMA、HLA-DMB、HLA-DO、HLA-DOA、HLA-DOB、HLADP、HLA-DPA1、HLA-DPB1、HLA-DQ、HLA-DQA1、HLA-DQA2、HLA-DQB1、HLA-DQB2、HLA-DR、HLA-DRA、HLA-DRB1、HLADRB3、HLA-DRB4、HLA-DRB5或編碼蛋白酶體或免疫蛋白酶體組分之基因中之任一者)中；腫瘤類型(例如NSCLC、黑素瘤)；臨床腫瘤亞型(例如鱗狀肺癌與非鱗狀)；吸菸史；該肽之源基因在相關腫瘤類型或臨床亞型中之典型表現，視情況藉由驅動子突變分層。
至少一個改變可為讀框移位或非讀框移位插入缺失、誤義或無義取代、剪接位點改變、基因組重排或基因融合、或產生neoORF之任何基因組或表現改變。
腫瘤細胞可選自由以下組成之群：肺癌、黑素瘤、乳癌、卵巢癌、前列腺癌、腎癌、胃癌、結腸癌、睪丸癌、頭頸癌、胰臟癌、腦癌、B細胞淋巴瘤、急性骨髓性白血病、慢性骨髓性白血病、慢性淋巴球性白血病、T細胞淋巴球性白血病、非小細胞肺癌及小細胞肺癌。
本文所揭示之方法亦可包括獲得包含所選擇之新抗原集合或其子集的腫瘤疫苗，視情況另外包含向個體投與該腫瘤疫苗。
經選擇新抗原之集合中之新抗原中的至少一者在呈多肽形式時可包括以下中之至少一者：IC50值小於1000 nM之與MHC的結合親和力，對於MHC I類多肽，長度為8-15、8、9、10、11、12、13、14或15個胺基酸，對於MHC II類多肽，長度為6-30、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30個胺基酸，在親本蛋白質序列中之多肽內或多肽附近存在促進蛋白酶體裂解之序列基元，及存在促進TAP傳輸之序列基元。對於MHC II類，存在位於肽內或肽附近藉由胞外或溶酶體蛋白酶(例如組織蛋白酶)或HLA-DM催化之HLA結合促進裂解之序列基元。
本文揭示用於鑑別可能在腫瘤細胞之腫瘤細胞表面上呈現之一或多個新抗原的方法，其包含執行以下步驟：接收包含與自源自複數個新鮮或冷凍腫瘤樣品之主要組織相容複合體(MHC)溶離的複數個經分離之肽相關之資料的質譜資料；藉由至少鑑別腫瘤樣品中存在且呈現在與各訓練肽序列相關之一或多個MHC對偶基因上的訓練肽序列集合來獲得訓練資料集；基於訓練肽序列獲得訓練蛋白質序列集合；及使用訓練蛋白質序列及訓練肽序列訓練呈現模型之數值參數集合，呈現模型提供來自腫瘤細胞之肽序列在腫瘤細胞表面上由一或多個MHC對偶基因呈現之複數個數值可能性。
呈現模型可表示以下兩者之間的依賴性：MHC對偶基因中之一對特定對偶基因及在肽序列之特定位置處之特定胺基酸的存在；與在腫瘤細胞表面上由該對MHC對偶基因中之一特定對偶基因呈現在特定位置處包含特定胺基酸之此類肽序列的可能性。
本文所揭示之方法亦可包括選擇新抗原之子集，其中新抗原之子集係因為相對於一或多個不同腫瘤新抗原各自在腫瘤細胞表面上呈現之可能性增加而被選擇。
本文所揭示之方法亦可包括選擇新抗原之子集，其中新抗原之子集係因為相對於一或多個不同腫瘤新抗原各自能夠在個體中誘發腫瘤特異性免疫反應之可能性增加而被選擇。
本文所揭示之方法亦可包括選擇新抗原之子集，其中新抗原之子集係因為相對於一或多個不同腫瘤新抗原各自能夠由專職抗原呈現細胞(APC)呈現於初始T細胞之可能性增加而被選擇，視情況其中該APC為樹突狀細胞(DC)。
本文所揭示之方法亦可包括選擇新抗原之子集，其中新抗原之子集係因為相對於一或多個不同腫瘤新抗原各自經由中心或外周耐受性受抑制之可能性降低而被選擇。
本文所揭示之方法亦可包括選擇新抗原之子集，其中新抗原之子集係因為相對於一或多個不同腫瘤新抗原各自能夠在個體中誘發針對正常組織之自體免疫反應之可能性降低而被選擇。
本文所揭示之方法亦可包括選擇新抗原之子集，其中新抗原之子集係因為相對於APC各自將在腫瘤細胞中經差異性轉譯後修飾之可能性降低而被選擇，視情況其中該APC為樹突狀細胞(DC)。
除非另外指明，否則本文方法之實踐將採用此項技術之技能範圍內的蛋白質化學、生物化學、重組DNA技術及藥理學之習知方法。在文獻中完全解釋此類技術。參見例如T.E. Creighton,Proteins: Structures and Molecular Properties (W.H. Freeman and Company, 1993)；A.L. Lehninger,Biochemistry (Worth Publishers, Inc.，現行版)；Sambrook等人,Molecular Cloning: A Laboratory Manual (第2版, 1989)；Methods In Enzymology (S. Colowick及N. Kaplan編, Academic Press, Inc.)；Remington's Pharmaceutical Sciences , 第18 版(Easton, Pennsylvania: Mack Publishing Company, 1990)；Carey 及SundbergAdvanced Organic Chemistry 第3 版. (Plenum Press)第A 卷及第B 卷(1992)。III. 鑑別新抗原中之腫瘤特異性突變
本文亦揭示用於鑑別某些突變(例如存在於癌細胞中之變異體或對偶基因)的方法。具體言之，此等突變可存在於患有癌症之個體之癌細胞的基因組、轉錄組、蛋白質組或外顯子組中，而非個體之正常組織中。用於鑑別對腫瘤具有特異性之新抗原(包括共有新抗原)之具體方法為熟習此項技術者已知，例如美國專利第10,055,540號、美國申請公開案第US20200010849A1號以及國際專利申請公開案WO/2018/195357及WO/2018/208856中更詳細地描述之方法，該等文獻出於所有目的各自以全文引用的方式併入本文中。
若腫瘤中之基因突變引起腫瘤中特有之蛋白質的胺基酸序列變化，則認為其可用於免疫靶向腫瘤。有用的突變包括：(1)非同義突變，導致蛋白質中之胺基酸不同；(2)通讀突變，其中終止密碼子經修飾或缺失，導致轉譯在C端具有新穎腫瘤特異性序列之較長蛋白質；(3)剪接位點突變，導致在成熟mRNA中包含內含子且因此導致特有的腫瘤特異性蛋白質序列；(4)染色體重排，在2種蛋白質之接合處產生具有腫瘤特異性序列之嵌合蛋白質(亦即基因融合)；(5)讀框移位突變或缺失，導致具有新穎腫瘤特異性蛋白質序列之新的開放閱讀框架。突變亦可包括非讀框移位插入缺失、誤義或無義取代、剪接位點改變、基因組重排或基因融合、或產生neoORF之任何基因組或表現改變中之一或多者。
由例如腫瘤細胞中之剪接位點、讀框移位、通讀或基因融合突變產生之具有突變之肽或突變多肽可藉由對腫瘤與正常細胞中之DNA、RNA或蛋白質進行定序來鑑別。
突變亦可包括先前鑑別之腫瘤特異性突變。已知腫瘤突變可見於癌症體細胞突變目錄(COSMIC)資料庫。
多種方法可用於偵測個體之DNA或RNA中特定突變或對偶基因的存在。本領域中之進步已提供精確、容易且便宜的大規模SNP基因分型。舉例而言，已描述數種技術，包括動態對偶基因特異性雜交(DASH)、微量盤陣列對角線凝膠電泳(MADGE)、焦磷酸定序、寡核苷酸特異性連接、TaqMan系統以及各種DNA「晶片」技術，諸如Affymetrix SNP晶片。此等方法利用通常藉由PCR擴增靶基因區。仍有其他方法，基於藉由侵入性裂解產生小信號分子，隨後進行質譜法或固定化掛鎖探針及滾環擴增。下文彙總此項技術中已知用於偵測特異性突變之數種方法。
基於PCR之偵測手段可包括同時多重擴增複數個標記。舉例而言，選擇PCR引子以產生大小不重疊且可同時分析之PCR產物為此項技術中所熟知的。可替代地，可用經差異性標記且因此可各自經差異性偵測之引子擴增不同的標記。當然，基於雜交之偵測手段允許樣品中多個PCR產物之差異偵測。此項技術中已其他技術以允許複數個標記之多重分析。
已開發數種方法以便於基因組DNA或細胞RNA中單核苷酸多形現象之分析。舉例而言，單鹼基多形現象可藉由使用特殊化核酸外切酶抗性核苷酸來偵測，如例如Mundy, C. R. (美國專利第4,656,127號)中所揭示。根據該方法，允許與緊靠著多形位點3'之對偶基因序列互補的引子與獲自特定動物或人類之靶分子雜交。若靶分子上之多形位點含有與所存在之特定核酸外切酶抗性核苷酸衍生物互補的核苷酸，則該衍生物將併入於雜交引子之末端上。此類併入使得引子對核酸外切酶具有抗性，從而允許其偵測。由於樣品之核酸外切酶抗性衍生物的身分為已知的，故引子已對核酸外切酶具有抗性之發現揭露靶分子之多形位點中存在之核苷酸與反應中所用之核苷酸衍生物互補。此方法之優勢在於其不需要判定大量無關序列資料。
可使用基於溶液之方法確定多形位點之核苷酸的身分。Cohen, D.等人(法國專利2,650,840；PCT申請案第WO91/02087號)。如在美國專利第4,656,127號之Mundy方法中，採用與緊靠著多形位點3'之對偶基因序列互補的引子。該方法使用經標記之雙去氧核苷酸衍生物確定該位點之核苷酸的身分，若該核苷酸與多形位點之核苷酸互補，則將併入於引子之末端上。
稱為遺傳位元分析或GBA之替代方法由Goelet, P. 等人(PCT申請案第92/15712號)描述。Goelet, P.等人之方法使用經標記之終止子及與多形位點3'序列互補之引子的混合物。所併入的經標記之終止子因此藉由所評估之靶分子之多形位點中存在的核苷酸確定且與其互補。與Cohen等人(法國專利2,650,840；PCT申請案第WO91/02087號)之方法相比，Goelet, P.等人之方法可為非均相分析，其中引子或靶分子固定於固相。
已描述數種用於分析DNA中多形位點之引子引導的核苷酸併入程序(Komher, J. S.等人, Nucl. Acids. Res. 17:7779-7784 (1989)；Sokolov, B. P., Nucl. Acids Res. 18:3671 (1990)；Syvanen, A.-C.等人, Genomics 8:684-692 (1990)；Kuppuswamy, M. N. 等人, Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 88:1143-1147 (1991)；Prezant, T. R. 等人, Hum. Mutat. 1:159-164 (1992)；Ugozzoli , L.等人, GATA 9:107-112 (1992)；Nyren, P.等人, Anal. Biochem. 208:171-175 (1993))。此等方法與GBA的不同的處在於其利用併入經標記之去氧核苷酸來區分多形位點處的鹼基。在此類格式中，由於信號與併入之去氧核苷酸之數目成比例，故在同一核苷酸之操作中發生的多形現象可產生與操作之長度成比例的信號(Syvanen, A.-C.等人, Amer. J. Hum. Genet. 52:46-59 (1993))。
許多方案直接自數百萬個單獨的DNA或RNA分子中並行獲取序列資訊。即時單分子合成定序技術依賴於螢光核苷酸之偵測，因為其併入至與正定序之模板互補的DNA的新生股中。在一種方法中，將長度為30-50個鹼基之寡核苷酸在5'端共價錨定於玻璃蓋玻片上。此等錨定股執行兩種功能。首先，若模板經組態具有與表面結合之寡核苷酸互補的捕捉尾部，則其充當靶模板股之捕捉位點。其亦充當模板引導之引子延伸的引子，形成序列閱讀的基礎。捕捉引子充當固定位點以便使用多個合成、偵測及化學裂解染料連接子以移除染料之循環進行序列測定。各循環由添加聚合酶/經標記之核苷酸混合物、沖洗、成像及染料之裂解組成。在一替代方法中，聚合酶經螢光供體分子修飾且固定在載玻片上，而各核苷酸用連接至γ-磷酸之受體螢光部分進行顏色編碼。系統偵測經螢光標記之聚合酶與經螢光修飾之核苷酸之間的相互作用，因為核苷酸併入至從頭鏈中。亦存在其他合成定序技術。
可使用任何適合之合成定序平台鑑別突變。如上所述，目前可用四種主要合成定序平台：來自Roche/454 Life Sciences之基因組定序儀、來自Illumina/Solexa之1G分析儀、來自Applied BioSystems之SOLiD系統及來自Helicos Biosciences之Heliscope系統。合成定序平台亦已由Pacific BioSciences及VisiGen Biotechnologies描述。在一些實施例中，將所定序之複數個核酸分子結合於支撐物(例如固體支撐物)。為將核酸固定於支撐物上，可在模板之3'及/或5'端添加捕捉序列/通用引發位點。核酸可藉由將捕捉序列與共價連接於支撐物之互補序列雜交而結合於支撐物。捕捉序列(亦稱為通用捕捉序列)為與連接至支撐物之序列互補的核酸序列，其可雙重充當通用引子。
作為捕捉序列之替代方案，偶合對(諸如抗體/抗原、受體/配體或如例如美國專利申請案第2006/0252077號中所述之抗生物素蛋白-生物素對)之一成員可連接於各片段，以捕捉在用該偶合對之相應第二成員塗佈的表面上。
在捕捉後，可例如藉由單分子偵測/定序來分析序列，例如，如實例及美國專利第7,283,337 號中所述，包括模板依賴性合成定序。在合成定序中，表面結合之分子在聚合酶存在下暴露於複數個經標記之核苷酸三磷酸。模板之序列藉由併入至生長鏈之3'端的經標記之核苷酸的順序來測定。此可即時進行或可以分步重複模式進行。對於即時分析，可將不同的光學標記併入各核苷酸且可利用多個雷射刺激併入的核苷酸。
定序亦可包括其他大規模平行定序或下一代定序(NGS)技術及平台。大規模平行定序技術及平台之額外實例為Illumina HiSeq或MiSeq、Thermo PGM或Proton、Pac Bio RS II或Sequel、Qiagen之Gene Reader及Oxford Nanopore MinION。可使用其他類似的當前大規模平行定序技術，以及此等技術之後代。
可利用任何細胞類型或組織來獲得用於本文所述之方法的核酸樣品。舉例而言，DNA或RNA樣品可獲自腫瘤或體液，例如藉由已知技術(例如靜脈穿刺)獲得之血液或唾液。可替代地，可對乾燥樣品(例如頭髮或皮膚)執行核酸測試。另外，可自腫瘤獲得樣品用於定序且可自正常組織獲得另一樣品用於定序，其中正常組織具有與腫瘤相同的組織類型。可自腫瘤獲得樣品用於定序且可自正常組織獲得另一樣品用於定序，其中正常組織相對於腫瘤具有不同的組織類型。
腫瘤可包括肺癌、黑素瘤、乳癌、卵巢癌、前列腺癌、腎癌、胃癌、結腸癌、睪丸癌、頭頸癌、胰臟癌、腦癌、B細胞淋巴瘤、急性骨髓性白血病、慢性骨髓性白血病、慢性淋巴球性白血病、T細胞淋巴球性白血病、非小細胞肺癌及小細胞肺癌中之一或多者。
可替代地，可使用蛋白質質譜法鑑別或驗證與腫瘤細胞上之MHC蛋白質結合之突變肽的存在。肽可自腫瘤細胞或自腫瘤免疫沈澱之HLA分子酸溶離，且隨後使用質譜法鑑別。IV. 抗原
抗原可包括核苷酸或多肽。舉例而言，抗原可為編碼多肽序列之RNA序列。可用於疫苗中之抗原可因此包括核酸序列或多肽序列。
本文揭示包含藉由本文所揭示之方法鑑別的腫瘤特異性突變的經分離之肽、包含已知腫瘤特異性突變之肽及藉由本文所揭示之方法鑑別的突變多肽或其片段。新抗原肽可描述於其編碼序列之上下文中，其中新抗原包括編碼相關多肽序列之核酸序列(例如DNA或RNA)。
本文亦揭示肽，其源自已知或已發現與正常細胞或組織相比在腫瘤細胞或癌組織中具有改變之表現的任何多肽，例如已知或已發現與正常細胞或組織相比在腫瘤細胞或癌組織中異常表現之任何多肽。可例如在COSMIC資料庫中發現可獲得抗原肽之適合之多肽。COSMIC策劃關於人類癌症體細胞突變之綜合資訊。該肽含有腫瘤特異性突變。
本文所述之經修飾之腺病毒載體及其他構築體可用於遞送來自任何生物體之抗原，包括其毒素或其他副產物，以預防及/或治療與該生物體或其副產物相關之感染或其他不良反應。
可併入疫苗中(例如在卡匣中編碼)之抗原包括免疫原，其可用於使人類或非人類動物針對病毒，諸如感染人類及非人類脊椎動物之病原性病毒免疫。抗原可選自多種病毒家族。期望針對其之免疫反應之理想病毒家族的實例包括小核糖核酸病毒家族，包括鼻病毒屬，其引起約50%之普通感冒病例；腸病毒屬，包括脊髓灰質炎病毒、柯薩奇病毒(coxsackievirus)、埃可病毒及人類腸病毒，諸如A型肝炎病毒；及口蹄疫病毒屬，其主要在非人類動物中引起口蹄疫。在小核糖核酸病毒家族之病毒中，靶抗原包括VP1、VP2、VP3、VP4及VPG。另一病毒家族包括杯狀病毒家族，其涵蓋諾沃克(Norwalk)病毒群，其為流行性胃腸炎之重要病原體。用於靶向抗原以誘發人類及非人類動物中之免疫反應的另一理想病毒家族為披蓋病毒(togavirus)家族，其包括α病毒屬，包括辛德畢斯病毒、羅斯河病毒及委內瑞拉東部及西部馬腦炎病毒；及風疹病毒屬(rubivirus)，包括風疹病毒。黃病毒科包括登革熱、黃熱病、日本腦炎、聖路易斯腦炎及蜱傳腦炎病毒。其他靶抗原可產生自C型肝炎或冠狀病毒家族，其包括許多非人類病毒，諸如感染性支氣管炎病毒(家禽)、豬傳染性胃腸炎病毒(豬)、豬血凝性腦脊髓炎病毒(豬)、貓感染性腹膜炎病毒(貓)、貓腸冠狀病毒(貓)、犬冠狀病毒(狗)及人類呼吸道冠狀病毒，其可能引起普通感冒及/或非A、B或C型肝炎。在冠狀病毒家族中，靶抗原包括E1 (亦稱為M或基質蛋白)、E2 (亦稱為S或刺突蛋白(Spike protein))、E3 (亦稱為HE或血凝素-elterose)糖蛋白(並非在所有冠狀病毒中均存在)、或N (核衣殼)。其他抗原亦可靶向彈狀病毒家族，包括囊泡病毒屬(例如，水泡性口炎病毒)及狂犬病毒屬(例如，狂犬病)。在彈狀病毒家族中，合適之抗原可源自G蛋白或N蛋白。包括出血熱病毒諸如瑪律堡(Marburg)病毒及埃博拉病毒之絲狀病毒科(filoviridae)可為合適之抗原來源。副黏病毒家族包括副流感病毒1型、副流感病毒3型，牛副流感病毒3型、風疹病毒(腮腺炎病毒)、副流感病毒2型、副流感病毒4型、新城疫病毒(雞)、牛瘟、麻疹病毒，其包括麻疹及犬瘟熱，及肺炎病毒，包括呼吸道合胞病毒(例如，糖(G)蛋白及融合(F)蛋白，其序列可獲自GenBank)。流感病毒被歸類為正黏病毒家族，且可為抗原之合適來源(例如HA蛋白、N1蛋白)。布尼亞病毒(bunyavirus)家族包括布尼亞病毒屬(加利福尼亞腦炎、拉克羅斯(La Crosse))、白蛉病毒(裂谷熱)、漢坦病毒(普馬拉病毒(puremala)為一種出血熱(hemahagin fever)病毒)、內羅病毒(奈洛比綿羊病)及各種未指定之布加病毒。鼻病毒家族提供針對LCM及拉沙熱病毒之抗原來源。呼腸孤病毒家族包括呼腸孤病毒屬、輪狀病毒屬(可引起兒童急性胃腸炎)、環狀病毒(orbivirus)屬及栽培病毒(cultivirus)屬(科羅拉多蜱傳熱、利龐博(Lebombo) (人類)、馬器質性腦病、藍舌病)。逆轉錄病毒家族包括腸病毒亞科，涵蓋人類及獸醫疾病，如貓白血病病毒、HTLVI及HTLVII、慢病毒(包括人類免疫缺陷病毒(HIV)、猿猴免疫缺陷病毒(SIV)、貓免疫缺陷病毒(FIV)、馬感染性貧血病毒及泡沫病毒亞科(spumavirinal))。在慢病毒中，已描述許多合適之抗原且可容易地選擇。合適之HIV及SIV抗原之實例包括但不限於gag、pol、Vif、Vpx、VPR、Env、Tat、Nef及Rev蛋白，以及其各種片段。舉例而言，Env蛋白之合適片段可包括其任何次單元，諸如gp120、gp160、gp41或其較小片段，例如長度至少約8個胺基酸。類似地，可選擇tat蛋白之片段。[參見美國專利第5,891,994號及美國專利第6,193,981號]。亦參見D. H. Barouch等人, J. Virol., 75(5):2462-2467 (2001年3月)及R. R. Amara等人,Science, 292:69-74 (2001年4月6日)中所述之HIV及SIV蛋白。在另一實例中，HIV及/或SIV免疫原性蛋白質或肽可用於形成融合蛋白或其他免疫原性分子。參見例如2001年8月2日公開之WO 01/54719及1999年4月8日公開之WO 99/16884中描述的HIV-1 Tat及/或Nef融合蛋白及免疫方案。本發明不限於本文所述之HIV及/或SIV免疫原性蛋白或肽。另外，已描述或可由熟習此項技術者容易地對該等蛋白質進行多種修飾。參見例如美國專利第5,972,596號中所述之經修飾gag蛋白。此外，任何期望之HIV及/或SIV免疫原可單獨或組合遞送。此等組合可包括來自單個載體或來自多個載體之表現。乳多泡病毒家族包括多瘤病毒亞科(BKU及JCU病毒)及乳頭瘤病毒亞科(與癌症或乳頭瘤之惡性進展相關)。腺病毒家族包括引起呼吸道疾病及/或腸炎之病毒(EX、AD7、ARD、O.B.)。細小病毒科貓細小病毒(貓腸炎)、貓泛白細胞減少症病毒、犬細小病毒及豬細小病毒。疱疹病毒家族包括α疱疹病毒亞科，其涵蓋單純疱疹病毒屬(HSVI、HSVII)、水痘病毒屬(假狂犬病、水痘帶狀疱疹)；及β疱疹病毒亞科，其包括巨細胞病毒屬(人類CMV)、鼠巨細胞病毒屬；及γ疱疹病毒亞科，其包括淋巴隱病毒屬、EBV (伯基茲淋巴瘤(Burkitts lymphoma))、感染性鼻氣管炎、馬立克氏病(Marek's disease)病毒及鼻病毒。痘病毒家族包括脊椎動物痘病毒亞科，其涵蓋正痘病毒屬(天花(Variola/Smallpox)及牛痘(Vaccinia/Cowpox))、副痘病毒、禽痘病毒、羊痘病毒、野兔痘病毒、豬痘病毒及昆蟲痘病毒(entomopoxyirinae)亞科。肝炎病毒家族包括B型肝炎病毒。可能為合適抗原來源之一種未分類病毒為δ型肝炎病毒。其他病毒來源可包括禽感染性法氏囊病(bursal disease)病毒及豬呼吸道與生殖症候群病毒。α病毒家族包括馬動脈炎病毒及各種腦炎病毒。
可併入疫苗中(例如，在卡匣中編碼)之抗原亦包括免疫原，其可用於使人類或非人類動物針對病原體(包括感染人類及非人類脊椎動物之細菌、真菌、寄生微生物或多細胞寄生蟲)免疫。細菌病原體之實例包括病原性革蘭氏陽性球菌，包括肺炎球菌；葡萄球菌；及鏈球菌。病原性革蘭氏陰性球菌包括腦膜炎球菌；淋球菌。病原性腸革蘭氏陰性桿菌包括腸桿菌科；假單胞菌(pseudomonas )、不動桿菌(acinetobacteria)及艾肯菌(eikenella )；類鼻疽(melioidosis)；沙門氏菌(salmonella )；志賀氏菌(shigella )；嗜血桿菌(haemophilus ) (流感嗜血桿菌(Haemophilus influenzae )、睡眠嗜血桿菌(Haemophilus somnus ))；莫拉氏菌(moraxella )；杜克雷嗜血桿菌(H. ducreyi ) (其引起軟下疳)；布魯氏菌(brucella )；野兔熱弗朗西絲菌(Franisella tularensis ) (其引起兔熱病)；耶爾森氏菌(yersinia ) (巴氏桿菌(pasteurella ))；莫尼氏鏈球菌(streptobacillus moniliformis )；及螺菌(spirillum )。革蘭氏陽性桿菌包括單核細胞增生李斯特菌(listeria monocytogenes )；紅斑丹毒絲菌(erysipelothrix rhusiopathiae )；白喉棒狀桿菌(Corynebacterium diphtheria ) (白喉)；霍亂(cholera)；炭疽桿菌(B. anthracis ) (炭疽)；杜諾凡病(腹股溝肉芽腫)；及巴氏桿菌病(bartonellosis)。由病原性厭氧細菌引起之疾病包括破傷風；肉毒桿菌中毒；其他梭狀芽胞桿菌；結核；麻風；及其他分枝桿菌。特定細菌物種之實例為(但不限於)肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumoniae )、化膿性鏈球菌(Streptococcus pyogenes )、無乳鏈球菌(Streptococcus agalactiae )、糞鏈球菌(Streptococcus faecalis )、卡他莫拉菌(Moraxella catarrhalis )、幽門螺桿菌(Helicobacter pylori )、腦膜炎奈瑟菌(Neisseria meningitidis )、淋病奈瑟菌(Neisseria gonorrhoeae )、沙眼衣原體(Chlamydia trachomatis )、肺炎衣原體(Chlamydia pneumoniae )、鸚鵡熱衣原體(Chlamydia psittaci )、百日咳博多特氏菌(Bordetella pertussis )、傷寒沙門氏菌(Salmonella typhi )、鼠傷寒沙門氏菌(Salmonella typhimurium )、霍亂沙門氏菌(Salmonella choleraesuis )、大腸埃希氏菌(Escherichia coli )、志賀氏菌(Shigella )、霍亂弧菌(Vibrio cholerae )、白喉棒狀桿菌(Corynebacterium diphtheriae )、結核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis )、鳥分枝桿菌(Mycobacterium avium )、細胞內分枝桿菌(Mycobacterium intracellulare )複合體、奇異變形桿菌(Proteus mirabilis )、尋常變形桿菌(Proteus vulgaris )、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus )、破傷風梭菌(Clostridium tetani )、鉤端螺旋體(Leptospira interrogans )、伯氏疏螺旋體(Borrelia burgdorferi )、溶血巴斯德氏菌(Pasteurella haemolytica )、多殺巴斯德氏菌(Pasteurella multocida )、胸膜肺炎放線桿菌(Actinobacillus pleuropneumoniae )及雞敗血支原體(Mycoplasma gallisepticum )。病原性螺旋體疾病包括梅毒；密螺旋體病：雅司病(yaws)、品他病(pinta)及地方性梅毒；及鉤端螺旋體病。由高病原菌及病原真菌引起之其他感染包括放線菌病；諾卡菌病；隱球菌病(隱球菌(Cryptococcus ))、芽生菌病(芽生菌(Blastomyces ))、組織胞漿菌病(組織胞漿菌(Histoplasma ))及球孢子菌病(球孢子菌(Coccidiodes ))；念珠菌病(念珠菌(Candida ))、曲黴菌病(曲黴菌(Aspergillis ))及毛黴菌病；孢子絲菌病；副球孢子菌病、黴樣真菌病(petriellidiosis)、球擬酵母病、足菌腫及著色真菌病；及皮膚癬菌病。立克次氏菌感染包括斑疹傷寒、洛磯山斑疹熱(Rocky Mountain spotted fever)、Q熱及立克次體痘(Rickettsialpox)。支原體及衣原體感染之實例包括：肺炎支原體(mycoplasma pneumoniae )；性病性淋巴肉芽腫；鸚鵡熱；及圍產期衣原體感染。病原性真核生物涵蓋病原性原生動物及蠕蟲，且由此產生之感染包括：阿米巴蟲病；瘧疾；利什曼病(例如由利什曼原蟲(Leishmania major )引起)；錐蟲病；弓形蟲病(例如由弓形蟲(Toxoplasma gondii )引起)；卡氏肺孢子蟲(Pneumocystis carinii )；Trichans；弓形蟲；巴貝西蟲病；賈第鞭毛蟲病(例如由賈第鞭毛蟲(Giardia )引起)；旋毛蟲病(例如由滴蟲(Trichomonas )引起)；絲蟲病；血吸蟲病(例如由血吸蟲(Schistosoma )引起)；線蟲；吸蟲(trematode)或吸蟲(fluke)；及絛蟲(帶蟲)感染。其他寄生蟲感染可由蛔蟲(Ascaris )、鞭蟲(Trichuris )、隱孢子蟲(Cryptosporidium )及卡氏肺孢子蟲等引起。
本文亦揭示衍生自與感染性疾病生物體、個體中之感染或個體之受感染細胞相關之任何多肽的肽。抗原可源自感染性疾病生物體之核酸序列或多肽序列。感染性疾病生物體之多肽序列包括但不限於病原體源肽、病毒源肽、細菌源肽、真菌源肽及/或寄生蟲源肽。感染性疾病生物體包括但不限於嚴重急性呼吸症候群相關冠狀病毒(SARS)、嚴重急性呼吸症候群冠狀病毒2 (SARS-CoV-2)、埃博拉病毒、HIV、B型肝炎病毒(HBV)、流感、C型肝炎病毒(HCV)及結核病。
可選擇預測在細胞(諸如腫瘤細胞、受感染細胞或免疫細胞，包括專職抗原呈現細胞，諸如樹突狀細胞)之細胞表面上呈現的抗原。可選擇預測具有免疫原性之抗原。
由抗原核酸序列編碼之一或多種多肽可包含以下中之至少一者：IC50值小於1000 nM之與MHC的結合親和力，對於MHC I類多肽，長度為8-15個，8、9、10、11、12、13、14或15個胺基酸，在肽內或肽附近存在促進蛋白酶體裂解之序列基元，及存在促進TAP傳輸之序列基元。對於長度為6-30 (6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30)個胺基酸之MHC II類肽，在肽內或附近存在促進藉由胞外或溶酶體蛋白酶(例如組織蛋白酶)裂解或HLA-DM催化的HLA結合的序列基元。
一或多個抗原可呈現在腫瘤之表面上。一或多個抗原可呈現在受感染細胞之表面上。
一或多個抗原在具有腫瘤之個體中可具有免疫原性，例如能夠誘發個體中之T細胞反應或B細胞反應。一或多種抗原在具有或疑似具有感染之個體中可為免疫原性的，例如能夠在個體中引起T細胞反應或B細胞反應。一或多種抗原在具有感染風險之個體中可為免疫原性的，例如能夠在個體中引起T細胞反應或B細胞反應，其提供針對感染之免疫保護(亦即免疫性)，例如刺激記憶T細胞、記憶B細胞或感染特異性抗體的產生。
一或多種抗原可以能夠引起B細胞反應，例如產生識別一或多種抗原之抗體。抗體可識別線性多肽序列或識別二級及三級結構。因此，B細胞抗原可包括線性多肽序列或具有二級及三級結構之多肽，包括但不限於全長蛋白質、蛋白質次單元、蛋白質結構域，或任何已知或預測具有二級及三級結構之多肽序列。
在疫苗生產背景下，對於個體，可不考慮在個體中誘發自體免疫反應之一或多個抗原。
至少一個抗原肽分子(例如抗原決定基序列)之大小可包含但不限於約5、約6、約7、約8、約9、約10、約11、約12、約13、約14、約15、約16、約17、約18、約19、約20、約21、約22、約23、約24、約25、約26、約27、約28、約29、約30、約31、約32、約33、約34、約35、約36、約37、約38、約39、約40、約41、約42、約43、約44、約45、約46、約47、約48、約49、約50、約60、約70、約80、約90、約100、約110、約120或更多個胺基分子殘基，及可源自其中的任何範圍。在具體實施例中，抗原肽分子等於或小於50個胺基酸。
抗原肽及多肽可為：對於MHC I類，15個殘基或更少的長度且通常由約8個與約11個之間的殘基，尤其9或10個殘基組成；對於MHC II類，6-30個殘基，包括端值。
若需要，可以數種方式設計較長的肽。在一種情況下，當HLA對偶基因上肽之呈現可能性經預測或已知時，較長的肽可由以下任一者組成：(1)個別呈現之具有朝向各相應基因產物之N端及C端延伸2-5個胺基酸的肽；(2)所呈現之肽中之一些或全部與各自之延伸序列的串接。在另一種情況下，當定序揭露腫瘤中所存在之長(＞10個殘基)新抗原決定基序列(例如歸因於產生新穎肽序列之讀框移位、通讀或內含子包含)時，較長的肽將由以下組成：(3)新穎腫瘤特異性或感染性疾病特異性胺基酸之整個延伸段，因此繞過對基於計算或活體外測試選擇最強HLA呈現之較短肽的需要。在兩種情況下，使用較長的肽允許患者細胞進行內源性加工，且可引起更有效的抗原呈現及誘發T細胞反應。
抗原肽及多肽可呈現於HLA蛋白質上。在一些態樣中，抗原肽及多肽以比野生型肽更大的親和力呈現於HLA蛋白質上。在一些態樣中，抗原肽或多肽之IC50可至少小於5000 nM、至少小於1000 nM、至少小於500 nM、至少小於250 nM、至少小於200 nM、至少小於150 nM、至少小於100 nM、至少小於50 nM或更小。
在一些態樣中，抗原肽及多肽在投與個體時不誘發自體免疫反應及/或引起免疫耐受性。
亦提供包含至少兩個或大於兩個抗原肽之組合物。在一些實施例中，組合物含有至少兩個不同的肽。至少兩個不同的肽可源自相同的多肽。不同的多肽意指肽根據長度、胺基酸序列或兩者而變化。肽可源自已知或已發現含有腫瘤特異性突變之任何多肽，或肽源自與正常細胞或組織相比在腫瘤細胞或癌組織中具有改變之表現的任何多肽，例如已知或已發現與正常細胞或組織相比在腫瘤細胞或癌組織中異常表現之任何多肽。可例如在COSMIC資料庫或AACR基因組學證據瘤形成資訊交換(GENIE)資料庫中發現可獲得抗原肽之適合之多肽。COSMIC策劃關於人類癌症體細胞突變之綜合資訊。AACR GENIE彙總及將臨床級癌症基因組資料與來自數萬癌症患者之臨床結果聯繫起來。在一些態樣中，腫瘤特異性突變為特定癌症類型之驅動突變。該肽可源自已知或疑似與感染性疾病生物體相關之任何多肽，或源自已知或已發現與正常細胞或組織相比在受感染細胞中表現發生改變之任何多肽的肽(例如感染性疾病聚核苷酸或多肽，包括表現限於宿主細胞之感染性疾病聚核苷酸或多肽)。
具有所需活性或特性之抗原肽及多肽可經修飾以提供某些所需屬性，例如改善之藥理學特徵，同時增加或至少保留實質上所有未經修飾之肽與所需MHC分子結合及活化合適T細胞之生物活性。舉例而言，抗原肽及多肽可進行各種變化，諸如保守或非保守取代，其中此類變化可在其使用中提供某些優勢，諸如改良之MHC結合、穩定性或呈現。保守取代意謂用生物及/或化學類似的另一胺基酸殘基(例如一個疏水性殘基置換另一個胺基酸殘基或一個極性殘基置換另一胺基酸殘基)置換胺基酸殘基。取代包括以下組合，諸如Gly、Ala；Val、Ile、Leu、Met；Asp、Glu；Asn、Gln；Ser、Thr；Lys、Arg；及Phe、Tyr。單胺基酸取代之效應亦可使用D-胺基酸探測。此類修飾可使用熟知的肽合成程序進行，如Merrifield, Science 232:341-347 (1986), Barany 及Merrifield, The Peptides, Gross 及Meienhofer, 編 (N.Y., Academic Press), 第1-284 頁(1979)；及Stewart及Young, Solid Phase Peptide Synthesis, (Rockford, Ill., Pierce), 第2版 (1984)中所述。
肽及多肽用各種胺基酸模擬物或非天然胺基酸修飾可在提高肽及多肽之活體內穩定性方面特別有用。穩定性可以多種方式加以分析。舉例而言，肽酶及各種生物介質(諸如人類血漿及血清)已用於測試穩定性。參見例如Verhoef等人, Eur. J. Drug Metab Pharmacokin. 11:291-302 (1986)。肽之半衰期可使用25%人類血清(v/v)分析方便地確定。方案一般如下。匯集之人類血清(AB型，非加熱不活化)在使用之前藉由離心去脂。血清隨後用RPMI組織培養基稀釋至25%且用於測試肽穩定性。在預定時間間隔下，移出少量反應溶液且添加至6%三氯乙酸或乙醇水溶液中。將混濁的反應樣品冷卻(4℃) 15分鐘，且隨後旋轉集結沈澱的血清蛋白質。隨後使用穩定性特異性層析條件藉由逆相HPLC來判定肽之存在。
肽及多肽可經修飾以提供除改良之血清半衰期以外的所需屬性。舉例而言，肽誘發CTL活性之能力可藉由與含有至少一個能夠誘發T輔助細胞反應之抗原決定基的序列連接來增強。免疫原性肽/T輔助細胞結合物可藉由間隔分子連接。間隔子通常由相對較小的中性分子(諸如胺基酸或胺基酸模擬物)構成，其在生理條件下實質上不帶電。間隔子通常選自例如Ala、Gly或非極性胺基酸或中性極性胺基酸之其他中性間隔子。應理解，視情況存在之間隔子無需由相同殘基組成，且因此可為雜寡聚物或均寡聚物。當存在時，間隔子將通常為至少一個或兩個殘基，更通常三至六個殘基。可替代地，肽可在無間隔子之情況下連接於T輔助肽。
抗原肽可直接或經由在肽之胺基或羧基端處的間隔子連接於T輔助肽。抗原肽或T輔助肽之胺基端可經醯化。例示性T輔助肽包括破傷風類毒素830-843、流感307-319、瘧疾環子孢子382-398及378-389。
蛋白質或肽可藉由熟習此項技術者已知的任何技術製造，包括經由標準分子生物學技術表現蛋白質、多肽或肽；自天然來源分離蛋白質或肽；或化學合成蛋白質或肽。先前已揭示對應於各種基因之核苷酸及蛋白質、多肽及肽序列，且可見於一般熟習此項技術者已知的電腦化資料庫中。一種此類資料庫為位於美國國家衛生研究院(National Institutes of Health)網站的國家生物技術資訊中心(National Center for Biotechnology Information)的Genbank及GenPept資料庫。已知基因之編碼區可使用本文所揭示或一般熟習此項技術者應知曉之技術擴增及/或表現。可替代地，蛋白質、多肽及肽之各種市售製劑已為熟習此項技術者所知。
在另一態樣中，抗原包括編碼抗原肽或其部分之核酸(例如多核苷酸)。聚核苷酸可為例如DNA、cDNA、PNA、CNA、RNA (例如mRNA)、單股及/或雙股、或天然或穩定形式之聚核苷酸，諸如具有硫代磷酸主鏈之聚核苷酸，或其組合，且其可含有或可不含內含子。另一態樣提供一種能夠表現多肽或其部分之表現載體。不同細胞類型的表現載體在此項技術中已熟知且無需過度實驗便可選擇。一般而言，DNA以適當定向插入至表現載體(諸如質體)中且以正確閱讀框架進行表現。若需要，DNA可連接於由所需宿主識別之適當轉錄及轉譯調節控制核酸序列，而此類控制件一般可用於表現載體中。載體隨後經由標準技術引入至宿主中。指導可見於例如Sambrook 等人 (1989) Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.中。V. 遞送組合物
本文亦揭示一種能夠引起特異性免疫反應(例如腫瘤特異性免疫反應或感染性疾病生物體特異性免疫反應)之免疫原性組合物，例如疫苗組合物。疫苗組合物通常包含例如使用本文所述之方法選擇的一個或多個抗原。疫苗組合物亦可稱為疫苗。
疫苗可含有1至30個肽；2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30個不同的肽；6、7、8、9、10、11、12、13或14個不同的肽；或12、13或14個不同的肽。肽可包括轉譯後修飾。疫苗可含有1至100或更多個核酸序列；2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100或更多個不同的核酸序列；6、7、8、9、10、11、12、13或14個不同的核酸序列；或12、13或14個不同的核酸序列。疫苗可含有1至30個抗原序列，2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100或更多個不同抗原序列，6、7、8、9、10、11、12、13或14個不同抗原序列，或12、13或14個不同抗原序列。
疫苗可含有1至30個抗原編碼核酸序列，2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100或更多個不同的抗原編碼核酸序列，6、7、8、9、10、11、12、13或14個不同的抗原編碼核酸序列，或12、13或14種不同的抗原編碼核酸序列。抗原編碼核酸序列可係指抗原「卡匣」之抗原編碼部分。卡匣之特徵在下面更詳細地描述。
疫苗可含有1至30個不同的抗原決定基編碼核酸序列，2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100或更多個不同的抗原決定基編碼核酸序列，6、7、8、9、10、11、12、13或14個不同的抗原決定基編碼核酸序列，或12、13或14個不同的抗原決定基編碼核酸序列。抗原決定基序列編碼抗原決定基可係指單個抗原決定基序列之序列。
疫苗可含有抗原決定基編碼核酸序列之至少兩個重複序列。如本文所用，「重複序列」係指相同核酸抗原決定基編碼核酸序列(包括本文所述之視情況選用之5'連接子序列及/或視情況選用之3'連接子序列)在抗原編碼核酸序列內的兩次或更多次迭代。在一個實例中，卡匣之抗原編碼核酸序列部分編碼抗原決定基編碼核酸序列之至少兩個重複序列。在另外的非限制性實例中，卡匣之抗原編碼核酸序列部分編碼超過一個不同的抗原決定基，且至少一個不同的抗原決定基由編碼該等不同抗原決定基之核酸序列的至少兩個重複序列編碼(亦即至少兩個不同的抗原決定基編碼核酸序列)。在說明性的非限制性實例中，抗原編碼核酸序列編碼由抗原決定基編碼核酸序列編碼之抗原決定基A、B及C，亦即抗原決定基編碼序列A (EA )、抗原決定基編碼序列B (EB )及抗原決定基編碼序列C (EC )，且具有至少一個不同抗原決定基之重複序列的例示性抗原編碼核酸序列由下式舉例說明，但不限於此： - 一個不同抗原決定基之重複序列(抗原決定基A之重複序列)： EA -EB -EC -EA ；或 EA -EA -EB -EC - 多個不同抗原決定基之重複序列(抗原決定基A、B及C之重複序列)： EA -EB -EC -EA -EB -EC ；或 EA -EA -EB -EB -EC -EC - 多個不同抗原決定基之多個重複序列(抗原決定基A、B及C之重複序列)： EA -EB -EC -EA -EB -EC -EA -EB -EC ；或 EA -EA -EA -EB -EB -EB -EC -EC -EC
以上實例並非限制性的，且具有至少一個不同抗原決定基之重複序列的抗原編碼核酸序列可以任何順序或頻率編碼不同抗原決定基中之每一者。舉例而言，順序及頻率可為不同抗原決定基之隨機排列，例如，在具有抗原決定基A、B及C之實例中，其式為EA -EB -EC -EC -EA -EB -EA -EC -EA -EC -EC -EB 。
本文亦提供抗原編碼卡匣，該抗原編碼卡匣具有由下式自5'至3'描述之至少一個抗原編碼核酸序列： (Ex -(EN n )y )z 其中E表示包含至少一個不同抗原決定基編碼核酸序列中之至少一者的核酸序列， n表示獨立之不同抗原決定基編碼核酸序列之數目且為包括0之任何整數， EN 表示包含對於每個相應n之獨立之不同的抗原決定基編碼核酸序列的核酸序列， 對於z之每次迭代：對於各n，x = 0或1，y = 0或1，且x或y中之至少一者= 1，且 z = 2或更大，其中抗原編碼核酸序列包含E之至少兩次迭代、給定EN 或其組合。
各E或EN 可獨立地包含本文描述之任何抗原決定基編碼核酸序列。舉例而言，各E或EN 可獨立地包含由式(L5b -Nc -L3d )自5'至3'描述之核酸序列，其中N包含與各E或EN 相關之不同的抗原決定基編碼核酸序列，其中c = 1，L5包含5'連接子序列，其中b = 0或1，且L3包含3'連接子序列，其中d = 0或1。本文進一步描述可使用之抗原決定基及連接子，例如參見「V.A.卡匣」部分。
抗原決定基編碼核酸序列(包括視情況選用之5'連接子序列及/或視情況選用之3'連接子序列)之重複序列可直接彼此線性連接(例如如上所示之EA -EA -…)。抗原決定基編碼核酸序列之重複序列可由一或多個其他核苷酸序列分隔開。通常，抗原決定基編碼核酸序列之重複序列可由適用於本文所述之組合物之任何大小的核酸序列分隔開。在一個實例中，抗原決定基編碼核酸序列之重複序列可由分開之不同的抗原決定基編碼核酸序列(例如，如上所示之EA -EB -EC -EA …)分隔開。在其中重複序列由單個獨立之不同的抗原決定基編碼核酸序列分隔開且各抗原決定基編碼核酸序列(包括視情況選用之5'連接子序列及/或視情況選用之3'連接子序列)編碼長度為25個胺基酸之肽的實例中，重複序列可由75個核苷酸分隔開，諸如在由EA -EB -EA …表示之抗原編碼核酸中，EA 由75個核苷酸分隔開。在一個說明性實例中，具有序列VTNTEMFVTAPDNLGYMYEVQWPGQTQPQIANCSVYDFFVWLHYYSVRDTVTNTEMFVTAPDNLGYMYEVQWPGQTQPQIANCSVYDFFVWLHYYSVRDT之抗原編碼核酸編碼25聚體抗原之重複序列Trp1 (VTNTEMFVTAPDNLGYMYEVQWPGQ)及Trp2 (TQPQIANCSVYDFFVWLHYYSVRDT)，Trp1之重複序列由25聚體Trp2分隔開且因此Trp1抗原決定基編碼核酸序列之重複序列由75個核苷酸Trp2抗原決定基編碼核酸序列分隔開。在其中重複序列由2、3、4、5、6、7、8或9個單獨之不同的抗原決定基編碼核酸序列分隔開且各抗原決定基編碼核酸序列(包括視情況選用之5'連接子序列及/或視情況選用之3'連接子序列)編碼長度為25個胺基酸之肽的實例中，重複序列可分別由150、225、300、375、450、525、600或675個核苷酸分隔開。
在一個實施例中，選擇不同肽及/或多肽或編碼其之核酸序列，使得肽及/或多肽能夠與不同MHC分子(諸如不同MHC I類分子及/或不同MHC II類分子)結合。在一些態樣中，一種疫苗組合物包含能夠與最常出現之MHC I類分子及/或不同MHCII類分子締合之肽及/或多肽的編碼序列。因此，疫苗組合物可包含能夠與至少2個較佳的，至少3個較佳的或至少4個較佳的MHC I類分子及/或不同MHC II類分子結合的不同片段。
疫苗組合物能夠引起特異性細胞毒性T細胞反應及/或特異性輔助T細胞反應。
疫苗組合物可另外包含佐劑及/或載劑。有用的佐劑及載劑之實例在下文中給出。組合物可與載劑締合，諸如蛋白質或抗原呈現細胞，諸如能夠將肽呈現於T細胞之樹突狀細胞(DC)。
佐劑為混合至疫苗組合物中增加或以其他方式修飾對抗原之免疫反應的任何物質。載劑可為主鏈結構，例如能夠與抗原締合之多肽或多糖。視情況，佐劑為共價或非共價結合的。
佐劑提高對抗原之免疫反應的能力通常顯現為免疫介導性反應之顯著或實質性增加或疾病症狀之減少。舉例而言，體液免疫的增強典型地顯現為針對抗原所產生之抗體力價的顯著增大，且T細胞活性的增強典型地顯現為細胞增殖或細胞性細胞毒性或細胞激素分泌的增強。佐劑亦可改變免疫反應，例如藉由將主要體液或Th反應變為主要細胞或Th反應。
適合之佐劑包括(但不限於) 1018 ISS、礬、鋁鹽、Amplivax、AS15、BCG、CP-870,893、CpG7909、CyaA、dSLIM、GM-CSF、IC30、IC31、咪喹莫特(Imiquimod)、ImuFact IMP321、IS Patch、ISS、ISCOMATRIX、JuvImmune、LipoVac、MF59、單磷醯基脂質A、Montanide IMS 1312、Montanide ISA 206、Montanide ISA 50V、Montanide ISA-51、OK-432、OM-174、OM-197-MP-EC、ONTAK、PepTel 載體系統、PLG微粒、雷西莫特(resiquimod)、SRL172、病毒粒子及其他病毒樣顆粒、YF-17D、VEGF捕獲劑、R848、β-葡聚糖、Pam3Cys、Aquila之源自皂素之QS21刺激子(Aquila Biotech, Worcester, Mass., USA)、分支桿菌提取物及合成細菌細胞壁模擬物，及其他專用佐劑，諸如Ribi之Detox. Quil或Superfos。諸如弗氏(Freund's)不完全或GM-CSF之佐劑為有用的。先前已描述對樹突狀細胞具有特異性之數種免疫佐劑(例如MF59)及其製備(Dupuis M,等人, Cell Immunol. 1998; 186(1):18-27; Allison A C; Dev Biol Stand. 1998; 92:3-11)。亦可使用細胞介素。數種細胞介素已直接關聯於：影響樹突狀細胞遷移至淋巴組織(例如TNF-α)、加速樹突狀細胞成熟變為T-淋巴球之有效抗原呈遞細胞(例如GM-CSF、IL-1及IL-4) (美國專利第5,849,589號，其以全文引用的方式特別併入本文中)及充當免疫佐劑(例如IL-12) (Gabrilovich D I,等人, J Immunother Emphasis Tumor Immunol. 1996 (6):414-418)。
亦已報導CpG免疫刺激性寡核苷酸增強佐劑在疫苗環境中之效應。亦可使用其他TLR結合分子，諸如結合RNA之TLR 7、TLR 8及/或TLR 9。
有用佐劑之其他實例包括(但不限於)經化學修飾之CpG (例如CpR、Idera)、聚(I:C) (例如聚i:CI2U)、非CpG細菌DNA或RNA以及免疫活性小分子及抗體，諸如環磷醯胺、舒尼替尼(sunitinib)、貝伐單抗(bevacizumab)、西樂葆(celebrex)、NCX-4016、西地那非(sildenafil)、他達拉非(tadalafil)、伐地那非(vardenafil)、索拉菲尼(sorafinib)、XL-999、CP-547632、帕佐泮尼(pazopanib)、ZD2171、AZD2171、伊匹單抗、曲美單抗(tremelimumab)及SC58175，其可起治療作用及/或充當佐劑。佐劑及添加劑之量及濃度可容易由熟習此項技術者確定而無需過度實驗。額外佐劑包括群落刺激因子，諸如顆粒球巨噬細胞群落刺激因子(GM-CSF，沙格司亭(sargramostim))。
疫苗組合物可包含多於一種不同的佐劑。此外，治療性組合物可包含任何佐劑物質，包括以上各者中之任一者或其組合。亦預期，疫苗及佐劑可一起或以任何適當的順序分開投與。
載劑(或賦形劑)可獨立於佐劑存在。載劑之功能可例如為增加特定突變體之分子量以提高活性或免疫原性、賦予穩定性、增加生物活性或增加血清半衰期。此外，載劑可輔助呈現肽至T細胞。載劑可為熟習此項技術者已知的任何適合之載劑，例如蛋白質或抗原呈現細胞。載劑蛋白質可為(但不限於)匙孔螺血氰蛋白、血清蛋白質(諸如轉鐵蛋白)、牛血清白蛋白、人類血清白蛋白、甲狀腺球蛋白或卵白蛋白、免疫球蛋白或激素，諸如胰島素或棕櫚酸。為用於人類免疫接種，載劑一般為生理學上可接受之載劑，其為人類可接受的且為安全的。然而，破傷風類毒素及/或白喉類毒素為適合之載劑。可替代地，載劑可為葡聚糖，例如瓊脂糖。
細胞毒性T細胞(CTL)識別呈結合至MHC分子之肽形式而非完整外來抗原自身的抗原。MHC分子本身位於抗原呈現細胞之細胞表面上。因此，若存在肽抗原、MHC分子及APC之三聚體複合物，則可能活化CTL。相應地，若不僅肽用於活化CTL，而且若另外添加具有相應MHC分子之APC，則可增強免疫反應。因此，在一些實施例中，疫苗組合物另外含有至少一種抗原呈遞細胞。
抗原亦可包括於基於病毒載體之疫苗平台中，諸如牛痘、禽痘、自我複製α 病毒、馬拉巴病毒(marabavirus)、腺病毒(參見例如Tatsis等人, Adenoviruses,Molecular Therapy (2004) 10, 616-629)或慢病毒，包括(但不限於)第二、第三或雜交第二/第三代慢病毒及任一代之重組慢病毒，其設計成靶向特定細胞類型或受體(參見例如Hu 等人, Immunization Del ivered by Lentiviral Vectors for Cancer and Infectious Diseases,Immunol Rev. (2011) 239(1): 45-61, Sakuma等人, Lentiviral vectors: basic to translational ,Biochem J. (2012) 443(3):603-18, Cooper 等人, Rescue of splicing-mediated intron loss maximizes expression in lentiviral vectors containing the human ubiquitin C promoter,Nucl. Acids Res. (2015) 43 (1): 682-690, Zufferey 等人, Self-Inactivating Lentivirus Vector for Safe and Efficient In Vivo Gene Delivery,J. Virol . (1998) 72 (12): 9873-9880)。視上述基於病毒載體之疫苗平台的包裝能力而定，此方法可遞送編碼一或多個抗原肽之一或多個核酸序列。序列可側接非突變序列，可由連接子分開或可在前面有一或多個靶向亞細胞區室之序列(參見例如Gros等人, Prospective identification of neoantigenspecific lymphocytes in the peripheral blood of melanoma patients,Nat Med. (2016) 22 (4):433-8, Stronen等人, Targeting of cancer neoantigens with donor-derived T cell receptor repertoires,Science. (2016) 352 (6291):1337-41, Lu 等人, Efficient identification of mutated cancer antigens recognized by T cells associated with durable tumor regressions,Clin Cancer Res. (2014) 20(13):3401-10)。在引入宿主後，經感染細胞表現抗原，從而引發針對肽之宿主免疫(例如CTL)反應。適用於免疫方案中之牛痘載體及方法描述於例如美國專利第4,722,848號中。另一種載體為卡介苗(Bacille Calmet te Guerin，BCG)。BCG載體描述於Stover等人 (Nature 351:456-460 (1991))中。根據本文描述，適用於抗原之治療性投與或免疫接種的各種其他疫苗載體，例如傷寒沙門氏菌載體及其類似物對於熟習此項技術者將為顯而易見的。
本文亦揭示能夠遞送一或多種有效負載核酸序列之腺病毒載體遞送組合物。有效負載核酸序列可為期望遞送至所關注細胞之任何核酸序列。通常，有效負載為與啟動子連接以驅動核酸序列之表現之核酸序列。有效負載核酸序列可編碼多肽(亦即，能夠經轉錄且轉譯成蛋白質之核酸序列)。通常，編碼肽之有效負載核酸序列可編碼期望在細胞中表現之任何蛋白質。蛋白質之實例包括但不限於抗原(例如，MHC I類抗原決定基、MHC II類抗原決定基或能夠刺激B細胞反應之抗原決定基)，抗體，細胞介素，嵌合抗原受體(CAR)，T細胞受體或基因組編輯系統元件(例如，基因組編輯系統中使用之核酸酶)。基因組編輯系統包括但不限於CRISPR系統、鋅指系統、大範圍核酸酶系統或TALEN系統。有效負載核酸序列可為非編碼的(亦即，能夠經轉錄但不能轉譯成蛋白質之核酸序列)。通常，非編碼有效負載核酸序列可為期望在細胞中表現之任何非編碼聚核苷酸。非編碼聚核苷酸之實例包括但不限於RNA干擾(RNAi)聚核苷酸(例如，反義寡核苷酸、shRNA、siRNA、miRNA等)或基因組編輯系統聚核苷酸(例如，嚮導RNA [gRNA]、單嚮導RNA [sgRNA]、反式激活CRISPR [tracrRNA]及/或CRISPR RNA [crRNA])。有效負載核酸序列可編碼兩個或更多個(例如2、3、4、5或更多個)不同的多肽(例如，兩個或更多個連接在一起的不同的抗原決定基序列)或含有兩個或更多個不同的非編碼序列核酸序列(例如，兩個或更多個不同的RNAi聚核苷酸)。有效負載核酸序列可具有多肽編碼核酸序列與非編碼核酸序列之組合。V.A.1 卡匣
用於選擇一或多個抗原，選殖及構造「卡匣」及其插入於病毒載體中之方法屬於本文所提供之教示內容給出之此項技術中的技能內。卡匣可具有一或多個有效負載核酸序列，諸如含有多個有效負載核酸序列之卡匣各自獨立地可操作地連接於單獨之啟動子及/或使用其他多順反子系統連接在一起，諸如2A核糖體跳躍序列元件(例如E2A、P2A、F2A或T2A序列)或內部核糖體進入位點(IRES)序列元件。在含有超過一個有效負載核酸序列之卡匣中，各有效負載核酸序列可含有一或多個有效負載，例如，各有效負載核酸序列可編碼兩個或更多個多肽或含有兩個或更多個非編碼核酸序列。卡匣可具有多肽編碼核酸序列與非編碼核酸序列之組合。
卡匣可為抗原卡匣。「抗原卡匣」意指所選擇之抗原或複數個抗原與轉錄抗原且表現轉錄產物所必需之其他調控元件之組合。抗原卡匣可包括一或多個抗原。所選擇之一個或複數個抗原可指不同的抗原決定基序列，例如，卡匣中之抗原編碼核酸序列可編碼抗原決定基編碼核酸序列(或複數個抗原決定基編碼核酸序列)，使得抗原決定基經轉錄及表現。
有效負載核酸序列或複數個有效負載核酸序列可以允許轉錄之方式可操作地連接於調控組件。該等組件包括可驅動用病毒載體轉染之細胞中之抗原表現的習知調控元件。因此，卡匣亦可含有所選擇之啟動子，其連接於一或多個有效負載核酸序列且用其他視情況選用之調控元件定位在重組載體之經選擇病毒序列內。
有用的啟動子可為組成型啟動子或經調控(例如誘發型)啟動子，其將能夠控制有待表現之有效負載核酸序列的量，且通常在編碼有效負載核酸序列之情況下肽(例如抗原)的量。舉例而言，合乎需要的啟動子為細胞巨大病毒即刻早期啟動子/強化子之啟動子[參見例如Boshart等人, Cell, 41:521-530 (1985)]。另一種合乎需要的啟動子包括勞斯肉瘤(Rous sarcoma)病毒LTR啟動子/強化子。另一種啟動子/強化子序列為雞細胞質β-肌動蛋白啟動子[T. A. Kost等人, Nucl. Acids Res., 11(23):8287 (1983)]。其他適合或合乎需要的啟動子可由熟習此項技術者選擇，諸如CMV、SV40、EF-1、RSV、PGK、HSA、MCK或EBV啟動子序列。
卡匣亦可包括對病毒載體序列異源之核酸序列，包括提供轉錄物之有效聚腺苷酸化(poly(A)、poly-A或pA)之信號的序列及具有功能性剪接供體及受體位點之內含子。本發明之例示性載體中採用之普通poly-A序列源自乳多泡病毒SV-40。poly-A序列一般可在有效負載核酸序列之後及在病毒載體序列之前插入於卡匣中。普通內含子序列亦可源自SV-40，且稱為SV-40 T內含子序列。卡匣亦可含有此類內含子，位於啟動子/強化子序列與有效負載核酸序列之間。此等及其他普通載體元件之選擇為習知的[參見例如Sambrook 等人, 「Molecular Cloning. A Laboratory Manual.」, 第2版, Cold Spring Harbor Laboratory, New York (1989)及其中列舉之參考文獻]且許多此類序列可自商業及工業來源以及Genbank獲得。
卡匣可具有一或多個有效負載核酸序列。舉例而言，給定卡匣可包括1-10、1-20、1-30、10-20、15-25、15-20、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多個有效負載核酸序列。有效負載核酸序列可直接彼此連接。有效負載核酸序列亦可利用連接子彼此連接。
卡匣可具有一或多個編碼多肽之有效負載核酸序列。舉例而言，給定卡匣可包括1-10、1-20、1-30、10-20、15-25、15-20、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20個或更多個編碼多肽之有效負載核酸序列。卡匣可具有一或多個有效負載核酸序列，其中各有效負載核酸序列編碼不同多肽。卡匣可具有一或多個有效負載核酸序列，其中各有效負載核酸序列編碼一或多個多肽。卡匣可具有一或多個有效負載核酸序列，其中一或多個有效負載核酸序列編碼一或多個多肽。由有效負載核酸序列編碼之多肽可相對於彼此處於任何定向，包括N至C或C至N。
抗原卡匣可具有一或多個抗原。舉例而言，給定卡匣可包括1-10、1-20、1-30、10-20、15-25、15-20、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20個或更多個抗原。抗原可直接彼此連接。抗原亦可利用連接子彼此連接。抗原相對於彼此可處於任何方向，包括N至C或C至N。
如上陳述，卡匣可定位於病毒載體中之任何經選擇缺失之位點中，諸如E1基因區缺失或E3基因區缺失之位點，以及可選擇之其他位點。
卡匣可使用下式描述以描述各元件之有序序列，自5'至3'： (Pa -(L5b -Nc -L3d )X )Z -(P2h -(G5e -Uf )Y )W -G3g
其中P及P2包含啟動子核酸序列，N包含不同抗原決定基編碼核酸序列，L5包含5'連接子序列，L3包含3'連接子序列，G5包含編碼胺基酸連接子之核酸序列，G3包含編碼胺基酸連接子之至少一個核酸序列中之一者，U包含MHC II類抗原編碼核酸序列，其中對於各X，相應Nc係抗原決定基編碼核酸序列，其中對於各Y，相應Uf係抗原編碼核酸序列。該組合物及有序序列可進一步藉由選擇存在元件之數目來定義，例如其中a=0或1，其中b=0或1，其中c=1，其中d=0或1，其中e=0或1，其中f=1，其中g=0或1，其中h=0或1，X=1至400，Y=0、1、2、3、4或5，Z=1至400，且W=0、1、2、3、4或5。
在一個實例中，存在之元件包括其中a=0，b=1，d=1，e=1，g=1，h=0，X=10，Y=2，Z=1，及W=1，其描述其中無其他啟動子存在(亦即僅存在由RNA α病毒主鏈提供之啟動子核酸序列)，存在20個MHC I類抗原決定基，各N存在5'連接子，各N存在3'連接子，存在2個MHC II類抗原決定基，存在連接兩個MHC II類抗原決定基之連接子，存在將兩個MHC II類抗原決定基之5'端連接至最終MHC I類抗原決定基之3'連接子的連接子，且存在將兩個MHC II類抗原決定基之3'端連接至RNA α病毒主鏈的連接子。將卡匣之3'端連接至RNA α病毒主鏈之實例包括直接連接至由RNA α病毒主鏈提供之3'UTR元件(諸如3' 19-nt CSE)。將卡匣之5'端連接至RNA α病毒主鏈之實例包括直接連接至26S啟動子序列、α病毒5'UTR、51-nt CSE或24-nt CSE。
其他實例包括：其中a=1，描述其中存在除RNA α病毒主鏈所提供之啟動子核酸序列以外的啟動子；其中a=1且Z大於1，其中存在除RNA α病毒主鏈所提供之啟動子核酸序列以外的多個啟動子，其各自驅動1個或更多個不同MHC I類抗原決定基編碼核酸序列之表現；其中h=1，描述其中存在分離啟動子以驅動MHC II類抗原編碼核酸序列之表現；以及其中g=0，描述MHC II類抗原編碼核酸序列(若存在)直接連接於RNA α病毒主鏈。
其他實例包括其中所存在之各MHC I類抗原決定基可具有5'連接子、3'連接子，兩者都不具有，或具有兩者。在其中同一卡匣中存在超過一種MHC I類抗原決定基之實例中，一些MHC I類抗原決定基可具有5'連接子及3'連接子兩者，而其他MHC I類抗原決定基可具有5'連接子、3'連接子或兩者均不具有。在其中同一卡匣中存在超過一種MHC I類抗原決定基之其他實例中，一些MHC I類抗原決定基可具有5'連接子或3'連接子，而其他MHC I類抗原決定基可具有5'連接子、3'連接子或兩者均不具有。
在其中同一卡匣中存在超過一種MHC II類抗原決定基之實例中，一些MHC II類抗原決定基可具有5'連接子及3'連接子兩者，而其他MHC II類抗原決定基可具有5'連接子、3'連接子或兩者均不具有。在其中同一卡匣中存在超過一種MHC II類抗原決定基之其他實例中，一些MHC II類抗原決定基可具有5'連接子或3'連接子，而其他MHC II類抗原決定基可具有5'連接子、3'連接子或兩者均不具有。
啟動子核酸序列P及/或P2可與RNA α病毒主鏈所提供之啟動子核酸序列相同。舉例而言，由RNA α病毒主鏈提供之啟動子序列Pn及P2可各自包含26S次基因組啟動子。啟動子核酸序列P及/或P2可不同於RNA α病毒主鏈所提供之啟動子核酸序列，以及可彼此不同。
5'連接子L5可為天然序列或非天然序列。非天然序列包括但不限於AAY、RR及DPP。3'連接子L3亦可為天然序列或非天然序列。另外，L5及L3可兩者均為天然序列，兩者均為非天然序列，或一者可為天然的且另一者可為非天然的。對於各X，胺基酸連接子可為2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100或更多個胺基酸長。對於各X，胺基酸連接子亦可為至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25、至少26、至少27、至少28、至少29、或至少30個胺基酸長。
對於各Y，胺基酸連接子G5可為2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100或更多個胺基酸長。對於各Y，胺基酸連接子亦可為至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25、至少26、至少27、至少28、至少29、或至少30個胺基酸長。
胺基酸連接子G3可為2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100或更多個胺基酸長。G3亦可為至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25、至少26、至少27、至少28、至少29、或至少30個胺基酸長。
對於各X，各N可編碼7-15個胺基酸長之MHC I類抗原決定基。對於各X，各N亦可編碼5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30個胺基酸長之MHC I類抗原決定基。對於各X，各N亦可編碼至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25、至少26、至少27、至少28、至少29或至少30個胺基酸長之MHC I類抗原決定基。
編碼有效負載核酸序列之卡匣可為700個核苷酸或更少。編碼有效負載核酸序列之卡匣可為700個核苷酸或更少，且編碼2個不同的抗原決定基編碼核酸序列。編碼有效負載核酸序列之卡匣可為700個核苷酸或更少，且編碼至少2個不同的抗原決定基編碼核酸序列。編碼有效負載核酸序列之卡匣可為700個核苷酸或更少，且編碼3個不同的抗原決定基編碼核酸序列。編碼有效負載核酸序列之卡匣可為700個核苷酸或更少，且編碼至少3個不同的抗原決定基編碼核酸序列。編碼有效負載核酸序列之卡匣可為700個核苷酸或更少，且包括1-10、1-5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多個抗原。
編碼有效負載核酸序列之卡匣之長度可在375-700個核苷酸之間。編碼有效負載核酸序列之卡匣之長度可在375-700個核苷酸之間，且編碼2個不同的抗原決定基編碼核酸序列。編碼有效負載核酸序列之卡匣長度可在375-700個核苷酸之間，且編碼至少2個不同的抗原決定基編碼核酸序列。編碼有效負載核酸序列之卡匣之長度可在375-700個核苷酸之間，且編碼3個不同的抗原決定基編碼核酸序列。編碼有效負載核酸序列之卡匣之長度在375-700個核苷酸之間，且編碼至少3個不同的抗原決定基編碼核酸序列。編碼有效負載核酸序列之卡匣長度可在375-700個核苷酸之間，且包括1-10、1-5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多個抗原。
編碼有效負載核酸序列之卡匣之長度可為600、500、400、300、200或100個核苷酸或更少。編碼有效負載核酸序列之卡匣之長度可為600、500、400、300、200或100個核苷酸或更少，且編碼2個不同的抗原決定基編碼核酸序列。編碼有效負載核酸序列之卡匣之長度可為600、500、400、300、200或100個核苷酸或更少，且編碼至少2個不同的抗原決定基編碼核酸序列。編碼有效負載核酸序列之卡匣之長度可為600、500、400、300、200或100個核苷酸或更少，且編碼3個不同的抗原決定基編碼核酸序列。編碼有效負載核酸序列之卡匣之長度可為600、500、400、300、200或100個核苷酸或更少，且編碼至少3個不同的抗原決定基編碼核酸序列。編碼有效負載核酸序列之卡匣長度可為600、500、400、300、200或100個核苷酸或更少，且包括1-10、1-5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多個抗原。
編碼有效負載核酸序列之卡匣之長度可為375-600個、375-500個、或375-400個核苷酸。編碼有效負載核酸序列之卡匣之長度可為375-600個、375-500個、或375-400個核苷酸，且編碼2個不同的抗原決定基編碼核酸序列。編碼有效負載核酸序列之卡匣之長度可為375-600個、375-500個、或375-400個核苷酸，且編碼至少2個不同的抗原決定基編碼核酸序列。編碼有效負載核酸序列之卡匣之長度可為375-600個、375-500個、或375-400個核苷酸，且編碼3個不同的抗原決定基編碼核酸序列。編碼有效負載核酸序列之卡匣之長度可為375-600個、375-500個、或375-400個核苷酸，且編碼至少3個不同的抗原決定基編碼核酸序列。編碼有效負載核酸序列之卡匣之長度可為375-600個、375-500個、或375-400個核苷酸，且包括1-10、1-5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多個抗原。V.A.2    TET 啟動子系統
本文亦揭示病毒載體，其包含具有至少一個有效負載序列、可操作地連接於可調控啟動子之至少一個啟動子序列之卡匣，該可調控啟動子為TET啟動子系統，諸如TET-On系統或TET-Off系統。不希望受理論束縛，TET啟動子系統可用於在病毒產生期間最小化卡匣中編碼之有效負載核酸(諸如疫苗卡匣中編碼之抗原)之轉錄。TET啟動子系統可包括四環素(TET)阻遏蛋白(TETr)控制之啟動子。因此，本文亦揭示病毒載體，其包含具有至少一個有效負載序列、可操作地連接於四環素(TET)阻遏蛋白(TETr)控制之啟動子之至少一個啟動子序列的卡匣。TETr序列(tTS)可包括以SEQ ID NO:63所示及/或由以SEQ ID NO:62所示之核苷酸序列編碼的胺基酸序列。TETr控制之啟動子可包括19 bp TET操縱子(TETo)序列TCCCTATCAGTGATAGAGA (SEQ ID NO: 60)。TETr控制之啟動子可包括2、3、4、5、6、7、8、9或10個或更多個TETo核酸序列。在TETr控制之啟動子中有2個或更多個TETo核酸序列，可將TETo序列連接在一起。在TETr控制之啟動子中有2個或更多個TETo核酸序列，可將TETo序列直接連接在一起。在TETr控制之啟動子中有2個或更多個TETo核酸序列，可將TETo序列利用連接子序列連接在一起，諸如具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個或更多個核苷酸之連接子序列。在一個實例中，連接子序列具有以SEQ ID NO:61所示之連接子核苷酸序列。通常，TETr控制之啟動子可使用所需之任何啟動子序列，諸如SV40、EF-1、RSV、PGK、HSA、MCK或EBV啟動子序列。TETr控制之啟動子可使用CMV啟動子序列。TETr控制之啟動子可使用最小CMV啟動子序列。TETo序列可在啟動子序列區之上游(5')，其中RNA聚合酶結合。在說明性實例中，7個TETo序列在啟動子序列之上游(5')。可操作地連接於至少一個有效負載核酸序列且在啟動子序列區上游具有TETo序列之TETr控制之啟動子可具有以下式描述之有序序列，自5'至3'：(T-LY )X -P-N 其中N為有效負載核酸序列，P為可操作地連接於有效負載核酸序列之啟動子序列的RNA聚合酶結合序列，T為包含以SEQ ID NO:60所示之核苷酸序列之TETo核酸序列，L為連接子序列，其中對於各X，Y = 0或1，且其中X = 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20。在說明性實例中，X = 7且對於各X之Y = 1描述其中7個TETo序列在啟動子序列之上游(5')且各TETo序列由連接子隔開。
TETo序列可在啟動子序列區之下游(3')，其中RNA聚合酶結合。在另一個說明性實例中，2個TETo序列在啟動子序列之下游(3')。可操作地連接於至少一個有效負載核酸序列且在啟動子序列區下游具有TETo序列之TETr控制之啟動子可具有以下式描述之有序序列，自5'至3'：P-(T-LY )X -N 其中N為有效負載核酸序列，P為可操作地連接於有效負載核酸序列之啟動子序列的RNA聚合酶結合序列，T為包含以SEQ ID NO:60所示之核苷酸序列之TETo核酸序列，L為連接子序列，其中對於各X，Y = 0或1，且其中X = 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20。在說明性實例中，X = 2且對於各X之Y = 1描述其中2個TETo序列在啟動子序列之下游(3')且各TETo序列由連接子隔開。
具有TETr控制之啟動子之載體的病毒產生可使用經工程改造以表現TETr序列(tTS)之任何病毒生產細胞株，諸如經工程改造以表現tTS之293細胞株或其衍生物(例如293F細胞株)。在表現tTS之細胞中具有TETr控制之啟動子之載體的病毒產生可改善病毒產生。在表現tTS之細胞中具有TETr控制之啟動子之載體的病毒產生可提高病毒感染性，定義為每個感染單位(IU)之病毒粒子(VP)。在表現tTS之細胞中具有TETr控制之啟動子之載體的病毒產生可提高病毒產量及/或病毒感染性，相對於在非tTS表現細胞中之產生，提高至少1.5倍、至少2倍、至少2.5倍、至少3倍、至少3.5倍、至少4倍、至少4.5倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍、至少8倍、至少9倍或至少10倍。在表現tTS之細胞中具有TETr控制之啟動子之載體的病毒產生可提高病毒產量及/或病毒感染性，相對於在非tTS表現細胞中之產生，提高至少15倍、至少20倍、至少25倍、至少30倍、至少35倍、至少40倍、至少45倍、至少50倍、至少60倍、至少70倍、至少80倍、至少90倍或至少100倍。在表現tTS之細胞中具有TETr控制之啟動子之載體的病毒產生可提高病毒產量及/或病毒感染性，相對於不具有TETr控制之啟動子之載體的產生，提高至少1.5倍、至少2倍、至少2.5倍、至少3倍、至少3.5倍、至少4倍、至少4.5倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍、至少8倍、至少9倍或至少10倍。在表現tTS之細胞中具有TETr控制之啟動子之載體的病毒產生可提高病毒產量及/或病毒感染性，相對於不具有TETr控制之啟動子之載體的產生，提高至少15倍、至少20倍、至少25倍、至少30倍、至少35倍、至少40倍、至少45倍、至少50倍、至少60倍、至少70倍、至少80倍、至少90倍或至少100倍。V.B. 免疫檢查點
本文所描述之載體，諸如本文所描述之C68載體或本文所描述之α病毒載體，可包含編碼至少一個抗原之核酸且相同或單獨載體可包含編碼至少一個結合及阻斷免疫檢查點分子之活性的免疫調節因子(例如諸如scFv之抗體)之核酸。載體可包含卡匣及一或多個編碼檢查點抑制劑之核酸分子。
阻斷或抑制可靶向之說明性免疫檢查點分子包括(但不限於) CTLA-4、4-1BB (CD137)、4-1BBL (CD137L)、PDL1、PDL2、PD1、B7-H3、B7-H4、BTLA、HVEM、TIM3、GAL9、LAG3、TIM3、B7H3、B7H4、VISTA、KIR、2B4 (屬於分子之CD2家族，且在所有NK、γδ及記憶CD8+ (αβ) T細胞上表現)、CD160 (亦稱為BY55)及CGEN-15049。免疫檢查點抑制劑包括結合於以下中之一或多者及阻斷或抑制以下中之一或多者的活性的抗體或其抗原結合片段或其他結合蛋白：CTLA-4、PDL1、PDL2、PD1、B7-H3、B7-H4、BTLA、HVEM、TIM3、GAL9、LAG3、TIM3、B7H3、B7H4、VISTA、KIR、2B4、CD160及CGEN-15049。說明性免疫檢查點抑制劑包括曲美單抗(CTLA-4阻斷抗體)、抗OX40、PD-L1單株抗體(抗B7-H1；MEDI4736)、伊匹單抗、MK-3475 (PD-1阻斷劑)、納武單抗(Nivolumab) (抗PD1抗體)、CT-011(抗PD1抗體)、BY55單株抗體、AMP224 (抗PDL1抗體)、BMS-936559 (抗PDL1抗體)、MPLDL3280A(抗PDL1抗體)、MSB0010718C (抗PDL1抗體)及易沃伊(Yervoy)/伊匹單抗(抗CTLA-4檢查點抑制劑)。抗體編碼序列可使用此項技術中之普通技能經工程改造至諸如C68之載體中。例示性方法描述於Fang 等人, Stable antibody expression at therapeutic levels using the 2A peptide.Nat Biotechnol . 2005年5月;23(5):584-90. 電子版2005年4月17日中；其以引用的方式併入本文中用於所有目的。V.C. 疫苗設計及製造的額外考慮 V.C.1. 判定覆蓋所有腫瘤次純系之肽集合
軀幹肽，意指由所有或大部分腫瘤次純系呈現之彼等肽，可優先包括於疫苗中。53 視情況，若不存在經預測以高機率呈現且具有免疫原性之軀幹肽，或若經預測以高機率呈現且具有免疫原性之軀幹肽的數目足夠小以致額外非軀幹肽可包括於疫苗中，則其他肽可藉由估計腫瘤次純系之數目及身分且選擇肽以使疫苗所覆蓋之腫瘤次純系之數目達到最大而進行優先排序54 。V.C.2. 抗原優先排序
在應用所有上述抗原過濾之後，可能仍有比疫苗技術可支撐的更多的候選抗原可用於疫苗包涵。另外，可保留關於抗原分析之各個態樣的不確定性，且候選疫苗抗原之不同特性之間可存在折衷。因此，可考慮整合式多維模型代替選擇過程之各步驟中的預定過濾器，將候選新抗原置於具有至少以下軸之空間中且使用整合方法優化選擇。 1.    自體免疫或耐受性之風險(生殖系之風險) (自體免疫之風險較低通常為較佳的) 2.    定序偽影之機率(偽影之機率較低通常為較佳的) 3.    免疫原性之機率(免疫原性之機率較高通常為較佳的) 4.    呈現之機率(呈現之機率較高通常為較佳的) 5.    基因表現(較高表現通常為較佳的) 6.    HLA基因之覆蓋率(參與抗原集合呈現之HLA分子數目愈大可降低腫瘤經由HLA分子之下調或突變逃避免疫攻擊的機率) 7.    HLA類別之覆蓋率(覆蓋HLA-I及HLA-II兩者可增加治療反應之機率且降低腫瘤逃避之機率)
另外，視情況，若預測抗原由在患者腫瘤或受感染細胞之全部或一部分中損失或失活之HLA對偶基因呈現，則可自疫苗接種去除該等抗原之優先排序(例如排除該等抗原)。HLA對偶基因損失可藉由體細胞突變、雜合性缺失或基因座之同型接合缺失發生。用於偵測HLA對偶基因體細胞突變之方法為此項技術中所熟知，例如(Shukla等人，2015)。用於偵測體細胞LOH及同型接合缺失(包括HLA基因座)之方法同樣經充分描述。(Carter等人, 2012；McGranahan等人, 2017；Van Loo等人, 2010)。若質譜資料表明所預測之抗原未被預測之HLA對偶基因呈現，則亦可去除抗原之優先排序。V.D. α 病毒 V.D.1. α 病毒生物學
α病毒為披膜病毒科之成員，且為正義單股RNA病毒。成員通常分類為舊世界，諸如辛德畢斯、羅斯河、馬雅羅、基孔肯雅及塞姆利基森林病毒，或新世界，諸如東部馬腦炎、奧拉、摩根堡、或委內瑞拉馬腦炎及其衍生病毒株TC-83 (Strauss Microbrial Review 1994)。天然α病毒基因組通常約12kb長，其中前三分之二含有編碼非結構蛋白(nsP)之基因，該等非結構蛋白形成用於病毒基因組自我複製之RNA複製複合物，且最後三分之一含有編碼用於病毒粒子產生之結構蛋白的亞基因组表現卡匣(Frolov RNA 2001)。
α 病毒之模型生命週期涉及數個不同步驟(Strauss Microbrial Review 1994, Jose Future Microbiol 2009)。在病毒附著於宿主細胞後，病毒粒子與內飲區室內之膜融合，導致基因組RNA最終釋放至細胞溶質中。以正股定向且包含5'甲基鳥苷酸帽及3' polyA尾部之基因組RNA經轉譯以產生形成複製複合物之非結構蛋白nsP1-4。在感染早期，正股隨後由複合物複製成負股模板。在當前模型中，複製複合物隨著感染進展被進一步加工，使得所得經加工之複合物轉換成將負股轉錄成全長正股基因組RNA以及含有結構基因之26S亞基因组正股RNA。α病毒之數個保守序列元件(CSE)已鑑別為可能在各種RNA複製步驟中起作用，包括：負股模板之正股RNA複製中的5' UTR的互補序列、基因組模板之負股合成複製中的51-nt CSE、負股之亞基因组RNA轉錄中的在nsP與26S RNA之間的接合區中的24-nt CSE、及正股模板之負股合成中的3' 19-nt CSE。
在各種RNA物種複製後，病毒粒子隨後通常在病毒之天然生命週期中組裝。26S RNA經轉譯且所得蛋白質經進一步加工以產生結構蛋白，其包括衣殼蛋白、醣蛋白E1及E2以及兩個小多肽E3及6K (Strauss 1994)。發生病毒RNA之衣殼化，衣殼蛋白通常僅特異性針對所包裝之基因組RNA，隨後病毒粒子集裝且在膜表面出芽。V.D.2. 作為遞送載體之 α 病毒
α病毒(包括α病毒序列、特徵及其他元件)可用於產生基於α病毒之遞送載體(亦稱為α病毒載體、α病毒病毒載體、α病毒疫苗載體、自我複製RNA (srRNA)載體或自放大RNA (samRNA)載體)。α病毒先前已經工程改造以用作表現載體系統(Pushko 1997, Rheme 2004)。α病毒提供數種優勢，特別是在可能需要異源抗原表現之疫苗環境中。由於在宿主細胞溶質中自我複製的能力，故α病毒載體一般能夠在細胞內產生高複本數之表現卡匣，從而導致高水準異源抗原產生。另外，載體一般為瞬時的，從而使得生物安全性得以改良以及減少對載體之免疫耐受性的誘發。與其他標準病毒載體(諸如人類腺病毒)相比，公眾一般亦缺乏對α病毒載體預先存在的免疫性。基於α病毒之載體亦一般導致對經感染細胞的細胞毒性反應。在一定程度上，細胞毒性在疫苗環境中對於適當引發對所表現之異源抗原的免疫反應可為重要的。然而，所需細胞毒性之程度可為平衡作用，且因此已開發數種減毒α病毒，包括VEE之TC-83病毒株。因此，本文所述之抗原表現載體之實例可利用α病毒主鏈，其允許高水準之抗原表現、引發對抗原之穩固免疫反應、不引發對載體本身之免疫反應，且可以安全方式使用。此外，抗原表現卡匣可經設計以經由優化載體使用之α病毒序列(包括但不限於源自VEE或其減毒衍生物TC-83之序列)而引發不同水準之免疫反應。
已使用α病毒序列工程改造數種表現載體設計策略(Pushko 1997)。在一個策略中，α病毒載體設計包括在結構蛋白基因下游插入26S啟動子序列元件之第二複本，隨後為異源基因(Frolov 1993)。因此，除天然非結構蛋白及結構蛋白之外，亦產生表現異源蛋白之額外亞基因组RNA。在此系統中，存在用於產生感染性病毒粒子之所有元件，且因此可能發生在未感染細胞中反覆輪表現載體之感染。
另一種表現載體設計利用輔助病毒系統(Pushko 1997)。在此策略中，結構蛋白由異源基因替代。因此，在由仍完整之非結構基因介導病毒RNA之自我複製之後，26S亞基因组RNA提供異源蛋白之表現。傳統上，表現結構蛋白之額外載體隨後諸如藉由細胞株之共轉染以反式供應，以產生感染性病毒。系統詳細描述於USPN 8,093,021中，其出於所有目的以全文引用的方式併入本文中。輔助載體系統提供限制形成感染性顆粒之可能性的益處，因此提高生物安全性。另外，輔助載體系統減小總載體長度，潛在提高複製及表現效率。因此，本文所述之抗原表現載體之實例可利用結構蛋白由卡匣替代之α病毒主鏈，所得載體降低生物安全問題，同時由於整體表現載體尺寸減小而促進有效表現。V.D.3. 活體外 α 病毒產生
α病毒遞送載體一般為正義RNA聚核苷酸。此項技術中熟知的用於產生RNA之便利技術為活體外轉錄IVT。在此技術中，首先藉由熟習此項技術者熟知的技術產生所需載體之DNA模板，包括標準分子生物學技術，諸如選殖、限制性消化、連接、基因合成及聚合酶鏈式反應(PCR)。DNA模板在期望轉錄成RNA之序列的5'端處含有RNA聚合酶啟動子。啟動子包括(但不限於)噬菌體聚合酶啟動子，諸如T3、T7或SP6。DNA模板隨後與適當RNA聚合酶、緩衝劑及核苷酸(NTP)一起培育。所得RNA聚核苷酸可視情況經進一步修飾，包括(但不限於)添加5'帽結構，諸如7-甲基鳥苷或相關結構，且視情況修飾3'端以包括聚腺苷酸(polyA)尾部。RNA可隨後使用本領域中熟知的技術純化，諸如苯酚-氯仿提取。V.D.4. 經由脂質奈米粒子遞送
在疫苗載體設計中考慮之一重要態樣為針對載體本身之免疫性(Riley 2017)。此可呈對載體本身(諸如某些人類腺病毒系統)預先存在的免疫性形式，或呈在疫苗投與後對載體產生免疫性之形式。若進行相同疫苗之多次投藥(諸如分開的初始及增強劑量)，或若使用相同疫苗載體系統遞送不同卡匣，則後者為重要的考慮因素。
在α病毒載體之情況下，標準遞送方法為先前論述之輔助病毒系統，其以反式提供衣殼、E1及E2蛋白質以產生感染性病毒粒子。然而，重要的是注意E1及E2蛋白質通常為中和抗體之主要靶標(Strauss 1994)。因此，若中和抗體靶向感染性粒子，則使用α病毒載體遞送所關注之抗原至靶細胞的功效可能會降低。
病毒粒子介導之基因遞送的替代方案為使用奈米材料遞送表現載體(Riley 2017)。重要的是，奈米材料載具可由非免疫原性材料製成且一般避免引發對遞送載體本身之免疫性。此等材料可包括(但不限於)脂質、無機奈米材料及其他聚合材料。脂質可為陽離子、陰離子或中性的。材料可為合成或天然來源的，且在一些情況下為可生物降解的。脂質可包括脂肪、膽固醇、磷脂、脂質結合物，包括(但不限於)聚乙二醇(PEG)結合物(聚乙二醇化脂質)、蠟、油、甘油酯及脂溶性維生素。
脂質奈米粒子(LNP)為有吸引力的遞送系統，因為脂質之兩親媒性使得能夠形成膜及囊泡狀結構(Riley 2017)。一般而言，此等囊泡藉由吸收至靶細胞之膜中且將核酸釋放至細胞溶質中來遞送表現載體。另外，LNP可經進一步修飾或官能化以有助於靶向特定細胞類型。LNP設計中之另一考慮因素為靶向效率與細胞毒性之間的平衡。脂質組合物一般包括陽離子、中性、陰離子及兩性脂質之確定的混合物。在一些情況下，包括特定脂質以防止LNP聚集、防止脂質氧化、或提供有助於額外部分附著之功能性化學基團。脂質組合物可影響整體LNP大小及穩定性。在一實例中，脂質組合物包含二亞油基甲基-4-二甲基胺基丁酸酯(MC3)及MC3樣分子。MC3及MC3樣脂質組合物可經調配以包括一或多種其他脂質，諸如PEG或PEG結合之脂質、固醇或中性脂質。
直接暴露於血清之核酸載體(諸如表現載體)可具有數種不期望之結果，包括核酸由血清核酸酶降解或游離核酸對免疫系統之脫靶刺激。因此，囊封α病毒載體可用於避免降解，同時亦避免潛在的脫靶影響。在某些實例中，α病毒載體完全囊封在遞送載具內，諸如在LNP之含水內部。α病毒載體囊封在LNP內可藉由熟習此項技術者熟知的技術來進行，諸如在微流體液滴生成裝置上進行的微流體混合及液滴生成。此類裝置包括(但不限於)標準T形接頭裝置或流動聚焦裝置。在一實例中，所需脂質調配物(諸如含有MC3或MC3樣之組合物)與α病毒遞送載體及其他所需藥劑並行提供至液滴生成裝置，使得遞送載體及所需藥劑完全囊封在基於MC3或MC3樣之LNP內部。在一實例中，液滴生成裝置可控制所產生之LNP的尺寸範圍及尺寸分佈。舉例而言，LNP之尺寸可在1至1000奈米直徑範圍內，例如1、10、50、100、500或1000奈米。在液滴生成後，囊封表現載體之遞送載具可經進一步處理或修飾以使其準備用於投與。V.E. 黑猩猩腺病毒 (ChAd) V.E.1. 用黑猩猩腺病毒遞送病毒
用於遞送一或多種抗原(例如經由編碼一或多種抗原或新抗原之卡匣)之疫苗組合物可藉由提供黑猩猩來源之腺病毒核酸序列、多種新穎載體及表現黑猩猩腺病毒基因之細胞株來產生。黑猩猩C68腺病毒(在本文中亦稱為ChAdV68)之核酸序列可用於抗原遞送之疫苗組合物中(參見SEQ ID NO:1)。源自C68腺病毒之載體的使用進一步詳細描述於USPN 6,083,716中，其出於所有目的以全文引用的方式併入本文中。
在另一態樣中，本文提供包含黑猩猩腺病毒之DNA序列之重組腺病毒(諸如C68)及以操作方式連接至引導其表現之調控序列的卡匣。重組病毒能夠感染哺乳動物細胞、較佳人類細胞，且能夠在細胞中表現卡匣有效負載。在此載體中，天然黑猩猩E1基因及/或E3基因及/或E4基因可缺失。卡匣可插入至此等基因缺失位點中之任一者中。卡匣可包括抗原，針對其激活之免疫反應為所需的。
在另一態樣中，本文提供一種經黑猩猩腺病毒(諸如C68)感染之哺乳動物細胞。
在另一態樣中，提供一種新穎的哺乳動物細胞株，其表現黑猩猩腺病毒基因(例如來自C68)或其功能片段。
在另一態樣中，本文提供一種用於將卡匣遞送至哺乳動物細胞中之方法，其包括以下步驟：向細胞中引入有效量之已經工程改造以表現卡匣之黑猩猩腺病毒，諸如C68。
另一態樣提供一種用於在哺乳動物宿主中引發免疫反應以治療癌症之方法。該方法可包含向宿主投與有效量之重組黑猩猩腺病毒，諸如C68之步驟，該重組黑猩猩腺病毒包含卡匣，該卡匣編碼免疫反應靶向之來自腫瘤之一或多個抗原。
另一態樣提供一種用於在哺乳動物宿主中引發免疫反應以治療或預防個體之疾病、諸如感染性疾病的方法。該方法可包括對該宿主投與有效量之重組黑猩猩腺病毒、諸如C68之步驟，該重組黑猩猩腺病毒包含編碼一或多種抗原之抗原卡匣，該等抗原諸如來自免疫反應靶向之感染性疾病。
亦揭示一種非猿猴哺乳動物細胞，其表現獲自SEQ ID NO:1序列之黑猩猩腺病毒基因。該基因可選自由以下組成之群：SEQ ID NO:1之腺病毒E1A、E1B、E2A、E2B、E3、E4、L1、L2、L3、L4及L5。
亦揭示一種包含黑猩猩腺病毒DNA序列之核酸分子，該黑猩猩腺病毒DNA序列包含獲自SEQ ID NO:1序列之基因。該基因可選自由以下組成之群：SEQ ID NO:1之該等黑猩猩腺病毒E1A、E1B、E2A、E2B、E3、E4、L1、L2、L3、L4及L5基因。在一些態樣中，核酸分子包含SEQ ID NO:1。在一些態樣中，核酸分子包含SEQ ID NO:1序列，缺少選自由以下組成之群的至少一個基因：SEQ ID NO:1 之E1A、E1B、E2A、E2B、E3、E4、L1、L2、L3、L4及L5基因。
亦揭示一種載體，其包含獲自SEQ ID NO:1之黑猩猩腺病毒DNA序列及可操作地連接於一或多個調控序列之卡匣，該一或多個調控序列引導卡匣在異源宿主細胞中之表現，視情況其中該黑猩猩腺病毒DNA序列包含至少用於複製及病毒粒子衣殼化所必需之順式元件，該等順式元件側接卡匣及調控序列。在一些態樣中，黑猩猩腺病毒DNA序列包含選自由以下組成之群的基因：SEQ ID NO:1之E1A、E1B、E2A、E2B、E3、E4、L1、L2、L3、L4及L5基因序列。在一些態樣中，載體可缺乏E1A及/或E1B基因。
本文亦揭示經本文所揭示之載體轉染之宿主細胞，該載體諸如經工程改造以表現卡匣之C68載體。本文亦揭示經由將本文所揭示之載體引入細胞中而表現其中引入之所選擇之基因的人類細胞。
本文亦揭示一種腺病毒載體，其包含：部分缺失之E4基因，其包括缺失或部分缺失之E4orf2區及缺失或部分缺失之E4orf3區，及視情況存在之缺失或部分缺失之E4orf4區。該部分缺失之E4可包含以SEQ ID NO:1所示之序列的至少核苷酸34,916至35,642之E4缺失，且其中該載體包含以SEQ ID NO:1所示之序列的至少核苷酸之2至36,518。該部分缺失之E4可包含以SEQ ID NO:1所示之序列的核苷酸34,916至34,942之至少部分缺失、以SEQ ID NO:1所示之序列的核苷酸34,952至35,305之至少部分缺失及以SEQ ID NO:1所示之序列的核苷酸35,302至35,642之至少部分缺失的E4缺失，且其中該載體包含以SEQ ID NO:1所示之序列的至少核苷酸2至36,518。該部分缺失之E4可包含以SEQ ID NO:1所示之序列的至少核苷酸34,980至36,516之E4缺失，且其中該載體包含以SEQ ID NO:1所示之序列的至少核苷酸2至36,518。該部分缺失之E4可包含以SEQ ID NO:1所示之序列的至少核苷酸34,979至35,642之E4缺失，且其中該載體包含以SEQ ID NO:1所示之序列的至少核苷酸2至36,518。該部分缺失之E4可包含以SEQ ID NO:1所示之序列的E4Orf2至少部分缺失、完全缺失E4Orf3及E4Orf4至少部分缺失之E4缺失。該部分缺失之E4可包含E4Orf2至少部分缺失、E4Orf3至少部分缺失及E4Orf4至少部分缺失之E4缺失。該部分缺失之E4可包含E4Orf1至少部分缺失、完全缺失E4Orf2及E4Orf3至少部分缺失之E4缺失。該部分缺失之E4可包含E4Orf2至少部分缺失及E4Orf3至少部分缺失之E4缺失。該部分缺失之E4可包含E4Orf1之起始位點至E4Orf5之起始位點之E4缺失。該部分缺失之E4可為E4Orf1之起始位點附近之E4缺失。該部分缺失之E4可為E4Orf2之起始位點附近之E4缺失。該部分缺失之E4可為E4Orf3之起始位點附近之E4缺失。該部分缺失之E4可為E4Orf4之起始位點附近之E4缺失。該E4缺失可為至少50、至少100、至少200、至少300、至少400、至少500、至少600、至少700、至少800、至少900、至少1000、至少1100、至少1200、至少1300、至少1400、至少1500、至少1600、至少1700、至少1800、至少1900或至少2000個核苷酸。該E4缺失可為至少700個核苷酸。該E4缺失可為至少1500個核苷酸。該E4缺失可為50個或更少、100個或更少、200個或更少、300個或更少、400個或更少、500個或更少、600個或更少、700個或更少、800個或更少、900個或更少、1000個或更少、1100個或更少、1200個或更少、1300個或更少、1400個或更少、1500個或更少、1600個或更少、1700個或更少、1800個或更少、1900個或更少或2000個或更少核苷酸。該E4缺失可為750個核苷酸或更少。該E4缺失可為至少1550個核苷酸或更少。
該部分缺失之E4基因可為以SEQ ID NO:1所示之E4基因序列，其缺少以SEQ ID NO:1所示之序列之至少核苷酸34,916至35,642。該部分缺失之E4基因可為以SEQ ID NO:1中所示之E4基因序列，其缺少以SEQ ID NO:1所示之序列之至少核苷酸34,916至34,942、核苷酸34,952至35,305，及以SEQ ID NO:1中所示之序列之核苷酸35,302至35,642。該部分缺失之E4基因可為以SEQ ID NO:1所示之E4基因序列，且缺少以SEQ ID NO:1所示之序列之至少核苷酸34,980至36,516。該部分缺失之E4基因可為以SEQ ID NO:1所示之E4基因序列，且缺少以SEQ ID NO:1所示之序列之至少核苷酸34,979至35,642。具有部分缺失之E4基因之腺病毒載體可具有卡匣，其中該卡匣包含至少一個有效負載核酸序列，且其中該卡匣包含可操作地連接於至少一個有效負載核酸序列之至少一個啟動子序列。具有部分缺失之E4基因之腺病毒載體可具有以SEQ ID NO: 1所示之ChAdV68序列之一或多個基因或調控序列，視情況其中該一或多個基因或調控序列包含以SEQ ID NO: 1所示之序列之黑猩猩腺病毒反向末端重複序列(ITR)、E1A、E1B、E2A、E2B、E3、E4、L1、L2、L3、L4及L5基因中的至少一者。具有部分缺失之E4基因之腺病毒載體可具有以SEQ ID NO:1所示之序列之核苷酸2至34,916，其中該部分缺失之E4基因為核苷酸2至34,916之3'，且視情況該等核苷酸2至34,916另外缺少以SEQ ID NO:1所示之序列之核苷酸577至3403，對應於E1缺失，及/或缺少以SEQ ID NO:1所示之序列之核苷酸27,125至31,825，對應於E3缺失。具有部分缺失之E4基因之腺病毒載體可具有以SEQ ID NO:1所示之序列之核苷酸35,643至36,518，且其中該部分缺失之E4基因為核苷酸35,643至36,518之5'。具有部分缺失之E4基因之腺病毒載體可具有以SEQ ID NO:1所示之序列之核苷酸2至34,916，其中該部分缺失之E4基因為核苷酸2至34,916之3'，該等核苷酸2至34,916另外缺少以SEQ ID NO:1所示之序列之核苷酸577至3403，對應於E1缺失，及缺少以SEQ ID NO:1所示之序列之核苷酸27,125至31,825，對應於E3缺失。具有部分缺失之E4基因之腺病毒載體可具有以SEQ ID NO:1所示之序列之核苷酸2至34,916，其中該部分缺失之E4基因為核苷酸2至34,916之3'，該等核苷酸2至34,916另外缺少以SEQ ID NO:1所示之序列之核苷酸577至3403，對應於E1缺失，及缺少以SEQ ID NO:1所示之序列之核苷酸27,125至31,825，對應於E3缺失，且具有以SEQ ID NO:1所示之序列之核苷酸35,643至36,518，且其中該部分缺失之E4基因為核苷酸35,643至36,518之5'。
該部分缺失之E4基因可為以SEQ ID NO:1所示之E4基因序列，其缺少以SEQ ID NO:1所示之序列之至少核苷酸34,916至35,642、以SEQ ID NO:1所示之序列之核苷酸2至34,916，其中該部分缺失之E4基因為核苷酸2至34,916之3'，該等核苷酸2至34,916另外缺少以SEQ ID NO:1所示之序列之核苷酸577至3403，對應於E1缺失，及缺少以SEQ ID NO:1所示之序列之核苷酸27,125至31,825，對應於E3缺失，且具有以SEQ ID NO:1所示之序列之核苷酸35,643至36,518，且其中該部分缺失之E4基因為核苷酸35,643至36,518之5'。
具有部分缺失之E4基因之腺病毒載體可具有
本文亦揭示一種用於將卡匣遞送至哺乳動物細胞之方法，其包含向該細胞中引入有效量之本文所揭示之載體，諸如經工程改造以表現卡匣之C68載體。
本文亦揭示一種用於產生之方法，其包含將本文所揭示之載體引入哺乳動物細胞中，在適合之條件下培養細胞且產生抗原。V.E.2. 表現 E1 之互補細胞株
為產生缺失本文所述之基因中之任一者的重組黑猩猩腺病毒(Ad)，缺失基因區之功能若對於病毒之複製及感染性必不可少，則可藉由輔助病毒或細胞株(亦即互補或包裝細胞株)供應至重組病毒。舉例而言，為產生複製缺陷型黑猩猩腺病毒載體，可使用表現人類或黑猩猩腺病毒之E1基因產物的細胞株；此類細胞株可包括HEK293或其變異體。可遵循產生表現黑猩猩E1基因產物之細胞株的方案(USPN 6,083,716之實例3及4)，以產生表現任何所選擇之黑猩猩腺病毒基因的細胞株。
AAV增強分析可用於鑑別表現黑猩猩腺病毒E1之細胞株。此分析用於鑑別藉由使用例如來自其他物種之其他未表徵之腺病毒的E1基因製備的細胞株中的E1功能。該分析描述於USPN 6,083,716之實例4B中。
所選擇之黑猩猩腺病毒基因(例如E1)可在啟動子之轉錄控制下用於在所選擇之親本細胞株中表現。誘發型或組成型啟動子可用於此目的。在誘發型啟動子中包括可由鋅誘發之綿羊金屬硫蛋白啟動子，或可由糖皮質激素、特別是地塞米松(dexamethasone)誘發之小鼠乳腺腫瘤病毒(MMTV)啟動子。其他誘發型啟動子，諸如以引用的方式併入本文中之國際專利申請案WO95/13392中所鑑別之彼等誘發型啟動子，亦可用於產生包裝細胞株。亦可採用控制黑猩猩腺病毒基因表現之組成型啟動子。
親本細胞可經選擇以產生表現任何所需C68基因之新穎細胞株。此類親本細胞株可為(但不限於) HeLa [ATCC寄存編號CCL 2]、A549 [ATCC寄存編號CCL 185]、KB [CCL 17]、Detroit [例如Detroit 510、CCL 72]及WI-38 [CCL 75]細胞。其他適合之親本細胞株可獲自其他來源。親本細胞株可包括CHO、HEK293或其變異體、911、HeLa、A549、LP-293、PER.C6或AE1-2a。
表現E1之細胞株可用於產生重組黑猩猩腺病毒E1缺失之載體。使用基本上相同的程序構築之表現一或多種其他黑猩猩腺病毒基因產物的細胞株用於產生缺失編碼彼等產物之基因的重組黑猩猩腺病毒載體。另外，表現其他人類Ad E1基因產物之細胞株亦用於產生黑猩猩重組Ad。V.E.3. 作為載體之重組病毒粒子
本文所揭示之組合物可包含病毒載體，其將至少一種抗原遞送至細胞。此類載體包含黑猩猩腺病毒DNA序列(諸如C68)及可操作地連接於引導卡匣表現之調控序列的卡匣。C68載體能夠在經感染之哺乳動物細胞中表現卡匣。C68載體可功能性缺失一或多個病毒基因。卡匣包含至少一個在一或多個調控序列(諸如啟動子)控制下的抗原。視情況選用之輔助病毒及/或包裝細胞株可向黑猩猩病毒載體供應缺失之腺病毒基因的任何必需產物。
術語「功能性缺失」意指移除或以其他方式改變(例如藉由突變或修飾)足夠量的基因區，使得基因區不再能夠產生一或多種基因表現之功能性產物。可導致功能性缺失之突變或修飾包括但不限於無義突變，諸如引入提前終止密碼子及移除典型及非典型的起始密碼子，改變mRNA剪接或其他轉錄加工之突變，或其組合。若需要，可移除整個基因區。
形成本文所揭示之載體的核酸序列之修飾，包括序列缺失、插入及其他突變，可使用標準分子生物學技術產生且在本發明之範疇內。V.E.4. 病毒質體載體之構築
用於本發明之黑猩猩腺病毒C68載體包括重組缺陷型腺病毒，亦即在E1a或E1b基因中功能性缺失且視情況攜帶其他突變(例如其他基因中之溫度敏感性突變或缺失)的黑猩猩腺病毒序列。預期此等黑猩猩序列亦用於形成來自其他腺病毒及/或腺相關病毒序列之雜交載體。由人類腺病毒製備之同源腺病毒載體描述於公開的文獻中[參見例如上文所引用之Kozarsky I 及II，及其中列舉之參考文獻，美國專利第5,240,846號]。
在構築用於將卡匣遞送至人類(或其他哺乳動物)細胞之有用黑猩猩腺病毒C68載體中，可將一系列腺病毒核酸序列用於載體。包含最小黑猩猩C68腺病毒序列之載體可與輔助病毒結合使用以產生感染性重組病毒粒子。輔助病毒提供最小黑猩猩腺病毒載體之病毒感染性及繁殖所需的基本基因產物。當在另外的功能性病毒載體中僅產生黑猩猩腺病毒基因之一或多個所選擇之缺失時，可藉由在所選擇之包裝細胞株中繁殖病毒而在病毒載體生產過程中供應缺失的基因產物，該包裝細胞株提供反式缺失之基因功能。V.E.5. 重組最小腺病毒
最小的黑猩猩Ad C68病毒為僅含有複製及病毒粒子衣殼化所必需之腺病毒順式元件的病毒粒子。亦即，載體含有腺病毒之順式作用5'及3'反向末端重複(ITR)序列(其充當複製起點)及天然5'包裝/強化子結構域(其含有用於包裝線性Ad基因組所必需的序列及E1啟動子之強化子元件)。參見例如在國際專利申請案WO96/13597中所描述且以引用的方式併入本文中的用於製備「最小」人類Ad載體之技術。V.E.6. 其他缺陷型腺病毒
重組複製缺乏型腺病毒亦可比最小黑猩猩腺病毒序列含有更多。此等其他Ad載體可藉由病毒基因區之各個部分的缺失及藉由視情況使用輔助病毒及/或包裝細胞株形成的感染性病毒粒子來表徵。
作為一個實例，適合之載體可藉由使C68腺病毒立即早期基因E1a及延遲早期基因E1b之全部或足夠部分缺失來形成，從而消除其正常的生物功能。當在含有提供相應反式基因產物之功能性腺病毒E1a及E1b基因的黑猩猩腺病毒轉化的互補細胞株上生長時，複製缺陷型E1缺失病毒能夠複製且產生感染性病毒。基於已知腺病毒序列之同源性，預期正如此項技術之人類重組E1缺失腺病毒，所得重組黑猩猩腺病毒能夠感染許多細胞類型且可表現抗原，但除非以極高感染倍率感染細胞，否則無法在不攜帶黑猩猩E1區DNA之大多數細胞中複製。
作為另一個實例，C68腺病毒延遲早期基因E3之全部或一部分可自形成重組病毒之一部分的黑猩猩腺病毒序列消除。
亦可構築具有E4基因缺失之黑猩猩腺病毒C68載體。另一個載體可在延遲早期基因E2a中含有缺失。
亦可在黑猩猩C68腺病毒基因組之晚期基因L1至L5中之任一者中獲得缺失。類似地，中間基因IX及IVa2 中之缺失可用於一些目的。可在其他結構性或非結構性腺病毒基因中獲得其他缺失。
上述缺失可單獨使用，亦即腺病毒序列可僅含有E1缺失。可替代地，可以任何組合使用有效破壞或降低其生物活性之完整基因或其部分的缺失。舉例而言，在一個例示性載體中，腺病毒C68序列可缺失E1基因及E4基因，或缺失E1、E2a及E3基因，或缺失E1及E3基因，或在缺失或不缺失E3之情況下缺失E1、E2a及E4基因等等。如上文所論述，此類缺失可與其他突變(諸如溫度敏感性突變)組合使用，以達成所需結果。
將包含抗原之卡匣視情況插入至黑猩猩C68 Ad病毒之任一缺失區中。可替代地，若需要，可將卡匣插入至現有基因區中以破壞該區之功能。V.E.7. 輔助病毒
視用於攜帶卡匣之病毒載體的黑猩猩腺病毒基因含量而定，可使用輔助腺病毒或非複製性病毒片段來提供足夠的黑猩猩腺病毒基因序列以產生含有該卡匣之感染性重組病毒粒子。
有用的輔助病毒含有所選擇之腺病毒基因序列，其不存在於腺病毒載體構築體中及/或不由載體轉染之包裝細胞株表現。輔助病毒可為複製缺陷型且除上述序列之外，亦含有多種腺病毒基因。輔助病毒可與本文所述之表現E1之細胞株組合使用。
對於C68，「輔助」病毒可為藉由用SspI剪切C68基因組之C末端形成的片段，其自病毒之左端移除約1300 bp。此經剪切之病毒隨後與質體DNA共轉染至表現E1之細胞株中，由此藉由與質體中之C68序列同源重組形成重組病毒。
輔助病毒亦可形成聚陽離子結合物，如Wu等人, J. Biol. Chem., 264:16985-16987 (1989)；K. J. Fisher及J. M. Wilson, Biochem. J., 299:49 (1994年4月1日)中所述。輔助病毒可視情況含有報導體基因。許多此類報導體基因為此項技術已知的。與腺病毒載體上之卡匣不同，輔助病毒上報導體基因之存在允許獨立地監測Ad載體及輔助病毒。此第二報導體用於純化後能夠將所得重組病毒與輔助病毒分離。V.E.8. 病毒粒子之組裝及細胞株之感染
將腺病毒之經選擇DNA序列、卡匣及其他載體元件組裝於各種中間質體及穿梭載體中，及使用質體及載體製造重組病毒粒子均可使用習知技術實現。此類技術包括cDNA之習知選殖技術、活體外重組技術(例如吉布森組裝(Gibson assembly))、腺病毒基因組之重疊寡核苷酸序列的使用、聚合酶鏈反應及提供所需核酸序列之任何適合之方法。採用標準轉染及共轉染技術，例如CaPO4沈澱技術或脂質體介導之轉染方法，諸如脂染胺。所採用之其他習知方法包括病毒基因組之同源重組、瓊脂覆層中病毒之蝕斑、量測信號產生之方法及其類似方法。
舉例而言，在構築及組裝所需含卡匣之病毒載體之後，可在輔助病毒存在下將載體轉染於包裝細胞株中。同源重組發生在輔助序列與載體序列之間，其允許載體中之腺病毒-抗原序列複製且包裝至病毒粒子衣殼中，從而產生重組病毒載體粒子。
所得重組黑猩猩C68腺病毒用於將卡匣轉移至所選擇之細胞中。在使用包裝細胞株中生長之重組病毒的活體內實驗中，E1缺失之重組黑猩猩腺病毒在將卡匣轉移至非黑猩猩(較佳人類)細胞中展現效用。V.E.9. 重組病毒載體之用途
所得含有卡匣之重組黑猩猩C68腺病毒(藉由使腺病毒載體與輔助病毒或腺病毒載體與包裝細胞株協同製備，如上文所述)因此提供可在活體內或活體外將抗原遞送至個體之有效基因轉移媒劑。
上述重組載體根據基因療法的公開方法投與人類。攜帶卡匣之黑猩猩病毒載體可投與患者，較佳懸浮於生物相容性溶液或醫藥學上可接受之遞送媒劑中。適合之媒劑包括無菌鹽水。已知為醫藥學上可接受之載劑且為熟習此項技術者所熟知的其他水性及非水性等張無菌注射溶液以及水性及非水性無菌懸浮液可用於此目的。
黑猩猩腺病毒載體係以足以轉導人類細胞且提供足夠水準之抗原轉移及表現的量投與，從而提供治療益處而無過度不良效應或具有醫學上可接受之生理效應，其可由熟習醫藥技術之人員來確定。習知及醫藥學上可接受之投藥途徑包括(但不限於)直接遞送至肝臟、鼻內、靜脈內、肌肉內、皮下、皮內、經口及其他非經腸投藥途徑。若需要，可組合投藥途徑。
病毒載體之劑量將主要取決於以下因素，諸如所治療之病況、患者之年齡、體重及健康狀況，且因此可在患者當中變化。劑量將經調節以平衡治療益處與任何副作用，且此類劑量可視採用重組載體之治療應用而變化。可監測抗原表現量以確定劑量投與頻率。
重組複製缺陷型腺病毒可以「醫藥學有效量」投與，亦即在投藥途徑中有效轉染所需細胞且提供所選擇之基因的足夠表現量以提供疫苗益處(亦即一些可量測之保護性免疫水準)的重組腺病毒之量。包含卡匣之C68載體可與佐劑共同投與。佐劑可與載體分開(例如礬)或在載體內編碼，尤其若佐劑為蛋白質。佐劑為此項技術中所熟知。
習知且醫藥學上可接受之投藥途徑包括(但不限於)鼻內、肌肉內、氣管內、皮下、皮內、經直腸、經口及其他非經腸投藥途徑。若需要，可組合或調整投藥途徑，視免疫原或疾病而定。舉例而言，在狂犬病預防中，皮下、氣管內及鼻內途徑為較佳的。投藥途徑主要將取決於所治療之疾病的性質。
可監測對抗原之免疫水準以確定是否需要增強劑。舉例而言，在評定血清中之抗體力價後，可能需要視情況增強免疫。VI. 治療及製造方法
亦提供一種藉由向個體投與一或多種抗原(諸如使用本文所揭示之方法鑑別的複數種抗原)在個體中誘發腫瘤特異性免疫反應、針對腫瘤接種疫苗、治療及/或緩解個體之癌症症狀的方法。
亦提供一種藉由向個體投與一或多種抗原(諸如使用本文所揭示之方法鑑別的複數種抗原)在個體中誘發感染性疾病生物體特異性免疫反應、針對感染性疾病生物體接種疫苗、治療及/或緩解個體之與感染性疾病生物體相關之感染症狀的方法。
在一些態樣中，個體已診斷患有癌症或處於罹患癌症之風險下。個體可為人類、犬、貓、馬或需要腫瘤特異性免疫反應之任何動物。腫瘤可為任何實體腫瘤，諸如乳房腫瘤、卵巢腫瘤、前列腺腫瘤、肺腫瘤、腎臟腫瘤、胃腫瘤、結腸腫瘤、睪丸腫瘤、頭頸部腫瘤、胰腺腫瘤、腦腫瘤、黑素瘤及其他組織器官腫瘤，以及血液腫瘤，諸如淋巴瘤及白血病，包括急性骨髓性白血病、慢性骨髓性白血病、慢性淋巴球性白血病、T細胞淋巴球性白血病及B細胞淋巴瘤。
在一些態樣中，已診斷出個體具有感染或處於感染風險中(例如，年齡、地理/旅行、及/或與工作相關之感染風險或易感性增加，或處於季節性及/或新型疾病感染風險中)。
抗原可以足以誘發CTL反應之量投與。抗原可以足以誘發T細胞反應之量投與。抗原可以足以誘發B細胞反應之量投與。
抗原可單獨或與其他治療劑組合投與。治療劑為例如化學治療劑、放射線或免疫療法。可針對特定癌症投與任何適合之治療性治療。治療劑可包括靶向感染性疾病生物體之彼等治療劑，諸如抗病毒劑或抗生素劑。
另外，可向個體進一步投與抗免疫抑制劑/免疫刺激劑，諸如檢查點抑制劑。舉例而言，可向個體進一步投與抗CTLA抗體或抗PD-1或抗PD-L1。藉由抗體阻斷CTLA-4或PD-L1可增強患者中對癌細胞之免疫反應。特定言之，已展示在按照疫苗接種方案時CTLA-4阻斷為有效的。
可確定包括於疫苗組合物中之各抗原的最佳量及最佳給藥方案。舉例而言，抗原或其變異體可製備用於靜脈內(i.v.)注射液、皮下(s.c.)注射液、皮內(i.d.)注射液、腹膜內(i.p.)注射液、肌肉內(i.m.)注射液。注射方法包括s.c.、i.d.、i.p.、i.m.及i.v.。DNA或RNA注射方法包括i.d.、i.m.、s.c.、i.p.及i.v.。疫苗組合物之其他投與方法為熟習此項技術者已知的。
疫苗可經編譯以使得組合物中存在之抗原的選擇、數目及/或量為組織、癌症、感染性疾病及/或患者特異性的。舉例而言，肽的準確選擇可根據所指定組織中之親本蛋白質的表現模式來導引或根據患者之突變或疾病狀態來導引。選擇可取決於癌症之具體類型、特定感染性疾病、疾病狀態、疫苗接種目標(例如，預防性或靶向正在進行之疾病)、較早的治療方案、患者免疫狀態及當然患者之HLA單倍型。此外，疫苗可根據特定患者之個人需要而含有個別化組分。實例包括根據抗原在特定患者中之表現改變抗原之選擇或在第一輪或治療方案之後調整二次治療。
可經由使用各種診斷方法(例如下文進一步描述之患者選擇方法)鑑別患者以投與抗原疫苗。患者選擇可涉及鑑別一或多個基因中之突變，或表現模式。患者選擇可涉及鑑別正在進行之感染之感染性疾病。患者選擇可涉及鑑別感染性疾病之感染風險。在一些情況下，患者選擇涉及鑑別患者之單倍型。各種患者選擇方法可同時進行，例如定序診斷可鑑別患者之突變及單倍型。各種患者選擇方法可依序進行，例如一個診斷性測試鑑別突變且分開的診斷測試鑑別患者之單倍型，且其中各測試可為相同(例如均為高通量定序)或不同(例如一個為高通量定序且另一個為桑格定序)的診斷方法。
對於待用作癌症或感染性疾病疫苗之組合物，在正常組織中大量表現之具有類似正常自身肽的抗原可避免或以低量存在於本文所述之組合物中。另一方面，若已知患者之腫瘤或受感染細胞表現大量的某一抗原，則用於治療此癌症或感染之各別醫藥組合物可以高量存在且/或可包括超過一種對此特定抗原或此抗原之路徑具有特異性的抗原。
可向已罹患癌症或感染之個體投與包含抗原之組合物。在治療應用中，組合物以足以引發對腫瘤抗原或感染性疾病生物體抗原之有效CTL反應且治癒或至少部分遏制症狀及/或併發症之量投與患者。足以實現此目標之量定義為「治療有效劑量」。對此用途有效之量將取決於例如組合物、投藥方式、所治療疾病之階段及嚴重程度、患者之體重及一般健康狀況、以及處方醫師之判斷。應記住，組合物一般可用於嚴重的疾病病況，亦即危及生命或可能危及生命之情形，尤其當癌症已轉移時。在此類情況下，鑒於外來物質之最小化及抗原之相對無毒性，治療醫師可能且可能感覺需要投與實質性過量之此等組合物。
對於治療用途，可在偵測或手術移除腫瘤時開始投藥或在偵測或治療感染時開始投藥。此後可接著為增強免疫劑量，直至症狀至少實質上減弱且隨後減弱一段時間。
用於治療性治療之醫藥組合物(例如疫苗組合物)意欲非經腸、局部、經鼻、經口或局部投藥。醫藥組合物可非經腸投與，例如靜脈內、皮下、皮內或肌肉內投與。組合物可在手術切除部位投與以誘發針對腫瘤之局部免疫反應。組合物可經投與以靶向個體之特定受感染組織及/或細胞(例如抗原呈現細胞)。本文揭示用於非經腸投與之組合物，其包含抗原及疫苗組合物溶解或懸浮於可接受之載劑(例如水性載劑)中之溶液。可使用多種水性載劑，例如水、緩衝水、0.9%生理食鹽水、0.3%甘胺酸、玻尿酸及其類似物。此等組合物可藉由習知的熟知滅菌技術滅菌或可經無菌過濾。所得水溶液可封裝以按原樣使用或凍乾，凍乾製劑在投與之前與無菌溶液組合。組合物可含有為接近生理條件而需要的醫藥學上可接受之輔助物質，諸如pH調節劑及緩衝劑、張力調節劑、濕潤劑及其類似物，例如乙酸鈉、乳酸鈉、氯化鈉、氯化鉀、氯化鈣、脫水山梨糖醇單月桂酸酯、三乙醇胺油酸酯等。
抗原亦可經由脂質體投與，脂質體使其靶向特定的細胞組織，諸如淋巴組織。脂質體亦用於增加半衰期。脂質體包括乳液、泡沫、膠束、不可溶單層、液晶、磷脂分散體、層狀層及其類似物。在此等製劑中，有待遞送之抗原作為脂質體之一部分單獨或與結合於例如淋巴細胞中普遍存在之受體的分子(諸如結合於CD45抗原之單株抗體)或與其他治療性或免疫原性組合物一起併入。因此，用所需新抗原填充之脂質體可引導至淋巴細胞之位點，在此脂質體隨後遞送所選擇之治療性/免疫原性組合物。脂質體可由標準的形成囊泡之脂質形成，其一般包括中性及帶負電荷之磷脂及固醇(諸如膽固醇)。脂質之選擇一般藉由考慮例如脂質體大小、脂質體在血流中之酸不穩定性及穩定性來指導。多種方法可用於製備脂質體，如例如Szoka等人, Ann. Rev. Biophys. Bioeng. 9; 467 (1980)；美國專利第4,235,871號、第4,501,728號、第4,501,728號、第4,837,028號及第5,019,369號中所描述。
對於靶向免疫細胞，待併入至脂質體中之配體可包括例如對所需免疫系統細胞之細胞表面決定子具有特異性的抗體或其片段。脂質體懸浮液可以一定劑量靜脈內、局部、表面等投與，該劑量尤其根據投藥方式、所遞送之肽及所治療疾病之階段而變化。
出於治療或免疫目的，編碼肽及視情況選用之一或多種本文所述之肽的核酸亦可投與患者。多種方法方便地用於將核酸遞送至患者。舉例而言，核酸可以「裸DNA」形式直接遞送。此方法描述於例如Wolff等人, Science 247: 1465-1468 (1990)以及美國專利第5,580,859號及第5,589,466號中。核酸亦可使用彈道式遞送投與，如例如美國專利第5,204,253號中所述。可投與僅包含DNA之粒子。可替代地，DNA可黏附於粒子，諸如金粒子。在存在或不存在電穿孔之情況下，用於遞送核酸序列之方法可包括病毒載體、mRNA載體及DNA載體。
核酸亦可與陽離子化合物(諸如陽離子脂質)複合遞送。脂質介導之基因遞送方法描述於例如9618372WOAWO 96/18372 ；9324640WOAWO 93/24640；Mannino及Gould-Fogerite, BioTechniques 6(7): 682-691 (1988)；美國專利第5,279,833號；Rose美國專利第5,279,833號；9106309WOAWO 91/06309；及Felgner等人, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 7413-7414 (1987)中。
抗原亦可包括於基於病毒載體之疫苗平台中，諸如牛痘、禽痘、自我複製α病毒、馬拉巴病毒(marabavirus)、腺病毒(參見例如Tatsis等人, Adenoviruses,Molecular Therapy (2004) 10, 616-629)或慢病毒，包括(但不限於)第二、第三或雜交第二/第三代慢病毒及任一代之重組慢病毒，其設計成靶向特定細胞類型或受體(參見例如Hu 等人, Immunization Del ivered by Lentiviral Vectors for Cancer and Infectious Diseases,Immunol Rev. (2011) 239(1): 45-61, Sakuma等人, Lentiviral vectors: basic to translational ,Biochem J. (2012) 443(3):603-18, Cooper 等人, Rescue of splicing-mediated intron loss maximizes expression in lentiviral vectors containing the human ubiquitin C promoter,Nucl. Acids Res. (2015) 43 (1): 682-690, Zufferey 等人, Self-Inactivating Lentivirus Vector for Safe and Efficient In Vivo Gene Delivery,J. Virol . (1998) 72 (12): 9873-9880)。視上述基於病毒載體之疫苗平台的包裝能力而定，此方法可遞送編碼一或多個抗原肽之一或多個核酸序列。序列可側接非突變序列，可由連接子分開或可在前面有一或多個靶向亞細胞區室之序列(參見例如Gros 等人, Prospective identification of neoantigenspecific lymphocytes in the peripheral blood of melanoma patients,Nat Med. (2016) 22 (4):433-8, Stronen等人, Targeting of cancer neoantigens with donor-derived T cell receptor repertoires,Science. (2016) 352 (6291):1337-41, Lu 等人, Efficient identification of mutated cancer antigens recognized by T cells associated with durable tumor regressions,Clin Cancer Res. (2014) 20(13):3401-10)。在引入宿主後，經感染細胞 表現抗原，從而引發針對肽之宿主免疫(例如CTL)反應。適用於免疫方案 中之牛痘載體及方法描述於例如美國專利第4,722,848號中。另一種載體 為卡介苗(Bacille Calmette Guerin，BCG)。BCG載體描述於Stover等人 (Nature 351:456-460 (1991))中。根據本文描述，適用於抗原之治療性投與或免疫接種的各種其他疫苗載體，例如傷寒沙門氏菌載體及其類似物對於熟習此項技術者將為顯而易見的。
投與核酸之手段使用編碼一或多個抗原決定基之袖珍基因構築體。為了產生編碼所選CTL抗原決定基之DNA序列(小型基因)以便在人類細胞中表現，對抗原決定基的胺基酸序列進行逆轉譯。使用人類密碼子使用表來指導各胺基酸之密碼子選擇。使編碼DNA序列的此等抗原決定基直接鄰接，產生連續多肽序列。為了最佳化表現及/或免疫原性，可將其他元件併入小型基因設計中。可經逆轉譯且包括於小型基因序列中的胺基酸序列之實例包括：輔助T淋巴細胞、抗原決定基、前導(信號)序列及內質網滯留信號。另外，可藉由包括鄰近於CTL抗原決定基之合成(例如聚丙胺酸)或天然存在的側接序列來改良CTL抗原決定基之MHC呈現。藉由組裝編碼袖珍基因之正股及負股的寡核苷酸而將袖珍基因序列轉化成DNA。重疊寡核苷酸(30-100個鹼基長)係在適當條件下使用熟知技術合成、磷酸化、純化及黏接。寡核苷酸之末端係使用T4 DNA連接酶連接。編碼CTL抗原決定基多肽之此合成袖珍基因可隨後選殖至所期望之表現載體中。
可製備經純化之質體DNA以便使用多種調配物注射。其中最簡單的為凍乾DNA在無菌磷酸鹽緩衝生理食鹽水(PBS)中復原。已描述多種方法，且可使用新技術。如上文所指出，核酸宜用陽離子脂質調配。另外，醣脂、促融合脂質體、肽及化合物(統稱為保護、相互作用、非縮合(PINC)) 亦可與純化的質體DNA複合，以影響諸如以下之變數：穩定性、肌肉內分散或移行至特定器官或細胞類型。
亦揭示一種製造疫苗之方法，其包括執行本文揭示之方法之步驟；以及製造包含複數種抗原或該複數種抗原之子集的疫苗。亦揭示一種製造腺病毒載體之方法，其包括執行本文揭示之方法之步驟；及產生包含卡匣之腺病毒載體。舉例而言，揭示使用TET啟動子系統，諸如本文所述之TETr控制之啟動子系統，製造腺病毒載體之方法。 使用TETr控制之啟動子系統之病毒生產可包括a. 提供包含卡匣之病毒載體，該卡匣包含：(i)至少一個有效負載核酸序列，及(ii)可操作地連接於該至少一個有效負載核酸序列之至少一個啟動子序列，其中該至少一個啟動子為四環素(TET)阻遏蛋白(TETr)控制之啟動子，b. 提供經工程改造以表現TETr蛋白之細胞；及c. 在足以產生病毒之條件下使病毒載體與細胞接觸。
本文所揭示之抗原可使用此項技術中已知之方法製造。舉例而言，製備本文揭示之抗原或載體(例如，包括至少一個編碼一或多個抗原之序列的載體)之方法可包括在適用於表現該抗原或載體之條件下培養宿主細胞，其中該宿主細胞包含編碼該抗原或載體之至少一種聚核苷酸，以及純化該抗原或載體。標準純化方法包括層析技術、電泳、免疫、沈澱、透析、過濾、濃縮及層析聚焦技術。
宿主細胞可包括中國倉鼠卵巢(CHO)細胞、NS0細胞、酵母或HEK293細胞。宿主細胞可用一或多個聚核苷酸轉化，該一或多個聚核苷酸包含至少一個編碼本文揭示之抗原或載體之核酸序列，視情況其中經分離聚核苷酸進一步包含可操作地連接於編碼抗原或載體之至少一個核酸序列的啟動子序列。在某些實施例中，經分離之聚核苷酸可為cDNA。VII. 抗原使用及投藥
可使用疫苗接種方案給予個體一或多種抗原。初免疫苗及增強疫苗可用於向個體給藥。初免疫苗可基於C68 (例如SEQ ID NO:1或2中所示之序列)或srRNA (例如SEQ ID NO:3或4中所示之序列)，且增強疫苗可基於C68 (例如SEQ ID NO:1或2中所示之序列)或srRNA (例如SEQID NO:3或4中所示之序列)。各載體通常包括具有抗原之卡匣。卡匣可包括約20種抗原，其由間隔子(諸如通常包圍各抗原之天然序列)或其他非天然間隔序列(諸如AAY)分開。卡匣亦可包括MHCII抗原，諸如破傷風類毒素抗原及PADRE抗原，其可視為通用II類抗原。卡匣亦可包括靶向序列，諸如泛素靶向序列。另外，各疫苗劑量可與檢查點抑制劑(CPI)結合(例如同時、之前或之後)投與個體。CPI可包括抑制CTLA4、PD1及/或PDL1之彼等，諸如抗體或其抗原結合部分。此類抗體可包括曲美單抗或德瓦魯單抗(durvalumab)。
初免疫苗可注射(例如肌肉內)於個體。可使用每一劑量雙側注射。舉例而言，可使用一或多次ChAdV68 (C68) 注射(例如總劑量1× 1012 個病毒粒子)；可使用選自0.001至1 ug RNA、尤其0.1或1 ug範圍之低疫苗劑量的一或多次自我複製RNA (srRNA)注射；或可使用選自1至100 ug RNA、尤其10或100 ug 範圍之高疫苗劑量的一或多次srRNA注射。
可在初始疫苗接種之後注射(例如肌肉內)疫苗增強劑(增強疫苗)。增強疫苗可在初免後約每1、2、3、4、5、6、7、8、9或10週，例如每4週及/或8週投與。可使用每一劑量雙側注射。舉例而言，可使用一或多次ChAdV68 (C68)注射(例如總劑量1× 1012 個病毒粒子)；可使用選自0.001至1 ug RNA、尤其0.1或1 ug範圍之低疫苗劑量的一或多次自我複製RNA (srRNA)注射；或可使用選自1至100 ug RNA、尤其10或100 ug範圍之高疫苗劑量的一或多次srRNA注射。
亦可向個體投與抗CTLA-4 (例如曲美單抗)。舉例而言，抗CTLA4可在肌肉內疫苗注射(ChAdV68初免或srRNA低劑量)部位附近皮下投與，以確保引流至同一淋巴結。曲美單抗為CTLA-4之選擇性人類IgG2 mAb抑制劑。目標抗CTLA-4 (曲美單抗)皮下劑量通常為70-75 mg(尤其75 mg)，其劑量範圍為例如1-100 mg或5-420 mg。
在某些情況下，可使用抗PD-L1 抗體，諸如德瓦魯單抗(MEDI 4736)。德瓦魯單抗為一種選擇性、高親和力人類IgG1 mAb，其阻斷PD-L1結合於PD-1及CD80。德瓦魯單抗一般每4週以20 mg/kg i.v.投與。
可在疫苗投與之前、期間及/或之後進行免疫監測。除其他參數外，此類監測可告知安全性及功效。
為進行免疫監測，通常使用PBMC。PBMC可在初始疫苗接種之前及在初始疫苗接種之後(例如4週及8週)分離。PBMC可僅在增強疫苗接種之前及在每次增強疫苗接種之後(例如4週及8週)收集。
可評估T細胞反應作為免疫監測方案之一部分。舉例而言，可監測及/或評估本文所述之疫苗組合物刺激免疫反應之能力。如本文所用，「刺激免疫反應」係指免疫反應之任何增加，諸如引發免疫反應(例如，在初始個體中刺激免疫反應之起始的初免疫苗)或增強免疫反應(例如，在對抗原具有預先存在之免疫反應、諸如由初免疫苗引發之預先存在之免疫反應的個體中刺激免疫反應增強的增強疫苗)。可使用此項技術中已知的一或多種方法量測T細胞反應，諸如ELISpot、細胞內細胞介素染色、細胞介素分泌及細胞表面捕捉、T細胞增殖、MHC多聚體染色或藉由細胞毒性分析。針對疫苗中編碼之抗原決定基的T細胞反應可藉由使用ELISpot分析量測細胞介素(諸如IFN-γ)之誘發而自PBMC監測。針對疫苗中編碼之抗原決定基的特異性CD4或CD8 T細胞反應可藉由使用流式細胞量測術量測胞內或胞外捕捉之細胞介素(諸如IFN-γ)之誘發而自PBMC監測。針對疫苗中編碼之抗原決定基的特異性CD4或CD8 T細胞反應可藉由使用MHC多聚體染色量測表現特異性針對抗原決定基/MHC I類複合物之T細胞受體的T細胞群體而自PBMC監測。針對疫苗中編碼之抗原決定基的特異性CD4或CD8 T細胞反應可藉由在3H-胸苷、溴去氧尿苷及羧基螢光素-二乙酸酯-琥珀醯亞胺酯(CFSE)併入後量測T細胞群之離體擴增而自PBMC監測。特異性針對疫苗中編碼之抗原決定基之源自PBMC之T細胞的抗原識別能力及溶解活性可藉由鉻釋放分析或替代性比色細胞毒性分析來功能性評估。
可使用此項技術中已知的一或多種方法，諸如用於確定B細胞分化(例如，分化為漿細胞)、B細胞或漿細胞增殖、B細胞或漿細胞活化(例如，諸如CD80或CD86之共刺激標記物的上調)、抗體類別切換及/或抗體產生(例如ELISA)之分析，來量測B細胞反應。VIII. 抗原鑑別 VIII.A. 抗原候選鑑別
已描述關於腫瘤及正常外顯子組及轉錄組之NGS分析的研究方法且將其應用於抗原鑑別空間。6,14,15 可考慮在臨床環境中針對對抗原鑑別之更大敏感性及特異性的某些優化。此等優化可分為兩個領域，亦即與實驗室方法相關之彼等優化及與NGS資料分析相關之彼等優化。所描述之研究方法亦可應用於在其他情形下鑑別抗原，諸如鑑別來自感染性疾病生物體之抗原、個體之感染或個體之受感染細胞的鑑別。優化實例為熟習此項技術者已知，例如更詳細地描述於以下各者之方法：美國專利第10,055,540號、美國申請公開案第US20200010849A1號以及國際專利申請公開案WO/2018/195357及WO/2018/208856，出於所有目的各自以全文引用的方式併入本文中。VIII.B.  HLA 肽之分離及偵測
在裂解及溶解組織樣品後，使用經典免疫沈澱(IP)方法進行HLA-肽分子之分離(55-58)。澄清的溶解物用於HLA特異性IP。
免疫沈澱係使用與珠粒偶合之抗體來進行，其中抗體特異性針對HLA分子。對於泛I類HLA免疫沈澱，使用泛I類CR抗體；對於II類HLA-DR，使用HLA-DR抗體。在隔夜培育期間，抗體共價連接於NHS-瓊脂糖珠粒。在共價連接後，將珠粒洗滌且等分用於IP。(59, 60)免疫沈澱反應亦可用未共價連接於珠粒之抗體來進行。通常使用塗佈有蛋白A及/或蛋白G之瓊脂糖或磁性珠粒來完成此，該等珠粒將抗體固定於管柱。下文列舉可用於選擇性地富集MHC/肽複合物之一些抗體。
抗體名稱 特異性
W6/32 I類HLA-A、B、C
L243 II類-HLA-DR
Tu36 II類-HLA-DR
LN3 II類-HLA-DR
Tu39 II類-HLA-DR、DP、DQ
將澄清的組織溶解物添加至抗體珠粒中進行免疫沈澱。在免疫沈澱後，自溶解物移除珠粒且將溶解物儲存用於額外實驗，包括額外IP。洗滌IP珠粒以移除非特異性結合且使用標準技術自珠粒溶離HLA/肽複合物。使用分子量旋轉管柱或C18分級分離自肽移除蛋白質組分。所得肽藉由SpeedVac蒸發變乾且在一些情況下，在MS分析之前儲存在-20C下。
乾燥的肽在適於逆相層析之HPLC緩衝液中復原且裝載於C-18微毛細管HPLC管柱上，以便在Fusion Lumos質譜儀(Thermo)中梯度溶離。在Orbitrap偵測器中以高解析度收集肽質量/電荷(m/z)之MS1譜，隨後在所選擇之離子的HCD片段化後，在離子阱偵測器中收集MS2低解析度掃描。另外，可使用CID或ETD片段化方法或三種技術之任何組合來獲得MS2譜，以達到肽之更大的胺基酸覆蓋率。MS2譜亦可在Orbitrap偵測器中以高解析度質量精度量測。
使用Comet (61, 62)對來自各分析之MS2譜進行蛋白質資料庫搜尋，且使用Percolator (63-65)對肽鑑別進行評分。使用PEAKSstudio (Bioinformatics Solutions Inc.)來進行額外定序，且可使用其他搜尋引擎或定序方法，包括頻譜匹配及從頭定序(97)。VIII.B.1. 支持綜合 HLA 肽定序之 MS 偵測極限研究 。
使用肽YVYVADVAAK，使用裝載於LC管柱上之不同量的肽確定偵測極限。所測試之肽的量為1 pmol、100 fmol、10 fmol、1 fmol及100 amol。(表1)結果展示於圖24A及24B中。此等結果表明，最低偵測極限(LoD)在埃莫耳範圍(10-18 )中，動態範圍跨越五個數量級，且信號雜訊比足以在低飛莫耳範圍(10-15 )定序。表 1
肽m/z 裝載於管柱上 1e9個細胞中之複本數/細胞
566.830 1 pmol 600
562.823 100 fmol 60
559.816 10 fmol 6
556.810 1 fmol 0.6
553.802 100 amol 0.06
IX. 呈現模型
呈現模型可用於鑑別在患者中肽呈現之可能性。各種呈現模型為熟習此項技術者已知，例如更詳細地描述於美國專利第10,055,540號、美國申請公開案第US20200010849A1號及第US20110293637號以及國際專利申請公開案WO/2018/195357、WO/2018/208856及WO2016187508中之呈現模型，該等文獻出於所有目的各自以全文引用之方式併入本文中。X. 訓練模組
訓練模組可用於基於訓練資料組構築一或多個呈現模型，該等模型產生肽序列是否會經與該等肽序列相關聯之MHC對偶基因呈現的可能性。各種訓練模組為熟習此項技術者已知，例如更詳細地描述於美國專利第10,055,540號、美國申請公開案第US20200010849A1號以及國際專利申請公開案WO/2018/195357及WO/2018/208856中之呈現模型，該等呈現模型出於所有目的各自以全文引用之方式併入本文中。訓練模組可以在獨立對偶基因(per-allele)基礎上構築呈現模型以預測肽之呈現可能性。訓練模組亦可在存在兩個或或更多個MHC對偶基因之多對偶基因環境中構築呈現模型以預測肽之呈現可能性。XI. 預測模組
預測模組可用於接收序列資料且使用呈現模型選擇序列資料中之候選抗原。具體言之，序列資料可以為自患者之腫瘤組織細胞、受感染細胞患者或感染性疾病生物體自身提取的DNA序列、RNA序列及/或蛋白質序列。預測模組可以藉由將自患者之正常組織細胞提取的序列資料與自患者之腫瘤組織細胞提取的序列資料相比較以鑑別含有一或多個突變之部分，由此鑑別出呈突變肽序列之新抗原。預測模組可諸如藉由將自患者之正常組織細胞提取的序列資料與自患者之受感染細胞提取的序列資料相比較以鑑別含有一或多種感染性疾病生物體相關抗原之部分，由此鑑別出候選抗原，其為病原體衍生肽、病毒衍生肽、細菌衍生肽、真菌衍生肽及寄生蟲衍生肽。預測模組可藉由將自患者之正常組織細胞提取的序列資料與自患者之腫瘤組織細胞提取的序列資料相比較以鑑別不恰當表現之候選抗原，由此鑑別出與正常細胞或組織相比在腫瘤細胞或癌組織中具有改變表現之候選抗原。預測模組可藉由將自患者之正常組織細胞提取的序列資料與自患者之受感染組織細胞提取的序列資料相比較以鑑別表現之候選抗原(例如，鑑別對感染性疾病具特異性之表現之聚核苷酸及/或多肽)，由此鑑別出與正常細胞或組織相比在受感染細胞或受感染組織中表現之候選抗原。
呈現模組可將一或多個呈現模型應用於經處理之肽序列以估計該等肽序列之呈現可能性。具體言之，預測模組可藉由將呈現模型應用於候選抗原來選擇可能呈現在腫瘤HLA分子或受感染細胞HLA分子上之一或多個候選抗原肽序列。在一個實施方案中，呈現模組選出估計呈現可能性超過預定臨限值之候選抗原序列。在另一實施方案中，呈現模型選出N 個具有最高估計呈現可能性之候選抗原序列(其中N 一般為可以在疫苗中遞送的最大抗原決定基數量)。包括選擇用於給定患者之候選抗原的疫苗可以注射至患者體內以誘發免疫反應。XI.B. 卡匣設計模組 XI.B.1 綜述
卡匣設計模組可基於選擇用於注射至患者體內之候選肽產生疫苗卡匣序列。各種卡匣設計模組為熟習此項技術者已知，例如更詳細地描述於美國專利第10,055,540號、美國申請公開案第US20200010849A1號以及國際專利申請公開案WO/2018/195357及WO/2018/208856中之卡匣設計模組，該等文獻出於所有目的各自以全文引用之方式併入本文中。
可以基於由預測模組確定的與超過預定臨限值之呈現可能性相關聯之所選肽產生治療性抗原決定基集合，其中該等呈現可能性係由呈現模型測定。然而，應瞭解，在其他實施例中，可以基於多種方法中之任一種或多種(單獨或組合形式)，例如基於針對患者之HLA I類或II類對偶基因之結合親和力或預測之結合親和力、針對患者之HLA I類或II類對偶基因之結合穩定性或預測之結合穩定性、隨機取樣及類似方法產生治療性抗原決定基之集合。
治療性抗原決定基可對應於自身選擇之肽。除所選肽外，治療性抗原決定基亦可包括C端及/或N端側接序列。N端及C端側接序列可為治療性疫苗抗原決定基在其源蛋白質之背景下之天然N端及C端側接序列。治療性抗原決定基可表示固定長度的抗原決定基。治療性抗原決定基可表示可變長度的抗原決定基，其中抗原決定基之長度可視例如C-側接序列或N-側接序列之長度而改變。舉例而言，C端側接序列及N端側接序列可各自具有2-5個殘基的變化長度，由此產生16種可能的抗原決定基選擇。
卡匣設計模組亦可藉由考慮橫跨該卡匣中一對治療性抗原決定基之間之接合點的接合點抗原決定基之呈現來產生卡匣序列。接合點抗原決定基係由於在該卡匣中串接治療性抗原決定基及連接子序列之過程而在該卡匣中產生的新穎非自身但不相關之抗原決定基序列。接合點抗原決定基之新穎序列不同於該卡匣之治療性抗原決定基本身。
卡匣設計模組可產生降低在患者中呈現接合點抗原決定基之可能性的卡匣序列。具體言之，當將卡匣注射至患者體內時，接合點抗原決定基有可能經患者之I類HLA或II類HLA對偶基因呈現，且分別刺激CD8或CD4 T細胞反應。由於T細胞與接合點抗原決定基之反應沒有治療益處，且可能因抗原競爭而減弱針對該卡匣中所選治療性抗原決定基之免疫反應，故此類反應常常係不合需要的。76
卡匣設計模組可迭代一或多個候選卡匣，且確定與卡匣序列相關聯之接合點抗原決定基之呈現評分低於數字臨限值的卡匣序列。接合點抗原決定基呈現評分係與該卡匣中接合點抗原決定基之呈現可能性相關聯的量，且較高的接合點抗原決定基呈現評分值指示該卡匣之接合點抗原決定基會由I類HLA或II類HLA或兩者呈現之可能性較高。
在一個實施例中，卡匣設計模組可以確定候選卡匣序列中與最低接合點抗原決定基呈現評分相關聯之卡匣序列。
卡匣設計模組可以迭代一或多個候選卡匣序列，確定候選卡匣之接合點抗原決定基呈現評分，且鑑別與低於臨限值之接合點抗原決定基呈現評分相關聯之最佳卡匣序列。
卡匣設計模組可以進一步檢查該一或多個候選卡匣序列以鑑別候選卡匣序列中之接合點抗原決定基中之任一個是否為設計使用該疫苗之給定患者之自身抗原決定基。為實現此目的，卡匣設計模組針對已知資料庫，諸如BLAST檢查接合點抗原決定基。在一個實施例中，卡匣設計模組可經組態以設計避免接合點自身抗原決定基之卡匣。
卡匣設計模組可執行蠻力方法且迭代所有或大部分可能的候選卡匣序列以選擇具有最小接合點抗原決定基呈現評分之序列。然而，由於疫苗容量增加，此類候選卡匣之數量可能極大。舉例而言，對於20個抗原決定基之疫苗容量，卡匣設計模組必須迭代約1018 個可能的候選卡匣，才能確定具有最低接合點抗原決定基呈現評分之卡匣。對於卡匣設計模組在合理的時間量內完成以產生用於患者之疫苗而言，此確定在計算上可能較為繁瑣(就所需之計算處理資源而言)且有時難以處理。另外，考慮到每一候選卡匣的可能接合點抗原決定基，甚至可能更為繁瑣。因此，卡匣設計模組可以基於迭代明顯少於蠻力方法中之候選卡匣序列數量的候選卡匣數量來選擇卡匣序列。
卡匣設計模組可產生隨機產生或至少偽隨機產生的候選卡匣子集，且選擇與低於預定臨限值之接合點抗原決定基呈現評分相關聯之候選卡匣作為卡匣序列。另外，卡匣設計模組可以自該小組中選擇具有最低接合點抗原決定基呈現評分之候選卡匣作為卡匣序列。舉例而言，卡匣設計模組可以針對20個所選抗原決定基的集合產生約1百萬個候選卡匣的子集，且選出具有最小接合點抗原決定基呈現評分之候選卡匣。儘管產生一小組隨機卡匣序列且自該小組中選出具有低接合點抗原決定基呈現評分之卡匣序列可能不如蠻力方法好，但其需要明顯較少的計算資源，由此使其實施在技術上為可實行的。另外，相對於此種更高效之技術，執行蠻力法可能僅引起接合點抗原決定基呈現評分之微小或甚至可忽略的改良，因此，由資源分配之觀點看，蠻力法係不值得實施的。卡匣設計模組可藉由將卡匣之抗原決定基序列用非對稱旅行商問題(TSP)公式表示來確定改良之卡匣組態。根據節點清單及每對節點之間之距離，TSP確定與最短總距離相關聯之節點之序列以訪問每個節點恰好一次且返回至原始節點。舉例而言，根據城市A、B及C且已知彼此之間的距離，TSP之解決方案產生一個閉合的城市序列，對於該序列，訪問每個城市恰好一次所行進之總距離係可能途徑當中最短的。TSP之非對稱形式確定當一對節點之間的距離不對稱時節點之最佳序列。舉例而言，自節點A行進至節點B之「距離」可以不同於自節點B行進至節點A之「距離」。藉由使用非對稱TSP解決改良之最佳卡匣，卡匣設計模組可以尋找使所有在該卡匣之抗原決定基之間的接合點之呈現評分降低的卡匣序列。非對稱TSP解決方案指示對應於應當在卡匣中串接抗原決定基以使該卡匣之所有接合點的接合點抗原決定基呈現評分減到最小之次序的治療性抗原決定基序列。相較於隨機取樣方法，經由此方法確定的卡匣序列可以產生具有明顯較少接合點抗原決定基呈現之序列，同時可能需要明顯較少的計算資源，尤其是在所產生的候選卡匣序列數量很大時。不同計算方法及用於優化卡匣設計之比較之說明性實例更詳細地描述於美國專利第10,055,540號、美國申請公開案第US20200010849A1號以及國際專利申請公開案WO/2018/195357及WO/2018/208856中，該等文献出於所有目的各自以全文引用之方式併入本文中。XI.B.2 共有抗原疫苗序列選擇
使用本文提供之詳細揭示內容，熟習此項技術者可選擇包含在共有抗原疫苗中之共有抗原序列以及用該疫苗治療之適當患者。在某些情況下，特定突變及HLA對偶基因組合可為較佳(例如，基於可自給定個體獲得之表明各自存在於個體中之定序數據)，且隨後組合在一起使用以鑑別共有新抗原序列。XIII. 示例電腦
電腦可用於計算本文所述之方法中之任一者。熟習此項技術者將認識到電腦可具有不同架構。電腦之實例為熟習此項技術者已知，例如更詳細地描述於美國專利第10,055,540號、美國申請公開案第US20200010849A1號以及國際專利申請公開案WO/2018/195357及WO/2018/208856中之電腦，該等文献出於所有目的各自以全文引用之方式併入本文中。XIV. 抗原遞送載體實例
下文為執行本發明之特定實施例之實例。該等實例僅出於說明性目的提供，且不意欲以任何方式限制本發明之範疇。已作出努力以確保所使用數字的精確性(例如，量、溫度等)，但一些實驗性誤差及偏差當然應為允許的。
除非另外指明，否則本發明將採用此項技術之技能範圍內的蛋白質化學、生物化學、DNA重組技術及藥理學習知方法實施。在文獻中完全解釋此類技術。參見例如T.E. Creighton,Proteins: Structures and Molecular Properties (W.H. Freeman and Company, 1993) ；A.L. Lehninger,Biochemistry (Worth Publishers, Inc.，現行版)；Sambrook等人,Molecular Cloning: A Laboratory Manual (第2版, 1989)；Methods In Enzymology (S. Colowick 及N. Kaplan 編, Academic Press, Inc.) ；Remington's Pharmaceutical Sciences , 第18 版(Easton, Pennsylvania: Mack Publishing Company, 1990)；Carey及SundbergAdvanced Organic Chemistry 第3 版. (Plenum Press)第A卷及第B卷(1992)。XIV.A. 新抗原卡匣設計
可以經由疫苗接種遞送刺激相應細胞免疫反應之多個I類MHC限制性腫瘤特異性新抗原(TSNA)。在一個實例中，疫苗卡匣經工程改造而以單一基因產物形式編碼多個抗原決定基，其中該等抗原決定基係嵌入其天然的周圍肽序列內或藉由非天然連接子序列隔開。鑑別出會潛在地影響抗原加工及呈現且因此影響TSNA特異性CD8 T細胞反應之量值及廣度的若干設計參數。在本實例中，設計及構築出若干模型卡匣以評價：(1)是否可以針對併入單一表現卡匣中之多個抗原決定基產生穩定T細胞反應；(2)什麼使得最佳連接子置放於表現卡匣內之TSNA之間，引起所有抗原決定基之最佳加工及呈現；(3)該等抗原決定基在卡匣內之相對位置是否影響T細胞反應；(4)卡匣內抗原決定基之數量是否影響針對個別抗原決定基之T細胞反應的量值或品質；(5)添加細胞靶向序列是否改善T細胞反應。
產生兩個讀取結果以評價抗原呈現及對模型卡匣內之標記物抗原決定基具有特異性之T細胞反應：(1)活體外基於細胞之篩選，其允許藉由專門工程改造之報導體T細胞之活化進行衡量，來評估抗原呈現(Aarnoudse等人, 2002；Nagai等人, 2012)；及(2)使用HLA-A2轉殖基因小鼠(Vitiello等人, 1991)，藉由其相應抗原決定基特異性T細胞反應評估卡匣來源之人源抗原決定基之疫苗接種後免疫原性的活體內分析(Cornet等人, 2006；Depla等人, 2008；Ishioka等人, 1999)。XIV.B. 抗原卡匣設計評價 XIV.B.1. 方法與材料 TCR 及卡匣設計及選殖
當藉由A*0201呈現時，所選TCR識別肽NLVPMVATV (PDB# 5D2N)、CLGGLLTMV (PDB#3REV)、GILGFVFTL (PDB#1OGA)、LLFGYPVYV (PDB#1AO7)。構築含有2A肽連接之TCR次單元(β隨後為α)、EMCV IRES及2A連接之CD8次單元(β隨後為α及嘌呤黴素抗性基因)的轉移載體。對開放閱讀框架序列進行密碼子優化且由GeneArt合成。產生用於活體外抗原決定基加工及呈現研究的細胞株
肽係購自ProImmune或Genscript，在含10 mM參(2-羧基乙基)膦(TCEP)之水/DMSO(2:8，v/v)中稀釋至10 mg/mL。除非另外指出，否則細胞培養基及補充劑係來自Gibco。熱滅活胎牛血清(FBShi)係來自Seradigm。QUANTI-Luc 受質、吉歐黴素(Zeocin)及嘌呤黴素係來自InvivoGen。將Jurkat-Lucia NFAT 細胞(InvivoGen)維持在補充有10% FBShi、丙酮酸鈉及100 μg/mL吉歐黴素之RPMI 1640中。轉導後，該等細胞立即另外接受0.3 μg/mL 嘌呤黴素。在伊氏培養基(Iscove's Medium，IMDM)加20% FBShi中培養T2細胞(ATCC CRL-1992)。U-87 MG(ATCC HTB-14)細胞係維持在補充有10% FBShi之MEM伊格爾培養基(MEM Eagles Medium)中。
Jurkat-Lucia NFAT細胞含有NFAT誘發性Lucia報導體構築體。Lucia基因在藉由接合T細胞受體(TCR)活化時，將利用腔腸素之螢光素酶分泌至培養基中。此螢光素酶可使用QUANTI -Luc螢光素酶偵測試劑量測。Jurkat-Lucia細胞經慢病毒轉導以表現抗原特異性TCR。HIV源性慢病毒轉移載體係自GeneCopoeia獲得，且表現VSV-G之慢病毒輔助質體(support plasmid) (pCMV-VsvG)、Rev(pRSV-Rev)及Gag-pol(pCgpV)係自Cell Design Labs獲得。
藉由使用40 μl脂染胺及20 μg DNA混合物(以重量計4:2:1:1之轉移質體:pCgpV:pRSV-Rev:pCMV-VsvG)，用脂染胺2000(Thermo Fisher)轉染T75燒瓶中50-80%匯合之HEK293細胞，來製備慢病毒。使用Lenti-X系統(Clontech)濃縮8-10 mL含病毒之培養基，且使病毒再懸浮於100-200 μl新鮮培養基中。使用此體積覆蓋相等體積之Jurkat-Lucia細胞(在不同實驗中使用5×10E4-1×10E6細胞)。在含0.3 μg/ml嘌呤黴素之培養基中培養之後，分選細胞以獲得選殖性。使用裝載肽之T2細胞測試該等Jurkat-Lucia TCR純系之活性及選擇性。活體外抗原決定基加工及呈現分析
常規地使用T2細胞，藉由TCR檢查抗原識別。T2細胞缺乏用於抗原加工之肽轉運蛋白(TAP缺陷型)且不能在內質網中裝載內源性肽以在MHC上呈現。然而，T2細胞可輕易裝載有外源肽。將五種標記肽(NLVPMVATV、CLGGLLTMV、GLCTLVAML、LLFGYPVYV、GILGFVFTL)及兩種不相關肽(WLSLLVPFV、FLLTRICT)裝載於T2細胞上。簡言之，對T2細胞計數且用IMDM加1% FBShi稀釋至1× 106 個細胞/毫升。添加肽以產生10 μg肽/1× 106 個細胞。接著在37℃下培育細胞90分鐘。用IMDM加20% FBShi洗滌細胞兩次，稀釋至5× 10E5個細胞/毫升且將100 μL塗鋪至96孔Costar組織培養盤中。對Jurkat-Lucia TCR純系計數且在RPMI 1640加10% FBShi中稀釋至5× 10E5個細胞/毫升，且將100 μL添加至T2細胞中。培養盤在37℃及5% CO2 下培育隔夜。接著以400 g離心培養盤3分鐘且將20 μL上清液移至白色平底Greiner盤中。QUANTILuc受質係根據說明書製備且以每孔50 μL添加。在Molecular Devices SpectraMax iE3x上讀取螢光素酶表現量。
為了測試腺病毒卡匣之標記物抗原決定基呈現，使用U-87MG細胞作為替代抗原呈現細胞(APC)且用腺病毒載體轉導。收集U-87MG細胞且以5× 10E5個細胞/100 μl塗鋪於96孔Costar組織培養盤中之培養基中。在37℃培育培養盤約2小時。用MEM加10% FBShi將腺病毒卡匣稀釋至MOI 100、50、10、5、1及0且將其以每孔5μl添加至U-87 MG細胞中。再在37℃下培育培養盤約2小時。對Jurkat-Lucia TCR純系計數且在RPMI加10% FBShi中稀釋至5× 10E5個細胞/毫升，且將其以每孔100 μL添加至U-87 MG細胞中。接著，在37℃及5% CO2 下培育培養盤約24小時。以400 g離心培養盤3分鐘且將20 μL上清液移至白色平底Greiner盤中。QUANTI-Luc 受質係根據說明書製備且以每孔50 μL 添加。在Molecular Devices SpectraMax iE3x上讀取螢光素酶表現量。用於免疫原性研究之小鼠品系
轉殖基因HLA-A2.1(HLA-A2 Tg)小鼠係自Taconic Labs, Inc獲得。此等小鼠攜帶由嵌合I類分子組成之轉殖基因，該嵌合I類分子包含人類HLA-A2.1前導序列、α1及α2結構域以及鼠類H2-Kb α3、跨膜及細胞質結構域(Vitiello等人, 1991)。用於該等研究之小鼠係基於C57Bl/6背景的野生型BALB/cAnNTac 雌性及同型接合HLA-A2.1 Tg雄性的第一代後代(F1)。腺病毒載體 (Ad5v) 免疫接種
經由兩側肌肉內注射至脛前肌中對HLA-A2 Tg小鼠免疫接種1× 1010 至1× 106 個腺病毒載體病毒粒子。在免疫接種後12天量測免疫反應。淋巴細胞分離
自新鮮收集的經免疫接種小鼠之脾及淋巴結分離淋巴細胞。使用GentleMACS組織解離器，根據製造商的說明書，在含有10%胎牛血清以及青黴素及鏈黴素之RPMI(完全RPMI)中解離組織。離體酶聯免疫斑點 (ELISPOT) 分析
ELISPOT 分析係根據ELISPOT 統一準則(Janetzki 等人, 2015)，利用小鼠IFNg ELISpotPLUS套組(MABTECH)進行。將1× 105 個脾細胞與10 uM指定肽一起在塗有IFNg抗體之96孔盤中培育16小時。使用鹼性磷酸酶使斑點顯色。對反應定時10分鐘且藉由用自來水流過盤來淬滅反應。使用AID vSpot讀取器譜圖對斑點計數。對於ELISPOT分析，將飽和度＞50%之孔記錄為「太多而無法計數」。將複製孔之偏差＞10%的樣品自分析中排除。接著，使用下式，針對孔匯合校正斑點計數：斑點計數+2 × (斑點計數×%匯合/[100%-%匯合])。藉由用抗原刺激之孔減去陰性肽刺激孔中之斑點計數來校正陰性背景。最後，將標記為太多而無法計數之孔設定成最高觀測校正值，四捨五入至最接近之百分數。離體細胞內細胞因子染色 (ICS) 及流式細胞量測術分析
將2-5× 106 個細胞/ 毫升密度的新鮮分離之淋巴細胞與10 uM 指定肽一起培育2小時。兩小時之後，添加布雷菲爾德菌素A(brefeldin A)達到5 ug/ml濃度且將細胞與刺激劑一起再培育4小時。刺激之後，用可固定的死活細胞鑑定染料(fixable viability dye) eFluor780，根據製造商之方案標記活細胞，且用以1:400稀釋之抗CD8 APC(純系53-6.7, BioLegend)染色。對於細胞內染色，使用1:100稀釋之抗IFNg PE(純系XMG1.2, BioLegend)。將樣品收集於Attune NxT流式細胞儀(Thermo Scientific)上。使用FlowJo標繪對流式細胞量測術資料並分析。為了評估抗原特異性反應之程度，計算響應於各肽刺激劑的FNg+之CD8+細胞百分比及總IFNg+細胞數量/1× 106 個活細胞。XIV.B.2. 抗原卡匣設計之活體外評價
作為抗原卡匣設計評價之實例，開發活體外基於細胞之分析以評估在模型疫苗卡匣內之所選人類抗原決定基是否經抗原呈現細胞表現、加工及呈現(圖1)。在識別後，經工程改造成表現五種對明確表徵之肽-HLA組合具有特異性之TCR之一的Jurkat-Lucia報告子T細胞變得活化且將活化T細胞核因子(NFAT)易位至核中，引起螢光素酶報導基因之轉錄活化。藉由生物發光定量個別報導體CD8 T細胞株之抗原刺激。
藉由用表現構築體轉導慢病毒來改良個別Jurkat-Lucia報導體株，該表現構築體包括藉由P2A核糖體跳躍序列(skip sequence)分離以確保等莫耳量轉譯產物之抗原特異性TCRβ及TCRα鏈(Banu 等人, 2014)。將第二CD8 β-P2A-CD8 α元件添加至慢病毒構築體提供親本報導體細胞株缺乏之CD8輔助受體之表現，因為細胞表面上之CD8對於與目標pMHC分子之結合親和力至關重要且經由接合其胞質尾區促進信號傳導(Lyons等人, 2006；Yachi等人, 2006)。
在慢病毒轉導之後，使Jurkat-Lucia報告子在嘌呤黴素選擇下擴增，經歷單細胞螢光輔助細胞分選(FACS)且測試單株群之螢光素酶表現。由此得到具有功能性細胞反應的針對特定肽抗原1、2、4及5之穩定轉導之報導體細胞株。(表2)。表 2 ：活體外T細胞活化分析之研究.如藉由螢光素酶之誘發所量測的肽特異性T細胞識別指示疫苗卡匣抗原之有效加工及呈現。
短卡匣設計
抗原決定基 AAY
1 24.5 ± 0.5
2 11.3 ± 0.4
3* n/a
4 26.1 ± 3.1
5 46.3 ± 1.9
* 尚未產生的針對抗原決定基3之報導體T細胞
在另一實例中，將一系列短卡匣、所有標記物抗原決定基併入同一位置(圖2A)中且僅改變分離HLA-A*0201限制性抗原決定基(圖2B)。報導體T細胞分別與U-87抗原呈現細胞(APC)混合，該等抗原呈現細胞經表現此等短卡匣之腺病毒構築體感染，且相對於未感染之對照量測螢光素酶表現。藉由匹配報導體T細胞識別模型卡匣中之全部四個抗原，展示多個抗原之有效加工及呈現。T細胞反應之量值在很大程度上遵循天然及AAY-連接子之類似趨勢。自基於RR-連接子之卡匣釋放的抗原顯示較低螢光素酶誘發(表3)。經設計以破壞抗原加工之DPP-連接子製造引起較低抗原決定基呈現的疫苗卡匣(表3)。表 3 ：短卡匣中連接子序列之評價。在活體外T細胞活化分析中之螢光素酶誘發指示，除基於DPP之卡匣外，所有連接子均有助於卡匣抗原之有效釋放。僅T細胞抗原決定基(無連接子)=9AA，天然連接子一側=17AA，天然連接子兩側=25AA，非天然連接子=AAY、RR、DPP
   短卡匣設計
抗原決定基 9AA 17AA 25AA AAY RR DPP
1 33.6 ± 0.9 42.8 ± 2.1 42.3 ± 2.3 24.5 ± 0.5 21.7 ± 0.9 0.9 ± 0.1
2 12.0 ± 0.9 10.3 ± 0.6 14.6 ± 04 11.3 ± 0.4 8.5 ± 0.3 1.1 ± 0.2
3* n/a n/a n/a n/a n/a n/a
4 26.6 ± 2.5 16.1 ± 0.6 16.6 ± 0.8 26.1 ± 3.1 12.5 ± 0.8 1.3 ± 0.2
5 29.7 ± 0.6 21.2 ± 0.7 24.3 ± 1.4 46.3 ± 1.9 19.7 ± 0.4 1.3  ± 0.1
* 尚未產生的針對抗原決定基3之報導體T細胞
在另一實例中，構築另外一系列之短卡匣，該等卡匣除人類及小鼠抗原決定基外，亦含有定位於該卡匣之N或C末端上的靶向序列諸如泛素(Ub)、MHC及Ig-κ信號肽(SP)及/或MHC跨膜(TM)基元。(圖3)。當藉由腺病毒載體遞送至U-87 APC時，報導體T細胞再次展示多個卡匣源性抗原之有效加工及呈現。然而，各種靶向特徵對於T細胞反應之量值無明顯影響(表4)。表 4 ：添加至模型疫苗卡匣之細胞靶向序列的評價. 採用活體外T細胞活化分析證實，四個HLA-A*0201限制性標記物抗原決定基自模型卡匣有效釋放且靶向序列沒有明顯改善T細胞識別及活化。
短卡匣設計
抗原決定基 A B C D E F G H I J
1 32.5 ± 1.5 31.8 ± 0.8 29.1 ± 1.2 29.1 ± 1.1 28.4 ± 0.7 20.4 ± 0.5 35.0 ± 1.3 30.3 ± 2.0 22.5 ± 0.9 38.1 ± 1.6
2 6.1 ± 0.2 6.3 ± 0.2 7.6 ± 0.4 7.0 ± 0.5 5.9 ± 0.2 3.7 ± 0.2 7.6 ± 0.4 5.4 ± 0.3 6.2 ± 0.4 6.4 ± 0.3
3* n/a n/a n/a n/a n/a n/a n/a n/a n/a n/a
4 12.3 ± 1.1 14.1 ± 0.7 12.2 ± 0.8 13.7 ± 1.0 11.7 ± 0.8 10.6 ± 0.4 11.0 ± 0.6 7.6 ± 0.6 16.1 ± 0.5 8.7 ± 0.5
5 44.4 ± 2.8 53.6 ± 1.6 49.9 ± 3.3 50.5 ± 2.8 41.7 ± 2.8 36.1 ± 1.1 46.5 ± 2.1 31.4 ± 0.6 75.4 ± 1.6 35.7 ± 2.2
* 尚未產生的針對抗原決定基3之報導體T細胞XIV.B.3. 抗原卡匣設計之活體內評價
作為抗原卡匣設計評價之另一實例，疫苗卡匣經設計以含有5個已知以HLA-A*02:01限制性方式刺激CD8 T細胞的明確表徵之人類I類MHC抗原決定基(圖2A、3、5A)。為了評價活體內免疫原性，將含有此等標記物抗原決定基之疫苗卡匣併入腺病毒載體中且用於感染HLA-A2轉殖基因小鼠(圖4)。此小鼠模型攜帶的轉殖基因部分由人類HLAA*0201及小鼠H2-Kb組成，因此編碼由人類HLA-A2.1前導序列、連接至鼠類α3之α1及α2結構域、跨膜及細胞質H2-Kb結構域組成的嵌合I類MHC分子(Vitiello等人, 1991)。該嵌合分子允許HLA-A*02:01限制性抗原呈現，同時維持CD8輔助受體與MHC上之α3結構域的物種相配之相互作用。
對與短卡匣，所有標記物抗原決定基均產生比已通常報導的強大約10-50倍之T細胞反應，如藉由IFN-γ ELISPOT所測定(Cornet等人, 2006；Depla等人, 2008；Ishioka等人, 1999)。在評價的所有連接子中，各自含有藉由天然胺基酸序列側接之極小抗原決定基的25聚體序列多聯體產生最大且最廣泛之T細胞反應(表5)。細胞內細胞因子染色(ICS)及流式細胞量測術分析揭示，抗原特異性T細胞反應係源自於CD8 T細胞。表 5 ：短卡匣中連接子序列之活體內評價. ELISPOT資料指示，HLA-A2轉殖基因小鼠在用1e11腺病毒病毒粒子感染後17天，針對卡匣中之所有I類MHC限制性抗原決定基產生T細胞反應。
短卡匣設計
抗原決定基 9AA 17AA 25AA AAY RR DPP
1 2020+/-583 2505+/-1281 6844+/-956 1489+/-762 1675+/-690 1781+/-774
2 4472+/-755 3792+/-1319 7629+/-996 3851+/-1748 4726+/-1715 5868+/-1427
3 5830+/-315 3629+/-862 7253+/-491 4813+/-1761 6779+/-1033 7328+/-1700
4 5536+/-375 2446+/-955 2961+/-1487 4230+/-1759 6518+/-909 7222+/-1824
5 8800+/-0 7943+/-821 8423+/-442 8312+/-696 8800+/-0 1836+/-328
在另一實例中，構築一系列長疫苗卡匣且將其併入腺病毒載體中，其緊鄰著原始的5個標記物抗原決定基含有另外16個具有已知CD8 T細胞反應性之HLA-A*02:01、A*03:01及B*44:05抗原決定基(圖5A、B)。此等長卡匣之尺寸近似地模仿最終臨床卡匣設計，且僅抗原決定基相對於彼此之位置係不同的。對於長疫苗卡匣與短疫苗卡匣，CD8 T細胞反應在量值及廣度方面係相當的，證實(a)添加更多抗原決定基不會顯著影響針對原始抗原決定基集合之免疫反應的量值，及(b)抗原決定基在卡匣中之位置不影響隨之而來的針對其之T細胞反應(表6)。表 6 ：有關長卡匣中抗原決定基位置之影響的活體內評價. ELISPOT資料指示，對於長疫苗卡匣與短疫苗卡匣，HLA-A2轉殖基因小鼠在用5e10腺病毒病毒粒子感染後17天，產生之T細胞反應的量值相當。
長卡匣設計
抗原決定基 標準 錯義 短
1 863+/-1080 804+/-1113 1871+/-2859
2 6425+/-1594 28+/-62 5390+/-1357
3 * 23+/-30 36+/-18 0+/-48
4 2224+/-1074 2727+/-644 2637+/-1673
5 7952+/-297 8100+/-0 8100+/-0
* 疑似技術失誤引起T細胞反應之缺乏。XIV.B.4. 用於免疫原性及毒理學研究之抗原卡匣設計
總體而言，有關模型卡匣評價之發現(圖2-5，表2-6)證實，對於模型疫苗卡匣，當採用「串珠(string of beads)」法在基於腺病毒之載體的背景下編碼約20個抗原決定基時，實現強力的免疫原性。抗原決定基藉由串接25聚體序列組裝，該等序列各自嵌入在兩側上藉由其天然、周圍肽序列(例如在每一側上之8個胺基酸殘基)側接的極小CD8 T細胞抗原決定基(例如9個胺基酸殘基)。如本文所用，「天然」或「原生」側接序列係指給定抗原決定基在該抗原決定基處於其源蛋白質內之天然存在環境中的N及/或C末端側接序列。舉例而言，HCMV pp65 MHC I抗原決定基NLVPMVATV係藉由原生5'序列WQAGILAR側接於其5'端上且藉由原生3'序列QGQNLKYQ側接於其3'端上，由此產生在HCMV pp65源蛋白質內發現的25聚體肽WQAGILARNLVPMVATVQGQNLKYQ。天然或原生序列亦可指編碼藉由原生側接序列側接之抗原決定基的核酸序列。每個25mer序列係直接連接至隨後之25聚體序列。在極小CD8 T細胞抗原決定基係大於或小於9個胺基酸之實例中，側接肽長度可以經調整以使得總長度仍為25聚體肽序列。舉例而言，10個胺基酸之CD8 T細胞抗原決定基可以藉由8個胺基酸之序列及7個胺基酸側接。多聯體之後為兩個通用的II類MHC抗原決定基，包括該等抗原決定基係為了刺激CD4 T輔助細胞及改善疫苗卡匣抗原之總體活體內免疫原性。(Alexander 等人, 1994 ；Panina-Bordignon等人, 1989) II類抗原決定基係藉由GPGPG胺基酸連接子(SEQ ID NO:56)連接至最終I類抗原決定基。該兩個II類抗原決定基亦藉由GPGPG胺基酸連接子彼此連接且藉由GPGPG胺基酸連接子側接於C末端上。看起來，抗原決定基之位置及數量基本上不影響T細胞識別或反應。靶向序列看起來亦基本上不影響卡匣源性抗原之免疫原性。
作為另一實例，基於用模型卡匣獲得的活體外及活體內資料(圖2-5，表2-6)，產生交替已知在非人類靈長類動物(NHP)、小鼠及人類中具有免疫原性的明確表徵之T細胞抗原決定基的卡匣設計。該全部嵌入天然25聚體序列中的20個抗原決定基之後係存在於所評價的所有模型卡匣中之兩個通用II類MHC抗原決定基(圖6)。使用此卡匣設計在多個物種中研究免疫原性以及藥理學及毒理學研究。XIV.B.5.      30 、 40 及 50 個抗原之抗原卡匣設計及評價
設計具有30 (L)、40 (XL)或50 (XXL)個抗原決定基之大抗原卡匣，各自為25個胺基酸長。抗原決定基係用以模擬包括腫瘤抗原之疾病抗原之人類、NHP及小鼠抗原決定基的混合。圖29說明來自各種物種之抗原決定基之一般組織。所使用之模型抗原分別對應於人類、靈長類動物及小鼠模型抗原決定基描述於表32、33及34中。表32、33及34中之每一者描述抗原決定基位置、名稱、最小抗原決定基描述及MHC類別。
將此等卡匣選殖於如所描述之ChAdV68及α病毒疫苗載體中以評估較長多抗原決定基卡匣之功效。圖30顯示，大抗原卡匣中之每一者自ChAdV載體表現，如藉由西方墨點法由至少一個預期尺寸之主要條帶指示。
如所描述對小鼠免疫接種以評估大卡匣之功效。藉由以下分析抗原決定基AH1 (上圖)及SIINFEKL (下圖)之T細胞反應：用ChAdV68載體免疫接種之後ICS及四聚體染色(分別為圖31/表35及圖32/表36)及用srRNA載體免疫接種之後ICS (圖33/表37)。使用表現30 (L)、40 (XL)或50 (XXL)個抗原決定基之ChAdV68及srRNA疫苗載體的免疫接種誘發對模型疾病抗原決定基之CD8+免疫反應。 表32-大卡匣中之人類抗原決定基
Figure 02_image001
表33-大卡匣中之NHP抗原決定基
Figure 02_image003
表34-大卡匣中之小鼠抗原決定基
Figure 02_image005
表35：經ChAd大卡匣處理之小鼠中響應於AH1及SIINFEKL肽之平均IFNg+細胞.資料呈現為佔總CD8細胞之百分比。展示藉由ANOVA以及杜凱氏測試獲得之每組的平均值及標準差以及p 值。所有p值均與MAG 20-抗原卡匣比較。
抗原數量 抗原 平均值 標準差 p值 N
20 SIINFEKL 5.308 0.660 n/a 8
30 SIINFEKL 4.119 1.019 0.978 8
40 SIINFEKL 6.324 0.954 0.986 8
50 SIINFEKL 8.169 1.469 0.751 8
20 AH1 6.405 2.664 n/a 8
30 AH1 4.373 1.442 0.093 8
40 AH1 4.126 1.135 0.050 8
50 AH1 4.216 0.808 0.063 8
表36：經ChAd大卡匣處理之小鼠中對應於AH1及SIINFEKL抗原之平均四聚體+細胞.資料呈現為佔總CD8細胞之百分比。展示藉由ANOVA以及杜凱氏測試獲得之每組的平均值及標準差以及p值。所有p值均與MAG 20-抗原卡匣比較。
抗原數量 抗原 平均值 標準差 p值 N
20 SIINFEKL 10.314 2.384 n/a 8
30 SIINFEKL 4.551 2.370 0.003 8
40 SIINFEKL 5.186 3.254 0.009 8
50 SIINFEKL 14.113 3.660 0.072 8
20 AH1 6.864 2.207 n/a 8
30 AH1 4.713 0.922 0.036 8
40 AH1 5.393 1.452 0.223 8
50 AH1 5.860 1.041 0.543 8
表37：經SAM大卡匣處理之小鼠中響應於AH1及SIINFEKL肽之平均IFNg+細胞.資料呈現為佔總CD8細胞之百分比。展示藉由ANOVA以及杜凱氏測試獲得之每組的平均值及標準差以及p值。所有p值均與MAG 20-抗原卡匣比較。
抗原數量 抗原 平均值 標準差 p值 N
20 SIINFEKL 1.843 0.422 n/a 8
30 SIINFEKL 2.112 0.522 0.879 7
40 SIINFEKL 1.754 0.978 0.995 7
50 SIINFEKL 1.409 0.766 0.606 8
20 AH1 3.050 0.909 n/a 8
30 AH1 0.618 0.427 1.91E-05 7
40 AH1 1.286 0.284 0.001 7
50 AH1 1.309 1.149 0.001 8
XV.        ChAd 抗原卡匣遞送載體 XV.A.    ChAd 抗原卡匣遞送載體之構築
在一個實例中，將黑猩猩腺病毒(ChAd)工程改造成用於抗原卡匣之遞送載體。在另一實例中，基於缺失E1 (nt 457至3014)及E3 (nt27,816-31,332)序列的AC_000011.1(來自專利US 6083716之序列2)合成全長ChAdV68載體。插入處於CMV啟動子/強化子控制下的報導基因代替缺失之E1序列。將此純系轉染至HEK293細胞中不會產生感染性病毒。為了確定野生型C68病毒之序列，自ATCC獲得分離株VR-594，傳代，且接著獨立地定序(SEQ ID NO: 10)。當將AC_000011.1序列與野生型ChAdV68病毒之ATCC VR-594序列(SEQ ID NO: 10)相比較時，鑑別出6個核苷酸差異。在一個實例中，基於相應ATCC VR-594核苷酸在五個位置處經取代之AC_000011.1產生經修飾之ChAdV68 載體(ChAdV68.5WTnt SEQ ID NO: 1)。
在另一實例中，基於缺失E1 (nt 577至3403)及E3 (nt 27,816-31,332)序列且相應ATCC VR-594 核苷酸在四個位置經取代之AC_000011.1產生經修飾之ChAdV68載體。插入處於CMV啟動子/強化子控制下之GFP報導體(ChAdV68.4WTnt.GFP；SEQ ID NO: 11)或模型新抗原卡匣(ChAdV68.4WTnt.MAG25mer；SEQ ID NO: 12)代替缺失之E1序列。
在另一實例中，基於缺失E1 (nt 577 至3403)及E3 (nt 27,125-31,825)序列且相應ATCC VR-594 核苷酸在五個位置經取代之AC_000011.1產生經修飾之ChAdV68載體。插入處於CMV啟動子/強化子控制下之GFP報導體(ChAdV68.5WTnt.GFP；SEQ ID NO: 13)或模型新抗原卡匣(ChAdV68.5WTnt.MAG25mer；SEQ ID NO: 2)代替缺失之E1序列。
相關載體在下文描述： - 全長ChAdVC68序列「ChAdV68.5WTnt」 (SEQ ID NO: 1)；相應ATCC VR-594核苷酸在五個位置經取代之AC_000011.1序列。 - ATCC VR-594 C68 (SEQ ID NO:10)；獨立定序；全長C68 - ChAdV68.4WTnt .GFP (SEQ ID NO:11)；缺失E1 (nt 577至3403)及E3 (nt 27,816-31,332)序列；相應ATCC VR-594核苷酸在四個位置經取代；插入處於CMV啟動子/強化子控制下之GFP報導體代替缺失之E1的AC_000011.1 - ChAdV68.4WTnt .MAG25mer (SEQ ID NO:12)；缺失E1 (577至3403)及E3 (nt 27,816-31,332)序列；相應ATCC VR-594核苷酸在四個位置經取代；插入處於CMV啟動子/強化子控制下之模型新抗原卡匣代替缺失之E1的AC_000011.1 - ChAdV68.5WTnt.GFP (SEQ ID NO: 13)；缺失E1 (nt 577 至3403)及E3 (nt 27,125-31,825)序列；相應ATCC VR-594核苷酸在五個位置經取代；插入處於CMV啟動子/強化子控制下之GFP報導體代替缺失之E1的AC_000011.1XV.B.    ChAd 抗原卡匣遞送載體測試 XV.B.1. ChAd 載體評價之方法及材料 使用脂染胺轉染 HEK293A 細胞
使用以下方案，製備ChAdV68構築體(ChAdV68.4WTnt.GFP、ChAdV68.5WTnt.GFP、ChAdV68.4WTnt.MAG25mer及ChAdV68.5WTnt.MAG25mer)之DNA且將其轉染至HEK293A細胞中。
用PacI消化10 μg質體DNA以釋放病毒基因組。隨後使用GeneJet DNA清除微柱(Thermo Fisher)根據製造商對長DNA片段之說明書純化DNA，且在20 ul經預加熱之水中溶離；在溶離步驟之前將管柱在37度下靜置0.5-1小時。
在轉染之前，將HEK293A以106個細胞/孔之細胞密度引入6孔培養盤中，保持14-18小時。用每孔1 ml新鮮培養基(含青黴素/鏈黴素及麩胺酸之DMEM-10% hiFBS)覆蓋細胞。在根據製造商的方案，用微升體積(2-4 ul)脂染胺2000兩次轉染中使用每孔1-2 ug之純化DNA。將0.5 ml含有轉染混合物之OPTI-MEM培養基添加至各孔中之1 ml標準生長培養基中且在細胞上保持隔夜。
在37℃下培育經轉染之細胞培養物至少5-7天。若在轉染後第7天未見到病毒蝕斑，則將細胞以1:4或1:6分離，且在37℃下培育以監測蝕斑之產生。可替代地，收集經轉染之細胞且進行3個冷凍及解凍循環，且使用細胞溶解產物感染HEK293A細胞且培育細胞直至觀測到病毒蝕斑。使用磷酸鈣將 ChAdV68 轉染至 HEK293A 細胞中且產生第三代病毒原液
使用以下方案，製備ChAdV68構築體(ChAdV68.4WTnt.GFP、ChAdV68.5WTnt.GFP、ChAdV68.4WTnt.MAG25mer、ChAdV68.5WTnt.MAG25mer)之DNA且將其轉染至HEK293A細胞中。
在轉染前一天，將HEK293A細胞以106 個細胞/孔接種於6孔盤之5% BS/DMEM/1XP/S、1XGlutamax中。每次轉染需要兩個孔。在轉染前二至四小時，將培養基更換成新鮮培養基。用PacI 使ChAdV68.4WTnt.GFP質體線性化。接著，用酚氯仿提取經線性化之DNA且使用十分之一體積之3M乙酸鈉pH 5.3及兩體積之100%乙醇使其沈澱。藉由以12,000xg 離心5分鐘使沈澱之DNA集結，隨後用70%乙醇洗滌1次。空氣乾燥集結粒且使其再懸浮於50 μL無菌水中。使用NanoDropTM (ThermoFisher)測定DNA濃度且將體積調整至5 μg DNA/50 μL。
將169 μL無菌水添加至微量離心管中。隨後將5 μL 2M CaCl2 添加至水且藉由移液輕緩地混合。將50 μL DNA逐滴添加至CaCl2 水溶液。接著添加二十六微升2M CaCl2 且藉由用微量移液管移液兩次小心地混合。此最終溶液應當由於250 μL 0.25M CaCl2 中之5 μg DNA組成。接著製備含有250 μL 2XHBS(Hepes緩衝溶液)之第二管。使用連接至Pipet-Aid空氣之2 mL無菌移液管緩慢鼓泡通過2XHBS溶液。同時，逐滴添加於0.25M CaCl2 溶液中之DNA溶液。在添加最終DNA液滴之後，繼續鼓泡約5秒。接著在室溫下培育溶液達20分鐘，隨後添加至293A細胞中。將250 μL DNA/磷酸鈣溶液逐滴添加至前一天以106 個細胞/孔接種於6孔盤中的293A細胞單層中。將細胞放回恆溫箱中且培育隔夜。24小時後更換培養基。72小時後，將細胞以1:6分至6孔盤中。每天藉由光學顯微鏡檢查監測細胞單層之細胞病變效應(CPE)之跡象。轉染後7-10天，觀測到病毒蝕斑且藉由用移液管移取孔中之培養基以使細胞升高來收集細胞單層。將收集之細胞及培養基轉移至50 mL離心管中，隨後進行三輪冷凍解凍(在-80℃及37℃下)。隨後之溶解產物，稱為初代病毒原液，藉由在桌上型離心機(4300Xg)上全速離心來澄清且使用一部分溶解產物(10-50%)感染T25燒瓶中之293A細胞。將感染之細胞培育48小時，隨後在完全CPE下收集細胞及培養基。再次收集細胞，冷凍解凍且澄清，隨後使用此第二代病毒原液感染以每個燒瓶1.5 × 107 個細胞接種之T150燒瓶。在72小時實現完全CPE之後，以與先前病毒原液相同之方式收集且處理培養基及細胞以產生第三代原液。在 293F 細胞中之製造
在8% CO2 之恆溫箱中，在293FreeStyleTM (ThermoFisher)培養基中生長之293F細胞中產生ChAdV68病毒。感染當天，將細胞稀釋至106 個細胞/毫升，且具有98%活力，且在每個生產週期於1L搖瓶(Corning)中使用400 mL。每次感染使用靶MOI ＞3.3之4 mL第三代病毒原液。將細胞培育48-72小時，直至藉由錐蟲藍量測到活力＜70%。接著，藉由全速桌上型離心機離心來收集及經感染細胞且在1×PBS中洗滌，再離心，且接著使其再懸浮於20 mL之10mM Tris pH 7.4中。藉由冷凍解凍3次將細胞集結粒溶解且藉由以4,300Xg離心5分鐘使其澄清。藉由 CsCl 離心純化
藉由CsCl離心使病毒DNA純化。執行兩次不連續梯度操作。第一次係自細胞組分中純化出病毒且第二次係自細胞組分進一步優化分離且將缺陷性粒子與感染性粒子分離。
將10 mL之1.2 (26.8g CsCl溶解於92 mL之10 mM Tris pH 8.0中) CsCl添加至異質同晶聚合物管中。接著，使用移液管遞送至管底部，小心地添加8 mL之1.4 CsCl (53 g CsCl溶解於87 mL之10 mM Tris pH 8.0中)。將澄清之病毒小心地鋪在該1.2層之頂部上。必要時，再添加10 mM Tris以使各管平衡。接著將該等管置放於SW-32Ti旋轉器中且在10℃下離心2小時30分鐘。接著將該管移至層流櫃中且使用18號針及10 mL注射器抽吸病毒帶。應避免取出污染性宿主細胞DNA及蛋白質。接著用10 mM Tris pH 8.0將該病毒帶稀釋至少2倍並如前所述鋪在如上文所描述之不連續梯度上。如前所述進行操作，然而，此時進行該操作隔夜。次日，小心抽吸病毒帶以避免抽吸出任何缺陷性粒子帶。接著使用Slide-a-LyzerTM 盒(Pierce)針對ARM緩衝液(20 mM Tris pH 8.0、25 mM NaCl、2.5%丙三醇)透析病毒。進行此操作3次，每次更換緩衝液保持1小時。接著將病毒等分以在-80℃下儲存。病毒分析
基於1.1× 1012 個病毒粒子(VP)之消光係數相當於在OD260 nm下之吸光度值1，藉由使用OD 260分析測定VP濃度。在病毒溶解緩衝液(0.1% SDS、10 mM Tris pH 7.4、1 mM EDTA)中製備腺病毒之兩種稀釋液(1:5及1:10)。一式兩份量測該兩種稀釋液之OD且藉由用OD260值乘以稀釋因子乘以1.1× 1012 VP來量測每毫升VP濃度。
利用病毒原液之限制性稀釋分析來計算感染單位(IU)力價。病毒起初在DMEM/5%NS/1× PS中100倍稀釋且接著，使用10倍稀釋法稀釋至1× 10-7 。接著，將100 μL此等稀釋液添加至在之前至少一小時以3e5個細胞/孔接種於24孔盤中之293A細胞中。一式兩份地執行此操作。培養盤在37℃ 下在CO2 (5%)培育箱中培育48 h。接著用1×PBS洗滌細胞，且接著用100%冷甲醇(-20℃)固定。接著在-20℃培育該等盤最少20分鐘。用1×PBS洗滌各孔，接著在室溫下，在1×PBS/0.1% BSA中阻斷1小時。添加兔抗Ad 抗體(Abcam, Cambridge, MA)於阻斷緩衝液中之1:8,000稀釋液(每孔0.25 ml)且在室溫下培育1小時。用每孔0.5 mL PBS洗滌各孔4 次。每孔添加1000倍稀釋的HRP 偶聯之山羊抗兔抗體(Bethyl Labs, Montgomery Texas)且培育1小時，隨後進行最後一輪洗滌。進行5次PBS洗滌且使用於含0.01% H2 O2 之Tris緩衝生理食鹽水中的二胺基聯苯胺四鹽酸鹽(Diaminobenzidine tetrahydrochloride，DAB)受質(0.67 mg/mL DAB於50 mM Tris pH 7.5、150 mM NaCl)使該等盤顯色。使各孔顯色5 分鐘，隨後計數。使用產生每個視野4-40個經染色細胞之稀釋液，在10×下對細胞計數。所用視野係0.32 mm2 柵格，相當於在24孔盤上每個視野有625個柵格。可以藉由每個柵格中經染色細胞之數量乘以每個視野之柵格數量乘以稀釋因子10測定每毫升中感染性病毒之數量。類似地，當用GFP表現性細胞操作時，可以使用螢光而非衣殼染色來測定每毫升中GFP表現性病毒粒子之數量。免疫接種
經兩側肌肉內注射向C57BL/6J雌性小鼠及Balb/c雌性小鼠注射1× 108 個ChAdV68.5WTnt.MAG25mer病毒粒子(VP)，體積為100 uL(每條腿50 uL) 。脾細胞解離
將每隻小鼠之脾及淋巴結匯集於3 mL完全RPMI (RPMI、10% FBS、青黴素/鏈黴素)中。使用gentleMACS 解離器(Miltenyi Biotec)，遵循製造商的方案進行機械解離。經由40微米過濾器過濾解離之細胞且用ACK溶解緩衝液(150 mM NH4 Cl、10 mM KHCO3 、0.1 mM Na2 EDTA)溶解紅細胞。再次經由30微米過濾器過濾細胞且接著使其再懸浮於完全RPMI中。在Attune NxT流式細胞儀(Thermo Fisher)上使用碘化丙錠染色對細胞計數以排除死亡及凋亡之細胞。接著將細胞調整至適當活細胞濃度以供隨後分析。離體酶聯免疫斑點 (ELISPOT) 分析
ELISPOT分析係根據ELISPOT統一準則{DOI: 10.1038/nprot.2015.068}，利用小鼠IFNg ELISpotPLUS 套組(MABTECH)進行。將5× 104 個脾細胞與10 uM指定肽一起在塗有IFNg抗體之96孔盤中培育16小時。使用鹼性磷酸酶使斑點顯色。對反應定時10分鐘且藉由用自來水流過盤終止反應。使用AID vSpot讀取器譜圖對斑點計數。對於ELISPOT分析，將飽和度＞50%之孔記錄為「太多而無法計數」。將複製孔之偏差＞10%的樣品自分析中排除。接著，使用下式，針對孔匯合校正斑點計數：斑點計數+2 × (斑點計數×%匯合/[100%-%匯合])。藉由用抗原刺激之孔減去陰性肽刺激孔中之斑點計數來校正陰性背景。最後，將標記為太多而無法計數之孔設定成最高觀測校正值，四捨五入至最接近之百分數。XV.B.2. 在 DNA 轉染之後 ChAdV68 病毒遞送粒子之製造
在一個實例中，將ChAdV68.4WTnt.GFP (圖7)及ChAdV68.5WTnt. GFP (圖8) DNA轉染至HEK293A細胞中且在轉染之後7-10天觀測病毒複製(病毒蝕斑)。使用光學顯微鏡檢查(圖7A及8A)及螢光顯微鏡檢查(圖7B-C及圖8B-C)觀測ChAdV68 病毒蝕斑。GFP 表示產毒ChAdV68病毒遞送粒子之產生。XV.B.3. ChAdV68 病毒遞送粒子擴增
在一個實例中，使ChAdV68.4WTnt .GFP、ChAdV68.5WTnt.GFP及ChAdV68.5WTnt.MAG25mer病毒在HEK293F細胞中擴增且在轉染之後18天，製備純化之病毒原液(圖9)。定量經純化ChAdV68病毒原液中之病毒粒子數且與使用相同方案製造的5型腺病毒(Ad5)及ChAdVY25(密切相關之ChAdV；Dicks, 2012, PloS ONE 7, e40385)病毒原液相比較。ChAdV68病毒力價與Ad5及ChAdVY25相當(表7)。表 7 . 在293F懸浮細胞中產生腺病毒載體
構築體 平均 VP/ 單元 +/-SD
Ad5-載體(多載體) 2.96e4+/- 2.26e4
Ad5-GFP 3.89e4
chAdY25-GFP 1.75e3+/-6.03e1
ChAdV68.4WTnt.GFP 1.2e4 +/-6.5e3
ChAdV68.5WTnt.GFP 1.8e3
ChAdV68.5WTnt.MAG25mer 1.39e3+/-1.1e3
* SD僅在執行多個生產週期情況下報導XV.B.4. 評價在腫瘤模型中之免疫原性
在小鼠免疫原性研究中評價表現小鼠腫瘤抗原之C68載體以證實C68 載體引起T細胞反應。在C57BL/6J 雌性小鼠中量測針對I類MHC抗原決定基SIINFEKL之T細胞反應且在Balb/c小鼠中量測針對I類MHC抗原決定基AH1-A5(Slansky等人, 2000, Immunity13:529-538)之T細胞反應。如圖15 中所示，在用ChAdV68.5WTnt.MAG25mer免疫接種小鼠之後量測相對於對照之強烈的T細胞反應。當對C57BL/6J或Balb/c小鼠免疫接種ChAdV68.5WTnt.MAG25mer 時，在免疫接種之後10天，在ELISpot分析中分別觀測到每106 個脾細胞8957個或4019個斑點形成細胞(SFC)之平均細胞免疫反應。
亦在評估ChAdV及抗CTLA4抗體之共同投藥之CT26腫瘤模型中評估腫瘤浸潤性淋巴球。小鼠經植入CT26腫瘤細胞且在植入7天之後用ChAdV疫苗免疫接種且用抗CTLA4抗體(純系9D9)或IgG處理作為對照。在免疫接種12天之後分析腫瘤浸潤性淋巴球。使用gentleMACS解離器(Miltenyi Biotec)及小鼠腫瘤解離套組(Miltenyi Biotec)解離來自各小鼠之腫瘤。經由30微米過濾器過濾解離細胞且使其再懸浮於完全RPMI中。在Attune NxT流式細胞儀(Thermo Fisher)上使用碘化丙錠染色對細胞計數以排除死亡及凋亡之細胞。接著將細胞調整至適當活細胞濃度以供隨後分析。藉由MHC-四聚體複合物鑑別抗原特異性細胞且用抗CD8及生存力標記物共同染色。在初免免疫接種12天之後收集腫瘤。
腫瘤內之抗原特異性CD8+ T細胞分別在經ChAdV、抗CTLA4 及ChAdV+ 抗-CTLA4處理之群組中包含佔總存活細胞群之3.3%、2.2%或8.1%之中值(圖41及表40)。用抗CTLA與活性ChAdV免疫接種的組合處理相比於單獨ChAdV及單獨抗CTLA4兩者導致抗原特異性CD8+ T細胞頻率統計顯著增加，從而說明抗CTLA4在與ChAdV68疫苗共同投與時增加腫瘤內之浸潤性T細胞數目。 表40 - CT26腫瘤中之四聚體+浸潤性CD8 T細胞頻率
處理 四聚體 + 中值百分比
ChAdV68.5WTnt.MAG25mer (ChAdV) 3.3
抗CTLA4 2.2
ChAdV68.5WTnt.MAG25mer (ChAdV) + 抗CTLA4 8.1
XVI. α 病毒抗原卡匣遞送載體 XVI.A. α 病毒遞送載體評價之材料及方法 活體外轉錄以產生 RNA
對於活體外測試 ：藉由用PmeI限制性消化使質體DNA線性化，遵循製造商的方案(GeneJet DNA淨化套組, Thermo)進行管柱純化且用作模板。根據製造商的方案，使用RiboMAX大規模RNA生產系統(Promega)，利用m7 G帽類似物(Promega)進行活體外轉錄。根據製造商的方案，使用RNeasy套組(Qiagen)純化mRNA。
對於活體內研究 ：產生RNA且由TriLink Biotechnologies純化且用Enzymatic Cap1封端。RNA 轉染
轉染前約16小時，HEK293A細胞對於96孔係以6e4個細胞/孔接種且對於24孔係以2e5個細胞/孔接種。使用MessengerMAX脂染胺(Invitrogen)且遵循製造商的方案，用mRNA轉染細胞。對於96孔，每孔使用0.15 uL脂染胺及10 ng mRNA，且對於24孔，每孔使用0.75 uL脂染胺及150 ng mRNA。GFP表現mRNA(TriLink Biotechnologies)用作轉染對照。螢光素酶分析
使用ONE-Glo螢光素酶分析(Promega)，遵循製造商的方案，在每種條件下於白色壁96孔盤中一式三份進行螢光素酶報導體分析。使用SpectraMax量測發光。qRT-PCR
在轉染後2小時，用新鮮培養基沖洗經轉染之細胞且更換培養基以 移除任何未經轉染之mRNA。接著，在各種時間點，將細胞收集於RLT plus 溶解緩衝液(Qiagen)中，使用QiaShredder (Qiagen)均質化且使用RNeasy套組(Qiagen)提取RNA，所有操作均遵循製造商的方案。使用Nanodrop (Thermo Scientific)量化總RNA。每次反應使用20 ng總RNA，使用Quantitect Probe One-Step RT-PCR套組(Qiagen)在qTower3 (Analytik Jena)上根據製造商之方案進行qRT-PCR。對於每個探針，一式三份地操作各樣品。肌蛋白或GusB用作參考基因。定製引子/探針係由IDT產生(表8)。表 8. qPCR引子/探針
目標      
Luci 引子1 GTGGTGTGCAGCGAGAATAG
   引子2 CGCTCGTTGTAGATGTCGTTAG
   探針 /56-FAM/TTGCAGTTC/ZEN/TTCATGCCCGTGTTG/3IABkFQ/
GusB 引子1 GTTTTTGATCCAGACCCAGATG
   引子2 GCCCATTATTCAGAGCGAGTA
   探針 /56-FAM/TGCAGGGTT/ZEN/TCACCAGGATCCAC/3IABkFQ/
ActB 引子1 CCTTGCACATGCCGGAG
   引子2 ACAGAGCCTCGCCTTTG
   探針 /56-FAM/TCATCCATG/ZEN/GTGAGCTGGCGG/3IABkFQ/
MAG-25聚體 引子1 CTGAAAGCTCGGTTTGCTAATG
Set1 引子2 CCATGCTGGAAGAGACAATCT
   探針 /56-FAM/CGTTTCTGA/ZEN/TGGCGCTGACCGATA/3IABkFQ/
MAG-25聚體 引子1 TATGCCTATCCTGTCTCCTCTG
Set2 引子2 GCTAATGCAGCTAAGTCCTCTC
   探針 /56-FAM/TGTTTACCC/ZEN/TGACCGTGCCTTCTG/3IABkFQ/
B16-OVA 腫瘤模型
在C57BL/6J小鼠左下方側腹部中注射105 個B16-OVA細胞/動物。在免疫接種之前，使腫瘤生長3天。CT26 腫瘤模型
在Balb/c小鼠左下方側腹部中注射106 個CT26細胞/動物。在免疫接種之前，使腫瘤生長7天。免疫接種
對於srRNA疫苗，經兩側肌肉內注射向小鼠注射10 ug RNA，體積100 uL(每條腿50 uL)。對於Ad5疫苗，經兩側肌肉內注射向小鼠注射5 × 1010 個病毒粒子(VP)，體積100 uL(每條腿50 uL)。每週2次，經由腹膜內注射向動物注射250 ug劑量的抗CTLA-4 (純系9D9, BioXcell)、抗PD-1 (純系RMP1-14, BioXcell)或抗IgG (純系MPC-11, BioXcell)。活體內生物發光成像
在每個時間點，經由腹膜內注射向小鼠注射150 mg/kg螢光素受質且在注射之後10-15分鐘，使用IVIS活體內成像系統(PerkinElmer)量測生物發光。脾細胞解離
將每隻小鼠之脾及淋巴結匯集於3 mL完全RPMI (RPMI、10% FBS、青黴素/ 鏈黴素)中。使用gentleMACS 解離器(Miltenyi Biotec)，遵循製造商的方案進行機械解離。經由40微米過濾器過濾解離之細胞且用ACK溶解緩衝液(150 mM NH4 Cl、10 mM KHCO3 、0.1 mM Na2 EDTA)溶解紅細胞。再次經由30微米過濾器過濾細胞且接著使其再懸浮於完全RPMI中。在Attune NxT流式細胞儀(Thermo Fisher)上使用碘化丙錠染色對細胞計數以排除死亡及凋亡之細胞。接著將細胞調整至適當活細胞濃度以供隨後分析。離體酶聯免疫斑點 (ELISPOT) 分析
ELISPOT分析係根據ELISPOT統一準則{DOI: 10.1038/nprot.2015.068}，利用小鼠IFNg ELISpotPLUS套組(MABTECH)進行。將5 × 104 個脾細胞與10 uM指定肽一起在塗有IFNg抗體之96孔盤中培育16小時。使用鹼性磷酸酶使斑點顯色。對反應定時10分鐘且藉由用自來水流過盤終止反應。使用AID vSpot 讀取器譜圖對斑點計數。對於ELISPOT分析，將飽和度＞50%之孔記錄為「太多而無法計數」。將複製孔之偏差＞10%的樣品自分析中排除。接著，使用下式，針對孔匯合校正斑點計數：斑點計數+2 × (斑點計數×%匯合/[100%-%匯合])。藉由用抗原刺激之孔減去陰性肽刺激孔中之斑點計數來校正陰性背景。最後，將標記為太多而無法計數之孔設定成最高觀測校正值，四捨五入至最接近之百分數。XVI.B. α 病毒載體 XVI.B.1. α 病毒載體活體外評價
在本發明之一個實施方案中，由基於委內瑞拉馬腦炎(Venezuelan Equine Encephalitis，VEE)(Kinney, 1986, Virology 152: 400-413)之自我複製RNA(srRNA)載體產生用於抗原表現系統之RNA α病毒主鏈。在一個實例中，編碼位於26S亞基因组啟動子3'端的VEE結構蛋白之序列缺失(VEE序列7544至11,175缺失；編號基於Kinney等人1986；SEQ ID NO: 6)且經抗原序列(SEQ ID NO:14及SEQ ID NO: 4)或螢光素酶報導體(例如VEE-螢光素酶，SEQ ID NO: 15)替換(圖10)。由srRNA DNA載體活體外轉錄RNA，將其轉染至HEK293A細胞中且量測螢光素酶報導體表現。此外，用編碼螢光素酶之(非複製性)mRNA轉染以供比較。當比較23小時量測值與2小時量測值時，對於VEE-螢光素酶srRNA觀測到srRNA報導體信號有約30,000 倍增加(表9)。相比之下，在相同時間段內，mRNA報導體展現＜10倍之信號增加(表9)。表 9 . 來自VEE自我複製載體之螢光素酶的表現隨時間增加. 在96孔中用每孔10 ngVEE-螢光素酶srRNA或10 ng 非複製性螢光素酶Mrna (TriLink L-6307)轉染HEK293A細胞。在轉染倍各種時間量測發光。螢光素酶表現係以相對發光單位(RLU)報導。每個資料點係3個轉染孔之平均值+/-SD。
構築體 時間點 (hr) 平均 RLU 標準差 ( 三個重複孔 )
mRNA 2 878.6666667 120.7904522
mRNA 5 1847.333333 978.515372
mRNA 9 4847 868.3271273
mRNA 23 8639.333333 751.6816702
SRRNA 2 27 15
SRRNA 5 4884.333333 2955.158935
SRRNA 9 182065.5 16030.81784
SRRNA 23 783658.3333 68985.05538
在另一實例中，藉由使用定量逆轉錄聚合酶鏈反應(qRT-PCR)量測編碼螢光素酶之srRNA (VEE-螢光素酶)或編碼多抗原決定基卡匣之srRNA (VEE-MAG25mer)轉染之後的RNA含量來直接確定srRNA之複製。對於VEE-螢光素酶srRNA觀測到約150倍的RNA增加(表10)，而對於VEE-MAG25mer srRNA觀測到30-50倍的RNA增加(表11)。此等資料證實，當轉染至細胞中時，VEE srRNA載體複製。表 10. VEE-螢光素酶srRNA轉染之細胞中RNA複製的直接量測.用VEE-螢光素酶srRNA (150 ng/孔，24孔)轉染HEK293A細胞且在轉染之後各種時間，藉由qRT-PCR定量RNA含量。基於肌動蛋白參考基因使各量測值標準化且呈現相對於2小時時間點之倍數變化。
時間點 (hr) 螢光素酶 Ct 肌動蛋白 Ct dCt Ref dCt ddCt 相對倍數變化
2 20.51 18.14 2.38 2.38 0.00 1.00
4 20.09 18.39 1.70 2.38 -0.67 1.59
6 15.50 18.19 -2.69 2.38 -5.07 33.51
8 13.51 18.36 -4.85 2.38 -7.22 149.43
表 11 . VEE-MAG25mer srRNA轉染之細胞中RNA複製的直接量測.用VEEMAG25mer srRNA (150 ng/孔，24孔)轉染HEK293細胞且在轉染之後各種時間，藉由qRT-PCR定量RNA含量。基於GusB參考基因使各量測值標準化且呈現相對於2小時時間點之倍數變化。圖上的不同線表示2個不同的qPCR引子/探針集，該兩個集合均偵測srRNA之抗原決定基卡匣區。
引子 / 探針 時間點 (hr) Ct GusB Ct dCt Ref dCt ddCt 相對倍數變化
Set1 2 18.96 22.41 -3.45 -3.45 0.00 1.00
Set1 4 17.46 22.27 -4.81 -3.45 -1.37 2.58
Set1 6 14.87 22.04 -7.17 -3.45 -3.72 13.21
Set1 8 14.16 22.19 -8.02 -3.45 -4.58 23.86
Set1 24 13.16 22.01 -8.86 -3.45 -5.41 42.52
Set1 36 13.53 22.63 -9.10 -3.45 -5.66 50.45
Set2 2 17.75 22.41 -4.66 -4.66 0.00 1.00
Set2 4 16.66 22.27 -5.61 -4.66 -0.94 1.92
Set2 6 14.22 22.04 -7.82 -4.66 -3.15 8.90
Set2 8 13.18 22.19 -9.01 -4.66 -4.35 20.35
Set2 24 12.22 22.01 -9.80 -4.66 -5.13 35.10
Set2 36 13.08 22.63 -9.55 -4.66 -4.89 29.58
XVI.B.2. α 病毒載體之活體內評價
在另一實例中，在活體內評價VEE-螢光素酶報導體表現。對小鼠注射10 μg封裝於脂質奈米粒子(MC3)中之VEE-螢光素酶srRNA且在注射後24小時及48小時，以及7天及14天使其成像以測定生物發光信號。在注射後24小時偵測到螢光素酶信號且其隨時間增加，且在srRNA注射之後7天出現峰值(圖11)。XVI.B.3. α 病毒載體腫瘤模型評價
在一個實施方案中，為了確定VEE srRNA載體在活體內引導抗原特異性免疫反應，產生表現2種不同I類MHC小鼠腫瘤抗原決定基SIINFEKL及AH1-A5 之VEE srRNA 載體(VEE-UbAAY，SEQ ID NO: 14)(Slansky等人, 2000, Immunity 13:529-538)。利用B16-OVA黑素瘤細胞株表現SFL (SIINFEKL)抗原決定基，且AH1-A5 (SPSYAYHQF；Slansky等人, 2000, Immunity)抗原決定基誘發T細胞靶向由CT26結腸癌細胞株表現之相關抗原決定基(AH1/SPSYVYHQF ；Huang 等人, 1996, Proc Natl Acad Sci USA 93:9730-9735)。在一個實例中，對於活體內研究，藉由使用T7聚合酶(TriLink Biotechnologies)活體外轉錄來產生VEEUbAAY srRNA且將其封裝於脂質奈米粒子(MC3)中。
在用MC3調配之VEE-UbAAY srRNA免疫接種帶有B16-OVA腫瘤之小鼠之後兩週，觀測到相對於對照，靶向SFL的強烈抗原特異性T細胞反應。在一個實例中，在用SFL肽刺激之後，在ELISpot分析中量測到每106 個脾細胞3835個(中值)斑點形成細胞(SFC) (圖12A，表12)且如藉由五聚體染色所量測，1.8%(中值)之CD8 T細胞具有SFL抗原特異性(圖12B，表12)。在另一實例中，共投與抗CTLA-4單株抗體(mAb)及VEEsrRNA疫苗引起總體T細胞反應之中度增加，且在ELISpot分析中量測到每106 個脾細胞的4794.5個(中值)SFC (圖12A，表12)。表 12 . 在帶有B16-OVA腫瘤之C57BL/6J小鼠中VEE srRNA免疫接種後14天ELISPOT及MHCI-五聚體染色分析之結果。
群組 小鼠 SFC/1e6 脾細胞 五聚體陽性 (CD8 之百分比 ) 群組 小鼠 SFC/1e6 脾細胞 五聚體陽性 (CD8 之百分比 )
對照 1 47 0.22 Vax 1 6774 4.92
2 80 0.32 2 2323 1.34
3 0 0.27 3 2997 1.52
4 0 0.29 4 4492 1.86
5 0 0.27 5 4970 3.7
6 0 0.25 6 4.13
7 0 0.23 7 3835 1.66
8 87 0.25 8 3119 1.64
aCTLA4 1 0 0.24 Vax + aCTLA4 1 6232 2.16
2 0 0.26 2 4242 0.82
3 0 0.39 3 5347 1.57
4 0 0.28 4 6568 2.33
5 0 0.28 5 6269 1.55
6 0 0.28 6 4056 1.74
7 0 0.31 7 4163 1.14
8 6 0.26 8 3667 1.01
* 應注意，自 Vax 組中小鼠 #6 得到的結果由於三個重複孔之間變化較大而自分析排除。
在另一實施方案中，為反映臨床方法，在B16-OVA及CT26小鼠腫瘤模型中進行異源初免/增強免疫，其中帶有腫瘤之小鼠先用表現相同抗原卡匣之腺病毒載體(Ad5-UbAAY)免疫接種，隨後在Ad5-UbAAY初免之後14天，用VEE-UbAAY srRNA疫苗增強免疫。在一個實例中，藉由Ad5-UbAAY疫苗誘發抗原特異性免疫反應，由此在ELISpot分析中量測到每106 個脾細胞7330個(中值)SFC(圖13A ，表13)且藉由五聚體染色量測到2.9%(中值)之CD8 T細胞靶向SFL抗原(圖13 C，表13)。在另一實例中，在VEE-UbAAY srRNA增強免疫之後2週，B16-OVA模型中仍維持T細胞反應，且在ELISpot分析中量測到每106 個脾細胞3960個(中值)SFL特異性SFC(圖13 B，表13)且藉由五聚體染色量測到3.1%(中值)之CD8T細胞靶向SFL抗原(圖13 D，表13)。表 13 . 用Ad5疫苗初免及srRNA增強免疫進行異源初免/增強免疫之後B16-OVA小鼠之免疫監測。
第 14 天
群組 小鼠 SFC/1e6 脾細胞 五聚體陽性 (CD8 之百分比 ) 群組 小鼠 SFC/1e6 脾細胞 五聚體陽性 (CD8 之百分比 )
對照 1 0 0.10 Vax 1 8514 1.87
2 0 0.09 2 7779 1.91
3 0 0.11 3 6177 3.17
4 46 0.18 4 7945 3.41
5 0 0.11 5 8821 4.51
6 16 0.11 6 6881 2.48
7 0 0.24 7 5365 2.57
8 37 0.10 8 6705 3.98
aCTLA4 1 0 0.08 Vax + aCTLA4 1 9416 2.35
2 29 0.10 2 7918 3.33
3 0 0.09 3 10153 4.50
4 29 0.09 4 7212 2.98
5 0 0.10 5 11203 4.38
6 49 0.10 6 9784 2.27
7 0 0.10 8 7267 2.87
8 31 0.14
第 28 天
群組 小鼠 SFC/1e6 脾細胞 五聚體陽性 (CD8 之百分比 ) 群組 小鼠 SFC/1e6 脾細胞 五聚體陽性 (CD8 之百分比 )
對照 2 0 0.17 Vax 1 5033 2.61
4 0 0.15 2 3958 3.08
6 20 0.17 4 3960 3.58
aCTLA4 1 7 0.23 Vax + aCTLA4 4 3460 2.44
2 0 0.18 5 5670 3.46
3 0 0.14
在另一實施方案中，在Ad5-UbAAY初免及VEE-UbAAY srRNA增強免疫之後，在CT26小鼠模型中觀測到類似結果。在一個實例中，在Ad5-UbAAY初免(第14天)之後觀測到AH1抗原特異性反應且在ELISpot分析中量測到每106 個脾細胞平均5187個SFC(圖14 A，表14)且在VEE-UbAAY srRNA增強免疫(第28天)之後於ELISpot分析中量測到每106 個脾細胞平均3799個SFC(圖14 B，表14)。表 14 . 在CT26腫瘤小鼠模型中異源初免/增強免疫之後的免疫監測。
第 12 天 第 21 天
群組 小鼠 SFC/1e6 脾細胞 群組 小鼠 SFC/1e6 脾細胞
對照 1 1799 對照 9 167
2 1442 10 115
3 1235 11 347
aPD1 1 737 aPD1 8 511
2 5230 11 758
3 332 Vax 9 3133
Vax 1 6287 10 2036
2 4086 11 6227
Vax + aPD1 1 5363 Vax + aPD1 8 3844
2 6500 9 2071
11 4888
XVII.    ChAdV/srRNA 組合腫瘤模型評價
在鼠類CT26腫瘤模型中評價使用ChAdV68及自我複製RNA(srRNA)之各種給藥方案。XVII.A  ChAdV/srRNA 組合腫瘤模型評價之方法及材料 腫瘤注射
對Balb/c小鼠注射CT26腫瘤細胞株。腫瘤細胞注射之後7天，將小鼠隨機分成不同研究組(28-40隻小鼠/組)並開始治療。在Balb/c小鼠左下方側腹部中注射106 個CT26細胞/動物。在免疫接種之前，使腫瘤生長7天。研究組詳細地描述於表15中。 表15-ChAdV/srRNA組合腫瘤模型評價研究組
群組 N 處理 劑量 體積 時程 途徑
1 40 ChAdV68對照 1e11 vp 2x 50 uL 第0天 IM
srRNA對照 10 ug 50 uL 第14天、第28天、第42天 IM
抗PD1 250 ug 100 uL 2次/週(第0天起始) IP
2 40 ChAdV68對照 1e11 vp 2x 50 uL 第0天 IM
srRNA對照 10 ug 50 uL 第14天、第28天、第42天 IM
抗IgG 250 ug 100 uL 2次/週(第0天起始) IP
3 28 ChAdV68疫苗 1e11 vp 2x 50 uL 第0天 IM
srRNA疫苗 10 ug 50 uL 第14天、第28天、第42天 IM
抗PD1 250 ug 100 uL 2次/週(第0天起始) IP
4 28 ChAdV68疫苗 1e11 vp 2x 50 uL 第0天 IM
srRNA疫苗 10 ug 50 uL 第14天、第28天、第42天 IM
抗IgG 250 ug 100 uL 2次/週(第0天起始) IP
5 28 srRNA疫苗 10 ug 50 uL 第0天、第28天、第42天 IM
ChAdV68疫苗 1e11 vp 2x 50 uL 第14天 IM
抗PD1 250 ug 100 uL 2次/週(第0天起始) IP
6 28 srRNA疫苗 10 ug 50 uL 第0天、第28天、第42天 IM
ChAdV68疫苗 1e11 vp 2x 50 uL 第14天 IM
抗IgG 250 ug 100 uL 2次/週(第0天起始) IP
7 40 srRNA疫苗 10 ug 50 uL 第0天、第14天、第28天 IM
抗PD1 250 ug 100 uL 2次/週(第0天起始) IP
8 40 srRNA疫苗 10 ug 50 uL 第0天、第14天、第28天、第42天 IM
抗IgG 250 ug 100 uL 2次/週(第0天起始) IP
免疫接種
對於srRNA疫苗，經兩側肌肉內注射對小鼠注射10 ug VEE-MAG25mer srRNA，體積100 μL(每條腿50 uL)。對於C68疫苗，經兩側肌肉內注射對小鼠注射1 × 1011 個ChAdV68.5WTnt.MAG25mer病毒粒子(VP)，體積100 uL(每條腿50 uL)。每週2次，經由腹膜內注射對動物注射250 ug劑量的抗PD-1 (純系RMP1-14，BioXcell)或抗IgG (純系MPC-11，BioXcell)。脾細胞解離
將每隻小鼠之脾及淋巴結匯集於3 mL完全RPMI (RPMI、10% FBS、青黴素/ 鏈黴素)中。使用gentleMACS 解離器(Miltenyi Biotec)，遵循製造商的方案進行機械解離。經由40微米過濾器過濾解離之細胞且用ACK溶解緩衝液(150 mM NH4 Cl、10 mM KHCO3 、0.1 mM Na2 EDTA)溶解紅細胞。再次經由30微米過濾器過濾細胞且接著使其再懸浮於完全RPMI中。在Attune NxT流式細胞儀(Thermo Fisher)上使用碘化丙錠染色對細胞計數以排除死亡及凋亡之細胞。接著將細胞調整至適當活細胞濃度以供隨後分析。離體酶聯免疫斑點 (ELISPOT) 分析
ELISPOT分析係根據ELISPOT統一準則{DOI: 10.1038/nprot.2015.068}，利用小鼠IFNg ELISpotPLUS套組(MABTECH)進行。將5× 104 個脾細胞與10 uM指定肽一起在塗有IFNg抗體之96孔盤中培育16小時。使用鹼性磷酸酶使斑點顯色。對反應定時10分鐘且藉由用自來水流過盤終止反應。使用AID vSpot讀取器譜圖對斑點計數。對於ELISPOT分析，將飽和度＞50%之孔記錄為「太多而無法計數」。將複製孔之偏差＞10%的樣品自分析中排除。接著，使用下式，針對孔匯合校正斑點計數：斑點計數+2 × (斑點計數×%匯合/[100%-%匯合])。藉由用抗原刺激之孔減去陰性肽刺激孔中之斑點計數來校正陰性背景。最後，將標記為太多而無法計數之孔設定成最高觀測校正值，四捨五入至最接近之百分數。XVII.B 在 CT26 腫瘤模型中 ChAdV/srRNA 組合之評價
在CT26小鼠腫瘤模型中評價ChAdV68.5WTnt.MAG25mer/VEE-MAG25mer srRNA異源初免/增強免疫或VEE-MAG25mer srRNA同源初免/增強免疫疫苗之免疫原性及功效。對Balb/c小鼠注射CT26腫瘤細胞株。注射腫瘤細胞之後7天，將小鼠隨機分成不同研究組並開始治療。研究組詳細地描述於表15中且較粗略地描述於表16中。 表16-初免/增強免疫研究組
群組 初免 增強免疫
1 對照 對照
2 對照 + 抗PD-1 對照 + 抗PD-1
3 ChAdV68.5WTnt.MAG25mer VEE-MAG25mer srRNA
4 ChAdV68.5WTnt.MAG25mer + 抗PD-1 VEE-MAG25mer srRNA + 抗PD-1
5 VEE-MAG25mer srRNA ChAdV68.5WTnt.MAG25mer
6 VEE-MAG25mer srRNA + 抗PD-1 ChAdV68.5WTnt.MAG25mer + 抗PD-1
7 VEE-MAG25mer srRNA VEE-MAG25mer srRNA
8 VEE-MAG25mer srRNA + 抗PD-1 VEE-MAG25mer srRNA + 抗PD-1
在初始疫苗接種之後14天收集脾進行免疫監測。一週兩次獲取腫瘤及體重量測值且監測存活情況。在所有活性疫苗組中觀測到強烈的免疫反應。
在第一次免疫接種之後14天，在ELISpot分析中，在分別免疫接種ChAdV68.5WTnt.MAG25mer (ChAdV/第3組)、ChAdV68.5WTnt.MAG25mer+ 抗PD-1 (ChAdV+PD-1/第4組)、VEEMAG25mer srRNA (srRNA/第5組與第7組之組合之中值)或VEEMAG25mer srRNA+抗PD-1 (srRNA+PD-1/第6組與第8組之組合之中值)之小鼠中觀測到每106 個脾細胞10,630個、12,976個、3319個或3745個斑點形成細胞(SFC)之中值細胞免疫反應(圖16 及表17)。相比之下，疫苗對照(第1組)或疫苗對照與抗PD-1之組合(第2組)分別展現每106 個脾細胞296個或285個SFC之中值細胞免疫反應。 表17-在CT26腫瘤模型中之細胞免疫反應
處理 中值 SFC/106 個脾細胞
對照 296
PD1 285
ChAdV68.5WTnt.MAG25mer (ChAdV) 10630
ChAdV68.5WTnt.MAG25mer + PD1 (ChAdV + PD-1) 12976
VEE-MAG25mer srRNA (srRNA) 3319
VEE-MAG25mer srRNA + PD-1 (srRNA + PD1) 3745
與ELISpot資料相符，在第一次免疫接種之後14天，免疫接種ChAdV68.5WTnt.MAG25mer (ChAdV/第3組)、ChAdV68.5WTnt.MAG25mer+ 抗PD-1 (ChAdV+PD-1/第4組)、VEEMAG25mer srRNA (srRNA/ 第5 組與第7 組之組合之中值)或VEEMAG25mer srRNA+抗PD-1 (srRNA+PD-1/第6組與第8組之組合之中值)之小鼠中分別有5.6%、7.8%、1.8%或1.9%之CD8 T細胞(中值)在細胞內細胞因子染色(ICS)分析中展現抗原特異性反應(圖17 及表18)。免疫接種疫苗對照或疫苗對照與抗PD-1之組合的小鼠分別顯示0.2%及0.1%之抗原特異性CD8反應。 表18-在CT26腫瘤模型中之CD8 T細胞反應
處理 中值 CD8 IFN-γ 陽性百分比
對照 0.21
PD1 0.1
ChAdV68.5WTnt.MAG25mer (ChAdV) 5.6
ChAdV68.5WTnt.MAG25mer + PD1 (ChAdV + PD-1) 7.8
VEE-MAG25mer srRNA (srRNA) 1.8
VEE-MAG25mer srRNA + PD-1 (srRNA + PD1) 1.9
在CT26結腸腫瘤模型中量測所有組之腫瘤生長情況，且到開始治療後21天(注射CT-26腫瘤細胞之後28天)，出現腫瘤生長。在開始治療後21天，基於較大腫瘤尺寸(＞2500 mm3 )處死小鼠；因此，僅呈現前21天以避免分析偏差。ChAdV68.5WTnt.MAG25mer初免/VEEMAG25mer srRNA增強免疫(第3組)、ChAdV68.5WTnt.MAG25mer初免/VEE-MAG25mer srRNA增強免疫+ 抗PD-1(第4 組)、VEE-MAG25mer srRNA初免/ChAdV68.5WTnt.MAG25mer 增強免疫(第5 組)、VEEMAG25mer srRNA初免/ChAdV68.5WTnt.MAG25mer 增強免疫+ 抗PD-1(第6組)、VEE-MAG25mer srRNA初免/VEE-MAG25mer srRNA增強免疫(第7 組)及VEE-MAG25mer srRNA初免/VEE-MAG25mer srRNA增強免疫+抗PD-1(第8組)在21天時的平均腫瘤體積分別為1129、848、2142、1418、2198及1606 mm3 (圖18 及表19)。疫苗對照疫苗對照與抗PD-1之組合的平均腫瘤體積分別為2361或2067 mm3 。基於此等資料，用ChAdV68.5WTnt.MAG25mer/VEE-MAG25mer srRNA (第3組)、ChAdV68.5WTnt.MAG25mer/VEE-MAG25mer srRNA+ 抗PD-1 (第4組)、VEE-MAG25mer srRNA/ChAdV68.5WTnt.MAG25mer+ 抗PD-1 (第6組)及VEE-MAG25mer srRNA/VEE-MAG25mer srRNA+ 抗PD-1 (第8組)之疫苗治療在21天時引起腫瘤生長減慢，明顯不同於對照(第1組)。 表19-第21天量測之CT26模型之腫瘤尺寸
處理 腫瘤尺寸 (mm3 ) SEM
對照 2361 235
PD1 2067 137
chAdV/srRNA 1129 181
chAdV/srRNA + PD1 848 182
srRNA/chAdV 2142 233
srRNA/chAdV + PD1 1418 220
srRNA 2198 134
srRNA + PD1 1606 210
在CT-26腫瘤模型中，在開始治療後，監測存活情況35天(注射CT-26腫瘤細胞之後42天)。在小鼠疫苗接種4個測試組合之後，觀測到存活率提高。在疫苗接種之後，利用ChAdV68.5WTnt.MAG25mer初免/VEE-MAG25mer srRNA增強免疫與抗PD-1之組合(第4組；相對於對照組1，P＜0.0001)、VEE-MAG25mer srRNA初免/VEE-MAG25mer srRNA增強免疫與抗PD-1 之組合(第8組；相對於對照組1，P=0.0006)、ChAdV68.5WTnt.MAG25mer初免/VEE-MAG25mer srRNA增強免疫(第3組；相對於對照組1，P=0.0003)VEE-MAG25mer srRNA 初免/ChAdV68.5WTnt.MAG25mer 增強免疫與抗PD-1之組合(第6組；相對於對照組1，P=0.0016)之小鼠的存活率分別為64%、46%、41%及36% (圖19 及表20)。其餘治療組[VEE-MAG25mer srRNA初免/ChAdV68.5WTnt.MAG25mer 增強免疫(第5組)、VEE-MAG25mer srRNA初免/VEE-MAG25mer srRNA增強免疫(第7組)及單獨抗PD-1 (第2組)]的存活率與對照組1無明顯不同(≤14%)。 表20-CT26模型中之存活率
時間點 對照 PD1 chAdV/ srRNA chAdV/ srRNA + PD1 srRNA/ chAdV srRNA/ chAdV + PD1 srRNA srRNA + PD1
0 100 100 100 100.00 100.00 100 100 100
21 96 100 100 100 100 95 100 100
24 54 64 91 100 68 82 68 71
28 21 32 68 86 45 68 21 64
31 7 14 41 64 14 36 11 46
35 7 14 41 64 14 36 11 46
總之，相對於對照，ChAdV68.5WTnt.MAG25mer及VEEMAG25mer srRNA引起針對由疫苗編碼之小鼠腫瘤抗原的強烈T細胞反應。向帶有腫瘤之小鼠投與ChAdV68.5WTnt.MAG25mer初免及VEEMAG25mer srRNA增強免疫並且共投與或不共投與抗PD-1、投與VEEMAG25mer srRNA初免及ChAdV68.5WTnt.MAG25mer增強免疫與抗PD-1之組合或投與作為同源初免增強免疫之VEE-MAG25mer srRNA與抗PD-1之組合使存活率提高。XVIII. 非人類靈長類動物研究
在非人類靈長類動物(NHP)中評價使用ChAdV68及自我複製RNA(srRNA)之各種給藥方案。材料及方法
向各NHP中肌肉內注射初免疫苗以起始研究(疫苗初免)。亦向各NHP中肌肉內注射一或多種增強免疫疫苗(疫苗增強免疫)。根據表中概述之組，投與每劑兩側注射液且在下文概述。免疫接種
對Mamu-A*01印度恆河猴兩側免疫接種以LNP-1或LNP-2調配之1 × 1012 個ChAdV68.5WTnt.MAG25mer病毒粒子(每側注射5× 1011 個病毒粒子)、30 μg VEE-MAG25MER srRNA、100 μg VEE-MAG25mer srRNA或300 ug VEE-MAG25mer srRNA。在初始疫苗接種後指定時間之時，經肌肉內投與30 ug、100 ug或300 ug VEE-MAG25mer srRNA。免疫監測
在初始疫苗接種後指定時間之時，使用淋巴球分離培養基(Lymphocyte Separation Medium，LSM；MP Biomedicals)及LeucoSep分離管(Greiner Bio-One)分離PBMC且使其再懸浮於含有10% FBS及青黴素/鏈黴素之RPMI中。在Attune NxT流式細胞儀(Thermo Fisher)上使用碘化丙錠染色對細胞計數以排除死亡及凋亡之細胞。接著將細胞調整至適當活細胞濃度以供隨後分析。對於研究中的每隻猴，使用ELISpot或流式細胞量測方法量測T細胞反應。藉由使用離體酶聯免疫斑點(ELISpot)分析量測諸如IFN-γ之細胞介素之誘發來監測PBMC中針對疫苗中編碼之6個不同恆河猴Mamu-A*01之I類抗原決定基之T細胞反應。ELISPOT分析係根據ELISPOT統一準則{DOI: 10.1038/nprot.2015.068}，利用猴IFNg ELISpotPLUS套組(MABTECH)進行。將200,000 個PBMC與10 uM指定肽一起在塗有IFNg抗體之96孔盤中培育16小時。使用鹼性磷酸酶使斑點顯色。對反應定時10分鐘且藉由用自來水流過盤終止反應。使用AID vSpot讀取器譜圖對斑點計數。對於ELISPOT分析，將飽和度＞50%之孔記錄為「太多而無法計數」。將複製孔之偏差＞10%的樣品自分析中排除。接著，使用下式，針對孔匯合校正斑點計數：斑點計數+2 × (斑點計數×%匯合/[100%-%匯合])。藉由用抗原刺激之孔減去陰性肽刺激孔中之斑點計數來校正陰性背景。最後，將標記為太多而無法計數之孔設定成最高觀測校正值，四捨五入至最接近之百分數。
藉由使用流式細胞量測術量測諸如IFN-γ之細胞內細胞介素之誘發來監測PBMC中針對疫苗中編碼之6個不同恆河猴Mamu-A*01之I類抗原決定基的特異性CD4及CD8 T細胞反應。由兩種方法得到的結果指示，以抗原特異性方式誘發針對抗原決定基之細胞介素。恆河猴之免疫原性
本研究亦設計用於(a)評價30 μg及100 μg 劑量VEE-MAG25mer srRNA以同源初免/增強免疫形式與ChAdV68.5WTnt.MAG25mer之組合的免疫原性及初步安全性；(b)比較在使用LNP1相對LNP2之脂質奈米粒子中VEE-MAG25mer srRNA之免疫反應；及(c)評價針對VEE-MAG25mer srRNA及ChAdV68.5WTnt.MAG25mer免疫接種之T細胞反應的動力學。
此研究組係在Mamu-A*01印度恆河猴中進行以展示免疫原性。選擇用於本研究中之抗原僅在恆河猴中識別到，具體言之，係具有Mamu-A*01 I類MHC單倍型之抗原。將Mamu-A*01印度恆河猴隨機分成不同研究組(6隻恆河猴/組)且經兩側IM注射投與編碼包括多個Mamu-A*01限制性抗原決定基之模型抗原的ChAdV68.5WTnt.MAG25mer 或VEEMAG25mer srRNA載體。研究組如下所述。表 21 ：印度恆河猴之非GLP免疫原性研究
群組 初免 增強免疫1 增強免疫2
1 VEE-MAG25mer srRNA -LNP1(30 µg) VEE-MAG25mer srRNA -LNP1 (30 µg) VEE-MAG25mer srRNA -LNP1 (30 µg)
2 VEE-MAG25mer srRNA -LNP1 (100 µg) VEE-MAG25mer srRNA -LNP1 (100 µg) VEE-MAG25mer srRNA -LNP1 (100 µg)
3 VEE-MAG25mer srRNA -LNP2 (100 µg) VEE-MAG25mer srRNA -LNP2 (100 µg) VEE-MAG25mer srRNA -LNP2 (100 µg)
4 ChAdV68.5WTnt.MAG25mer VEE-MAG25mer srRNA -LNP1 (100 µg) VEE-MAG25mer srRNA -LNP1 (100 µg)
在免疫接種之前及在初始免疫接種之後第1週、第2週、第3週、第4週、第5週、第6週、第8週、第9週及第10週收集PBMC以供免疫監測。結果
在免疫接種之前及在初始免疫接種之後第1週、第2週、第3週、第4週、第5週、第6週、第8週、第9週及10週針對六種不同Mamu-A*01限制性抗原決定基量測外周血液單核細胞(PBMC)之抗原特異性細胞免疫反應。動物在第4週及第8週接受30 μg 或100 μg劑量且以LNP1 或LNP2調配之VEE-MAG25mer srRNA之增強免疫接種，如表21中所描述。標繪在各免疫監測時間點下針對全部六個抗原決定基之組合免疫反應(圖20 A-D及表22-25)。
在初始VEE-MAG25mer srRNA-LNP1(30 μg)初免免疫接種之後第1週、第2週、第3週、第4週、第5週、第6週、第8週、第9週或第10週在所有量測下觀測到組合的抗原特異性免疫反應，分別為每106 個PBMC 170、14、15、11、7、8、14、17、12個SFC (六個抗原決定基組合) (圖20 A)。在初始VEE-MAG25mer srRNA-LNP1 (100 μg)初免免疫接種之後第1週、第2週、第3週、第4週、第5週、第6週、第8週、第9週或第10週在所有量測下觀測到組合的抗原特異性免疫反應，分別為每106 個PBMC 108、-3、14、1、37、4、105、17、25個SFC (六個抗原決定基組合) (圖20 B)。在初始VEE-MAG25mer srRNA-LNP2 (100 μg)初免免疫接種之後第1週、第2週、第3週、第4週、第5週、第6週、第8週、第9週或第10週在所有量測下觀測到組合的抗原特異性免疫反應，分別為每106 個PBMC-17、38、14、-2、87、21、104、129、89個SFC (六個抗原決定基組合) (圖20 C)。負值係各抗原決定基/動物之相對於放血前值之標準化的結果。
在初始ChAdV68.5WTnt.MAG25mer初免免疫接種之後第1週、第2週、第3週、第4週、第5週、第6週、第8週、第9週或第10週在所有量測下觀測到組合的抗原特異性免疫反應，分別為每106 個PBMC 1218、1784、1866、973、1813、747、797、1249及547個SFC (六個抗原決定基組合) (圖20 D)。免疫反應顯示出預期之型態，其中在初始免疫接種之後約2-3週量測到峰值免疫反應，隨後在4週之後免疫反應縮減。在用ChAdV68.5WTnt. MAG25mer 初始免疫接種之後5週(亦即，在用VEEMAG25mer srRNA第一增強免疫之後1週)量測到每106 個PBMC 1813個SFC之組合的抗原特異性細胞免疫反應(六個抗原決定基組合)。在用VEEMAG25mer srRNA第一增強免疫之後1週(第5週)量測到之免疫反應與針對ChAdV68.5WTnt.MAG25mer初免免疫接種(第3週)量測到之峰值免疫反應相當(圖20 D)。分別在用ChAdV68.5WTnt.MAG25mer初始免疫接種之後9週(亦即，用VEE-MAG25mer srRNA第二增強免疫之後1週)量測到每106 個PBMC 1249個SFC之組合的抗原特異性細胞免疫反應(六個抗原決定基組合)。在用VEE-MAG25mer srRNA第二增強免疫之後1週(第9週)量測到之免疫反應比臨在增強免疫接種之前量測到之免疫反應高約2倍(圖20 D)。表 22 ：對於VEE-MAG25mer srRNA-LNP1(30 μg) (第1組)各抗原決定基之每106 個PBMC之平均斑點形成細胞(SFC)數±SEM
週 抗原
Env CL9 Env TL9 Gag CM9 Gag LW9 Pol SV9 Tat TL8
1 0±0 0±0 0±0 0±0 0±0 0±0
2 39.7±22.7 35.4±25.1 3.2±3.6 33±28.1 30.9±20.3 28.3±17.5
3 2±2.4 0.2±1.8 1.8±2.4 3.7±1.9 1.7±2.8 4.9±2.3
4 1±1.8 0.3±1.2 5.5±3.6 2.3±2.2 5.7±2.7 0.8±0.8
5 0.5±0.9 1.4±3.8 3.1±1.6 2.3±2.7 1.9±2 1.4±1.2
6 1.9±1.8 -0.3±3 1.7±1.2 1.4±1.4 0.8±1.1 1.1±1
8 -0.4±0.8 -0.9±2.9 0.5±1.3 3±1.1 2.2±2.1 3.7±2
9 1±1.7 1.2±4.2 7.2±3.9 0.5±0.7 1.6±3 3±1
10 3.8±1.8 11±5 -1.1±1.1 1.9±0.9 1.3±1.6 0.2±0.5
表 23 ：對於VEE-MAG25mer srRNA-LNP1(100 μg) (第2組)各抗原決定基之每106 個PBMC之平均斑點形成細胞(SFC)數±SEM
週 抗原
Env CL9 Env TL9 Gag CM9 Gag LW9 Pol SV9 Tat TL8
1 0±0 0±0 0±0 0±0 0±0 0±0
2 7.9±17.2 23.2±17.4 11.4±4.9 41.7±16.5 15±13.5 8.9±6.2
3 -3.1±4.6 -7.2±6.5 2.3±2.3 -0.3±2.7 2.7±5.1 2.2±1.4
4 1.9±3.8 -6.2±7.6 10.5±4.1 1.2±2.9 5.6±4.9 1.1±0.8
5 -2.6±7 -8±5.9 1.5±1.7 6.4±2.3 0.7±4.3 3.3±1.3
6 6.3±6.3 4.4±8.3 6.6±4.4 5.2±5.2 3.9±5 10.8±6.9
8 -3.6±7.2 -6.8±7.3 -0.8±1.2 3.4±4.2 6.4±7.5 5.7±2.7
9 8.1±2.4 20.6±23.4 18.9±5.7 8.1±8.9 9±11.2 40±17.6
10 3.1±8 -3.9±8.5 3.3±1.8 0.6±2.9 7.4±6.4 6.1±2.5
表 24 ：對於VEE-MAG25mer srRNA-LNP2(100 μg) (第3組)各抗原決定基之每106 個PBMC之平均斑點形成細胞(SFC)數±SEM
週 抗原
Env CL9 Env TL9 Gag CM9 Gag LW9 Pol SV9 Tat TL8
1 0±0 0±0 0±0 0±0 0±0 0±0
2 -5.9±3.8 -0.3±0.5 -0.5±1.5 -5.7±6.1 -1±1.3 -3.2±5.5
3 0.7±5.2 3.4±2.4 4.2±4.6 18.3±15.5 11.9±5.1 -0.4±8.2
4 -3.8±5.5 2.3±1.8 11.3±6.1 -3.1±5.6 8.5±4 -1.5±6.1
5 -3.7±5.7 -0.1±0.7 -0.2±1.6 3.4±8.5 3±3.1 -4.6±5
6 12.3±15 7.8±4.9 24.7±19.8 23.2±22.5 18.7±15.8 0.5±6.2
8 5.9±12.3 -0.1±0.7 -0.5±1.3 8.8±14.4 8.7±8 -1.3±4
9 16.1±13.4 16.5±4 22.9±4.2 13±13.2 16.4±7.8 19.6±9.2
10 29.9±21.8 22±19.5 0.5±2.6 22.2±22.6 35.3±15.8 19.4±17.3
表 25 ：對於ChAdV68.5WTnt.MAG25mer初免各抗原決定基之每106 個PBMC之平均斑點形成細胞(SFC)數±SEM
週 抗原
Env CL9 Env TL9 Gag CM9 Gag LW9 Pol SV9 Tat TL8
1 178±68.7 206.5±94.8 221.2±120 15.4±16.7 33.3±25.9 563.5±174.4
2 311.2±165.5 278.8±100.9 344.6±110.8 46.3±13.5 181.6±76.8 621.4±220.9
3 277.3±101.1 359.6±90.5 468.2±106.6 41.7±11.1 169.8±57.8 549.4±115.7
4 140±46.5 169.6±46.8 239.4±37 26.5±11.4 75±31.6 322.2±50.7
5 155.6±62.1 406.7±96.4 542.7±143.3 35.1±16.6 134.2±53.7 538.5±91.9
6 78.9±42.5 95.5±29.4 220.9±75.3 -1.4±5.3 43.4±19.6 308.1±42.6
8 88.4±30.4 162.1±30.3 253.4±78.6 21.4±11.2 53.7±22.3 217.8±45.2
9 158.5±69 322.3±87.2 338.2±137.1 5.6±12.4 109.2±17.9 314.8±43.4
10 97.3±32.5 133.2±27 154.9±59.2 10±6 26±16.7 125.5±27.7
結果
用ChAdV68.5-WTnt.MAG25mer 免疫接種Mamu-A*01印度恆河猴。在免疫接種之前及在初始免疫接種之後第4週、第5週、第6週、第7週、第8週、第10週、第11週、第12週、第13週、第14週、第15週、第16週、第17週、第18週、第19週、第20週、第21週、第22週、第23週或第24週針對六種不同Mamu-A*01限制性抗原決定基量測外周血液單核細胞(PBMC)之抗原特異性細胞免疫反應(圖21及表27)。動物在第4週、第12週及第20週接受用使用LNP2調配物之VEE-MAG25mer srRNA增強免疫接種。在用ChAdV68.5WTnt.MAG25mer初始免疫接種之後第4週、第5 週、第6 週、第7 週、第8 週、第10週、第11 週、第12週、第13週、第14週、第15週、第16週、第17週、第18週、第19週、第20週、第21 週、第22 週、第23 週或第24 週量測到每106 個PBMC 1750、4225、1100、2529、3218、1915、1708、1561、5077、4543、4920、5820、3395、2728、1996、1465、4730、2984、2828或3043個SFC之組合的抗原特異性免疫反應(六個抗原決定基組合) (圖21)。在用VEE-MAG25mer srRNA第二增強免疫接種之後1週(第13週)量測到之免疫反應比在臨增強免疫接種之前(第12週)量測到之免疫反應高約3倍。在用VEE-MAG25mer srRNA第三增強免疫接種之後1週(第21週)量測到之免疫反應比在臨增強免疫接種之前(第20週)量測到之免疫反應高約3倍，類似於針對第二增強免疫觀測到之反應。
Mamu-A*01 印度恆河猴亦用使用兩種不同LNP調配物(LNP1及LNP2)之VEE-MAG25mer srRNA免疫接種。在免疫接種之前及在初始免疫接種之後第4週、第5週、第6週、第7週、第8週、第10週、第11週、第12週、第13週、第14週或第15週針對六種不同Mamu-A*01限制性抗原決定基量測外周血液單核細胞(PBMC)之抗原特異性細胞免疫反應(圖22及23，表28及29)。動物在第4週及第12週接受用使用各別LNP1或LNP2調配物之VEE-MAG25mer srRNA增強免疫接種。在用VEEMAG25mer srRNA-LNP2免疫接種之後第4週、第5週、第7週、第8週、第10週、第11週、第13週、第14週、第15週量測到每106 個PBMC 168、204、103、126、140、145、330、203及162個SFC之組合的抗原特異性免疫反應(六個抗原決定基組合) (圖22)。在用VEE-MAG25mer srRNALNP1免疫接種之後第4週、第5週、第7週、第8週、第10週、第11週、第12週、第13週、第14週、第15週量測到每106 個PBMC 189、185、349、437、492、570、233、886、369及381個SFC之組合的抗原特異性免疫反應(六個抗原決定基組合) (圖23)。表 27 ：對於用ChAdV68.5WTnt.MAG25mer初免疫苗接種(第1組)各抗原決定基之每106 個PBMC之平均斑點形成細胞(SFC)數±SEM
週 抗原
Env CL9 Env TL9 Gag CM9 Gag LW9 Pol SV9 Tat TL8
4 173±41.6 373.5±87.3 461.4±74.2 38.4±26.1 94.5±26 609.2±121.9
5 412.7±138.4 987.8±283.3 1064.4±266.9 85.6±31.2 367.2±135.2 1306.8±332.8
6 116.2±41.2 231.1±46.3 268.3±90.7 86.1±42 174.3±61 223.9±38.1
7 287.4±148.7 588.9±173.9 693.2±224.8 92.1±33.5 172.9±55.6 694.6±194.8
8 325.4±126.6 735.8±212 948.9±274.5 211.3±62.7 179.1±50 817.3±185.2
10 312±129.7 543.2±188.4 618.6±221.7 -5.7±4.1 136.5±51.3 309.9±85.6
11 248.5±81.1 348.7±129.8 581.1±205.5 -3.1±4.4 119±51.2 413.7±144.8
12 261.9±68.2 329.9±83 486.5±118.6 -1.2±5.1 132.8±31.8 350.9±69.3
13 389.3±167.7 1615.8±418.3 1244.3±403.6 1.3±8.1 522.5±155 1303.3±385.6
14 406.3±121.6 1616±491.7 1142.3±247.2 6.6±11.1 322.7±94.1 1048.6±215.6
15 446.8±138.7 1700.8±469.1 1306.3±294.4 43±24.5 421.2±87.9 1001.5±236.4
16 686.8±268.8 1979.5±541.7 1616.8±411.8 2.4±7.8 381.9±116.4 1152.8±352.7
17 375.8±109.3 1378.6±561.2 773.1±210.3 -1.4±4.3 177.6±93.7 691.7±245
18 255.9±99.7 1538.4±498.1 498.7±152.3 -5.3±3.3 26.2±13.4 413.9±164.8
19 133±62.6 955.9±456.8 491.1±121.8 -5.7±4.1 50.3±25.4 371.2±123.7
20 163.7±55.8 641.7±313.5 357.9±91.1 2.6±7.5 41.4±24.2 257.8±68.9
21 319.9±160.5 2017.1±419.9 1204.8±335.2 -3.7±5.1 268.1±109.6 924.1±301
22 244.7±105.6 1370.9±563.5 780.3±390 -3.6±5.1 118.2±68.1 473.3±249.3
23 176.7±81.8 1263.7±527.3 838.6±367.9 -5.7±4.1 73.6±49 480.9±163.9
24 236.5±92 1324.7±589.3 879.7±321 -0.4±5.7 104±53.1 498±135.8
表 28 ：對於用VEE-MAG25mer srRNA-LNP2 (300 μg)初免疫苗接種(第2組)各抗原決定基之每106 個PBMC之平均斑點形成細胞(SFC)數±SEM
週 抗原
Env CL9 Env TL9 Gag CM9 Gag LW9 Pol SV9 Tat TL8
4 46±27.1 18.4±6.8 58.3±45.8 29.9±20.8 4.9±2.3 10.7±4
5 85.4±54 5.2±5.8 52.4±51.2 34.5±35 11.8±12.2 14.4±7.9
7 18.6±32.5 1.9±1.7 59.4±55.7 9.3±10.7 3.3±3 10.7±6.1
8 36.6±39.4 6.3±3.9 48.7±39.9 13.5±8.8 3.8±3.6 17.2±9.7
10 69.1±59.1 4.4±1.9 39.3±38 14.7±10.8 4.4±5.3 8.5±5.3
11 43±38.8 22.6±21.1 30.2±26.2 3.3±2.2 5.8±3.5 40.3±25.5
13 120.4±78.3 68.2±43.9 54.2±36.8 21.8±7.4 17.7±6.1 47.4±27.3
14 76±44.8 28±19.5 65.9±64.3 -0.3±1.3 2.5±2 31.1±26.5
15 58.9±41.4 19.5±15.1 55.4±51 2.5±2 5.5±3.6 20.1±15.7
表 29 ：對於用VEE-MAG25mer srRNA-LNP1 (300 μg)初免疫苗接種(第3組)各抗原決定基之每106 個PBMC之平均斑點形成細胞(SFC)數±SEM
週 抗原
Env CL9 Env TL9 Gag CM9 Gag LW9 Pol SV9 Tat TL8
4 19.5±8.7 13.3±13.1 16.5±15.3 10.5±7.3 35.9±24.8 92.9±91.6
5 87.9±43.9 12.7±11.7 37.2±31.9 21.1±23.8 13.2±13.7 12.6±13.7
7 21.1±13.3 48.8±48.4 51.7±39.5 9.1±10.5 58.6±55.8 159.4±159
8 47.7±21.7 66.4±52.2 59.8±57.4 49.4±28 79.4±63 133.8±132.1
10 49±30.2 42.2±41.1 139.3±139.3 51.6±51.2 78.2±75.8 131.7±131.6
11 42±26.8 20.9±21.4 177.1±162 -6.3±4.3 104.3±104.1 231.5±230.1
12 40.2±19 20.3±11.9 42.2±46.7 3.7±6.7 57±44.7 70±69.2
13 81.2±48.9 38.2±37.6 259.4±222.2 -4±4.1 164.1±159.3 347.3±343.5
14 34.5±31.8 5.3±11.6 138.6±137.3 -4.7±5.2 52.3±52.9 142.6±142.6
15 49±24 6.7±9.8 167.1±163.8 -6.4±4.2 47.8±42.3 116.6±114.5
srRNA 劑量範圍研究
在本發明之一個實施方案中，可在mamu A01印度恆河猴中進行srRNA劑量範圍研究以鑑別用於NHP免疫原性研究之srRNA劑量。在一個實例中，可藉由IM注射向Mamu A01印度恆河猴投與編碼包括多個mamu A01限制性抗原決定基之模型抗原的srRNA載體。在另一實例中，可靠近IM疫苗注射部位投與(SC)抗CTLA-4單株抗體以靶向一組動物中之疫苗引流淋巴結。可在初始疫苗接種之後每2 週收集PBMC以供免疫監測。研究組描述於下文中(表30)。表 30 ：印度恆河猴中之非GLP RNA劑量範圍研究
群組 初免 增強免疫 1 增強免疫 2
1 srRNA-LNP (低劑量) srRNA-LNP (低劑量) srRNA-LNP (低劑量)
2 srRNA-LNP (中劑量) srRNA-LNP (中劑量) srRNA-LNP (中劑量)
3 srRNA-LNP (高劑量) srRNA-LNP (高劑量) srRNA-LNP (高劑量)
4 srRNA-LNP (高劑量) +抗-CTLA-4 srRNA-LNP (高劑量) +抗-CTLA-4 srRNA-LNP (高劑量) +抗-CTLA-4
* 待以高劑量≤300 μg測定之srRNA之劑量範圍。印度恆河猴中之免疫原性研究
在mamu A01印度恆河猴(NHP)中進行疫苗研究以說明使用抗原載體之免疫原性。圖34說明疫苗接種策略。三組NHP經免疫接種ChAdV68.5-WTnt .MAG25mer且免疫接種檢查點抑制劑抗CTLA-4抗體伊匹單抗(第5組及第6組)或不免疫接種檢查點抑制劑(第4組)。該抗體經靜脈內(第5組)或皮下(第6組)投與。三角形指示第0週及第32週之ChAdV68疫苗接種(1e12 vp/動物)。圓形表示第0週、第4週、第12週、第20週、第28週及第32週之α病毒疫苗接種。
呈現在經免疫接種之NHP中對應於單獨chAd-MAG免疫接種(圖35及表31A)、IV遞送之chAd-MAG免疫接種與檢查點抑制劑(圖36及表31B)，以及SC遞送之chAd-MAG免疫接種與檢查點抑制劑(圖37及表31C)的CD8+抗抗原決定基反應之時程。結果表明，ChAdV68載體有效激活靈長類動物中之CD8+反應，α病毒載體有效增強ChAdV68疫苗初免反應，檢查點抑制劑無論IV還是SC遞送均增幅初免及增強免疫反應，且在疫苗接種後再投與chAd載體以有效增強免疫反應。表 31A ：用chAd-MAG給藥之恆河猴中之CD8+抗抗原決定基反應(第4組)。展示平均SFC/1e6脾細胞+ / -標準誤差
週 抗原
Env CL9 Env TL9 Gag CM9 Gag LW9 Pol SV9 Tat TL8
4 173±41.6 373.5±87.3 461.4±74.2 38.4±26.1 94.5±26 609.2±121.9
5 412.7±138.4 987.8±283.3 1064.4±266.9 85.6±31.2 367.2±135.2 1306.8±332.8
6 116.2±41.2 231.1±46.3 268.3±90.7 86.1±42 174.3±61 223.9±38.1
7 287.4±148.7 588.9±173.9 693.2±224.8 92.1±33.5 172.9±55.6 694.6±194.8
8 325.4±126.6 735.8±212 948.9±274.5 211.3±62.7 179.1±50 817.3±185.2
10 312±129.7 543.2±188.4 618.6±221.7 -5.7±4.1 136.5±51.3 309.9±85.6
11 248.5±81.1 348.7±129.8 581.1±205.5 -3.1±4.4 119±51.2 413.7±144.8
12 261.9±68.2 329.9±83 486.5±118.6 -1.2±5.1 132.8±31.8 350.9±69.3
13 389.3±167.7 1615.8±418.3 1244.3±403.6 1.3±8.1 522.5±155 1303.3±385.6
14 406.3±121.6 1616±491.7 1142.3±247.2 6.6±11.1 322.7±94.1 1048.6±215.6
15 446.8±138.7 1700.8±469.1 1306.3±294.4 43±24.5 421.2±87.9 1001.5±236.4
16 686.8±268.8 1979.5±541.7 1616.8±411.8 2.4±7.8 381.9±116.4 1152.8±352.7
17 375.8±109.3 1378.6±561.2 773.1±210.3 -1.4±4.3 177.6±93.7 691.7±245
18 255.9±99.7 1538.4±498.1 498.7±152.3 -5.3±3.3 26.2±13.4 413.9±164.8
19 133±62.6 955.9±456.8 491.1±121.8 -5.7±4.1 50.3±25.4 371.2±123.7
20 163.7±55.8 641.7±313.5 357.9±91.1 2.6±7.5 41.4±24.2 257.8±68.9
21 319.9±160.5 2017.1±419.9 1204.8±335.2 -3.7±5.1 268.1±109.6 924.1±301
22 244.7±105.6 1370.9±563.5 780.3±390 -3.6±5.1 118.2±68.1 473.3±249.3
23 176.7±81.8 1263.7±527.3 838.6±367.9 -5.7±4.1 73.6±49 480.9±163.9
24 236.5±92 1324.7±589.3 879.7±321 -0.4±5.7 104±53.1 498±135.8
25 136.4±52.6 1207.1±501.6 924±358.5 6.2±10.5 74.1±34.4 484.6±116.7
26 278.2±114.4 1645±661.7 1170.2±469.9 -2.9±5.7 80.6±55.8 784.4±214.1
27 159±56.8 961.7±547.1 783.6±366.4 -5±4.3 63.6±27.5 402.9±123.4
28 189.6±75.7 1073.1±508.8 668.3±312.5 -5.7±4.1 80.3±38.3 386.4±122
29 155.3±69.1 1102.9±606.1 632.9±235 34.5±24.2 80±35.5 422.5±122.9
30 160.2±59.9 859±440.9 455±209.1 -3±5.3 60.5±28.4 302.7±123.2
31 122.2±49.7 771.1±392.7 582.2±233.5 -5.7±4.1 55.1±27.3 295.2±68.3
32 119.3±28.3 619.4±189.7 566±222.1 -3.7±5.1 21.9±4.5 320.5±76.4
33 380.5±122 1636.1±391.4 1056.2±205.7 -5.7±4.1 154.5±38.5 988.4±287.7
34 1410.8±505.4 972.4±301.5 319.6±89.6 -4.8±4.2 141.1±49.8 1375.5±296.7
37 130.8±29.2 500±156.9 424.9±148.9 -3.5±4.7 77.7±24.6 207.1±42.4
38 167.7±54.8 1390.8±504.7 830.4±329.1 -5.5±4.1 111.8±43.2 516±121.7
表 31B ：IV遞送之chAd-MAG加抗CTLA4抗體(伊匹單抗)給藥之恆河猴中的CD8+抗抗原決定基反應(第5組)。展示平均SFC/1e6脾細胞+ / -標準誤差
週 抗原
Env CL9 Env TL9 Gag CM9 Gag LW9 Pol SV9 Tat TL8
4 1848.1±432.2 1295.7±479.7 1709.8±416.9 513.7±219.8 838.5±221.1 2514.6±246.5
5 1844.1±410.2 2367.5±334.4 1983.1±370.7 732.1±249.4 1429.7±275.3 2517.7±286.5
6 822.4±216.7 1131.2±194.7 796.8±185.8 226.8±70 802.2±101.4 913.5±222.7
7 1147.2±332.9 1066±311.2 1149.8±467.3 267.4±162.6 621.5±283.2 1552.2±395.1
8 1192.7±188.8 1461.5±237.7 1566.9±310.5 522.5±118.6 662.3±142.4 1706±216.7
10 1249±220.3 1170.6±227.7 1297.3±264.7 -0.3±4.4 551.8±90.5 1425.3±142.6
11 934.2±221.7 808±191.3 1003.1±293.4 1.9±4.3 364.2±76.6 1270.8±191.6
12 1106.2±216.6 896.7±190.7 1020.1±243.3 1.3±3.9 436.6±90 1222±155.4
13 2023.8±556.3 3696.7±1.7 2248.5±436.4 -4.5±3.5 2614±406.1 3700±0
14 1278.7±240 2639.5±387 1654.6±381.1 -6±2.1 988.8±197.9 2288.3±298.7
15 1458.9±281.8 2932.5±488.7 1893.4±499 74.6±15.6 1657.8±508.9 2709.1±428.7
16 1556.8±243 2143.8±295.2 2082.8±234.2 -5.8±2.5 1014.6±161.4 2063.7±86.7
17 1527±495.1 2213±677.1 1767.7±391.8 15.1±5.9 633.8±133.9 2890.8±433.9
18 1068.2±279.9 1940.9±204.1 1114.1±216.1 -5.8±2.5 396.6±77.6 1659.4±171.7
19 760.7±362.2 1099.5±438.4 802.7±192.5 -2.4±3.3 262.2±62.2 1118.6±224.2
20 696.3±138.2 954.9±198 765.1±248.4 -1.4±4.4 279.6±89.3 1139±204.5
21 1201.4±327.9 3096±1.9 1901±412.1 -5.8±2.5 1676.3±311.5 2809.3±195.8
22 1442.5±508.3 2944.7±438.6 1528.4±349.6 2.8±5.1 940.7±160.5 2306.3±218.6
23 1400.4±502.2 2757.1±452.9 1604.2±450.1 -5.1±2.3 708.1±162.6 2100.4±362.9
24 1351±585.1 2264.5±496 1080.6±253.8 0.3±6.5 444.2±126.4 1823.7±306.5
25 1211.5±505.2 2160.4±581.8 970.8±235.9 2.5±3.8 450.4±126.9 1626.2±261.3
26 1443±492.5 2485±588 1252.5±326.4 -0.2±6 360.2±92.3 2081.9±331.1
27 896.2±413.3 1686±559.5 751±192.1 -3.7±2.5 247.4±82.8 1364.1±232
28 1147.8±456.9 1912.1±417.1 930.3±211.4 -5.8±2.5 423.9±79.6 1649.3±315
29 1038.5±431.9 1915.2±626.1 786.8±205.9 23.5±8.3 462.8±64 1441.5±249.7
30 730.5±259.3 1078.6±211.5 699.1±156.2 -4.4±2.7 234.4±43.9 1160.6±112.6
31 750.4±328.3 1431±549.9 650.6±141.1 -5.2±3 243.4±56.4 868.9±142.8
32 581.4±227.7 1326.6±505.2 573.3±138 -3.2±4.2 160.8±49.2 936.4±110.4
33 2198.4±403.8 3093.4±123.3 2391.8±378.4 7.1±8.5 1598.1±343.1 2827.5±289.5
34 2654.3±337 2709.9±204.3 1297.5±291.4 0.4±4.2 1091.8±242.9 1924±245.7
37 846.8±301.7 1706.9±196 973.6±149.3 50.5±45.2 777.3±140.2 1478.8±94.3
表 31C ：SC遞送之chAd-MAG加抗CTLA4抗體(伊匹單抗)給藥之恆河猴中的CD8+抗抗原決定基反應(第6組)。展示平均SFC/1e6脾細胞+ / -標準誤差
週 抗原
Env CL9 Env TL9 Gag CM9 Gag LW9 Pol SV9 Tat TL8
4 598.3±157.4 923.7±306.8 1075.6±171.8 180.5±74.1 752.3±245.8 1955.3±444.4
5 842.2±188.5 1703.7±514.2 1595.8±348.4 352.7±92.3 1598.9±416.8 2163.7±522.1
6 396.4±45.3 728.3±232.7 503.8±151.9 282±69 463.1±135.7 555.2±191.5
7 584.2±177 838.3±254.9 1013.9±349.4 173.6±64.3 507.4±165.7 1222.8±368
8 642.9±134 1128.6±240.6 1259.1±163.8 366.1±72.8 726.7±220.9 1695.6±359.4
10 660.4±211.4 746.9±222.7 944.8±210.2 -1.2±1.9 523.4±230.7 787.3±308.3
11 571.2±162 609.4±194.3 937.9±186.5 -8.9±2.3 511.6±229.6 1033.3±315.7
12 485.3±123.7 489.4±142.7 919.3±214.1 -8.9±2.3 341.6±139.4 1394.7±432.1
13 986.9±154.5 2811.9±411.3 1687.7±344.3 -4.1±5.1 1368.5±294.2 2751±501.9
14 945.9±251.4 2027.7±492.8 1386.7±326.7 -5.7±2.8 708.9±277.1 1588.2±440.1
15 1075.2±322.4 2386±580.7 1606.3±368.1 -5.4±3.2 763.3±248.8 1896.5±507.8
16 1171.8±341.6 2255.1±439.6 1672.2±342.3 -7.8±2.4 1031.6±228.8 1896.4±419.9
17 1118.2±415.4 2156.3±476 1345.3±377.7 -1.1±6.7 573.7±118.8 1614.4±382.3
18 861.3±313.8 2668.2±366.8 1157.2±259.6 -8.9±2.3 481.2±164 1725.8±511.4
19 719.2±294.2 1447.2±285 968±294.5 -2.2±4.6 395.6±106.1 1199.6±289.2
20 651.6±184 1189.8±242.8 947.4±249.8 -8.9±2.3 355±106.3 1234.7±361.7
21 810.3±301.9 2576.2±283.7 1334±363.1 -8.9±2.3 892.2±305 1904.4±448.1
22 775±196.4 2949±409.7 1421.8±309.7 38±27.8 577±144.2 2330.6±572.3
23 584.9±240.2 1977.9±361.4 1209.8±405.1 -7.3±3.2 273.7±93.3 1430.6±363.9
24 485.4±194.4 1819.8±325.5 837.2±261.4 -3.4±4.1 234.4±71.1 943.9±243.3
25 452.3±175 2072±405.7 957.1±293.1 -8.9±2.3 163±43.2 1341.2±394.7
26 517.9±179.1 2616±567.5 1126.6±289 -8.3±2.3 199.9±89.2 1615.7±385.6
27 592.8±171.7 1838.3±372.4 749.3±170.4 -7.3±2.5 325.5±98.7 1110.7±308.8
28 793±228.5 1795.4±332.3 1068.7±210.3 2.5±4.1 553.1±144.3 1480.8±357.1
29 661.8±199.9 2140.6±599.3 1202.7±292.2 -8.7±2.8 558.9±279.2 1424.2±408.6
30 529.1±163.3 1528.2±249.8 840.5±218.3 -8.9±2.3 357.7±149.4 1029.3±335
31 464.8±152.9 1332.2±322.7 726.3±194.3 -8.9±2.3 354.3±158.6 884.4±282
32 612.9±175.3 1584.2±390.2 1058.3±219.8 -8.7±2.8 364.6±149.8 1388.8±467.3
33 1600.2±416.7 2597.4±367.9 2086.4±414.8 -6.3±3.3 893.8±266 2490.6±416.4
34 2814.6±376.2 2713.6±380.8 1888.8±499.4 -7.5±3.1 1288.9±438.9 2428.1±458.9
37 1245.9±471.7 1877.7±291.2 1606.6±441.9 14.2±13 1227.5±348.1 1260.7±342
印度恆河猴中之記憶表型
恆河猴經免疫接種具有或不具有抗CTLA4之ChAdV68.5WTnt.MAG25mer/VEE-MAG25mer srRNA異源初免/ 增強免疫方案，且再次用ChAdV68.5WTnt.MAG25mer 加打。在最終ChAdV68投藥之後11個月評估各組(研究第18個月)。ELISpot如所描述進行。圖38及表38展示在免疫接種前(左圖)及免疫接種之後18 個月(右圖)如藉由ELISpot所量測之對六種不同Mamu-A*01限制性抗原決定基之細胞反應。對限制性抗原決定基之反應的偵測表明，抗原特異性記憶反應由ChAdV68/samRNA疫苗方案產生。
為評估記憶，使用雙色Mamu-A*01四聚體標記監測識別在疫苗中編碼之4種不同恆河猴Mamu-A*01 I類抗原決定基的CD8+ T細胞，其中各抗原由獨特的雙陽性組合表示，且允許鑑別單個樣品內之所有4個抗原特異性群體。藉由用細胞表面標記物CD45RA及CCR7共同染色來進行記憶細胞表型。圖39及表39展示識別四種不同Mamu-A*01限制性抗原決定基之記憶T細胞之組合四聚體染色及CD45RA/CCR7共同染色的結果。T細胞表型亦藉由流式細胞量測術評估。圖40展示在研究第18個月時四個Mamu-A*01四聚體+CD8+ T細胞群體之總和內記憶細胞類型之分佈。記憶細胞表徵如下：CD45RA+CCR7+=初始，CD45RA+CCR7-=效應(Teff)，CD45RA-CCR7+=中央記憶(Tcm)，CD45RA-CCR7-=效應記憶(Tem)。總體而言，結果表明，在最後一次增強免疫之後至少一年偵測到記憶反應，從而表明持久的免疫性，包括效應、中央記憶及效應記憶群體。 表38 在初免前及記憶評估時間點(18個月)各動物之每106 個PBMC的平均斑點形成細胞(SFC)。
動物 初免前基線 18個月
Tat TL8 Gag CM9 Env TL9 Env CL9 Gag LW9 Pol SV9 Tat TL8 Gag CM9 Env TL9 Env CL9 Gag LW9 Pol SV9
1 1.7 0.0 0.0 5.0 0.0 13.7 683.0 499.2 1100.3 217.5 47.7 205.3
2 0.0 0.0 0.0 0.2 0.1 0.0 773.4 ND 1500.0 509.3 134.5 242.5
3 0.0 0.0 6.7 6.8 10.2 3.3 746.3 167.5 494.1 402.8 140.6 376.0
4 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 47.6 1023.9 85.1 44.2 44.2 47.6
5 15.3 6.7 18.6 15.6 5.2 12.1 842.4 467.7 1500.0 805.9 527.8 201.8
6 3.1 0.0 0.0 15.5 6.9 5.3 224.3 720.3 849.0 296.9 32.4 121.9
ND=由於技術排除未測定 表39 來自存活CD8+細胞之Mamu-A*01四聚體陽性%
動物 Tat TL8 Gag CM9 Env TL9 Env CL9
1 0.42 0.11 0.19 0.013
2 0.36 0.048 0.033 0.00834
3 0.97 0.051 0.35 0.048
4 0.46 0.083 0.17 0.028
5 0.77 0.45 0.14 0.2
6 0.71 0.16 0.17 0.04
印度恆河猴中之非 GLP RNA 劑量範圍研究 ( 較高劑量 )
本研究經設計用於(a)評價300 μg 劑量VEE-MAG25mer srRNA以同源初免/增強免疫或異源初免/增強免疫形式與ChAdV68.5WTnt.MAG25mer之組合的免疫原性；(b)比較在使用300 μg劑量LNP1對LNP2之脂質奈米粒子中VEE-MAG25mer srRNA之免疫反應；及(c)評價針對VEE-MAG25mer srRNA及ChAdV68.5WTnt.MAG25mer免疫接種之T細胞反應的動力學。
該研究組係在Mamu-A*01印度恆河猴中進行以證實免疫原性。在諸如恆河猴之非人類靈長類動物物種中之疫苗免疫原性係在人類中疫苗效力之最佳預測指標。此外，選擇用於本研究中之抗原僅在恆河猴中識別到，具體言之，係彼等具有Mamu-A*01 I類MHC單倍型之抗原。將Mamu-A*01印度恆河猴隨機分成不同研究組(6隻恆河猴/組)且經兩側IM注射投與編碼包括多個Mamu-A*01限制性抗原之模型抗原的ChAdV68.5-WTnt.MAG25mer或VEE-MAG25mer srRNA。研究組如下所述。
在免疫接種之前及在初始免疫接種之後第4週、第5週、第6週、第7週、第8週、第10週、第11週、第12週、第13週、第14週、第15週、第16週、第17週、第18週、第19週、第20週、第21週、第22週、第23週或第24週收集PBMC以供第1組(異源初免/增強免疫)之免疫監測。在免疫接種之前及在初始免疫接種之後第4週、第5週、第7週、第8週、第10週、第11週、第12週、第13週、第14週或第15週收集PBMC以供第2組及第3組(同源初免/增強免疫)之免疫監測。表 26 ：印度恆河猴之非GLP免疫原性研究
群組 初免 增強免疫1 增強免疫2 增強免疫3
1 ChAdV68.5WTnt.MAG25mer VEE-MAG25mer srRNA -LNP2 (300 µg) VEE-MAG25mer srRNA -LNP2 (300 µg) VEE-MAG25mer srRNA -LNP2 (300 µg)
2 VEE-MAG25mer srRNA -LNP2 (300 µg) VEE-MAG25mer srRNA -LNP2 (300 µg) VEE-MAG25mer srRNA -LNP2 (300 µg)   
3 VEE-MAG25mer srRNA  -LNP1 (300 µg) VEE-MAG25mer srRNA  -LNP1 (300 µg) VEE-MAG25mer srRNA  -LNP1 (300 µg)   
XIX. 鑑別 MHC/ 肽靶標反應性 T 細胞及 TCR
針對一或多個抗原/HLA肽對，包括本文所述之任何抗原，諸如腫瘤相關抗原或感染性疾病相關抗原，鑑別靶反應性T細胞及TCR。
可自患者之血液、淋巴結或腫瘤中分離出T細胞。可例如藉由分選抗原-MHC四聚體結合細胞或藉由分選在T細胞及抗原脈衝之抗原呈現細胞之活體外共培養物中刺激的活化細胞來富集T細胞之抗原特異性T細胞。此項技術中已知用於抗原特異性T細胞鑑別之各種試劑，包括載有抗原之四聚體及其他基於MHC之試劑。
可藉由抗原特異性T細胞之TCR之單細胞定序來鑑別與抗原相關之α-β (或γ-δ) TCR二聚體。可替代地，可進行抗原特異性T細胞之整體TCR定序，且可使用此項技術中已知之TCR配對方法確定具有高匹配機率之α-β對。
可替代地或另外，可經由活體外引發來自健康供體之初始T細胞來獲得抗原特異性T細胞。自PBMC、淋巴結或臍帶血中獲得之T細胞可經抗原脈衝之抗原呈現細胞反復刺激，從而引發經歷抗原之T細胞分化。隨後可類似於上文針對來自患者之抗原特異性T細胞所述來鑑別TCR。XX.       ChAdV68 載體中之 E4 缺失展現提高之生產能力
選擇ChAdV68腺病毒載體之純系以提高病毒生產能力。在蝕斑分離過程中選擇表現模型TSNA卡匣MAG之快速生長/適合ChAdV68病毒且如下所述進行分析。材料及方法 ChAdV68 蝕斑分離
製備ChAdV68-MAG病毒之系列稀釋液(自10-2 至10-9 )，且將100 uL涂鋪於以1e6個細胞/60 mM培養盤接種之HEK293A (ThermoFisher目錄號R70507)細胞上。感染後24小時，移除培養基，且用DMEM/1.25%瓊脂糖覆蓋受感染細胞，且使蝕斑生長10-15天。在此期間，挑取72個病毒蝕斑。將病毒在0.5 mL DMEM/5% FBS培養基中溶離隔夜，且將一半溶離液(0.25 mL)用於重新感染以1e5個細胞/孔接種於24孔培養盤之293A細胞。病毒經擴增且感染至293A細胞上。選擇快速生長之純系用於在400 mL 293F (ThermoFisher目錄號A14528)懸浮培養物中產生病毒。藉由2X CsCl梯度純化來純化病毒，且藉由3輪透析將其調配至ARM緩衝液(25 mM NaCl、20 mm Tris pH 8.0、2.5%甘油)中。病毒粒子力價藉由在56 C下0.1% SDS裂解後在260 nm處之吸光度測定。感染力價使用抗衣殼免疫染色分析確定。下一代定序
使用QiAamp病毒DNA套組(Qiagen)自純化之病毒純化DNA，且使用Illumina平台 進行NGS。純系生產能力之 MOI 評價
使用純化之病毒以0.1 IU之MOI設置受控感染且培育96小時。在細胞裂解物中量測感染單位。將產量與非蝕斑選擇病毒(池)進行比較。免疫接種
向Balb/c雌性小鼠注射ChAdV68.5WTnt.MAG25mer (SEQ ID NO:2)或ChAdV68-MAG-E4缺失(SEQ ID NO: 57；「MAG E4 δ」及「ChAdV68-MAG-E4」)之1x109 或1x1010 個病毒粒子(VP)，體積為100 uL，雙側肌肉內注射(每條腿50 uL)。
將Mamu-A*01印度恆河猴用1x1012 個病毒粒子(5x1011 個病毒粒子/注射)之ChAdV68.5WTnt.MAG25mer (「ChAdV68-CMV-MAG」；SEQ ID NO:2；無E4缺失或TET反應元件)或ChAdV68-E4d-CMT-MAG (SEQ ID NO:64；E4缺失及CMT TET反應元件[參見下文])以雙側肌肉內注射在股四頭肌中免疫。在注射當天，亦向恆河猴投與50 mg抗CTLA4抗體(伊匹单抗) SC。
ChAdV68-E4d-CMT-MAG; SEQ ID NO: 64
CATCaTCAATAATATACCTCAAACTTTTTGTGCGCGTTAATATGCAAATGAGGCGTTTGAATTTGGGGAGGAAGGGCGGTGATTGGTCGAGGGATGAGCGACCGTTAGGGGCGGGGCGAGTGACGTTTTGATGACGTGGTTGCGAGGAGGAGCCAGTTTGCAAGTTCTCGTGGGAAAAGTGACGTCAAACGAGGTGTGGTTTGAACACGGAAATACTCAATTTTCCCGCGCTCTCTGACAGGAAATGAGGTGTTTCTGGGCGGATGCAAGTGAAAACGGGCCATTTTCGCGCGAAAACTGAATGAGGAAGTGAAAATCTGAGTAATTTCGCGTTTATGGCAGGGAGGAGTATTTGCCGAGGGCCGAGTAGACTTTGACCGATTACGTGGGGGTTTCGATTACCGTGTTTTTCACCTAAATTTCCGCGTACGGTGTCAAAGTCCGGTGTTTTTACGTAGGTGTCAGCTGATCGCCAGGGTATTTAAACCTGCGCTCTCCAGTCAAGAGGCCACTCTTGAGTGCCAGCGAGAAGAGTTTTCTCCTCCGCGCCGCGAGTCAGATCTACACTTTGAAAGTAGGGATAACAGGGTAATgacattgattattgactagttGttaaTAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTCCGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTACGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGgTGATGCGGTTTTGGCAGTACACCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAATAACCCCGCCCCGTTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAgcTCTCCCTATCAGTGATAGAGATCTCCCTATCAGTGATAGAGATCGTCGACGAGCTCGTTTAGTGAACCGTCAGATCGCCTGGAACGCCATCCACGCTGTTTTGACCTCCATAGAAGACAGCGATCGCGccaccATGGCCGGGATGTTCCAGGCACTGTCCGAAGGCTGCACACCCTATGATATTAACCAGATGCTGAATGTCCTGGGAGACCACCAGGTCTCTGGCCTGGAGCAGCTGGAGAGCATCATCAACTTCGAGAAGCTGACCGAGTGGACAAGCTCCAATGTGATGCCTATCCTGTCCCCACTGACCAAGGGCATCCTGGGCTTCGTGTTTACCCTGACAGTGCCTTCTGAGCGGGGCCTGTCTTGCATCAGCGAGGCAGACGCAACCACACCAGAGTCCGCCAATCTGGGCGAGGAGATCCTGTCTCAGCTGTACCTGTGGCCCCGGGTGACATATCACTCCCCTTCTTACGCCTATCACCAGTTCGAGCGGAGAGCCAAGTACAAGAGACACTTCCCAGGCTTTGGCCAGTCTCTGCTGTTCGGCTACCCCGTGTACGTGTTCGGCGATTGCGTGCAGGGCGACTGGGATGCCATCCGGTTTAGATACTGCGCACCACCTGGATATGCACTGCTGAGGTGTAACGACACCAATTATTCCGCCCTGCTGGCAGTGGGCGCCCTGGAGGGCCCTCGCAATCAGGATTGGCTGGGCGTGCCAAGGCAGCTGGTGACACGCATGCAGGCCATCCAGAACGCAGGCCTGTGCACCCTGGTGGCAATGCTGGAGGAGACAATCTTCTGGCTGCAGGCCTTTCTGATGGCCCTGACCGACAGCGGCCCCAAGACAAACATCATCGTGGATTCCCAGTACGTGATGGGCATCTCCAAGCCTTCTTTCCAGGAGTTTGTGGACTGGGAGAACGTGAGCCCAGAGCTGAATTCCACCGATCAGCCATTCTGGCAGGCAGGAATCCTGGCAAGGAACCTGGTGCCTATGGTGGCCACAGTGCAGGGCCAGAATCTGAAGTACCAGGGCCAGAGCCTGGTCATCAGCGCCTCCATCATCGTGTTTAACCTGCTGGAGCTGGAGGGCGACTATCGGGACGATGGCAACGTGTGGGTGCACACCCCACTGAGCCCCAGAACACTGAACGCCTGGGTGAAGGCCGTGGAGGAGAAGAAGGGCATCCCAGTGCACCTGGAGCTGGCCTCCATGACCAATATGGAGCTGATGTCTAGCATCGTGCACCAGCAGGTGAGGACATACGGACCCGTGTTCATGTGCCTGGGAGGCCTGCTGACCATGGTGGCAGGAGCCGTGTGGCTGACAGTGCGGGTGCTGGAGCTGTTCAGAGCCGCCCAGCTGGCCAACGATGTGGTGCTGCAGATCATGGAGCTGTGCGGAGCAGCCTTTCGCCAGGTGTGCCACACCACAGTGCCATGGCCCAATGCCTCCCTGACCCCCAAGTGGAACAATGAGACAACACAGCCTCAGATCGCCAACTGTAGCGTGTACGACTTCTTCGTGTGGCTGCACTACTATAGCGTGAGGGATACCCTGTGGCCCCGCGTGACATACCACATGAATAAGTACGCCTATCACATGCTGGAGAGGCGCGCCAAGTATAAGAGAGGCCCTGGCCCAGGCGCAAAGTTTGTGGCAGCATGGACCCTGAAGGCCGCCGCCGGCCCCGGCCCCGGCCAGTATATCAAGGCTAACAGTAAGTTCATTGGAATCACAGAGCTGGGACCCGGACCTGGATAATGAGTTTAAACTCCCATTTAAATGTGAGGGTTAATGCTTCGAGCAGACATGATAAGATACATTGATGAGTTTGGACAAACCACAACTAGAATGCAGTGAAAAAAATGCTTTATTTGTGAAATTTGTGATGCTATTGCTTTATTTGTAACCATTATAAGCTGCAATAAACAAGTTAACAACAACAATTGCATTCATTTTATGTTTCAGGTTCAGGGGGAGATGTGGGAGGTTTTTTAAAGCAAGTAAAACCTCTACAAATGTGGTAAAATAACTATAACGGTCCTAAGGTAGCGAGTGAGTAGTGTTCTGGGGCGGGGGAGGACCTGCATGAGGGCCAGAATAACTGAAATCTGTGCTTTTCTGTGTGTTGCAGCAGCATGAGCGGAAGCGGCTCCTTTGAGGGAGGGGTATTCAGCCCTTATCTGACGGGGCGTCTCCCCTCCTGGGCGGGAGTGCGTCAGAATGTGATGGGATCCACGGTGGACGGCCGGCCCGTGCAGCCCGCGAACTCTTCAACCCTGACCTATGCAACCCTGAGCTCTTCGTCGTTGGACGCAGCTGCCGCCGCAGCTGCTGCATCTGCCGCCAGCGCCGTGCGCGGAATGGCCATGGGCGCCGGCTACTACGGCACTCTGGTGGCCAACTCGAGTTCCACCAATAATCCCGCCAGCCTGAACGAGGAGAAGCTGTTGCTGCTGATGGCCCAGCTCGAGGCCTTGACCCAGCGCCTGGGCGAGCTGACCCAGCAGGTGGCTCAGCTGCAGGAGCAGACGCGGGCCGCGGTTGCCACGGTGAAATCCAAATAAAAAATGAATCAATAAATAAACGGAGACGGTTGTTGATTTTAACACAGAGTCTGAATCTTTATTTGATTTTTCGCGCGCGGTAGGCCCTGGACCACCGGTCTCGATCATTGAGCACCCGGTGGATCTTTTCCAGGACCCGGTAGAGGTGGGCTTGGATGTTGAGGTACATGGGCATGAGCCCGTCCCGGGGGTGGAGGTAGCTCCATTGCAGGGCCTCGTGCTCGGGGGTGGTGTTGTAAATCACCCAGTCATAGCAGGGGCGCAGGGCATGGTGTTGCACAATATCTTTGAGGAGGAGACTGATGGCCACGGGCAGCCCTTTGGTGTAGGTGTTTACAAATCTGTTGAGCTGGGAGGGATGCATGCGGGGGGAGATGAGGTGCATCTTGGCCTGGATCTTGAGATTGGCGATGTTACCGCCCAGATCCCGCCTGGGGTTCATGTTGTGCAGGACCACCAGCACGGTGTATCCGGTGCACTTGGGGAATTTATCATGCAACTTGGAAGGGAAGGCGTGAAAGAATTTGGCGACGCCTTTGTGCCCGCCCAGGTTTTCCATGCACTCATCCATGATGATGGCGATGGGCCCGTGGGCGGCGGCCTGGGCAAAGACGTTTCGGGGGTCGGACACATCATAGTTGTGGTCCTGGGTGAGGTCATCATAGGCCATTTTAATGAATTTGGGGCGGAGGGTGCCGGACTGGGGGACAAAGGTtCCCTCGATCCCGGGGGCGTAGTTCCCCTCACAGATCTGCATCTCCCAGGCTTTGAGCTCGGAGGGGGGGATCATGTCCACCTGCGGGGCGATAAAGAACACGGTTTCCGGGGCGGGGGAGATGAGCTGGGCCGAAAGCAAGTTCCGGAGCAGCTGGGACTTGCCGCAGCCGGTGGGGCCGTAGATGACCCCGATGACCGGCTGCAGGTGGTAGTTGAGGGAGAGACAGCTGCCGTCCTCCCGGAGGAGGGGGGCCACCTCGTTCATCATCTCGCGCACGTGCATGTTCTCGCGCACCAGTTCCGCCAGGAGGCGCTCTCCCCCCAGGGATAGGAGCTCCTGGAGCGAGGCGAAGTTTTTCAGCGGCTTGAGTCCGTCGGCCATGGGCATTTTGGAGAGGGTTTGTTGCAAGAGTTCCAGGCGGTCCCAGAGCTCGGTGATGTGCTCTACGGCATCTCGATCCAGCAGACCTCCTCGTTTCGCGGGTTGGGACGGCTGCGGGAGTAGGGCACCAGACGATGGGCGTCCAGCGCAGCCAGGGTCCGGTCCTTCCAGGGTCGCAGCGTCCGCGTCAGGGTGGTCTCCGTCACGGTGAAGGGGTGCGCGCCGGGCTGGGCGCTTGCGAGGGTGCGCTTCAGGCTCATCCGGCTGGTCGAAAACCGCTCCCGATCGGCGCCCTGCGCGTCGGCCAGGTAGCAATTGACCATGAGTTCGTAGTTGAGCGCCTCGGCCGCGTGGCCTTTGGCGCGGAGCTTACCTTTGGAAGTCTGCCCGCAGGCGGGACAGAGGAGGGACTTGAGGGCGTAGAGCTTGGGGGCGAGGAAGACGGACTCGGGGGCGTAGGCGTCCGCGCCGCAGTGGGCGCAGACGGTCTCGCACTCCACGAGCCAGGTGAGGTCGGGCTGGTCGGGGTCAAAAACCAGTTTCCCGCCGTTCTTTTTGATGCGTTTCTTACCTTTGGTCTCCATGAGCTCGTGTCCCCGCTGGGTGACAAAGAGGCTGTCCGTGTCCCCGTAGACCGACTTTATGGGCCGGTCCTCGAGCGGTGTGCCGCGGTCCTCCTCGTAGAGGAACCCCGCCCACTCCGAGACGAAAGCCCGGGTCCAGGCCAGCACGAAGGAGGCCACGTGGGACGGGTAGCGGTCGTTGTCCACCAGCGGGTCCACCTTTTCCAGGGTATGCAAACACATGTCCCCCTCGTCCACATCCAGGAAGGTGATTGGCTTGTAAGTGTAGGCCACGTGACCGGGGGTCCCGGCCGGGGGGGTATAAAAGGGTGCGGGTCCCTGCTCGTCCTCACTGTCTTCCGGATCGCTGTCCAGGAGCGCCAGCTGTTGGGGTAGGTATTCCCTCTCGAAGGCGGGCATGACCTCGGCACTCAGGTTGTCAGTTTCTAGAAACGAGGAGGATTTGATATTGACGGTGCCGGCGGAGATGCCTTTCAAGAGCCCCTCGTCCATCTGGTCAGAAAAGACGATCTTTTTGTTGTCGAGCTTGGTGGCGAAGGAGCCGTAGAGGGCGTTGGAGAGGAGCTTGGCGATGGAGCGCATGGTCTGGTTTTTTTCCTTGTCGGCGCGCTCCTTGGCGGCGATGTTGAGCTGCACGTACTCGCGCGCCACGCACTTCCATTCGGGGAAGACGGTGGTCAGCTCGTCGGGCACGATTCTGACCTGCCAGCCCCGATTATGCAGGGTGATGAGGTCCACACTGGTGGCCACCTCGCCGCGCAGGGGCTCATTAGTCCAGCAGAGGCGTCCGCCCTTGCGCGAGCAGAAGGGGGGCAGGGGGTCCAGCATGACCTCGTCGGGGGGGTCGGCATCGATGGTGAAGATGCCGGGCAGGAGGTCGGGGTCAAAGTAGCTGATGGAAGTGGCCAGATCGTCCAGGGCAGCTTGCCATTCGCGCACGGCCAGCGCGCGCTCGTAGGGACTGAGGGGCGTGCCCCAGGGCATGGGATGGGTAAGCGCGGAGGCGTACATGCCGCAGATGTCGTAGACGTAGAGGGGCTCCTCGAGGATGCCGATGTAGGTGGGGTAGCAGCGCCCCCCGCGGATGCTGGCGCGCACGTAGTCATACAGCTCGTGCGAGGGGGCGAGGAGCCCCGGGCCCAGGTTGGTGCGACTGGGCTTTTCGGCGCGGTAGACGATCTGGCGGAAAATGGCATGCGAGTTGGAGGAGATGGTGGGCCTTTGGAAGATGTTGAAGTGGGCGTGGGGCAGTCCGACCGAGTCGCGGATGAAGTGGGCGTAGGAGTCTTGCAGCTTGGCGACGAGCTCGGCGGTGACTAGGACGTCCAGAGCGCAGTAGTCGAGGGTCTCCTGGATGATGTCATACTTGAGCTGTCCCTTTTGTTTCCACAGCTCGCGGTTGAGAAGGAACTCTTCGCGGTCCTTCCAGTACTCTTCGAGGGGGAACCCGTCCTGATCTGCACGGTAAGAGCCTAGCATGTAGAACTGGTTGACGGCCTTGTAGGCGCAGCAGCCCTTCTCCACGGGGAGGGCGTAGGCCTGGGCGGCCTTGCGCAGGGAGGTGTGCGTGAGGGCGAAAGTGTCCCTGACCATGACCTTGAGGAACTGGTGCTTGAAGTCGATATCGTCGCAGCCCCCCTGCTCCCAGAGCTGGAAGTCCGTGCGCTTCTTGTAGGCGGGGTTGGGCAAAGCGAAAGTAACATCGTTGAAGAGGATCTTGCCCGCGCGGGGCATAAAGTTGCGAGTGATGCGGAAAGGTTGGGGCACCTCGGCCCGGTTGTTGATGACCTGGGCGGCGAGCACGATCTCGTCGAAGCCGTTGATGTTGTGGCCCACGATGTAGAGTTCCACGAATCGCGGACGGCCCTTGACGTGGGGCAGTTTCTTGAGCTCCTCGTAGGTGAGCTCGTCGGGGTCGCTGAGCCCGTGCTGCTCGAGCGCCCAGTCGGCGAGATGGGGGTTGGCGCGGAGGAAGGAAGTCCAGAGATCCACGGCCAGGGCGGTTTGCAGACGGTCCCGGTACTGACGGAACTGCTGCCCGACGGCCATTTTTTCGGGGGTGACGCAGTAGAAGGTGCGGGGGTCCCCGTGCCAGCGATCCCATTTGAGCTGGAGGGCGAGATCGAGGGCGAGCTCGACGAGCCGGTCGTCCCCGGAGAGTTTCATGACCAGCATGAAGGGGACGAGCTGCTTGCCGAAGGACCCCATCCAGGTGTAGGTTTCCACATCGTAGGTGAGGAAGAGCCTTTCGGTGCGAGGATGCGAGCCGATGGGGAAGAACTGGATCTCCTGCCACCAATTGGAGGAATGGCTGTTGATGTGATGGAAGTAGAAATGCCGACGGCGCGCCGAACACTCGTGCTTGTGTTTATACAAGCGGCCACAGTGCTCGCAACGCTGCACGGGATGCACGTGCTGCACGAGCTGTACCTGAGTTCCTTTGACGAGGAATTTCAGTGGGAAGTGGAGTCGTGGCGCCTGCATCTCGTGCTGTACTACGTCGTGGTGGTCGGCCTGGCCCTCTTCTGCCTCGATGGTGGTCATGCTGACGAGCCCGCGCGGGAGGCAGGTCCAGACCTCGGCGCGAGCGGGTCGGAGAGCGAGGACGAGGGCGCGCAGGCCGGAGCTGTCCAGGGTCCTGAGACGCTGCGGAGTCAGGTCAGTGGGCAGCGGCGGCGCGCGGTTGACTTGCAGGAGTTTTTCCAGGGCGCGCGGGAGGTCCAGATGGTACTTGATCTCCACCGCGCCATTGGTGGCGACGTCGATGGCTTGCAGGGTCCCGTGCCCCTGGGGTGTGACCACCGTCCCCCGTTTCTTCTTGGGCGGCTGGGGCGACGGGGGCGGTGCCTCTTCCATGGTTAGAAGCGGCGGCGAGGACGCGCGCCGGGCGGCAGGGGCGGCTCGGGGCCCGGAGGCAGGGGCGGCAGGGGCACGTCGGCGCCGCGCGCGGGTAGGTTCTGGTACTGCGCCCGGAGAAGACTGGCGTGAGCGACGACGCGACGGTTGACGTCCTGGATCTGACGCCTCTGGGTGAAGGCCACGGGACCCGTGAGTTTGAACCTGAAAGAGAGTTCGACAGAATCAATCTCGGTATCGTTGACGGCGGCCTGCCGCAGGATCTCTTGCACGTCGCCCGAGTTGTCCTGGTAGGCGATCTCGGTCATGAACTGCTCGATCTCCTCCTCTTGAAGGTCTCCGCGGCCGGCGCGCTCCACGGTGGCCGCGAGGTCGTTGGAGATGCGGCCCATGAGCTGCGAGAAGGCGTTCATGCCCGCCTCGTTCCAGACGCGGCTGTAGACCACGACGCCCTCGGGATCGCgGGCGCGCATGACCACCTGGGCGAGGTTGAGCTCCACGTGGCGCGTGAAGACCGCGTAGTTGCAGAGGCGCTGGTAGAGGTAGTTGAGCGTGGTGGCGATGTGCTCGGTGACGAAGAAATACATGATCCAGCGGCGGAGCGGCATCTCGCTGACGTCGCCCAGCGCCTCCAAACGTTCCATGGCCTCGTAAAAGTCCACGGCGAAGTTGAAAAACTGGGAGTTGCGCGCCGAGACGGTCAACTCCTCCTCCAGAAGACGGATGAGCTCGGCGATGGTGGCGCGCACCTCGCGCTCGAAGGCCCCCGGGAGTTCCTCCACTTCCTCTTCTTCCTCCTCCACTAACATCTCTTCTACTTCCTCCTCAGGCGGCAGTGGTGGCGGGGGAGGGGGCCTGCGTCGCCGGCGGCGCACGGGCAGACGGTCGATGAAGCGCTCGATGGTCTCGCCGCGCCGGCGTCGCATGGTCTCGGTGACGGCGCGCCCGTCCTCGCGGGGCCGCAGCGTGAAGACGCCGCCGCGCATCTCCAGGTGGCCGGGGGGGTCCCCGTTGGGCAGGGAGAGGGCGCTGACGATGCATCTTATCAATTGCCCCGTAGGGACTCCGCGCAAGGACCTGAGCGTCTCGAGATCCACGGGATCTGAAAACCGCTGAACGAAGGCTTCGAGCCAGTCGCAGTCGCAAGGTAGGCTGAGCACGGTTTCTTCTGGCGGGTCATGTTGGTTGGGAGCGGGGCGGGCGATGCTGCTGGTGATGAAGTTGAAATAGGCGGTTCTGAGACGGCGGATGGTGGCGAGGAGCACCAGGTCTTTGGGCCCGGCTTGCTGGATGCGCAGACGGTCGGCCATGCCCCAGGCGTGGTCCTGACACCTGGCCAGGTCCTTGTAGTAGTCCTGCATGAGCCGCTCCACGGGCACCTCCTCCTCGCCCGCGCGGCCGTGCATGCGCGTGAGCCCGAAGCCGCGCTGGGGCTGGACGAGCGCCAGGTCGGCGACGACGCGCTCGGCGAGGATGGCTTGCTGGATCTGGGTGAGGGTGGTCTGGAAGTCATCAAAGTCGACGAAGCGGTGGTAGGCTCCGGTGTTGATGGTGTAGGAGCAGTTGGCCATGACGGACCAGTTGACGGTCTGGTGGCCCGGACGCACGAGCTCGTGGTACTTGAGGCGCGAGTAGGCGCGCGTGTCGAAGATGTAGTCGTTGCAGGTGCGCACCAGGTACTGGTAGCCGATGAGGAAGTGCGGCGGCGGCTGGCGGTAGAGCGGCCATCGCTCGGTGGCGGGGGCGCCGGGCGCGAGGTCCTCGAGCATGGTGCGGTGGTAGCCGTAGATGTACCTGGACATCCAGGTGATGCCGGCGGCGGTGGTGGAGGCGCGCGGGAACTCGCGGACGCGGTTCCAGATGTTGCGCAGCGGCAGGAAGTAGTTCATGGTGGGCACGGTCTGGCCCGTGAGGCGCGCGCAGTCGTGGATGCTCTATACGGGCAAAAACGAAAGCGGTCAGCGGCTCGACTCCGTGGCCTGGAGGCTAAGCGAACGGGTTGGGCTGCGCGTGTACCCCGGTTCGAATCTCGAATCAGGCTGGAGCCGCAGCTAACGTGGTATTGGCACTCCCGTCTCGACCCAAGCCTGCACCAACCCTCCAGGATACGGAGGCGGGTCGTTTTGCAACTTTTTTTTGGAGGCCGGATGAGACTAGTAAGCGCGGAAAGCGGCCGACCGCGATGGCTCGCTGCCGTAGTCTGGAGAAGAATCGCCAGGGTTGCGTTGCGGTGTGCCCCGGTTCGAGGCCGGCCGGATTCCGCGGCTAACGAGGGCGTGGCTGCCCCGTCGTTTCCAAGACCCCATAGCCAGCCGACTTCTCCAGTTACGGAGCGAGCCCCTCTTTTGTTTTGTTTGTTTTTGCCAGATGCATCCCGTACTGCGGCAGATGCGCCCCCACCACCCTCCACCGCAACAACAGCCCCCTCCACAGCCGGCGCTTCTGCCCCCGCCCCAGCAGCAACTTCCAGCCACGACCGCCGCGGCCGCCGTGAGCGGGGCTGGACAGAGTTATGATCACCAGCTGGCCTTGGAAGAGGGCGAGGGGCTGGCGCGCCTGGGGGCGTCGTCGCCGGAGCGGCACCCGCGCGTGCAGATGAAAAGGGACGCTCGCGAGGCCTACGTGCCCAAGCAGAACCTGTTCAGAGACAGGAGCGGCGAGGAGCCCGAGGAGATGCGCGCGGCCCGGTTCCACGCGGGGCGGGAGCTGCGGCGCGGCCTGGACCGAAAGAGGGTGCTGAGGGACGAGGATTTCGAGGCGGACGAGCTGACGGGGATCAGCCCCGCGCGCGCGCACGTGGCCGCGGCCAACCTGGTCACGGCGTACGAGCAGACCGTGAAGGAGGAGAGCAACTTCCAAAAATCCTTCAACAACCACGTGCGCACCCTGATCGCGCGCGAGGAGGTGACCCTGGGCCTGATGCACCTGTGGGACCTGCTGGAGGCCATCGTGCAGAACCCCACCAGCAAGCCGCTGACGGCGCAGCTGTTCCTGGTGGTGCAGCATAGTCGGGACAACGAAGCGTTCAGGGAGGCGCTGCTGAATATCACCGAGCCCGAGGGCCGCTGGCTCCTGGACCTGGTGAACATTCTGCAGAGCATCGTGGTGCAGGAGCGCGGGCTGCCGCTGTCCGAGAAGCTGGCGGCCATCAACTTCTCGGTGCTGAGTTTGGGCAAGTACTACGCTAGGAAGATCTACAAGACCCCGTACGTGCCCATAGACAAGGAGGTGAAGATCGACGGGTTTTACATGCGCATGACCCTGAAAGTGCTGACCCTGAGCGACGATCTGGGGGTGTACCGCAACGACAGGATGCACCGTGCGGTGAGCGCCAGCAGGCGGCGCGAGCTGAGCGACCAGGAGCTGATGCATAGTCTGCAGCGGGCCCTGACCGGGGCCGGGACCGAGGGGGAGAGCTACTTTGACATGGGCGCGGACCTGCACTGGCAGCCCAGCCGCCGGGCCTTGGAGGCGGCGGCAGGACCCTACGTAGAAGAGGTGGACGATGAGGTGGACGAGGAGGGCGAGTACCTGGAAGACTGATGGCGCGACCGTATTTTTGCTAGATGCAACAACAACAGCCACCTCCTGATCCCGCGATGCGGGCGGCGCTGCAGAGCCAGCCGTCCGGCATTAACTCCTCGGACGATTGGACCCAGGCCATGCAACGCATCATGGCGCTGACGACCCGCAACCCCGAAGCCTTTAGACAGCAGCCCCAGGCCAACCGGCTCTCGGCCATCCTGGAGGCCGTGGTGCCCTCGCGCTCCAACCCCACGCACGAGAAGGTCCTGGCCATCGTGAACGCGCTGGTGGAGAACAAGGCCATCCGCGGCGACGAGGCCGGCCTGGTGTACAACGCGCTGCTGGAGCGCGTGGCCCGCTACAACAGCACCAACGTGCAGACCAACCTGGACCGCATGGTGACCGACGTGCGCGAGGCCGTGGCCCAGCGCGAGCGGTTCCACCGCGAGTCCAACCTGGGATCCATGGTGGCGCTGAACGCCTTCCTCAGCACCCAGCCCGCCAACGTGCCCCGGGGCCAGGAGGACTACACCAACTTCATCAGCGCCCTGCGCCTGATGGTGACCGAGGTGCCCCAGAGCGAGGTGTACCAGTCCGGGCCGGACTACTTCTTCCAGACCAGTCGCCAGGGCTTGCAGACCGTGAACCTGAGCCAGGCTTTCAAGAACTTGCAGGGCCTGTGGGGCGTGCAGGCCCCGGTCGGGGACCGCGCGACGGTGTCGAGCCTGCTGACGCCGAACTCGCGCCTGCTGCTGCTGCTGGTGGCCCCCTTCACGGACAGCGGCAGCATCAACCGCAACTCGTACCTGGGCTACCTGATTAACCTGTACCGCGAGGCCATCGGCCAGGCGCACGTGGACGAGCAGACCTACCAGGAGATCACCCACGTGAGCCGCGCCCTGGGCCAGGACGACCCGGGCAACCTGGAAGCCACCCTGAACTTTTTGCTGACCAACCGGTCGCAGAAGATCCCGCCCCAGTACGCGCTCAGCACCGAGGAGGAGCGCATCCTGCGTTACGTGCAGCAGAGCGTGGGCCTGTTCCTGATGCAGGAGGGGGCCACCCCCAGCGCCGCGCTCGACATGACCGCGCGCAACATGGAGCCCAGCATGTACGCCAGCAACCGCCCGTTCATCAATAAACTGATGGACTACTTGCATCGGGCGGCCGCCATGAACTCTGACTATTTCACCAACGCCATCCTGAATCCCCACTGGCTCCCGCCGCCGGGGTTCTACACGGGCGAGTACGACATGCCCGACCCCAATGACGGGTTCCTGTGGGACGATGTGGACAGCAGCGTGTTCTCCCCCCGACCGGGTGCTAACGAGCGCCCCTTGTGGAAGAAGGAAGGCAGCGACCGACGCCCGTCCTCGGCGCTGTCCGGCCGCGAGGGTGCTGCCGCGGCGGTGCCCGAGGCCGCCAGTCCTTTCCCGAGCTTGCCCTTCTCGCTGAACAGTATCCGCAGCAGCGAGCTGGGCAGGATCACGCGCCCGCGCTTGCTGGGCGAAGAGGAGTACTTGAATGACTCGCTGTTGAGACCCGAGCGGGAGAAGAACTTCCCCAATAACGGGATAGAAAGCCTGGTGGACAAGATGAGCCGCTGGAAGACGTATGCGCAGGAGCACAGGGACGATCCCCGGGCGTCGCAGGGGGCCACGAGCCGGGGCAGCGCCGCCCGTAAACGCCGGTGGCACGACAGGCAGCGGGGACAGATGTGGGACGATGAGGACTCCGCCGACGACAGCAGCGTGTTGGACTTGGGTGGGAGTGGTAACCCGTTCGCTCACCTGCGCCCCCGTATCGGGCGCATGATGTAAGAGAAACCGAAAATAAATGATACTCACCAAGGCCATGGCGACCAGCGTGCGTTCGTTTCTTCTCTGTTGTTGTTGTATCTAGTATGATGAGGCGTGCGTACCCGGAGGGTCCTCCTCCCTCGTACGAGAGCGTGATGCAGCAGGCGATGGCGGCGGCGGCGATGCAGCCCCCGCTGGAGGCTCCTTACGTGCCCCCGCGGTACCTGGCGCCTACGGAGGGGCGGAACAGCATTCGTTACTCGGAGCTGGCACCCTTGTACGATACCACCCGGTTGTACCTGGTGGACAACAAGTCGGCGGACATCGCCTCGCTGAACTACCAGAACGACCACAGCAACTTCCTGACCACCGTGGTGCAGAACAATGACTTCACCCCCACGGAGGCCAGCACCCAGACCATCAACTTTGACGAGCGCTCGCGGTGGGGCGGCCAGCTGAAAACCATCATGCACACCAACATGCCCAACGTGAACGAGTTCATGTACAGCAACAAGTTCAAGGCGCGGGTGATGGTCTCCCGCAAGACCCCCAATGGGGTGACAGTGACAGAGGATTATGATGGTAGTCAGGATGAGCTGAAGTATGAATGGGTGGAATTTGAGCTGCCCGAAGGCAACTTCTCGGTGACCATGACCATCGACCTGATGAACAACGCCATCATCGACAATTACTTGGCGGTGGGGCGGCAGAACGGGGTGCTGGAGAGCGACATCGGCGTGAAGTTCGACACTAGGAACTTCAGGCTGGGCTGGGACCCCGTGACCGAGCTGGTCATGCCCGGGGTGTACACCAACGAGGCTTTCCATCCCGATATTGTCTTGCTGCCCGGCTGCGGGGTGGACTTCACCGAGAGCCGCCTCAGCAACCTGCTGGGCATTCGCAAGAGGCAGCCCTTCCAGGAAGGCTTCCAGATCATGTACGAGGATCTGGAGGGGGGCAACATCCCCGCGCTCCTGGATGTCGACGCCTATGAGAAAAGCAAGGAGGATGCAGCAGCTGAAGCAACTGCAGCCGTAGCTACCGCCTCTACCGAGGTCAGGGGCGATAATTTTGCAAGCGCCGCAGCAGTGGCAGCGGCCGAGGCGGCTGAAACCGAAAGTAAGATAGTCATTCAGCCGGTGGAGAAGGATAGCAAGAACAGGAGCTACAACGTACTACCGGACAAGATAAACACCGCCTACCGCAGCTGGTACCTAGCCTACAACTATGGCGACCCCGAGAAGGGCGTGCGCTCCTGGACGCTGCTCACCACCTCGGACGTCACCTGCGGCGTGGAGCAAGTCTACTGGTCGCTGCCCGACATGATGCAAGACCCGGTCACCTTCCGCTCCACGCGTCAAGTTAGCAACTACCCGGTGGTGGGCGCCGAGCTCCTGCCCGTCTACTCCAAGAGCTTCTTCAACGAGCAGGCCGTCTACTCGCAGCAGCTGCGCGCCTTCACCTCGCTTACGCACGTCTTCAACCGCTTCCCCGAGAACCAGATCCTCGTCCGCCCGCCCGCGCCCACCATTACCACCGTCAGTGAAAACGTTCCTGCTCTCACAGATCACGGGACCCTGCCGCTGCGCAGCAGTATCCGGGGAGTCCAGCGCGTGACCGTTACTGACGCCAGACGCCGCACCTGCCCCTACGTCTACAAGGCCCTGGGCATAGTCGCGCCGCGCGTCCTCTCGAGCCGCACCTTCTAAATGTCCATTCTCATCTCGCCCAGTAATAACACCGGTTGGGGCCTGCGCGCGCCCAGCAAGATGTACGGAGGCGCTCGCCAACGCTCCACGCAACACCCCGTGCGCGTGCGCGGGCACTTCCGCGCTCCCTGGGGCGCCCTCAAGGGCCGCGTGCGGTCGCGCACCACCGTCGACGACGTGATCGACCAGGTGGTGGCCGACGCGCGCAACTACACCCCCGCCGCCGCGCCCGTCTCCACCGTGGACGCCGTCATCGACAGCGTGGTGGCcGACGCGCGCCGGTACGCCCGCGCCAAGAGCCGGCGGCGGCGCATCGCCCGGCGGCACCGGAGCACCCCCGCCATGCGCGCGGCGCGAGCCTTGCTGCGCAGGGCCAGGCGCACGGGACGCAGGGCCATGCTCAGGGCGGCCAGACGCGCGGCTTCAGGCGCCAGCGCCGGCAGGACCCGGAGACGCGCGGCCACGGCGGCGGCAGCGGCCATCGCCAGCATGTCCCGCCCGCGGCGAGGGAACGTGTACTGGGTGCGCGACGCCGCCACCGGTGTGCGCGTGCCCGTGCGCACCCGCCCCCCTCGCACTTGAAGATGTTCACTTCGCGATGTTGATGTGTCCCAGCGGCGAGGAGGATGTCCAAGCGCAAATTCAAGGAAGAGATGCTCCAGGTCATCGCGCCTGAGATCTACGGCCCTGCGGTGGTGAAGGAGGAAAGAAAGCCCCGCAAAATCAAGCGGGTCAAAAAGGACAAAAAGGAAGAAGAAAGTGATGTGGACGGATTGGTGGAGTTTGTGCGCGAGTTCGCCCCCCGGCGGCGCGTGCAGTGGCGCGGGCGGAAGGTGCAACCGGTGCTGAGACCCGGCACCACCGTGGTCTTCACGCCCGGCGAGCGCTCCGGCACCGCTTCCAAGCGCTCCTACGACGAGGTGTACGGGGATGATGATATTCTGGAGCAGGCGGCCGAGCGCCTGGGCGAGTTTGCTTACGGCAAGCGCAGCCGTTCCGCACCGAAGGAAGAGGCGGTGTCCATCCCGCTGGACCACGGCAACCCCACGCCGAGCCTCAAGCCCGTGACCTTGCAGCAGGTGCTGCCGACCGCGGCGCCGCGCCGGGGGTTCAAGCGCGAGGGCGAGGATCTGTACCCCACCATGCAGCTGATGGTGCCCAAGCGCCAGAAGCTGGAAGACGTGCTGGAGACCATGAAGGTGGACCCGGACGTGCAGCCCGAGGTCAAGGTGCGGCCCATCAAGCAGGTGGCCCCGGGCCTGGGCGTGCAGACCGTGGACATCAAGATTCCCACGGAGCCCATGGAAACGCAGACCGAGCCCATGATCAAGCCCAGCACCAGCACCATGGAGGTGCAGACGGATCCCTGGATGCCATCGGCTCCTAGTCGAAGACCCCGGCGCAAGTACGGCGCGGCCAGCCTGCTGATGCCCAACTACGCGCTGCATCCTTCCATCATCCCCACGCCGGGCTACCGCGGCACGCGCTTCTACCGCGGTCATACCAGCAGCCGCCGCCGCAAGACCACCACTCGCCGCCGCCGTCGCCGCACCGCCGCTGCAACCACCCCTGCCGCCCTGGTGCGGAGAGTGTACCGCCGCGGCCGCGCACCTCTGACCCTGCCGCGCGCGCGCTACCACCCGAGCATCGCCATTTAAACTTTCGCCtGCTTTGCAGATCAATGGCCCTCACATGCCGCCTTCGCGTTCCCATTACGGGCTACCGAGGAAGAAAACCGCGCCGTAGAAGGCTGGCGGGGAACGGGATGCGTCGCCACCACCACCGGCGGCGGCGCGCCATCAGCAAGCGGTTGGGGGGAGGCTTCCTGCCCGCGCTGATCCCCATCATCGCCGCGGCGATCGGGGCGATCCCCGGCATTGCTTCCGTGGCGGTGCAGGCCTCTCAGCGCCACTGAGACACACTTGGAAACATCTTGTAATAAACCaATGGACTCTGACGCTCCTGGTCCTGTGATGTGTTTTCGTAGACAGATGGAAGACATCAATTTTTCGTCCCTGGCTCCGCGACACGGCACGCGGCCGTTCATGGGCACCTGGAGCGACATCGGCACCAGCCAACTGAACGGGGGCGCCTTCAATTGGAGCAGTCTCTGGAGCGGGCTTAAGAATTTCGGGTCCACGCTTAAAACCTATGGCAGCAAGGCGTGGAACAGCACCACAGGGCAGGCGCTGAGGGATAAGCTGAAAGAGCAGAACTTCCAGCAGAAGGTGGTCGATGGGCTCGCCTCGGGCATCAACGGGGTGGTGGACCTGGCCAACCAGGCCGTGCAGCGGCAGATCAACAGCCGCCTGGACCCGGTGCCGCCCGCCGGCTCCGTGGAGATGCCGCAGGTGGAGGAGGAGCTGCCTCCCCTGGACAAGCGGGGCGAGAAGCGACCCCGCCCCGATGCGGAGGAGACGCTGCTGACGCACACGGACGAGCCGCCCCCGTACGAGGAGGCGGTGAAACTGGGTCTGCCCACCACGCGGCCCATCGCGCCCCTGGCCACCGGGGTGCTGAAACCCGAAAAGCCCGCGACCCTGGACTTGCCTCCTCCCCAGCCTTCCCGCCCCTCTACAGTGGCTAAGCCCCTGCCGCCGGTGGCCGTGGCCCGCGCGCGACCCGGGGGCACCGCCCGCCCTCATGCGAACTGGCAGAGCACTCTGAACAGCATCGTGGGTCTGGGAGTGCAGAGTGTGAAGCGCCGCCGCTGCTATTAAACCTACCGTAGCGCTTAACTTGCTTGTCTGTGTGTGTATGTATTATGTCGCCGCCGCCGCTGTCCACCAGAAGGAGGAGTGAAGAGGCGCGTCGCCGAGTTGCAAGATGGCCACCCCATCGATGCTGCCCCAGTGGGCGTACATGCACATCGCCGGACAGGACGCTTCGGAGTACCTGAGTCCGGGTCTGGTGCAGTTTGCCCGCGCCACAGACACCTACTTCAGTCTGGGGAACAAGTTTAGGAACCCCACGGTGGCGCCCACGCACGATGTGACCACCGACCGCAGCCAGCGGCTGACGCTGCGCTTCGTGCCCGTGGACCGCGAGGACAACACCTACTCGTACAAAGTGCGCTACACGCTGGCCGTGGGCGACAACCGCGTGCTGGACATGGCCAGCACCTACTTTGACATCCGCGGCGTGCTGGATCGGGGCCCTAGCTTCAAACCCTACTCCGGCACCGCCTACAACAGTCTGGCCCCCAAGGGAGCACCCAACACTTGTCAGTGGACATATAAAGCCGATGGTGAAACTGCCACAGAAAAAACCTATACATATGGAAATGCACCCGTGCAGGGCATTAACATCACAAAAGATGGTATTCAACTTGGAACTGACACCGATGATCAGCCAATCTACGCAGATAAAACCTATCAGCCTGAACCTCAAGTGGGTGATGCTGAATGGCATGACATCACTGGTACTGATGAAAAGTATGGAGGCAGAGCTCTTAAGCCTGATACCAAAATGAAGCCTTGTTATGGTTCTTTTGCCAAGCCTACTAATAAAGAAGGAGGTCAGGCAAATGTGAAAACAGGAACAGGCACTACTAAAGAATATGACATAGACATGGCTTTCTTTGACAACAGAAGTGCGGCTGCTGCTGGCCTAGCTCCAGAAATTGTTTTGTATACTGAAAATGTGGATTTGGAAACTCCAGATACCCATATTGTATACAAAGCAGGCACAGATGACAGCAGCTCTTCTATTAATTTGGGTCAGCAAGCCATGCCCAACAGACCTAACTACATTGGTTTCAGAGACAACTTTATCGGGCTCATGTACTACAACAGCACTGGCAATATGGGGGTGCTGGCCGGTCAGGCTTCTCAGCTGAATGCTGTGGTTGACTTGCAAGACAGAAACACCGAGCTGTCCTACCAGCTCTTGCTTGACTCTCTGGGTGACAGAACCCGGTATTTCAGTATGTGGAATCAGGCGGTGGACAGCTATGATCCTGATGTGCGCATTATTGAAAATCATGGTGTGGAGGATGAACTTCCCAACTATTGTTTCCCTCTGGATGCTGTTGGCAGAACAGATACTTATCAGGGAATTAAGGCTAATGGAACTGATCAAACCACATGGACCAAAGATGACAGTGTCAATGATGCTAATGAGATAGGCAAGGGTAATCCATTCGCCATGGAAATCAACATCCAAGCCAACCTGTGGAGGAACTTCCTCTACGCCAACGTGGCCCTGTACCTGCCCGACTCTTACAAGTACACGCCGGCCAATGTTACCCTGCCCACCAACACCAACACCTACGATTACATGAACGGCCGGGTGGTGGCGCCCTCGCTGGTGGACTCCTACATCAACATCGGGGCGCGCTGGTCGCTGGATCCCATGGACAACGTGAACCCCTTCAACCACCACCGCAATGCGGGGCTGCGCTACCGCTCCATGCTCCTGGGCAACGGGCGCTACGTGCCCTTCCACATCCAGGTGCCCCAGAAATTTTTCGCCATCAAGAGCCTCCTGCTCCTGCCCGGGTCCTACACCTACGAGTGGAACTTCCGCAAGGACGTCAACATGATCCTGCAGAGCTCCCTCGGCAACGACCTGCGCACGGACGGGGCCTCCATCTCCTTCACCAGCATCAACCTCTACGCCACCTTCTTCCCCATGGCGCACAACACGGCCTCCACGCTCGAGGCCATGCTGCGCAACGACACCAACGACCAGTCCTTCAACGACTACCTCTCGGCGGCCAACATGCTCTACCCCATCCCGGCCAACGCCACCAACGTGCCCATCTCCATCCCCTCGCGCAACTGGGCCGCCTTCCGCGGCTGGTCCTTCACGCGTCTCAAGACCAAGGAGACGCCCTCGCTGGGCTCCGGGTTCGACCCCTACTTCGTCTACTCGGGCTCCATCCCCTACCTCGACGGCACCTTCTACCTCAACCACACCTTCAAGAAGGTCTCCATCACCTTCGACTCCTCCGTCAGCTGGCCCGGCAACGACCGGCTCCTGACGCCCAACGAGTTCGAAATCAAGCGCACCGTCGACGGCGAGGGCTACAACGTGGCCCAGTGCAACATGACCAAGGACTGGTTCCTGGTCCAGATGCTGGCCCACTACAACATCGGCTACCAGGGCTTCTACGTGCCCGAGGGCTACAAGGACCGCATGTACTCCTTCTTCCGCAACTTCCAGCCCATGAGCCGCCAGGTGGTGGACGAGGTCAACTACAAGGACTACCAGGCCGTCACCCTGGCCTACCAGCACAACAACTCGGGCTTCGTCGGCTACCTCGCGCCCACCATGCGCCAGGGCCAGCCCTACCCCGCCAACTACCCCTACCCGCTCATCGGCAAGAGCGCCGTCACCAGCGTCACCCAGAAAAAGTTCCTCTGCGACAGGGTCATGTGGCGCATCCCCTTCTCCAGCAACTTCATGTCCATGGGCGCGCTCACCGACCTCGGCCAGAACATGCTCTATGCCAACTCCGCCCACGCGCTAGACATGAATTTCGAAGTCGACCCCATGGATGAGTCCACCCTTCTCTATGTTGTCTTCGAAGTCTTCGACGTCGTCCGAGTGCACCAGCCCCACCGCGGCGTCATCGAGGCCGTCTACCTGCGCACCCCCTTCTCGGCCGGTAACGCCACCACCTAAGCTCTTGCTTCTTGCAAGCCATGGCCGCGGGCTCCGGCGAGCAGGAGCTCAGGGCCATCATCCGCGACCTGGGCTGCGGGCCCTACTTCCTGGGCACCTTCGATAAGCGCTTCCCGGGATTCATGGCCCCGCACAAGCTGGCCTGCGCCATCGTCAACACGGCCGGCCGCGAGACCGGGGGCGAGCACTGGCTGGCCTTCGCCTGGAACCCGCGCTCGAACACCTGCTACCTCTTCGACCCCTTCGGGTTCTCGGACGAGCGCCTCAAGCAGATCTACCAGTTCGAGTACGAGGGCCTGCTGCGCCGCAGCGCCCTGGCCACCGAGGACCGCTGCGTCACCCTGGAAAAGTCCACCCAGACCGTGCAGGGTCCGCGCTCGGCCGCCTGCGGGCTCTTCTGCTGCATGTTCCTGCACGCCTTCGTGCACTGGCCCGACCGCCCCATGGACAAGAACCCCACCATGAACTTGCTGACGGGGGTGCCCAACGGCATGCTCCAGTCGCCCCAGGTGGAACCCACCCTGCGCCGCAACCAGGAGGCGCTCTACCGCTTCCTCAACTCCCACTCCGCCTACTTTCGCTCCCACCGCGCGCGCATCGAGAAGGCCACCGCCTTCGACCGCATGAATCAAGACATGTAAACCGTGTGTGTATGTTAAATGTCTTTAATAAACAGCACTTTCATGTTACACATGCATCTGAGATGATTTATTTAGAAATCGAAAGGGTTCTGCCGGGTCTCGGCATGGCCCGCGGGCAGGGACACGTTGCGGAACTGGTACTTGGCCAGCCACTTGAACTCGGGGATCAGCAGTTTGGGCAGCGGGGTGTCGGGGAAGGAGTCGGTCCACAGCTTCCGCGTCAGTTGCAGGGCGCCCAGCAGGTCGGGCGCGGAGATCTTGAAATCGCAGTTGGGACCCGCGTTCTGCGCGCGGGAGTTGCGGTACACGGGGTTGCAGCACTGGAACACCATCAGGGCCGGGTGCTTCACGCTCGCCAGCACCGTCGCGTCGGTGATGCTCTCCACGTCGAGGTCCTCGGCGTTGGCCATCCCGAAGGGGGTCATCTTGCAGGTCTGCCTTCCCATGGTGGGCACGCACCCGGGCTTGTGGTTGCAATCGCAGTGCAGGGGGATCAGCATCATCTGGGCCTGGTCGGCGTTCATCCCCGGGTACATGGCCTTCATGAAAGCCTCCAATTGCCTGAACGCCTGCTGGGCCTTGGCTCCCTCGGTGAAGAAGACCCCGCAGGACTTGCTAGAGAACTGGTTGGTGGCGCACCCGGCGTCGTGCACGCAGCAGCGCGCGTCGTTGTTGGCCAGCTGCACCACGCTGCGCCCCCAGCGGTTCTGGGTGATCTTGGCCCGGTCGGGGTTCTCCTTCAGCGCGCGCTGCCCGTTCTCGCTCGCCACATCCATCTCGATCATGTGCTCCTTCTGGATCATGGTGGTCCCGTGCAGGCACCGCAGCTTGCCCTCGGCCTCGGTGCACCCGTGCAGCCACAGCGCGCACCCGGTGCACTCCCAGTTCTTGTGGGCGATCTGGGAATGCGCGTGCACGAAGCCCTGCAGGAAGCGGCCCATCATGGTGGTCAGGGTCTTGTTGCTAGTGAAGGTCAGCGGAATGCCGCGGTGCTCCTCGTTGATGTACAGGTGGCAGATGCGGCGGTACACCTCGCCCTGCTCGGGCATCAGCTGGAAGTTGGCTTTCAGGTCGGTCTCCACGCGGTAGCGGTCCATCAGCATAGTCATGATTTCCATACCCTTCTCCCAGGCCGAGACGATGGGCAGGCTCATAGGGTTCTTCACCATCATCTTAGCGCTAGCAGCCGCGGCCAGGGGGTCGCTCTCGTCCAGGGTCTCAAAGCTCCGCTTGCCGTCCTTCTCGGTGATCCGCACCGGGGGGTAGCTGAAGCCCACGGCCGCCAGCTCCTCCTCGGCCTGTCTTTCGTCCTCGCTGTCCTGGCTGACGTCCTGCAGGACCACATGCTTGGTCTTGCGGGGTTTCTTCTTGGGCGGCAGCGGCGGCGGAGATGTTGGAGATGGCGAGGGGGAGCGCGAGTTCTCGCTCACCACTACTATCTCTTCCTCTTCTTGGTCCGAGGCCACGCGGCGGTAGGTATGTCTCTTCGGGGGCAGAGGCGGAGGCGACGGGCTCTCGCCGCCGCGACTTGGCGGATGGCTGGCAGAGCCCCTTCCGCGTTCGGGGGTGCGCTCCCGGCGGCGCTCTGACTGACTTCCTCCGCGGCCGGCCATTGTGTTCTCCTAGGGAGGAACAACAAGCATGGAGACTCAGCCATCGCCAACCTCGCCATCTGCCCCCACCGCCGACGAGAAGCAGCAGCAGCAGAATGAAAGCTTAACCGCCCCGCCGCCCAGCCCCGCCACCTCCGACGCGGCCGTCCCAGACATGCAAGAGATGGAGGAATCCATCGAGATTGACCTGGGCTATGTGACGCCCGCGGAGCACGAGGAGGAGCTGGCAGTGCGCTTTTCACAAGAAGAGATACACCAAGAACAGCCAGAGCAGGAAGCAGAGAATGAGCAGAGTCAGGCTGGGCTCGAGCATGACGGCGACTACCTCCACCTGAGCGGGGGGGAGGACGCGCTCATCAAGCATCTGGCCCGGCAGGCCACCATCGTCAAGGATGCGCTGCTCGACCGCACCGAGGTGCCCCTCAGCGTGGAGGAGCTCAGCCGCGCCTACGAGTTGAACCTCTTCTCGCCGCGCGTGCCCCCCAAGCGCCAGCCCAATGGCACCTGCGAGCCCAACCCGCGCCTCAACTTCTACCCGGTCTTCGCGGTGCCCGAGGCCCTGGCCACCTACCACATCTTTTTCAAGAACCAAAAGATCCCCGTCTCCTGCCGCGCCAACCGCACCCGCGCCGACGCCCTTTTCAACCTGGGTCCCGGCGCCCGCCTACCTGATATCGCCTCCTTGGAAGAGGTTCCCAAGATCTTCGAGGGTCTGGGCAGCGACGAGACTCGGGCCGCGAACGCTCTGCAAGGAGAAGGAGGAGAGCATGAGCACCACAGCGCCCTGGTCGAGTTGGAAGGCGACAACGCGCGGCTGGCGGTGCTCAAACGCACGGTCGAGCTGACCCATTTCGCCTACCCGGCTCTGAACCTGCCCCCCAAAGTCATGAGCGCGGTCATGGACCAGGTGCTCATCAAGCGCGCGTCGCCCATCTCCGAGGACGAGGGCATGCAAGACTCCGAGGAGGGCAAGCCCGTGGTCAGCGACGAGCAGCTGGCCCGGTGGCTGGGTCCTAATGCTAGTCCCCAGAGTTTGGAAGAGCGGCGCAAACTCATGATGGCCGTGGTCCTGGTGACCGTGGAGCTGGAGTGCCTGCGCCGCTTCTTCGCCGACGCGGAGACCCTGCGCAAGGTCGAGGAGAACCTGCACTACCTCTTCAGGCACGGGTTCGTGCGCCAGGCCTGCAAGATCTCCAACGTGGAGCTGACCAACCTGGTCTCCTACATGGGCATCTTGCACGAGAACCGCCTGGGGCAGAACGTGCTGCACACCACCCTGCGCGGGGAGGCCCGGCGCGACTACATCCGCGACTGCGTCTACCTCTACCTCTGCCACACCTGGCAGACGGGCATGGGCGTGTGGCAGCAGTGTCTGGAGGAGCAGAACCTGAAAGAGCTCTGCAAGCTCCTGCAGAAGAACCTCAAGGGTCTGTGGACCGGGTTCGACGAGCGCACCACCGCCTCGGACCTGGCCGACCTCATTTTCCCCGAGCGCCTCAGGCTGACGCTGCGCAACGGCCTGCCCGACTTTATGAGCCAAAGCATGTTGCAAAACTTTCGCTCTTTCATCCTCGAACGCTCCGGAATCCTGCCCGCCACCTGCTCCGCGCTGCCCTCGGACTTCGTGCCGCTGACCTTCCGCGAGTGCCCCCCGCCGCTGTGGAGCCACTGCTACCTGCTGCGCCTGGCCAACTACCTGGCCTACCACTCGGACGTGATCGAGGACGTCAGCGGCGAGGGCCTGCTCGAGTGCCACTGCCGCTGCAACCTCTGCACGCCGCACCGCTCCCTGGCCTGCAACCCCCAGCTGCTGAGCGAGACCCAGATCATCGGCACCTTCGAGTTGCAAGGGCCCAGCGAAGGCGAGGGTTCAGCCGCCAAGGGGGGTCTGAAACTCACCCCGGGGCTGTGGACCTCGGCCTACTTGCGCAAGTTCGTGCCCGAGGACTACCATCCCTTCGAGATCAGGTTCTACGAGGACCAATCCCATCCGCCCAAGGCCGAGCTGTCGGCCTGCGTCATCACCCAGGGGGCGATCCTGGCCCAATTGCAAGCCATCCAGAAATCCCGCCAAGAATTCTTGCTGAAAAAGGGCCGCGGGGTCTACCTCGACCCCCAGACCGGTGAGGAGCTCAACCCCGGCTTCCCCCAGGATGCCCCGAGGAAACAAGAAGCTGAAAGTGGAGCTGCCGCCCGTGGAGGATTTGGAGGAAGACTGGGAGAACAGCAGTCAGGCAGAGGAGGAGGAGATGGAGGAAGACTGGGACAGCACTCAGGCAGAGGAGGACAGCCTGCAAGACAGTCTGGAGGAAGACGAGGAGGAGGCAGAGGAGGAGGTGGAAGAAGCAGCCGCCGCCAGACCGTCGTCCTCGGCGGGGGAGAAAGCAAGCAGCACGGATACCATCTCCGCTCCGGGTCGGGGTCCCGCTCGACCACACAGTAGATGGGACGAGACCGGACGATTCCCGAACCCCACCACCCAGACCGGTAAGAAGGAGCGGCAGGGATACAAGTCCTGGCGGGGGCACAAAAACGCCATCGTCTCCTGCTTGCAGGCCTGCGGGGGCAACATCTCCTTCACCCGGCGCTACCTGCTCTTCCACCGCGGGGTGAACTTTCCCCGCAACATCTTGCATTACTACCGTCACCTCCACAGCCCCTACTACTTCCAAGAAGAGGCAGCAGCAGCAGAAAAAGACCAGCAGAAAACCAGCAGCTAGAAAATCCACAGCGGCGGCAGCAGGTGGACTGAGGATCGCGGCGAACGAGCCGGCGCAAACCCGGGAGCTGAGGAACCGGATCTTTCCCACCCTCTATGCCATCTTCCAGCAGAGTCGGGGGCAGGAGCAGGAACTGAAAGTCAAGAACCGTTCTCTGCGCTCGCTCACCCGCAGTTGTCTGTATCACAAGAGCGAAGACCAACTTCAGCGCACTCTCGAGGACGCCGAGGCTCTCTTCAACAAGTACTGCGCGCTCACTCTTAAAGAGTAGCCCGCGCCCGCCCAGTCGCAGAAAAAGGCGGGAATTACGTCACCTGTGCCCTTCGCCCTAGCCGCCTCCACCCATCATCATGAGCAAAGAGATTCCCACGCCTTACATGTGGAGCTACCAGCCCCAGATGGGCCTGGCCGCCGGTGCCGCCCAGGACTACTCCACCCGCATGAATTGGCTCAGCGCCGGGCCCGCGATGATCTCACGGGTGAATGACATCCGCGCCCACCGAAACCAGATACTCCTAGAACAGTCAGCGCTCACCGCCACGCCCCGCAATCACCTCAATCCGCGTAATTGGCCCGCCGCCCTGGTGTACCAGGAAATTCCCCAGCCCACGACCGTACTACTTCCGCGAGACGCCCAGGCCGAAGTCCAGCTGACTAACTCAGGTGTCCAGCTGGCGGGCGGCGCCACCCTGTGTCGTCACCGCCCCGCTCAGGGTATAAAGCGGCTGGTGATCCGGGGCAGAGGCACACAGCTCAACGACGAGGTGGTGAGCTCTTCGCTGGGTCTGCGACCTGACGGAGTCTTCCAACTCGCCGGATCGGGGAGATCTTCCTTCACGCCTCGTCAGGCCGTCCTGACTTTGGAGAGTTCGTCCTCGCAGCCCCGCTCGGGTGGCATCGGCACTCTCCAGTTCGTGGAGGAGTTCACTCCCTCGGTCTACTTCAACCCCTTCTCCGGCTCCCCCGGCCACTACCCGGACGAGTTCATCCCGAACTTCGACGCCATCAGCGAGTCGGTGGACGGCTACGATTGAAACTAATCACCCCCTTATCCAGTGAAATAAAGATCATATTGATGATGATTTTACAGAAATAAAAAATAATCATTTGATTTGAAATAAAGATACAATCATATTGATGATTTGAGTTTAACAAAAAAATAAAGAATCACTTACTTGAAATCTGATACCAGGTCTCTGTCCATGTTTTCTGCCAACACCACTTCACTCCCCTCTTCCCAGCTCTGGTACTGCAGGCCCCGGCGGGCTGCAAACTTCCTCCACACGCTGAAGGGGATGTCAAATTCCTCCTGTCCCTCAATCTTCATTTTATCTTCTATCAGATGTCCAAAAAGCGCGTCCGGGTGGATGATGACTTCGACCCCGTCTACCCCTACGATGCAGACAACGCACCGACCGTGCCCTTCATCAACCCCCCCTTCGTCTCTTCAGATGGATTCCAAGAGAAGCCCCTGGGGGTGTTGTCCCTGCGACTGGCCGACCCCGTCACCACCAAGAACGGGGAAATCACCCTCAAGCTGGGAGAGGGGGTGGACCTCGATTCCTCGGGAAAACTCATCTCCAACACGGCCACCAAGGCCGCCGCCCCTCTCAGTTTTTCCAACAACACCATTTCCCTTAACATGGATCACCCCTTTTACACTAAAGATGGAAAATTATCCTTACAAGTTTCTCCACCATTAAATATACTGAGAACAAGCATTCTAAACACACTAGCTTTAGGTTTTGGATCAGGTTTAGGACTCCGTGGCTCTGCCTTGGCAGTACAGTTAGTCTCTCCACTTACATTTGATACTGATGGAAACATAAAGCTTACCTTAGACAGAGGTTTGCATGTTACAACAGGAGATGCAATTGAAAGCAACATAAGCTGGGCTAAAGGTTTAAAATTTGAAGATGGAGCCATAGCAACCAACATTGGAAATGGGTTAGAGTTTGGAAGCAGTAGTACAGAAACAGGTGTTGATGATGCTTACCCAATCCAAGTTAAACTTGGATCTGGCCTTAGCTTTGACAGTACAGGAGCCATAATGGCTGGTAACAAAGAAGACGATAAACTCACTTTGTGGACAACACCTGATCCATCACCAAACTGTCAAATACTCGCAGAAAATGATGCAAAACTAACACTTTGCTTGACTAAATGTGGTAGTCAAATACTGGCCACTGTGTCAGTCTTAGTTGTAGGAAGTGGAAACCTAAACCCCATTACTGGCACCGTAAGCAGTGCTCAGGTGTTTCTACGTTTTGATGCAAACGGTGTTCTTTTAACAGAACATTCTACACTAAAAAAATACTGGGGGTATAGGCAGGGAGATAGCATAGATGGCACTCCATATACCAATGCTGTAGGATTCATGCCCAATTTAAAAGCTTATCCAAAGTCACAAAGTTCTACTACTAAAAATAATATAGTAGGGCAAGTATACATGAATGGAGATGTTTCAAAACCTATGCTTCTCACTATAACCCTCAATGGTACTGATGACAGCAACAGTACATATTCAATGTCATTTTCATACACCTGGACTAATGGAAGCTATGTTGGAGCAACATTTGGGGCTAACTCTTATACCTTCTCATACATCGCCCAAGAATGAACACTGTATCCCACCCTGCATGCCAACCCTTCCCACCCCACTCTGTGGAACAAACTCTGAAACACAAAATAAAATAAAGTTCAAGTGTTTTATTGATTCAACAGTTTTACAGGATTCGAGCAGTTATTTTTCCTCCACCCTCCCAGGACATGGAATACACCACCCTCTCCCCCCGCACAGCCTTGAACATCTGAATGCCATTGGTGATGGACATGCTTTTGGTCTCCACGTTCCACACAGTTTCAGAGCGAGCCAGTCTCGGGTCGGTCAGGGAGATGAAACCCTCCGGGCACTCCCGCATCTGCACCTCACAGCTCAACAGCTGAGGATTGTCCTCGGTGGTCGGGATCACGGTTATCTGGAAGAAGCAGAAGAGCGGCGGTGGGAATCATAGTCCGCGAACGGGATCGGCCGGTGGTGTCGCATCAGGCCCCGCAGCAGTCGCTGCCGCCGCCGCTCCGTCAAGCTGCTGCTCAGGGGGTCCGGGTCCAGGGACTCCCTCAGCATGATGCCCACGGCCCTCAGCATCAGTCGTCTGGTGCGGCGGGCGCAGCAGCGCATGCGGATCTCGCTCAGGTCGCTGCAGTACGTGCAACACAGAACCACCAGGTTGTTCAACAGTCCATAGTTCAACACGCTCCAGCCGAAACTCATCGCGGGAAGGATGCTACCCACGTGGCCGTCGTACCAGATCCTCAGGTAAATCAAGTGGTGCCCCCTCCAGAACACGCTGCCCACGTACATGATCTCCTTGGGCATGTGGCGGTTCACCACCTCCCGGTACCACATCACCCTCTGGTTGAACATGCAGCCCCGGATGATCCTGCGGAACCACAGGGCCAGCACCGCCCCGCCCGCCATGCAGCGAAGAGACCCCGGGTCCCGGCAATGGCAATGGAGGACCCACCGCTCGTACCCGTGGATCATCTGGGAGCTGAACAAGTCTATGTTGGCACAGCACAGGCATATGCTCATGCATCTCTTCAGCACTCTCAACTCCTCGGGGGTCAAAACCATATCCCAGGGCACGGGGAACTCTTGCAGGACAGCGAACCCCGCAGAACAGGGCAATCCTCGCACAGAACTTACATTGTGCATGGACAGGGTATCGCAATCAGGCAGCACCGGGTGATCCTCCACCAGAGAAGCGCGGGTCTCGGTCTCCTCACAGCGTGGTAAGGGGGCCGGCCGATACGGGTGATGGCGGGACGCGGCTGATCGTGTTCGCGACCGTGTCATGATGCAGTTGCTTTCGGACATTTTCGTACTTGCTGTAGCAGAACCTGGTCCGGGCGCTGCACACCGATCGCCGGCGGCGGTCTCGGCGCTTGGAACGCTCGGTGTTGAAATTGTAAAACAGCCACTCTCTCAGACCGTGCAGCAGATCTAGGGCCTCAGGAGTGATGAAGATCCCATCATGCCTGATGGCTCTGATCACATCGACCACCGTGGAATGGGCCAGACCCAGCCAGATGATGCAATTTTGTTGGGTTTCGGTGACGGCGAGCCTCGGGAACAACGATGAAGTAAATGCAAGCGGTGCGTTCCAGCATGGTTAGTTAGCTGATCTGTAGAAAAAACAAAAATGAACATTAAACCATGCTAGCCTGGCGAACAGGTGGGTAAATCGTTCTCTCCAGCACCAGGCAGGCCACGGGGTCTCCGGCGCGACCCTCGTAAAAATTGTCGCTATGATTGAAAACCATCACAGAGAGACGTTCCCGGTGGCCGGCGTGAATGATTCGACAAGATGAATACACCCCCGGAACATTGGCGTCCGCGAGTGAAAAAAAGCGCCCGAGGAAGCAATAAGGCACTACAATGCTCAGTCTCAAGTCCAGCAAAGCGATGCCATGCGGATGAAGCACAAAATTCTCAGGTGCGTACAAAATGTAATTACTCCCCTCCTGCACAGGCAGCAAAGCCCCCGATCCCTCCAGGTACACATACAAAGCCTCAGCGTCCATAGCTTACCGAGCAGCAGCACACAACAGGCGCAAGAGTCAGAGAAAGGCTGAGCTCTAACCTGTCCACCCGCTCTCTGCTCAATATATAGCCCAGATCTACACTGACGTAAAGGCCAAAGTCTAAAAATACCCGCCAAATAATCACACACGCCCAGCACACGCCCAGAAACCGGTGACACACTCAAAAAAATACGCGCACTTCCTCAAACGCCCAAAACTGCCGTCATTTCCGGGTTCCCACGCTACGTCATCAAAACACGACTTTCAAATTCCGTCGACCGTTAAAAACGTCACCCGCCCCGCCCCTAACGGTCGCCCGTCTCTCAGCCAATCAGCGCCCCGCATCCCCAAATTCAAACACCTCATTTGCATATTAACGCGCACAAAAAGTTTGAGGTATATTATTGATGATG
免疫監測小鼠
自免疫小鼠之新鮮收集之脾臟及淋巴結中分離淋巴細胞。根據製造商之說明，使用GentleMACS組織分離器將組織在含有10%胎牛血清與青黴素及鏈黴素之RPMI (完全RPMI)中解離。將新鮮分離之淋巴細胞以2-5x106 個細胞/mL之密度與10uM之指定肽培育2小時。兩小時後，添加布雷菲德菌素A至5ug/ml之濃度，且將細胞與刺激劑再培育4小時。刺激後，根據製造商之方案，用可固定活力染料eFluor780標記活細胞，且以1:400稀釋度用抗CD8 APC (純系53-6.7，BioLegend)染色。抗IFNg PE (純系XMG1.2，BioLegend)以1:100用於細胞內染色。在Attune NxT流式細胞儀(Thermo Scientific)上收集樣品。繪製流式細胞儀資料且使用FlowJo進行分析。為評估抗原特異性反應之程度，響應於各肽刺激劑，計算CD8+細胞之IFNg+百分比及總IFNg+細胞數/1x106 個活細胞。免疫監測 NHP
在初次接種疫苗後之指定時間，使用淋巴細胞分離培養基(LSM，MP Biomedicals)及LeucoSep分離管(Greiner Bio-One)分離PBMC，且重懸於含有10% FBS及青黴素/鏈黴素之RPMI中。使用碘化丙錠染色在Attune NxT流式細胞儀(Thermo Fisher)上對細胞進行計數，以排除死亡及凋亡之細胞。隨後將細胞調整至適當的活細胞濃度，以進行後續分析。對於研究中之各猴子，使用ELISpot或流式細胞儀方法量測T細胞反應。藉由使用離體酶聯免疫斑點(ELISpot)分析量測細胞介素(諸如IFN-γ)之誘導，自PBMC監測疫苗中編碼之6種不同恆河猴Mamu-A*01 I類抗原決定基之T細胞反應。使用猴IFNg ELISpotPLUS套組(MABTECH)根據ELISPOT統一準則{DOI: 10.1038/nprot.2015.068}進行ELISpot分析。將200,000個PBMC與10uM指定肽一起在塗有IFNg抗體之96孔盤中培育16小時。使用鹼性磷酸酶使斑點顯色。將反應定時10分鐘且藉由用自來水流過盤終止反應。使用AID vSpot讀取器譜對斑點計數。對於ELISPOT分析，將飽和度＞50%之孔記錄為「太多而無法計數」。將複製孔之偏差＞10%的樣品自分析中排除。接著，使用下式，針對孔匯合校正斑點計數：斑點計數+ 2 × (斑點計數×%匯合/[100%-%匯合])。藉由用抗原刺激之孔減去陰性肽刺激孔中之斑點計數來校正陰性背景。最後，將標記為太多而無法計數之孔設定成最高觀測校正值，四捨五入至最接近之百分數。結果
如所述，在蝕斑分離期間選擇表現模型TSNA卡匣MAG (ChAdV68.5WTnt.MAG25mer；SEQ ID NO:2)之快速生長/適合之ChAdV68病毒。在最初75個蝕斑中，如CPE (細胞致病作用)之某些跡象所表明，有33個產生病毒，且如由培育7天後之明顯蝕斑數量或蝕斑大小所表明，其中8個比其餘生長得更快。選擇快速生長之純系用於在400 mL 293F (ThermoFisher目錄號A14528)懸浮培養物中產生病毒。確定8個純系之感染單位(IU)力價。如圖25所示，所有選擇之純系均顯示IU力價等於或大於未純化之匯集病毒參考。相對於未純化之匯集病毒參考，純系1、24及60展示IU力價提高至少9倍。
藉由NGS進一步分析純系1、24及60 (3個生產力最高之純系)，且指示各純系均含有E4區中之缺失。兩個純系(純系1A及純系24)在E4orf2-E4orf4之間，特定言之在野生型ChAdV68病毒(SEQ ID NO:1)之34,916至35,642 bp之間共有相同之727 bp突變(圖26)。純系60在E4orf1-E4orf3區(34,980-36,516)中缺失，但缺失較大(1539 bp)。基於該等缺失，兩個純系集合皆共有Orf 2及3缺失(34,979-35,642)，表明Orf 2及3缺失有助於提高生產能力。
產生三個E4缺失之病毒載體，其缺失在純系1A及24中缺失之E4區部分，且與其原始非E4缺失載體進行比較。選擇之載體為1) chAd-空(「空」)，無卡匣或調控區(啟動子或poly-A)，2) ChAdV68.5WTnt.GFP (SEQ ID NO:13；「GFP」)，及3) ChAdV68.5WTnt.MAG25mer (SEQ ID NO:2；「MAG」)。其均基於序列AC_000011.1，其中E1 (nt577至3403)及E3缺失(nt 27,125-31,825) [SEQ ID NO:1]。將該等載體與吾人所鑑別之相同但在E4區(SEQ ID NO:1之34,916至35,642)中缺失；ChAdV68-空-E4缺失(SEQ ID NO: 59；「E4 δ」)、ChAdV68-GFP-E4缺失(SEQ ID NO: 58；「GFP E4 δ」)及ChAdV68-MAG-E4缺失(SEQ ID NO: 57；「MAG E4 δ」及「ChAdV68-MAG-E4」)之載體分別進行比較。製備該六種載體，且確定病毒粒子(VP)及感染單位(IU)力價。以400 mL之生產規模評價生產能力。如圖27所示，在每個比較中，E4缺失型式均展示病毒粒子力價(左圖)及感染單位力價(右圖)增加。
在E4缺失之及非缺失載體之間比較MAG卡匣之表現。如圖28所示，對感染ChAdV68.5WTnt.MAG25mer (「MAG」)及ChAdV68-MAG-E4缺失(「MAG-E4」)病毒之HEK293F細胞裂解物進行之西方墨點分析表明，E4缺失病毒與非E4缺失病毒相比表現更高水準之MAG卡匣。
隨後比較ChAdV68.5WTnt.MAG25mer (「ChAdV68-MAG」)及其E4缺失對應物ChAdV68-MAG-E4缺失(「ChAdV68-E4δ」)對小鼠實施免疫。在用AH1肽刺激後，藉由ICS分析T細胞反應之IFN-γ產生。如圖42A及表41A所示，用E4缺失載體進行之免疫在兩種測試劑量下均展現至少等效之免疫反應(左圖1x109 ，右圖1x1010 )，E4缺失載體中反應增加有積極趨勢。
表 41A - E4缺失ChAdV68之IFN-γ產生(ICS)
處理 劑量 平均IFNg+ CD8之百分比 標準差 N
ChAdV68-MAG 1.00E+10 1.040875 0.211938 8
ChAdV68-E4δ 1.00E+10 1.084125 0.213109 8
ChAdV68-MAG 1.00E+09 0.61575 0.202046 8
ChAdV68-E4δ 1.00E+09 0.800125 0.189558 8
隨後用ChAdV68.5WTnt.MAG25mer (「ChAdV68-CMV-MAG」；SEQ ID NO:2)或ChAdV68-E4d-CMT-MAG (SEQ ID NO:64)對恆河猴實施免疫，各組亦投與抗CTLA4抗體(伊匹單抗)。在用6種不同恆河猴Mamu-A*01 I類抗原決定基刺激後，藉由ELISpot分析T細胞反應之IFN-γ產生。如圖 42B 及圖 42C 所示，且在表 41B (ChAdV68-CMV-MAG)及表 41C (ChAdV68-E4d-CMT-MAG)中定量，用E4缺失載體進行免疫展現至少等效免疫反應，E4缺失載體中反應增加有積極趨勢。表 41B ：對於ChAdV68-CMV-MAG各抗原決定基之每106 個PBMC之平均斑點形成單元(SFC) ± SEM
週 抗原
Env CL9 Env TL9 Gag CM9 Gag LW9 Pol SV9 Tat TL8
1 531+/-131 950+/-215 654+/-216 14+/-6 12+/-0 1460+/-272
2 399+/-74 887+/-159 924+/-351 0+/-0 0+/-0 1986+/-434
3 312+/-101 616+/-155 675+/-212 0+/-0 0+/-0 1795+/-481
4 533+/-151 851+/-129 1011+/-207 10+/-7 73+/-12 2290+/-729
表 41C ：對於ChAdV68-E4d-CMT-MAG各抗原決定基之每106 個PBMC之平均斑點形成單元(SFC) ± SEM
週 抗原
Env CL9 Env TL9 Gag CM9 Gag LW9 Pol SV9 Tat TL8
1 1037+/-285 966+/-287 1341+/-470 20+/-13 10+/-9 2777+/-1180
2 707+/-376 905+/-343 1217+/-543 0+/-0 0+/-0 1805+/-681
3 612+/-302 1038+/-361 1040+/-474 0+/-0 0+/-0 1906+/-462
4 1237+/-722 1282+/-665 1487+/-760 3+/-2 183+/-122 2084+/-943
XXI. TETr 調控卡匣表現系統之構築
建立TETr調控病毒表現系統，以在病毒產生過程中最小化卡匣中編碼之核酸，諸如疫苗中編碼卡匣之抗原的轉錄。圖43說明使用抗原編碼疫苗之實例的四環素控制之病毒產生系統之一個實例的總體策略，亦即： - 表現TET阻遏蛋白(TETr)之293F細胞藉由與最小CMV啟動子上游之TET操縱子序列結合來抑制疫苗卡匣之表現 - 卡匣序列之轉錄促進腺病毒產生而不影響卡匣表現 - 一旦活體內投藥，即不存在阻遏物，且卡匣之轉錄可不受阻礙地進行
圖44A呈現展示關於待表現之啟動子及卡匣之TET反應區(稱為「TETo」反應區)的一個實例之排列的示意圖。TET反應區由在各TETo之間用間隔子(aaagtgaaagtcgagtttaccac；SEQ ID NO:70)連接之19 bp TET操縱子(TETo)序列(tccctatcagtgatagaga；SEQ ID NO:60)的七個重複序列組成。TET反應區位於最小CMV啟動子(67 bp；參見SEQ ID NO: 61)及卡匣位置起點之上游(5')。TETo反應區及啟動子序列之排列以SEQ ID NO:61顯示及描述。
圖44B呈現展示關於有待表現之啟動子及卡匣之TET反應區(稱為「CMT」反應區)的另一實例之排列的示意圖。TET反應區包括用兩個核苷酸間隔子連接在一起的19 bp TET操縱子(TETo)序列(tccctatcagtgatagaga；SEQ ID NO: 60)之兩個重複序列。TET反應區位於全長CMV啟動子(605 bp；參見SEQ ID NO: 64)之下游(3')且位於卡匣位置起點之上游(5')。CMT反應區及啟動子序列之排列以SEQ ID NO:64顯示及描述。
將TETo反應區插入ChAdV68.5WTnt.GFP (SEQ ID NO: 13)之I-SceI與AsisI位點之間，以產生ChAdV68-TETo-GFP。將TETr序列(tTS；SEQ ID NO: 62)選殖至慢病毒pLX載體中以產生pLXCMV-tTS-iPuro，且用於轉導293F細胞。下面呈現用於構築系統之序列。在嘌呤黴素選擇後產生純系293F TETr株。評價GFP轉殖基因表現以藉由TETr株活體外評價表現調控。如圖45A所示，在感染ChAdV68-TETo-GFP病毒後，相對於親本293F細胞株(左圖)，表現TETr之293F細胞(純系17，右圖)中之GFP顯著降低。
使用插入在ChAdV68-空-E4缺失(SEQ ID NO:59)之I-SceI與AsisI位點之間之CMT反應區，且用插入SEAP代替缺失之E1 (ChAdV68-E4d-CMT-SEAP」)，生成分泌之胚胎鹼性磷酸酶SEAP報導基因構築體。293F細胞以0.3之MOI感染，且在24小時後收集培養基用於SEAP分析(Phospha-LightTM System (Applied Biosystems)，該SEAP分析使用化學發光受質偵測分泌之鹼性磷酸酶，隨後根據製造商之說明進行操作。如圖45B所示，在感染ChAdV68-E4d-CMT-SEAP病毒後，在表現TETr之293F細胞(「tTS純系17」)中，SEAP分泌減少120倍至背景水準，其中使用表現對照表現卡匣之ChAdV68載體相對於親本293F細胞株(「293F」)設置背景。因此，當在活體外表現TETr之細胞株中使用時，由TETr控制之啟動子表現之腺病毒卡匣展現降低之卡匣表現。
ChAdV68載體主鏈之I-SceI與AsisI位點之間的TETo反應區。(SEQ ID NO:61) 19bp TETo序列之七個重複序列之一為粗斜體。最小CMV啟動子為粗體且額外天然CMV啟動子序列為斜體。
ccatgttgacattgattattgactagttattaaagtact tccctatcagtgatagaga aaagtgaaagtcgagtttaccactccctatcagtgatagagaaaagtgaaagtcgagtttaccactccctatcagtgatagagaaaagtgaaagtcgagtttaccactccctatcagtgatagagaaaagtgaaagtcgagtttaccactccctatcagtgatagagaaaagtgaaagtcgagtttaccactccctatcagtgatagagaaaagtgaaagtcgagtttaccactccctatcagtgatagagaaaagtgaaagtcgagctcggtacccgggtcgaggtaggcgtgtacggtgggaggcctatataagcagagctcgtttagtgaaccgtcagatcgcctggag
TETr序列(tTS)核酸序列(SEQ ID NO:62)
ATGAGCAGACTGGACAAGAGCAAAGTGATCAACAGCGCCCTGGAACTGCTGAACGAAGTGGGCATCGAGGGCCTGACAACCAGAAAGCTGGCCCAGAAGCTGGGCGTTGAGCAGCCTACACTGTATTGGCACGTGCGGAACAAGCAGACCCTGATGAATATGCTGAGCGAGGCCATCCTGGCCAAGCACCATACAAGATCTGCCCCTCTGCCAACCGAGAGCTGGCAGCAGTTTCTGCAAGAGAACGCCCTGAGCTTCAGAAAGGCCCTGCTGGTGCATAGAGATGGCGCCAGACTGCACATCGGCACATCTCCCACACCTCCACAGTTTGAGCAGGCTGAGGCACAGCTGAGATGTCTGTGTGATGCCGGCTTTAGCGTGGAAGAGGCCCTGTTCATCCTGCAGTCCATCAGCCACTTTACACTGGGCGCCGTGCTGGAAGAACAGGCCACCAACCAGATCGAGAACAACCACGTGATCGACGCTGCCCCTCCACTGCTGCAAGAGGCCTTCAATATCCAAGCCAGAACCAGCGCCGAGATGGCCTTCCACTTTGGCCTGAAGTCCCTGATCTTTGGCTTCAGCGCCCAGCTGGACGAGAAGAAGCACACACCTATCGAGGACGGCAACAAGCCCAAGAAGAAGCGGAAGCTGGCCGTCAGCGTGACCTTTGAAGATGTGGCCGTGCTGTTCACCCGGGACGAGTGGAAGAAACTGGACCTGAGCCAGCGGAGCCTGTACCGGGAAGTGATGCTGGAAAACTACAGCAACCTGGCCTCCATGGCCGGCTTTCTGTTCACCAAGCCTAAAGTGATCTCCCTGCTTCAGCAGGGCGAAGATCCTTGGTAA
TETr序列(tTS)胺基酸序列(SEQ ID NO:63)
MSRLDKSKVINSALELLNEVGIEGLTTRKLAQKLGVEQPTLYWHVRNKQTLMNMLSEAILAKHHTRSAPLPTESWQQFLQENALSFRKALLVHRDGARLHIGTSPTPPQFEQAEAQLRCLCDAGFSVEEALFILQSISHFTLGAVLEEQATNQIENNHVIDAAPPLLQEAFNIQARTSAEMAFHFGLKSLIFGFSAQLDEKKHTPIEDGNKPKKKRKLAVSVTFEDVAVLFTRDEWKKLDLSQRSLYREVMLENYSNLASMAGFLFTKPKVISLLQQGEDPW
ChAdV68載體主鏈之I-SceI與AsisI位點之間的CMT反應區。(SEQ ID NO:64) 19bp TETo序列之兩個重複序列為粗體。全長CMV啟動子為斜體。
GACATTGATTATTGACTAGTTGTTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTCCGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTACGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACACCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAATAACCCCGCCCCGTTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCT CTCCCTATCAGTGATAGAGA TCTCCCTATCAGTGATAGAGA TC
XXII.    TETr 調控之卡匣表現系統中之病毒產生
將TETo反應區插入ChAdV68.5WTnt.MAG25mer (「ChAdV68-CMV-MAG」；SEQ ID NO:2)之I-SceI與AsisI位點之間，以產生在TET調控啟動子之控制下表現模型抗原卡匣之ChAdV68-TETo-MAG病毒(SEQ ID NO:65)。比較表現TETr之細胞株(純系17)與不表現TETr之親本細胞株(293F)之間的病毒產生。如圖46所示，如藉由三個獨立重複樣本中之病毒粒子(VP；上圖)及感染單位(IU；下圖)力價所評估，病毒產量得以提高。
亦將在表現TETr之細胞株(純系17)中產生之ChAdV68-TETo-MAG病毒的病毒產生與缺乏TETo序列之病毒(「ChAdV68-CMV-MAG」)進行比較。如圖47A所示，相對於ChAdV68-CMV-MAG，ChAdV68-TETo-MAG病毒之病毒產量為3.4倍。該等結果表明遞送之卡匣轉殖基因之活體外表現降低，轉化為更一致且提高之病毒生產能力。
對於一系列病毒構築體，包括以E4缺失及TET反應元件為特徵之構築體，進一步比較表現TETr之細胞株(tTS純系17)中產生之病毒產生。該等構築體均表現相同之對照腫瘤特異性新抗原(TSNA)卡匣。如所示，以E1/E3缺失及5個核苷酸取代為特徵之一般主鏈與ChAdV68.5WTnt.MAG25mer (SEQ ID NO:2)相同，其中在I-SceI與AsisI位點之間插入TETo及CMT反應區，且用MAG25mer卡匣代替TSNA卡匣。缺失之E4區為上文鑑別者(SEQ ID NO:1之34,916至35,642缺失)。所研究之各種構築體描述如下： - ChAdV68-CMV-TSNA；E1/E3缺失，全長CMV啟動子 - ChAdV68-CT-TSNA；E1/E3缺失，全長CMV啟動子，使用替代密碼子優化進行密碼子優化的TSNA卡匣(SEQ ID NO:66) - ChAdV68-TETo-TSNA；E1/E3缺失，用最小CMV啟動子上游(5')之間隔子連接的TETo之7個重複序列(「TETo」反應區) (SEQ ID NO:67) - ChAdV68-CMT-TSNA；E1/E3缺失，全長CMV啟動子下游(3')之直接連接在一起的TETo之2個重複序列(「CMT」反應區) (SEQ ID NO:68) - ChAdV68-E4d-CMT-TSNA；E1/E3/E4缺失，全長CMV啟動子下游(3')之直接連接在一起的TETo之2個重複序列(SEQ ID NO:69)
如圖47B所示，ChAdV68-CT-TSNA、ChAdV68-TETo-TSNA、ChAdV68-CMT-TSNA及ChAdV68-E4d-CMT-TSNA病毒之病毒產量相對於ChAdV68-CMV-TSNA分別提高約6倍、39倍、137倍或300倍。亦評估病毒粒子與感染單位之比率，以量測病毒之感染能力，且藉由將病毒粒子(VP)力價/mL除以感染單位(IU)力價/mL來計算，其中較低比率表示每個粒子之較高感染性(比率為1:1代表每個粒子具感染性之理想比率)。如表42A所示，相對於ChAdV68-CMV-TSNA，TET控制之載體ChAdV68-TETo-TSNA、ChAdV68-CMT-TSNA及ChAdV68-E4d-CMT-TSNA均表現出提高之感染能力，其中CMT載體展現最佳感染能力。
對於以大型模型抗原卡匣(50XXL；參見圖29及表32-34)或M2.2模型抗原卡匣為特徵之構築體，評估另一系列病毒構築體(包括以E4缺失及TET反應元件為特徵之構築體)的病毒產生。如所示，以E1/E3缺失及5個核苷酸取代為特徵之一般主鏈與ChAdV68.5WTnt.MAG25mer (SEQ ID NO:2)相同，其中在I-SceI與AsisI位點之間插入TETo及CMT反應區，且用MAG25mer卡匣代替指定卡匣。缺失之E4區為上文鑑別者(SEQ ID NO:1之34,916至35,642缺失)。所研究之各種構築體描述如下： - ChAdV68-CMV-50 XXL；E1/E3缺失，全長CMV啟動子，使用Genscrip密碼子優化工具對50XXL卡匣進行密碼子優化 - ChAdV68-CMT-50XXL；E1/E3缺失，全長CMV啟動子下游(3')之直接連接在一起的TETo之2個重複序列，使用Genscrip密碼子優化工具對50XXL卡匣進行密碼子優化 - ChAdV68- CT-50XXL；E1/E3缺失，全長CMV啟動子，使用替代密碼子優化工具對50XXL卡匣進行密碼子優化 - ChAdV68-E4d-CMT-50XXL；E1/E3/E4缺失，全長CMV啟動子下游(3')之直接連接在一起的TETo之2個重複序列；使用Genscrip密碼子優化工具對50XXL卡匣進行密碼子優化 - ChAdV68-CMV-M2.2；E1/E3缺失，全長CMV啟動子，使用Genscrip密碼子優化工具對M2.2卡匣進行密碼子優化 - ChAdV68-CMT-M2.2；E1/E3缺失，全長CMV啟動子下游(3')之直接連接在一起的TETo之2個重複序列，使用Genscrip密碼子優化工具對M2.2卡匣進行密碼子優化 - ChAdV68-E4d-CMT-M2.2；E1/E3/E4缺失，全長CMV啟動子下游(3')之直接連接在一起的TETo之2個重複序列，使用Genscrip密碼子優化工具對M2.2卡匣進行密碼子優化
如圖47C所示，藉由在表現tTS之細胞株中使用具有CMT反應區之腺病毒載體，可提高模型抗原卡匣50XXL及M2.2之病毒產生。舉例而言，相對於親本293F細胞株(左圖；左起第二欄)，在表現tTS之細胞株(左圖；中欄)中，ChAdV68-CMT-50XXL之病毒產量幾乎為10倍，且相對於親本293F細胞株中缺少CMT反應區之載體(右圖；左欄)，ChAdV68-CMT-M2.2為15倍(右圖；中欄)。在50XXL構築體之情況下，藉由將CMT反應區與E4缺失(左圖中欄與左圖右欄)組合，可進一步提高病毒產量。在某些情況下，亦藉由替代密碼子優化達成改進(如關於ChAdV68-CT-50XXL所示)。亦評估病毒粒子與感染單位之比率。如表42C所示，相對於不具有E4缺失及TET反應元件之載體，在E4缺失背景中TET控制之載體均展現提高之感染能力。表 42A – 病毒粒子 / 感染單位比率， TSNA 構築體
構築體 VP:IU 比率
ChAdV68-CMV-TSNA 591:1
ChAdV68-CT-TSNA 63:1
ChAdV68-TETo-TSNA 135:1
ChAdV68-CMT-TSNA 22:1
ChAdV68-E4d-CMT-TSNA 34:1
表 42B – 病毒粒子 / 感染單位比率， 50XXL 構築體
構築體 VP:IU 比率
ChAdV68-CMV-50XXL 260:1
ChAdV68-E4d-CMT-50XXL 32:1
ChAdV68-CMV-M2.2 662:1
ChAdV68-E4d-CMT-M2.2 50:1
ChAdV68-TETo-MAG (SEQ ID NO:65)
CATCATCAATAATATACCTCAAACTTTTTGTGCGCGTTAATATGCAAATGAGGCGTTTGAATTTGGGGAGGAAGGGCGGTGATTGGTCGAGGGATGAGCGACCGTTAGGGGCGGGGCGAGTGACGTTTTGATGACGTGGTTGCGAGGAGGAGCCAGTTTGCAAGTTCTCGTGGGAAAAGTGACGTCAAACGAGGTGTGGTTTGAACACGGAAATACTCAATTTTCCCGCGCTCTCTGACAGGAAATGAGGTGTTTCTGGGCGGATGCAAGTGAAAACGGGCCATTTTCGCGCGAAAACTGAATGAGGAAGTGAAAATCTGAGTAATTTCGCGTTTATGGCAGGGAGGAGTATTTGCCGAGGGCCGAGTAGACTTTGACCGATTACGTGGGGGTTTCGATTACCGTGTTTTTCACCTAAATTTCCGCGTACGGTGTCAAAGTCCGGTGTTTTTACGTAGGTGTCAGCTGATCGCCAGGGTATTTAAACCTGCGCTCTCCAGTCAAGAGGCCACTCTTGAGTGCCAGCGAGAAGAGTTTTCTCCTCCGCGCCGCGAGTCAGATCTACACTTTGAAAGTAGGGATAACAGGGTAATCCATGTTGACATTGATTATTGACTAGTTATTAAAGTACTTCCCTATCAGTGATAGAGAAAAGTGAAAGTCGAGTTTACCACTCCCTATCAGTGATAGAGAAAAGTGAAAGTCGAGTTTACCACTCCCTATCAGTGATAGAGAAAAGTGAAAGTCGAGTTTACCACTCCCTATCAGTGATAGAGAAAAGTGAAAGTCGAGTTTACCACTCCCTATCAGTGATAGAGAAAAGTGAAAGTCGAGTTTACCACTCCCTATCAGTGATAGAGAAAAGTGAAAGTCGAGTTTACCACTCCCTATCAGTGATAGAGAAAAGTGAAAGTCGAGCTCGGTACCCGGGTCGAGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGCCTATATAAGCAGAGCTCGTTTAGTGAACCGTCAGATCGCCTGGAGACGCCATCCACGCTGTTTTGACCTCCATAGAAGACAGCGATCGCGCCACCATGGCCGGGATGTTCCAGGCACTGTCCGAAGGCTGCACACCCTATGATATTAACCAGATGCTGAATGTCCTGGGAGACCACCAGGTCTCTGGCCTGGAGCAGCTGGAGAGCATCATCAACTTCGAGAAGCTGACCGAGTGGACAAGCTCCAATGTGATGCCTATCCTGTCCCCACTGACCAAGGGCATCCTGGGCTTCGTGTTTACCCTGACAGTGCCTTCTGAGCGGGGCCTGTCTTGCATCAGCGAGGCAGACGCAACCACACCAGAGTCCGCCAATCTGGGCGAGGAGATCCTGTCTCAGCTGTACCTGTGGCCCCGGGTGACATATCACTCCCCTTCTTACGCCTATCACCAGTTCGAGCGGAGAGCCAAGTACAAGAGACACTTCCCAGGCTTTGGCCAGTCTCTGCTGTTCGGCTACCCCGTGTACGTGTTCGGCGATTGCGTGCAGGGCGACTGGGATGCCATCCGGTTTAGATACTGCGCACCACCTGGATATGCACTGCTGAGGTGTAACGACACCAATTATTCCGCCCTGCTGGCAGTGGGCGCCCTGGAGGGCCCTCGCAATCAGGATTGGCTGGGCGTGCCAAGGCAGCTGGTGACACGCATGCAGGCCATCCAGAACGCAGGCCTGTGCACCCTGGTGGCAATGCTGGAGGAGACAATCTTCTGGCTGCAGGCCTTTCTGATGGCCCTGACCGACAGCGGCCCCAAGACAAACATCATCGTGGATTCCCAGTACGTGATGGGCATCTCCAAGCCTTCTTTCCAGGAGTTTGTGGACTGGGAGAACGTGAGCCCAGAGCTGAATTCCACCGATCAGCCATTCTGGCAGGCAGGAATCCTGGCAAGGAACCTGGTGCCTATGGTGGCCACAGTGCAGGGCCAGAATCTGAAGTACCAGGGCCAGAGCCTGGTCATCAGCGCCTCCATCATCGTGTTTAACCTGCTGGAGCTGGAGGGCGACTATCGGGACGATGGCAACGTGTGGGTGCACACCCCACTGAGCCCCAGAACACTGAACGCCTGGGTGAAGGCCGTGGAGGAGAAGAAGGGCATCCCAGTGCACCTGGAGCTGGCCTCCATGACCAATATGGAGCTGATGTCTAGCATCGTGCACCAGCAGGTGAGGACATACGGACCCGTGTTCATGTGCCTGGGAGGCCTGCTGACCATGGTGGCAGGAGCCGTGTGGCTGACAGTGCGGGTGCTGGAGCTGTTCAGAGCCGCCCAGCTGGCCAACGATGTGGTGCTGCAGATCATGGAGCTGTGCGGAGCAGCCTTTCGCCAGGTGTGCCACACCACAGTGCCATGGCCCAATGCCTCCCTGACCCCCAAGTGGAACAATGAGACAACACAGCCTCAGATCGCCAACTGTAGCGTGTACGACTTCTTCGTGTGGCTGCACTACTATAGCGTGAGGGATACCCTGTGGCCCCGCGTGACATACCACATGAATAAGTACGCCTATCACATGCTGGAGAGGCGCGCCAAGTATAAGAGAGGCCCTGGCCCAGGCGCAAAGTTTGTGGCAGCATGGACCCTGAAGGCCGCCGCCGGCCCCGGCCCCGGCCAGTATATCAAGGCTAACAGTAAGTTCATTGGAATCACAGAGCTGGGACCCGGACCTGGATAATGAGTTTAAACTCCCATTTAAATGTGAGGGTTAATGCTTCGAGCAGACATGATAAGATACATTGATGAGTTTGGACAAACCACAACTAGAATGCAGTGAAAAAAATGCTTTATTTGTGAAATTTGTGATGCTATTGCTTTATTTGTAACCATTATAAGCTGCAATAAACAAGTTAACAACAACAATTGCATTCATTTTATGTTTCAGGTTCAGGGGGAGATGTGGGAGGTTTTTTAAAGCAAGTAAAACCTCTACAAATGTGGTAAAATAACTATAACGGTCCTAAGGTAGCGAGTGAGTAGTGTTCTGGGGCGGGGGAGGACCTGCATGAGGGCCAGAATAACTGAAATCTGTGCTTTTCTGTGTGTTGCAGCAGCATGAGCGGAAGCGGCTCCTTTGAGGGAGGGGTATTCAGCCCTTATCTGACGGGGCGTCTCCCCTCCTGGGCGGGAGTGCGTCAGAATGTGATGGGATCCACGGTGGACGGCCGGCCCGTGCAGCCCGCGAACTCTTCAACCCTGACCTATGCAACCCTGAGCTCTTCGTCGTTGGACGCAGCTGCCGCCGCAGCTGCTGCATCTGCCGCCAGCGCCGTGCGCGGAATGGCCATGGGCGCCGGCTACTACGGCACTCTGGTGGCCAACTCGAGTTCCACCAATAATCCCGCCAGCCTGAACGAGGAGAAGCTGTTGCTGCTGATGGCCCAGCTCGAGGCCTTGACCCAGCGCCTGGGCGAGCTGACCCAGCAGGTGGCTCAGCTGCAGGAGCAGACGCGGGCCGCGGTTGCCACGGTGAAATCCAAATAAAAAATGAATCAATAAATAAACGGAGACGGTTGTTGATTTTAACACAGAGTCTGAATCTTTATTTGATTTTTCGCGCGCGGTAGGCCCTGGACCACCGGTCTCGATCATTGAGCACCCGGTGGATCTTTTCCAGGACCCGGTAGAGGTGGGCTTGGATGTTGAGGTACATGGGCATGAGCCCGTCCCGGGGGTGGAGGTAGCTCCATTGCAGGGCCTCGTGCTCGGGGGTGGTGTTGTAAATCACCCAGTCATAGCAGGGGCGCAGGGCATGGTGTTGCACAATATCTTTGAGGAGGAGACTGATGGCCACGGGCAGCCCTTTGGTGTAGGTGTTTACAAATCTGTTGAGCTGGGAGGGATGCATGCGGGGGGAGATGAGGTGCATCTTGGCCTGGATCTTGAGATTGGCGATGTTACCGCCCAGATCCCGCCTGGGGTTCATGTTGTGCAGGACCACCAGCACGGTGTATCCGGTGCACTTGGGGAATTTATCATGCAACTTGGAAGGGAAGGCGTGAAAGAATTTGGCGACGCCTTTGTGCCCGCCCAGGTTTTCCATGCACTCATCCATGATGATGGCGATGGGCCCGTGGGCGGCGGCCTGGGCAAAGACGTTTCGGGGGTCGGACACATCATAGTTGTGGTCCTGGGTGAGGTCATCATAGGCCATTTTAATGAATTTGGGGCGGAGGGTGCCGGACTGGGGGACAAAGGTACCCTCGATCCCGGGGGCGTAGTTCCCCTCACAGATCTGCATCTCCCAGGCTTTGAGCTCGGAGGGGGGGATCATGTCCACCTGCGGGGCGATAAAGAACACGGTTTCCGGGGCGGGGGAGATGAGCTGGGCCGAAAGCAAGTTCCGGAGCAGCTGGGACTTGCCGCAGCCGGTGGGGCCGTAGATGACCCCGATGACCGGCTGCAGGTGGTAGTTGAGGGAGAGACAGCTGCCGTCCTCCCGGAGGAGGGGGGCCACCTCGTTCATCATCTCGCGCACGTGCATGTTCTCGCGCACCAGTTCCGCCAGGAGGCGCTCTCCCCCCAGGGATAGGAGCTCCTGGAGCGAGGCGAAGTTTTTCAGCGGCTTGAGTCCGTCGGCCATGGGCATTTTGGAGAGGGTTTGTTGCAAGAGTTCCAGGCGGTCCCAGAGCTCGGTGATGTGCTCTACGGCATCTCGATCCAGCAGACCTCCTCGTTTCGCGGGTTGGGACGGCTGCGGGAGTAGGGCACCAGACGATGGGCGTCCAGCGCAGCCAGGGTCCGGTCCTTCCAGGGTCGCAGCGTCCGCGTCAGGGTGGTCTCCGTCACGGTGAAGGGGTGCGCGCCGGGCTGGGCGCTTGCGAGGGTGCGCTTCAGGCTCATCCGGCTGGTCGAAAACCGCTCCCGATCGGCGCCCTGCGCGTCGGCCAGGTAGCAATTGACCATGAGTTCGTAGTTGAGCGCCTCGGCCGCGTGGCCTTTGGCGCGGAGCTTACCTTTGGAAGTCTGCCCGCAGGCGGGACAGAGGAGGGACTTGAGGGCGTAGAGCTTGGGGGCGAGGAAGACGGACTCGGGGGCGTAGGCGTCCGCGCCGCAGTGGGCGCAGACGGTCTCGCACTCCACGAGCCAGGTGAGGTCGGGCTGGTCGGGGTCAAAAACCAGTTTCCCGCCGTTCTTTTTGATGCGTTTCTTACCTTTGGTCTCCATGAGCTCGTGTCCCCGCTGGGTGACAAAGAGGCTGTCCGTGTCCCCGTAGACCGACTTTATGGGCCGGTCCTCGAGCGGTGTGCCGCGGTCCTCCTCGTAGAGGAACCCCGCCCACTCCGAGACGAAAGCCCGGGTCCAGGCCAGCACGAAGGAGGCCACGTGGGACGGGTAGCGGTCGTTGTCCACCAGCGGGTCCACCTTTTCCAGGGTATGCAAACACATGTCCCCCTCGTCCACATCCAGGAAGGTGATTGGCTTGTAAGTGTAGGCCACGTGACCGGGGGTCCCGGCCGGGGGGGTATAAAAGGGTGCGGGTCCCTGCTCGTCCTCACTGTCTTCCGGATCGCTGTCCAGGAGCGCCAGCTGTTGGGGTAGGTATTCCCTCTCGAAGGCGGGCATGACCTCGGCACTCAGGTTGTCAGTTTCTAGAAACGAGGAGGATTTGATATTGACGGTGCCGGCGGAGATGCCTTTCAAGAGCCCCTCGTCCATCTGGTCAGAAAAGACGATCTTTTTGTTGTCGAGCTTGGTGGCGAAGGAGCCGTAGAGGGCGTTGGAGAGGAGCTTGGCGATGGAGCGCATGGTCTGGTTTTTTTCCTTGTCGGCGCGCTCCTTGGCGGCGATGTTGAGCTGCACGTACTCGCGCGCCACGCACTTCCATTCGGGGAAGACGGTGGTCAGCTCGTCGGGCACGATTCTGACCTGCCAGCCCCGATTATGCAGGGTGATGAGGTCCACACTGGTGGCCACCTCGCCGCGCAGGGGCTCATTAGTCCAGCAGAGGCGTCCGCCCTTGCGCGAGCAGAAGGGGGGCAGGGGGTCCAGCATGACCTCGTCGGGGGGGTCGGCATCGATGGTGAAGATGCCGGGCAGGAGGTCGGGGTCAAAGTAGCTGATGGAAGTGGCCAGATCGTCCAGGGCAGCTTGCCATTCGCGCACGGCCAGCGCGCGCTCGTAGGGACTGAGGGGCGTGCCCCAGGGCATGGGATGGGTAAGCGCGGAGGCGTACATGCCGCAGATGTCGTAGACGTAGAGGGGCTCCTCGAGGATGCCGATGTAGGTGGGGTAGCAGCGCCCCCCGCGGATGCTGGCGCGCACGTAGTCATACAGCTCGTGCGAGGGGGCGAGGAGCCCCGGGCCCAGGTTGGTGCGACTGGGCTTTTCGGCGCGGTAGACGATCTGGCGGAAAATGGCATGCGAGTTGGAGGAGATGGTGGGCCTTTGGAAGATGTTGAAGTGGGCGTGGGGCAGTCCGACCGAGTCGCGGATGAAGTGGGCGTAGGAGTCTTGCAGCTTGGCGACGAGCTCGGCGGTGACTAGGACGTCCAGAGCGCAGTAGTCGAGGGTCTCCTGGATGATGTCATACTTGAGCTGTCCCTTTTGTTTCCACAGCTCGCGGTTGAGAAGGAACTCTTCGCGGTCCTTCCAGTACTCTTCGAGGGGGAACCCGTCCTGATCTGCACGGTAAGAGCCTAGCATGTAGAACTGGTTGACGGCCTTGTAGGCGCAGCAGCCCTTCTCCACGGGGAGGGCGTAGGCCTGGGCGGCCTTGCGCAGGGAGGTGTGCGTGAGGGCGAAAGTGTCCCTGACCATGACCTTGAGGAACTGGTGCTTGAAGTCGATATCGTCGCAGCCCCCCTGCTCCCAGAGCTGGAAGTCCGTGCGCTTCTTGTAGGCGGGGTTGGGCAAAGCGAAAGTAACATCGTTGAAGAGGATCTTGCCCGCGCGGGGCATAAAGTTGCGAGTGATGCGGAAAGGTTGGGGCACCTCGGCCCGGTTGTTGATGACCTGGGCGGCGAGCACGATCTCGTCGAAGCCGTTGATGTTGTGGCCCACGATGTAGAGTTCCACGAATCGCGGACGGCCCTTGACGTGGGGCAGTTTCTTGAGCTCCTCGTAGGTGAGCTCGTCGGGGTCGCTGAGCCCGTGCTGCTCGAGCGCCCAGTCGGCGAGATGGGGGTTGGCGCGGAGGAAGGAAGTCCAGAGATCCACGGCCAGGGCGGTTTGCAGACGGTCCCGGTACTGACGGAACTGCTGCCCGACGGCCATTTTTTCGGGGGTGACGCAGTAGAAGGTGCGGGGGTCCCCGTGCCAGCGATCCCATTTGAGCTGGAGGGCGAGATCGAGGGCGAGCTCGACGAGCCGGTCGTCCCCGGAGAGTTTCATGACCAGCATGAAGGGGACGAGCTGCTTGCCGAAGGACCCCATCCAGGTGTAGGTTTCCACATCGTAGGTGAGGAAGAGCCTTTCGGTGCGAGGATGCGAGCCGATGGGGAAGAACTGGATCTCCTGCCACCAATTGGAGGAATGGCTGTTGATGTGATGGAAGTAGAAATGCCGACGGCGCGCCGAACACTCGTGCTTGTGTTTATACAAGCGGCCACAGTGCTCGCAACGCTGCACGGGATGCACGTGCTGCACGAGCTGTACCTGAGTTCCTTTGACGAGGAATTTCAGTGGGAAGTGGAGTCGTGGCGCCTGCATCTCGTGCTGTACTACGTCGTGGTGGTCGGCCTGGCCCTCTTCTGCCTCGATGGTGGTCATGCTGACGAGCCCGCGCGGGAGGCAGGTCCAGACCTCGGCGCGAGCGGGTCGGAGAGCGAGGACGAGGGCGCGCAGGCCGGAGCTGTCCAGGGTCCTGAGACGCTGCGGAGTCAGGTCAGTGGGCAGCGGCGGCGCGCGGTTGACTTGCAGGAGTTTTTCCAGGGCGCGCGGGAGGTCCAGATGGTACTTGATCTCCACCGCGCCATTGGTGGCGACGTCGATGGCTTGCAGGGTCCCGTGCCCCTGGGGTGTGACCACCGTCCCCCGTTTCTTCTTGGGCGGCTGGGGCGACGGGGGCGGTGCCTCTTCCATGGTTAGAAGCGGCGGCGAGGACGCGCGCCGGGCGGCAGGGGCGGCTCGGGGCCCGGAGGCAGGGGCGGCAGGGGCACGTCGGCGCCGCGCGCGGGTAGGTTCTGGTACTGCGCCCGGAGAAGACTGGCGTGAGCGACGACGCGACGGTTGACGTCCTGGATCTGACGCCTCTGGGTGAAGGCCACGGGACCCGTGAGTTTGAACCTGAAAGAGAGTTCGACAGAATCAATCTCGGTATCGTTGACGGCGGCCTGCCGCAGGATCTCTTGCACGTCGCCCGAGTTGTCCTGGTAGGCGATCTCGGTCATGAACTGCTCGATCTCCTCCTCTTGAAGGTCTCCGCGGCCGGCGCGCTCCACGGTGGCCGCGAGGTCGTTGGAGATGCGGCCCATGAGCTGCGAGAAGGCGTTCATGCCCGCCTCGTTCCAGACGCGGCTGTAGACCACGACGCCCTCGGGATCGCGGGCGCGCATGACCACCTGGGCGAGGTTGAGCTCCACGTGGCGCGTGAAGACCGCGTAGTTGCAGAGGCGCTGGTAGAGGTAGTTGAGCGTGGTGGCGATGTGCTCGGTGACGAAGAAATACATGATCCAGCGGCGGAGCGGCATCTCGCTGACGTCGCCCAGCGCCTCCAAACGTTCCATGGCCTCGTAAAAGTCCACGGCGAAGTTGAAAAACTGGGAGTTGCGCGCCGAGACGGTCAACTCCTCCTCCAGAAGACGGATGAGCTCGGCGATGGTGGCGCGCACCTCGCGCTCGAAGGCCCCCGGGAGTTCCTCCACTTCCTCTTCTTCCTCCTCCACTAACATCTCTTCTACTTCCTCCTCAGGCGGCAGTGGTGGCGGGGGAGGGGGCCTGCGTCGCCGGCGGCGCACGGGCAGACGGTCGATGAAGCGCTCGATGGTCTCGCCGCGCCGGCGTCGCATGGTCTCGGTGACGGCGCGCCCGTCCTCGCGGGGCCGCAGCGTGAAGACGCCGCCGCGCATCTCCAGGTGGCCGGGGGGGTCCCCGTTGGGCAGGGAGAGGGCGCTGACGATGCATCTTATCAATTGCCCCGTAGGGACTCCGCGCAAGGACCTGAGCGTCTCGAGATCCACGGGATCTGAAAACCGCTGAACGAAGGCTTCGAGCCAGTCGCAGTCGCAAGGTAGGCTGAGCACGGTTTCTTCTGGCGGGTCATGTTGGTTGGGAGCGGGGCGGGCGATGCTGCTGGTGATGAAGTTGAAATAGGCGGTTCTGAGACGGCGGATGGTGGCGAGGAGCACCAGGTCTTTGGGCCCGGCTTGCTGGATGCGCAGACGGTCGGCCATGCCCCAGGCGTGGTCCTGACACCTGGCCAGGTCCTTGTAGTAGTCCTGCATGAGCCGCTCCACGGGCACCTCCTCCTCGCCCGCGCGGCCGTGCATGCGCGTGAGCCCGAAGCCGCGCTGGGGCTGGACGAGCGCCAGGTCGGCGACGACGCGCTCGGCGAGGATGGCTTGCTGGATCTGGGTGAGGGTGGTCTGGAAGTCATCAAAGTCGACGAAGCGGTGGTAGGCTCCGGTGTTGATGGTGTAGGAGCAGTTGGCCATGACGGACCAGTTGACGGTCTGGTGGCCCGGACGCACGAGCTCGTGGTACTTGAGGCGCGAGTAGGCGCGCGTGTCGAAGATGTAGTCGTTGCAGGTGCGCACCAGGTACTGGTAGCCGATGAGGAAGTGCGGCGGCGGCTGGCGGTAGAGCGGCCATCGCTCGGTGGCGGGGGCGCCGGGCGCGAGGTCCTCGAGCATGGTGCGGTGGTAGCCGTAGATGTACCTGGACATCCAGGTGATGCCGGCGGCGGTGGTGGAGGCGCGCGGGAACTCGCGGACGCGGTTCCAGATGTTGCGCAGCGGCAGGAAGTAGTTCATGGTGGGCACGGTCTGGCCCGTGAGGCGCGCGCAGTCGTGGATGCTCTATACGGGCAAAAACGAAAGCGGTCAGCGGCTCGACTCCGTGGCCTGGAGGCTAAGCGAACGGGTTGGGCTGCGCGTGTACCCCGGTTCGAATCTCGAATCAGGCTGGAGCCGCAGCTAACGTGGTATTGGCACTCCCGTCTCGACCCAAGCCTGCACCAACCCTCCAGGATACGGAGGCGGGTCGTTTTGCAACTTTTTTTTGGAGGCCGGATGAGACTAGTAAGCGCGGAAAGCGGCCGACCGCGATGGCTCGCTGCCGTAGTCTGGAGAAGAATCGCCAGGGTTGCGTTGCGGTGTGCCCCGGTTCGAGGCCGGCCGGATTCCGCGGCTAACGAGGGCGTGGCTGCCCCGTCGTTTCCAAGACCCCATAGCCAGCCGACTTCTCCAGTTACGGAGCGAGCCCCTCTTTTGTTTTGTTTGTTTTTGCCAGATGCATCCCGTACTGCGGCAGATGCGCCCCCACCACCCTCCACCGCAACAACAGCCCCCTCCACAGCCGGCGCTTCTGCCCCCGCCCCAGCAGCAACTTCCAGCCACGACCGCCGCGGCCGCCGTGAGCGGGGCTGGACAGAGTTATGATCACCAGCTGGCCTTGGAAGAGGGCGAGGGGCTGGCGCGCCTGGGGGCGTCGTCGCCGGAGCGGCACCCGCGCGTGCAGATGAAAAGGGACGCTCGCGAGGCCTACGTGCCCAAGCAGAACCTGTTCAGAGACAGGAGCGGCGAGGAGCCCGAGGAGATGCGCGCGGCCCGGTTCCACGCGGGGCGGGAGCTGCGGCGCGGCCTGGACCGAAAGAGGGTGCTGAGGGACGAGGATTTCGAGGCGGACGAGCTGACGGGGATCAGCCCCGCGCGCGCGCACGTGGCCGCGGCCAACCTGGTCACGGCGTACGAGCAGACCGTGAAGGAGGAGAGCAACTTCCAAAAATCCTTCAACAACCACGTGCGCACCCTGATCGCGCGCGAGGAGGTGACCCTGGGCCTGATGCACCTGTGGGACCTGCTGGAGGCCATCGTGCAGAACCCCACCAGCAAGCCGCTGACGGCGCAGCTGTTCCTGGTGGTGCAGCATAGTCGGGACAACGAAGCGTTCAGGGAGGCGCTGCTGAATATCACCGAGCCCGAGGGCCGCTGGCTCCTGGACCTGGTGAACATTCTGCAGAGCATCGTGGTGCAGGAGCGCGGGCTGCCGCTGTCCGAGAAGCTGGCGGCCATCAACTTCTCGGTGCTGAGTTTGGGCAAGTACTACGCTAGGAAGATCTACAAGACCCCGTACGTGCCCATAGACAAGGAGGTGAAGATCGACGGGTTTTACATGCGCATGACCCTGAAAGTGCTGACCCTGAGCGACGATCTGGGGGTGTACCGCAACGACAGGATGCACCGTGCGGTGAGCGCCAGCAGGCGGCGCGAGCTGAGCGACCAGGAGCTGATGCATAGTCTGCAGCGGGCCCTGACCGGGGCCGGGACCGAGGGGGAGAGCTACTTTGACATGGGCGCGGACCTGCACTGGCAGCCCAGCCGCCGGGCCTTGGAGGCGGCGGCAGGACCCTACGTAGAAGAGGTGGACGATGAGGTGGACGAGGAGGGCGAGTACCTGGAAGACTGATGGCGCGACCGTATTTTTGCTAGATGCAACAACAACAGCCACCTCCTGATCCCGCGATGCGGGCGGCGCTGCAGAGCCAGCCGTCCGGCATTAACTCCTCGGACGATTGGACCCAGGCCATGCAACGCATCATGGCGCTGACGACCCGCAACCCCGAAGCCTTTAGACAGCAGCCCCAGGCCAACCGGCTCTCGGCCATCCTGGAGGCCGTGGTGCCCTCGCGCTCCAACCCCACGCACGAGAAGGTCCTGGCCATCGTGAACGCGCTGGTGGAGAACAAGGCCATCCGCGGCGACGAGGCCGGCCTGGTGTACAACGCGCTGCTGGAGCGCGTGGCCCGCTACAACAGCACCAACGTGCAGACCAACCTGGACCGCATGGTGACCGACGTGCGCGAGGCCGTGGCCCAGCGCGAGCGGTTCCACCGCGAGTCCAACCTGGGATCCATGGTGGCGCTGAACGCCTTCCTCAGCACCCAGCCCGCCAACGTGCCCCGGGGCCAGGAGGACTACACCAACTTCATCAGCGCCCTGCGCCTGATGGTGACCGAGGTGCCCCAGAGCGAGGTGTACCAGTCCGGGCCGGACTACTTCTTCCAGACCAGTCGCCAGGGCTTGCAGACCGTGAACCTGAGCCAGGCTTTCAAGAACTTGCAGGGCCTGTGGGGCGTGCAGGCCCCGGTCGGGGACCGCGCGACGGTGTCGAGCCTGCTGACGCCGAACTCGCGCCTGCTGCTGCTGCTGGTGGCCCCCTTCACGGACAGCGGCAGCATCAACCGCAACTCGTACCTGGGCTACCTGATTAACCTGTACCGCGAGGCCATCGGCCAGGCGCACGTGGACGAGCAGACCTACCAGGAGATCACCCACGTGAGCCGCGCCCTGGGCCAGGACGACCCGGGCAACCTGGAAGCCACCCTGAACTTTTTGCTGACCAACCGGTCGCAGAAGATCCCGCCCCAGTACGCGCTCAGCACCGAGGAGGAGCGCATCCTGCGTTACGTGCAGCAGAGCGTGGGCCTGTTCCTGATGCAGGAGGGGGCCACCCCCAGCGCCGCGCTCGACATGACCGCGCGCAACATGGAGCCCAGCATGTACGCCAGCAACCGCCCGTTCATCAATAAACTGATGGACTACTTGCATCGGGCGGCCGCCATGAACTCTGACTATTTCACCAACGCCATCCTGAATCCCCACTGGCTCCCGCCGCCGGGGTTCTACACGGGCGAGTACGACATGCCCGACCCCAATGACGGGTTCCTGTGGGACGATGTGGACAGCAGCGTGTTCTCCCCCCGACCGGGTGCTAACGAGCGCCCCTTGTGGAAGAAGGAAGGCAGCGACCGACGCCCGTCCTCGGCGCTGTCCGGCCGCGAGGGTGCTGCCGCGGCGGTGCCCGAGGCCGCCAGTCCTTTCCCGAGCTTGCCCTTCTCGCTGAACAGTATCCGCAGCAGCGAGCTGGGCAGGATCACGCGCCCGCGCTTGCTGGGCGAAGAGGAGTACTTGAATGACTCGCTGTTGAGACCCGAGCGGGAGAAGAACTTCCCCAATAACGGGATAGAAAGCCTGGTGGACAAGATGAGCCGCTGGAAGACGTATGCGCAGGAGCACAGGGACGATCCCCGGGCGTCGCAGGGGGCCACGAGCCGGGGCAGCGCCGCCCGTAAACGCCGGTGGCACGACAGGCAGCGGGGACAGATGTGGGACGATGAGGACTCCGCCGACGACAGCAGCGTGTTGGACTTGGGTGGGAGTGGTAACCCGTTCGCTCACCTGCGCCCCCGTATCGGGCGCATGATGTAAGAGAAACCGAAAATAAATGATACTCACCAAGGCCATGGCGACCAGCGTGCGTTCGTTTCTTCTCTGTTGTTGTTGTATCTAGTATGATGAGGCGTGCGTACCCGGAGGGTCCTCCTCCCTCGTACGAGAGCGTGATGCAGCAGGCGATGGCGGCGGCGGCGATGCAGCCCCCGCTGGAGGCTCCTTACGTGCCCCCGCGGTACCTGGCGCCTACGGAGGGGCGGAACAGCATTCGTTACTCGGAGCTGGCACCCTTGTACGATACCACCCGGTTGTACCTGGTGGACAACAAGTCGGCGGACATCGCCTCGCTGAACTACCAGAACGACCACAGCAACTTCCTGACCACCGTGGTGCAGAACAATGACTTCACCCCCACGGAGGCCAGCACCCAGACCATCAACTTTGACGAGCGCTCGCGGTGGGGCGGCCAGCTGAAAACCATCATGCACACCAACATGCCCAACGTGAACGAGTTCATGTACAGCAACAAGTTCAAGGCGCGGGTGATGGTCTCCCGCAAGACCCCCAATGGGGTGACAGTGACAGAGGATTATGATGGTAGTCAGGATGAGCTGAAGTATGAATGGGTGGAATTTGAGCTGCCCGAAGGCAACTTCTCGGTGACCATGACCATCGACCTGATGAACAACGCCATCATCGACAATTACTTGGCGGTGGGGCGGCAGAACGGGGTGCTGGAGAGCGACATCGGCGTGAAGTTCGACACTAGGAACTTCAGGCTGGGCTGGGACCCCGTGACCGAGCTGGTCATGCCCGGGGTGTACACCAACGAGGCTTTCCATCCCGATATTGTCTTGCTGCCCGGCTGCGGGGTGGACTTCACCGAGAGCCGCCTCAGCAACCTGCTGGGCATTCGCAAGAGGCAGCCCTTCCAGGAAGGCTTCCAGATCATGTACGAGGATCTGGAGGGGGGCAACATCCCCGCGCTCCTGGATGTCGACGCCTATGAGAAAAGCAAGGAGGATGCAGCAGCTGAAGCAACTGCAGCCGTAGCTACCGCCTCTACCGAGGTCAGGGGCGATAATTTTGCAAGCGCCGCAGCAGTGGCAGCGGCCGAGGCGGCTGAAACCGAAAGTAAGATAGTCATTCAGCCGGTGGAGAAGGATAGCAAGAACAGGAGCTACAACGTACTACCGGACAAGATAAACACCGCCTACCGCAGCTGGTACCTAGCCTACAACTATGGCGACCCCGAGAAGGGCGTGCGCTCCTGGACGCTGCTCACCACCTCGGACGTCACCTGCGGCGTGGAGCAAGTCTACTGGTCGCTGCCCGACATGATGCAAGACCCGGTCACCTTCCGCTCCACGCGTCAAGTTAGCAACTACCCGGTGGTGGGCGCCGAGCTCCTGCCCGTCTACTCCAAGAGCTTCTTCAACGAGCAGGCCGTCTACTCGCAGCAGCTGCGCGCCTTCACCTCGCTTACGCACGTCTTCAACCGCTTCCCCGAGAACCAGATCCTCGTCCGCCCGCCCGCGCCCACCATTACCACCGTCAGTGAAAACGTTCCTGCTCTCACAGATCACGGGACCCTGCCGCTGCGCAGCAGTATCCGGGGAGTCCAGCGCGTGACCGTTACTGACGCCAGACGCCGCACCTGCCCCTACGTCTACAAGGCCCTGGGCATAGTCGCGCCGCGCGTCCTCTCGAGCCGCACCTTCTAAATGTCCATTCTCATCTCGCCCAGTAATAACACCGGTTGGGGCCTGCGCGCGCCCAGCAAGATGTACGGAGGCGCTCGCCAACGCTCCACGCAACACCCCGTGCGCGTGCGCGGGCACTTCCGCGCTCCCTGGGGCGCCCTCAAGGGCCGCGTGCGGTCGCGCACCACCGTCGACGACGTGATCGACCAGGTGGTGGCCGACGCGCGCAACTACACCCCCGCCGCCGCGCCCGTCTCCACCGTGGACGCCGTCATCGACAGCGTGGTGGCCGACGCGCGCCGGTACGCCCGCGCCAAGAGCCGGCGGCGGCGCATCGCCCGGCGGCACCGGAGCACCCCCGCCATGCGCGCGGCGCGAGCCTTGCTGCGCAGGGCCAGGCGCACGGGACGCAGGGCCATGCTCAGGGCGGCCAGACGCGCGGCTTCAGGCGCCAGCGCCGGCAGGACCCGGAGACGCGCGGCCACGGCGGCGGCAGCGGCCATCGCCAGCATGTCCCGCCCGCGGCGAGGGAACGTGTACTGGGTGCGCGACGCCGCCACCGGTGTGCGCGTGCCCGTGCGCACCCGCCCCCCTCGCACTTGAAGATGTTCACTTCGCGATGTTGATGTGTCCCAGCGGCGAGGAGGATGTCCAAGCGCAAATTCAAGGAAGAGATGCTCCAGGTCATCGCGCCTGAGATCTACGGCCCTGCGGTGGTGAAGGAGGAAAGAAAGCCCCGCAAAATCAAGCGGGTCAAAAAGGACAAAAAGGAAGAAGAAAGTGATGTGGACGGATTGGTGGAGTTTGTGCGCGAGTTCGCCCCCCGGCGGCGCGTGCAGTGGCGCGGGCGGAAGGTGCAACCGGTGCTGAGACCCGGCACCACCGTGGTCTTCACGCCCGGCGAGCGCTCCGGCACCGCTTCCAAGCGCTCCTACGACGAGGTGTACGGGGATGATGATATTCTGGAGCAGGCGGCCGAGCGCCTGGGCGAGTTTGCTTACGGCAAGCGCAGCCGTTCCGCACCGAAGGAAGAGGCGGTGTCCATCCCGCTGGACCACGGCAACCCCACGCCGAGCCTCAAGCCCGTGACCTTGCAGCAGGTGCTGCCGACCGCGGCGCCGCGCCGGGGGTTCAAGCGCGAGGGCGAGGATCTGTACCCCACCATGCAGCTGATGGTGCCCAAGCGCCAGAAGCTGGAAGACGTGCTGGAGACCATGAAGGTGGACCCGGACGTGCAGCCCGAGGTCAAGGTGCGGCCCATCAAGCAGGTGGCCCCGGGCCTGGGCGTGCAGACCGTGGACATCAAGATTCCCACGGAGCCCATGGAAACGCAGACCGAGCCCATGATCAAGCCCAGCACCAGCACCATGGAGGTGCAGACGGATCCCTGGATGCCATCGGCTCCTAGTCGAAGACCCCGGCGCAAGTACGGCGCGGCCAGCCTGCTGATGCCCAACTACGCGCTGCATCCTTCCATCATCCCCACGCCGGGCTACCGCGGCACGCGCTTCTACCGCGGTCATACCAGCAGCCGCCGCCGCAAGACCACCACTCGCCGCCGCCGTCGCCGCACCGCCGCTGCAACCACCCCTGCCGCCCTGGTGCGGAGAGTGTACCGCCGCGGCCGCGCACCTCTGACCCTGCCGCGCGCGCGCTACCACCCGAGCATCGCCATTTAAACTTTCGCCTGCTTTGCAGATCAATGGCCCTCACATGCCGCCTTCGCGTTCCCATTACGGGCTACCGAGGAAGAAAACCGCGCCGTAGAAGGCTGGCGGGGAACGGGATGCGTCGCCACCACCACCGGCGGCGGCGCGCCATCAGCAAGCGGTTGGGGGGAGGCTTCCTGCCCGCGCTGATCCCCATCATCGCCGCGGCGATCGGGGCGATCCCCGGCATTGCTTCCGTGGCGGTGCAGGCCTCTCAGCGCCACTGAGACACACTTGGAAACATCTTGTAATAAACCAATGGACTCTGACGCTCCTGGTCCTGTGATGTGTTTTCGTAGACAGATGGAAGACATCAATTTTTCGTCCCTGGCTCCGCGACACGGCACGCGGCCGTTCATGGGCACCTGGAGCGACATCGGCACCAGCCAACTGAACGGGGGCGCCTTCAATTGGAGCAGTCTCTGGAGCGGGCTTAAGAATTTCGGGTCCACGCTTAAAACCTATGGCAGCAAGGCGTGGAACAGCACCACAGGGCAGGCGCTGAGGGATAAGCTGAAAGAGCAGAACTTCCAGCAGAAGGTGGTCGATGGGCTCGCCTCGGGCATCAACGGGGTGGTGGACCTGGCCAACCAGGCCGTGCAGCGGCAGATCAACAGCCGCCTGGACCCGGTGCCGCCCGCCGGCTCCGTGGAGATGCCGCAGGTGGAGGAGGAGCTGCCTCCCCTGGACAAGCGGGGCGAGAAGCGACCCCGCCCCGATGCGGAGGAGACGCTGCTGACGCACACGGACGAGCCGCCCCCGTACGAGGAGGCGGTGAAACTGGGTCTGCCCACCACGCGGCCCATCGCGCCCCTGGCCACCGGGGTGCTGAAACCCGAAAAGCCCGCGACCCTGGACTTGCCTCCTCCCCAGCCTTCCCGCCCCTCTACAGTGGCTAAGCCCCTGCCGCCGGTGGCCGTGGCCCGCGCGCGACCCGGGGGCACCGCCCGCCCTCATGCGAACTGGCAGAGCACTCTGAACAGCATCGTGGGTCTGGGAGTGCAGAGTGTGAAGCGCCGCCGCTGCTATTAAACCTACCGTAGCGCTTAACTTGCTTGTCTGTGTGTGTATGTATTATGTCGCCGCCGCCGCTGTCCACCAGAAGGAGGAGTGAAGAGGCGCGTCGCCGAGTTGCAAGATGGCCACCCCATCGATGCTGCCCCAGTGGGCGTACATGCACATCGCCGGACAGGACGCTTCGGAGTACCTGAGTCCGGGTCTGGTGCAGTTTGCCCGCGCCACAGACACCTACTTCAGTCTGGGGAACAAGTTTAGGAACCCCACGGTGGCGCCCACGCACGATGTGACCACCGACCGCAGCCAGCGGCTGACGCTGCGCTTCGTGCCCGTGGACCGCGAGGACAACACCTACTCGTACAAAGTGCGCTACACGCTGGCCGTGGGCGACAACCGCGTGCTGGACATGGCCAGCACCTACTTTGACATCCGCGGCGTGCTGGATCGGGGCCCTAGCTTCAAACCCTACTCCGGCACCGCCTACAACAGTCTGGCCCCCAAGGGAGCACCCAACACTTGTCAGTGGACATATAAAGCCGATGGTGAAACTGCCACAGAAAAAACCTATACATATGGAAATGCACCCGTGCAGGGCATTAACATCACAAAAGATGGTATTCAACTTGGAACTGACACCGATGATCAGCCAATCTACGCAGATAAAACCTATCAGCCTGAACCTCAAGTGGGTGATGCTGAATGGCATGACATCACTGGTACTGATGAAAAGTATGGAGGCAGAGCTCTTAAGCCTGATACCAAAATGAAGCCTTGTTATGGTTCTTTTGCCAAGCCTACTAATAAAGAAGGAGGTCAGGCAAATGTGAAAACAGGAACAGGCACTACTAAAGAATATGACATAGACATGGCTTTCTTTGACAACAGAAGTGCGGCTGCTGCTGGCCTAGCTCCAGAAATTGTTTTGTATACTGAAAATGTGGATTTGGAAACTCCAGATACCCATATTGTATACAAAGCAGGCACAGATGACAGCAGCTCTTCTATTAATTTGGGTCAGCAAGCCATGCCCAACAGACCTAACTACATTGGTTTCAGAGACAACTTTATCGGGCTCATGTACTACAACAGCACTGGCAATATGGGGGTGCTGGCCGGTCAGGCTTCTCAGCTGAATGCTGTGGTTGACTTGCAAGACAGAAACACCGAGCTGTCCTACCAGCTCTTGCTTGACTCTCTGGGTGACAGAACCCGGTATTTCAGTATGTGGAATCAGGCGGTGGACAGCTATGATCCTGATGTGCGCATTATTGAAAATCATGGTGTGGAGGATGAACTTCCCAACTATTGTTTCCCTCTGGATGCTGTTGGCAGAACAGATACTTATCAGGGAATTAAGGCTAATGGAACTGATCAAACCACATGGACCAAAGATGACAGTGTCAATGATGCTAATGAGATAGGCAAGGGTAATCCATTCGCCATGGAAATCAACATCCAAGCCAACCTGTGGAGGAACTTCCTCTACGCCAACGTGGCCCTGTACCTGCCCGACTCTTACAAGTACACGCCGGCCAATGTTACCCTGCCCACCAACACCAACACCTACGATTACATGAACGGCCGGGTGGTGGCGCCCTCGCTGGTGGACTCCTACATCAACATCGGGGCGCGCTGGTCGCTGGATCCCATGGACAACGTGAACCCCTTCAACCACCACCGCAATGCGGGGCTGCGCTACCGCTCCATGCTCCTGGGCAACGGGCGCTACGTGCCCTTCCACATCCAGGTGCCCCAGAAATTTTTCGCCATCAAGAGCCTCCTGCTCCTGCCCGGGTCCTACACCTACGAGTGGAACTTCCGCAAGGACGTCAACATGATCCTGCAGAGCTCCCTCGGCAACGACCTGCGCACGGACGGGGCCTCCATCTCCTTCACCAGCATCAACCTCTACGCCACCTTCTTCCCCATGGCGCACAACACGGCCTCCACGCTCGAGGCCATGCTGCGCAACGACACCAACGACCAGTCCTTCAACGACTACCTCTCGGCGGCCAACATGCTCTACCCCATCCCGGCCAACGCCACCAACGTGCCCATCTCCATCCCCTCGCGCAACTGGGCCGCCTTCCGCGGCTGGTCCTTCACGCGTCTCAAGACCAAGGAGACGCCCTCGCTGGGCTCCGGGTTCGACCCCTACTTCGTCTACTCGGGCTCCATCCCCTACCTCGACGGCACCTTCTACCTCAACCACACCTTCAAGAAGGTCTCCATCACCTTCGACTCCTCCGTCAGCTGGCCCGGCAACGACCGGCTCCTGACGCCCAACGAGTTCGAAATCAAGCGCACCGTCGACGGCGAGGGCTACAACGTGGCCCAGTGCAACATGACCAAGGACTGGTTCCTGGTCCAGATGCTGGCCCACTACAACATCGGCTACCAGGGCTTCTACGTGCCCGAGGGCTACAAGGACCGCATGTACTCCTTCTTCCGCAACTTCCAGCCCATGAGCCGCCAGGTGGTGGACGAGGTCAACTACAAGGACTACCAGGCCGTCACCCTGGCCTACCAGCACAACAACTCGGGCTTCGTCGGCTACCTCGCGCCCACCATGCGCCAGGGCCAGCCCTACCCCGCCAACTACCCCTACCCGCTCATCGGCAAGAGCGCCGTCACCAGCGTCACCCAGAAAAAGTTCCTCTGCGACAGGGTCATGTGGCGCATCCCCTTCTCCAGCAACTTCATGTCCATGGGCGCGCTCACCGACCTCGGCCAGAACATGCTCTATGCCAACTCCGCCCACGCGCTAGACATGAATTTCGAAGTCGACCCCATGGATGAGTCCACCCTTCTCTATGTTGTCTTCGAAGTCTTCGACGTCGTCCGAGTGCACCAGCCCCACCGCGGCGTCATCGAGGCCGTCTACCTGCGCACCCCCTTCTCGGCCGGTAACGCCACCACCTAAGCTCTTGCTTCTTGCAAGCCATGGCCGCGGGCTCCGGCGAGCAGGAGCTCAGGGCCATCATCCGCGACCTGGGCTGCGGGCCCTACTTCCTGGGCACCTTCGATAAGCGCTTCCCGGGATTCATGGCCCCGCACAAGCTGGCCTGCGCCATCGTCAACACGGCCGGCCGCGAGACCGGGGGCGAGCACTGGCTGGCCTTCGCCTGGAACCCGCGCTCGAACACCTGCTACCTCTTCGACCCCTTCGGGTTCTCGGACGAGCGCCTCAAGCAGATCTACCAGTTCGAGTACGAGGGCCTGCTGCGCCGCAGCGCCCTGGCCACCGAGGACCGCTGCGTCACCCTGGAAAAGTCCACCCAGACCGTGCAGGGTCCGCGCTCGGCCGCCTGCGGGCTCTTCTGCTGCATGTTCCTGCACGCCTTCGTGCACTGGCCCGACCGCCCCATGGACAAGAACCCCACCATGAACTTGCTGACGGGGGTGCCCAACGGCATGCTCCAGTCGCCCCAGGTGGAACCCACCCTGCGCCGCAACCAGGAGGCGCTCTACCGCTTCCTCAACTCCCACTCCGCCTACTTTCGCTCCCACCGCGCGCGCATCGAGAAGGCCACCGCCTTCGACCGCATGAATCAAGACATGTAAACCGTGTGTGTATGTTAAATGTCTTTAATAAACAGCACTTTCATGTTACACATGCATCTGAGATGATTTATTTAGAAATCGAAAGGGTTCTGCCGGGTCTCGGCATGGCCCGCGGGCAGGGACACGTTGCGGAACTGGTACTTGGCCAGCCACTTGAACTCGGGGATCAGCAGTTTGGGCAGCGGGGTGTCGGGGAAGGAGTCGGTCCACAGCTTCCGCGTCAGTTGCAGGGCGCCCAGCAGGTCGGGCGCGGAGATCTTGAAATCGCAGTTGGGACCCGCGTTCTGCGCGCGGGAGTTGCGGTACACGGGGTTGCAGCACTGGAACACCATCAGGGCCGGGTGCTTCACGCTCGCCAGCACCGTCGCGTCGGTGATGCTCTCCACGTCGAGGTCCTCGGCGTTGGCCATCCCGAAGGGGGTCATCTTGCAGGTCTGCCTTCCCATGGTGGGCACGCACCCGGGCTTGTGGTTGCAATCGCAGTGCAGGGGGATCAGCATCATCTGGGCCTGGTCGGCGTTCATCCCCGGGTACATGGCCTTCATGAAAGCCTCCAATTGCCTGAACGCCTGCTGGGCCTTGGCTCCCTCGGTGAAGAAGACCCCGCAGGACTTGCTAGAGAACTGGTTGGTGGCGCACCCGGCGTCGTGCACGCAGCAGCGCGCGTCGTTGTTGGCCAGCTGCACCACGCTGCGCCCCCAGCGGTTCTGGGTGATCTTGGCCCGGTCGGGGTTCTCCTTCAGCGCGCGCTGCCCGTTCTCGCTCGCCACATCCATCTCGATCATGTGCTCCTTCTGGATCATGGTGGTCCCGTGCAGGCACCGCAGCTTGCCCTCGGCCTCGGTGCACCCGTGCAGCCACAGCGCGCACCCGGTGCACTCCCAGTTCTTGTGGGCGATCTGGGAATGCGCGTGCACGAAGCCCTGCAGGAAGCGGCCCATCATGGTGGTCAGGGTCTTGTTGCTAGTGAAGGTCAGCGGAATGCCGCGGTGCTCCTCGTTGATGTACAGGTGGCAGATGCGGCGGTACACCTCGCCCTGCTCGGGCATCAGCTGGAAGTTGGCTTTCAGGTCGGTCTCCACGCGGTAGCGGTCCATCAGCATAGTCATGATTTCCATACCCTTCTCCCAGGCCGAGACGATGGGCAGGCTCATAGGGTTCTTCACCATCATCTTAGCGCTAGCAGCCGCGGCCAGGGGGTCGCTCTCGTCCAGGGTCTCAAAGCTCCGCTTGCCGTCCTTCTCGGTGATCCGCACCGGGGGGTAGCTGAAGCCCACGGCCGCCAGCTCCTCCTCGGCCTGTCTTTCGTCCTCGCTGTCCTGGCTGACGTCCTGCAGGACCACATGCTTGGTCTTGCGGGGTTTCTTCTTGGGCGGCAGCGGCGGCGGAGATGTTGGAGATGGCGAGGGGGAGCGCGAGTTCTCGCTCACCACTACTATCTCTTCCTCTTCTTGGTCCGAGGCCACGCGGCGGTAGGTATGTCTCTTCGGGGGCAGAGGCGGAGGCGACGGGCTCTCGCCGCCGCGACTTGGCGGATGGCTGGCAGAGCCCCTTCCGCGTTCGGGGGTGCGCTCCCGGCGGCGCTCTGACTGACTTCCTCCGCGGCCGGCCATTGTGTTCTCCTAGGGAGGAACAACAAGCATGGAGACTCAGCCATCGCCAACCTCGCCATCTGCCCCCACCGCCGACGAGAAGCAGCAGCAGCAGAATGAAAGCTTAACCGCCCCGCCGCCCAGCCCCGCCACCTCCGACGCGGCCGTCCCAGACATGCAAGAGATGGAGGAATCCATCGAGATTGACCTGGGCTATGTGACGCCCGCGGAGCACGAGGAGGAGCTGGCAGTGCGCTTTTCACAAGAAGAGATACACCAAGAACAGCCAGAGCAGGAAGCAGAGAATGAGCAGAGTCAGGCTGGGCTCGAGCATGACGGCGACTACCTCCACCTGAGCGGGGGGGAGGACGCGCTCATCAAGCATCTGGCCCGGCAGGCCACCATCGTCAAGGATGCGCTGCTCGACCGCACCGAGGTGCCCCTCAGCGTGGAGGAGCTCAGCCGCGCCTACGAGTTGAACCTCTTCTCGCCGCGCGTGCCCCCCAAGCGCCAGCCCAATGGCACCTGCGAGCCCAACCCGCGCCTCAACTTCTACCCGGTCTTCGCGGTGCCCGAGGCCCTGGCCACCTACCACATCTTTTTCAAGAACCAAAAGATCCCCGTCTCCTGCCGCGCCAACCGCACCCGCGCCGACGCCCTTTTCAACCTGGGTCCCGGCGCCCGCCTACCTGATATCGCCTCCTTGGAAGAGGTTCCCAAGATCTTCGAGGGTCTGGGCAGCGACGAGACTCGGGCCGCGAACGCTCTGCAAGGAGAAGGAGGAGAGCATGAGCACCACAGCGCCCTGGTCGAGTTGGAAGGCGACAACGCGCGGCTGGCGGTGCTCAAACGCACGGTCGAGCTGACCCATTTCGCCTACCCGGCTCTGAACCTGCCCCCCAAAGTCATGAGCGCGGTCATGGACCAGGTGCTCATCAAGCGCGCGTCGCCCATCTCCGAGGACGAGGGCATGCAAGACTCCGAGGAGGGCAAGCCCGTGGTCAGCGACGAGCAGCTGGCCCGGTGGCTGGGTCCTAATGCTAGTCCCCAGAGTTTGGAAGAGCGGCGCAAACTCATGATGGCCGTGGTCCTGGTGACCGTGGAGCTGGAGTGCCTGCGCCGCTTCTTCGCCGACGCGGAGACCCTGCGCAAGGTCGAGGAGAACCTGCACTACCTCTTCAGGCACGGGTTCGTGCGCCAGGCCTGCAAGATCTCCAACGTGGAGCTGACCAACCTGGTCTCCTACATGGGCATCTTGCACGAGAACCGCCTGGGGCAGAACGTGCTGCACACCACCCTGCGCGGGGAGGCCCGGCGCGACTACATCCGCGACTGCGTCTACCTCTACCTCTGCCACACCTGGCAGACGGGCATGGGCGTGTGGCAGCAGTGTCTGGAGGAGCAGAACCTGAAAGAGCTCTGCAAGCTCCTGCAGAAGAACCTCAAGGGTCTGTGGACCGGGTTCGACGAGCGCACCACCGCCTCGGACCTGGCCGACCTCATTTTCCCCGAGCGCCTCAGGCTGACGCTGCGCAACGGCCTGCCCGACTTTATGAGCCAAAGCATGTTGCAAAACTTTCGCTCTTTCATCCTCGAACGCTCCGGAATCCTGCCCGCCACCTGCTCCGCGCTGCCCTCGGACTTCGTGCCGCTGACCTTCCGCGAGTGCCCCCCGCCGCTGTGGAGCCACTGCTACCTGCTGCGCCTGGCCAACTACCTGGCCTACCACTCGGACGTGATCGAGGACGTCAGCGGCGAGGGCCTGCTCGAGTGCCACTGCCGCTGCAACCTCTGCACGCCGCACCGCTCCCTGGCCTGCAACCCCCAGCTGCTGAGCGAGACCCAGATCATCGGCACCTTCGAGTTGCAAGGGCCCAGCGAAGGCGAGGGTTCAGCCGCCAAGGGGGGTCTGAAACTCACCCCGGGGCTGTGGACCTCGGCCTACTTGCGCAAGTTCGTGCCCGAGGACTACCATCCCTTCGAGATCAGGTTCTACGAGGACCAATCCCATCCGCCCAAGGCCGAGCTGTCGGCCTGCGTCATCACCCAGGGGGCGATCCTGGCCCAATTGCAAGCCATCCAGAAATCCCGCCAAGAATTCTTGCTGAAAAAGGGCCGCGGGGTCTACCTCGACCCCCAGACCGGTGAGGAGCTCAACCCCGGCTTCCCCCAGGATGCCCCGAGGAAACAAGAAGCTGAAAGTGGAGCTGCCGCCCGTGGAGGATTTGGAGGAAGACTGGGAGAACAGCAGTCAGGCAGAGGAGGAGGAGATGGAGGAAGACTGGGACAGCACTCAGGCAGAGGAGGACAGCCTGCAAGACAGTCTGGAGGAAGACGAGGAGGAGGCAGAGGAGGAGGTGGAAGAAGCAGCCGCCGCCAGACCGTCGTCCTCGGCGGGGGAGAAAGCAAGCAGCACGGATACCATCTCCGCTCCGGGTCGGGGTCCCGCTCGACCACACAGTAGATGGGACGAGACCGGACGATTCCCGAACCCCACCACCCAGACCGGTAAGAAGGAGCGGCAGGGATACAAGTCCTGGCGGGGGCACAAAAACGCCATCGTCTCCTGCTTGCAGGCCTGCGGGGGCAACATCTCCTTCACCCGGCGCTACCTGCTCTTCCACCGCGGGGTGAACTTTCCCCGCAACATCTTGCATTACTACCGTCACCTCCACAGCCCCTACTACTTCCAAGAAGAGGCAGCAGCAGCAGAAAAAGACCAGCAGAAAACCAGCAGCTAGAAAATCCACAGCGGCGGCAGCAGGTGGACTGAGGATCGCGGCGAACGAGCCGGCGCAAACCCGGGAGCTGAGGAACCGGATCTTTCCCACCCTCTATGCCATCTTCCAGCAGAGTCGGGGGCAGGAGCAGGAACTGAAAGTCAAGAACCGTTCTCTGCGCTCGCTCACCCGCAGTTGTCTGTATCACAAGAGCGAAGACCAACTTCAGCGCACTCTCGAGGACGCCGAGGCTCTCTTCAACAAGTACTGCGCGCTCACTCTTAAAGAGTAGCCCGCGCCCGCCCAGTCGCAGAAAAAGGCGGGAATTACGTCACCTGTGCCCTTCGCCCTAGCCGCCTCCACCCATCATCATGAGCAAAGAGATTCCCACGCCTTACATGTGGAGCTACCAGCCCCAGATGGGCCTGGCCGCCGGTGCCGCCCAGGACTACTCCACCCGCATGAATTGGCTCAGCGCCGGGCCCGCGATGATCTCACGGGTGAATGACATCCGCGCCCACCGAAACCAGATACTCCTAGAACAGTCAGCGCTCACCGCCACGCCCCGCAATCACCTCAATCCGCGTAATTGGCCCGCCGCCCTGGTGTACCAGGAAATTCCCCAGCCCACGACCGTACTACTTCCGCGAGACGCCCAGGCCGAAGTCCAGCTGACTAACTCAGGTGTCCAGCTGGCGGGCGGCGCCACCCTGTGTCGTCACCGCCCCGCTCAGGGTATAAAGCGGCTGGTGATCCGGGGCAGAGGCACACAGCTCAACGACGAGGTGGTGAGCTCTTCGCTGGGTCTGCGACCTGACGGAGTCTTCCAACTCGCCGGATCGGGGAGATCTTCCTTCACGCCTCGTCAGGCCGTCCTGACTTTGGAGAGTTCGTCCTCGCAGCCCCGCTCGGGTGGCATCGGCACTCTCCAGTTCGTGGAGGAGTTCACTCCCTCGGTCTACTTCAACCCCTTCTCCGGCTCCCCCGGCCACTACCCGGACGAGTTCATCCCGAACTTCGACGCCATCAGCGAGTCGGTGGACGGCTACGATTGAAACTAATCACCCCCTTATCCAGTGAAATAAAGATCATATTGATGATGATTTTACAGAAATAAAAAATAATCATTTGATTTGAAATAAAGATACAATCATATTGATGATTTGAGTTTAACAAAAAAATAAAGAATCACTTACTTGAAATCTGATACCAGGTCTCTGTCCATGTTTTCTGCCAACACCACTTCACTCCCCTCTTCCCAGCTCTGGTACTGCAGGCCCCGGCGGGCTGCAAACTTCCTCCACACGCTGAAGGGGATGTCAAATTCCTCCTGTCCCTCAATCTTCATTTTATCTTCTATCAGATGTCCAAAAAGCGCGTCCGGGTGGATGATGACTTCGACCCCGTCTACCCCTACGATGCAGACAACGCACCGACCGTGCCCTTCATCAACCCCCCCTTCGTCTCTTCAGATGGATTCCAAGAGAAGCCCCTGGGGGTGTTGTCCCTGCGACTGGCCGACCCCGTCACCACCAAGAACGGGGAAATCACCCTCAAGCTGGGAGAGGGGGTGGACCTCGATTCCTCGGGAAAACTCATCTCCAACACGGCCACCAAGGCCGCCGCCCCTCTCAGTTTTTCCAACAACACCATTTCCCTTAACATGGATCACCCCTTTTACACTAAAGATGGAAAATTATCCTTACAAGTTTCTCCACCATTAAATATACTGAGAACAAGCATTCTAAACACACTAGCTTTAGGTTTTGGATCAGGTTTAGGACTCCGTGGCTCTGCCTTGGCAGTACAGTTAGTCTCTCCACTTACATTTGATACTGATGGAAACATAAAGCTTACCTTAGACAGAGGTTTGCATGTTACAACAGGAGATGCAATTGAAAGCAACATAAGCTGGGCTAAAGGTTTAAAATTTGAAGATGGAGCCATAGCAACCAACATTGGAAATGGGTTAGAGTTTGGAAGCAGTAGTACAGAAACAGGTGTTGATGATGCTTACCCAATCCAAGTTAAACTTGGATCTGGCCTTAGCTTTGACAGTACAGGAGCCATAATGGCTGGTAACAAAGAAGACGATAAACTCACTTTGTGGACAACACCTGATCCATCACCAAACTGTCAAATACTCGCAGAAAATGATGCAAAACTAACACTTTGCTTGACTAAATGTGGTAGTCAAATACTGGCCACTGTGTCAGTCTTAGTTGTAGGAAGTGGAAACCTAAACCCCATTACTGGCACCGTAAGCAGTGCTCAGGTGTTTCTACGTTTTGATGCAAACGGTGTTCTTTTAACAGAACATTCTACACTAAAAAAATACTGGGGGTATAGGCAGGGAGATAGCATAGATGGCACTCCATATACCAATGCTGTAGGATTCATGCCCAATTTAAAAGCTTATCCAAAGTCACAAAGTTCTACTACTAAAAATAATATAGTAGGGCAAGTATACATGAATGGAGATGTTTCAAAACCTATGCTTCTCACTATAACCCTCAATGGTACTGATGACAGCAACAGTACATATTCAATGTCATTTTCATACACCTGGACTAATGGAAGCTATGTTGGAGCAACATTTGGGGCTAACTCTTATACCTTCTCATACATCGCCCAAGAATGAACACTGTATCCCACCCTGCATGCCAACCCTTCCCACCCCACTCTGTGGAACAAACTCTGAAACACAAAATAAAATAAAGTTCAAGTGTTTTATTGATTCAACAGTTTTACAGGATTCGAGCAGTTATTTTTCCTCCACCCTCCCAGGACATGGAATACACCACCCTCTCCCCCCGCACAGCCTTGAACATCTGAATGCCATTGGTGATGGACATGCTTTTGGTCTCCACGTTCCACACAGTTTCAGAGCGAGCCAGTCTCGGGTCGGTCAGGGAGATGAAACCCTCCGGGCACTCCCGCATCTGCACCTCACAGCTCAACAGCTGAGGATTGTCCTCGGTGGTCGGGATCACGGTTATCTGGAAGAAGCAGAAGAGCGGCGGTGGGAATCATAGTCCGCGAACGGGATCGGCCGGTGGTGTCGCATCAGGCCCCGCAGCAGTCGCTGCCGCCGCCGCTCCGTCAAGCTGCTGCTCAGGGGGTCCGGGTCCAGGGACTCCCTCAGCATGATGCCCACGGCCCTCAGCATCAGTCGTCTGGTGCGGCGGGCGCAGCAGCGCATGCGGATCTCGCTCAGGTCGCTGCAGTACGTGCAACACAGAACCACCAGGTTGTTCAACAGTCCATAGTTCAACACGCTCCAGCCGAAACTCATCGCGGGAAGGATGCTACCCACGTGGCCGTCGTACCAGATCCTCAGGTAAATCAAGTGGTGCCCCCTCCAGAACACGCTGCCCACGTACATGATCTCCTTGGGCATGTGGCGGTTCACCACCTCCCGGTACCACATCACCCTCTGGTTGAACATGCAGCCCCGGATGATCCTGCGGAACCACAGGGCCAGCACCGCCCCGCCCGCCATGCAGCGAAGAGACCCCGGGTCCCGGCAATGGCAATGGAGGACCCACCGCTCGTACCCGTGGATCATCTGGGAGCTGAACAAGTCTATGTTGGCACAGCACAGGCATATGCTCATGCATCTCTTCAGCACTCTCAACTCCTCGGGGGTCAAAACCATATCCCAGGGCACGGGGAACTCTTGCAGGACAGCGAACCCCGCAGAACAGGGCAATCCTCGCACAGAACTTACATTGTGCATGGACAGGGTATCGCAATCAGGCAGCACCGGGTGATCCTCCACCAGAGAAGCGCGGGTCTCGGTCTCCTCACAGCGTGGTAAGGGGGCCGGCCGATACGGGTGATGGCGGGACGCGGCTGATCGTGTTCGCGACCGTGTCATGATGCAGTTGCTTTCGGACATTTTCGTACTTGCTGTAGCAGAACCTGGTCCGGGCGCTGCACACCGATCGCCGGCGGCGGTCTCGGCGCTTGGAACGCTCGGTGTTGAAATTGTAAAACAGCCACTCTCTCAGACCGTGCAGCAGATCTAGGGCCTCAGGAGTGATGAAGATCCCATCATGCCTGATGGCTCTGATCACATCGACCACCGTGGAATGGGCCAGACCCAGCCAGATGATGCAATTTTGTTGGGTTTCGGTGACGGCGGGGGAGGGAAGAACAGGAAGAACCATGATTAACTTTTAATCCAAACGGTCTCGGAGTACTTCAAAATGAAGATCGCGGAGATGGCACCTCTCGCCCCCGCTGTGTTGGTGGAAAATAACAGCCAGGTCAAAGGTGATACGGTTCTCGAGATGTTCCACGGTGGCTTCCAGCAAAGCCTCCACGCGCACATCCAGAAACAAGACAATAGCGAAAGCGGGAGGGTTCTCTAATTCCTCAATCATCATGTTACACTCCTGCACCATCCCCAGATAATTTTCATTTTTCCAGCCTTGAATGATTCGAACTAGTTCCTGAGGTAAATCCAAGCCAGCCATGATAAAGAGCTCGCGCAGAGCGCCCTCCACCGGCATTCTTAAGCACACCCTCATAATTCCAAGATATTCTGCTCCTGGTTCACCTGCAGCAGATTGACAAGCGGAATATCAAAATCTCTGCCGCGATCCCTGAGCTCCTCCCTCAGCAATAACTGTAAGTACTCTTTCATATCCTCTCCGAAATTTTTAGCCATAGGACCACCAGGAATAAGATTAGGGCAAGCCACAGTACAGATAAACCGAAGTCCTCCCCAGTGAGCATTGCCAAATGCAAGACTGCTATAAGCATGCTGGCTAGACCCGGTGATATCTTCCAGATAACTGGACAGAAAATCGCCCAGGCAATTTTTAAGAAAATCAACAAAAGAAAAATCCTCCAGGTGGACGTTTAGAGCCTCGGGAACAACGATGAAGTAAATGCAAGCGGTGCGTTCCAGCATGGTTAGTTAGCTGATCTGTAGAAAAAACAAAAATGAACATTAAACCATGCTAGCCTGGCGAACAGGTGGGTAAATCGTTCTCTCCAGCACCAGGCAGGCCACGGGGTCTCCGGCGCGACCCTCGTAAAAATTGTCGCTATGATTGAAAACCATCACAGAGAGACGTTCCCGGTGGCCGGCGTGAATGATTCGACAAGATGAATACACCCCCGGAACATTGGCGTCCGCGAGTGAAAAAAAGCGCCCGAGGAAGCAATAAGGCACTACAATGCTCAGTCTCAAGTCCAGCAAAGCGATGCCATGCGGATGAAGCACAAAATTCTCAGGTGCGTACAAAATGTAATTACTCCCCTCCTGCACAGGCAGCAAAGCCCCCGATCCCTCCAGGTACACATACAAAGCCTCAGCGTCCATAGCTTACCGAGCAGCAGCACACAACAGGCGCAAGAGTCAGAGAAAGGCTGAGCTCTAACCTGTCCACCCGCTCTCTGCTCAATATATAGCCCAGATCTACACTGACGTAAAGGCCAAAGTCTAAAAATACCCGCCAAATAATCACACACGCCCAGCACACGCCCAGAAACCGGTGACACACTCAAAAAAATACGCGCACTTCCTCAAACGCCCAAAACTGCCGTCATTTCCGGGTTCCCACGCTACGTCATCAAAACACGACTTTCAAATTCCGTCGACCGTTAAAAACGTCACCCGCCCCGCCCCTAACGGTCGCCCGTCTCTCAGCCAATCAGCGCCCCGCATCCCCAAATTCAAACACCTCATTTGCATATTAACGCGCACAAAAAGTTTGAGGTATATTATTGATGATGG
ChAdV68-CT-TSNA (SEQ ID NO:66)
CATCATCAATAATATACCTCAAACTTTTTGTGCGCGTTAATATGCAAATGAGGCGTTTGAATTTGGGGAGGAAGGGCGGTGATTGGTCGAGGGATGAGCGACCGTTAGGGGCGGGGCGAGTGACGTTTTGATGACGTGGTTGCGAGGAGGAGCCAGTTTGCAAGTTCTCGTGGGAAAAGTGACGTCAAACGAGGTGTGGTTTGAACACGGAAATACTCAATTTTCCCGCGCTCTCTGACAGGAAATGAGGTGTTTCTGGGCGGATGCAAGTGAAAACGGGCCATTTTCGCGCGAAAACTGAATGAGGAAGTGAAAATCTGAGTAATTTCGCGTTTATGGCAGGGAGGAGTATTTGCCGAGGGCCGAGTAGACTTTGACCGATTACGTGGGGGTTTCGATTACCGTGTTTTTCACCTAAATTTCCGCGTACGGTGTCAAAGTCCGGTGTTTTTACGTAGGTGTCAGCTGATCGCCAGGGTATTTAAACCTGCGCTCTCCAGTCAAGAGGCCACTCTTGAGTGCCAGCGAGAAGAGTTTTCTCCTCCGCGCCGCGAGTCAGATCTACACTTTGAAAGTAGGGATAACAGGGTAATGACATTGATTATTGACTAGTTGTTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTCCGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTACGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACACCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAATAACCCCGCCCCGTTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTCGTTTAGTGAACCGTCAGATCGCCTGGAACGCCATCCACGCTGTTTTGACCTCCATAGAAGACAGCGATCGCGCCACCATGGCTGGCATGACCGAGTACAAGCTGGTGGTAGTGGGAGCAGGGGATGTTGGAAAATCAGCCTTGACTATTCAGCTCATCCAGGGCACAGATCTGGATCACCAGGAGAAATGTCTCTCGCGACTGTACGACCACATGCCTGAGGGTCTGACCCCCCTTATGGGAGTGTCGTCCTCTTCTGCGCTGGCCCGTCTCGGATTACCCATGGATAAACTCAATAAAATCACCGCCCCGGCGAGCCAGAAGTTAAGACAACTGCAAAAGATGGAAACTCCTGAACTACTGCCCTGTGGGTATCTTGTAGAAGAAAATACCACGATCTCTGTGACAGTGAAGGGCCTGGAGGCTCAGAATAAGATCAAAGGGTGCACTGGGTCGGTGAACATGACTTTACAGAGAGCCAGCGCAGCTCCTAAGACTGGTGGCGGGGGTGAAGCCGCTGCATACAACAACACTCTTGTGGCACGGCACGTGCCCCAGATACCAAAGCCCGATTCCTTGGTGGGGCTTAGTGATGAGTTGGGGAAGCGGGACACTTTTGCAGAGTCTCTGATTCGTAGGATGGCATCCGCGGGCTACCTGTTCCTGGACATCATCACATACGTGGTCTTTGCTGTAACCTTCGTGCTTGGTGTTTTAGGAGGGCTGAACACAGAAACCAATGAGAAGGCTTTAGAAGCTGTGTTTGGCAAGTATGGAAGAATAGTGGAGGTGCTGGGGGGCCGGTCATGCGAGGAGCTGACGGCGGTACTTCCTCCACCTCAGCTTTTGGGCAGGAGATTTAACTTCTTCTCATACTCCTATGTGGCCGCAGGAAGTTCCGGGAATAACTATGACCTCATGGCCCAACCCATCACGCCCGGGCCCGACACAACCCCGTTACCAGTGACCGATACTAGTTCCGTGAGTACAGGCCACGCCACCAGCCTGCCTGTGACTGACGCTGGACTCAGGGTTACAGAGAGTAAGGGGCACAGCGATTCATGGCACCTGTCTTTGGATACGGCCATCAGGGTCAACACCCCTAAACTGGTGTCCGAGGTTGAGGAACTCAACAAAAGCATTACAGCGCTACGAGAAAAGCTACTGCAGATGGTGGAGGCCGACAGACCCGGAAACCTCTTCATTGGGGGCTTAAATACAGAGACTAATGAAGACAGCCCGGTCAAGGATGAAGTAGTGGTGAATGATCAGTGGGGACAGAACTGCAGCTGCCACCACGGCGGTTACGAGTTTCCGGACCTGCACCGCACCATCGTGTCTGAGTGTGACGTGTACCTCACCTACATGCTGCGCCAGGCCGCCCTTCAGCTGTTCTTTGATCTCTACCACTCCATTCCGTCAAGCTTCAGCCCCTTAGTCCTCAGCTGTTTAGTGCAGCCCTTGGAAGATGTGGAGGTCATGGAGAAGGACGGCACCACATTCTCCTGTGAAGTTTCTCATGACGAGGTTCCTCGGACATATGGACCCGTGTTTATGTGTCTGGGAGGACTGCTGACCATGGTGGCTGGAGCTGTTTGGCTGACAGTTGGACCCGGACCAGGCGCCAAATTTGTTGCTGCTTGGACACTGAAAGCTGCTGCTGGGCCCGGACCAGGCCAGTACATCAAGGCCAACTCTAAGTTTATCGGCATCACCGAATTGGGACCTGGACCCGGCTAGTAGTGAGTTTAAACTCCCATTTAAATGTGAGGGTTAATGCTTCGAGCAGACATGATAAGATACATTGATGAGTTTGGACAAACCACAACTAGAATGCAGTGAAAAAAATGCTTTATTTGTGAAATTTGTGATGCTATTGCTTTATTTGTAACCATTATAAGCTGCAATAAACAAGTTAACAACAACAATTGCATTCATTTTATGTTTCAGGTTCAGGGGGAGATGTGGGAGGTTTTTTAAAGCAAGTAAAACCTCTACAAATGTGGTAAAATAACTATAACGGTCCTAAGGTAGCGAGTGAGTAGTGTTCTGGGGCGGGGGAGGACCTGCATGAGGGCCAGAATAACTGAAATCTGTGCTTTTCTGTGTGTTGCAGCAGCATGAGCGGAAGCGGCTCCTTTGAGGGAGGGGTATTCAGCCCTTATCTGACGGGGCGTCTCCCCTCCTGGGCGGGAGTGCGTCAGAATGTGATGGGATCCACGGTGGACGGCCGGCCCGTGCAGCCCGCGAACTCTTCAACCCTGACCTATGCAACCCTGAGCTCTTCGTCGTTGGACGCAGCTGCCGCCGCAGCTGCTGCATCTGCCGCCAGCGCCGTGCGCGGAATGGCCATGGGCGCCGGCTACTACGGCACTCTGGTGGCCAACTCGAGTTCCACCAATAATCCCGCCAGCCTGAACGAGGAGAAGCTGTTGCTGCTGATGGCCCAGCTCGAGGCCTTGACCCAGCGCCTGGGCGAGCTGACCCAGCAGGTGGCTCAGCTGCAGGAGCAGACGCGGGCCGCGGTTGCCACGGTGAAATCCAAATAAAAAATGAATCAATAAATAAACGGAGACGGTTGTTGATTTTAACACAGAGTCTGAATCTTTATTTGATTTTTCGCGCGCGGTAGGCCCTGGACCACCGGTCTCGATCATTGAGCACCCGGTGGATCTTTTCCAGGACCCGGTAGAGGTGGGCTTGGATGTTGAGGTACATGGGCATGAGCCCGTCCCGGGGGTGGAGGTAGCTCCATTGCAGGGCCTCGTGCTCGGGGGTGGTGTTGTAAATCACCCAGTCATAGCAGGGGCGCAGGGCATGGTGTTGCACAATATCTTTGAGGAGGAGACTGATGGCCACGGGCAGCCCTTTGGTGTAGGTGTTTACAAATCTGTTGAGCTGGGAGGGATGCATGCGGGGGGAGATGAGGTGCATCTTGGCCTGGATCTTGAGATTGGCGATGTTACCGCCCAGATCCCGCCTGGGGTTCATGTTGTGCAGGACCACCAGCACGGTGTATCCGGTGCACTTGGGGAATTTATCATGCAACTTGGAAGGGAAGGCGTGAAAGAATTTGGCGACGCCTTTGTGCCCGCCCAGGTTTTCCATGCACTCATCCATGATGATGGCGATGGGCCCGTGGGCGGCGGCCTGGGCAAAGACGTTTCGGGGGTCGGACACATCATAGTTGTGGTCCTGGGTGAGGTCATCATAGGCCATTTTAATGAATTTGGGGCGGAGGGTGCCGGACTGGGGGACAAAGGTACCCTCGATCCCGGGGGCGTAGTTCCCCTCACAGATCTGCATCTCCCAGGCTTTGAGCTCGGAGGGGGGGATCATGTCCACCTGCGGGGCGATAAAGAACACGGTTTCCGGGGCGGGGGAGATGAGCTGGGCCGAAAGCAAGTTCCGGAGCAGCTGGGACTTGCCGCAGCCGGTGGGGCCGTAGATGACCCCGATGACCGGCTGCAGGTGGTAGTTGAGGGAGAGACAGCTGCCGTCCTCCCGGAGGAGGGGGGCCACCTCGTTCATCATCTCGCGCACGTGCATGTTCTCGCGCACCAGTTCCGCCAGGAGGCGCTCTCCCCCCAGGGATAGGAGCTCCTGGAGCGAGGCGAAGTTTTTCAGCGGCTTGAGTCCGTCGGCCATGGGCATTTTGGAGAGGGTTTGTTGCAAGAGTTCCAGGCGGTCCCAGAGCTCGGTGATGTGCTCTACGGCATCTCGATCCAGCAGACCTCCTCGTTTCGCGGGTTGGGACGGCTGCGGGAGTAGGGCACCAGACGATGGGCGTCCAGCGCAGCCAGGGTCCGGTCCTTCCAGGGTCGCAGCGTCCGCGTCAGGGTGGTCTCCGTCACGGTGAAGGGGTGCGCGCCGGGCTGGGCGCTTGCGAGGGTGCGCTTCAGGCTCATCCGGCTGGTCGAAAACCGCTCCCGATCGGCGCCCTGCGCGTCGGCCAGGTAGCAATTGACCATGAGTTCGTAGTTGAGCGCCTCGGCCGCGTGGCCTTTGGCGCGGAGCTTACCTTTGGAAGTCTGCCCGCAGGCGGGACAGAGGAGGGACTTGAGGGCGTAGAGCTTGGGGGCGAGGAAGACGGACTCGGGGGCGTAGGCGTCCGCGCCGCAGTGGGCGCAGACGGTCTCGCACTCCACGAGCCAGGTGAGGTCGGGCTGGTCGGGGTCAAAAACCAGTTTCCCGCCGTTCTTTTTGATGCGTTTCTTACCTTTGGTCTCCATGAGCTCGTGTCCCCGCTGGGTGACAAAGAGGCTGTCCGTGTCCCCGTAGACCGACTTTATGGGCCGGTCCTCGAGCGGTGTGCCGCGGTCCTCCTCGTAGAGGAACCCCGCCCACTCCGAGACGAAAGCCCGGGTCCAGGCCAGCACGAAGGAGGCCACGTGGGACGGGTAGCGGTCGTTGTCCACCAGCGGGTCCACCTTTTCCAGGGTATGCAAACACATGTCCCCCTCGTCCACATCCAGGAAGGTGATTGGCTTGTAAGTGTAGGCCACGTGACCGGGGGTCCCGGCCGGGGGGGTATAAAAGGGTGCGGGTCCCTGCTCGTCCTCACTGTCTTCCGGATCGCTGTCCAGGAGCGCCAGCTGTTGGGGTAGGTATTCCCTCTCGAAGGCGGGCATGACCTCGGCACTCAGGTTGTCAGTTTCTAGAAACGAGGAGGATTTGATATTGACGGTGCCGGCGGAGATGCCTTTCAAGAGCCCCTCGTCCATCTGGTCAGAAAAGACGATCTTTTTGTTGTCGAGCTTGGTGGCGAAGGAGCCGTAGAGGGCGTTGGAGAGGAGCTTGGCGATGGAGCGCATGGTCTGGTTTTTTTCCTTGTCGGCGCGCTCCTTGGCGGCGATGTTGAGCTGCACGTACTCGCGCGCCACGCACTTCCATTCGGGGAAGACGGTGGTCAGCTCGTCGGGCACGATTCTGACCTGCCAGCCCCGATTATGCAGGGTGATGAGGTCCACACTGGTGGCCACCTCGCCGCGCAGGGGCTCATTAGTCCAGCAGAGGCGTCCGCCCTTGCGCGAGCAGAAGGGGGGCAGGGGGTCCAGCATGACCTCGTCGGGGGGGTCGGCATCGATGGTGAAGATGCCGGGCAGGAGGTCGGGGTCAAAGTAGCTGATGGAAGTGGCCAGATCGTCCAGGGCAGCTTGCCATTCGCGCACGGCCAGCGCGCGCTCGTAGGGACTGAGGGGCGTGCCCCAGGGCATGGGATGGGTAAGCGCGGAGGCGTACATGCCGCAGATGTCGTAGACGTAGAGGGGCTCCTCGAGGATGCCGATGTAGGTGGGGTAGCAGCGCCCCCCGCGGATGCTGGCGCGCACGTAGTCATACAGCTCGTGCGAGGGGGCGAGGAGCCCCGGGCCCAGGTTGGTGCGACTGGGCTTTTCGGCGCGGTAGACGATCTGGCGGAAAATGGCATGCGAGTTGGAGGAGATGGTGGGCCTTTGGAAGATGTTGAAGTGGGCGTGGGGCAGTCCGACCGAGTCGCGGATGAAGTGGGCGTAGGAGTCTTGCAGCTTGGCGACGAGCTCGGCGGTGACTAGGACGTCCAGAGCGCAGTAGTCGAGGGTCTCCTGGATGATGTCATACTTGAGCTGTCCCTTTTGTTTCCACAGCTCGCGGTTGAGAAGGAACTCTTCGCGGTCCTTCCAGTACTCTTCGAGGGGGAACCCGTCCTGATCTGCACGGTAAGAGCCTAGCATGTAGAACTGGTTGACGGCCTTGTAGGCGCAGCAGCCCTTCTCCACGGGGAGGGCGTAGGCCTGGGCGGCCTTGCGCAGGGAGGTGTGCGTGAGGGCGAAAGTGTCCCTGACCATGACCTTGAGGAACTGGTGCTTGAAGTCGATATCGTCGCAGCCCCCCTGCTCCCAGAGCTGGAAGTCCGTGCGCTTCTTGTAGGCGGGGTTGGGCAAAGCGAAAGTAACATCGTTGAAGAGGATCTTGCCCGCGCGGGGCATAAAGTTGCGAGTGATGCGGAAAGGTTGGGGCACCTCGGCCCGGTTGTTGATGACCTGGGCGGCGAGCACGATCTCGTCGAAGCCGTTGATGTTGTGGCCCACGATGTAGAGTTCCACGAATCGCGGACGGCCCTTGACGTGGGGCAGTTTCTTGAGCTCCTCGTAGGTGAGCTCGTCGGGGTCGCTGAGCCCGTGCTGCTCGAGCGCCCAGTCGGCGAGATGGGGGTTGGCGCGGAGGAAGGAAGTCCAGAGATCCACGGCCAGGGCGGTTTGCAGACGGTCCCGGTACTGACGGAACTGCTGCCCGACGGCCATTTTTTCGGGGGTGACGCAGTAGAAGGTGCGGGGGTCCCCGTGCCAGCGATCCCATTTGAGCTGGAGGGCGAGATCGAGGGCGAGCTCGACGAGCCGGTCGTCCCCGGAGAGTTTCATGACCAGCATGAAGGGGACGAGCTGCTTGCCGAAGGACCCCATCCAGGTGTAGGTTTCCACATCGTAGGTGAGGAAGAGCCTTTCGGTGCGAGGATGCGAGCCGATGGGGAAGAACTGGATCTCCTGCCACCAATTGGAGGAATGGCTGTTGATGTGATGGAAGTAGAAATGCCGACGGCGCGCCGAACACTCGTGCTTGTGTTTATACAAGCGGCCACAGTGCTCGCAACGCTGCACGGGATGCACGTGCTGCACGAGCTGTACCTGAGTTCCTTTGACGAGGAATTTCAGTGGGAAGTGGAGTCGTGGCGCCTGCATCTCGTGCTGTACTACGTCGTGGTGGTCGGCCTGGCCCTCTTCTGCCTCGATGGTGGTCATGCTGACGAGCCCGCGCGGGAGGCAGGTCCAGACCTCGGCGCGAGCGGGTCGGAGAGCGAGGACGAGGGCGCGCAGGCCGGAGCTGTCCAGGGTCCTGAGACGCTGCGGAGTCAGGTCAGTGGGCAGCGGCGGCGCGCGGTTGACTTGCAGGAGTTTTTCCAGGGCGCGCGGGAGGTCCAGATGGTACTTGATCTCCACCGCGCCATTGGTGGCGACGTCGATGGCTTGCAGGGTCCCGTGCCCCTGGGGTGTGACCACCGTCCCCCGTTTCTTCTTGGGCGGCTGGGGCGACGGGGGCGGTGCCTCTTCCATGGTTAGAAGCGGCGGCGAGGACGCGCGCCGGGCGGCAGGGGCGGCTCGGGGCCCGGAGGCAGGGGCGGCAGGGGCACGTCGGCGCCGCGCGCGGGTAGGTTCTGGTACTGCGCCCGGAGAAGACTGGCGTGAGCGACGACGCGACGGTTGACGTCCTGGATCTGACGCCTCTGGGTGAAGGCCACGGGACCCGTGAGTTTGAACCTGAAAGAGAGTTCGACAGAATCAATCTCGGTATCGTTGACGGCGGCCTGCCGCAGGATCTCTTGCACGTCGCCCGAGTTGTCCTGGTAGGCGATCTCGGTCATGAACTGCTCGATCTCCTCCTCTTGAAGGTCTCCGCGGCCGGCGCGCTCCACGGTGGCCGCGAGGTCGTTGGAGATGCGGCCCATGAGCTGCGAGAAGGCGTTCATGCCCGCCTCGTTCCAGACGCGGCTGTAGACCACGACGCCCTCGGGATCGCGGGCGCGCATGACCACCTGGGCGAGGTTGAGCTCCACGTGGCGCGTGAAGACCGCGTAGTTGCAGAGGCGCTGGTAGAGGTAGTTGAGCGTGGTGGCGATGTGCTCGGTGACGAAGAAATACATGATCCAGCGGCGGAGCGGCATCTCGCTGACGTCGCCCAGCGCCTCCAAACGTTCCATGGCCTCGTAAAAGTCCACGGCGAAGTTGAAAAACTGGGAGTTGCGCGCCGAGACGGTCAACTCCTCCTCCAGAAGACGGATGAGCTCGGCGATGGTGGCGCGCACCTCGCGCTCGAAGGCCCCCGGGAGTTCCTCCACTTCCTCTTCTTCCTCCTCCACTAACATCTCTTCTACTTCCTCCTCAGGCGGCAGTGGTGGCGGGGGAGGGGGCCTGCGTCGCCGGCGGCGCACGGGCAGACGGTCGATGAAGCGCTCGATGGTCTCGCCGCGCCGGCGTCGCATGGTCTCGGTGACGGCGCGCCCGTCCTCGCGGGGCCGCAGCGTGAAGACGCCGCCGCGCATCTCCAGGTGGCCGGGGGGGTCCCCGTTGGGCAGGGAGAGGGCGCTGACGATGCATCTTATCAATTGCCCCGTAGGGACTCCGCGCAAGGACCTGAGCGTCTCGAGATCCACGGGATCTGAAAACCGCTGAACGAAGGCTTCGAGCCAGTCGCAGTCGCAAGGTAGGCTGAGCACGGTTTCTTCTGGCGGGTCATGTTGGTTGGGAGCGGGGCGGGCGATGCTGCTGGTGATGAAGTTGAAATAGGCGGTTCTGAGACGGCGGATGGTGGCGAGGAGCACCAGGTCTTTGGGCCCGGCTTGCTGGATGCGCAGACGGTCGGCCATGCCCCAGGCGTGGTCCTGACACCTGGCCAGGTCCTTGTAGTAGTCCTGCATGAGCCGCTCCACGGGCACCTCCTCCTCGCCCGCGCGGCCGTGCATGCGCGTGAGCCCGAAGCCGCGCTGGGGCTGGACGAGCGCCAGGTCGGCGACGACGCGCTCGGCGAGGATGGCTTGCTGGATCTGGGTGAGGGTGGTCTGGAAGTCATCAAAGTCGACGAAGCGGTGGTAGGCTCCGGTGTTGATGGTGTAGGAGCAGTTGGCCATGACGGACCAGTTGACGGTCTGGTGGCCCGGACGCACGAGCTCGTGGTACTTGAGGCGCGAGTAGGCGCGCGTGTCGAAGATGTAGTCGTTGCAGGTGCGCACCAGGTACTGGTAGCCGATGAGGAAGTGCGGCGGCGGCTGGCGGTAGAGCGGCCATCGCTCGGTGGCGGGGGCGCCGGGCGCGAGGTCCTCGAGCATGGTGCGGTGGTAGCCGTAGATGTACCTGGACATCCAGGTGATGCCGGCGGCGGTGGTGGAGGCGCGCGGGAACTCGCGGACGCGGTTCCAGATGTTGCGCAGCGGCAGGAAGTAGTTCATGGTGGGCACGGTCTGGCCCGTGAGGCGCGCGCAGTCGTGGATGCTCTATACGGGCAAAAACGAAAGCGGTCAGCGGCTCGACTCCGTGGCCTGGAGGCTAAGCGAACGGGTTGGGCTGCGCGTGTACCCCGGTTCGAATCTCGAATCAGGCTGGAGCCGCAGCTAACGTGGTATTGGCACTCCCGTCTCGACCCAAGCCTGCACCAACCCTCCAGGATACGGAGGCGGGTCGTTTTGCAACTTTTTTTTGGAGGCCGGATGAGACTAGTAAGCGCGGAAAGCGGCCGACCGCGATGGCTCGCTGCCGTAGTCTGGAGAAGAATCGCCAGGGTTGCGTTGCGGTGTGCCCCGGTTCGAGGCCGGCCGGATTCCGCGGCTAACGAGGGCGTGGCTGCCCCGTCGTTTCCAAGACCCCATAGCCAGCCGACTTCTCCAGTTACGGAGCGAGCCCCTCTTTTGTTTTGTTTGTTTTTGCCAGATGCATCCCGTACTGCGGCAGATGCGCCCCCACCACCCTCCACCGCAACAACAGCCCCCTCCACAGCCGGCGCTTCTGCCCCCGCCCCAGCAGCAACTTCCAGCCACGACCGCCGCGGCCGCCGTGAGCGGGGCTGGACAGAGTTATGATCACCAGCTGGCCTTGGAAGAGGGCGAGGGGCTGGCGCGCCTGGGGGCGTCGTCGCCGGAGCGGCACCCGCGCGTGCAGATGAAAAGGGACGCTCGCGAGGCCTACGTGCCCAAGCAGAACCTGTTCAGAGACAGGAGCGGCGAGGAGCCCGAGGAGATGCGCGCGGCCCGGTTCCACGCGGGGCGGGAGCTGCGGCGCGGCCTGGACCGAAAGAGGGTGCTGAGGGACGAGGATTTCGAGGCGGACGAGCTGACGGGGATCAGCCCCGCGCGCGCGCACGTGGCCGCGGCCAACCTGGTCACGGCGTACGAGCAGACCGTGAAGGAGGAGAGCAACTTCCAAAAATCCTTCAACAACCACGTGCGCACCCTGATCGCGCGCGAGGAGGTGACCCTGGGCCTGATGCACCTGTGGGACCTGCTGGAGGCCATCGTGCAGAACCCCACCAGCAAGCCGCTGACGGCGCAGCTGTTCCTGGTGGTGCAGCATAGTCGGGACAACGAAGCGTTCAGGGAGGCGCTGCTGAATATCACCGAGCCCGAGGGCCGCTGGCTCCTGGACCTGGTGAACATTCTGCAGAGCATCGTGGTGCAGGAGCGCGGGCTGCCGCTGTCCGAGAAGCTGGCGGCCATCAACTTCTCGGTGCTGAGTTTGGGCAAGTACTACGCTAGGAAGATCTACAAGACCCCGTACGTGCCCATAGACAAGGAGGTGAAGATCGACGGGTTTTACATGCGCATGACCCTGAAAGTGCTGACCCTGAGCGACGATCTGGGGGTGTACCGCAACGACAGGATGCACCGTGCGGTGAGCGCCAGCAGGCGGCGCGAGCTGAGCGACCAGGAGCTGATGCATAGTCTGCAGCGGGCCCTGACCGGGGCCGGGACCGAGGGGGAGAGCTACTTTGACATGGGCGCGGACCTGCACTGGCAGCCCAGCCGCCGGGCCTTGGAGGCGGCGGCAGGACCCTACGTAGAAGAGGTGGACGATGAGGTGGACGAGGAGGGCGAGTACCTGGAAGACTGATGGCGCGACCGTATTTTTGCTAGATGCAACAACAACAGCCACCTCCTGATCCCGCGATGCGGGCGGCGCTGCAGAGCCAGCCGTCCGGCATTAACTCCTCGGACGATTGGACCCAGGCCATGCAACGCATCATGGCGCTGACGACCCGCAACCCCGAAGCCTTTAGACAGCAGCCCCAGGCCAACCGGCTCTCGGCCATCCTGGAGGCCGTGGTGCCCTCGCGCTCCAACCCCACGCACGAGAAGGTCCTGGCCATCGTGAACGCGCTGGTGGAGAACAAGGCCATCCGCGGCGACGAGGCCGGCCTGGTGTACAACGCGCTGCTGGAGCGCGTGGCCCGCTACAACAGCACCAACGTGCAGACCAACCTGGACCGCATGGTGACCGACGTGCGCGAGGCCGTGGCCCAGCGCGAGCGGTTCCACCGCGAGTCCAACCTGGGATCCATGGTGGCGCTGAACGCCTTCCTCAGCACCCAGCCCGCCAACGTGCCCCGGGGCCAGGAGGACTACACCAACTTCATCAGCGCCCTGCGCCTGATGGTGACCGAGGTGCCCCAGAGCGAGGTGTACCAGTCCGGGCCGGACTACTTCTTCCAGACCAGTCGCCAGGGCTTGCAGACCGTGAACCTGAGCCAGGCTTTCAAGAACTTGCAGGGCCTGTGGGGCGTGCAGGCCCCGGTCGGGGACCGCGCGACGGTGTCGAGCCTGCTGACGCCGAACTCGCGCCTGCTGCTGCTGCTGGTGGCCCCCTTCACGGACAGCGGCAGCATCAACCGCAACTCGTACCTGGGCTACCTGATTAACCTGTACCGCGAGGCCATCGGCCAGGCGCACGTGGACGAGCAGACCTACCAGGAGATCACCCACGTGAGCCGCGCCCTGGGCCAGGACGACCCGGGCAACCTGGAAGCCACCCTGAACTTTTTGCTGACCAACCGGTCGCAGAAGATCCCGCCCCAGTACGCGCTCAGCACCGAGGAGGAGCGCATCCTGCGTTACGTGCAGCAGAGCGTGGGCCTGTTCCTGATGCAGGAGGGGGCCACCCCCAGCGCCGCGCTCGACATGACCGCGCGCAACATGGAGCCCAGCATGTACGCCAGCAACCGCCCGTTCATCAATAAACTGATGGACTACTTGCATCGGGCGGCCGCCATGAACTCTGACTATTTCACCAACGCCATCCTGAATCCCCACTGGCTCCCGCCGCCGGGGTTCTACACGGGCGAGTACGACATGCCCGACCCCAATGACGGGTTCCTGTGGGACGATGTGGACAGCAGCGTGTTCTCCCCCCGACCGGGTGCTAACGAGCGCCCCTTGTGGAAGAAGGAAGGCAGCGACCGACGCCCGTCCTCGGCGCTGTCCGGCCGCGAGGGTGCTGCCGCGGCGGTGCCCGAGGCCGCCAGTCCTTTCCCGAGCTTGCCCTTCTCGCTGAACAGTATCCGCAGCAGCGAGCTGGGCAGGATCACGCGCCCGCGCTTGCTGGGCGAAGAGGAGTACTTGAATGACTCGCTGTTGAGACCCGAGCGGGAGAAGAACTTCCCCAATAACGGGATAGAAAGCCTGGTGGACAAGATGAGCCGCTGGAAGACGTATGCGCAGGAGCACAGGGACGATCCCCGGGCGTCGCAGGGGGCCACGAGCCGGGGCAGCGCCGCCCGTAAACGCCGGTGGCACGACAGGCAGCGGGGACAGATGTGGGACGATGAGGACTCCGCCGACGACAGCAGCGTGTTGGACTTGGGTGGGAGTGGTAACCCGTTCGCTCACCTGCGCCCCCGTATCGGGCGCATGATGTAAGAGAAACCGAAAATAAATGATACTCACCAAGGCCATGGCGACCAGCGTGCGTTCGTTTCTTCTCTGTTGTTGTTGTATCTAGTATGATGAGGCGTGCGTACCCGGAGGGTCCTCCTCCCTCGTACGAGAGCGTGATGCAGCAGGCGATGGCGGCGGCGGCGATGCAGCCCCCGCTGGAGGCTCCTTACGTGCCCCCGCGGTACCTGGCGCCTACGGAGGGGCGGAACAGCATTCGTTACTCGGAGCTGGCACCCTTGTACGATACCACCCGGTTGTACCTGGTGGACAACAAGTCGGCGGACATCGCCTCGCTGAACTACCAGAACGACCACAGCAACTTCCTGACCACCGTGGTGCAGAACAATGACTTCACCCCCACGGAGGCCAGCACCCAGACCATCAACTTTGACGAGCGCTCGCGGTGGGGCGGCCAGCTGAAAACCATCATGCACACCAACATGCCCAACGTGAACGAGTTCATGTACAGCAACAAGTTCAAGGCGCGGGTGATGGTCTCCCGCAAGACCCCCAATGGGGTGACAGTGACAGAGGATTATGATGGTAGTCAGGATGAGCTGAAGTATGAATGGGTGGAATTTGAGCTGCCCGAAGGCAACTTCTCGGTGACCATGACCATCGACCTGATGAACAACGCCATCATCGACAATTACTTGGCGGTGGGGCGGCAGAACGGGGTGCTGGAGAGCGACATCGGCGTGAAGTTCGACACTAGGAACTTCAGGCTGGGCTGGGACCCCGTGACCGAGCTGGTCATGCCCGGGGTGTACACCAACGAGGCTTTCCATCCCGATATTGTCTTGCTGCCCGGCTGCGGGGTGGACTTCACCGAGAGCCGCCTCAGCAACCTGCTGGGCATTCGCAAGAGGCAGCCCTTCCAGGAAGGCTTCCAGATCATGTACGAGGATCTGGAGGGGGGCAACATCCCCGCGCTCCTGGATGTCGACGCCTATGAGAAAAGCAAGGAGGATGCAGCAGCTGAAGCAACTGCAGCCGTAGCTACCGCCTCTACCGAGGTCAGGGGCGATAATTTTGCAAGCGCCGCAGCAGTGGCAGCGGCCGAGGCGGCTGAAACCGAAAGTAAGATAGTCATTCAGCCGGTGGAGAAGGATAGCAAGAACAGGAGCTACAACGTACTACCGGACAAGATAAACACCGCCTACCGCAGCTGGTACCTAGCCTACAACTATGGCGACCCCGAGAAGGGCGTGCGCTCCTGGACGCTGCTCACCACCTCGGACGTCACCTGCGGCGTGGAGCAAGTCTACTGGTCGCTGCCCGACATGATGCAAGACCCGGTCACCTTCCGCTCCACGCGTCAAGTTAGCAACTACCCGGTGGTGGGCGCCGAGCTCCTGCCCGTCTACTCCAAGAGCTTCTTCAACGAGCAGGCCGTCTACTCGCAGCAGCTGCGCGCCTTCACCTCGCTTACGCACGTCTTCAACCGCTTCCCCGAGAACCAGATCCTCGTCCGCCCGCCCGCGCCCACCATTACCACCGTCAGTGAAAACGTTCCTGCTCTCACAGATCACGGGACCCTGCCGCTGCGCAGCAGTATCCGGGGAGTCCAGCGCGTGACCGTTACTGACGCCAGACGCCGCACCTGCCCCTACGTCTACAAGGCCCTGGGCATAGTCGCGCCGCGCGTCCTCTCGAGCCGCACCTTCTAAATGTCCATTCTCATCTCGCCCAGTAATAACACCGGTTGGGGCCTGCGCGCGCCCAGCAAGATGTACGGAGGCGCTCGCCAACGCTCCACGCAACACCCCGTGCGCGTGCGCGGGCACTTCCGCGCTCCCTGGGGCGCCCTCAAGGGCCGCGTGCGGTCGCGCACCACCGTCGACGACGTGATCGACCAGGTGGTGGCCGACGCGCGCAACTACACCCCCGCCGCCGCGCCCGTCTCCACCGTGGACGCCGTCATCGACAGCGTGGTGGCCGACGCGCGCCGGTACGCCCGCGCCAAGAGCCGGCGGCGGCGCATCGCCCGGCGGCACCGGAGCACCCCCGCCATGCGCGCGGCGCGAGCCTTGCTGCGCAGGGCCAGGCGCACGGGACGCAGGGCCATGCTCAGGGCGGCCAGACGCGCGGCTTCAGGCGCCAGCGCCGGCAGGACCCGGAGACGCGCGGCCACGGCGGCGGCAGCGGCCATCGCCAGCATGTCCCGCCCGCGGCGAGGGAACGTGTACTGGGTGCGCGACGCCGCCACCGGTGTGCGCGTGCCCGTGCGCACCCGCCCCCCTCGCACTTGAAGATGTTCACTTCGCGATGTTGATGTGTCCCAGCGGCGAGGAGGATGTCCAAGCGCAAATTCAAGGAAGAGATGCTCCAGGTCATCGCGCCTGAGATCTACGGCCCTGCGGTGGTGAAGGAGGAAAGAAAGCCCCGCAAAATCAAGCGGGTCAAAAAGGACAAAAAGGAAGAAGAAAGTGATGTGGACGGATTGGTGGAGTTTGTGCGCGAGTTCGCCCCCCGGCGGCGCGTGCAGTGGCGCGGGCGGAAGGTGCAACCGGTGCTGAGACCCGGCACCACCGTGGTCTTCACGCCCGGCGAGCGCTCCGGCACCGCTTCCAAGCGCTCCTACGACGAGGTGTACGGGGATGATGATATTCTGGAGCAGGCGGCCGAGCGCCTGGGCGAGTTTGCTTACGGCAAGCGCAGCCGTTCCGCACCGAAGGAAGAGGCGGTGTCCATCCCGCTGGACCACGGCAACCCCACGCCGAGCCTCAAGCCCGTGACCTTGCAGCAGGTGCTGCCGACCGCGGCGCCGCGCCGGGGGTTCAAGCGCGAGGGCGAGGATCTGTACCCCACCATGCAGCTGATGGTGCCCAAGCGCCAGAAGCTGGAAGACGTGCTGGAGACCATGAAGGTGGACCCGGACGTGCAGCCCGAGGTCAAGGTGCGGCCCATCAAGCAGGTGGCCCCGGGCCTGGGCGTGCAGACCGTGGACATCAAGATTCCCACGGAGCCCATGGAAACGCAGACCGAGCCCATGATCAAGCCCAGCACCAGCACCATGGAGGTGCAGACGGATCCCTGGATGCCATCGGCTCCTAGTCGAAGACCCCGGCGCAAGTACGGCGCGGCCAGCCTGCTGATGCCCAACTACGCGCTGCATCCTTCCATCATCCCCACGCCGGGCTACCGCGGCACGCGCTTCTACCGCGGTCATACCAGCAGCCGCCGCCGCAAGACCACCACTCGCCGCCGCCGTCGCCGCACCGCCGCTGCAACCACCCCTGCCGCCCTGGTGCGGAGAGTGTACCGCCGCGGCCGCGCACCTCTGACCCTGCCGCGCGCGCGCTACCACCCGAGCATCGCCATTTAAACTTTCGCCTGCTTTGCAGATCAATGGCCCTCACATGCCGCCTTCGCGTTCCCATTACGGGCTACCGAGGAAGAAAACCGCGCCGTAGAAGGCTGGCGGGGAACGGGATGCGTCGCCACCACCACCGGCGGCGGCGCGCCATCAGCAAGCGGTTGGGGGGAGGCTTCCTGCCCGCGCTGATCCCCATCATCGCCGCGGCGATCGGGGCGATCCCCGGCATTGCTTCCGTGGCGGTGCAGGCCTCTCAGCGCCACTGAGACACACTTGGAAACATCTTGTAATAAACCAATGGACTCTGACGCTCCTGGTCCTGTGATGTGTTTTCGTAGACAGATGGAAGACATCAATTTTTCGTCCCTGGCTCCGCGACACGGCACGCGGCCGTTCATGGGCACCTGGAGCGACATCGGCACCAGCCAACTGAACGGGGGCGCCTTCAATTGGAGCAGTCTCTGGAGCGGGCTTAAGAATTTCGGGTCCACGCTTAAAACCTATGGCAGCAAGGCGTGGAACAGCACCACAGGGCAGGCGCTGAGGGATAAGCTGAAAGAGCAGAACTTCCAGCAGAAGGTGGTCGATGGGCTCGCCTCGGGCATCAACGGGGTGGTGGACCTGGCCAACCAGGCCGTGCAGCGGCAGATCAACAGCCGCCTGGACCCGGTGCCGCCCGCCGGCTCCGTGGAGATGCCGCAGGTGGAGGAGGAGCTGCCTCCCCTGGACAAGCGGGGCGAGAAGCGACCCCGCCCCGATGCGGAGGAGACGCTGCTGACGCACACGGACGAGCCGCCCCCGTACGAGGAGGCGGTGAAACTGGGTCTGCCCACCACGCGGCCCATCGCGCCCCTGGCCACCGGGGTGCTGAAACCCGAAAAGCCCGCGACCCTGGACTTGCCTCCTCCCCAGCCTTCCCGCCCCTCTACAGTGGCTAAGCCCCTGCCGCCGGTGGCCGTGGCCCGCGCGCGACCCGGGGGCACCGCCCGCCCTCATGCGAACTGGCAGAGCACTCTGAACAGCATCGTGGGTCTGGGAGTGCAGAGTGTGAAGCGCCGCCGCTGCTATTAAACCTACCGTAGCGCTTAACTTGCTTGTCTGTGTGTGTATGTATTATGTCGCCGCCGCCGCTGTCCACCAGAAGGAGGAGTGAAGAGGCGCGTCGCCGAGTTGCAAGATGGCCACCCCATCGATGCTGCCCCAGTGGGCGTACATGCACATCGCCGGACAGGACGCTTCGGAGTACCTGAGTCCGGGTCTGGTGCAGTTTGCCCGCGCCACAGACACCTACTTCAGTCTGGGGAACAAGTTTAGGAACCCCACGGTGGCGCCCACGCACGATGTGACCACCGACCGCAGCCAGCGGCTGACGCTGCGCTTCGTGCCCGTGGACCGCGAGGACAACACCTACTCGTACAAAGTGCGCTACACGCTGGCCGTGGGCGACAACCGCGTGCTGGACATGGCCAGCACCTACTTTGACATCCGCGGCGTGCTGGATCGGGGCCCTAGCTTCAAACCCTACTCCGGCACCGCCTACAACAGTCTGGCCCCCAAGGGAGCACCCAACACTTGTCAGTGGACATATAAAGCCGATGGTGAAACTGCCACAGAAAAAACCTATACATATGGAAATGCACCCGTGCAGGGCATTAACATCACAAAAGATGGTATTCAACTTGGAACTGACACCGATGATCAGCCAATCTACGCAGATAAAACCTATCAGCCTGAACCTCAAGTGGGTGATGCTGAATGGCATGACATCACTGGTACTGATGAAAAGTATGGAGGCAGAGCTCTTAAGCCTGATACCAAAATGAAGCCTTGTTATGGTTCTTTTGCCAAGCCTACTAATAAAGAAGGAGGTCAGGCAAATGTGAAAACAGGAACAGGCACTACTAAAGAATATGACATAGACATGGCTTTCTTTGACAACAGAAGTGCGGCTGCTGCTGGCCTAGCTCCAGAAATTGTTTTGTATACTGAAAATGTGGATTTGGAAACTCCAGATACCCATATTGTATACAAAGCAGGCACAGATGACAGCAGCTCTTCTATTAATTTGGGTCAGCAAGCCATGCCCAACAGACCTAACTACATTGGTTTCAGAGACAACTTTATCGGGCTCATGTACTACAACAGCACTGGCAATATGGGGGTGCTGGCCGGTCAGGCTTCTCAGCTGAATGCTGTGGTTGACTTGCAAGACAGAAACACCGAGCTGTCCTACCAGCTCTTGCTTGACTCTCTGGGTGACAGAACCCGGTATTTCAGTATGTGGAATCAGGCGGTGGACAGCTATGATCCTGATGTGCGCATTATTGAAAATCATGGTGTGGAGGATGAACTTCCCAACTATTGTTTCCCTCTGGATGCTGTTGGCAGAACAGATACTTATCAGGGAATTAAGGCTAATGGAACTGATCAAACCACATGGACCAAAGATGACAGTGTCAATGATGCTAATGAGATAGGCAAGGGTAATCCATTCGCCATGGAAATCAACATCCAAGCCAACCTGTGGAGGAACTTCCTCTACGCCAACGTGGCCCTGTACCTGCCCGACTCTTACAAGTACACGCCGGCCAATGTTACCCTGCCCACCAACACCAACACCTACGATTACATGAACGGCCGGGTGGTGGCGCCCTCGCTGGTGGACTCCTACATCAACATCGGGGCGCGCTGGTCGCTGGATCCCATGGACAACGTGAACCCCTTCAACCACCACCGCAATGCGGGGCTGCGCTACCGCTCCATGCTCCTGGGCAACGGGCGCTACGTGCCCTTCCACATCCAGGTGCCCCAGAAATTTTTCGCCATCAAGAGCCTCCTGCTCCTGCCCGGGTCCTACACCTACGAGTGGAACTTCCGCAAGGACGTCAACATGATCCTGCAGAGCTCCCTCGGCAACGACCTGCGCACGGACGGGGCCTCCATCTCCTTCACCAGCATCAACCTCTACGCCACCTTCTTCCCCATGGCGCACAACACGGCCTCCACGCTCGAGGCCATGCTGCGCAACGACACCAACGACCAGTCCTTCAACGACTACCTCTCGGCGGCCAACATGCTCTACCCCATCCCGGCCAACGCCACCAACGTGCCCATCTCCATCCCCTCGCGCAACTGGGCCGCCTTCCGCGGCTGGTCCTTCACGCGTCTCAAGACCAAGGAGACGCCCTCGCTGGGCTCCGGGTTCGACCCCTACTTCGTCTACTCGGGCTCCATCCCCTACCTCGACGGCACCTTCTACCTCAACCACACCTTCAAGAAGGTCTCCATCACCTTCGACTCCTCCGTCAGCTGGCCCGGCAACGACCGGCTCCTGACGCCCAACGAGTTCGAAATCAAGCGCACCGTCGACGGCGAGGGCTACAACGTGGCCCAGTGCAACATGACCAAGGACTGGTTCCTGGTCCAGATGCTGGCCCACTACAACATCGGCTACCAGGGCTTCTACGTGCCCGAGGGCTACAAGGACCGCATGTACTCCTTCTTCCGCAACTTCCAGCCCATGAGCCGCCAGGTGGTGGACGAGGTCAACTACAAGGACTACCAGGCCGTCACCCTGGCCTACCAGCACAACAACTCGGGCTTCGTCGGCTACCTCGCGCCCACCATGCGCCAGGGCCAGCCCTACCCCGCCAACTACCCCTACCCGCTCATCGGCAAGAGCGCCGTCACCAGCGTCACCCAGAAAAAGTTCCTCTGCGACAGGGTCATGTGGCGCATCCCCTTCTCCAGCAACTTCATGTCCATGGGCGCGCTCACCGACCTCGGCCAGAACATGCTCTATGCCAACTCCGCCCACGCGCTAGACATGAATTTCGAAGTCGACCCCATGGATGAGTCCACCCTTCTCTATGTTGTCTTCGAAGTCTTCGACGTCGTCCGAGTGCACCAGCCCCACCGCGGCGTCATCGAGGCCGTCTACCTGCGCACCCCCTTCTCGGCCGGTAACGCCACCACCTAAGCTCTTGCTTCTTGCAAGCCATGGCCGCGGGCTCCGGCGAGCAGGAGCTCAGGGCCATCATCCGCGACCTGGGCTGCGGGCCCTACTTCCTGGGCACCTTCGATAAGCGCTTCCCGGGATTCATGGCCCCGCACAAGCTGGCCTGCGCCATCGTCAACACGGCCGGCCGCGAGACCGGGGGCGAGCACTGGCTGGCCTTCGCCTGGAACCCGCGCTCGAACACCTGCTACCTCTTCGACCCCTTCGGGTTCTCGGACGAGCGCCTCAAGCAGATCTACCAGTTCGAGTACGAGGGCCTGCTGCGCCGCAGCGCCCTGGCCACCGAGGACCGCTGCGTCACCCTGGAAAAGTCCACCCAGACCGTGCAGGGTCCGCGCTCGGCCGCCTGCGGGCTCTTCTGCTGCATGTTCCTGCACGCCTTCGTGCACTGGCCCGACCGCCCCATGGACAAGAACCCCACCATGAACTTGCTGACGGGGGTGCCCAACGGCATGCTCCAGTCGCCCCAGGTGGAACCCACCCTGCGCCGCAACCAGGAGGCGCTCTACCGCTTCCTCAACTCCCACTCCGCCTACTTTCGCTCCCACCGCGCGCGCATCGAGAAGGCCACCGCCTTCGACCGCATGAATCAAGACATGTAAACCGTGTGTGTATGTTAAATGTCTTTAATAAACAGCACTTTCATGTTACACATGCATCTGAGATGATTTATTTAGAAATCGAAAGGGTTCTGCCGGGTCTCGGCATGGCCCGCGGGCAGGGACACGTTGCGGAACTGGTACTTGGCCAGCCACTTGAACTCGGGGATCAGCAGTTTGGGCAGCGGGGTGTCGGGGAAGGAGTCGGTCCACAGCTTCCGCGTCAGTTGCAGGGCGCCCAGCAGGTCGGGCGCGGAGATCTTGAAATCGCAGTTGGGACCCGCGTTCTGCGCGCGGGAGTTGCGGTACACGGGGTTGCAGCACTGGAACACCATCAGGGCCGGGTGCTTCACGCTCGCCAGCACCGTCGCGTCGGTGATGCTCTCCACGTCGAGGTCCTCGGCGTTGGCCATCCCGAAGGGGGTCATCTTGCAGGTCTGCCTTCCCATGGTGGGCACGCACCCGGGCTTGTGGTTGCAATCGCAGTGCAGGGGGATCAGCATCATCTGGGCCTGGTCGGCGTTCATCCCCGGGTACATGGCCTTCATGAAAGCCTCCAATTGCCTGAACGCCTGCTGGGCCTTGGCTCCCTCGGTGAAGAAGACCCCGCAGGACTTGCTAGAGAACTGGTTGGTGGCGCACCCGGCGTCGTGCACGCAGCAGCGCGCGTCGTTGTTGGCCAGCTGCACCACGCTGCGCCCCCAGCGGTTCTGGGTGATCTTGGCCCGGTCGGGGTTCTCCTTCAGCGCGCGCTGCCCGTTCTCGCTCGCCACATCCATCTCGATCATGTGCTCCTTCTGGATCATGGTGGTCCCGTGCAGGCACCGCAGCTTGCCCTCGGCCTCGGTGCACCCGTGCAGCCACAGCGCGCACCCGGTGCACTCCCAGTTCTTGTGGGCGATCTGGGAATGCGCGTGCACGAAGCCCTGCAGGAAGCGGCCCATCATGGTGGTCAGGGTCTTGTTGCTAGTGAAGGTCAGCGGAATGCCGCGGTGCTCCTCGTTGATGTACAGGTGGCAGATGCGGCGGTACACCTCGCCCTGCTCGGGCATCAGCTGGAAGTTGGCTTTCAGGTCGGTCTCCACGCGGTAGCGGTCCATCAGCATAGTCATGATTTCCATACCCTTCTCCCAGGCCGAGACGATGGGCAGGCTCATAGGGTTCTTCACCATCATCTTAGCGCTAGCAGCCGCGGCCAGGGGGTCGCTCTCGTCCAGGGTCTCAAAGCTCCGCTTGCCGTCCTTCTCGGTGATCCGCACCGGGGGGTAGCTGAAGCCCACGGCCGCCAGCTCCTCCTCGGCCTGTCTTTCGTCCTCGCTGTCCTGGCTGACGTCCTGCAGGACCACATGCTTGGTCTTGCGGGGTTTCTTCTTGGGCGGCAGCGGCGGCGGAGATGTTGGAGATGGCGAGGGGGAGCGCGAGTTCTCGCTCACCACTACTATCTCTTCCTCTTCTTGGTCCGAGGCCACGCGGCGGTAGGTATGTCTCTTCGGGGGCAGAGGCGGAGGCGACGGGCTCTCGCCGCCGCGACTTGGCGGATGGCTGGCAGAGCCCCTTCCGCGTTCGGGGGTGCGCTCCCGGCGGCGCTCTGACTGACTTCCTCCGCGGCCGGCCATTGTGTTCTCCTAGGGAGGAACAACAAGCATGGAGACTCAGCCATCGCCAACCTCGCCATCTGCCCCCACCGCCGACGAGAAGCAGCAGCAGCAGAATGAAAGCTTAACCGCCCCGCCGCCCAGCCCCGCCACCTCCGACGCGGCCGTCCCAGACATGCAAGAGATGGAGGAATCCATCGAGATTGACCTGGGCTATGTGACGCCCGCGGAGCACGAGGAGGAGCTGGCAGTGCGCTTTTCACAAGAAGAGATACACCAAGAACAGCCAGAGCAGGAAGCAGAGAATGAGCAGAGTCAGGCTGGGCTCGAGCATGACGGCGACTACCTCCACCTGAGCGGGGGGGAGGACGCGCTCATCAAGCATCTGGCCCGGCAGGCCACCATCGTCAAGGATGCGCTGCTCGACCGCACCGAGGTGCCCCTCAGCGTGGAGGAGCTCAGCCGCGCCTACGAGTTGAACCTCTTCTCGCCGCGCGTGCCCCCCAAGCGCCAGCCCAATGGCACCTGCGAGCCCAACCCGCGCCTCAACTTCTACCCGGTCTTCGCGGTGCCCGAGGCCCTGGCCACCTACCACATCTTTTTCAAGAACCAAAAGATCCCCGTCTCCTGCCGCGCCAACCGCACCCGCGCCGACGCCCTTTTCAACCTGGGTCCCGGCGCCCGCCTACCTGATATCGCCTCCTTGGAAGAGGTTCCCAAGATCTTCGAGGGTCTGGGCAGCGACGAGACTCGGGCCGCGAACGCTCTGCAAGGAGAAGGAGGAGAGCATGAGCACCACAGCGCCCTGGTCGAGTTGGAAGGCGACAACGCGCGGCTGGCGGTGCTCAAACGCACGGTCGAGCTGACCCATTTCGCCTACCCGGCTCTGAACCTGCCCCCCAAAGTCATGAGCGCGGTCATGGACCAGGTGCTCATCAAGCGCGCGTCGCCCATCTCCGAGGACGAGGGCATGCAAGACTCCGAGGAGGGCAAGCCCGTGGTCAGCGACGAGCAGCTGGCCCGGTGGCTGGGTCCTAATGCTAGTCCCCAGAGTTTGGAAGAGCGGCGCAAACTCATGATGGCCGTGGTCCTGGTGACCGTGGAGCTGGAGTGCCTGCGCCGCTTCTTCGCCGACGCGGAGACCCTGCGCAAGGTCGAGGAGAACCTGCACTACCTCTTCAGGCACGGGTTCGTGCGCCAGGCCTGCAAGATCTCCAACGTGGAGCTGACCAACCTGGTCTCCTACATGGGCATCTTGCACGAGAACCGCCTGGGGCAGAACGTGCTGCACACCACCCTGCGCGGGGAGGCCCGGCGCGACTACATCCGCGACTGCGTCTACCTCTACCTCTGCCACACCTGGCAGACGGGCATGGGCGTGTGGCAGCAGTGTCTGGAGGAGCAGAACCTGAAAGAGCTCTGCAAGCTCCTGCAGAAGAACCTCAAGGGTCTGTGGACCGGGTTCGACGAGCGCACCACCGCCTCGGACCTGGCCGACCTCATTTTCCCCGAGCGCCTCAGGCTGACGCTGCGCAACGGCCTGCCCGACTTTATGAGCCAAAGCATGTTGCAAAACTTTCGCTCTTTCATCCTCGAACGCTCCGGAATCCTGCCCGCCACCTGCTCCGCGCTGCCCTCGGACTTCGTGCCGCTGACCTTCCGCGAGTGCCCCCCGCCGCTGTGGAGCCACTGCTACCTGCTGCGCCTGGCCAACTACCTGGCCTACCACTCGGACGTGATCGAGGACGTCAGCGGCGAGGGCCTGCTCGAGTGCCACTGCCGCTGCAACCTCTGCACGCCGCACCGCTCCCTGGCCTGCAACCCCCAGCTGCTGAGCGAGACCCAGATCATCGGCACCTTCGAGTTGCAAGGGCCCAGCGAAGGCGAGGGTTCAGCCGCCAAGGGGGGTCTGAAACTCACCCCGGGGCTGTGGACCTCGGCCTACTTGCGCAAGTTCGTGCCCGAGGACTACCATCCCTTCGAGATCAGGTTCTACGAGGACCAATCCCATCCGCCCAAGGCCGAGCTGTCGGCCTGCGTCATCACCCAGGGGGCGATCCTGGCCCAATTGCAAGCCATCCAGAAATCCCGCCAAGAATTCTTGCTGAAAAAGGGCCGCGGGGTCTACCTCGACCCCCAGACCGGTGAGGAGCTCAACCCCGGCTTCCCCCAGGATGCCCCGAGGAAACAAGAAGCTGAAAGTGGAGCTGCCGCCCGTGGAGGATTTGGAGGAAGACTGGGAGAACAGCAGTCAGGCAGAGGAGGAGGAGATGGAGGAAGACTGGGACAGCACTCAGGCAGAGGAGGACAGCCTGCAAGACAGTCTGGAGGAAGACGAGGAGGAGGCAGAGGAGGAGGTGGAAGAAGCAGCCGCCGCCAGACCGTCGTCCTCGGCGGGGGAGAAAGCAAGCAGCACGGATACCATCTCCGCTCCGGGTCGGGGTCCCGCTCGACCACACAGTAGATGGGACGAGACCGGACGATTCCCGAACCCCACCACCCAGACCGGTAAGAAGGAGCGGCAGGGATACAAGTCCTGGCGGGGGCACAAAAACGCCATCGTCTCCTGCTTGCAGGCCTGCGGGGGCAACATCTCCTTCACCCGGCGCTACCTGCTCTTCCACCGCGGGGTGAACTTTCCCCGCAACATCTTGCATTACTACCGTCACCTCCACAGCCCCTACTACTTCCAAGAAGAGGCAGCAGCAGCAGAAAAAGACCAGCAGAAAACCAGCAGCTAGAAAATCCACAGCGGCGGCAGCAGGTGGACTGAGGATCGCGGCGAACGAGCCGGCGCAAACCCGGGAGCTGAGGAACCGGATCTTTCCCACCCTCTATGCCATCTTCCAGCAGAGTCGGGGGCAGGAGCAGGAACTGAAAGTCAAGAACCGTTCTCTGCGCTCGCTCACCCGCAGTTGTCTGTATCACAAGAGCGAAGACCAACTTCAGCGCACTCTCGAGGACGCCGAGGCTCTCTTCAACAAGTACTGCGCGCTCACTCTTAAAGAGTAGCCCGCGCCCGCCCAGTCGCAGAAAAAGGCGGGAATTACGTCACCTGTGCCCTTCGCCCTAGCCGCCTCCACCCATCATCATGAGCAAAGAGATTCCCACGCCTTACATGTGGAGCTACCAGCCCCAGATGGGCCTGGCCGCCGGTGCCGCCCAGGACTACTCCACCCGCATGAATTGGCTCAGCGCCGGGCCCGCGATGATCTCACGGGTGAATGACATCCGCGCCCACCGAAACCAGATACTCCTAGAACAGTCAGCGCTCACCGCCACGCCCCGCAATCACCTCAATCCGCGTAATTGGCCCGCCGCCCTGGTGTACCAGGAAATTCCCCAGCCCACGACCGTACTACTTCCGCGAGACGCCCAGGCCGAAGTCCAGCTGACTAACTCAGGTGTCCAGCTGGCGGGCGGCGCCACCCTGTGTCGTCACCGCCCCGCTCAGGGTATAAAGCGGCTGGTGATCCGGGGCAGAGGCACACAGCTCAACGACGAGGTGGTGAGCTCTTCGCTGGGTCTGCGACCTGACGGAGTCTTCCAACTCGCCGGATCGGGGAGATCTTCCTTCACGCCTCGTCAGGCCGTCCTGACTTTGGAGAGTTCGTCCTCGCAGCCCCGCTCGGGTGGCATCGGCACTCTCCAGTTCGTGGAGGAGTTCACTCCCTCGGTCTACTTCAACCCCTTCTCCGGCTCCCCCGGCCACTACCCGGACGAGTTCATCCCGAACTTCGACGCCATCAGCGAGTCGGTGGACGGCTACGATTGAAACTAATCACCCCCTTATCCAGTGAAATAAAGATCATATTGATGATGATTTTACAGAAATAAAAAATAATCATTTGATTTGAAATAAAGATACAATCATATTGATGATTTGAGTTTAACAAAAAAATAAAGAATCACTTACTTGAAATCTGATACCAGGTCTCTGTCCATGTTTTCTGCCAACACCACTTCACTCCCCTCTTCCCAGCTCTGGTACTGCAGGCCCCGGCGGGCTGCAAACTTCCTCCACACGCTGAAGGGGATGTCAAATTCCTCCTGTCCCTCAATCTTCATTTTATCTTCTATCAGATGTCCAAAAAGCGCGTCCGGGTGGATGATGACTTCGACCCCGTCTACCCCTACGATGCAGACAACGCACCGACCGTGCCCTTCATCAACCCCCCCTTCGTCTCTTCAGATGGATTCCAAGAGAAGCCCCTGGGGGTGTTGTCCCTGCGACTGGCCGACCCCGTCACCACCAAGAACGGGGAAATCACCCTCAAGCTGGGAGAGGGGGTGGACCTCGATTCCTCGGGAAAACTCATCTCCAACACGGCCACCAAGGCCGCCGCCCCTCTCAGTTTTTCCAACAACACCATTTCCCTTAACATGGATCACCCCTTTTACACTAAAGATGGAAAATTATCCTTACAAGTTTCTCCACCATTAAATATACTGAGAACAAGCATTCTAAACACACTAGCTTTAGGTTTTGGATCAGGTTTAGGACTCCGTGGCTCTGCCTTGGCAGTACAGTTAGTCTCTCCACTTACATTTGATACTGATGGAAACATAAAGCTTACCTTAGACAGAGGTTTGCATGTTACAACAGGAGATGCAATTGAAAGCAACATAAGCTGGGCTAAAGGTTTAAAATTTGAAGATGGAGCCATAGCAACCAACATTGGAAATGGGTTAGAGTTTGGAAGCAGTAGTACAGAAACAGGTGTTGATGATGCTTACCCAATCCAAGTTAAACTTGGATCTGGCCTTAGCTTTGACAGTACAGGAGCCATAATGGCTGGTAACAAAGAAGACGATAAACTCACTTTGTGGACAACACCTGATCCATCACCAAACTGTCAAATACTCGCAGAAAATGATGCAAAACTAACACTTTGCTTGACTAAATGTGGTAGTCAAATACTGGCCACTGTGTCAGTCTTAGTTGTAGGAAGTGGAAACCTAAACCCCATTACTGGCACCGTAAGCAGTGCTCAGGTGTTTCTACGTTTTGATGCAAACGGTGTTCTTTTAACAGAACATTCTACACTAAAAAAATACTGGGGGTATAGGCAGGGAGATAGCATAGATGGCACTCCATATACCAATGCTGTAGGATTCATGCCCAATTTAAAAGCTTATCCAAAGTCACAAAGTTCTACTACTAAAAATAATATAGTAGGGCAAGTATACATGAATGGAGATGTTTCAAAACCTATGCTTCTCACTATAACCCTCAATGGTACTGATGACAGCAACAGTACATATTCAATGTCATTTTCATACACCTGGACTAATGGAAGCTATGTTGGAGCAACATTTGGGGCTAACTCTTATACCTTCTCATACATCGCCCAAGAATGAACACTGTATCCCACCCTGCATGCCAACCCTTCCCACCCCACTCTGTGGAACAAACTCTGAAACACAAAATAAAATAAAGTTCAAGTGTTTTATTGATTCAACAGTTTTACAGGATTCGAGCAGTTATTTTTCCTCCACCCTCCCAGGACATGGAATACACCACCCTCTCCCCCCGCACAGCCTTGAACATCTGAATGCCATTGGTGATGGACATGCTTTTGGTCTCCACGTTCCACACAGTTTCAGAGCGAGCCAGTCTCGGGTCGGTCAGGGAGATGAAACCCTCCGGGCACTCCCGCATCTGCACCTCACAGCTCAACAGCTGAGGATTGTCCTCGGTGGTCGGGATCACGGTTATCTGGAAGAAGCAGAAGAGCGGCGGTGGGAATCATAGTCCGCGAACGGGATCGGCCGGTGGTGTCGCATCAGGCCCCGCAGCAGTCGCTGCCGCCGCCGCTCCGTCAAGCTGCTGCTCAGGGGGTCCGGGTCCAGGGACTCCCTCAGCATGATGCCCACGGCCCTCAGCATCAGTCGTCTGGTGCGGCGGGCGCAGCAGCGCATGCGGATCTCGCTCAGGTCGCTGCAGTACGTGCAACACAGAACCACCAGGTTGTTCAACAGTCCATAGTTCAACACGCTCCAGCCGAAACTCATCGCGGGAAGGATGCTACCCACGTGGCCGTCGTACCAGATCCTCAGGTAAATCAAGTGGTGCCCCCTCCAGAACACGCTGCCCACGTACATGATCTCCTTGGGCATGTGGCGGTTCACCACCTCCCGGTACCACATCACCCTCTGGTTGAACATGCAGCCCCGGATGATCCTGCGGAACCACAGGGCCAGCACCGCCCCGCCCGCCATGCAGCGAAGAGACCCCGGGTCCCGGCAATGGCAATGGAGGACCCACCGCTCGTACCCGTGGATCATCTGGGAGCTGAACAAGTCTATGTTGGCACAGCACAGGCATATGCTCATGCATCTCTTCAGCACTCTCAACTCCTCGGGGGTCAAAACCATATCCCAGGGCACGGGGAACTCTTGCAGGACAGCGAACCCCGCAGAACAGGGCAATCCTCGCACAGAACTTACATTGTGCATGGACAGGGTATCGCAATCAGGCAGCACCGGGTGATCCTCCACCAGAGAAGCGCGGGTCTCGGTCTCCTCACAGCGTGGTAAGGGGGCCGGCCGATACGGGTGATGGCGGGACGCGGCTGATCGTGTTCGCGACCGTGTCATGATGCAGTTGCTTTCGGACATTTTCGTACTTGCTGTAGCAGAACCTGGTCCGGGCGCTGCACACCGATCGCCGGCGGCGGTCTCGGCGCTTGGAACGCTCGGTGTTGAAATTGTAAAACAGCCACTCTCTCAGACCGTGCAGCAGATCTAGGGCCTCAGGAGTGATGAAGATCCCATCATGCCTGATGGCTCTGATCACATCGACCACCGTGGAATGGGCCAGACCCAGCCAGATGATGCAATTTTGTTGGGTTTCGGTGACGGCGGGGGAGGGAAGAACAGGAAGAACCATGATTAACTTTTAATCCAAACGGTCTCGGAGTACTTCAAAATGAAGATCGCGGAGATGGCACCTCTCGCCCCCGCTGTGTTGGTGGAAAATAACAGCCAGGTCAAAGGTGATACGGTTCTCGAGATGTTCCACGGTGGCTTCCAGCAAAGCCTCCACGCGCACATCCAGAAACAAGACAATAGCGAAAGCGGGAGGGTTCTCTAATTCCTCAATCATCATGTTACACTCCTGCACCATCCCCAGATAATTTTCATTTTTCCAGCCTTGAATGATTCGAACTAGTTCCTGAGGTAAATCCAAGCCAGCCATGATAAAGAGCTCGCGCAGAGCGCCCTCCACCGGCATTCTTAAGCACACCCTCATAATTCCAAGATATTCTGCTCCTGGTTCACCTGCAGCAGATTGACAAGCGGAATATCAAAATCTCTGCCGCGATCCCTGAGCTCCTCCCTCAGCAATAACTGTAAGTACTCTTTCATATCCTCTCCGAAATTTTTAGCCATAGGACCACCAGGAATAAGATTAGGGCAAGCCACAGTACAGATAAACCGAAGTCCTCCCCAGTGAGCATTGCCAAATGCAAGACTGCTATAAGCATGCTGGCTAGACCCGGTGATATCTTCCAGATAACTGGACAGAAAATCGCCCAGGCAATTTTTAAGAAAATCAACAAAAGAAAAATCCTCCAGGTGGACGTTTAGAGCCTCGGGAACAACGATGAAGTAAATGCAAGCGGTGCGTTCCAGCATGGTTAGTTAGCTGATCTGTAGAAAAAACAAAAATGAACATTAAACCATGCTAGCCTGGCGAACAGGTGGGTAAATCGTTCTCTCCAGCACCAGGCAGGCCACGGGGTCTCCGGCGCGACCCTCGTAAAAATTGTCGCTATGATTGAAAACCATCACAGAGAGACGTTCCCGGTGGCCGGCGTGAATGATTCGACAAGATGAATACACCCCCGGAACATTGGCGTCCGCGAGTGAAAAAAAGCGCCCGAGGAAGCAATAAGGCACTACAATGCTCAGTCTCAAGTCCAGCAAAGCGATGCCATGCGGATGAAGCACAAAATTCTCAGGTGCGTACAAAATGTAATTACTCCCCTCCTGCACAGGCAGCAAAGCCCCCGATCCCTCCAGGTACACATACAAAGCCTCAGCGTCCATAGCTTACCGAGCAGCAGCACACAACAGGCGCAAGAGTCAGAGAAAGGCTGAGCTCTAACCTGTCCACCCGCTCTCTGCTCAATATATAGCCCAGATCTACACTGACGTAAAGGCCAAAGTCTAAAAATACCCGCCAAATAATCACACACGCCCAGCACACGCCCAGAAACCGGTGACACACTCAAAAAAATACGCGCACTTCCTCAAACGCCCAAAACTGCCGTCATTTCCGGGTTCCCACGCTACGTCATCAAAACACGACTTTCAAATTCCGTCGACCGTTAAAAACGTCACCCGCCCCGCCCCTAACGGTCGCCCGTCTCTCAGCCAATCAGCGCCCCGCATCCCCAAATTCAAACACCTCATTTGCATATTAACGCGCACAAAAAGTTTGAGGTATATTATTGATGATG
ChAdV68-TETo-TSNA (SEQ ID NO:67)
CCATCTTCAATAATATACCTCAAACTTTTTGTGCGCGTTAATATGCAAATGAGGCGTTTGAATTTGGGGAGGAAGGGCGGTGATTGGTCGAGGGATGAGCGACCGTTAGGGGCGGGGCGAGTGACGTTTTGATGACGTGGTTGCGAGGAGGAGCCAGTTTGCAAGTTCTCGTGGGAAAAGTGACGTCAAACGAGGTGTGGTTTGAACACGGAAATACTCAATTTTCCCGCGCTCTCTGACAGGAAATGAGGTGTTTCTGGGCGGATGCAAGTGAAAACGGGCCATTTTCGCGCGAAAACTGAATGAGGAAGTGAAAATCTGAGTAATTTCGCGTTTATGGCAGGGAGGAGTATTTGCCGAGGGCCGAGTAGACTTTGACCGATTACGTGGGGGTTTCGATTACCGTGTTTTTCACCTAAATTTCCGCGTACGGTGTCAAAGTCCGGTGTTTTTACGTAGGTGTCAGCTGATCGCCAGGGTATTTAAACCTGCGCTCTCCAGTCAAGAGGCCACTCTTGAGTGCCAGCGAGAAGAGTTTTCTCCTCCGCGCCGCGAGTCAGATCTACACTTTGAAAGTAGGGATAACAGGGTAATCCATGTTGACATTGATTATTGACTAGTTATTAAAGTACTTCCCTATCAGTGATAGAGAAAAGTGAAAGTCGAGTTTACCACTCCCTATCAGTGATAGAGAAAAGTGAAAGTCGAGTTTACCACTCCCTATCAGTGATAGAGAAAAGTGAAAGTCGAGTTTACCACTCCCTATCAGTGATAGAGAAAAGTGAAAGTCGAGTTTACCACTCCCTATCAGTGATAGAGAAAAGTGAAAGTCGAGTTTACCACTCCCTATCAGTGATAGAGAAAAGTGAAAGTCGAGTTTACCACTCCCTATCAGTGATAGAGAAAAGTGAAAGTCGAGCTCGGTACCCGGGTCGAGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGCCTATATAAGCAGAGCTCGTTTAGTGAACCGTCAGATCGCCTGGAGACGCCATCCACGCTGTTTTGACCTCCATAGAAGACAGCGATCGCGCCACCATGGCTGGCATGACCGAGTACAAGCTAGTCGTTGTGGGAGCTGGAGATGTGGGCAAATCTGCTCTGACCATTCAGCTGATTCAGGGCACAGATCTGGATCACCAGGAGAAGTGTCTGAGCAGGCTGTACGACCACATGCCAGAAGGATTAACCCCTCTTATGGGAGTGAGCTCTTCTTCTGCTCTGGCCAGACTGGGACTGCCTATGGATAAGCTGAACAAGATCACAGCTCCTGCCTCTCAGAAACTGAGACAGCTGCAGAAGATGGAGACCCCTGAACTGCTGCCTTGTGGATATCTGGTGGAGGAGAATACCACAATCAGCGTGACCGTGAAAGGCCTGGAAGCCCAGAACAAGATCAAAGGCTGTACCGGCTCTGTGAATATGACACTGCAGAGAGCTTCTGCCGCCCCTAAGACAGGAGGAGGAGGAGAAGCTGCTGCCTACAATAATACATTAGTGGCCAGACATGTGCCCCAGATCCCTAAGCCTGACAGCCTGGTTGGCCTGAGCGATGAATTAGGAAAAAGAGACACATTTGCCGAGAGCCTGATCCGGAGAATGGCCTCTGCCGGCTACCTGTTCCTGGATATCATCACATATGTTGTGTTTGCCGTGACCTTCGTGCTGGGAGTTCTGGGCGGCCTGAATACCGAGACCAATGAAAAAGCTCTTGAAGCCGTGTTTGGCAAGTACGGCAGAATCGTGGAGGTGCTGGGCGGCAGATCTTGTGAAGAATTAACAGCTGTGTTACCACCTCCTCAGCTGCTTGGCAGACGGTTCAACTTCTTCAGCTACAGCTACGTTGCTGCTGGCTCTTCTGGCAACAACTACGACCTGATGGCCCAGCCTATTACACCTGGACCTGATACAACACCTCTGCCTGTGACCGATACATCTTCTGTGTCTACCGGACACGCCACATCTCTGCCAGTGACAGATGCTGGACTGAGAGTGACAGAGTCTAAAGGACACAGCGATTCTTGGCACCTGAGCCTGGATACAGCCATCAGGGTGAATACCCCTAAGCTGGTTTCTGAAGTGGAAGAGCTGAACAAGAGCATCACCGCCCTGAGGGAGAAGTTACTGCAGATGGTGGAAGCCGATAGACCTGGAAACCTGTTTATTGGAGGCCTGAACACCGAGACCAATGAGGACTCTCCCGTGAAGGATGAAGTGGTGGTGAACGATCAATGGGGCCAGAATTGTAGCTGCCATCATGGAGGCTACGAGTTCCCTGATCTGCACAGGACAATCGTGTCTGAGTGCGATGTGTATCTGACCTACATGCTGAGACAGGCTGCTCTGCAGCTGTTCTTCGACCTGTATCACAGCATCCCTAGCAGCTTTTCTCCTCTGGTTCTGAGCTGTCTGGTGCAGCCTCTGGAAGATGTGGAAGTGATGGAGAAGGATGGCACAACCTTTAGCTGTGAGGTGAGCCACGATGAGGTGCCTCGGACATATGGACCCGTGTTTATGTGTCTGGGAGGACTGCTGACCATGGTGGCTGGAGCTGTTTGGCTGACAGTTGGACCCGGACCAGGCGCCAAATTTGTTGCTGCTTGGACACTGAAAGCTGCTGCTGGGCCCGGACCAGGCCAGTACATCAAGGCCAACTCTAAGTTTATCGGCATCACCGAATTGGGACCTGGACCCGGCTAGTAGTGAGTTTAAACTCCCATTTAAATGTGAGGGTTAATGCTTCGAGCAGACATGATAAGATACATTGATGAGTTTGGACAAACCACAACTAGAATGCAGTGAAAAAAATGCTTTATTTGTGAAATTTGTGATGCTATTGCTTTATTTGTAACCATTATAAGCTGCAATAAACAAGTTAACAACAACAATTGCATTCATTTTATGTTTCAGGTTCAGGGGGAGATGTGGGAGGTTTTTTAAAGCAAGTAAAACCTCTACAAATGTGGTAAAATAACTATAACGGTCCTAAGGTAGCGAGTGAGTAGTGTTCTGGGGCGGGGGAGGACCTGCATGAGGGCCAGAATAACTGAAATCTGTGCTTTTCTGTGTGTTGCAGCAGCATGAGCGGAAGCGGCTCCTTTGAGGGAGGGGTATTCAGCCCTTATCTGACGGGGCGTCTCCCCTCCTGGGCGGGAGTGCGTCAGAATGTGATGGGATCCACGGTGGACGGCCGGCCCGTGCAGCCCGCGAACTCTTCAACCCTGACCTATGCAACCCTGAGCTCTTCGTCGTTGGACGCAGCTGCCGCCGCAGCTGCTGCATCTGCCGCCAGCGCCGTGCGCGGAATGGCCATGGGCGCCGGCTACTACGGCACTCTGGTGGCCAACTCGAGTTCCACCAATAATCCCGCCAGCCTGAACGAGGAGAAGCTGTTGCTGCTGATGGCCCAGCTCGAGGCCTTGACCCAGCGCCTGGGCGAGCTGACCCAGCAGGTGGCTCAGCTGCAGGAGCAGACGCGGGCCGCGGTTGCCACGGTGAAATCCAAATAAAAAATGAATCAATAAATAAACGGAGACGGTTGTTGATTTTAACACAGAGTCTGAATCTTTATTTGATTTTTCGCGCGCGGTAGGCCCTGGACCACCGGTCTCGATCATTGAGCACCCGGTGGATCTTTTCCAGGACCCGGTAGAGGTGGGCTTGGATGTTGAGGTACATGGGCATGAGCCCGTCCCGGGGGTGGAGGTAGCTCCATTGCAGGGCCTCGTGCTCGGGGGTGGTGTTGTAAATCACCCAGTCATAGCAGGGGCGCAGGGCATGGTGTTGCACAATATCTTTGAGGAGGAGACTGATGGCCACGGGCAGCCCTTTGGTGTAGGTGTTTACAAATCTGTTGAGCTGGGAGGGATGCATGCGGGGGGAGATGAGGTGCATCTTGGCCTGGATCTTGAGATTGGCGATGTTACCGCCCAGATCCCGCCTGGGGTTCATGTTGTGCAGGACCACCAGCACGGTGTATCCGGTGCACTTGGGGAATTTATCATGCAACTTGGAAGGGAAGGCGTGAAAGAATTTGGCGACGCCTTTGTGCCCGCCCAGGTTTTCCATGCACTCATCCATGATGATGGCGATGGGCCCGTGGGCGGCGGCCTGGGCAAAGACGTTTCGGGGGTCGGACACATCATAGTTGTGGTCCTGGGTGAGGTCATCATAGGCCATTTTAATGAATTTGGGGCGGAGGGTGCCGGACTGGGGGACAAAGGTACCCTCGATCCCGGGGGCGTAGTTCCCCTCACAGATCTGCATCTCCCAGGCTTTGAGCTCGGAGGGGGGGATCATGTCCACCTGCGGGGCGATAAAGAACACGGTTTCCGGGGCGGGGGAGATGAGCTGGGCCGAAAGCAAGTTCCGGAGCAGCTGGGACTTGCCGCAGCCGGTGGGGCCGTAGATGACCCCGATGACCGGCTGCAGGTGGTAGTTGAGGGAGAGACAGCTGCCGTCCTCCCGGAGGAGGGGGGCCACCTCGTTCATCATCTCGCGCACGTGCATGTTCTCGCGCACCAGTTCCGCCAGGAGGCGCTCTCCCCCCAGGGATAGGAGCTCCTGGAGCGAGGCGAAGTTTTTCAGCGGCTTGAGTCCGTCGGCCATGGGCATTTTGGAGAGGGTTTGTTGCAAGAGTTCCAGGCGGTCCCAGAGCTCGGTGATGTGCTCTACGGCATCTCGATCCAGCAGACCTCCTCGTTTCGCGGGTTGGGACGGCTGCGGGAGTAGGGCACCAGACGATGGGCGTCCAGCGCAGCCAGGGTCCGGTCCTTCCAGGGTCGCAGCGTCCGCGTCAGGGTGGTCTCCGTCACGGTGAAGGGGTGCGCGCCGGGCTGGGCGCTTGCGAGGGTGCGCTTCAGGCTCATCCGGCTGGTCGAAAACCGCTCCCGATCGGCGCCCTGCGCGTCGGCCAGGTAGCAATTGACCATGAGTTCGTAGTTGAGCGCCTCGGCCGCGTGGCCTTTGGCGCGGAGCTTACCTTTGGAAGTCTGCCCGCAGGCGGGACAGAGGAGGGACTTGAGGGCGTAGAGCTTGGGGGCGAGGAAGACGGACTCGGGGGCGTAGGCGTCCGCGCCGCAGTGGGCGCAGACGGTCTCGCACTCCACGAGCCAGGTGAGGTCGGGCTGGTCGGGGTCAAAAACCAGTTTCCCGCCGTTCTTTTTGATGCGTTTCTTACCTTTGGTCTCCATGAGCTCGTGTCCCCGCTGGGTGACAAAGAGGCTGTCCGTGTCCCCGTAGACCGACTTTATGGGCCGGTCCTCGAGCGGTGTGCCGCGGTCCTCCTCGTAGAGGAACCCCGCCCACTCCGAGACGAAAGCCCGGGTCCAGGCCAGCACGAAGGAGGCCACGTGGGACGGGTAGCGGTCGTTGTCCACCAGCGGGTCCACCTTTTCCAGGGTATGCAAACACATGTCCCCCTCGTCCACATCCAGGAAGGTGATTGGCTTGTAAGTGTAGGCCACGTGACCGGGGGTCCCGGCCGGGGGGGTATAAAAGGGTGCGGGTCCCTGCTCGTCCTCACTGTCTTCCGGATCGCTGTCCAGGAGCGCCAGCTGTTGGGGTAGGTATTCCCTCTCGAAGGCGGGCATGACCTCGGCACTCAGGTTGTCAGTTTCTAGAAACGAGGAGGATTTGATATTGACGGTGCCGGCGGAGATGCCTTTCAAGAGCCCCTCGTCCATCTGGTCAGAAAAGACGATCTTTTTGTTGTCGAGCTTGGTGGCGAAGGAGCCGTAGAGGGCGTTGGAGAGGAGCTTGGCGATGGAGCGCATGGTCTGGTTTTTTTCCTTGTCGGCGCGCTCCTTGGCGGCGATGTTGAGCTGCACGTACTCGCGCGCCACGCACTTCCATTCGGGGAAGACGGTGGTCAGCTCGTCGGGCACGATTCTGACCTGCCAGCCCCGATTATGCAGGGTGATGAGGTCCACACTGGTGGCCACCTCGCCGCGCAGGGGCTCATTAGTCCAGCAGAGGCGTCCGCCCTTGCGCGAGCAGAAGGGGGGCAGGGGGTCCAGCATGACCTCGTCGGGGGGGTCGGCATCGATGGTGAAGATGCCGGGCAGGAGGTCGGGGTCAAAGTAGCTGATGGAAGTGGCCAGATCGTCCAGGGCAGCTTGCCATTCGCGCACGGCCAGCGCGCGCTCGTAGGGACTGAGGGGCGTGCCCCAGGGCATGGGATGGGTAAGCGCGGAGGCGTACATGCCGCAGATGTCGTAGACGTAGAGGGGCTCCTCGAGGATGCCGATGTAGGTGGGGTAGCAGCGCCCCCCGCGGATGCTGGCGCGCACGTAGTCATACAGCTCGTGCGAGGGGGCGAGGAGCCCCGGGCCCAGGTTGGTGCGACTGGGCTTTTCGGCGCGGTAGACGATCTGGCGGAAAATGGCATGCGAGTTGGAGGAGATGGTGGGCCTTTGGAAGATGTTGAAGTGGGCGTGGGGCAGTCCGACCGAGTCGCGGATGAAGTGGGCGTAGGAGTCTTGCAGCTTGGCGACGAGCTCGGCGGTGACTAGGACGTCCAGAGCGCAGTAGTCGAGGGTCTCCTGGATGATGTCATACTTGAGCTGTCCCTTTTGTTTCCACAGCTCGCGGTTGAGAAGGAACTCTTCGCGGTCCTTCCAGTACTCTTCGAGGGGGAACCCGTCCTGATCTGCACGGTAAGAGCCTAGCATGTAGAACTGGTTGACGGCCTTGTAGGCGCAGCAGCCCTTCTCCACGGGGAGGGCGTAGGCCTGGGCGGCCTTGCGCAGGGAGGTGTGCGTGAGGGCGAAAGTGTCCCTGACCATGACCTTGAGGAACTGGTGCTTGAAGTCGATATCGTCGCAGCCCCCCTGCTCCCAGAGCTGGAAGTCCGTGCGCTTCTTGTAGGCGGGGTTGGGCAAAGCGAAAGTAACATCGTTGAAGAGGATCTTGCCCGCGCGGGGCATAAAGTTGCGAGTGATGCGGAAAGGTTGGGGCACCTCGGCCCGGTTGTTGATGACCTGGGCGGCGAGCACGATCTCGTCGAAGCCGTTGATGTTGTGGCCCACGATGTAGAGTTCCACGAATCGCGGACGGCCCTTGACGTGGGGCAGTTTCTTGAGCTCCTCGTAGGTGAGCTCGTCGGGGTCGCTGAGCCCGTGCTGCTCGAGCGCCCAGTCGGCGAGATGGGGGTTGGCGCGGAGGAAGGAAGTCCAGAGATCCACGGCCAGGGCGGTTTGCAGACGGTCCCGGTACTGACGGAACTGCTGCCCGACGGCCATTTTTTCGGGGGTGACGCAGTAGAAGGTGCGGGGGTCCCCGTGCCAGCGATCCCATTTGAGCTGGAGGGCGAGATCGAGGGCGAGCTCGACGAGCCGGTCGTCCCCGGAGAGTTTCATGACCAGCATGAAGGGGACGAGCTGCTTGCCGAAGGACCCCATCCAGGTGTAGGTTTCCACATCGTAGGTGAGGAAGAGCCTTTCGGTGCGAGGATGCGAGCCGATGGGGAAGAACTGGATCTCCTGCCACCAATTGGAGGAATGGCTGTTGATGTGATGGAAGTAGAAATGCCGACGGCGCGCCGAACACTCGTGCTTGTGTTTATACAAGCGGCCACAGTGCTCGCAACGCTGCACGGGATGCACGTGCTGCACGAGCTGTACCTGAGTTCCTTTGACGAGGAATTTCAGTGGGAAGTGGAGTCGTGGCGCCTGCATCTCGTGCTGTACTACGTCGTGGTGGTCGGCCTGGCCCTCTTCTGCCTCGATGGTGGTCATGCTGACGAGCCCGCGCGGGAGGCAGGTCCAGACCTCGGCGCGAGCGGGTCGGAGAGCGAGGACGAGGGCGCGCAGGCCGGAGCTGTCCAGGGTCCTGAGACGCTGCGGAGTCAGGTCAGTGGGCAGCGGCGGCGCGCGGTTGACTTGCAGGAGTTTTTCCAGGGCGCGCGGGAGGTCCAGATGGTACTTGATCTCCACCGCGCCATTGGTGGCGACGTCGATGGCTTGCAGGGTCCCGTGCCCCTGGGGTGTGACCACCGTCCCCCGTTTCTTCTTGGGCGGCTGGGGCGACGGGGGCGGTGCCTCTTCCATGGTTAGAAGCGGCGGCGAGGACGCGCGCCGGGCGGCAGGGGCGGCTCGGGGCCCGGAGGCAGGGGCGGCAGGGGCACGTCGGCGCCGCGCGCGGGTAGGTTCTGGTACTGCGCCCGGAGAAGACTGGCGTGAGCGACGACGCGACGGTTGACGTCCTGGATCTGACGCCTCTGGGTGAAGGCCACGGGACCCGTGAGTTTGAACCTGAAAGAGAGTTCGACAGAATCAATCTCGGTATCGTTGACGGCGGCCTGCCGCAGGATCTCTTGCACGTCGCCCGAGTTGTCCTGGTAGGCGATCTCGGTCATGAACTGCTCGATCTCCTCCTCTTGAAGGTCTCCGCGGCCGGCGCGCTCCACGGTGGCCGCGAGGTCGTTGGAGATGCGGCCCATGAGCTGCGAGAAGGCGTTCATGCCCGCCTCGTTCCAGACGCGGCTGTAGACCACGACGCCCTCGGGATCGCGGGCGCGCATGACCACCTGGGCGAGGTTGAGCTCCACGTGGCGCGTGAAGACCGCGTAGTTGCAGAGGCGCTGGTAGAGGTAGTTGAGCGTGGTGGCGATGTGCTCGGTGACGAAGAAATACATGATCCAGCGGCGGAGCGGCATCTCGCTGACGTCGCCCAGCGCCTCCAAACGTTCCATGGCCTCGTAAAAGTCCACGGCGAAGTTGAAAAACTGGGAGTTGCGCGCCGAGACGGTCAACTCCTCCTCCAGAAGACGGATGAGCTCGGCGATGGTGGCGCGCACCTCGCGCTCGAAGGCCCCCGGGAGTTCCTCCACTTCCTCTTCTTCCTCCTCCACTAACATCTCTTCTACTTCCTCCTCAGGCGGCAGTGGTGGCGGGGGAGGGGGCCTGCGTCGCCGGCGGCGCACGGGCAGACGGTCGATGAAGCGCTCGATGGTCTCGCCGCGCCGGCGTCGCATGGTCTCGGTGACGGCGCGCCCGTCCTCGCGGGGCCGCAGCGTGAAGACGCCGCCGCGCATCTCCAGGTGGCCGGGGGGGTCCCCGTTGGGCAGGGAGAGGGCGCTGACGATGCATCTTATCAATTGCCCCGTAGGGACTCCGCGCAAGGACCTGAGCGTCTCGAGATCCACGGGATCTGAAAACCGCTGAACGAAGGCTTCGAGCCAGTCGCAGTCGCAAGGTAGGCTGAGCACGGTTTCTTCTGGCGGGTCATGTTGGTTGGGAGCGGGGCGGGCGATGCTGCTGGTGATGAAGTTGAAATAGGCGGTTCTGAGACGGCGGATGGTGGCGAGGAGCACCAGGTCTTTGGGCCCGGCTTGCTGGATGCGCAGACGGTCGGCCATGCCCCAGGCGTGGTCCTGACACCTGGCCAGGTCCTTGTAGTAGTCCTGCATGAGCCGCTCCACGGGCACCTCCTCCTCGCCCGCGCGGCCGTGCATGCGCGTGAGCCCGAAGCCGCGCTGGGGCTGGACGAGCGCCAGGTCGGCGACGACGCGCTCGGCGAGGATGGCTTGCTGGATCTGGGTGAGGGTGGTCTGGAAGTCATCAAAGTCGACGAAGCGGTGGTAGGCTCCGGTGTTGATGGTGTAGGAGCAGTTGGCCATGACGGACCAGTTGACGGTCTGGTGGCCCGGACGCACGAGCTCGTGGTACTTGAGGCGCGAGTAGGCGCGCGTGTCGAAGATGTAGTCGTTGCAGGTGCGCACCAGGTACTGGTAGCCGATGAGGAAGTGCGGCGGCGGCTGGCGGTAGAGCGGCCATCGCTCGGTGGCGGGGGCGCCGGGCGCGAGGTCCTCGAGCATGGTGCGGTGGTAGCCGTAGATGTACCTGGACATCCAGGTGATGCCGGCGGCGGTGGTGGAGGCGCGCGGGAACTCGCGGACGCGGTTCCAGATGTTGCGCAGCGGCAGGAAGTAGTTCATGGTGGGCACGGTCTGGCCCGTGAGGCGCGCGCAGTCGTGGATGCTCTATACGGGCAAAAACGAAAGCGGTCAGCGGCTCGACTCCGTGGCCTGGAGGCTAAGCGAACGGGTTGGGCTGCGCGTGTACCCCGGTTCGAATCTCGAATCAGGCTGGAGCCGCAGCTAACGTGGTATTGGCACTCCCGTCTCGACCCAAGCCTGCACCAACCCTCCAGGATACGGAGGCGGGTCGTTTTGCAACTTTTTTTTGGAGGCCGGATGAGACTAGTAAGCGCGGAAAGCGGCCGACCGCGATGGCTCGCTGCCGTAGTCTGGAGAAGAATCGCCAGGGTTGCGTTGCGGTGTGCCCCGGTTCGAGGCCGGCCGGATTCCGCGGCTAACGAGGGCGTGGCTGCCCCGTCGTTTCCAAGACCCCATAGCCAGCCGACTTCTCCAGTTACGGAGCGAGCCCCTCTTTTGTTTTGTTTGTTTTTGCCAGATGCATCCCGTACTGCGGCAGATGCGCCCCCACCACCCTCCACCGCAACAACAGCCCCCTCCACAGCCGGCGCTTCTGCCCCCGCCCCAGCAGCAACTTCCAGCCACGACCGCCGCGGCCGCCGTGAGCGGGGCTGGACAGAGTTATGATCACCAGCTGGCCTTGGAAGAGGGCGAGGGGCTGGCGCGCCTGGGGGCGTCGTCGCCGGAGCGGCACCCGCGCGTGCAGATGAAAAGGGACGCTCGCGAGGCCTACGTGCCCAAGCAGAACCTGTTCAGAGACAGGAGCGGCGAGGAGCCCGAGGAGATGCGCGCGGCCCGGTTCCACGCGGGGCGGGAGCTGCGGCGCGGCCTGGACCGAAAGAGGGTGCTGAGGGACGAGGATTTCGAGGCGGACGAGCTGACGGGGATCAGCCCCGCGCGCGCGCACGTGGCCGCGGCCAACCTGGTCACGGCGTACGAGCAGACCGTGAAGGAGGAGAGCAACTTCCAAAAATCCTTCAACAACCACGTGCGCACCCTGATCGCGCGCGAGGAGGTGACCCTGGGCCTGATGCACCTGTGGGACCTGCTGGAGGCCATCGTGCAGAACCCCACCAGCAAGCCGCTGACGGCGCAGCTGTTCCTGGTGGTGCAGCATAGTCGGGACAACGAAGCGTTCAGGGAGGCGCTGCTGAATATCACCGAGCCCGAGGGCCGCTGGCTCCTGGACCTGGTGAACATTCTGCAGAGCATCGTGGTGCAGGAGCGCGGGCTGCCGCTGTCCGAGAAGCTGGCGGCCATCAACTTCTCGGTGCTGAGTTTGGGCAAGTACTACGCTAGGAAGATCTACAAGACCCCGTACGTGCCCATAGACAAGGAGGTGAAGATCGACGGGTTTTACATGCGCATGACCCTGAAAGTGCTGACCCTGAGCGACGATCTGGGGGTGTACCGCAACGACAGGATGCACCGTGCGGTGAGCGCCAGCAGGCGGCGCGAGCTGAGCGACCAGGAGCTGATGCATAGTCTGCAGCGGGCCCTGACCGGGGCCGGGACCGAGGGGGAGAGCTACTTTGACATGGGCGCGGACCTGCACTGGCAGCCCAGCCGCCGGGCCTTGGAGGCGGCGGCAGGACCCTACGTAGAAGAGGTGGACGATGAGGTGGACGAGGAGGGCGAGTACCTGGAAGACTGATGGCGCGACCGTATTTTTGCTAGATGCAACAACAACAGCCACCTCCTGATCCCGCGATGCGGGCGGCGCTGCAGAGCCAGCCGTCCGGCATTAACTCCTCGGACGATTGGACCCAGGCCATGCAACGCATCATGGCGCTGACGACCCGCAACCCCGAAGCCTTTAGACAGCAGCCCCAGGCCAACCGGCTCTCGGCCATCCTGGAGGCCGTGGTGCCCTCGCGCTCCAACCCCACGCACGAGAAGGTCCTGGCCATCGTGAACGCGCTGGTGGAGAACAAGGCCATCCGCGGCGACGAGGCCGGCCTGGTGTACAACGCGCTGCTGGAGCGCGTGGCCCGCTACAACAGCACCAACGTGCAGACCAACCTGGACCGCATGGTGACCGACGTGCGCGAGGCCGTGGCCCAGCGCGAGCGGTTCCACCGCGAGTCCAACCTGGGATCCATGGTGGCGCTGAACGCCTTCCTCAGCACCCAGCCCGCCAACGTGCCCCGGGGCCAGGAGGACTACACCAACTTCATCAGCGCCCTGCGCCTGATGGTGACCGAGGTGCCCCAGAGCGAGGTGTACCAGTCCGGGCCGGACTACTTCTTCCAGACCAGTCGCCAGGGCTTGCAGACCGTGAACCTGAGCCAGGCTTTCAAGAACTTGCAGGGCCTGTGGGGCGTGCAGGCCCCGGTCGGGGACCGCGCGACGGTGTCGAGCCTGCTGACGCCGAACTCGCGCCTGCTGCTGCTGCTGGTGGCCCCCTTCACGGACAGCGGCAGCATCAACCGCAACTCGTACCTGGGCTACCTGATTAACCTGTACCGCGAGGCCATCGGCCAGGCGCACGTGGACGAGCAGACCTACCAGGAGATCACCCACGTGAGCCGCGCCCTGGGCCAGGACGACCCGGGCAACCTGGAAGCCACCCTGAACTTTTTGCTGACCAACCGGTCGCAGAAGATCCCGCCCCAGTACGCGCTCAGCACCGAGGAGGAGCGCATCCTGCGTTACGTGCAGCAGAGCGTGGGCCTGTTCCTGATGCAGGAGGGGGCCACCCCCAGCGCCGCGCTCGACATGACCGCGCGCAACATGGAGCCCAGCATGTACGCCAGCAACCGCCCGTTCATCAATAAACTGATGGACTACTTGCATCGGGCGGCCGCCATGAACTCTGACTATTTCACCAACGCCATCCTGAATCCCCACTGGCTCCCGCCGCCGGGGTTCTACACGGGCGAGTACGACATGCCCGACCCCAATGACGGGTTCCTGTGGGACGATGTGGACAGCAGCGTGTTCTCCCCCCGACCGGGTGCTAACGAGCGCCCCTTGTGGAAGAAGGAAGGCAGCGACCGACGCCCGTCCTCGGCGCTGTCCGGCCGCGAGGGTGCTGCCGCGGCGGTGCCCGAGGCCGCCAGTCCTTTCCCGAGCTTGCCCTTCTCGCTGAACAGTATCCGCAGCAGCGAGCTGGGCAGGATCACGCGCCCGCGCTTGCTGGGCGAAGAGGAGTACTTGAATGACTCGCTGTTGAGACCCGAGCGGGAGAAGAACTTCCCCAATAACGGGATAGAAAGCCTGGTGGACAAGATGAGCCGCTGGAAGACGTATGCGCAGGAGCACAGGGACGATCCCCGGGCGTCGCAGGGGGCCACGAGCCGGGGCAGCGCCGCCCGTAAACGCCGGTGGCACGACAGGCAGCGGGGACAGATGTGGGACGATGAGGACTCCGCCGACGACAGCAGCGTGTTGGACTTGGGTGGGAGTGGTAACCCGTTCGCTCACCTGCGCCCCCGTATCGGGCGCATGATGTAAGAGAAACCGAAAATAAATGATACTCACCAAGGCCATGGCGACCAGCGTGCGTTCGTTTCTTCTCTGTTGTTGTTGTATCTAGTATGATGAGGCGTGCGTACCCGGAGGGTCCTCCTCCCTCGTACGAGAGCGTGATGCAGCAGGCGATGGCGGCGGCGGCGATGCAGCCCCCGCTGGAGGCTCCTTACGTGCCCCCGCGGTACCTGGCGCCTACGGAGGGGCGGAACAGCATTCGTTACTCGGAGCTGGCACCCTTGTACGATACCACCCGGTTGTACCTGGTGGACAACAAGTCGGCGGACATCGCCTCGCTGAACTACCAGAACGACCACAGCAACTTCCTGACCACCGTGGTGCAGAACAATGACTTCACCCCCACGGAGGCCAGCACCCAGACCATCAACTTTGACGAGCGCTCGCGGTGGGGCGGCCAGCTGAAAACCATCATGCACACCAACATGCCCAACGTGAACGAGTTCATGTACAGCAACAAGTTCAAGGCGCGGGTGATGGTCTCCCGCAAGACCCCCAATGGGGTGACAGTGACAGAGGATTATGATGGTAGTCAGGATGAGCTGAAGTATGAATGGGTGGAATTTGAGCTGCCCGAAGGCAACTTCTCGGTGACCATGACCATCGACCTGATGAACAACGCCATCATCGACAATTACTTGGCGGTGGGGCGGCAGAACGGGGTGCTGGAGAGCGACATCGGCGTGAAGTTCGACACTAGGAACTTCAGGCTGGGCTGGGACCCCGTGACCGAGCTGGTCATGCCCGGGGTGTACACCAACGAGGCTTTCCATCCCGATATTGTCTTGCTGCCCGGCTGCGGGGTGGACTTCACCGAGAGCCGCCTCAGCAACCTGCTGGGCATTCGCAAGAGGCAGCCCTTCCAGGAAGGCTTCCAGATCATGTACGAGGATCTGGAGGGGGGCAACATCCCCGCGCTCCTGGATGTCGACGCCTATGAGAAAAGCAAGGAGGATGCAGCAGCTGAAGCAACTGCAGCCGTAGCTACCGCCTCTACCGAGGTCAGGGGCGATAATTTTGCAAGCGCCGCAGCAGTGGCAGCGGCCGAGGCGGCTGAAACCGAAAGTAAGATAGTCATTCAGCCGGTGGAGAAGGATAGCAAGAACAGGAGCTACAACGTACTACCGGACAAGATAAACACCGCCTACCGCAGCTGGTACCTAGCCTACAACTATGGCGACCCCGAGAAGGGCGTGCGCTCCTGGACGCTGCTCACCACCTCGGACGTCACCTGCGGCGTGGAGCAAGTCTACTGGTCGCTGCCCGACATGATGCAAGACCCGGTCACCTTCCGCTCCACGCGTCAAGTTAGCAACTACCCGGTGGTGGGCGCCGAGCTCCTGCCCGTCTACTCCAAGAGCTTCTTCAACGAGCAGGCCGTCTACTCGCAGCAGCTGCGCGCCTTCACCTCGCTTACGCACGTCTTCAACCGCTTCCCCGAGAACCAGATCCTCGTCCGCCCGCCCGCGCCCACCATTACCACCGTCAGTGAAAACGTTCCTGCTCTCACAGATCACGGGACCCTGCCGCTGCGCAGCAGTATCCGGGGAGTCCAGCGCGTGACCGTTACTGACGCCAGACGCCGCACCTGCCCCTACGTCTACAAGGCCCTGGGCATAGTCGCGCCGCGCGTCCTCTCGAGCCGCACCTTCTAAATGTCCATTCTCATCTCGCCCAGTAATAACACCGGTTGGGGCCTGCGCGCGCCCAGCAAGATGTACGGAGGCGCTCGCCAACGCTCCACGCAACACCCCGTGCGCGTGCGCGGGCACTTCCGCGCTCCCTGGGGCGCCCTCAAGGGCCGCGTGCGGTCGCGCACCACCGTCGACGACGTGATCGACCAGGTGGTGGCCGACGCGCGCAACTACACCCCCGCCGCCGCGCCCGTCTCCACCGTGGACGCCGTCATCGACAGCGTGGTGGCCGACGCGCGCCGGTACGCCCGCGCCAAGAGCCGGCGGCGGCGCATCGCCCGGCGGCACCGGAGCACCCCCGCCATGCGCGCGGCGCGAGCCTTGCTGCGCAGGGCCAGGCGCACGGGACGCAGGGCCATGCTCAGGGCGGCCAGACGCGCGGCTTCAGGCGCCAGCGCCGGCAGGACCCGGAGACGCGCGGCCACGGCGGCGGCAGCGGCCATCGCCAGCATGTCCCGCCCGCGGCGAGGGAACGTGTACTGGGTGCGCGACGCCGCCACCGGTGTGCGCGTGCCCGTGCGCACCCGCCCCCCTCGCACTTGAAGATGTTCACTTCGCGATGTTGATGTGTCCCAGCGGCGAGGAGGATGTCCAAGCGCAAATTCAAGGAAGAGATGCTCCAGGTCATCGCGCCTGAGATCTACGGCCCTGCGGTGGTGAAGGAGGAAAGAAAGCCCCGCAAAATCAAGCGGGTCAAAAAGGACAAAAAGGAAGAAGAAAGTGATGTGGACGGATTGGTGGAGTTTGTGCGCGAGTTCGCCCCCCGGCGGCGCGTGCAGTGGCGCGGGCGGAAGGTGCAACCGGTGCTGAGACCCGGCACCACCGTGGTCTTCACGCCCGGCGAGCGCTCCGGCACCGCTTCCAAGCGCTCCTACGACGAGGTGTACGGGGATGATGATATTCTGGAGCAGGCGGCCGAGCGCCTGGGCGAGTTTGCTTACGGCAAGCGCAGCCGTTCCGCACCGAAGGAAGAGGCGGTGTCCATCCCGCTGGACCACGGCAACCCCACGCCGAGCCTCAAGCCCGTGACCTTGCAGCAGGTGCTGCCGACCGCGGCGCCGCGCCGGGGGTTCAAGCGCGAGGGCGAGGATCTGTACCCCACCATGCAGCTGATGGTGCCCAAGCGCCAGAAGCTGGAAGACGTGCTGGAGACCATGAAGGTGGACCCGGACGTGCAGCCCGAGGTCAAGGTGCGGCCCATCAAGCAGGTGGCCCCGGGCCTGGGCGTGCAGACCGTGGACATCAAGATTCCCACGGAGCCCATGGAAACGCAGACCGAGCCCATGATCAAGCCCAGCACCAGCACCATGGAGGTGCAGACGGATCCCTGGATGCCATCGGCTCCTAGTCGAAGACCCCGGCGCAAGTACGGCGCGGCCAGCCTGCTGATGCCCAACTACGCGCTGCATCCTTCCATCATCCCCACGCCGGGCTACCGCGGCACGCGCTTCTACCGCGGTCATACCAGCAGCCGCCGCCGCAAGACCACCACTCGCCGCCGCCGTCGCCGCACCGCCGCTGCAACCACCCCTGCCGCCCTGGTGCGGAGAGTGTACCGCCGCGGCCGCGCACCTCTGACCCTGCCGCGCGCGCGCTACCACCCGAGCATCGCCATTTAAACTTTCGCCTGCTTTGCAGATCAATGGCCCTCACATGCCGCCTTCGCGTTCCCATTACGGGCTACCGAGGAAGAAAACCGCGCCGTAGAAGGCTGGCGGGGAACGGGATGCGTCGCCACCACCACCGGCGGCGGCGCGCCATCAGCAAGCGGTTGGGGGGAGGCTTCCTGCCCGCGCTGATCCCCATCATCGCCGCGGCGATCGGGGCGATCCCCGGCATTGCTTCCGTGGCGGTGCAGGCCTCTCAGCGCCACTGAGACACACTTGGAAACATCTTGTAATAAACCAATGGACTCTGACGCTCCTGGTCCTGTGATGTGTTTTCGTAGACAGATGGAAGACATCAATTTTTCGTCCCTGGCTCCGCGACACGGCACGCGGCCGTTCATGGGCACCTGGAGCGACATCGGCACCAGCCAACTGAACGGGGGCGCCTTCAATTGGAGCAGTCTCTGGAGCGGGCTTAAGAATTTCGGGTCCACGCTTAAAACCTATGGCAGCAAGGCGTGGAACAGCACCACAGGGCAGGCGCTGAGGGATAAGCTGAAAGAGCAGAACTTCCAGCAGAAGGTGGTCGATGGGCTCGCCTCGGGCATCAACGGGGTGGTGGACCTGGCCAACCAGGCCGTGCAGCGGCAGATCAACAGCCGCCTGGACCCGGTGCCGCCCGCCGGCTCCGTGGAGATGCCGCAGGTGGAGGAGGAGCTGCCTCCCCTGGACAAGCGGGGCGAGAAGCGACCCCGCCCCGATGCGGAGGAGACGCTGCTGACGCACACGGACGAGCCGCCCCCGTACGAGGAGGCGGTGAAACTGGGTCTGCCCACCACGCGGCCCATCGCGCCCCTGGCCACCGGGGTGCTGAAACCCGAAAAGCCCGCGACCCTGGACTTGCCTCCTCCCCAGCCTTCCCGCCCCTCTACAGTGGCTAAGCCCCTGCCGCCGGTGGCCGTGGCCCGCGCGCGACCCGGGGGCACCGCCCGCCCTCATGCGAACTGGCAGAGCACTCTGAACAGCATCGTGGGTCTGGGAGTGCAGAGTGTGAAGCGCCGCCGCTGCTATTAAACCTACCGTAGCGCTTAACTTGCTTGTCTGTGTGTGTATGTATTATGTCGCCGCCGCCGCTGTCCACCAGAAGGAGGAGTGAAGAGGCGCGTCGCCGAGTTGCAAGATGGCCACCCCATCGATGCTGCCCCAGTGGGCGTACATGCACATCGCCGGACAGGACGCTTCGGAGTACCTGAGTCCGGGTCTGGTGCAGTTTGCCCGCGCCACAGACACCTACTTCAGTCTGGGGAACAAGTTTAGGAACCCCACGGTGGCGCCCACGCACGATGTGACCACCGACCGCAGCCAGCGGCTGACGCTGCGCTTCGTGCCCGTGGACCGCGAGGACAACACCTACTCGTACAAAGTGCGCTACACGCTGGCCGTGGGCGACAACCGCGTGCTGGACATGGCCAGCACCTACTTTGACATCCGCGGCGTGCTGGATCGGGGCCCTAGCTTCAAACCCTACTCCGGCACCGCCTACAACAGTCTGGCCCCCAAGGGAGCACCCAACACTTGTCAGTGGACATATAAAGCCGATGGTGAAACTGCCACAGAAAAAACCTATACATATGGAAATGCACCCGTGCAGGGCATTAACATCACAAAAGATGGTATTCAACTTGGAACTGACACCGATGATCAGCCAATCTACGCAGATAAAACCTATCAGCCTGAACCTCAAGTGGGTGATGCTGAATGGCATGACATCACTGGTACTGATGAAAAGTATGGAGGCAGAGCTCTTAAGCCTGATACCAAAATGAAGCCTTGTTATGGTTCTTTTGCCAAGCCTACTAATAAAGAAGGAGGTCAGGCAAATGTGAAAACAGGAACAGGCACTACTAAAGAATATGACATAGACATGGCTTTCTTTGACAACAGAAGTGCGGCTGCTGCTGGCCTAGCTCCAGAAATTGTTTTGTATACTGAAAATGTGGATTTGGAAACTCCAGATACCCATATTGTATACAAAGCAGGCACAGATGACAGCAGCTCTTCTATTAATTTGGGTCAGCAAGCCATGCCCAACAGACCTAACTACATTGGTTTCAGAGACAACTTTATCGGGCTCATGTACTACAACAGCACTGGCAATATGGGGGTGCTGGCCGGTCAGGCTTCTCAGCTGAATGCTGTGGTTGACTTGCAAGACAGAAACACCGAGCTGTCCTACCAGCTCTTGCTTGACTCTCTGGGTGACAGAACCCGGTATTTCAGTATGTGGAATCAGGCGGTGGACAGCTATGATCCTGATGTGCGCATTATTGAAAATCATGGTGTGGAGGATGAACTTCCCAACTATTGTTTCCCTCTGGATGCTGTTGGCAGAACAGATACTTATCAGGGAATTAAGGCTAATGGAACTGATCAAACCACATGGACCAAAGATGACAGTGTCAATGATGCTAATGAGATAGGCAAGGGTAATCCATTCGCCATGGAAATCAACATCCAAGCCAACCTGTGGAGGAACTTCCTCTACGCCAACGTGGCCCTGTACCTGCCCGACTCTTACAAGTACACGCCGGCCAATGTTACCCTGCCCACCAACACCAACACCTACGATTACATGAACGGCCGGGTGGTGGCGCCCTCGCTGGTGGACTCCTACATCAACATCGGGGCGCGCTGGTCGCTGGATCCCATGGACAACGTGAACCCCTTCAACCACCACCGCAATGCGGGGCTGCGCTACCGCTCCATGCTCCTGGGCAACGGGCGCTACGTGCCCTTCCACATCCAGGTGCCCCAGAAATTTTTCGCCATCAAGAGCCTCCTGCTCCTGCCCGGGTCCTACACCTACGAGTGGAACTTCCGCAAGGACGTCAACATGATCCTGCAGAGCTCCCTCGGCAACGACCTGCGCACGGACGGGGCCTCCATCTCCTTCACCAGCATCAACCTCTACGCCACCTTCTTCCCCATGGCGCACAACACGGCCTCCACGCTCGAGGCCATGCTGCGCAACGACACCAACGACCAGTCCTTCAACGACTACCTCTCGGCGGCCAACATGCTCTACCCCATCCCGGCCAACGCCACCAACGTGCCCATCTCCATCCCCTCGCGCAACTGGGCCGCCTTCCGCGGCTGGTCCTTCACGCGTCTCAAGACCAAGGAGACGCCCTCGCTGGGCTCCGGGTTCGACCCCTACTTCGTCTACTCGGGCTCCATCCCCTACCTCGACGGCACCTTCTACCTCAACCACACCTTCAAGAAGGTCTCCATCACCTTCGACTCCTCCGTCAGCTGGCCCGGCAACGACCGGCTCCTGACGCCCAACGAGTTCGAAATCAAGCGCACCGTCGACGGCGAGGGCTACAACGTGGCCCAGTGCAACATGACCAAGGACTGGTTCCTGGTCCAGATGCTGGCCCACTACAACATCGGCTACCAGGGCTTCTACGTGCCCGAGGGCTACAAGGACCGCATGTACTCCTTCTTCCGCAACTTCCAGCCCATGAGCCGCCAGGTGGTGGACGAGGTCAACTACAAGGACTACCAGGCCGTCACCCTGGCCTACCAGCACAACAACTCGGGCTTCGTCGGCTACCTCGCGCCCACCATGCGCCAGGGCCAGCCCTACCCCGCCAACTACCCCTACCCGCTCATCGGCAAGAGCGCCGTCACCAGCGTCACCCAGAAAAAGTTCCTCTGCGACAGGGTCATGTGGCGCATCCCCTTCTCCAGCAACTTCATGTCCATGGGCGCGCTCACCGACCTCGGCCAGAACATGCTCTATGCCAACTCCGCCCACGCGCTAGACATGAATTTCGAAGTCGACCCCATGGATGAGTCCACCCTTCTCTATGTTGTCTTCGAAGTCTTCGACGTCGTCCGAGTGCACCAGCCCCACCGCGGCGTCATCGAGGCCGTCTACCTGCGCACCCCCTTCTCGGCCGGTAACGCCACCACCTAAGCTCTTGCTTCTTGCAAGCCATGGCCGCGGGCTCCGGCGAGCAGGAGCTCAGGGCCATCATCCGCGACCTGGGCTGCGGGCCCTACTTCCTGGGCACCTTCGATAAGCGCTTCCCGGGATTCATGGCCCCGCACAAGCTGGCCTGCGCCATCGTCAACACGGCCGGCCGCGAGACCGGGGGCGAGCACTGGCTGGCCTTCGCCTGGAACCCGCGCTCGAACACCTGCTACCTCTTCGACCCCTTCGGGTTCTCGGACGAGCGCCTCAAGCAGATCTACCAGTTCGAGTACGAGGGCCTGCTGCGCCGCAGCGCCCTGGCCACCGAGGACCGCTGCGTCACCCTGGAAAAGTCCACCCAGACCGTGCAGGGTCCGCGCTCGGCCGCCTGCGGGCTCTTCTGCTGCATGTTCCTGCACGCCTTCGTGCACTGGCCCGACCGCCCCATGGACAAGAACCCCACCATGAACTTGCTGACGGGGGTGCCCAACGGCATGCTCCAGTCGCCCCAGGTGGAACCCACCCTGCGCCGCAACCAGGAGGCGCTCTACCGCTTCCTCAACTCCCACTCCGCCTACTTTCGCTCCCACCGCGCGCGCATCGAGAAGGCCACCGCCTTCGACCGCATGAATCAAGACATGTAAACCGTGTGTGTATGTTAAATGTCTTTAATAAACAGCACTTTCATGTTACACATGCATCTGAGATGATTTATTTAGAAATCGAAAGGGTTCTGCCGGGTCTCGGCATGGCCCGCGGGCAGGGACACGTTGCGGAACTGGTACTTGGCCAGCCACTTGAACTCGGGGATCAGCAGTTTGGGCAGCGGGGTGTCGGGGAAGGAGTCGGTCCACAGCTTCCGCGTCAGTTGCAGGGCGCCCAGCAGGTCGGGCGCGGAGATCTTGAAATCGCAGTTGGGACCCGCGTTCTGCGCGCGGGAGTTGCGGTACACGGGGTTGCAGCACTGGAACACCATCAGGGCCGGGTGCTTCACGCTCGCCAGCACCGTCGCGTCGGTGATGCTCTCCACGTCGAGGTCCTCGGCGTTGGCCATCCCGAAGGGGGTCATCTTGCAGGTCTGCCTTCCCATGGTGGGCACGCACCCGGGCTTGTGGTTGCAATCGCAGTGCAGGGGGATCAGCATCATCTGGGCCTGGTCGGCGTTCATCCCCGGGTACATGGCCTTCATGAAAGCCTCCAATTGCCTGAACGCCTGCTGGGCCTTGGCTCCCTCGGTGAAGAAGACCCCGCAGGACTTGCTAGAGAACTGGTTGGTGGCGCACCCGGCGTCGTGCACGCAGCAGCGCGCGTCGTTGTTGGCCAGCTGCACCACGCTGCGCCCCCAGCGGTTCTGGGTGATCTTGGCCCGGTCGGGGTTCTCCTTCAGCGCGCGCTGCCCGTTCTCGCTCGCCACATCCATCTCGATCATGTGCTCCTTCTGGATCATGGTGGTCCCGTGCAGGCACCGCAGCTTGCCCTCGGCCTCGGTGCACCCGTGCAGCCACAGCGCGCACCCGGTGCACTCCCAGTTCTTGTGGGCGATCTGGGAATGCGCGTGCACGAAGCCCTGCAGGAAGCGGCCCATCATGGTGGTCAGGGTCTTGTTGCTAGTGAAGGTCAGCGGAATGCCGCGGTGCTCCTCGTTGATGTACAGGTGGCAGATGCGGCGGTACACCTCGCCCTGCTCGGGCATCAGCTGGAAGTTGGCTTTCAGGTCGGTCTCCACGCGGTAGCGGTCCATCAGCATAGTCATGATTTCCATACCCTTCTCCCAGGCCGAGACGATGGGCAGGCTCATAGGGTTCTTCACCATCATCTTAGCGCTAGCAGCCGCGGCCAGGGGGTCGCTCTCGTCCAGGGTCTCAAAGCTCCGCTTGCCGTCCTTCTCGGTGATCCGCACCGGGGGGTAGCTGAAGCCCACGGCCGCCAGCTCCTCCTCGGCCTGTCTTTCGTCCTCGCTGTCCTGGCTGACGTCCTGCAGGACCACATGCTTGGTCTTGCGGGGTTTCTTCTTGGGCGGCAGCGGCGGCGGAGATGTTGGAGATGGCGAGGGGGAGCGCGAGTTCTCGCTCACCACTACTATCTCTTCCTCTTCTTGGTCCGAGGCCACGCGGCGGTAGGTATGTCTCTTCGGGGGCAGAGGCGGAGGCGACGGGCTCTCGCCGCCGCGACTTGGCGGATGGCTGGCAGAGCCCCTTCCGCGTTCGGGGGTGCGCTCCCGGCGGCGCTCTGACTGACTTCCTCCGCGGCCGGCCATTGTGTTCTCCTAGGGAGGAACAACAAGCATGGAGACTCAGCCATCGCCAACCTCGCCATCTGCCCCCACCGCCGACGAGAAGCAGCAGCAGCAGAATGAAAGCTTAACCGCCCCGCCGCCCAGCCCCGCCACCTCCGACGCGGCCGTCCCAGACATGCAAGAGATGGAGGAATCCATCGAGATTGACCTGGGCTATGTGACGCCCGCGGAGCACGAGGAGGAGCTGGCAGTGCGCTTTTCACAAGAAGAGATACACCAAGAACAGCCAGAGCAGGAAGCAGAGAATGAGCAGAGTCAGGCTGGGCTCGAGCATGACGGCGACTACCTCCACCTGAGCGGGGGGGAGGACGCGCTCATCAAGCATCTGGCCCGGCAGGCCACCATCGTCAAGGATGCGCTGCTCGACCGCACCGAGGTGCCCCTCAGCGTGGAGGAGCTCAGCCGCGCCTACGAGTTGAACCTCTTCTCGCCGCGCGTGCCCCCCAAGCGCCAGCCCAATGGCACCTGCGAGCCCAACCCGCGCCTCAACTTCTACCCGGTCTTCGCGGTGCCCGAGGCCCTGGCCACCTACCACATCTTTTTCAAGAACCAAAAGATCCCCGTCTCCTGCCGCGCCAACCGCACCCGCGCCGACGCCCTTTTCAACCTGGGTCCCGGCGCCCGCCTACCTGATATCGCCTCCTTGGAAGAGGTTCCCAAGATCTTCGAGGGTCTGGGCAGCGACGAGACTCGGGCCGCGAACGCTCTGCAAGGAGAAGGAGGAGAGCATGAGCACCACAGCGCCCTGGTCGAGTTGGAAGGCGACAACGCGCGGCTGGCGGTGCTCAAACGCACGGTCGAGCTGACCCATTTCGCCTACCCGGCTCTGAACCTGCCCCCCAAAGTCATGAGCGCGGTCATGGACCAGGTGCTCATCAAGCGCGCGTCGCCCATCTCCGAGGACGAGGGCATGCAAGACTCCGAGGAGGGCAAGCCCGTGGTCAGCGACGAGCAGCTGGCCCGGTGGCTGGGTCCTAATGCTAGTCCCCAGAGTTTGGAAGAGCGGCGCAAACTCATGATGGCCGTGGTCCTGGTGACCGTGGAGCTGGAGTGCCTGCGCCGCTTCTTCGCCGACGCGGAGACCCTGCGCAAGGTCGAGGAGAACCTGCACTACCTCTTCAGGCACGGGTTCGTGCGCCAGGCCTGCAAGATCTCCAACGTGGAGCTGACCAACCTGGTCTCCTACATGGGCATCTTGCACGAGAACCGCCTGGGGCAGAACGTGCTGCACACCACCCTGCGCGGGGAGGCCCGGCGCGACTACATCCGCGACTGCGTCTACCTCTACCTCTGCCACACCTGGCAGACGGGCATGGGCGTGTGGCAGCAGTGTCTGGAGGAGCAGAACCTGAAAGAGCTCTGCAAGCTCCTGCAGAAGAACCTCAAGGGTCTGTGGACCGGGTTCGACGAGCGCACCACCGCCTCGGACCTGGCCGACCTCATTTTCCCCGAGCGCCTCAGGCTGACGCTGCGCAACGGCCTGCCCGACTTTATGAGCCAAAGCATGTTGCAAAACTTTCGCTCTTTCATCCTCGAACGCTCCGGAATCCTGCCCGCCACCTGCTCCGCGCTGCCCTCGGACTTCGTGCCGCTGACCTTCCGCGAGTGCCCCCCGCCGCTGTGGAGCCACTGCTACCTGCTGCGCCTGGCCAACTACCTGGCCTACCACTCGGACGTGATCGAGGACGTCAGCGGCGAGGGCCTGCTCGAGTGCCACTGCCGCTGCAACCTCTGCACGCCGCACCGCTCCCTGGCCTGCAACCCCCAGCTGCTGAGCGAGACCCAGATCATCGGCACCTTCGAGTTGCAAGGGCCCAGCGAAGGCGAGGGTTCAGCCGCCAAGGGGGGTCTGAAACTCACCCCGGGGCTGTGGACCTCGGCCTACTTGCGCAAGTTCGTGCCCGAGGACTACCATCCCTTCGAGATCAGGTTCTACGAGGACCAATCCCATCCGCCCAAGGCCGAGCTGTCGGCCTGCGTCATCACCCAGGGGGCGATCCTGGCCCAATTGCAAGCCATCCAGAAATCCCGCCAAGAATTCTTGCTGAAAAAGGGCCGCGGGGTCTACCTCGACCCCCAGACCGGTGAGGAGCTCAACCCCGGCTTCCCCCAGGATGCCCCGAGGAAACAAGAAGCTGAAAGTGGAGCTGCCGCCCGTGGAGGATTTGGAGGAAGACTGGGAGAACAGCAGTCAGGCAGAGGAGGAGGAGATGGAGGAAGACTGGGACAGCACTCAGGCAGAGGAGGACAGCCTGCAAGACAGTCTGGAGGAAGACGAGGAGGAGGCAGAGGAGGAGGTGGAAGAAGCAGCCGCCGCCAGACCGTCGTCCTCGGCGGGGGAGAAAGCAAGCAGCACGGATACCATCTCCGCTCCGGGTCGGGGTCCCGCTCGACCACACAGTAGATGGGACGAGACCGGACGATTCCCGAACCCCACCACCCAGACCGGTAAGAAGGAGCGGCAGGGATACAAGTCCTGGCGGGGGCACAAAAACGCCATCGTCTCCTGCTTGCAGGCCTGCGGGGGCAACATCTCCTTCACCCGGCGCTACCTGCTCTTCCACCGCGGGGTGAACTTTCCCCGCAACATCTTGCATTACTACCGTCACCTCCACAGCCCCTACTACTTCCAAGAAGAGGCAGCAGCAGCAGAAAAAGACCAGCAGAAAACCAGCAGCTAGAAAATCCACAGCGGCGGCAGCAGGTGGACTGAGGATCGCGGCGAACGAGCCGGCGCAAACCCGGGAGCTGAGGAACCGGATCTTTCCCACCCTCTATGCCATCTTCCAGCAGAGTCGGGGGCAGGAGCAGGAACTGAAAGTCAAGAACCGTTCTCTGCGCTCGCTCACCCGCAGTTGTCTGTATCACAAGAGCGAAGACCAACTTCAGCGCACTCTCGAGGACGCCGAGGCTCTCTTCAACAAGTACTGCGCGCTCACTCTTAAAGAGTAGCCCGCGCCCGCCCAGTCGCAGAAAAAGGCGGGAATTACGTCACCTGTGCCCTTCGCCCTAGCCGCCTCCACCCATCATCATGAGCAAAGAGATTCCCACGCCTTACATGTGGAGCTACCAGCCCCAGATGGGCCTGGCCGCCGGTGCCGCCCAGGACTACTCCACCCGCATGAATTGGCTCAGCGCCGGGCCCGCGATGATCTCACGGGTGAATGACATCCGCGCCCACCGAAACCAGATACTCCTAGAACAGTCAGCGCTCACCGCCACGCCCCGCAATCACCTCAATCCGCGTAATTGGCCCGCCGCCCTGGTGTACCAGGAAATTCCCCAGCCCACGACCGTACTACTTCCGCGAGACGCCCAGGCCGAAGTCCAGCTGACTAACTCAGGTGTCCAGCTGGCGGGCGGCGCCACCCTGTGTCGTCACCGCCCCGCTCAGGGTATAAAGCGGCTGGTGATCCGGGGCAGAGGCACACAGCTCAACGACGAGGTGGTGAGCTCTTCGCTGGGTCTGCGACCTGACGGAGTCTTCCAACTCGCCGGATCGGGGAGATCTTCCTTCACGCCTCGTCAGGCCGTCCTGACTTTGGAGAGTTCGTCCTCGCAGCCCCGCTCGGGTGGCATCGGCACTCTCCAGTTCGTGGAGGAGTTCACTCCCTCGGTCTACTTCAACCCCTTCTCCGGCTCCCCCGGCCACTACCCGGACGAGTTCATCCCGAACTTCGACGCCATCAGCGAGTCGGTGGACGGCTACGATTGAAACTAATCACCCCCTTATCCAGTGAAATAAAGATCATATTGATGATGATTTTACAGAAATAAAAAATAATCATTTGATTTGAAATAAAGATACAATCATATTGATGATTTGAGTTTAACAAAAAAATAAAGAATCACTTACTTGAAATCTGATACCAGGTCTCTGTCCATGTTTTCTGCCAACACCACTTCACTCCCCTCTTCCCAGCTCTGGTACTGCAGGCCCCGGCGGGCTGCAAACTTCCTCCACACGCTGAAGGGGATGTCAAATTCCTCCTGTCCCTCAATCTTCATTTTATCTTCTATCAGATGTCCAAAAAGCGCGTCCGGGTGGATGATGACTTCGACCCCGTCTACCCCTACGATGCAGACAACGCACCGACCGTGCCCTTCATCAACCCCCCCTTCGTCTCTTCAGATGGATTCCAAGAGAAGCCCCTGGGGGTGTTGTCCCTGCGACTGGCCGACCCCGTCACCACCAAGAACGGGGAAATCACCCTCAAGCTGGGAGAGGGGGTGGACCTCGATTCCTCGGGAAAACTCATCTCCAACACGGCCACCAAGGCCGCCGCCCCTCTCAGTTTTTCCAACAACACCATTTCCCTTAACATGGATCACCCCTTTTACACTAAAGATGGAAAATTATCCTTACAAGTTTCTCCACCATTAAATATACTGAGAACAAGCATTCTAAACACACTAGCTTTAGGTTTTGGATCAGGTTTAGGACTCCGTGGCTCTGCCTTGGCAGTACAGTTAGTCTCTCCACTTACATTTGATACTGATGGAAACATAAAGCTTACCTTAGACAGAGGTTTGCATGTTACAACAGGAGATGCAATTGAAAGCAACATAAGCTGGGCTAAAGGTTTAAAATTTGAAGATGGAGCCATAGCAACCAACATTGGAAATGGGTTAGAGTTTGGAAGCAGTAGTACAGAAACAGGTGTTGATGATGCTTACCCAATCCAAGTTAAACTTGGATCTGGCCTTAGCTTTGACAGTACAGGAGCCATAATGGCTGGTAACAAAGAAGACGATAAACTCACTTTGTGGACAACACCTGATCCATCACCAAACTGTCAAATACTCGCAGAAAATGATGCAAAACTAACACTTTGCTTGACTAAATGTGGTAGTCAAATACTGGCCACTGTGTCAGTCTTAGTTGTAGGAAGTGGAAACCTAAACCCCATTACTGGCACCGTAAGCAGTGCTCAGGTGTTTCTACGTTTTGATGCAAACGGTGTTCTTTTAACAGAACATTCTACACTAAAAAAATACTGGGGGTATAGGCAGGGAGATAGCATAGATGGCACTCCATATACCAATGCTGTAGGATTCATGCCCAATTTAAAAGCTTATCCAAAGTCACAAAGTTCTACTACTAAAAATAATATAGTAGGGCAAGTATACATGAATGGAGATGTTTCAAAACCTATGCTTCTCACTATAACCCTCAATGGTACTGATGACAGCAACAGTACATATTCAATGTCATTTTCATACACCTGGACTAATGGAAGCTATGTTGGAGCAACATTTGGGGCTAACTCTTATACCTTCTCATACATCGCCCAAGAATGAACACTGTATCCCACCCTGCATGCCAACCCTTCCCACCCCACTCTGTGGAACAAACTCTGAAACACAAAATAAAATAAAGTTCAAGTGTTTTATTGATTCAACAGTTTTACAGGATTCGAGCAGTTATTTTTCCTCCACCCTCCCAGGACATGGAATACACCACCCTCTCCCCCCGCACAGCCTTGAACATCTGAATGCCATTGGTGATGGACATGCTTTTGGTCTCCACGTTCCACACAGTTTCAGAGCGAGCCAGTCTCGGGTCGGTCAGGGAGATGAAACCCTCCGGGCACTCCCGCATCTGCACCTCACAGCTCAACAGCTGAGGATTGTCCTCGGTGGTCGGGATCACGGTTATCTGGAAGAAGCAGAAGAGCGGCGGTGGGAATCATAGTCCGCGAACGGGATCGGCCGGTGGTGTCGCATCAGGCCCCGCAGCAGTCGCTGCCGCCGCCGCTCCGTCAAGCTGCTGCTCAGGGGGTCCGGGTCCAGGGACTCCCTCAGCATGATGCCCACGGCCCTCAGCATCAGTCGTCTGGTGCGGCGGGCGCAGCAGCGCATGCGGATCTCGCTCAGGTCGCTGCAGTACGTGCAACACAGAACCACCAGGTTGTTCAACAGTCCATAGTTCAACACGCTCCAGCCGAAACTCATCGCGGGAAGGATGCTACCCACGTGGCCGTCGTACCAGATCCTCAGGTAAATCAAGTGGTGCCCCCTCCAGAACACGCTGCCCACGTACATGATCTCCTTGGGCATGTGGCGGTTCACCACCTCCCGGTACCACATCACCCTCTGGTTGAACATGCAGCCCCGGATGATCCTGCGGAACCACAGGGCCAGCACCGCCCCGCCCGCCATGCAGCGAAGAGACCCCGGGTCCCGGCAATGGCAATGGAGGACCCACCGCTCGTACCCGTGGATCATCTGGGAGCTGAACAAGTCTATGTTGGCACAGCACAGGCATATGCTCATGCATCTCTTCAGCACTCTCAACTCCTCGGGGGTCAAAACCATATCCCAGGGCACGGGGAACTCTTGCAGGACAGCGAACCCCGCAGAACAGGGCAATCCTCGCACAGAACTTACATTGTGCATGGACAGGGTATCGCAATCAGGCAGCACCGGGTGATCCTCCACCAGAGAAGCGCGGGTCTCGGTCTCCTCACAGCGTGGTAAGGGGGCCGGCCGATACGGGTGATGGCGGGACGCGGCTGATCGTGTTCGCGACCGTGTCATGATGCAGTTGCTTTCGGACATTTTCGTACTTGCTGTAGCAGAACCTGGTCCGGGCGCTGCACACCGATCGCCGGCGGCGGTCTCGGCGCTTGGAACGCTCGGTGTTGAAATTGTAAAACAGCCACTCTCTCAGACCGTGCAGCAGATCTAGGGCCTCAGGAGTGATGAAGATCCCATCATGCCTGATGGCTCTGATCACATCGACCACCGTGGAATGGGCCAGACCCAGCCAGATGATGCAATTTTGTTGGGTTTCGGTGACGGCGGGGGAGGGAAGAACAGGAAGAACCATGATTAACTTTTAATCCAAACGGTCTCGGAGTACTTCAAAATGAAGATCGCGGAGATGGCACCTCTCGCCCCCGCTGTGTTGGTGGAAAATAACAGCCAGGTCAAAGGTGATACGGTTCTCGAGATGTTCCACGGTGGCTTCCAGCAAAGCCTCCACGCGCACATCCAGAAACAAGACAATAGCGAAAGCGGGAGGGTTCTCTAATTCCTCAATCATCATGTTACACTCCTGCACCATCCCCAGATAATTTTCATTTTTCCAGCCTTGAATGATTCGAACTAGTTCCTGAGGTAAATCCAAGCCAGCCATGATAAAGAGCTCGCGCAGAGCGCCCTCCACCGGCATTCTTAAGCACACCCTCATAATTCCAAGATATTCTGCTCCTGGTTCACCTGCAGCAGATTGACAAGCGGAATATCAAAATCTCTGCCGCGATCCCTGAGCTCCTCCCTCAGCAATAACTGTAAGTACTCTTTCATATCCTCTCCGAAATTTTTAGCCATAGGACCACCAGGAATAAGATTAGGGCAAGCCACAGTACAGATAAACCGAAGTCCTCCCCAGTGAGCATTGCCAAATGCAAGACTGCTATAAGCATGCTGGCTAGACCCGGTGATATCTTCCAGATAACTGGACAGAAAATCGCCCAGGCAATTTTTAAGAAAATCAACAAAAGAAAAATCCTCCAGGTGGACGTTTAGAGCCTCGGGAACAACGATGAAGTAAATGCAAGCGGTGCGTTCCAGCATGGTTAGTTAGCTGATCTGTAGAAAAAACAAAAATGAACATTAAACCATGCTAGCCTGGCGAACAGGTGGGTAAATCGTTCTCTCCAGCACCAGGCAGGCCACGGGGTCTCCGGCGCGACCCTCGTAAAAATTGTCGCTATGATTGAAAACCATCACAGAGAGACGTTCCCGGTGGCCGGCGTGAATGATTCGACAAGATGAATACACCCCCGGAACATTGGCGTCCGCGAGTGAAAAAAAGCGCCCGAGGAAGCAATAAGGCACTACAATGCTCAGTCTCAAGTCCAGCAAAGCGATGCCATGCGGATGAAGCACAAAATTCTCAGGTGCGTACAAAATGTAATTACTCCCCTCCTGCACAGGCAGCAAAGCCCCCGATCCCTCCAGGTACACATACAAAGCCTCAGCGTCCATAGCTTACCGAGCAGCAGCACACAACAGGCGCAAGAGTCAGAGAAAGGCTGAGCTCTAACCTGTCCACCCGCTCTCTGCTCAATATATAGCCCAGATCTACACTGACGTAAAGGCCAAAGTCTAAAAATACCCGCCAAATAATCACACACGCCCAGCACACGCCCAGAAACCGGTGACACACTCAAAAAAATACGCGCACTTCCTCAAACGCCCAAAACTGCCGTCATTTCCGGGTTCCCACGCTACGTCATCAAAACACGACTTTCAAATTCCGTCGACCGTTAAAAACGTCACCCGCCCCGCCCCTAACGGTCGCCCGTCTCTCAGCCAATCAGCGCCCCGCATCCCCAAATTCAAACACCTCATTTGCATATTAACGCGCACAAAAAGTTTGAGGTATATTATTGATGATGG
ChAdV68-CMT-TSNA (SEQ ID NO:68)
CATCATCAATAATATACCTCAAACTTTTTGTGCGCGTTAATATGCAAATGAGGCGTTTGAATTTGGGGAGGAAGGGCGGTGATTGGTCGAGGGATGAGCGACCGTTAGGGGCGGGGCGAGTGACGTTTTGATGACGTGGTTGCGAGGAGGAGCCAGTTTGCAAGTTCTCGTGGGAAAAGTGACGTCAAACGAGGTGTGGTTTGAACACGGAAATACTCAATTTTCCCGCGCTCTCTGACAGGAAATGAGGTGTTTCTGGGCGGATGCAAGTGAAAACGGGCCATTTTCGCGCGAAAACTGAATGAGGAAGTGAAAATCTGAGTAATTTCGCGTTTATGGCAGGGAGGAGTATTTGCCGAGGGCCGAGTAGACTTTGACCGATTACGTGGGGGTTTCGATTACCGTGTTTTTCACCTAAATTTCCGCGTACGGTGTCAAAGTCCGGTGTTTTTACGTAGGTGTCAGCTGATCGCCAGGGTATTTAAACCTGCGCTCTCCAGTCAAGAGGCCACTCTTGAGTGCCAGCGAGAAGAGTTTTCTCCTCCGCGCCGCGAGTCAGATCTACACTTTGAAAGTAGGGATAACAGGGTAATGACATTGATTATTGACTAGTTGTTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTCCGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTACGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACACCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAATAACCCCGCCCCGTTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTCTCCCTATCAGTGATAGAGATCTCCCTATCAGTGATAGAGATCGTCGACGAGCTCGTTTAGTGAACCGTCAGATCGCCTGGAACGCCATCCACGCTGTTTTGACCTCCATAGAAGACAGCGATCGCGCCACCATGGCTGGCATGACCGAGTACAAGCTAGTCGTTGTGGGAGCTGGAGATGTGGGCAAATCTGCTCTGACCATTCAGCTGATTCAGGGCACAGATCTGGATCACCAGGAGAAGTGTCTGAGCAGGCTGTACGACCACATGCCAGAAGGATTAACCCCTCTTATGGGAGTGAGCTCTTCTTCTGCTCTGGCCAGACTGGGACTGCCTATGGATAAGCTGAACAAGATCACAGCTCCTGCCTCTCAGAAACTGAGACAGCTGCAGAAGATGGAGACCCCTGAACTGCTGCCTTGTGGATATCTGGTGGAGGAGAATACCACAATCAGCGTGACCGTGAAAGGCCTGGAAGCCCAGAACAAGATCAAAGGCTGTACCGGCTCTGTGAATATGACACTGCAGAGAGCTTCTGCCGCCCCTAAGACAGGAGGAGGAGGAGAAGCTGCTGCCTACAATAATACATTAGTGGCCAGACATGTGCCCCAGATCCCTAAGCCTGACAGCCTGGTTGGCCTGAGCGATGAATTAGGAAAAAGAGACACATTTGCCGAGAGCCTGATCCGGAGAATGGCCTCTGCCGGCTACCTGTTCCTGGATATCATCACATATGTTGTGTTTGCCGTGACCTTCGTGCTGGGAGTTCTGGGCGGCCTGAATACCGAGACCAATGAAAAAGCTCTTGAAGCCGTGTTTGGCAAGTACGGCAGAATCGTGGAGGTGCTGGGCGGCAGATCTTGTGAAGAATTAACAGCTGTGTTACCACCTCCTCAGCTGCTTGGCAGACGGTTCAACTTCTTCAGCTACAGCTACGTTGCTGCTGGCTCTTCTGGCAACAACTACGACCTGATGGCCCAGCCTATTACACCTGGACCTGATACAACACCTCTGCCTGTGACCGATACATCTTCTGTGTCTACCGGACACGCCACATCTCTGCCAGTGACAGATGCTGGACTGAGAGTGACAGAGTCTAAAGGACACAGCGATTCTTGGCACCTGAGCCTGGATACAGCCATCAGGGTGAATACCCCTAAGCTGGTTTCTGAAGTGGAAGAGCTGAACAAGAGCATCACCGCCCTGAGGGAGAAGTTACTGCAGATGGTGGAAGCCGATAGACCTGGAAACCTGTTTATTGGAGGCCTGAACACCGAGACCAATGAGGACTCTCCCGTGAAGGATGAAGTGGTGGTGAACGATCAATGGGGCCAGAATTGTAGCTGCCATCATGGAGGCTACGAGTTCCCTGATCTGCACAGGACAATCGTGTCTGAGTGCGATGTGTATCTGACCTACATGCTGAGACAGGCTGCTCTGCAGCTGTTCTTCGACCTGTATCACAGCATCCCTAGCAGCTTTTCTCCTCTGGTTCTGAGCTGTCTGGTGCAGCCTCTGGAAGATGTGGAAGTGATGGAGAAGGATGGCACAACCTTTAGCTGTGAGGTGAGCCACGATGAGGTGCCTCGGACATATGGACCCGTGTTTATGTGTCTGGGAGGACTGCTGACCATGGTGGCTGGAGCTGTTTGGCTGACAGTTGGACCCGGACCAGGCGCCAAATTTGTTGCTGCTTGGACACTGAAAGCTGCTGCTGGGCCCGGACCAGGCCAGTACATCAAGGCCAACTCTAAGTTTATCGGCATCACCGAATTGGGACCTGGACCCGGCTAGTAGTGAGTTTAAACTCCCATTTAAATGTGAGGGTTAATGCTTCGAGCAGACATGATAAGATACATTGATGAGTTTGGACAAACCACAACTAGAATGCAGTGAAAAAAATGCTTTATTTGTGAAATTTGTGATGCTATTGCTTTATTTGTAACCATTATAAGCTGCAATAAACAAGTTAACAACAACAATTGCATTCATTTTATGTTTCAGGTTCAGGGGGAGATGTGGGAGGTTTTTTAAAGCAAGTAAAACCTCTACAAATGTGGTAAAATAACTATAACGGTCCTAAGGTAGCGAGTGAGTAGTGTTCTGGGGCGGGGGAGGACCTGCATGAGGGCCAGAATAACTGAAATCTGTGCTTTTCTGTGTGTTGCAGCAGCATGAGCGGAAGCGGCTCCTTTGAGGGAGGGGTATTCAGCCCTTATCTGACGGGGCGTCTCCCCTCCTGGGCGGGAGTGCGTCAGAATGTGATGGGATCCACGGTGGACGGCCGGCCCGTGCAGCCCGCGAACTCTTCAACCCTGACCTATGCAACCCTGAGCTCTTCGTCGTTGGACGCAGCTGCCGCCGCAGCTGCTGCATCTGCCGCCAGCGCCGTGCGCGGAATGGCCATGGGCGCCGGCTACTACGGCACTCTGGTGGCCAACTCGAGTTCCACCAATAATCCCGCCAGCCTGAACGAGGAGAAGCTGTTGCTGCTGATGGCCCAGCTCGAGGCCTTGACCCAGCGCCTGGGCGAGCTGACCCAGCAGGTGGCTCAGCTGCAGGAGCAGACGCGGGCCGCGGTTGCCACGGTGAAATCCAAATAAAAAATGAATCAATAAATAAACGGAGACGGTTGTTGATTTTAACACAGAGTCTGAATCTTTATTTGATTTTTCGCGCGCGGTAGGCCCTGGACCACCGGTCTCGATCATTGAGCACCCGGTGGATCTTTTCCAGGACCCGGTAGAGGTGGGCTTGGATGTTGAGGTACATGGGCATGAGCCCGTCCCGGGGGTGGAGGTAGCTCCATTGCAGGGCCTCGTGCTCGGGGGTGGTGTTGTAAATCACCCAGTCATAGCAGGGGCGCAGGGCATGGTGTTGCACAATATCTTTGAGGAGGAGACTGATGGCCACGGGCAGCCCTTTGGTGTAGGTGTTTACAAATCTGTTGAGCTGGGAGGGATGCATGCGGGGGGAGATGAGGTGCATCTTGGCCTGGATCTTGAGATTGGCGATGTTACCGCCCAGATCCCGCCTGGGGTTCATGTTGTGCAGGACCACCAGCACGGTGTATCCGGTGCACTTGGGGAATTTATCATGCAACTTGGAAGGGAAGGCGTGAAAGAATTTGGCGACGCCTTTGTGCCCGCCCAGGTTTTCCATGCACTCATCCATGATGATGGCGATGGGCCCGTGGGCGGCGGCCTGGGCAAAGACGTTTCGGGGGTCGGACACATCATAGTTGTGGTCCTGGGTGAGGTCATCATAGGCCATTTTAATGAATTTGGGGCGGAGGGTGCCGGACTGGGGGACAAAGGTTCCCTCGATCCCGGGGGCGTAGTTCCCCTCACAGATCTGCATCTCCCAGGCTTTGAGCTCGGAGGGGGGGATCATGTCCACCTGCGGGGCGATAAAGAACACGGTTTCCGGGGCGGGGGAGATGAGCTGGGCCGAAAGCAAGTTCCGGAGCAGCTGGGACTTGCCGCAGCCGGTGGGGCCGTAGATGACCCCGATGACCGGCTGCAGGTGGTAGTTGAGGGAGAGACAGCTGCCGTCCTCCCGGAGGAGGGGGGCCACCTCGTTCATCATCTCGCGCACGTGCATGTTCTCGCGCACCAGTTCCGCCAGGAGGCGCTCTCCCCCCAGGGATAGGAGCTCCTGGAGCGAGGCGAAGTTTTTCAGCGGCTTGAGTCCGTCGGCCATGGGCATTTTGGAGAGGGTTTGTTGCAAGAGTTCCAGGCGGTCCCAGAGCTCGGTGATGTGCTCTACGGCATCTCGATCCAGCAGACCTCCTCGTTTCGCGGGTTGGGACGGCTGCGGGAGTAGGGCACCAGACGATGGGCGTCCAGCGCAGCCAGGGTCCGGTCCTTCCAGGGTCGCAGCGTCCGCGTCAGGGTGGTCTCCGTCACGGTGAAGGGGTGCGCGCCGGGCTGGGCGCTTGCGAGGGTGCGCTTCAGGCTCATCCGGCTGGTCGAAAACCGCTCCCGATCGGCGCCCTGCGCGTCGGCCAGGTAGCAATTGACCATGAGTTCGTAGTTGAGCGCCTCGGCCGCGTGGCCTTTGGCGCGGAGCTTACCTTTGGAAGTCTGCCCGCAGGCGGGACAGAGGAGGGACTTGAGGGCGTAGAGCTTGGGGGCGAGGAAGACGGACTCGGGGGCGTAGGCGTCCGCGCCGCAGTGGGCGCAGACGGTCTCGCACTCCACGAGCCAGGTGAGGTCGGGCTGGTCGGGGTCAAAAACCAGTTTCCCGCCGTTCTTTTTGATGCGTTTCTTACCTTTGGTCTCCATGAGCTCGTGTCCCCGCTGGGTGACAAAGAGGCTGTCCGTGTCCCCGTAGACCGACTTTATGGGCCGGTCCTCGAGCGGTGTGCCGCGGTCCTCCTCGTAGAGGAACCCCGCCCACTCCGAGACGAAAGCCCGGGTCCAGGCCAGCACGAAGGAGGCCACGTGGGACGGGTAGCGGTCGTTGTCCACCAGCGGGTCCACCTTTTCCAGGGTATGCAAACACATGTCCCCCTCGTCCACATCCAGGAAGGTGATTGGCTTGTAAGTGTAGGCCACGTGACCGGGGGTCCCGGCCGGGGGGGTATAAAAGGGTGCGGGTCCCTGCTCGTCCTCACTGTCTTCCGGATCGCTGTCCAGGAGCGCCAGCTGTTGGGGTAGGTATTCCCTCTCGAAGGCGGGCATGACCTCGGCACTCAGGTTGTCAGTTTCTAGAAACGAGGAGGATTTGATATTGACGGTGCCGGCGGAGATGCCTTTCAAGAGCCCCTCGTCCATCTGGTCAGAAAAGACGATCTTTTTGTTGTCGAGCTTGGTGGCGAAGGAGCCGTAGAGGGCGTTGGAGAGGAGCTTGGCGATGGAGCGCATGGTCTGGTTTTTTTCCTTGTCGGCGCGCTCCTTGGCGGCGATGTTGAGCTGCACGTACTCGCGCGCCACGCACTTCCATTCGGGGAAGACGGTGGTCAGCTCGTCGGGCACGATTCTGACCTGCCAGCCCCGATTATGCAGGGTGATGAGGTCCACACTGGTGGCCACCTCGCCGCGCAGGGGCTCATTAGTCCAGCAGAGGCGTCCGCCCTTGCGCGAGCAGAAGGGGGGCAGGGGGTCCAGCATGACCTCGTCGGGGGGGTCGGCATCGATGGTGAAGATGCCGGGCAGGAGGTCGGGGTCAAAGTAGCTGATGGAAGTGGCCAGATCGTCCAGGGCAGCTTGCCATTCGCGCACGGCCAGCGCGCGCTCGTAGGGACTGAGGGGCGTGCCCCAGGGCATGGGATGGGTAAGCGCGGAGGCGTACATGCCGCAGATGTCGTAGACGTAGAGGGGCTCCTCGAGGATGCCGATGTAGGTGGGGTAGCAGCGCCCCCCGCGGATGCTGGCGCGCACGTAGTCATACAGCTCGTGCGAGGGGGCGAGGAGCCCCGGGCCCAGGTTGGTGCGACTGGGCTTTTCGGCGCGGTAGACGATCTGGCGGAAAATGGCATGCGAGTTGGAGGAGATGGTGGGCCTTTGGAAGATGTTGAAGTGGGCGTGGGGCAGTCCGACCGAGTCGCGGATGAAGTGGGCGTAGGAGTCTTGCAGCTTGGCGACGAGCTCGGCGGTGACTAGGACGTCCAGAGCGCAGTAGTCGAGGGTCTCCTGGATGATGTCATACTTGAGCTGTCCCTTTTGTTTCCACAGCTCGCGGTTGAGAAGGAACTCTTCGCGGTCCTTCCAGTACTCTTCGAGGGGGAACCCGTCCTGATCTGCACGGTAAGAGCCTAGCATGTAGAACTGGTTGACGGCCTTGTAGGCGCAGCAGCCCTTCTCCACGGGGAGGGCGTAGGCCTGGGCGGCCTTGCGCAGGGAGGTGTGCGTGAGGGCGAAAGTGTCCCTGACCATGACCTTGAGGAACTGGTGCTTGAAGTCGATATCGTCGCAGCCCCCCTGCTCCCAGAGCTGGAAGTCCGTGCGCTTCTTGTAGGCGGGGTTGGGCAAAGCGAAAGTAACATCGTTGAAGAGGATCTTGCCCGCGCGGGGCATAAAGTTGCGAGTGATGCGGAAAGGTTGGGGCACCTCGGCCCGGTTGTTGATGACCTGGGCGGCGAGCACGATCTCGTCGAAGCCGTTGATGTTGTGGCCCACGATGTAGAGTTCCACGAATCGCGGACGGCCCTTGACGTGGGGCAGTTTCTTGAGCTCCTCGTAGGTGAGCTCGTCGGGGTCGCTGAGCCCGTGCTGCTCGAGCGCCCAGTCGGCGAGATGGGGGTTGGCGCGGAGGAAGGAAGTCCAGAGATCCACGGCCAGGGCGGTTTGCAGACGGTCCCGGTACTGACGGAACTGCTGCCCGACGGCCATTTTTTCGGGGGTGACGCAGTAGAAGGTGCGGGGGTCCCCGTGCCAGCGATCCCATTTGAGCTGGAGGGCGAGATCGAGGGCGAGCTCGACGAGCCGGTCGTCCCCGGAGAGTTTCATGACCAGCATGAAGGGGACGAGCTGCTTGCCGAAGGACCCCATCCAGGTGTAGGTTTCCACATCGTAGGTGAGGAAGAGCCTTTCGGTGCGAGGATGCGAGCCGATGGGGAAGAACTGGATCTCCTGCCACCAATTGGAGGAATGGCTGTTGATGTGATGGAAGTAGAAATGCCGACGGCGCGCCGAACACTCGTGCTTGTGTTTATACAAGCGGCCACAGTGCTCGCAACGCTGCACGGGATGCACGTGCTGCACGAGCTGTACCTGAGTTCCTTTGACGAGGAATTTCAGTGGGAAGTGGAGTCGTGGCGCCTGCATCTCGTGCTGTACTACGTCGTGGTGGTCGGCCTGGCCCTCTTCTGCCTCGATGGTGGTCATGCTGACGAGCCCGCGCGGGAGGCAGGTCCAGACCTCGGCGCGAGCGGGTCGGAGAGCGAGGACGAGGGCGCGCAGGCCGGAGCTGTCCAGGGTCCTGAGACGCTGCGGAGTCAGGTCAGTGGGCAGCGGCGGCGCGCGGTTGACTTGCAGGAGTTTTTCCAGGGCGCGCGGGAGGTCCAGATGGTACTTGATCTCCACCGCGCCATTGGTGGCGACGTCGATGGCTTGCAGGGTCCCGTGCCCCTGGGGTGTGACCACCGTCCCCCGTTTCTTCTTGGGCGGCTGGGGCGACGGGGGCGGTGCCTCTTCCATGGTTAGAAGCGGCGGCGAGGACGCGCGCCGGGCGGCAGGGGCGGCTCGGGGCCCGGAGGCAGGGGCGGCAGGGGCACGTCGGCGCCGCGCGCGGGTAGGTTCTGGTACTGCGCCCGGAGAAGACTGGCGTGAGCGACGACGCGACGGTTGACGTCCTGGATCTGACGCCTCTGGGTGAAGGCCACGGGACCCGTGAGTTTGAACCTGAAAGAGAGTTCGACAGAATCAATCTCGGTATCGTTGACGGCGGCCTGCCGCAGGATCTCTTGCACGTCGCCCGAGTTGTCCTGGTAGGCGATCTCGGTCATGAACTGCTCGATCTCCTCCTCTTGAAGGTCTCCGCGGCCGGCGCGCTCCACGGTGGCCGCGAGGTCGTTGGAGATGCGGCCCATGAGCTGCGAGAAGGCGTTCATGCCCGCCTCGTTCCAGACGCGGCTGTAGACCACGACGCCCTCGGGATCGCGGGCGCGCATGACCACCTGGGCGAGGTTGAGCTCCACGTGGCGCGTGAAGACCGCGTAGTTGCAGAGGCGCTGGTAGAGGTAGTTGAGCGTGGTGGCGATGTGCTCGGTGACGAAGAAATACATGATCCAGCGGCGGAGCGGCATCTCGCTGACGTCGCCCAGCGCCTCCAAACGTTCCATGGCCTCGTAAAAGTCCACGGCGAAGTTGAAAAACTGGGAGTTGCGCGCCGAGACGGTCAACTCCTCCTCCAGAAGACGGATGAGCTCGGCGATGGTGGCGCGCACCTCGCGCTCGAAGGCCCCCGGGAGTTCCTCCACTTCCTCTTCTTCCTCCTCCACTAACATCTCTTCTACTTCCTCCTCAGGCGGCAGTGGTGGCGGGGGAGGGGGCCTGCGTCGCCGGCGGCGCACGGGCAGACGGTCGATGAAGCGCTCGATGGTCTCGCCGCGCCGGCGTCGCATGGTCTCGGTGACGGCGCGCCCGTCCTCGCGGGGCCGCAGCGTGAAGACGCCGCCGCGCATCTCCAGGTGGCCGGGGGGGTCCCCGTTGGGCAGGGAGAGGGCGCTGACGATGCATCTTATCAATTGCCCCGTAGGGACTCCGCGCAAGGACCTGAGCGTCTCGAGATCCACGGGATCTGAAAACCGCTGAACGAAGGCTTCGAGCCAGTCGCAGTCGCAAGGTAGGCTGAGCACGGTTTCTTCTGGCGGGTCATGTTGGTTGGGAGCGGGGCGGGCGATGCTGCTGGTGATGAAGTTGAAATAGGCGGTTCTGAGACGGCGGATGGTGGCGAGGAGCACCAGGTCTTTGGGCCCGGCTTGCTGGATGCGCAGACGGTCGGCCATGCCCCAGGCGTGGTCCTGACACCTGGCCAGGTCCTTGTAGTAGTCCTGCATGAGCCGCTCCACGGGCACCTCCTCCTCGCCCGCGCGGCCGTGCATGCGCGTGAGCCCGAAGCCGCGCTGGGGCTGGACGAGCGCCAGGTCGGCGACGACGCGCTCGGCGAGGATGGCTTGCTGGATCTGGGTGAGGGTGGTCTGGAAGTCATCAAAGTCGACGAAGCGGTGGTAGGCTCCGGTGTTGATGGTGTAGGAGCAGTTGGCCATGACGGACCAGTTGACGGTCTGGTGGCCCGGACGCACGAGCTCGTGGTACTTGAGGCGCGAGTAGGCGCGCGTGTCGAAGATGTAGTCGTTGCAGGTGCGCACCAGGTACTGGTAGCCGATGAGGAAGTGCGGCGGCGGCTGGCGGTAGAGCGGCCATCGCTCGGTGGCGGGGGCGCCGGGCGCGAGGTCCTCGAGCATGGTGCGGTGGTAGCCGTAGATGTACCTGGACATCCAGGTGATGCCGGCGGCGGTGGTGGAGGCGCGCGGGAACTCGCGGACGCGGTTCCAGATGTTGCGCAGCGGCAGGAAGTAGTTCATGGTGGGCACGGTCTGGCCCGTGAGGCGCGCGCAGTCGTGGATGCTCTATACGGGCAAAAACGAAAGCGGTCAGCGGCTCGACTCCGTGGCCTGGAGGCTAAGCGAACGGGTTGGGCTGCGCGTGTACCCCGGTTCGAATCTCGAATCAGGCTGGAGCCGCAGCTAACGTGGTATTGGCACTCCCGTCTCGACCCAAGCCTGCACCAACCCTCCAGGATACGGAGGCGGGTCGTTTTGCAACTTTTTTTTGGAGGCCGGATGAGACTAGTAAGCGCGGAAAGCGGCCGACCGCGATGGCTCGCTGCCGTAGTCTGGAGAAGAATCGCCAGGGTTGCGTTGCGGTGTGCCCCGGTTCGAGGCCGGCCGGATTCCGCGGCTAACGAGGGCGTGGCTGCCCCGTCGTTTCCAAGACCCCATAGCCAGCCGACTTCTCCAGTTACGGAGCGAGCCCCTCTTTTGTTTTGTTTGTTTTTGCCAGATGCATCCCGTACTGCGGCAGATGCGCCCCCACCACCCTCCACCGCAACAACAGCCCCCTCCACAGCCGGCGCTTCTGCCCCCGCCCCAGCAGCAACTTCCAGCCACGACCGCCGCGGCCGCCGTGAGCGGGGCTGGACAGAGTTATGATCACCAGCTGGCCTTGGAAGAGGGCGAGGGGCTGGCGCGCCTGGGGGCGTCGTCGCCGGAGCGGCACCCGCGCGTGCAGATGAAAAGGGACGCTCGCGAGGCCTACGTGCCCAAGCAGAACCTGTTCAGAGACAGGAGCGGCGAGGAGCCCGAGGAGATGCGCGCGGCCCGGTTCCACGCGGGGCGGGAGCTGCGGCGCGGCCTGGACCGAAAGAGGGTGCTGAGGGACGAGGATTTCGAGGCGGACGAGCTGACGGGGATCAGCCCCGCGCGCGCGCACGTGGCCGCGGCCAACCTGGTCACGGCGTACGAGCAGACCGTGAAGGAGGAGAGCAACTTCCAAAAATCCTTCAACAACCACGTGCGCACCCTGATCGCGCGCGAGGAGGTGACCCTGGGCCTGATGCACCTGTGGGACCTGCTGGAGGCCATCGTGCAGAACCCCACCAGCAAGCCGCTGACGGCGCAGCTGTTCCTGGTGGTGCAGCATAGTCGGGACAACGAAGCGTTCAGGGAGGCGCTGCTGAATATCACCGAGCCCGAGGGCCGCTGGCTCCTGGACCTGGTGAACATTCTGCAGAGCATCGTGGTGCAGGAGCGCGGGCTGCCGCTGTCCGAGAAGCTGGCGGCCATCAACTTCTCGGTGCTGAGTTTGGGCAAGTACTACGCTAGGAAGATCTACAAGACCCCGTACGTGCCCATAGACAAGGAGGTGAAGATCGACGGGTTTTACATGCGCATGACCCTGAAAGTGCTGACCCTGAGCGACGATCTGGGGGTGTACCGCAACGACAGGATGCACCGTGCGGTGAGCGCCAGCAGGCGGCGCGAGCTGAGCGACCAGGAGCTGATGCATAGTCTGCAGCGGGCCCTGACCGGGGCCGGGACCGAGGGGGAGAGCTACTTTGACATGGGCGCGGACCTGCACTGGCAGCCCAGCCGCCGGGCCTTGGAGGCGGCGGCAGGACCCTACGTAGAAGAGGTGGACGATGAGGTGGACGAGGAGGGCGAGTACCTGGAAGACTGATGGCGCGACCGTATTTTTGCTAGATGCAACAACAACAGCCACCTCCTGATCCCGCGATGCGGGCGGCGCTGCAGAGCCAGCCGTCCGGCATTAACTCCTCGGACGATTGGACCCAGGCCATGCAACGCATCATGGCGCTGACGACCCGCAACCCCGAAGCCTTTAGACAGCAGCCCCAGGCCAACCGGCTCTCGGCCATCCTGGAGGCCGTGGTGCCCTCGCGCTCCAACCCCACGCACGAGAAGGTCCTGGCCATCGTGAACGCGCTGGTGGAGAACAAGGCCATCCGCGGCGACGAGGCCGGCCTGGTGTACAACGCGCTGCTGGAGCGCGTGGCCCGCTACAACAGCACCAACGTGCAGACCAACCTGGACCGCATGGTGACCGACGTGCGCGAGGCCGTGGCCCAGCGCGAGCGGTTCCACCGCGAGTCCAACCTGGGATCCATGGTGGCGCTGAACGCCTTCCTCAGCACCCAGCCCGCCAACGTGCCCCGGGGCCAGGAGGACTACACCAACTTCATCAGCGCCCTGCGCCTGATGGTGACCGAGGTGCCCCAGAGCGAGGTGTACCAGTCCGGGCCGGACTACTTCTTCCAGACCAGTCGCCAGGGCTTGCAGACCGTGAACCTGAGCCAGGCTTTCAAGAACTTGCAGGGCCTGTGGGGCGTGCAGGCCCCGGTCGGGGACCGCGCGACGGTGTCGAGCCTGCTGACGCCGAACTCGCGCCTGCTGCTGCTGCTGGTGGCCCCCTTCACGGACAGCGGCAGCATCAACCGCAACTCGTACCTGGGCTACCTGATTAACCTGTACCGCGAGGCCATCGGCCAGGCGCACGTGGACGAGCAGACCTACCAGGAGATCACCCACGTGAGCCGCGCCCTGGGCCAGGACGACCCGGGCAACCTGGAAGCCACCCTGAACTTTTTGCTGACCAACCGGTCGCAGAAGATCCCGCCCCAGTACGCGCTCAGCACCGAGGAGGAGCGCATCCTGCGTTACGTGCAGCAGAGCGTGGGCCTGTTCCTGATGCAGGAGGGGGCCACCCCCAGCGCCGCGCTCGACATGACCGCGCGCAACATGGAGCCCAGCATGTACGCCAGCAACCGCCCGTTCATCAATAAACTGATGGACTACTTGCATCGGGCGGCCGCCATGAACTCTGACTATTTCACCAACGCCATCCTGAATCCCCACTGGCTCCCGCCGCCGGGGTTCTACACGGGCGAGTACGACATGCCCGACCCCAATGACGGGTTCCTGTGGGACGATGTGGACAGCAGCGTGTTCTCCCCCCGACCGGGTGCTAACGAGCGCCCCTTGTGGAAGAAGGAAGGCAGCGACCGACGCCCGTCCTCGGCGCTGTCCGGCCGCGAGGGTGCTGCCGCGGCGGTGCCCGAGGCCGCCAGTCCTTTCCCGAGCTTGCCCTTCTCGCTGAACAGTATCCGCAGCAGCGAGCTGGGCAGGATCACGCGCCCGCGCTTGCTGGGCGAAGAGGAGTACTTGAATGACTCGCTGTTGAGACCCGAGCGGGAGAAGAACTTCCCCAATAACGGGATAGAAAGCCTGGTGGACAAGATGAGCCGCTGGAAGACGTATGCGCAGGAGCACAGGGACGATCCCCGGGCGTCGCAGGGGGCCACGAGCCGGGGCAGCGCCGCCCGTAAACGCCGGTGGCACGACAGGCAGCGGGGACAGATGTGGGACGATGAGGACTCCGCCGACGACAGCAGCGTGTTGGACTTGGGTGGGAGTGGTAACCCGTTCGCTCACCTGCGCCCCCGTATCGGGCGCATGATGTAAGAGAAACCGAAAATAAATGATACTCACCAAGGCCATGGCGACCAGCGTGCGTTCGTTTCTTCTCTGTTGTTGTTGTATCTAGTATGATGAGGCGTGCGTACCCGGAGGGTCCTCCTCCCTCGTACGAGAGCGTGATGCAGCAGGCGATGGCGGCGGCGGCGATGCAGCCCCCGCTGGAGGCTCCTTACGTGCCCCCGCGGTACCTGGCGCCTACGGAGGGGCGGAACAGCATTCGTTACTCGGAGCTGGCACCCTTGTACGATACCACCCGGTTGTACCTGGTGGACAACAAGTCGGCGGACATCGCCTCGCTGAACTACCAGAACGACCACAGCAACTTCCTGACCACCGTGGTGCAGAACAATGACTTCACCCCCACGGAGGCCAGCACCCAGACCATCAACTTTGACGAGCGCTCGCGGTGGGGCGGCCAGCTGAAAACCATCATGCACACCAACATGCCCAACGTGAACGAGTTCATGTACAGCAACAAGTTCAAGGCGCGGGTGATGGTCTCCCGCAAGACCCCCAATGGGGTGACAGTGACAGAGGATTATGATGGTAGTCAGGATGAGCTGAAGTATGAATGGGTGGAATTTGAGCTGCCCGAAGGCAACTTCTCGGTGACCATGACCATCGACCTGATGAACAACGCCATCATCGACAATTACTTGGCGGTGGGGCGGCAGAACGGGGTGCTGGAGAGCGACATCGGCGTGAAGTTCGACACTAGGAACTTCAGGCTGGGCTGGGACCCCGTGACCGAGCTGGTCATGCCCGGGGTGTACACCAACGAGGCTTTCCATCCCGATATTGTCTTGCTGCCCGGCTGCGGGGTGGACTTCACCGAGAGCCGCCTCAGCAACCTGCTGGGCATTCGCAAGAGGCAGCCCTTCCAGGAAGGCTTCCAGATCATGTACGAGGATCTGGAGGGGGGCAACATCCCCGCGCTCCTGGATGTCGACGCCTATGAGAAAAGCAAGGAGGATGCAGCAGCTGAAGCAACTGCAGCCGTAGCTACCGCCTCTACCGAGGTCAGGGGCGATAATTTTGCAAGCGCCGCAGCAGTGGCAGCGGCCGAGGCGGCTGAAACCGAAAGTAAGATAGTCATTCAGCCGGTGGAGAAGGATAGCAAGAACAGGAGCTACAACGTACTACCGGACAAGATAAACACCGCCTACCGCAGCTGGTACCTAGCCTACAACTATGGCGACCCCGAGAAGGGCGTGCGCTCCTGGACGCTGCTCACCACCTCGGACGTCACCTGCGGCGTGGAGCAAGTCTACTGGTCGCTGCCCGACATGATGCAAGACCCGGTCACCTTCCGCTCCACGCGTCAAGTTAGCAACTACCCGGTGGTGGGCGCCGAGCTCCTGCCCGTCTACTCCAAGAGCTTCTTCAACGAGCAGGCCGTCTACTCGCAGCAGCTGCGCGCCTTCACCTCGCTTACGCACGTCTTCAACCGCTTCCCCGAGAACCAGATCCTCGTCCGCCCGCCCGCGCCCACCATTACCACCGTCAGTGAAAACGTTCCTGCTCTCACAGATCACGGGACCCTGCCGCTGCGCAGCAGTATCCGGGGAGTCCAGCGCGTGACCGTTACTGACGCCAGACGCCGCACCTGCCCCTACGTCTACAAGGCCCTGGGCATAGTCGCGCCGCGCGTCCTCTCGAGCCGCACCTTCTAAATGTCCATTCTCATCTCGCCCAGTAATAACACCGGTTGGGGCCTGCGCGCGCCCAGCAAGATGTACGGAGGCGCTCGCCAACGCTCCACGCAACACCCCGTGCGCGTGCGCGGGCACTTCCGCGCTCCCTGGGGCGCCCTCAAGGGCCGCGTGCGGTCGCGCACCACCGTCGACGACGTGATCGACCAGGTGGTGGCCGACGCGCGCAACTACACCCCCGCCGCCGCGCCCGTCTCCACCGTGGACGCCGTCATCGACAGCGTGGTGGCCGACGCGCGCCGGTACGCCCGCGCCAAGAGCCGGCGGCGGCGCATCGCCCGGCGGCACCGGAGCACCCCCGCCATGCGCGCGGCGCGAGCCTTGCTGCGCAGGGCCAGGCGCACGGGACGCAGGGCCATGCTCAGGGCGGCCAGACGCGCGGCTTCAGGCGCCAGCGCCGGCAGGACCCGGAGACGCGCGGCCACGGCGGCGGCAGCGGCCATCGCCAGCATGTCCCGCCCGCGGCGAGGGAACGTGTACTGGGTGCGCGACGCCGCCACCGGTGTGCGCGTGCCCGTGCGCACCCGCCCCCCTCGCACTTGAAGATGTTCACTTCGCGATGTTGATGTGTCCCAGCGGCGAGGAGGATGTCCAAGCGCAAATTCAAGGAAGAGATGCTCCAGGTCATCGCGCCTGAGATCTACGGCCCTGCGGTGGTGAAGGAGGAAAGAAAGCCCCGCAAAATCAAGCGGGTCAAAAAGGACAAAAAGGAAGAAGAAAGTGATGTGGACGGATTGGTGGAGTTTGTGCGCGAGTTCGCCCCCCGGCGGCGCGTGCAGTGGCGCGGGCGGAAGGTGCAACCGGTGCTGAGACCCGGCACCACCGTGGTCTTCACGCCCGGCGAGCGCTCCGGCACCGCTTCCAAGCGCTCCTACGACGAGGTGTACGGGGATGATGATATTCTGGAGCAGGCGGCCGAGCGCCTGGGCGAGTTTGCTTACGGCAAGCGCAGCCGTTCCGCACCGAAGGAAGAGGCGGTGTCCATCCCGCTGGACCACGGCAACCCCACGCCGAGCCTCAAGCCCGTGACCTTGCAGCAGGTGCTGCCGACCGCGGCGCCGCGCCGGGGGTTCAAGCGCGAGGGCGAGGATCTGTACCCCACCATGCAGCTGATGGTGCCCAAGCGCCAGAAGCTGGAAGACGTGCTGGAGACCATGAAGGTGGACCCGGACGTGCAGCCCGAGGTCAAGGTGCGGCCCATCAAGCAGGTGGCCCCGGGCCTGGGCGTGCAGACCGTGGACATCAAGATTCCCACGGAGCCCATGGAAACGCAGACCGAGCCCATGATCAAGCCCAGCACCAGCACCATGGAGGTGCAGACGGATCCCTGGATGCCATCGGCTCCTAGTCGAAGACCCCGGCGCAAGTACGGCGCGGCCAGCCTGCTGATGCCCAACTACGCGCTGCATCCTTCCATCATCCCCACGCCGGGCTACCGCGGCACGCGCTTCTACCGCGGTCATACCAGCAGCCGCCGCCGCAAGACCACCACTCGCCGCCGCCGTCGCCGCACCGCCGCTGCAACCACCCCTGCCGCCCTGGTGCGGAGAGTGTACCGCCGCGGCCGCGCACCTCTGACCCTGCCGCGCGCGCGCTACCACCCGAGCATCGCCATTTAAACTTTCGCCTGCTTTGCAGATCAATGGCCCTCACATGCCGCCTTCGCGTTCCCATTACGGGCTACCGAGGAAGAAAACCGCGCCGTAGAAGGCTGGCGGGGAACGGGATGCGTCGCCACCACCACCGGCGGCGGCGCGCCATCAGCAAGCGGTTGGGGGGAGGCTTCCTGCCCGCGCTGATCCCCATCATCGCCGCGGCGATCGGGGCGATCCCCGGCATTGCTTCCGTGGCGGTGCAGGCCTCTCAGCGCCACTGAGACACACTTGGAAACATCTTGTAATAAACCAATGGACTCTGACGCTCCTGGTCCTGTGATGTGTTTTCGTAGACAGATGGAAGACATCAATTTTTCGTCCCTGGCTCCGCGACACGGCACGCGGCCGTTCATGGGCACCTGGAGCGACATCGGCACCAGCCAACTGAACGGGGGCGCCTTCAATTGGAGCAGTCTCTGGAGCGGGCTTAAGAATTTCGGGTCCACGCTTAAAACCTATGGCAGCAAGGCGTGGAACAGCACCACAGGGCAGGCGCTGAGGGATAAGCTGAAAGAGCAGAACTTCCAGCAGAAGGTGGTCGATGGGCTCGCCTCGGGCATCAACGGGGTGGTGGACCTGGCCAACCAGGCCGTGCAGCGGCAGATCAACAGCCGCCTGGACCCGGTGCCGCCCGCCGGCTCCGTGGAGATGCCGCAGGTGGAGGAGGAGCTGCCTCCCCTGGACAAGCGGGGCGAGAAGCGACCCCGCCCCGATGCGGAGGAGACGCTGCTGACGCACACGGACGAGCCGCCCCCGTACGAGGAGGCGGTGAAACTGGGTCTGCCCACCACGCGGCCCATCGCGCCCCTGGCCACCGGGGTGCTGAAACCCGAAAAGCCCGCGACCCTGGACTTGCCTCCTCCCCAGCCTTCCCGCCCCTCTACAGTGGCTAAGCCCCTGCCGCCGGTGGCCGTGGCCCGCGCGCGACCCGGGGGCACCGCCCGCCCTCATGCGAACTGGCAGAGCACTCTGAACAGCATCGTGGGTCTGGGAGTGCAGAGTGTGAAGCGCCGCCGCTGCTATTAAACCTACCGTAGCGCTTAACTTGCTTGTCTGTGTGTGTATGTATTATGTCGCCGCCGCCGCTGTCCACCAGAAGGAGGAGTGAAGAGGCGCGTCGCCGAGTTGCAAGATGGCCACCCCATCGATGCTGCCCCAGTGGGCGTACATGCACATCGCCGGACAGGACGCTTCGGAGTACCTGAGTCCGGGTCTGGTGCAGTTTGCCCGCGCCACAGACACCTACTTCAGTCTGGGGAACAAGTTTAGGAACCCCACGGTGGCGCCCACGCACGATGTGACCACCGACCGCAGCCAGCGGCTGACGCTGCGCTTCGTGCCCGTGGACCGCGAGGACAACACCTACTCGTACAAAGTGCGCTACACGCTGGCCGTGGGCGACAACCGCGTGCTGGACATGGCCAGCACCTACTTTGACATCCGCGGCGTGCTGGATCGGGGCCCTAGCTTCAAACCCTACTCCGGCACCGCCTACAACAGTCTGGCCCCCAAGGGAGCACCCAACACTTGTCAGTGGACATATAAAGCCGATGGTGAAACTGCCACAGAAAAAACCTATACATATGGAAATGCACCCGTGCAGGGCATTAACATCACAAAAGATGGTATTCAACTTGGAACTGACACCGATGATCAGCCAATCTACGCAGATAAAACCTATCAGCCTGAACCTCAAGTGGGTGATGCTGAATGGCATGACATCACTGGTACTGATGAAAAGTATGGAGGCAGAGCTCTTAAGCCTGATACCAAAATGAAGCCTTGTTATGGTTCTTTTGCCAAGCCTACTAATAAAGAAGGAGGTCAGGCAAATGTGAAAACAGGAACAGGCACTACTAAAGAATATGACATAGACATGGCTTTCTTTGACAACAGAAGTGCGGCTGCTGCTGGCCTAGCTCCAGAAATTGTTTTGTATACTGAAAATGTGGATTTGGAAACTCCAGATACCCATATTGTATACAAAGCAGGCACAGATGACAGCAGCTCTTCTATTAATTTGGGTCAGCAAGCCATGCCCAACAGACCTAACTACATTGGTTTCAGAGACAACTTTATCGGGCTCATGTACTACAACAGCACTGGCAATATGGGGGTGCTGGCCGGTCAGGCTTCTCAGCTGAATGCTGTGGTTGACTTGCAAGACAGAAACACCGAGCTGTCCTACCAGCTCTTGCTTGACTCTCTGGGTGACAGAACCCGGTATTTCAGTATGTGGAATCAGGCGGTGGACAGCTATGATCCTGATGTGCGCATTATTGAAAATCATGGTGTGGAGGATGAACTTCCCAACTATTGTTTCCCTCTGGATGCTGTTGGCAGAACAGATACTTATCAGGGAATTAAGGCTAATGGAACTGATCAAACCACATGGACCAAAGATGACAGTGTCAATGATGCTAATGAGATAGGCAAGGGTAATCCATTCGCCATGGAAATCAACATCCAAGCCAACCTGTGGAGGAACTTCCTCTACGCCAACGTGGCCCTGTACCTGCCCGACTCTTACAAGTACACGCCGGCCAATGTTACCCTGCCCACCAACACCAACACCTACGATTACATGAACGGCCGGGTGGTGGCGCCCTCGCTGGTGGACTCCTACATCAACATCGGGGCGCGCTGGTCGCTGGATCCCATGGACAACGTGAACCCCTTCAACCACCACCGCAATGCGGGGCTGCGCTACCGCTCCATGCTCCTGGGCAACGGGCGCTACGTGCCCTTCCACATCCAGGTGCCCCAGAAATTTTTCGCCATCAAGAGCCTCCTGCTCCTGCCCGGGTCCTACACCTACGAGTGGAACTTCCGCAAGGACGTCAACATGATCCTGCAGAGCTCCCTCGGCAACGACCTGCGCACGGACGGGGCCTCCATCTCCTTCACCAGCATCAACCTCTACGCCACCTTCTTCCCCATGGCGCACAACACGGCCTCCACGCTCGAGGCCATGCTGCGCAACGACACCAACGACCAGTCCTTCAACGACTACCTCTCGGCGGCCAACATGCTCTACCCCATCCCGGCCAACGCCACCAACGTGCCCATCTCCATCCCCTCGCGCAACTGGGCCGCCTTCCGCGGCTGGTCCTTCACGCGTCTCAAGACCAAGGAGACGCCCTCGCTGGGCTCCGGGTTCGACCCCTACTTCGTCTACTCGGGCTCCATCCCCTACCTCGACGGCACCTTCTACCTCAACCACACCTTCAAGAAGGTCTCCATCACCTTCGACTCCTCCGTCAGCTGGCCCGGCAACGACCGGCTCCTGACGCCCAACGAGTTCGAAATCAAGCGCACCGTCGACGGCGAGGGCTACAACGTGGCCCAGTGCAACATGACCAAGGACTGGTTCCTGGTCCAGATGCTGGCCCACTACAACATCGGCTACCAGGGCTTCTACGTGCCCGAGGGCTACAAGGACCGCATGTACTCCTTCTTCCGCAACTTCCAGCCCATGAGCCGCCAGGTGGTGGACGAGGTCAACTACAAGGACTACCAGGCCGTCACCCTGGCCTACCAGCACAACAACTCGGGCTTCGTCGGCTACCTCGCGCCCACCATGCGCCAGGGCCAGCCCTACCCCGCCAACTACCCCTACCCGCTCATCGGCAAGAGCGCCGTCACCAGCGTCACCCAGAAAAAGTTCCTCTGCGACAGGGTCATGTGGCGCATCCCCTTCTCCAGCAACTTCATGTCCATGGGCGCGCTCACCGACCTCGGCCAGAACATGCTCTATGCCAACTCCGCCCACGCGCTAGACATGAATTTCGAAGTCGACCCCATGGATGAGTCCACCCTTCTCTATGTTGTCTTCGAAGTCTTCGACGTCGTCCGAGTGCACCAGCCCCACCGCGGCGTCATCGAGGCCGTCTACCTGCGCACCCCCTTCTCGGCCGGTAACGCCACCACCTAAGCTCTTGCTTCTTGCAAGCCATGGCCGCGGGCTCCGGCGAGCAGGAGCTCAGGGCCATCATCCGCGACCTGGGCTGCGGGCCCTACTTCCTGGGCACCTTCGATAAGCGCTTCCCGGGATTCATGGCCCCGCACAAGCTGGCCTGCGCCATCGTCAACACGGCCGGCCGCGAGACCGGGGGCGAGCACTGGCTGGCCTTCGCCTGGAACCCGCGCTCGAACACCTGCTACCTCTTCGACCCCTTCGGGTTCTCGGACGAGCGCCTCAAGCAGATCTACCAGTTCGAGTACGAGGGCCTGCTGCGCCGCAGCGCCCTGGCCACCGAGGACCGCTGCGTCACCCTGGAAAAGTCCACCCAGACCGTGCAGGGTCCGCGCTCGGCCGCCTGCGGGCTCTTCTGCTGCATGTTCCTGCACGCCTTCGTGCACTGGCCCGACCGCCCCATGGACAAGAACCCCACCATGAACTTGCTGACGGGGGTGCCCAACGGCATGCTCCAGTCGCCCCAGGTGGAACCCACCCTGCGCCGCAACCAGGAGGCGCTCTACCGCTTCCTCAACTCCCACTCCGCCTACTTTCGCTCCCACCGCGCGCGCATCGAGAAGGCCACCGCCTTCGACCGCATGAATCAAGACATGTAAACCGTGTGTGTATGTTAAATGTCTTTAATAAACAGCACTTTCATGTTACACATGCATCTGAGATGATTTATTTAGAAATCGAAAGGGTTCTGCCGGGTCTCGGCATGGCCCGCGGGCAGGGACACGTTGCGGAACTGGTACTTGGCCAGCCACTTGAACTCGGGGATCAGCAGTTTGGGCAGCGGGGTGTCGGGGAAGGAGTCGGTCCACAGCTTCCGCGTCAGTTGCAGGGCGCCCAGCAGGTCGGGCGCGGAGATCTTGAAATCGCAGTTGGGACCCGCGTTCTGCGCGCGGGAGTTGCGGTACACGGGGTTGCAGCACTGGAACACCATCAGGGCCGGGTGCTTCACGCTCGCCAGCACCGTCGCGTCGGTGATGCTCTCCACGTCGAGGTCCTCGGCGTTGGCCATCCCGAAGGGGGTCATCTTGCAGGTCTGCCTTCCCATGGTGGGCACGCACCCGGGCTTGTGGTTGCAATCGCAGTGCAGGGGGATCAGCATCATCTGGGCCTGGTCGGCGTTCATCCCCGGGTACATGGCCTTCATGAAAGCCTCCAATTGCCTGAACGCCTGCTGGGCCTTGGCTCCCTCGGTGAAGAAGACCCCGCAGGACTTGCTAGAGAACTGGTTGGTGGCGCACCCGGCGTCGTGCACGCAGCAGCGCGCGTCGTTGTTGGCCAGCTGCACCACGCTGCGCCCCCAGCGGTTCTGGGTGATCTTGGCCCGGTCGGGGTTCTCCTTCAGCGCGCGCTGCCCGTTCTCGCTCGCCACATCCATCTCGATCATGTGCTCCTTCTGGATCATGGTGGTCCCGTGCAGGCACCGCAGCTTGCCCTCGGCCTCGGTGCACCCGTGCAGCCACAGCGCGCACCCGGTGCACTCCCAGTTCTTGTGGGCGATCTGGGAATGCGCGTGCACGAAGCCCTGCAGGAAGCGGCCCATCATGGTGGTCAGGGTCTTGTTGCTAGTGAAGGTCAGCGGAATGCCGCGGTGCTCCTCGTTGATGTACAGGTGGCAGATGCGGCGGTACACCTCGCCCTGCTCGGGCATCAGCTGGAAGTTGGCTTTCAGGTCGGTCTCCACGCGGTAGCGGTCCATCAGCATAGTCATGATTTCCATACCCTTCTCCCAGGCCGAGACGATGGGCAGGCTCATAGGGTTCTTCACCATCATCTTAGCGCTAGCAGCCGCGGCCAGGGGGTCGCTCTCGTCCAGGGTCTCAAAGCTCCGCTTGCCGTCCTTCTCGGTGATCCGCACCGGGGGGTAGCTGAAGCCCACGGCCGCCAGCTCCTCCTCGGCCTGTCTTTCGTCCTCGCTGTCCTGGCTGACGTCCTGCAGGACCACATGCTTGGTCTTGCGGGGTTTCTTCTTGGGCGGCAGCGGCGGCGGAGATGTTGGAGATGGCGAGGGGGAGCGCGAGTTCTCGCTCACCACTACTATCTCTTCCTCTTCTTGGTCCGAGGCCACGCGGCGGTAGGTATGTCTCTTCGGGGGCAGAGGCGGAGGCGACGGGCTCTCGCCGCCGCGACTTGGCGGATGGCTGGCAGAGCCCCTTCCGCGTTCGGGGGTGCGCTCCCGGCGGCGCTCTGACTGACTTCCTCCGCGGCCGGCCATTGTGTTCTCCTAGGGAGGAACAACAAGCATGGAGACTCAGCCATCGCCAACCTCGCCATCTGCCCCCACCGCCGACGAGAAGCAGCAGCAGCAGAATGAAAGCTTAACCGCCCCGCCGCCCAGCCCCGCCACCTCCGACGCGGCCGTCCCAGACATGCAAGAGATGGAGGAATCCATCGAGATTGACCTGGGCTATGTGACGCCCGCGGAGCACGAGGAGGAGCTGGCAGTGCGCTTTTCACAAGAAGAGATACACCAAGAACAGCCAGAGCAGGAAGCAGAGAATGAGCAGAGTCAGGCTGGGCTCGAGCATGACGGCGACTACCTCCACCTGAGCGGGGGGGAGGACGCGCTCATCAAGCATCTGGCCCGGCAGGCCACCATCGTCAAGGATGCGCTGCTCGACCGCACCGAGGTGCCCCTCAGCGTGGAGGAGCTCAGCCGCGCCTACGAGTTGAACCTCTTCTCGCCGCGCGTGCCCCCCAAGCGCCAGCCCAATGGCACCTGCGAGCCCAACCCGCGCCTCAACTTCTACCCGGTCTTCGCGGTGCCCGAGGCCCTGGCCACCTACCACATCTTTTTCAAGAACCAAAAGATCCCCGTCTCCTGCCGCGCCAACCGCACCCGCGCCGACGCCCTTTTCAACCTGGGTCCCGGCGCCCGCCTACCTGATATCGCCTCCTTGGAAGAGGTTCCCAAGATCTTCGAGGGTCTGGGCAGCGACGAGACTCGGGCCGCGAACGCTCTGCAAGGAGAAGGAGGAGAGCATGAGCACCACAGCGCCCTGGTCGAGTTGGAAGGCGACAACGCGCGGCTGGCGGTGCTCAAACGCACGGTCGAGCTGACCCATTTCGCCTACCCGGCTCTGAACCTGCCCCCCAAAGTCATGAGCGCGGTCATGGACCAGGTGCTCATCAAGCGCGCGTCGCCCATCTCCGAGGACGAGGGCATGCAAGACTCCGAGGAGGGCAAGCCCGTGGTCAGCGACGAGCAGCTGGCCCGGTGGCTGGGTCCTAATGCTAGTCCCCAGAGTTTGGAAGAGCGGCGCAAACTCATGATGGCCGTGGTCCTGGTGACCGTGGAGCTGGAGTGCCTGCGCCGCTTCTTCGCCGACGCGGAGACCCTGCGCAAGGTCGAGGAGAACCTGCACTACCTCTTCAGGCACGGGTTCGTGCGCCAGGCCTGCAAGATCTCCAACGTGGAGCTGACCAACCTGGTCTCCTACATGGGCATCTTGCACGAGAACCGCCTGGGGCAGAACGTGCTGCACACCACCCTGCGCGGGGAGGCCCGGCGCGACTACATCCGCGACTGCGTCTACCTCTACCTCTGCCACACCTGGCAGACGGGCATGGGCGTGTGGCAGCAGTGTCTGGAGGAGCAGAACCTGAAAGAGCTCTGCAAGCTCCTGCAGAAGAACCTCAAGGGTCTGTGGACCGGGTTCGACGAGCGCACCACCGCCTCGGACCTGGCCGACCTCATTTTCCCCGAGCGCCTCAGGCTGACGCTGCGCAACGGCCTGCCCGACTTTATGAGCCAAAGCATGTTGCAAAACTTTCGCTCTTTCATCCTCGAACGCTCCGGAATCCTGCCCGCCACCTGCTCCGCGCTGCCCTCGGACTTCGTGCCGCTGACCTTCCGCGAGTGCCCCCCGCCGCTGTGGAGCCACTGCTACCTGCTGCGCCTGGCCAACTACCTGGCCTACCACTCGGACGTGATCGAGGACGTCAGCGGCGAGGGCCTGCTCGAGTGCCACTGCCGCTGCAACCTCTGCACGCCGCACCGCTCCCTGGCCTGCAACCCCCAGCTGCTGAGCGAGACCCAGATCATCGGCACCTTCGAGTTGCAAGGGCCCAGCGAAGGCGAGGGTTCAGCCGCCAAGGGGGGTCTGAAACTCACCCCGGGGCTGTGGACCTCGGCCTACTTGCGCAAGTTCGTGCCCGAGGACTACCATCCCTTCGAGATCAGGTTCTACGAGGACCAATCCCATCCGCCCAAGGCCGAGCTGTCGGCCTGCGTCATCACCCAGGGGGCGATCCTGGCCCAATTGCAAGCCATCCAGAAATCCCGCCAAGAATTCTTGCTGAAAAAGGGCCGCGGGGTCTACCTCGACCCCCAGACCGGTGAGGAGCTCAACCCCGGCTTCCCCCAGGATGCCCCGAGGAAACAAGAAGCTGAAAGTGGAGCTGCCGCCCGTGGAGGATTTGGAGGAAGACTGGGAGAACAGCAGTCAGGCAGAGGAGGAGGAGATGGAGGAAGACTGGGACAGCACTCAGGCAGAGGAGGACAGCCTGCAAGACAGTCTGGAGGAAGACGAGGAGGAGGCAGAGGAGGAGGTGGAAGAAGCAGCCGCCGCCAGACCGTCGTCCTCGGCGGGGGAGAAAGCAAGCAGCACGGATACCATCTCCGCTCCGGGTCGGGGTCCCGCTCGACCACACAGTAGATGGGACGAGACCGGACGATTCCCGAACCCCACCACCCAGACCGGTAAGAAGGAGCGGCAGGGATACAAGTCCTGGCGGGGGCACAAAAACGCCATCGTCTCCTGCTTGCAGGCCTGCGGGGGCAACATCTCCTTCACCCGGCGCTACCTGCTCTTCCACCGCGGGGTGAACTTTCCCCGCAACATCTTGCATTACTACCGTCACCTCCACAGCCCCTACTACTTCCAAGAAGAGGCAGCAGCAGCAGAAAAAGACCAGCAGAAAACCAGCAGCTAGAAAATCCACAGCGGCGGCAGCAGGTGGACTGAGGATCGCGGCGAACGAGCCGGCGCAAACCCGGGAGCTGAGGAACCGGATCTTTCCCACCCTCTATGCCATCTTCCAGCAGAGTCGGGGGCAGGAGCAGGAACTGAAAGTCAAGAACCGTTCTCTGCGCTCGCTCACCCGCAGTTGTCTGTATCACAAGAGCGAAGACCAACTTCAGCGCACTCTCGAGGACGCCGAGGCTCTCTTCAACAAGTACTGCGCGCTCACTCTTAAAGAGTAGCCCGCGCCCGCCCAGTCGCAGAAAAAGGCGGGAATTACGTCACCTGTGCCCTTCGCCCTAGCCGCCTCCACCCATCATCATGAGCAAAGAGATTCCCACGCCTTACATGTGGAGCTACCAGCCCCAGATGGGCCTGGCCGCCGGTGCCGCCCAGGACTACTCCACCCGCATGAATTGGCTCAGCGCCGGGCCCGCGATGATCTCACGGGTGAATGACATCCGCGCCCACCGAAACCAGATACTCCTAGAACAGTCAGCGCTCACCGCCACGCCCCGCAATCACCTCAATCCGCGTAATTGGCCCGCCGCCCTGGTGTACCAGGAAATTCCCCAGCCCACGACCGTACTACTTCCGCGAGACGCCCAGGCCGAAGTCCAGCTGACTAACTCAGGTGTCCAGCTGGCGGGCGGCGCCACCCTGTGTCGTCACCGCCCCGCTCAGGGTATAAAGCGGCTGGTGATCCGGGGCAGAGGCACACAGCTCAACGACGAGGTGGTGAGCTCTTCGCTGGGTCTGCGACCTGACGGAGTCTTCCAACTCGCCGGATCGGGGAGATCTTCCTTCACGCCTCGTCAGGCCGTCCTGACTTTGGAGAGTTCGTCCTCGCAGCCCCGCTCGGGTGGCATCGGCACTCTCCAGTTCGTGGAGGAGTTCACTCCCTCGGTCTACTTCAACCCCTTCTCCGGCTCCCCCGGCCACTACCCGGACGAGTTCATCCCGAACTTCGACGCCATCAGCGAGTCGGTGGACGGCTACGATTGAAACTAATCACCCCCTTATCCAGTGAAATAAAGATCATATTGATGATGATTTTACAGAAATAAAAAATAATCATTTGATTTGAAATAAAGATACAATCATATTGATGATTTGAGTTTAACAAAAAAATAAAGAATCACTTACTTGAAATCTGATACCAGGTCTCTGTCCATGTTTTCTGCCAACACCACTTCACTCCCCTCTTCCCAGCTCTGGTACTGCAGGCCCCGGCGGGCTGCAAACTTCCTCCACACGCTGAAGGGGATGTCAAATTCCTCCTGTCCCTCAATCTTCATTTTATCTTCTATCAGATGTCCAAAAAGCGCGTCCGGGTGGATGATGACTTCGACCCCGTCTACCCCTACGATGCAGACAACGCACCGACCGTGCCCTTCATCAACCCCCCCTTCGTCTCTTCAGATGGATTCCAAGAGAAGCCCCTGGGGGTGTTGTCCCTGCGACTGGCCGACCCCGTCACCACCAAGAACGGGGAAATCACCCTCAAGCTGGGAGAGGGGGTGGACCTCGATTCCTCGGGAAAACTCATCTCCAACACGGCCACCAAGGCCGCCGCCCCTCTCAGTTTTTCCAACAACACCATTTCCCTTAACATGGATCACCCCTTTTACACTAAAGATGGAAAATTATCCTTACAAGTTTCTCCACCATTAAATATACTGAGAACAAGCATTCTAAACACACTAGCTTTAGGTTTTGGATCAGGTTTAGGACTCCGTGGCTCTGCCTTGGCAGTACAGTTAGTCTCTCCACTTACATTTGATACTGATGGAAACATAAAGCTTACCTTAGACAGAGGTTTGCATGTTACAACAGGAGATGCAATTGAAAGCAACATAAGCTGGGCTAAAGGTTTAAAATTTGAAGATGGAGCCATAGCAACCAACATTGGAAATGGGTTAGAGTTTGGAAGCAGTAGTACAGAAACAGGTGTTGATGATGCTTACCCAATCCAAGTTAAACTTGGATCTGGCCTTAGCTTTGACAGTACAGGAGCCATAATGGCTGGTAACAAAGAAGACGATAAACTCACTTTGTGGACAACACCTGATCCATCACCAAACTGTCAAATACTCGCAGAAAATGATGCAAAACTAACACTTTGCTTGACTAAATGTGGTAGTCAAATACTGGCCACTGTGTCAGTCTTAGTTGTAGGAAGTGGAAACCTAAACCCCATTACTGGCACCGTAAGCAGTGCTCAGGTGTTTCTACGTTTTGATGCAAACGGTGTTCTTTTAACAGAACATTCTACACTAAAAAAATACTGGGGGTATAGGCAGGGAGATAGCATAGATGGCACTCCATATACCAATGCTGTAGGATTCATGCCCAATTTAAAAGCTTATCCAAAGTCACAAAGTTCTACTACTAAAAATAATATAGTAGGGCAAGTATACATGAATGGAGATGTTTCAAAACCTATGCTTCTCACTATAACCCTCAATGGTACTGATGACAGCAACAGTACATATTCAATGTCATTTTCATACACCTGGACTAATGGAAGCTATGTTGGAGCAACATTTGGGGCTAACTCTTATACCTTCTCATACATCGCCCAAGAATGAACACTGTATCCCACCCTGCATGCCAACCCTTCCCACCCCACTCTGTGGAACAAACTCTGAAACACAAAATAAAATAAAGTTCAAGTGTTTTATTGATTCAACAGTTTTACAGGATTCGAGCAGTTATTTTTCCTCCACCCTCCCAGGACATGGAATACACCACCCTCTCCCCCCGCACAGCCTTGAACATCTGAATGCCATTGGTGATGGACATGCTTTTGGTCTCCACGTTCCACACAGTTTCAGAGCGAGCCAGTCTCGGGTCGGTCAGGGAGATGAAACCCTCCGGGCACTCCCGCATCTGCACCTCACAGCTCAACAGCTGAGGATTGTCCTCGGTGGTCGGGATCACGGTTATCTGGAAGAAGCAGAAGAGCGGCGGTGGGAATCATAGTCCGCGAACGGGATCGGCCGGTGGTGTCGCATCAGGCCCCGCAGCAGTCGCTGCCGCCGCCGCTCCGTCAAGCTGCTGCTCAGGGGGTCCGGGTCCAGGGACTCCCTCAGCATGATGCCCACGGCCCTCAGCATCAGTCGTCTGGTGCGGCGGGCGCAGCAGCGCATGCGGATCTCGCTCAGGTCGCTGCAGTACGTGCAACACAGAACCACCAGGTTGTTCAACAGTCCATAGTTCAACACGCTCCAGCCGAAACTCATCGCGGGAAGGATGCTACCCACGTGGCCGTCGTACCAGATCCTCAGGTAAATCAAGTGGTGCCCCCTCCAGAACACGCTGCCCACGTACATGATCTCCTTGGGCATGTGGCGGTTCACCACCTCCCGGTACCACATCACCCTCTGGTTGAACATGCAGCCCCGGATGATCCTGCGGAACCACAGGGCCAGCACCGCCCCGCCCGCCATGCAGCGAAGAGACCCCGGGTCCCGGCAATGGCAATGGAGGACCCACCGCTCGTACCCGTGGATCATCTGGGAGCTGAACAAGTCTATGTTGGCACAGCACAGGCATATGCTCATGCATCTCTTCAGCACTCTCAACTCCTCGGGGGTCAAAACCATATCCCAGGGCACGGGGAACTCTTGCAGGACAGCGAACCCCGCAGAACAGGGCAATCCTCGCACAGAACTTACATTGTGCATGGACAGGGTATCGCAATCAGGCAGCACCGGGTGATCCTCCACCAGAGAAGCGCGGGTCTCGGTCTCCTCACAGCGTGGTAAGGGGGCCGGCCGATACGGGTGATGGCGGGACGCGGCTGATCGTGTTCGCGACCGTGTCATGATGCAGTTGCTTTCGGACATTTTCGTACTTGCTGTAGCAGAACCTGGTCCGGGCGCTGCACACCGATCGCCGGCGGCGGTCTCGGCGCTTGGAACGCTCGGTGTTGAAATTGTAAAACAGCCACTCTCTCAGACCGTGCAGCAGATCTAGGGCCTCAGGAGTGATGAAGATCCCATCATGCCTGATGGCTCTGATCACATCGACCACCGTGGAATGGGCCAGACCCAGCCAGATGATGCAATTTTGTTGGGTTTCGGTGACGGCGGGGGAGGGAAGAACAGGAAGAACCATGATTAACTTTTAATCCAAACGGTCTCGGAGTACTTCAAAATGAAGATCGCGGAGATGGCACCTCTCGCCCCCGCTGTGTTGGTGGAAAATAACAGCCAGGTCAAAGGTGATACGGTTCTCGAGATGTTCCACGGTGGCTTCCAGCAAAGCCTCCACGCGCACATCCAGAAACAAGACAATAGCGAAAGCGGGAGGGTTCTCTAATTCCTCAATCATCATGTTACACTCCTGCACCATCCCCAGATAATTTTCATTTTTCCAGCCTTGAATGATTCGAACTAGTTCCTGAGGTAAATCCAAGCCAGCCATGATAAAGAGCTCGCGCAGAGCGCCCTCCACCGGCATTCTTAAGCACACCCTCATAATTCCAAGATATTCTGCTCCTGGTTCACCTGCAGCAGATTGACAAGCGGAATATCAAAATCTCTGCCGCGATCCCTGAGCTCCTCCCTCAGCAATAACTGTAAGTACTCTTTCATATCCTCTCCGAAATTTTTAGCCATAGGACCACCAGGAATAAGATTAGGGCAAGCCACAGTACAGATAAACCGAAGTCCTCCCCAGTGAGCATTGCCAAATGCAAGACTGCTATAAGCATGCTGGCTAGACCCGGTGATATCTTCCAGATAACTGGACAGAAAATCGCCCAGGCAATTTTTAAGAAAATCAACAAAAGAAAAATCCTCCAGGTGGACGTTTAGAGCCTCGGGAACAACGATGAAGTAAATGCAAGCGGTGCGTTCCAGCATGGTTAGTTAGCTGATCTGTAGAAAAAACAAAAATGAACATTAAACCATGCTAGCCTGGCGAACAGGTGGGTAAATCGTTCTCTCCAGCACCAGGCAGGCCACGGGGTCTCCGGCGCGACCCTCGTAAAAATTGTCGCTATGATTGAAAACCATCACAGAGAGACGTTCCCGGTGGCCGGCGTGAATGATTCGACAAGATGAATACACCCCCGGAACATTGGCGTCCGCGAGTGAAAAAAAGCGCCCGAGGAAGCAATAAGGCACTACAATGCTCAGTCTCAAGTCCAGCAAAGCGATGCCATGCGGATGAAGCACAAAATTCTCAGGTGCGTACAAAATGTAATTACTCCCCTCCTGCACAGGCAGCAAAGCCCCCGATCCCTCCAGGTACACATACAAAGCCTCAGCGTCCATAGCTTACCGAGCAGCAGCACACAACAGGCGCAAGAGTCAGAGAAAGGCTGAGCTCTAACCTGTCCACCCGCTCTCTGCTCAATATATAGCCCAGATCTACACTGACGTAAAGGCCAAAGTCTAAAAATACCCGCCAAATAATCACACACGCCCAGCACACGCCCAGAAACCGGTGACACACTCAAAAAAATACGCGCACTTCCTCAAACGCCCAAAACTGCCGTCATTTCCGGGTTCCCACGCTACGTCATCAAAACACGACTTTCAAATTCCGTCGACCGTTAAAAACGTCACCCGCCCCGCCCCTAACGGTCGCCCGTCTCTCAGCCAATCAGCGCCCCGCATCCCCAAATTCAAACACCTCATTTGCATATTAACGCGCACAAAAAGTTTGAGGTATATTATTGATGATG
ChAdV68-E4d-CMT-TSNA (SEQ ID NO:69)
CATCATCAATAATATACCTCAAACTTTTTGTGCGCGTTAATATGCAAATGAGGCGTTTGAATTTGGGGAGGAAGGGCGGTGATTGGTCGAGGGATGAGCGACCGTTAGGGGCGGGGCGAGTGACGTTTTGATGACGTGGTTGCGAGGAGGAGCCAGTTTGCAAGTTCTCGTGGGAAAAGTGACGTCAAACGAGGTGTGGTTTGAACACGGAAATACTCAATTTTCCCGCGCTCTCTGACAGGAAATGAGGTGTTTCTGGGCGGATGCAAGTGAAAACGGGCCATTTTCGCGCGAAAACTGAATGAGGAAGTGAAAATCTGAGTAATTTCGCGTTTATGGCAGGGAGGAGTATTTGCCGAGGGCCGAGTAGACTTTGACCGATTACGTGGGGGTTTCGATTACCGTGTTTTTCACCTAAATTTCCGCGTACGGTGTCAAAGTCCGGTGTTTTTACGTAGGTGTCAGCTGATCGCCAGGGTATTTAAACCTGCGCTCTCCAGTCAAGAGGCCACTCTTGAGTGCCAGCGAGAAGAGTTTTCTCCTCCGCGCCGCGAGTCAGATCTACACTTTGAAAGTAGGGATAACAGGGTAATGACATTGATTATTGACTAGTTGTTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTCCGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTACGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACACCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAATAACCCCGCCCCGTTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTCTCCCTATCAGTGATAGAGATCTCCCTATCAGTGATAGAGATCGTCGACGAGCTCGTTTAGTGAACCGTCAGATCGCCTGGAACGCCATCCACGCTGTTTTGACCTCCATAGAAGACAGCGATCGCGCCACCATGGCTGGCATGACCGAGTACAAGCTAGTCGTTGTGGGAGCTGGAGATGTGGGCAAATCTGCTCTGACCATTCAGCTGATTCAGGGCACAGATCTGGATCACCAGGAGAAGTGTCTGAGCAGGCTGTACGACCACATGCCAGAAGGATTAACCCCTCTTATGGGAGTGAGCTCTTCTTCTGCTCTGGCCAGACTGGGACTGCCTATGGATAAGCTGAACAAGATCACAGCTCCTGCCTCTCAGAAACTGAGACAGCTGCAGAAGATGGAGACCCCTGAACTGCTGCCTTGTGGATATCTGGTGGAGGAGAATACCACAATCAGCGTGACCGTGAAAGGCCTGGAAGCCCAGAACAAGATCAAAGGCTGTACCGGCTCTGTGAATATGACACTGCAGAGAGCTTCTGCCGCCCCTAAGACAGGAGGAGGAGGAGAAGCTGCTGCCTACAATAATACATTAGTGGCCAGACATGTGCCCCAGATCCCTAAGCCTGACAGCCTGGTTGGCCTGAGCGATGAATTAGGAAAAAGAGACACATTTGCCGAGAGCCTGATCCGGAGAATGGCCTCTGCCGGCTACCTGTTCCTGGATATCATCACATATGTTGTGTTTGCCGTGACCTTCGTGCTGGGAGTTCTGGGCGGCCTGAATACCGAGACCAATGAAAAAGCTCTTGAAGCCGTGTTTGGCAAGTACGGCAGAATCGTGGAGGTGCTGGGCGGCAGATCTTGTGAAGAATTAACAGCTGTGTTACCACCTCCTCAGCTGCTTGGCAGACGGTTCAACTTCTTCAGCTACAGCTACGTTGCTGCTGGCTCTTCTGGCAACAACTACGACCTGATGGCCCAGCCTATTACACCTGGACCTGATACAACACCTCTGCCTGTGACCGATACATCTTCTGTGTCTACCGGACACGCCACATCTCTGCCAGTGACAGATGCTGGACTGAGAGTGACAGAGTCTAAAGGACACAGCGATTCTTGGCACCTGAGCCTGGATACAGCCATCAGGGTGAATACCCCTAAGCTGGTTTCTGAAGTGGAAGAGCTGAACAAGAGCATCACCGCCCTGAGGGAGAAGTTACTGCAGATGGTGGAAGCCGATAGACCTGGAAACCTGTTTATTGGAGGCCTGAACACCGAGACCAATGAGGACTCTCCCGTGAAGGATGAAGTGGTGGTGAACGATCAATGGGGCCAGAATTGTAGCTGCCATCATGGAGGCTACGAGTTCCCTGATCTGCACAGGACAATCGTGTCTGAGTGCGATGTGTATCTGACCTACATGCTGAGACAGGCTGCTCTGCAGCTGTTCTTCGACCTGTATCACAGCATCCCTAGCAGCTTTTCTCCTCTGGTTCTGAGCTGTCTGGTGCAGCCTCTGGAAGATGTGGAAGTGATGGAGAAGGATGGCACAACCTTTAGCTGTGAGGTGAGCCACGATGAGGTGCCTCGGACATATGGACCCGTGTTTATGTGTCTGGGAGGACTGCTGACCATGGTGGCTGGAGCTGTTTGGCTGACAGTTGGACCCGGACCAGGCGCCAAATTTGTTGCTGCTTGGACACTGAAAGCTGCTGCTGGGCCCGGACCAGGCCAGTACATCAAGGCCAACTCTAAGTTTATCGGCATCACCGAATTGGGACCTGGACCCGGCTAGTAGTGAGTTTAAACTCCCATTTAAATGTGAGGGTTAATGCTTCGAGCAGACATGATAAGATACATTGATGAGTTTGGACAAACCACAACTAGAATGCAGTGAAAAAAATGCTTTATTTGTGAAATTTGTGATGCTATTGCTTTATTTGTAACCATTATAAGCTGCAATAAACAAGTTAACAACAACAATTGCATTCATTTTATGTTTCAGGTTCAGGGGGAGATGTGGGAGGTTTTTTAAAGCAAGTAAAACCTCTACAAATGTGGTAAAATAACTATAACGGTCCTAAGGTAGCGAGTGAGTAGTGTTCTGGGGCGGGGGAGGACCTGCATGAGGGCCAGAATAACTGAAATCTGTGCTTTTCTGTGTGTTGCAGCAGCATGAGCGGAAGCGGCTCCTTTGAGGGAGGGGTATTCAGCCCTTATCTGACGGGGCGTCTCCCCTCCTGGGCGGGAGTGCGTCAGAATGTGATGGGATCCACGGTGGACGGCCGGCCCGTGCAGCCCGCGAACTCTTCAACCCTGACCTATGCAACCCTGAGCTCTTCGTCGTTGGACGCAGCTGCCGCCGCAGCTGCTGCATCTGCCGCCAGCGCCGTGCGCGGAATGGCCATGGGCGCCGGCTACTACGGCACTCTGGTGGCCAACTCGAGTTCCACCAATAATCCCGCCAGCCTGAACGAGGAGAAGCTGTTGCTGCTGATGGCCCAGCTCGAGGCCTTGACCCAGCGCCTGGGCGAGCTGACCCAGCAGGTGGCTCAGCTGCAGGAGCAGACGCGGGCCGCGGTTGCCACGGTGAAATCCAAATAAAAAATGAATCAATAAATAAACGGAGACGGTTGTTGATTTTAACACAGAGTCTGAATCTTTATTTGATTTTTCGCGCGCGGTAGGCCCTGGACCACCGGTCTCGATCATTGAGCACCCGGTGGATCTTTTCCAGGACCCGGTAGAGGTGGGCTTGGATGTTGAGGTACATGGGCATGAGCCCGTCCCGGGGGTGGAGGTAGCTCCATTGCAGGGCCTCGTGCTCGGGGGTGGTGTTGTAAATCACCCAGTCATAGCAGGGGCGCAGGGCATGGTGTTGCACAATATCTTTGAGGAGGAGACTGATGGCCACGGGCAGCCCTTTGGTGTAGGTGTTTACAAATCTGTTGAGCTGGGAGGGATGCATGCGGGGGGAGATGAGGTGCATCTTGGCCTGGATCTTGAGATTGGCGATGTTACCGCCCAGATCCCGCCTGGGGTTCATGTTGTGCAGGACCACCAGCACGGTGTATCCGGTGCACTTGGGGAATTTATCATGCAACTTGGAAGGGAAGGCGTGAAAGAATTTGGCGACGCCTTTGTGCCCGCCCAGGTTTTCCATGCACTCATCCATGATGATGGCGATGGGCCCGTGGGCGGCGGCCTGGGCAAAGACGTTTCGGGGGTCGGACACATCATAGTTGTGGTCCTGGGTGAGGTCATCATAGGCCATTTTAATGAATTTGGGGCGGAGGGTGCCGGACTGGGGGACAAAGGTTCCCTCGATCCCGGGGGCGTAGTTCCCCTCACAGATCTGCATCTCCCAGGCTTTGAGCTCGGAGGGGGGGATCATGTCCACCTGCGGGGCGATAAAGAACACGGTTTCCGGGGCGGGGGAGATGAGCTGGGCCGAAAGCAAGTTCCGGAGCAGCTGGGACTTGCCGCAGCCGGTGGGGCCGTAGATGACCCCGATGACCGGCTGCAGGTGGTAGTTGAGGGAGAGACAGCTGCCGTCCTCCCGGAGGAGGGGGGCCACCTCGTTCATCATCTCGCGCACGTGCATGTTCTCGCGCACCAGTTCCGCCAGGAGGCGCTCTCCCCCCAGGGATAGGAGCTCCTGGAGCGAGGCGAAGTTTTTCAGCGGCTTGAGTCCGTCGGCCATGGGCATTTTGGAGAGGGTTTGTTGCAAGAGTTCCAGGCGGTCCCAGAGCTCGGTGATGTGCTCTACGGCATCTCGATCCAGCAGACCTCCTCGTTTCGCGGGTTGGGACGGCTGCGGGAGTAGGGCACCAGACGATGGGCGTCCAGCGCAGCCAGGGTCCGGTCCTTCCAGGGTCGCAGCGTCCGCGTCAGGGTGGTCTCCGTCACGGTGAAGGGGTGCGCGCCGGGCTGGGCGCTTGCGAGGGTGCGCTTCAGGCTCATCCGGCTGGTCGAAAACCGCTCCCGATCGGCGCCCTGCGCGTCGGCCAGGTAGCAATTGACCATGAGTTCGTAGTTGAGCGCCTCGGCCGCGTGGCCTTTGGCGCGGAGCTTACCTTTGGAAGTCTGCCCGCAGGCGGGACAGAGGAGGGACTTGAGGGCGTAGAGCTTGGGGGCGAGGAAGACGGACTCGGGGGCGTAGGCGTCCGCGCCGCAGTGGGCGCAGACGGTCTCGCACTCCACGAGCCAGGTGAGGTCGGGCTGGTCGGGGTCAAAAACCAGTTTCCCGCCGTTCTTTTTGATGCGTTTCTTACCTTTGGTCTCCATGAGCTCGTGTCCCCGCTGGGTGACAAAGAGGCTGTCCGTGTCCCCGTAGACCGACTTTATGGGCCGGTCCTCGAGCGGTGTGCCGCGGTCCTCCTCGTAGAGGAACCCCGCCCACTCCGAGACGAAAGCCCGGGTCCAGGCCAGCACGAAGGAGGCCACGTGGGACGGGTAGCGGTCGTTGTCCACCAGCGGGTCCACCTTTTCCAGGGTATGCAAACACATGTCCCCCTCGTCCACATCCAGGAAGGTGATTGGCTTGTAAGTGTAGGCCACGTGACCGGGGGTCCCGGCCGGGGGGGTATAAAAGGGTGCGGGTCCCTGCTCGTCCTCACTGTCTTCCGGATCGCTGTCCAGGAGCGCCAGCTGTTGGGGTAGGTATTCCCTCTCGAAGGCGGGCATGACCTCGGCACTCAGGTTGTCAGTTTCTAGAAACGAGGAGGATTTGATATTGACGGTGCCGGCGGAGATGCCTTTCAAGAGCCCCTCGTCCATCTGGTCAGAAAAGACGATCTTTTTGTTGTCGAGCTTGGTGGCGAAGGAGCCGTAGAGGGCGTTGGAGAGGAGCTTGGCGATGGAGCGCATGGTCTGGTTTTTTTCCTTGTCGGCGCGCTCCTTGGCGGCGATGTTGAGCTGCACGTACTCGCGCGCCACGCACTTCCATTCGGGGAAGACGGTGGTCAGCTCGTCGGGCACGATTCTGACCTGCCAGCCCCGATTATGCAGGGTGATGAGGTCCACACTGGTGGCCACCTCGCCGCGCAGGGGCTCATTAGTCCAGCAGAGGCGTCCGCCCTTGCGCGAGCAGAAGGGGGGCAGGGGGTCCAGCATGACCTCGTCGGGGGGGTCGGCATCGATGGTGAAGATGCCGGGCAGGAGGTCGGGGTCAAAGTAGCTGATGGAAGTGGCCAGATCGTCCAGGGCAGCTTGCCATTCGCGCACGGCCAGCGCGCGCTCGTAGGGACTGAGGGGCGTGCCCCAGGGCATGGGATGGGTAAGCGCGGAGGCGTACATGCCGCAGATGTCGTAGACGTAGAGGGGCTCCTCGAGGATGCCGATGTAGGTGGGGTAGCAGCGCCCCCCGCGGATGCTGGCGCGCACGTAGTCATACAGCTCGTGCGAGGGGGCGAGGAGCCCCGGGCCCAGGTTGGTGCGACTGGGCTTTTCGGCGCGGTAGACGATCTGGCGGAAAATGGCATGCGAGTTGGAGGAGATGGTGGGCCTTTGGAAGATGTTGAAGTGGGCGTGGGGCAGTCCGACCGAGTCGCGGATGAAGTGGGCGTAGGAGTCTTGCAGCTTGGCGACGAGCTCGGCGGTGACTAGGACGTCCAGAGCGCAGTAGTCGAGGGTCTCCTGGATGATGTCATACTTGAGCTGTCCCTTTTGTTTCCACAGCTCGCGGTTGAGAAGGAACTCTTCGCGGTCCTTCCAGTACTCTTCGAGGGGGAACCCGTCCTGATCTGCACGGTAAGAGCCTAGCATGTAGAACTGGTTGACGGCCTTGTAGGCGCAGCAGCCCTTCTCCACGGGGAGGGCGTAGGCCTGGGCGGCCTTGCGCAGGGAGGTGTGCGTGAGGGCGAAAGTGTCCCTGACCATGACCTTGAGGAACTGGTGCTTGAAGTCGATATCGTCGCAGCCCCCCTGCTCCCAGAGCTGGAAGTCCGTGCGCTTCTTGTAGGCGGGGTTGGGCAAAGCGAAAGTAACATCGTTGAAGAGGATCTTGCCCGCGCGGGGCATAAAGTTGCGAGTGATGCGGAAAGGTTGGGGCACCTCGGCCCGGTTGTTGATGACCTGGGCGGCGAGCACGATCTCGTCGAAGCCGTTGATGTTGTGGCCCACGATGTAGAGTTCCACGAATCGCGGACGGCCCTTGACGTGGGGCAGTTTCTTGAGCTCCTCGTAGGTGAGCTCGTCGGGGTCGCTGAGCCCGTGCTGCTCGAGCGCCCAGTCGGCGAGATGGGGGTTGGCGCGGAGGAAGGAAGTCCAGAGATCCACGGCCAGGGCGGTTTGCAGACGGTCCCGGTACTGACGGAACTGCTGCCCGACGGCCATTTTTTCGGGGGTGACGCAGTAGAAGGTGCGGGGGTCCCCGTGCCAGCGATCCCATTTGAGCTGGAGGGCGAGATCGAGGGCGAGCTCGACGAGCCGGTCGTCCCCGGAGAGTTTCATGACCAGCATGAAGGGGACGAGCTGCTTGCCGAAGGACCCCATCCAGGTGTAGGTTTCCACATCGTAGGTGAGGAAGAGCCTTTCGGTGCGAGGATGCGAGCCGATGGGGAAGAACTGGATCTCCTGCCACCAATTGGAGGAATGGCTGTTGATGTGATGGAAGTAGAAATGCCGACGGCGCGCCGAACACTCGTGCTTGTGTTTATACAAGCGGCCACAGTGCTCGCAACGCTGCACGGGATGCACGTGCTGCACGAGCTGTACCTGAGTTCCTTTGACGAGGAATTTCAGTGGGAAGTGGAGTCGTGGCGCCTGCATCTCGTGCTGTACTACGTCGTGGTGGTCGGCCTGGCCCTCTTCTGCCTCGATGGTGGTCATGCTGACGAGCCCGCGCGGGAGGCAGGTCCAGACCTCGGCGCGAGCGGGTCGGAGAGCGAGGACGAGGGCGCGCAGGCCGGAGCTGTCCAGGGTCCTGAGACGCTGCGGAGTCAGGTCAGTGGGCAGCGGCGGCGCGCGGTTGACTTGCAGGAGTTTTTCCAGGGCGCGCGGGAGGTCCAGATGGTACTTGATCTCCACCGCGCCATTGGTGGCGACGTCGATGGCTTGCAGGGTCCCGTGCCCCTGGGGTGTGACCACCGTCCCCCGTTTCTTCTTGGGCGGCTGGGGCGACGGGGGCGGTGCCTCTTCCATGGTTAGAAGCGGCGGCGAGGACGCGCGCCGGGCGGCAGGGGCGGCTCGGGGCCCGGAGGCAGGGGCGGCAGGGGCACGTCGGCGCCGCGCGCGGGTAGGTTCTGGTACTGCGCCCGGAGAAGACTGGCGTGAGCGACGACGCGACGGTTGACGTCCTGGATCTGACGCCTCTGGGTGAAGGCCACGGGACCCGTGAGTTTGAACCTGAAAGAGAGTTCGACAGAATCAATCTCGGTATCGTTGACGGCGGCCTGCCGCAGGATCTCTTGCACGTCGCCCGAGTTGTCCTGGTAGGCGATCTCGGTCATGAACTGCTCGATCTCCTCCTCTTGAAGGTCTCCGCGGCCGGCGCGCTCCACGGTGGCCGCGAGGTCGTTGGAGATGCGGCCCATGAGCTGCGAGAAGGCGTTCATGCCCGCCTCGTTCCAGACGCGGCTGTAGACCACGACGCCCTCGGGATCGCGGGCGCGCATGACCACCTGGGCGAGGTTGAGCTCCACGTGGCGCGTGAAGACCGCGTAGTTGCAGAGGCGCTGGTAGAGGTAGTTGAGCGTGGTGGCGATGTGCTCGGTGACGAAGAAATACATGATCCAGCGGCGGAGCGGCATCTCGCTGACGTCGCCCAGCGCCTCCAAACGTTCCATGGCCTCGTAAAAGTCCACGGCGAAGTTGAAAAACTGGGAGTTGCGCGCCGAGACGGTCAACTCCTCCTCCAGAAGACGGATGAGCTCGGCGATGGTGGCGCGCACCTCGCGCTCGAAGGCCCCCGGGAGTTCCTCCACTTCCTCTTCTTCCTCCTCCACTAACATCTCTTCTACTTCCTCCTCAGGCGGCAGTGGTGGCGGGGGAGGGGGCCTGCGTCGCCGGCGGCGCACGGGCAGACGGTCGATGAAGCGCTCGATGGTCTCGCCGCGCCGGCGTCGCATGGTCTCGGTGACGGCGCGCCCGTCCTCGCGGGGCCGCAGCGTGAAGACGCCGCCGCGCATCTCCAGGTGGCCGGGGGGGTCCCCGTTGGGCAGGGAGAGGGCGCTGACGATGCATCTTATCAATTGCCCCGTAGGGACTCCGCGCAAGGACCTGAGCGTCTCGAGATCCACGGGATCTGAAAACCGCTGAACGAAGGCTTCGAGCCAGTCGCAGTCGCAAGGTAGGCTGAGCACGGTTTCTTCTGGCGGGTCATGTTGGTTGGGAGCGGGGCGGGCGATGCTGCTGGTGATGAAGTTGAAATAGGCGGTTCTGAGACGGCGGATGGTGGCGAGGAGCACCAGGTCTTTGGGCCCGGCTTGCTGGATGCGCAGACGGTCGGCCATGCCCCAGGCGTGGTCCTGACACCTGGCCAGGTCCTTGTAGTAGTCCTGCATGAGCCGCTCCACGGGCACCTCCTCCTCGCCCGCGCGGCCGTGCATGCGCGTGAGCCCGAAGCCGCGCTGGGGCTGGACGAGCGCCAGGTCGGCGACGACGCGCTCGGCGAGGATGGCTTGCTGGATCTGGGTGAGGGTGGTCTGGAAGTCATCAAAGTCGACGAAGCGGTGGTAGGCTCCGGTGTTGATGGTGTAGGAGCAGTTGGCCATGACGGACCAGTTGACGGTCTGGTGGCCCGGACGCACGAGCTCGTGGTACTTGAGGCGCGAGTAGGCGCGCGTGTCGAAGATGTAGTCGTTGCAGGTGCGCACCAGGTACTGGTAGCCGATGAGGAAGTGCGGCGGCGGCTGGCGGTAGAGCGGCCATCGCTCGGTGGCGGGGGCGCCGGGCGCGAGGTCCTCGAGCATGGTGCGGTGGTAGCCGTAGATGTACCTGGACATCCAGGTGATGCCGGCGGCGGTGGTGGAGGCGCGCGGGAACTCGCGGACGCGGTTCCAGATGTTGCGCAGCGGCAGGAAGTAGTTCATGGTGGGCACGGTCTGGCCCGTGAGGCGCGCGCAGTCGTGGATGCTCTATACGGGCAAAAACGAAAGCGGTCAGCGGCTCGACTCCGTGGCCTGGAGGCTAAGCGAACGGGTTGGGCTGCGCGTGTACCCCGGTTCGAATCTCGAATCAGGCTGGAGCCGCAGCTAACGTGGTATTGGCACTCCCGTCTCGACCCAAGCCTGCACCAACCCTCCAGGATACGGAGGCGGGTCGTTTTGCAACTTTTTTTTGGAGGCCGGATGAGACTAGTAAGCGCGGAAAGCGGCCGACCGCGATGGCTCGCTGCCGTAGTCTGGAGAAGAATCGCCAGGGTTGCGTTGCGGTGTGCCCCGGTTCGAGGCCGGCCGGATTCCGCGGCTAACGAGGGCGTGGCTGCCCCGTCGTTTCCAAGACCCCATAGCCAGCCGACTTCTCCAGTTACGGAGCGAGCCCCTCTTTTGTTTTGTTTGTTTTTGCCAGATGCATCCCGTACTGCGGCAGATGCGCCCCCACCACCCTCCACCGCAACAACAGCCCCCTCCACAGCCGGCGCTTCTGCCCCCGCCCCAGCAGCAACTTCCAGCCACGACCGCCGCGGCCGCCGTGAGCGGGGCTGGACAGAGTTATGATCACCAGCTGGCCTTGGAAGAGGGCGAGGGGCTGGCGCGCCTGGGGGCGTCGTCGCCGGAGCGGCACCCGCGCGTGCAGATGAAAAGGGACGCTCGCGAGGCCTACGTGCCCAAGCAGAACCTGTTCAGAGACAGGAGCGGCGAGGAGCCCGAGGAGATGCGCGCGGCCCGGTTCCACGCGGGGCGGGAGCTGCGGCGCGGCCTGGACCGAAAGAGGGTGCTGAGGGACGAGGATTTCGAGGCGGACGAGCTGACGGGGATCAGCCCCGCGCGCGCGCACGTGGCCGCGGCCAACCTGGTCACGGCGTACGAGCAGACCGTGAAGGAGGAGAGCAACTTCCAAAAATCCTTCAACAACCACGTGCGCACCCTGATCGCGCGCGAGGAGGTGACCCTGGGCCTGATGCACCTGTGGGACCTGCTGGAGGCCATCGTGCAGAACCCCACCAGCAAGCCGCTGACGGCGCAGCTGTTCCTGGTGGTGCAGCATAGTCGGGACAACGAAGCGTTCAGGGAGGCGCTGCTGAATATCACCGAGCCCGAGGGCCGCTGGCTCCTGGACCTGGTGAACATTCTGCAGAGCATCGTGGTGCAGGAGCGCGGGCTGCCGCTGTCCGAGAAGCTGGCGGCCATCAACTTCTCGGTGCTGAGTTTGGGCAAGTACTACGCTAGGAAGATCTACAAGACCCCGTACGTGCCCATAGACAAGGAGGTGAAGATCGACGGGTTTTACATGCGCATGACCCTGAAAGTGCTGACCCTGAGCGACGATCTGGGGGTGTACCGCAACGACAGGATGCACCGTGCGGTGAGCGCCAGCAGGCGGCGCGAGCTGAGCGACCAGGAGCTGATGCATAGTCTGCAGCGGGCCCTGACCGGGGCCGGGACCGAGGGGGAGAGCTACTTTGACATGGGCGCGGACCTGCACTGGCAGCCCAGCCGCCGGGCCTTGGAGGCGGCGGCAGGACCCTACGTAGAAGAGGTGGACGATGAGGTGGACGAGGAGGGCGAGTACCTGGAAGACTGATGGCGCGACCGTATTTTTGCTAGATGCAACAACAACAGCCACCTCCTGATCCCGCGATGCGGGCGGCGCTGCAGAGCCAGCCGTCCGGCATTAACTCCTCGGACGATTGGACCCAGGCCATGCAACGCATCATGGCGCTGACGACCCGCAACCCCGAAGCCTTTAGACAGCAGCCCCAGGCCAACCGGCTCTCGGCCATCCTGGAGGCCGTGGTGCCCTCGCGCTCCAACCCCACGCACGAGAAGGTCCTGGCCATCGTGAACGCGCTGGTGGAGAACAAGGCCATCCGCGGCGACGAGGCCGGCCTGGTGTACAACGCGCTGCTGGAGCGCGTGGCCCGCTACAACAGCACCAACGTGCAGACCAACCTGGACCGCATGGTGACCGACGTGCGCGAGGCCGTGGCCCAGCGCGAGCGGTTCCACCGCGAGTCCAACCTGGGATCCATGGTGGCGCTGAACGCCTTCCTCAGCACCCAGCCCGCCAACGTGCCCCGGGGCCAGGAGGACTACACCAACTTCATCAGCGCCCTGCGCCTGATGGTGACCGAGGTGCCCCAGAGCGAGGTGTACCAGTCCGGGCCGGACTACTTCTTCCAGACCAGTCGCCAGGGCTTGCAGACCGTGAACCTGAGCCAGGCTTTCAAGAACTTGCAGGGCCTGTGGGGCGTGCAGGCCCCGGTCGGGGACCGCGCGACGGTGTCGAGCCTGCTGACGCCGAACTCGCGCCTGCTGCTGCTGCTGGTGGCCCCCTTCACGGACAGCGGCAGCATCAACCGCAACTCGTACCTGGGCTACCTGATTAACCTGTACCGCGAGGCCATCGGCCAGGCGCACGTGGACGAGCAGACCTACCAGGAGATCACCCACGTGAGCCGCGCCCTGGGCCAGGACGACCCGGGCAACCTGGAAGCCACCCTGAACTTTTTGCTGACCAACCGGTCGCAGAAGATCCCGCCCCAGTACGCGCTCAGCACCGAGGAGGAGCGCATCCTGCGTTACGTGCAGCAGAGCGTGGGCCTGTTCCTGATGCAGGAGGGGGCCACCCCCAGCGCCGCGCTCGACATGACCGCGCGCAACATGGAGCCCAGCATGTACGCCAGCAACCGCCCGTTCATCAATAAACTGATGGACTACTTGCATCGGGCGGCCGCCATGAACTCTGACTATTTCACCAACGCCATCCTGAATCCCCACTGGCTCCCGCCGCCGGGGTTCTACACGGGCGAGTACGACATGCCCGACCCCAATGACGGGTTCCTGTGGGACGATGTGGACAGCAGCGTGTTCTCCCCCCGACCGGGTGCTAACGAGCGCCCCTTGTGGAAGAAGGAAGGCAGCGACCGACGCCCGTCCTCGGCGCTGTCCGGCCGCGAGGGTGCTGCCGCGGCGGTGCCCGAGGCCGCCAGTCCTTTCCCGAGCTTGCCCTTCTCGCTGAACAGTATCCGCAGCAGCGAGCTGGGCAGGATCACGCGCCCGCGCTTGCTGGGCGAAGAGGAGTACTTGAATGACTCGCTGTTGAGACCCGAGCGGGAGAAGAACTTCCCCAATAACGGGATAGAAAGCCTGGTGGACAAGATGAGCCGCTGGAAGACGTATGCGCAGGAGCACAGGGACGATCCCCGGGCGTCGCAGGGGGCCACGAGCCGGGGCAGCGCCGCCCGTAAACGCCGGTGGCACGACAGGCAGCGGGGACAGATGTGGGACGATGAGGACTCCGCCGACGACAGCAGCGTGTTGGACTTGGGTGGGAGTGGTAACCCGTTCGCTCACCTGCGCCCCCGTATCGGGCGCATGATGTAAGAGAAACCGAAAATAAATGATACTCACCAAGGCCATGGCGACCAGCGTGCGTTCGTTTCTTCTCTGTTGTTGTTGTATCTAGTATGATGAGGCGTGCGTACCCGGAGGGTCCTCCTCCCTCGTACGAGAGCGTGATGCAGCAGGCGATGGCGGCGGCGGCGATGCAGCCCCCGCTGGAGGCTCCTTACGTGCCCCCGCGGTACCTGGCGCCTACGGAGGGGCGGAACAGCATTCGTTACTCGGAGCTGGCACCCTTGTACGATACCACCCGGTTGTACCTGGTGGACAACAAGTCGGCGGACATCGCCTCGCTGAACTACCAGAACGACCACAGCAACTTCCTGACCACCGTGGTGCAGAACAATGACTTCACCCCCACGGAGGCCAGCACCCAGACCATCAACTTTGACGAGCGCTCGCGGTGGGGCGGCCAGCTGAAAACCATCATGCACACCAACATGCCCAACGTGAACGAGTTCATGTACAGCAACAAGTTCAAGGCGCGGGTGATGGTCTCCCGCAAGACCCCCAATGGGGTGACAGTGACAGAGGATTATGATGGTAGTCAGGATGAGCTGAAGTATGAATGGGTGGAATTTGAGCTGCCCGAAGGCAACTTCTCGGTGACCATGACCATCGACCTGATGAACAACGCCATCATCGACAATTACTTGGCGGTGGGGCGGCAGAACGGGGTGCTGGAGAGCGACATCGGCGTGAAGTTCGACACTAGGAACTTCAGGCTGGGCTGGGACCCCGTGACCGAGCTGGTCATGCCCGGGGTGTACACCAACGAGGCTTTCCATCCCGATATTGTCTTGCTGCCCGGCTGCGGGGTGGACTTCACCGAGAGCCGCCTCAGCAACCTGCTGGGCATTCGCAAGAGGCAGCCCTTCCAGGAAGGCTTCCAGATCATGTACGAGGATCTGGAGGGGGGCAACATCCCCGCGCTCCTGGATGTCGACGCCTATGAGAAAAGCAAGGAGGATGCAGCAGCTGAAGCAACTGCAGCCGTAGCTACCGCCTCTACCGAGGTCAGGGGCGATAATTTTGCAAGCGCCGCAGCAGTGGCAGCGGCCGAGGCGGCTGAAACCGAAAGTAAGATAGTCATTCAGCCGGTGGAGAAGGATAGCAAGAACAGGAGCTACAACGTACTACCGGACAAGATAAACACCGCCTACCGCAGCTGGTACCTAGCCTACAACTATGGCGACCCCGAGAAGGGCGTGCGCTCCTGGACGCTGCTCACCACCTCGGACGTCACCTGCGGCGTGGAGCAAGTCTACTGGTCGCTGCCCGACATGATGCAAGACCCGGTCACCTTCCGCTCCACGCGTCAAGTTAGCAACTACCCGGTGGTGGGCGCCGAGCTCCTGCCCGTCTACTCCAAGAGCTTCTTCAACGAGCAGGCCGTCTACTCGCAGCAGCTGCGCGCCTTCACCTCGCTTACGCACGTCTTCAACCGCTTCCCCGAGAACCAGATCCTCGTCCGCCCGCCCGCGCCCACCATTACCACCGTCAGTGAAAACGTTCCTGCTCTCACAGATCACGGGACCCTGCCGCTGCGCAGCAGTATCCGGGGAGTCCAGCGCGTGACCGTTACTGACGCCAGACGCCGCACCTGCCCCTACGTCTACAAGGCCCTGGGCATAGTCGCGCCGCGCGTCCTCTCGAGCCGCACCTTCTAAATGTCCATTCTCATCTCGCCCAGTAATAACACCGGTTGGGGCCTGCGCGCGCCCAGCAAGATGTACGGAGGCGCTCGCCAACGCTCCACGCAACACCCCGTGCGCGTGCGCGGGCACTTCCGCGCTCCCTGGGGCGCCCTCAAGGGCCGCGTGCGGTCGCGCACCACCGTCGACGACGTGATCGACCAGGTGGTGGCCGACGCGCGCAACTACACCCCCGCCGCCGCGCCCGTCTCCACCGTGGACGCCGTCATCGACAGCGTGGTGGCCGACGCGCGCCGGTACGCCCGCGCCAAGAGCCGGCGGCGGCGCATCGCCCGGCGGCACCGGAGCACCCCCGCCATGCGCGCGGCGCGAGCCTTGCTGCGCAGGGCCAGGCGCACGGGACGCAGGGCCATGCTCAGGGCGGCCAGACGCGCGGCTTCAGGCGCCAGCGCCGGCAGGACCCGGAGACGCGCGGCCACGGCGGCGGCAGCGGCCATCGCCAGCATGTCCCGCCCGCGGCGAGGGAACGTGTACTGGGTGCGCGACGCCGCCACCGGTGTGCGCGTGCCCGTGCGCACCCGCCCCCCTCGCACTTGAAGATGTTCACTTCGCGATGTTGATGTGTCCCAGCGGCGAGGAGGATGTCCAAGCGCAAATTCAAGGAAGAGATGCTCCAGGTCATCGCGCCTGAGATCTACGGCCCTGCGGTGGTGAAGGAGGAAAGAAAGCCCCGCAAAATCAAGCGGGTCAAAAAGGACAAAAAGGAAGAAGAAAGTGATGTGGACGGATTGGTGGAGTTTGTGCGCGAGTTCGCCCCCCGGCGGCGCGTGCAGTGGCGCGGGCGGAAGGTGCAACCGGTGCTGAGACCCGGCACCACCGTGGTCTTCACGCCCGGCGAGCGCTCCGGCACCGCTTCCAAGCGCTCCTACGACGAGGTGTACGGGGATGATGATATTCTGGAGCAGGCGGCCGAGCGCCTGGGCGAGTTTGCTTACGGCAAGCGCAGCCGTTCCGCACCGAAGGAAGAGGCGGTGTCCATCCCGCTGGACCACGGCAACCCCACGCCGAGCCTCAAGCCCGTGACCTTGCAGCAGGTGCTGCCGACCGCGGCGCCGCGCCGGGGGTTCAAGCGCGAGGGCGAGGATCTGTACCCCACCATGCAGCTGATGGTGCCCAAGCGCCAGAAGCTGGAAGACGTGCTGGAGACCATGAAGGTGGACCCGGACGTGCAGCCCGAGGTCAAGGTGCGGCCCATCAAGCAGGTGGCCCCGGGCCTGGGCGTGCAGACCGTGGACATCAAGATTCCCACGGAGCCCATGGAAACGCAGACCGAGCCCATGATCAAGCCCAGCACCAGCACCATGGAGGTGCAGACGGATCCCTGGATGCCATCGGCTCCTAGTCGAAGACCCCGGCGCAAGTACGGCGCGGCCAGCCTGCTGATGCCCAACTACGCGCTGCATCCTTCCATCATCCCCACGCCGGGCTACCGCGGCACGCGCTTCTACCGCGGTCATACCAGCAGCCGCCGCCGCAAGACCACCACTCGCCGCCGCCGTCGCCGCACCGCCGCTGCAACCACCCCTGCCGCCCTGGTGCGGAGAGTGTACCGCCGCGGCCGCGCACCTCTGACCCTGCCGCGCGCGCGCTACCACCCGAGCATCGCCATTTAAACTTTCGCCTGCTTTGCAGATCAATGGCCCTCACATGCCGCCTTCGCGTTCCCATTACGGGCTACCGAGGAAGAAAACCGCGCCGTAGAAGGCTGGCGGGGAACGGGATGCGTCGCCACCACCACCGGCGGCGGCGCGCCATCAGCAAGCGGTTGGGGGGAGGCTTCCTGCCCGCGCTGATCCCCATCATCGCCGCGGCGATCGGGGCGATCCCCGGCATTGCTTCCGTGGCGGTGCAGGCCTCTCAGCGCCACTGAGACACACTTGGAAACATCTTGTAATAAACCAATGGACTCTGACGCTCCTGGTCCTGTGATGTGTTTTCGTAGACAGATGGAAGACATCAATTTTTCGTCCCTGGCTCCGCGACACGGCACGCGGCCGTTCATGGGCACCTGGAGCGACATCGGCACCAGCCAACTGAACGGGGGCGCCTTCAATTGGAGCAGTCTCTGGAGCGGGCTTAAGAATTTCGGGTCCACGCTTAAAACCTATGGCAGCAAGGCGTGGAACAGCACCACAGGGCAGGCGCTGAGGGATAAGCTGAAAGAGCAGAACTTCCAGCAGAAGGTGGTCGATGGGCTCGCCTCGGGCATCAACGGGGTGGTGGACCTGGCCAACCAGGCCGTGCAGCGGCAGATCAACAGCCGCCTGGACCCGGTGCCGCCCGCCGGCTCCGTGGAGATGCCGCAGGTGGAGGAGGAGCTGCCTCCCCTGGACAAGCGGGGCGAGAAGCGACCCCGCCCCGATGCGGAGGAGACGCTGCTGACGCACACGGACGAGCCGCCCCCGTACGAGGAGGCGGTGAAACTGGGTCTGCCCACCACGCGGCCCATCGCGCCCCTGGCCACCGGGGTGCTGAAACCCGAAAAGCCCGCGACCCTGGACTTGCCTCCTCCCCAGCCTTCCCGCCCCTCTACAGTGGCTAAGCCCCTGCCGCCGGTGGCCGTGGCCCGCGCGCGACCCGGGGGCACCGCCCGCCCTCATGCGAACTGGCAGAGCACTCTGAACAGCATCGTGGGTCTGGGAGTGCAGAGTGTGAAGCGCCGCCGCTGCTATTAAACCTACCGTAGCGCTTAACTTGCTTGTCTGTGTGTGTATGTATTATGTCGCCGCCGCCGCTGTCCACCAGAAGGAGGAGTGAAGAGGCGCGTCGCCGAGTTGCAAGATGGCCACCCCATCGATGCTGCCCCAGTGGGCGTACATGCACATCGCCGGACAGGACGCTTCGGAGTACCTGAGTCCGGGTCTGGTGCAGTTTGCCCGCGCCACAGACACCTACTTCAGTCTGGGGAACAAGTTTAGGAACCCCACGGTGGCGCCCACGCACGATGTGACCACCGACCGCAGCCAGCGGCTGACGCTGCGCTTCGTGCCCGTGGACCGCGAGGACAACACCTACTCGTACAAAGTGCGCTACACGCTGGCCGTGGGCGACAACCGCGTGCTGGACATGGCCAGCACCTACTTTGACATCCGCGGCGTGCTGGATCGGGGCCCTAGCTTCAAACCCTACTCCGGCACCGCCTACAACAGTCTGGCCCCCAAGGGAGCACCCAACACTTGTCAGTGGACATATAAAGCCGATGGTGAAACTGCCACAGAAAAAACCTATACATATGGAAATGCACCCGTGCAGGGCATTAACATCACAAAAGATGGTATTCAACTTGGAACTGACACCGATGATCAGCCAATCTACGCAGATAAAACCTATCAGCCTGAACCTCAAGTGGGTGATGCTGAATGGCATGACATCACTGGTACTGATGAAAAGTATGGAGGCAGAGCTCTTAAGCCTGATACCAAAATGAAGCCTTGTTATGGTTCTTTTGCCAAGCCTACTAATAAAGAAGGAGGTCAGGCAAATGTGAAAACAGGAACAGGCACTACTAAAGAATATGACATAGACATGGCTTTCTTTGACAACAGAAGTGCGGCTGCTGCTGGCCTAGCTCCAGAAATTGTTTTGTATACTGAAAATGTGGATTTGGAAACTCCAGATACCCATATTGTATACAAAGCAGGCACAGATGACAGCAGCTCTTCTATTAATTTGGGTCAGCAAGCCATGCCCAACAGACCTAACTACATTGGTTTCAGAGACAACTTTATCGGGCTCATGTACTACAACAGCACTGGCAATATGGGGGTGCTGGCCGGTCAGGCTTCTCAGCTGAATGCTGTGGTTGACTTGCAAGACAGAAACACCGAGCTGTCCTACCAGCTCTTGCTTGACTCTCTGGGTGACAGAACCCGGTATTTCAGTATGTGGAATCAGGCGGTGGACAGCTATGATCCTGATGTGCGCATTATTGAAAATCATGGTGTGGAGGATGAACTTCCCAACTATTGTTTCCCTCTGGATGCTGTTGGCAGAACAGATACTTATCAGGGAATTAAGGCTAATGGAACTGATCAAACCACATGGACCAAAGATGACAGTGTCAATGATGCTAATGAGATAGGCAAGGGTAATCCATTCGCCATGGAAATCAACATCCAAGCCAACCTGTGGAGGAACTTCCTCTACGCCAACGTGGCCCTGTACCTGCCCGACTCTTACAAGTACACGCCGGCCAATGTTACCCTGCCCACCAACACCAACACCTACGATTACATGAACGGCCGGGTGGTGGCGCCCTCGCTGGTGGACTCCTACATCAACATCGGGGCGCGCTGGTCGCTGGATCCCATGGACAACGTGAACCCCTTCAACCACCACCGCAATGCGGGGCTGCGCTACCGCTCCATGCTCCTGGGCAACGGGCGCTACGTGCCCTTCCACATCCAGGTGCCCCAGAAATTTTTCGCCATCAAGAGCCTCCTGCTCCTGCCCGGGTCCTACACCTACGAGTGGAACTTCCGCAAGGACGTCAACATGATCCTGCAGAGCTCCCTCGGCAACGACCTGCGCACGGACGGGGCCTCCATCTCCTTCACCAGCATCAACCTCTACGCCACCTTCTTCCCCATGGCGCACAACACGGCCTCCACGCTCGAGGCCATGCTGCGCAACGACACCAACGACCAGTCCTTCAACGACTACCTCTCGGCGGCCAACATGCTCTACCCCATCCCGGCCAACGCCACCAACGTGCCCATCTCCATCCCCTCGCGCAACTGGGCCGCCTTCCGCGGCTGGTCCTTCACGCGTCTCAAGACCAAGGAGACGCCCTCGCTGGGCTCCGGGTTCGACCCCTACTTCGTCTACTCGGGCTCCATCCCCTACCTCGACGGCACCTTCTACCTCAACCACACCTTCAAGAAGGTCTCCATCACCTTCGACTCCTCCGTCAGCTGGCCCGGCAACGACCGGCTCCTGACGCCCAACGAGTTCGAAATCAAGCGCACCGTCGACGGCGAGGGCTACAACGTGGCCCAGTGCAACATGACCAAGGACTGGTTCCTGGTCCAGATGCTGGCCCACTACAACATCGGCTACCAGGGCTTCTACGTGCCCGAGGGCTACAAGGACCGCATGTACTCCTTCTTCCGCAACTTCCAGCCCATGAGCCGCCAGGTGGTGGACGAGGTCAACTACAAGGACTACCAGGCCGTCACCCTGGCCTACCAGCACAACAACTCGGGCTTCGTCGGCTACCTCGCGCCCACCATGCGCCAGGGCCAGCCCTACCCCGCCAACTACCCCTACCCGCTCATCGGCAAGAGCGCCGTCACCAGCGTCACCCAGAAAAAGTTCCTCTGCGACAGGGTCATGTGGCGCATCCCCTTCTCCAGCAACTTCATGTCCATGGGCGCGCTCACCGACCTCGGCCAGAACATGCTCTATGCCAACTCCGCCCACGCGCTAGACATGAATTTCGAAGTCGACCCCATGGATGAGTCCACCCTTCTCTATGTTGTCTTCGAAGTCTTCGACGTCGTCCGAGTGCACCAGCCCCACCGCGGCGTCATCGAGGCCGTCTACCTGCGCACCCCCTTCTCGGCCGGTAACGCCACCACCTAAGCTCTTGCTTCTTGCAAGCCATGGCCGCGGGCTCCGGCGAGCAGGAGCTCAGGGCCATCATCCGCGACCTGGGCTGCGGGCCCTACTTCCTGGGCACCTTCGATAAGCGCTTCCCGGGATTCATGGCCCCGCACAAGCTGGCCTGCGCCATCGTCAACACGGCCGGCCGCGAGACCGGGGGCGAGCACTGGCTGGCCTTCGCCTGGAACCCGCGCTCGAACACCTGCTACCTCTTCGACCCCTTCGGGTTCTCGGACGAGCGCCTCAAGCAGATCTACCAGTTCGAGTACGAGGGCCTGCTGCGCCGCAGCGCCCTGGCCACCGAGGACCGCTGCGTCACCCTGGAAAAGTCCACCCAGACCGTGCAGGGTCCGCGCTCGGCCGCCTGCGGGCTCTTCTGCTGCATGTTCCTGCACGCCTTCGTGCACTGGCCCGACCGCCCCATGGACAAGAACCCCACCATGAACTTGCTGACGGGGGTGCCCAACGGCATGCTCCAGTCGCCCCAGGTGGAACCCACCCTGCGCCGCAACCAGGAGGCGCTCTACCGCTTCCTCAACTCCCACTCCGCCTACTTTCGCTCCCACCGCGCGCGCATCGAGAAGGCCACCGCCTTCGACCGCATGAATCAAGACATGTAAACCGTGTGTGTATGTTAAATGTCTTTAATAAACAGCACTTTCATGTTACACATGCATCTGAGATGATTTATTTAGAAATCGAAAGGGTTCTGCCGGGTCTCGGCATGGCCCGCGGGCAGGGACACGTTGCGGAACTGGTACTTGGCCAGCCACTTGAACTCGGGGATCAGCAGTTTGGGCAGCGGGGTGTCGGGGAAGGAGTCGGTCCACAGCTTCCGCGTCAGTTGCAGGGCGCCCAGCAGGTCGGGCGCGGAGATCTTGAAATCGCAGTTGGGACCCGCGTTCTGCGCGCGGGAGTTGCGGTACACGGGGTTGCAGCACTGGAACACCATCAGGGCCGGGTGCTTCACGCTCGCCAGCACCGTCGCGTCGGTGATGCTCTCCACGTCGAGGTCCTCGGCGTTGGCCATCCCGAAGGGGGTCATCTTGCAGGTCTGCCTTCCCATGGTGGGCACGCACCCGGGCTTGTGGTTGCAATCGCAGTGCAGGGGGATCAGCATCATCTGGGCCTGGTCGGCGTTCATCCCCGGGTACATGGCCTTCATGAAAGCCTCCAATTGCCTGAACGCCTGCTGGGCCTTGGCTCCCTCGGTGAAGAAGACCCCGCAGGACTTGCTAGAGAACTGGTTGGTGGCGCACCCGGCGTCGTGCACGCAGCAGCGCGCGTCGTTGTTGGCCAGCTGCACCACGCTGCGCCCCCAGCGGTTCTGGGTGATCTTGGCCCGGTCGGGGTTCTCCTTCAGCGCGCGCTGCCCGTTCTCGCTCGCCACATCCATCTCGATCATGTGCTCCTTCTGGATCATGGTGGTCCCGTGCAGGCACCGCAGCTTGCCCTCGGCCTCGGTGCACCCGTGCAGCCACAGCGCGCACCCGGTGCACTCCCAGTTCTTGTGGGCGATCTGGGAATGCGCGTGCACGAAGCCCTGCAGGAAGCGGCCCATCATGGTGGTCAGGGTCTTGTTGCTAGTGAAGGTCAGCGGAATGCCGCGGTGCTCCTCGTTGATGTACAGGTGGCAGATGCGGCGGTACACCTCGCCCTGCTCGGGCATCAGCTGGAAGTTGGCTTTCAGGTCGGTCTCCACGCGGTAGCGGTCCATCAGCATAGTCATGATTTCCATACCCTTCTCCCAGGCCGAGACGATGGGCAGGCTCATAGGGTTCTTCACCATCATCTTAGCGCTAGCAGCCGCGGCCAGGGGGTCGCTCTCGTCCAGGGTCTCAAAGCTCCGCTTGCCGTCCTTCTCGGTGATCCGCACCGGGGGGTAGCTGAAGCCCACGGCCGCCAGCTCCTCCTCGGCCTGTCTTTCGTCCTCGCTGTCCTGGCTGACGTCCTGCAGGACCACATGCTTGGTCTTGCGGGGTTTCTTCTTGGGCGGCAGCGGCGGCGGAGATGTTGGAGATGGCGAGGGGGAGCGCGAGTTCTCGCTCACCACTACTATCTCTTCCTCTTCTTGGTCCGAGGCCACGCGGCGGTAGGTATGTCTCTTCGGGGGCAGAGGCGGAGGCGACGGGCTCTCGCCGCCGCGACTTGGCGGATGGCTGGCAGAGCCCCTTCCGCGTTCGGGGGTGCGCTCCCGGCGGCGCTCTGACTGACTTCCTCCGCGGCCGGCCATTGTGTTCTCCTAGGGAGGAACAACAAGCATGGAGACTCAGCCATCGCCAACCTCGCCATCTGCCCCCACCGCCGACGAGAAGCAGCAGCAGCAGAATGAAAGCTTAACCGCCCCGCCGCCCAGCCCCGCCACCTCCGACGCGGCCGTCCCAGACATGCAAGAGATGGAGGAATCCATCGAGATTGACCTGGGCTATGTGACGCCCGCGGAGCACGAGGAGGAGCTGGCAGTGCGCTTTTCACAAGAAGAGATACACCAAGAACAGCCAGAGCAGGAAGCAGAGAATGAGCAGAGTCAGGCTGGGCTCGAGCATGACGGCGACTACCTCCACCTGAGCGGGGGGGAGGACGCGCTCATCAAGCATCTGGCCCGGCAGGCCACCATCGTCAAGGATGCGCTGCTCGACCGCACCGAGGTGCCCCTCAGCGTGGAGGAGCTCAGCCGCGCCTACGAGTTGAACCTCTTCTCGCCGCGCGTGCCCCCCAAGCGCCAGCCCAATGGCACCTGCGAGCCCAACCCGCGCCTCAACTTCTACCCGGTCTTCGCGGTGCCCGAGGCCCTGGCCACCTACCACATCTTTTTCAAGAACCAAAAGATCCCCGTCTCCTGCCGCGCCAACCGCACCCGCGCCGACGCCCTTTTCAACCTGGGTCCCGGCGCCCGCCTACCTGATATCGCCTCCTTGGAAGAGGTTCCCAAGATCTTCGAGGGTCTGGGCAGCGACGAGACTCGGGCCGCGAACGCTCTGCAAGGAGAAGGAGGAGAGCATGAGCACCACAGCGCCCTGGTCGAGTTGGAAGGCGACAACGCGCGGCTGGCGGTGCTCAAACGCACGGTCGAGCTGACCCATTTCGCCTACCCGGCTCTGAACCTGCCCCCCAAAGTCATGAGCGCGGTCATGGACCAGGTGCTCATCAAGCGCGCGTCGCCCATCTCCGAGGACGAGGGCATGCAAGACTCCGAGGAGGGCAAGCCCGTGGTCAGCGACGAGCAGCTGGCCCGGTGGCTGGGTCCTAATGCTAGTCCCCAGAGTTTGGAAGAGCGGCGCAAACTCATGATGGCCGTGGTCCTGGTGACCGTGGAGCTGGAGTGCCTGCGCCGCTTCTTCGCCGACGCGGAGACCCTGCGCAAGGTCGAGGAGAACCTGCACTACCTCTTCAGGCACGGGTTCGTGCGCCAGGCCTGCAAGATCTCCAACGTGGAGCTGACCAACCTGGTCTCCTACATGGGCATCTTGCACGAGAACCGCCTGGGGCAGAACGTGCTGCACACCACCCTGCGCGGGGAGGCCCGGCGCGACTACATCCGCGACTGCGTCTACCTCTACCTCTGCCACACCTGGCAGACGGGCATGGGCGTGTGGCAGCAGTGTCTGGAGGAGCAGAACCTGAAAGAGCTCTGCAAGCTCCTGCAGAAGAACCTCAAGGGTCTGTGGACCGGGTTCGACGAGCGCACCACCGCCTCGGACCTGGCCGACCTCATTTTCCCCGAGCGCCTCAGGCTGACGCTGCGCAACGGCCTGCCCGACTTTATGAGCCAAAGCATGTTGCAAAACTTTCGCTCTTTCATCCTCGAACGCTCCGGAATCCTGCCCGCCACCTGCTCCGCGCTGCCCTCGGACTTCGTGCCGCTGACCTTCCGCGAGTGCCCCCCGCCGCTGTGGAGCCACTGCTACCTGCTGCGCCTGGCCAACTACCTGGCCTACCACTCGGACGTGATCGAGGACGTCAGCGGCGAGGGCCTGCTCGAGTGCCACTGCCGCTGCAACCTCTGCACGCCGCACCGCTCCCTGGCCTGCAACCCCCAGCTGCTGAGCGAGACCCAGATCATCGGCACCTTCGAGTTGCAAGGGCCCAGCGAAGGCGAGGGTTCAGCCGCCAAGGGGGGTCTGAAACTCACCCCGGGGCTGTGGACCTCGGCCTACTTGCGCAAGTTCGTGCCCGAGGACTACCATCCCTTCGAGATCAGGTTCTACGAGGACCAATCCCATCCGCCCAAGGCCGAGCTGTCGGCCTGCGTCATCACCCAGGGGGCGATCCTGGCCCAATTGCAAGCCATCCAGAAATCCCGCCAAGAATTCTTGCTGAAAAAGGGCCGCGGGGTCTACCTCGACCCCCAGACCGGTGAGGAGCTCAACCCCGGCTTCCCCCAGGATGCCCCGAGGAAACAAGAAGCTGAAAGTGGAGCTGCCGCCCGTGGAGGATTTGGAGGAAGACTGGGAGAACAGCAGTCAGGCAGAGGAGGAGGAGATGGAGGAAGACTGGGACAGCACTCAGGCAGAGGAGGACAGCCTGCAAGACAGTCTGGAGGAAGACGAGGAGGAGGCAGAGGAGGAGGTGGAAGAAGCAGCCGCCGCCAGACCGTCGTCCTCGGCGGGGGAGAAAGCAAGCAGCACGGATACCATCTCCGCTCCGGGTCGGGGTCCCGCTCGACCACACAGTAGATGGGACGAGACCGGACGATTCCCGAACCCCACCACCCAGACCGGTAAGAAGGAGCGGCAGGGATACAAGTCCTGGCGGGGGCACAAAAACGCCATCGTCTCCTGCTTGCAGGCCTGCGGGGGCAACATCTCCTTCACCCGGCGCTACCTGCTCTTCCACCGCGGGGTGAACTTTCCCCGCAACATCTTGCATTACTACCGTCACCTCCACAGCCCCTACTACTTCCAAGAAGAGGCAGCAGCAGCAGAAAAAGACCAGCAGAAAACCAGCAGCTAGAAAATCCACAGCGGCGGCAGCAGGTGGACTGAGGATCGCGGCGAACGAGCCGGCGCAAACCCGGGAGCTGAGGAACCGGATCTTTCCCACCCTCTATGCCATCTTCCAGCAGAGTCGGGGGCAGGAGCAGGAACTGAAAGTCAAGAACCGTTCTCTGCGCTCGCTCACCCGCAGTTGTCTGTATCACAAGAGCGAAGACCAACTTCAGCGCACTCTCGAGGACGCCGAGGCTCTCTTCAACAAGTACTGCGCGCTCACTCTTAAAGAGTAGCCCGCGCCCGCCCAGTCGCAGAAAAAGGCGGGAATTACGTCACCTGTGCCCTTCGCCCTAGCCGCCTCCACCCATCATCATGAGCAAAGAGATTCCCACGCCTTACATGTGGAGCTACCAGCCCCAGATGGGCCTGGCCGCCGGTGCCGCCCAGGACTACTCCACCCGCATGAATTGGCTCAGCGCCGGGCCCGCGATGATCTCACGGGTGAATGACATCCGCGCCCACCGAAACCAGATACTCCTAGAACAGTCAGCGCTCACCGCCACGCCCCGCAATCACCTCAATCCGCGTAATTGGCCCGCCGCCCTGGTGTACCAGGAAATTCCCCAGCCCACGACCGTACTACTTCCGCGAGACGCCCAGGCCGAAGTCCAGCTGACTAACTCAGGTGTCCAGCTGGCGGGCGGCGCCACCCTGTGTCGTCACCGCCCCGCTCAGGGTATAAAGCGGCTGGTGATCCGGGGCAGAGGCACACAGCTCAACGACGAGGTGGTGAGCTCTTCGCTGGGTCTGCGACCTGACGGAGTCTTCCAACTCGCCGGATCGGGGAGATCTTCCTTCACGCCTCGTCAGGCCGTCCTGACTTTGGAGAGTTCGTCCTCGCAGCCCCGCTCGGGTGGCATCGGCACTCTCCAGTTCGTGGAGGAGTTCACTCCCTCGGTCTACTTCAACCCCTTCTCCGGCTCCCCCGGCCACTACCCGGACGAGTTCATCCCGAACTTCGACGCCATCAGCGAGTCGGTGGACGGCTACGATTGAAACTAATCACCCCCTTATCCAGTGAAATAAAGATCATATTGATGATGATTTTACAGAAATAAAAAATAATCATTTGATTTGAAATAAAGATACAATCATATTGATGATTTGAGTTTAACAAAAAAATAAAGAATCACTTACTTGAAATCTGATACCAGGTCTCTGTCCATGTTTTCTGCCAACACCACTTCACTCCCCTCTTCCCAGCTCTGGTACTGCAGGCCCCGGCGGGCTGCAAACTTCCTCCACACGCTGAAGGGGATGTCAAATTCCTCCTGTCCCTCAATCTTCATTTTATCTTCTATCAGATGTCCAAAAAGCGCGTCCGGGTGGATGATGACTTCGACCCCGTCTACCCCTACGATGCAGACAACGCACCGACCGTGCCCTTCATCAACCCCCCCTTCGTCTCTTCAGATGGATTCCAAGAGAAGCCCCTGGGGGTGTTGTCCCTGCGACTGGCCGACCCCGTCACCACCAAGAACGGGGAAATCACCCTCAAGCTGGGAGAGGGGGTGGACCTCGATTCCTCGGGAAAACTCATCTCCAACACGGCCACCAAGGCCGCCGCCCCTCTCAGTTTTTCCAACAACACCATTTCCCTTAACATGGATCACCCCTTTTACACTAAAGATGGAAAATTATCCTTACAAGTTTCTCCACCATTAAATATACTGAGAACAAGCATTCTAAACACACTAGCTTTAGGTTTTGGATCAGGTTTAGGACTCCGTGGCTCTGCCTTGGCAGTACAGTTAGTCTCTCCACTTACATTTGATACTGATGGAAACATAAAGCTTACCTTAGACAGAGGTTTGCATGTTACAACAGGAGATGCAATTGAAAGCAACATAAGCTGGGCTAAAGGTTTAAAATTTGAAGATGGAGCCATAGCAACCAACATTGGAAATGGGTTAGAGTTTGGAAGCAGTAGTACAGAAACAGGTGTTGATGATGCTTACCCAATCCAAGTTAAACTTGGATCTGGCCTTAGCTTTGACAGTACAGGAGCCATAATGGCTGGTAACAAAGAAGACGATAAACTCACTTTGTGGACAACACCTGATCCATCACCAAACTGTCAAATACTCGCAGAAAATGATGCAAAACTAACACTTTGCTTGACTAAATGTGGTAGTCAAATACTGGCCACTGTGTCAGTCTTAGTTGTAGGAAGTGGAAACCTAAACCCCATTACTGGCACCGTAAGCAGTGCTCAGGTGTTTCTACGTTTTGATGCAAACGGTGTTCTTTTAACAGAACATTCTACACTAAAAAAATACTGGGGGTATAGGCAGGGAGATAGCATAGATGGCACTCCATATACCAATGCTGTAGGATTCATGCCCAATTTAAAAGCTTATCCAAAGTCACAAAGTTCTACTACTAAAAATAATATAGTAGGGCAAGTATACATGAATGGAGATGTTTCAAAACCTATGCTTCTCACTATAACCCTCAATGGTACTGATGACAGCAACAGTACATATTCAATGTCATTTTCATACACCTGGACTAATGGAAGCTATGTTGGAGCAACATTTGGGGCTAACTCTTATACCTTCTCATACATCGCCCAAGAATGAACACTGTATCCCACCCTGCATGCCAACCCTTCCCACCCCACTCTGTGGAACAAACTCTGAAACACAAAATAAAATAAAGTTCAAGTGTTTTATTGATTCAACAGTTTTACAGGATTCGAGCAGTTATTTTTCCTCCACCCTCCCAGGACATGGAATACACCACCCTCTCCCCCCGCACAGCCTTGAACATCTGAATGCCATTGGTGATGGACATGCTTTTGGTCTCCACGTTCCACACAGTTTCAGAGCGAGCCAGTCTCGGGTCGGTCAGGGAGATGAAACCCTCCGGGCACTCCCGCATCTGCACCTCACAGCTCAACAGCTGAGGATTGTCCTCGGTGGTCGGGATCACGGTTATCTGGAAGAAGCAGAAGAGCGGCGGTGGGAATCATAGTCCGCGAACGGGATCGGCCGGTGGTGTCGCATCAGGCCCCGCAGCAGTCGCTGCCGCCGCCGCTCCGTCAAGCTGCTGCTCAGGGGGTCCGGGTCCAGGGACTCCCTCAGCATGATGCCCACGGCCCTCAGCATCAGTCGTCTGGTGCGGCGGGCGCAGCAGCGCATGCGGATCTCGCTCAGGTCGCTGCAGTACGTGCAACACAGAACCACCAGGTTGTTCAACAGTCCATAGTTCAACACGCTCCAGCCGAAACTCATCGCGGGAAGGATGCTACCCACGTGGCCGTCGTACCAGATCCTCAGGTAAATCAAGTGGTGCCCCCTCCAGAACACGCTGCCCACGTACATGATCTCCTTGGGCATGTGGCGGTTCACCACCTCCCGGTACCACATCACCCTCTGGTTGAACATGCAGCCCCGGATGATCCTGCGGAACCACAGGGCCAGCACCGCCCCGCCCGCCATGCAGCGAAGAGACCCCGGGTCCCGGCAATGGCAATGGAGGACCCACCGCTCGTACCCGTGGATCATCTGGGAGCTGAACAAGTCTATGTTGGCACAGCACAGGCATATGCTCATGCATCTCTTCAGCACTCTCAACTCCTCGGGGGTCAAAACCATATCCCAGGGCACGGGGAACTCTTGCAGGACAGCGAACCCCGCAGAACAGGGCAATCCTCGCACAGAACTTACATTGTGCATGGACAGGGTATCGCAATCAGGCAGCACCGGGTGATCCTCCACCAGAGAAGCGCGGGTCTCGGTCTCCTCACAGCGTGGTAAGGGGGCCGGCCGATACGGGTGATGGCGGGACGCGGCTGATCGTGTTCGCGACCGTGTCATGATGCAGTTGCTTTCGGACATTTTCGTACTTGCTGTAGCAGAACCTGGTCCGGGCGCTGCACACCGATCGCCGGCGGCGGTCTCGGCGCTTGGAACGCTCGGTGTTGAAATTGTAAAACAGCCACTCTCTCAGACCGTGCAGCAGATCTAGGGCCTCAGGAGTGATGAAGATCCCATCATGCCTGATGGCTCTGATCACATCGACCACCGTGGAATGGGCCAGACCCAGCCAGATGATGCAATTTTGTTGGGTTTCGGTGACGGCGAGCCTCGGGAACAACGATGAAGTAAATGCAAGCGGTGCGTTCCAGCATGGTTAGTTAGCTGATCTGTAGAAAAAACAAAAATGAACATTAAACCATGCTAGCCTGGCGAACAGGTGGGTAAATCGTTCTCTCCAGCACCAGGCAGGCCACGGGGTCTCCGGCGCGACCCTCGTAAAAATTGTCGCTATGATTGAAAACCATCACAGAGAGACGTTCCCGGTGGCCGGCGTGAATGATTCGACAAGATGAATACACCCCCGGAACATTGGCGTCCGCGAGTGAAAAAAAGCGCCCGAGGAAGCAATAAGGCACTACAATGCTCAGTCTCAAGTCCAGCAAAGCGATGCCATGCGGATGAAGCACAAAATTCTCAGGTGCGTACAAAATGTAATTACTCCCCTCCTGCACAGGCAGCAAAGCCCCCGATCCCTCCAGGTACACATACAAAGCCTCAGCGTCCATAGCTTACCGAGCAGCAGCACACAACAGGCGCAAGAGTCAGAGAAAGGCTGAGCTCTAACCTGTCCACCCGCTCTCTGCTCAATATATAGCCCAGATCTACACTGACGTAAAGGCCAAAGTCTAAAAATACCCGCCAAATAATCACACACGCCCAGCACACGCCCAGAAACCGGTGACACACTCAAAAAAATACGCGCACTTCCTCAAACGCCCAAAACTGCCGTCATTTCCGGGTTCCCACGCTACGTCATCAAAACACGACTTTCAAATTCCGTCGACCGTTAAAAACGTCACCCGCCCCGCCCCTAACGGTCGCCCGTCTCTCAGCCAATCAGCGCCCCGCATCCCCAAATTCAAACACCTCATTTGCATATTAACGCGCACAAAAAGTTTGAGGTATATTATTGATGATG
XXIII.   TETr 調控卡匣表現系統中之免疫原性
在正常CMV啟動子(ChAdV-MAG)或TETo調控啟動子(TET-ChAdV-MAG)之控制下，用1x1010 VP之表現模型抗原卡匣之ChAdV68疫苗對Balb/c小鼠實施免疫。接種疫苗後12天收集脾臟且製成單細胞懸浮液。使用ICS量測CD8 T細胞中之抗原特異性IFN-γ產生。如圖48及表43所示，當用自TETo調控啟動子表現之抗原卡匣對小鼠實施免疫時，活體內功效相同或更好。因此，受調控之ChAd載體在活體內誘發對疫苗靶標之CD8+免疫反應方面同樣有效，且可能更有效。
如上文更詳細描述，亦用ChAdV68.5WTnt.MAG25mer (「ChAdV68-CMV-MAG」；SEQ ID NO:2)或ChAdV68-E4d-CMT-MAG (SEQ ID NO:64)對恆河猴實施免疫，各組亦投與抗CTLA4抗體(伊匹單抗)。在用6種不同恆河猴Mamu-A*01 I類抗原決定基刺激後，藉由ELISpot分析T細胞反應之IFN-γ產生。如圖 42B 及圖 42C 所示，且在表 41B (ChAdV68-CMV-MAG)及表 41C (ChAdV68-E4d-CMT-MAG)中進行定量，用以在E4缺失之載體背景中之「CMT」反應區為特徵之構築體進行免疫展現至少等效之免疫反應，在CMT-E4缺失載體中反應增加有積極趨勢。表 43 - ChAdV68-MAG 及 ChAdV68-Teto-MAG 免疫小鼠中之 %CD8+ 反應
ChAdV68-MAG 1e10 VP 小鼠# %CD8+ ChAdV68-TETo-MAG 1e10 VP 小鼠# %CD8+
1 9.35 1 17.58
2 9.31 2 16.88
3 17.60 3 18.93
4 10.08 4 9.59
5 6.06 5 24
6 8.15 6 16.28
7 10.08 7 18.92
8 9.87 8 22.24
中值 9.61 中值 18.25
XXIV. 患者群體之選擇
一或多種抗原用於使用本文描述之經修飾之腺病毒、諸如E4修飾之腺病毒來調配疫苗組合物。將疫苗投與至患者，例如以治療癌症。在某些情況下，例如使用伴隨診斷或常用之癌症基因組NGS分析來選擇患者，諸如FoundationOne、FoundationOne CDx、Guardant 360、Guardant OMNI或MSK IMPACT。示例性之患者選擇準則如下所述。患者選擇
藉由考慮腫瘤基因表現、體細胞突變狀態及患者HLA類型來進行共有新抗原疫苗接種之患者選擇。具體言之，若滿足以下條件，則患者視為符合疫苗療法： (a)           患者攜帶預測或已知呈現疫苗中包含之抗原決定基之HLA對偶基因，且患者腫瘤表現具有抗原決定基序列之基因，或 (b)          患者攜帶預測或已知呈現疫苗中包含之抗原決定基之HLA對偶基因，且患者腫瘤攜帶引起抗原決定基序列之突變，或 (c)           與(b)相同，但亦要求患者腫瘤表現具有高於特定臨限值(例如1 TPM或10 TPM)之突變之基因，或 (d)          與(b)相同，但亦要求患者腫瘤表現高於特定臨限值之突變(例如，在RNA水準下觀察到至少1個突變讀數) (e)           與(b)相同，但亦要求(c)及(d)中之附加準則 (f)           以上任何一項，但亦視情況要求在腫瘤中未偵測到呈現HLA對偶基因之喪失
藉由任何已建立之方法(包括RNASeq、微陣列、PCR、Nanostring、ISH、質譜或IHC)在RNA或蛋白質層面上量測基因表現。基因表現陽性之臨限值藉由幾種方法確定，包括：(1) HLA對偶基因在各種基因表現水準下預測抗原決定基呈現之機率，(2)如藉由質譜法量測之基因表現與HLA抗原決定基呈現之相關性，及/或(3)以不同水準表現基因之患者獲得疫苗接種之臨床益處。進一步擴大患者選擇範圍，以要求大於1個抗原決定基之陽性，例如，疫苗中包含至少2個、3個、4個或5個抗原決定基。
體細胞突變狀態可藉由任何已建立之方法進行評估，包括外顯子組定序(NGS DNASeq)、靶向外顯子組定序(基因組)、轉錄組定序(RNASeq)、Sanger定序、基於PCR之基因分型分析(例如Taqman或液滴數位PCR)、基於質譜之方法(例如，藉由Sequenom)，或熟習此項技術者已知之任何其他方法。
使用所描述之任何方法，例如藉由質譜法，鑑別另外之新共有新抗原。將該等新近鑑別之共有新抗原併入本文所述之疫苗卡匣中。
先前已驗證之新抗原另外驗證為由其他HLA對偶基因呈現，且告知針對疫苗卡匣之新抗原選擇及/或擴大潛在之可治療群體。
包含新型新抗原能夠擴大可定址之腫瘤類型(例如EGFR突變之NSCLC)或包含具有新腫瘤類型之患者。某些序列
本文所提及之載體、卡匣及抗體在下文描述且藉由SEQ ID NO提及。
全長ChAdVC68序列「ChAdV68.5WTnt」(SEQ ID NO:1)；具有在五個位置經取代之相應ATCC VR-594核苷酸之AC_000011.1序列；在位置6之W = A或T
CCATCWTCAATAATATACCTCAAACTTTTTGTGCGCGTTAATATGCAAATGAGGCGTTTGAATTTGGGGAGGAAGGGCGGTGATTGGTCGAGGGATGAGCGACCGTTAGGGGCGGGGCGAGTGACGTTTTGATGACGTGGTTGCGAGGAGGAGCCAGTTTGCAAGTTCTCGTGGGAAAAGTGACGTCAAACGAGGTGTGGTTTGAACACGGAAATACTCAATTTTCCCGCGCTCTCTGACAGGAAATGAGGTGTTTCTGGGCGGATGCAAGTGAAAACGGGCCATTTTCGCGCGAAAACTGAATGAGGAAGTGAAAATCTGAGTAATTTCGCGTTTATGGCAGGGAGGAGTATTTGCCGAGGGCCGAGTAGACTTTGACCGATTACGTGGGGGTTTCGATTACCGTGTTTTTCACCTAAATTTCCGCGTACGGTGTCAAAGTCCGGTGTTTTTACGTAGGTGTCAGCTGATCGCCAGGGTATTTAAACCTGCGCTCTCCAGTCAAGAGGCCACTCTTGAGTGCCAGCGAGAAGAGTTTTCTCCTCCGCGCCGCGAGTCAGATCTACACTTTGAAAGATGAGGCACCTGAGAGACCTGCCCGATGAGAAAATCATCATCGCTTCCGGGAACGAGATTCTGGAACTGGTGGTAAATGCCATGATGGGCGACGACCCTCCGGAGCCCCCCACCCCATTTGAGACACCTTCGCTGCACGATTTGTATGATCTGGAGGTGGATGTGCCCGAGGACGATCCCAATGAGGAGGCGGTAAATGATTTTTTTAGCGATGCCGCGCTGCTAGCTGCCGAGGAGGCTTCGAGCTCTAGCTCAGACAGCGACTCTTCACTGCATACCCCTAGACCCGGCAGAGGTGAGAAAAAGATCCCCGAGCTTAAAGGGGAAGAGATGGACTTGCGCTGCTATGAGGAATGCTTGCCCCCGAGCGATGATGAGGACGAGCAGGCGATCCAGAACGCAGCGAGCCAGGGAGTGCAAGCCGCCAGCGAGAGCTTTGCGCTGGACTGCCCGCCTCTGCCCGGACACGGCTGTAAGTCTTGTGAATTTCATCGCATGAATACTGGAGATAAAGCTGTGTTGTGTGCACTTTGCTATATGAGAGCTTACAACCATTGTGTTTACAGTAAGTGTGATTAAGTTGAACTTTAGAGGGAGGCAGAGAGCAGGGTGACTGGGCGATGACTGGTTTATTTATGTATATATGTTCTTTATATAGGTCCCGTCTCTGACGCAGATGATGAGACCCCCACTACAAAGTCCACTTCGTCACCCCCAGAAATTGGCACATCTCCACCTGAGAATATTGTTAGACCAGTTCCTGTTAGAGCCACTGGGAGGAGAGCAGCTGTGGAATGTTTGGATGACTTGCTACAGGGTGGGGTTGAACCTTTGGACTTGTGTACCCGGAAACGCCCCAGGCACTAAGTGCCACACATGTGTGTTTACTTGAGGTGATGTCAGTATTTATAGGGTGTGGAGTGCAATAAAAAATGTGTTGACTTTAAGTGCGTGGTTTATGACTCAGGGGTGGGGACTGTGAGTATATAAGCAGGTGCAGACCTGTGTGGTTAGCTCAGAGCGGCATGGAGATTTGGACGGTCTTGGAAGACTTTCACAAGACTAGACAGCTGCTAGAGAACGCCTCGAACGGAGTCTCTTACCTGTGGAGATTCTGCTTCGGTGGCGACCTAGCTAGGCTAGTCTACAGGGCCAAACAGGATTATAGTGAACAATTTGAGGTTATTTTGAGAGAGTGTTCTGGTCTTTTTGACGCTCTTAACTTGGGCCATCAGTCTCACTTTAACCAGAGGATTTCGAGAGCCCTTGATTTTACTACTCCTGGCAGAACCACTGCAGCAGTAGCCTTTTTTGCTTTTATTCTTGACAAATGGAGTCAAGAAACCCATTTCAGCAGGGATTACCAGCTGGATTTCTTAGCAGTAGCTTTGTGGAGAACATGGAAGTGCCAGCGCCTGAATGCAATCTCCGGCTACTTGCCGGTACAGCCGCTAGACACTCTGAGGATCCTGAATCTCCAGGAGAGTCCCAGGGCACGCCAACGTCGCCAGCAGCAGCAGCAGGAGGAGGATCAAGAAGAGAACCCGAGAGCCGGCCTGGACCCTCCGGCGGAGGAGGAGGAGTAGCTGACCTGTTTCCTGAACTGCGCCGGGTGCTGACTAGGTCTTCGAGTGGTCGGGAGAGGGGGATTAAGCGGGAGAGGCATGATGAGACTAATCACAGAACTGAACTGACTGTGGGTCTGATGAGTCGCAAGCGCCCAGAAACAGTGTGGTGGCATGAGGTGCAGTCGACTGGCACAGATGAGGTGTCGGTGATGCATGAGAGGTTTTCTCTAGAACAAGTCAAGACTTGTTGGTTAGAGCCTGAGGATGATTGGGAGGTAGCCATCAGGAATTATGCCAAGCTGGCTCTGAGGCCAGACAAGAAGTACAAGATTACTAAGCTGATAAATATCAGAAATGCCTGCTACATCTCAGGGAATGGGGCTGAAGTGGAGATCTGTCTCCAGGAAAGGGTGGCTTTCAGATGCTGCATGATGAATATGTACCCGGGAGTGGTGGGCATGGATGGGGTTACCTTTATGAACATGAGGTTCAGGGGAGATGGGTATAATGGCACGGTCTTTATGGCCAATACCAAGCTGACAGTCCATGGCTGCTCCTTCTTTGGGTTTAATAACACCTGCATCGAGGCCTGGGGTCAGGTCGGTGTGAGGGGCTGCAGTTTTTCAGCCAACTGGATGGGGGTCGTGGGCAGGACCAAGAGTATGCTGTCCGTGAAGAAATGCTTGTTTGAGAGGTGCCACCTGGGGGTGATGAGCGAGGGCGAAGCCAGAATCCGCCACTGCGCCTCTACCGAGACGGGCTGCTTTGTGCTGTGCAAGGGCAATGCTAAGATCAAGCATAATATGATCTGTGGAGCCTCGGACGAGCGCGGCTACCAGATGCTGACCTGCGCCGGCGGGAACAGCCATATGCTGGCCACCGTACATGTGGCTTCCCATGCTCGCAAGCCCTGGCCCGAGTTCGAGCACAATGTCATGACCAGGTGCAATATGCATCTGGGGTCCCGCCGAGGCATGTTCATGCCCTACCAGTGCAACCTGAATTATGTGAAGGTGCTGCTGGAGCCCGATGCCATGTCCAGAGTGAGCCTGACGGGGGTGTTTGACATGAATGTGGAGGTGTGGAAGATTCTGAGATATGATGAATCCAAGACCAGGTGCCGAGCCTGCGAGTGCGGAGGGAAGCATGCCAGGTTCCAGCCCGTGTGTGTGGATGTGACGGAGGACCTGCGACCCGATCATTTGGTGTTGCCCTGCACCGGGACGGAGTTCGGTTCCAGCGGGGAAGAATCTGACTAGAGTGAGTAGTGTTCTGGGGCGGGGGAGGACCTGCATGAGGGCCAGAATAACTGAAATCTGTGCTTTTCTGTGTGTTGCAGCAGCATGAGCGGAAGCGGCTCCTTTGAGGGAGGGGTATTCAGCCCTTATCTGACGGGGCGTCTCCCCTCCTGGGCGGGAGTGCGTCAGAATGTGATGGGATCCACGGTGGACGGCCGGCCCGTGCAGCCCGCGAACTCTTCAACCCTGACCTATGCAACCCTGAGCTCTTCGTCGTTGGACGCAGCTGCCGCCGCAGCTGCTGCATCTGCCGCCAGCGCCGTGCGCGGAATGGCCATGGGCGCCGGCTACTACGGCACTCTGGTGGCCAACTCGAGTTCCACCAATAATCCCGCCAGCCTGAACGAGGAGAAGCTGTTGCTGCTGATGGCCCAGCTCGAGGCCTTGACCCAGCGCCTGGGCGAGCTGACCCAGCAGGTGGCTCAGCTGCAGGAGCAGACGCGGGCCGCGGTTGCCACGGTGAAATCCAAATAAAAAATGAATCAATAAATAAACGGAGACGGTTGTTGATTTTAACACAGAGTCTGAATCTTTATTTGATTTTTCGCGCGCGGTAGGCCCTGGACCACCGGTCTCGATCATTGAGCACCCGGTGGATCTTTTCCAGGACCCGGTAGAGGTGGGCTTGGATGTTGAGGTACATGGGCATGAGCCCGTCCCGGGGGTGGAGGTAGCTCCATTGCAGGGCCTCGTGCTCGGGGGTGGTGTTGTAAATCACCCAGTCATAGCAGGGGCGCAGGGCATGGTGTTGCACAATATCTTTGAGGAGGAGACTGATGGCCACGGGCAGCCCTTTGGTGTAGGTGTTTACAAATCTGTTGAGCTGGGAGGGATGCATGCGGGGGGAGATGAGGTGCATCTTGGCCTGGATCTTGAGATTGGCGATGTTACCGCCCAGATCCCGCCTGGGGTTCATGTTGTGCAGGACCACCAGCACGGTGTATCCGGTGCACTTGGGGAATTTATCATGCAACTTGGAAGGGAAGGCGTGAAAGAATTTGGCGACGCCTTTGTGCCCGCCCAGGTTTTCCATGCACTCATCCATGATGATGGCGATGGGCCCGTGGGCGGCGGCCTGGGCAAAGACGTTTCGGGGGTCGGACACATCATAGTTGTGGTCCTGGGTGAGGTCATCATAGGCCATTTTAATGAATTTGGGGCGGAGGGTGCCGGACTGGGGGACAAAGGTACCCTCGATCCCGGGGGCGTAGTTCCCCTCACAGATCTGCATCTCCCAGGCTTTGAGCTCGGAGGGGGGGATCATGTCCACCTGCGGGGCGATAAAGAACACGGTTTCCGGGGCGGGGGAGATGAGCTGGGCCGAAAGCAAGTTCCGGAGCAGCTGGGACTTGCCGCAGCCGGTGGGGCCGTAGATGACCCCGATGACCGGCTGCAGGTGGTAGTTGAGGGAGAGACAGCTGCCGTCCTCCCGGAGGAGGGGGGCCACCTCGTTCATCATCTCGCGCACGTGCATGTTCTCGCGCACCAGTTCCGCCAGGAGGCGCTCTCCCCCCAGGGATAGGAGCTCCTGGAGCGAGGCGAAGTTTTTCAGCGGCTTGAGTCCGTCGGCCATGGGCATTTTGGAGAGGGTTTGTTGCAAGAGTTCCAGGCGGTCCCAGAGCTCGGTGATGTGCTCTACGGCATCTCGATCCAGCAGACCTCCTCGTTTCGCGGGTTGGGACGGCTGCGGGAGTAGGGCACCAGACGATGGGCGTCCAGCGCAGCCAGGGTCCGGTCCTTCCAGGGTCGCAGCGTCCGCGTCAGGGTGGTCTCCGTCACGGTGAAGGGGTGCGCGCCGGGCTGGGCGCTTGCGAGGGTGCGCTTCAGGCTCATCCGGCTGGTCGAAAACCGCTCCCGATCGGCGCCCTGCGCGTCGGCCAGGTAGCAATTGACCATGAGTTCGTAGTTGAGCGCCTCGGCCGCGTGGCCTTTGGCGCGGAGCTTACCTTTGGAAGTCTGCCCGCAGGCGGGACAGAGGAGGGACTTGAGGGCGTAGAGCTTGGGGGCGAGGAAGACGGACTCGGGGGCGTAGGCGTCCGCGCCGCAGTGGGCGCAGACGGTCTCGCACTCCACGAGCCAGGTGAGGTCGGGCTGGTCGGGGTCAAAAACCAGTTTCCCGCCGTTCTTTTTGATGCGTTTCTTACCTTTGGTCTCCATGAGCTCGTGTCCCCGCTGGGTGACAAAGAGGCTGTCCGTGTCCCCGTAGACCGACTTTATGGGCCGGTCCTCGAGCGGTGTGCCGCGGTCCTCCTCGTAGAGGAACCCCGCCCACTCCGAGACGAAAGCCCGGGTCCAGGCCAGCACGAAGGAGGCCACGTGGGACGGGTAGCGGTCGTTGTCCACCAGCGGGTCCACCTTTTCCAGGGTATGCAAACACATGTCCCCCTCGTCCACATCCAGGAAGGTGATTGGCTTGTAAGTGTAGGCCACGTGACCGGGGGTCCCGGCCGGGGGGGTATAAAAGGGTGCGGGTCCCTGCTCGTCCTCACTGTCTTCCGGATCGCTGTCCAGGAGCGCCAGCTGTTGGGGTAGGTATTCCCTCTCGAAGGCGGGCATGACCTCGGCACTCAGGTTGTCAGTTTCTAGAAACGAGGAGGATTTGATATTGACGGTGCCGGCGGAGATGCCTTTCAAGAGCCCCTCGTCCATCTGGTCAGAAAAGACGATCTTTTTGTTGTCGAGCTTGGTGGCGAAGGAGCCGTAGAGGGCGTTGGAGAGGAGCTTGGCGATGGAGCGCATGGTCTGGTTTTTTTCCTTGTCGGCGCGCTCCTTGGCGGCGATGTTGAGCTGCACGTACTCGCGCGCCACGCACTTCCATTCGGGGAAGACGGTGGTCAGCTCGTCGGGCACGATTCTGACCTGCCAGCCCCGATTATGCAGGGTGATGAGGTCCACACTGGTGGCCACCTCGCCGCGCAGGGGCTCATTAGTCCAGCAGAGGCGTCCGCCCTTGCGCGAGCAGAAGGGGGGCAGGGGGTCCAGCATGACCTCGTCGGGGGGGTCGGCATCGATGGTGAAGATGCCGGGCAGGAGGTCGGGGTCAAAGTAGCTGATGGAAGTGGCCAGATCGTCCAGGGCAGCTTGCCATTCGCGCACGGCCAGCGCGCGCTCGTAGGGACTGAGGGGCGTGCCCCAGGGCATGGGATGGGTAAGCGCGGAGGCGTACATGCCGCAGATGTCGTAGACGTAGAGGGGCTCCTCGAGGATGCCGATGTAGGTGGGGTAGCAGCGCCCCCCGCGGATGCTGGCGCGCACGTAGTCATACAGCTCGTGCGAGGGGGCGAGGAGCCCCGGGCCCAGGTTGGTGCGACTGGGCTTTTCGGCGCGGTAGACGATCTGGCGGAAAATGGCATGCGAGTTGGAGGAGATGGTGGGCCTTTGGAAGATGTTGAAGTGGGCGTGGGGCAGTCCGACCGAGTCGCGGATGAAGTGGGCGTAGGAGTCTTGCAGCTTGGCGACGAGCTCGGCGGTGACTAGGACGTCCAGAGCGCAGTAGTCGAGGGTCTCCTGGATGATGTCATACTTGAGCTGTCCCTTTTGTTTCCACAGCTCGCGGTTGAGAAGGAACTCTTCGCGGTCCTTCCAGTACTCTTCGAGGGGGAACCCGTCCTGATCTGCACGGTAAGAGCCTAGCATGTAGAACTGGTTGACGGCCTTGTAGGCGCAGCAGCCCTTCTCCACGGGGAGGGCGTAGGCCTGGGCGGCCTTGCGCAGGGAGGTGTGCGTGAGGGCGAAAGTGTCCCTGACCATGACCTTGAGGAACTGGTGCTTGAAGTCGATATCGTCGCAGCCCCCCTGCTCCCAGAGCTGGAAGTCCGTGCGCTTCTTGTAGGCGGGGTTGGGCAAAGCGAAAGTAACATCGTTGAAGAGGATCTTGCCCGCGCGGGGCATAAAGTTGCGAGTGATGCGGAAAGGTTGGGGCACCTCGGCCCGGTTGTTGATGACCTGGGCGGCGAGCACGATCTCGTCGAAGCCGTTGATGTTGTGGCCCACGATGTAGAGTTCCACGAATCGCGGACGGCCCTTGACGTGGGGCAGTTTCTTGAGCTCCTCGTAGGTGAGCTCGTCGGGGTCGCTGAGCCCGTGCTGCTCGAGCGCCCAGTCGGCGAGATGGGGGTTGGCGCGGAGGAAGGAAGTCCAGAGATCCACGGCCAGGGCGGTTTGCAGACGGTCCCGGTACTGACGGAACTGCTGCCCGACGGCCATTTTTTCGGGGGTGACGCAGTAGAAGGTGCGGGGGTCCCCGTGCCAGCGATCCCATTTGAGCTGGAGGGCGAGATCGAGGGCGAGCTCGACGAGCCGGTCGTCCCCGGAGAGTTTCATGACCAGCATGAAGGGGACGAGCTGCTTGCCGAAGGACCCCATCCAGGTGTAGGTTTCCACATCGTAGGTGAGGAAGAGCCTTTCGGTGCGAGGATGCGAGCCGATGGGGAAGAACTGGATCTCCTGCCACCAATTGGAGGAATGGCTGTTGATGTGATGGAAGTAGAAATGCCGACGGCGCGCCGAACACTCGTGCTTGTGTTTATACAAGCGGCCACAGTGCTCGCAACGCTGCACGGGATGCACGTGCTGCACGAGCTGTACCTGAGTTCCTTTGACGAGGAATTTCAGTGGGAAGTGGAGTCGTGGCGCCTGCATCTCGTGCTGTACTACGTCGTGGTGGTCGGCCTGGCCCTCTTCTGCCTCGATGGTGGTCATGCTGACGAGCCCGCGCGGGAGGCAGGTCCAGACCTCGGCGCGAGCGGGTCGGAGAGCGAGGACGAGGGCGCGCAGGCCGGAGCTGTCCAGGGTCCTGAGACGCTGCGGAGTCAGGTCAGTGGGCAGCGGCGGCGCGCGGTTGACTTGCAGGAGTTTTTCCAGGGCGCGCGGGAGGTCCAGATGGTACTTGATCTCCACCGCGCCATTGGTGGCGACGTCGATGGCTTGCAGGGTCCCGTGCCCCTGGGGTGTGACCACCGTCCCCCGTTTCTTCTTGGGCGGCTGGGGCGACGGGGGCGGTGCCTCTTCCATGGTTAGAAGCGGCGGCGAGGACGCGCGCCGGGCGGCAGGGGCGGCTCGGGGCCCGGAGGCAGGGGCGGCAGGGGCACGTCGGCGCCGCGCGCGGGTAGGTTCTGGTACTGCGCCCGGAGAAGACTGGCGTGAGCGACGACGCGACGGTTGACGTCCTGGATCTGACGCCTCTGGGTGAAGGCCACGGGACCCGTGAGTTTGAACCTGAAAGAGAGTTCGACAGAATCAATCTCGGTATCGTTGACGGCGGCCTGCCGCAGGATCTCTTGCACGTCGCCCGAGTTGTCCTGGTAGGCGATCTCGGTCATGAACTGCTCGATCTCCTCCTCTTGAAGGTCTCCGCGGCCGGCGCGCTCCACGGTGGCCGCGAGGTCGTTGGAGATGCGGCCCATGAGCTGCGAGAAGGCGTTCATGCCCGCCTCGTTCCAGACGCGGCTGTAGACCACGACGCCCTCGGGATCGCgGGCGCGCATGACCACCTGGGCGAGGTTGAGCTCCACGTGGCGCGTGAAGACCGCGTAGTTGCAGAGGCGCTGGTAGAGGTAGTTGAGCGTGGTGGCGATGTGCTCGGTGACGAAGAAATACATGATCCAGCGGCGGAGCGGCATCTCGCTGACGTCGCCCAGCGCCTCCAAACGTTCCATGGCCTCGTAAAAGTCCACGGCGAAGTTGAAAAACTGGGAGTTGCGCGCCGAGACGGTCAACTCCTCCTCCAGAAGACGGATGAGCTCGGCGATGGTGGCGCGCACCTCGCGCTCGAAGGCCCCCGGGAGTTCCTCCACTTCCTCTTCTTCCTCCTCCACTAACATCTCTTCTACTTCCTCCTCAGGCGGCAGTGGTGGCGGGGGAGGGGGCCTGCGTCGCCGGCGGCGCACGGGCAGACGGTCGATGAAGCGCTCGATGGTCTCGCCGCGCCGGCGTCGCATGGTCTCGGTGACGGCGCGCCCGTCCTCGCGGGGCCGCAGCGTGAAGACGCCGCCGCGCATCTCCAGGTGGCCGGGGGGGTCCCCGTTGGGCAGGGAGAGGGCGCTGACGATGCATCTTATCAATTGCCCCGTAGGGACTCCGCGCAAGGACCTGAGCGTCTCGAGATCCACGGGATCTGAAAACCGCTGAACGAAGGCTTCGAGCCAGTCGCAGTCGCAAGGTAGGCTGAGCACGGTTTCTTCTGGCGGGTCATGTTGGTTGGGAGCGGGGCGGGCGATGCTGCTGGTGATGAAGTTGAAATAGGCGGTTCTGAGACGGCGGATGGTGGCGAGGAGCACCAGGTCTTTGGGCCCGGCTTGCTGGATGCGCAGACGGTCGGCCATGCCCCAGGCGTGGTCCTGACACCTGGCCAGGTCCTTGTAGTAGTCCTGCATGAGCCGCTCCACGGGCACCTCCTCCTCGCCCGCGCGGCCGTGCATGCGCGTGAGCCCGAAGCCGCGCTGGGGCTGGACGAGCGCCAGGTCGGCGACGACGCGCTCGGCGAGGATGGCTTGCTGGATCTGGGTGAGGGTGGTCTGGAAGTCATCAAAGTCGACGAAGCGGTGGTAGGCTCCGGTGTTGATGGTGTAGGAGCAGTTGGCCATGACGGACCAGTTGACGGTCTGGTGGCCCGGACGCACGAGCTCGTGGTACTTGAGGCGCGAGTAGGCGCGCGTGTCGAAGATGTAGTCGTTGCAGGTGCGCACCAGGTACTGGTAGCCGATGAGGAAGTGCGGCGGCGGCTGGCGGTAGAGCGGCCATCGCTCGGTGGCGGGGGCGCCGGGCGCGAGGTCCTCGAGCATGGTGCGGTGGTAGCCGTAGATGTACCTGGACATCCAGGTGATGCCGGCGGCGGTGGTGGAGGCGCGCGGGAACTCGCGGACGCGGTTCCAGATGTTGCGCAGCGGCAGGAAGTAGTTCATGGTGGGCACGGTCTGGCCCGTGAGGCGCGCGCAGTCGTGGATGCTCTATACGGGCAAAAACGAAAGCGGTCAGCGGCTCGACTCCGTGGCCTGGAGGCTAAGCGAACGGGTTGGGCTGCGCGTGTACCCCGGTTCGAATCTCGAATCAGGCTGGAGCCGCAGCTAACGTGGTATTGGCACTCCCGTCTCGACCCAAGCCTGCACCAACCCTCCAGGATACGGAGGCGGGTCGTTTTGCAACTTTTTTTTGGAGGCCGGATGAGACTAGTAAGCGCGGAAAGCGGCCGACCGCGATGGCTCGCTGCCGTAGTCTGGAGAAGAATCGCCAGGGTTGCGTTGCGGTGTGCCCCGGTTCGAGGCCGGCCGGATTCCGCGGCTAACGAGGGCGTGGCTGCCCCGTCGTTTCCAAGACCCCATAGCCAGCCGACTTCTCCAGTTACGGAGCGAGCCCCTCTTTTGTTTTGTTTGTTTTTGCCAGATGCATCCCGTACTGCGGCAGATGCGCCCCCACCACCCTCCACCGCAACAACAGCCCCCTCCACAGCCGGCGCTTCTGCCCCCGCCCCAGCAGCAACTTCCAGCCACGACCGCCGCGGCCGCCGTGAGCGGGGCTGGACAGAGTTATGATCACCAGCTGGCCTTGGAAGAGGGCGAGGGGCTGGCGCGCCTGGGGGCGTCGTCGCCGGAGCGGCACCCGCGCGTGCAGATGAAAAGGGACGCTCGCGAGGCCTACGTGCCCAAGCAGAACCTGTTCAGAGACAGGAGCGGCGAGGAGCCCGAGGAGATGCGCGCGGCCCGGTTCCACGCGGGGCGGGAGCTGCGGCGCGGCCTGGACCGAAAGAGGGTGCTGAGGGACGAGGATTTCGAGGCGGACGAGCTGACGGGGATCAGCCCCGCGCGCGCGCACGTGGCCGCGGCCAACCTGGTCACGGCGTACGAGCAGACCGTGAAGGAGGAGAGCAACTTCCAAAAATCCTTCAACAACCACGTGCGCACCCTGATCGCGCGCGAGGAGGTGACCCTGGGCCTGATGCACCTGTGGGACCTGCTGGAGGCCATCGTGCAGAACCCCACCAGCAAGCCGCTGACGGCGCAGCTGTTCCTGGTGGTGCAGCATAGTCGGGACAACGAAGCGTTCAGGGAGGCGCTGCTGAATATCACCGAGCCCGAGGGCCGCTGGCTCCTGGACCTGGTGAACATTCTGCAGAGCATCGTGGTGCAGGAGCGCGGGCTGCCGCTGTCCGAGAAGCTGGCGGCCATCAACTTCTCGGTGCTGAGTTTGGGCAAGTACTACGCTAGGAAGATCTACAAGACCCCGTACGTGCCCATAGACAAGGAGGTGAAGATCGACGGGTTTTACATGCGCATGACCCTGAAAGTGCTGACCCTGAGCGACGATCTGGGGGTGTACCGCAACGACAGGATGCACCGTGCGGTGAGCGCCAGCAGGCGGCGCGAGCTGAGCGACCAGGAGCTGATGCATAGTCTGCAGCGGGCCCTGACCGGGGCCGGGACCGAGGGGGAGAGCTACTTTGACATGGGCGCGGACCTGCACTGGCAGCCCAGCCGCCGGGCCTTGGAGGCGGCGGCAGGACCCTACGTAGAAGAGGTGGACGATGAGGTGGACGAGGAGGGCGAGTACCTGGAAGACTGATGGCGCGACCGTATTTTTGCTAGATGCAACAACAACAGCCACCTCCTGATCCCGCGATGCGGGCGGCGCTGCAGAGCCAGCCGTCCGGCATTAACTCCTCGGACGATTGGACCCAGGCCATGCAACGCATCATGGCGCTGACGACCCGCAACCCCGAAGCCTTTAGACAGCAGCCCCAGGCCAACCGGCTCTCGGCCATCCTGGAGGCCGTGGTGCCCTCGCGCTCCAACCCCACGCACGAGAAGGTCCTGGCCATCGTGAACGCGCTGGTGGAGAACAAGGCCATCCGCGGCGACGAGGCCGGCCTGGTGTACAACGCGCTGCTGGAGCGCGTGGCCCGCTACAACAGCACCAACGTGCAGACCAACCTGGACCGCATGGTGACCGACGTGCGCGAGGCCGTGGCCCAGCGCGAGCGGTTCCACCGCGAGTCCAACCTGGGATCCATGGTGGCGCTGAACGCCTTCCTCAGCACCCAGCCCGCCAACGTGCCCCGGGGCCAGGAGGACTACACCAACTTCATCAGCGCCCTGCGCCTGATGGTGACCGAGGTGCCCCAGAGCGAGGTGTACCAGTCCGGGCCGGACTACTTCTTCCAGACCAGTCGCCAGGGCTTGCAGACCGTGAACCTGAGCCAGGCTTTCAAGAACTTGCAGGGCCTGTGGGGCGTGCAGGCCCCGGTCGGGGACCGCGCGACGGTGTCGAGCCTGCTGACGCCGAACTCGCGCCTGCTGCTGCTGCTGGTGGCCCCCTTCACGGACAGCGGCAGCATCAACCGCAACTCGTACCTGGGCTACCTGATTAACCTGTACCGCGAGGCCATCGGCCAGGCGCACGTGGACGAGCAGACCTACCAGGAGATCACCCACGTGAGCCGCGCCCTGGGCCAGGACGACCCGGGCAACCTGGAAGCCACCCTGAACTTTTTGCTGACCAACCGGTCGCAGAAGATCCCGCCCCAGTACGCGCTCAGCACCGAGGAGGAGCGCATCCTGCGTTACGTGCAGCAGAGCGTGGGCCTGTTCCTGATGCAGGAGGGGGCCACCCCCAGCGCCGCGCTCGACATGACCGCGCGCAACATGGAGCCCAGCATGTACGCCAGCAACCGCCCGTTCATCAATAAACTGATGGACTACTTGCATCGGGCGGCCGCCATGAACTCTGACTATTTCACCAACGCCATCCTGAATCCCCACTGGCTCCCGCCGCCGGGGTTCTACACGGGCGAGTACGACATGCCCGACCCCAATGACGGGTTCCTGTGGGACGATGTGGACAGCAGCGTGTTCTCCCCCCGACCGGGTGCTAACGAGCGCCCCTTGTGGAAGAAGGAAGGCAGCGACCGACGCCCGTCCTCGGCGCTGTCCGGCCGCGAGGGTGCTGCCGCGGCGGTGCCCGAGGCCGCCAGTCCTTTCCCGAGCTTGCCCTTCTCGCTGAACAGTATCCGCAGCAGCGAGCTGGGCAGGATCACGCGCCCGCGCTTGCTGGGCGAAGAGGAGTACTTGAATGACTCGCTGTTGAGACCCGAGCGGGAGAAGAACTTCCCCAATAACGGGATAGAAAGCCTGGTGGACAAGATGAGCCGCTGGAAGACGTATGCGCAGGAGCACAGGGACGATCCCCGGGCGTCGCAGGGGGCCACGAGCCGGGGCAGCGCCGCCCGTAAACGCCGGTGGCACGACAGGCAGCGGGGACAGATGTGGGACGATGAGGACTCCGCCGACGACAGCAGCGTGTTGGACTTGGGTGGGAGTGGTAACCCGTTCGCTCACCTGCGCCCCCGTATCGGGCGCATGATGTAAGAGAAACCGAAAATAAATGATACTCACCAAGGCCATGGCGACCAGCGTGCGTTCGTTTCTTCTCTGTTGTTGTTGTATCTAGTATGATGAGGCGTGCGTACCCGGAGGGTCCTCCTCCCTCGTACGAGAGCGTGATGCAGCAGGCGATGGCGGCGGCGGCGATGCAGCCCCCGCTGGAGGCTCCTTACGTGCCCCCGCGGTACCTGGCGCCTACGGAGGGGCGGAACAGCATTCGTTACTCGGAGCTGGCACCCTTGTACGATACCACCCGGTTGTACCTGGTGGACAACAAGTCGGCGGACATCGCCTCGCTGAACTACCAGAACGACCACAGCAACTTCCTGACCACCGTGGTGCAGAACAATGACTTCACCCCCACGGAGGCCAGCACCCAGACCATCAACTTTGACGAGCGCTCGCGGTGGGGCGGCCAGCTGAAAACCATCATGCACACCAACATGCCCAACGTGAACGAGTTCATGTACAGCAACAAGTTCAAGGCGCGGGTGATGGTCTCCCGCAAGACCCCCAATGGGGTGACAGTGACAGAGGATTATGATGGTAGTCAGGATGAGCTGAAGTATGAATGGGTGGAATTTGAGCTGCCCGAAGGCAACTTCTCGGTGACCATGACCATCGACCTGATGAACAACGCCATCATCGACAATTACTTGGCGGTGGGGCGGCAGAACGGGGTGCTGGAGAGCGACATCGGCGTGAAGTTCGACACTAGGAACTTCAGGCTGGGCTGGGACCCCGTGACCGAGCTGGTCATGCCCGGGGTGTACACCAACGAGGCTTTCCATCCCGATATTGTCTTGCTGCCCGGCTGCGGGGTGGACTTCACCGAGAGCCGCCTCAGCAACCTGCTGGGCATTCGCAAGAGGCAGCCCTTCCAGGAAGGCTTCCAGATCATGTACGAGGATCTGGAGGGGGGCAACATCCCCGCGCTCCTGGATGTCGACGCCTATGAGAAAAGCAAGGAGGATGCAGCAGCTGAAGCAACTGCAGCCGTAGCTACCGCCTCTACCGAGGTCAGGGGCGATAATTTTGCAAGCGCCGCAGCAGTGGCAGCGGCCGAGGCGGCTGAAACCGAAAGTAAGATAGTCATTCAGCCGGTGGAGAAGGATAGCAAGAACAGGAGCTACAACGTACTACCGGACAAGATAAACACCGCCTACCGCAGCTGGTACCTAGCCTACAACTATGGCGACCCCGAGAAGGGCGTGCGCTCCTGGACGCTGCTCACCACCTCGGACGTCACCTGCGGCGTGGAGCAAGTCTACTGGTCGCTGCCCGACATGATGCAAGACCCGGTCACCTTCCGCTCCACGCGTCAAGTTAGCAACTACCCGGTGGTGGGCGCCGAGCTCCTGCCCGTCTACTCCAAGAGCTTCTTCAACGAGCAGGCCGTCTACTCGCAGCAGCTGCGCGCCTTCACCTCGCTTACGCACGTCTTCAACCGCTTCCCCGAGAACCAGATCCTCGTCCGCCCGCCCGCGCCCACCATTACCACCGTCAGTGAAAACGTTCCTGCTCTCACAGATCACGGGACCCTGCCGCTGCGCAGCAGTATCCGGGGAGTCCAGCGCGTGACCGTTACTGACGCCAGACGCCGCACCTGCCCCTACGTCTACAAGGCCCTGGGCATAGTCGCGCCGCGCGTCCTCTCGAGCCGCACCTTCTAAATGTCCATTCTCATCTCGCCCAGTAATAACACCGGTTGGGGCCTGCGCGCGCCCAGCAAGATGTACGGAGGCGCTCGCCAACGCTCCACGCAACACCCCGTGCGCGTGCGCGGGCACTTCCGCGCTCCCTGGGGCGCCCTCAAGGGCCGCGTGCGGTCGCGCACCACCGTCGACGACGTGATCGACCAGGTGGTGGCCGACGCGCGCAACTACACCCCCGCCGCCGCGCCCGTCTCCACCGTGGACGCCGTCATCGACAGCGTGGTGGCcGACGCGCGCCGGTACGCCCGCGCCAAGAGCCGGCGGCGGCGCATCGCCCGGCGGCACCGGAGCACCCCCGCCATGCGCGCGGCGCGAGCCTTGCTGCGCAGGGCCAGGCGCACGGGACGCAGGGCCATGCTCAGGGCGGCCAGACGCGCGGCTTCAGGCGCCAGCGCCGGCAGGACCCGGAGACGCGCGGCCACGGCGGCGGCAGCGGCCATCGCCAGCATGTCCCGCCCGCGGCGAGGGAACGTGTACTGGGTGCGCGACGCCGCCACCGGTGTGCGCGTGCCCGTGCGCACCCGCCCCCCTCGCACTTGAAGATGTTCACTTCGCGATGTTGATGTGTCCCAGCGGCGAGGAGGATGTCCAAGCGCAAATTCAAGGAAGAGATGCTCCAGGTCATCGCGCCTGAGATCTACGGCCCTGCGGTGGTGAAGGAGGAAAGAAAGCCCCGCAAAATCAAGCGGGTCAAAAAGGACAAAAAGGAAGAAGAAAGTGATGTGGACGGATTGGTGGAGTTTGTGCGCGAGTTCGCCCCCCGGCGGCGCGTGCAGTGGCGCGGGCGGAAGGTGCAACCGGTGCTGAGACCCGGCACCACCGTGGTCTTCACGCCCGGCGAGCGCTCCGGCACCGCTTCCAAGCGCTCCTACGACGAGGTGTACGGGGATGATGATATTCTGGAGCAGGCGGCCGAGCGCCTGGGCGAGTTTGCTTACGGCAAGCGCAGCCGTTCCGCACCGAAGGAAGAGGCGGTGTCCATCCCGCTGGACCACGGCAACCCCACGCCGAGCCTCAAGCCCGTGACCTTGCAGCAGGTGCTGCCGACCGCGGCGCCGCGCCGGGGGTTCAAGCGCGAGGGCGAGGATCTGTACCCCACCATGCAGCTGATGGTGCCCAAGCGCCAGAAGCTGGAAGACGTGCTGGAGACCATGAAGGTGGACCCGGACGTGCAGCCCGAGGTCAAGGTGCGGCCCATCAAGCAGGTGGCCCCGGGCCTGGGCGTGCAGACCGTGGACATCAAGATTCCCACGGAGCCCATGGAAACGCAGACCGAGCCCATGATCAAGCCCAGCACCAGCACCATGGAGGTGCAGACGGATCCCTGGATGCCATCGGCTCCTAGTCGAAGACCCCGGCGCAAGTACGGCGCGGCCAGCCTGCTGATGCCCAACTACGCGCTGCATCCTTCCATCATCCCCACGCCGGGCTACCGCGGCACGCGCTTCTACCGCGGTCATACCAGCAGCCGCCGCCGCAAGACCACCACTCGCCGCCGCCGTCGCCGCACCGCCGCTGCAACCACCCCTGCCGCCCTGGTGCGGAGAGTGTACCGCCGCGGCCGCGCACCTCTGACCCTGCCGCGCGCGCGCTACCACCCGAGCATCGCCATTTAAACTTTCGCCtGCTTTGCAGATCAATGGCCCTCACATGCCGCCTTCGCGTTCCCATTACGGGCTACCGAGGAAGAAAACCGCGCCGTAGAAGGCTGGCGGGGAACGGGATGCGTCGCCACCACCACCGGCGGCGGCGCGCCATCAGCAAGCGGTTGGGGGGAGGCTTCCTGCCCGCGCTGATCCCCATCATCGCCGCGGCGATCGGGGCGATCCCCGGCATTGCTTCCGTGGCGGTGCAGGCCTCTCAGCGCCACTGAGACACACTTGGAAACATCTTGTAATAAACCaATGGACTCTGACGCTCCTGGTCCTGTGATGTGTTTTCGTAGACAGATGGAAGACATCAATTTTTCGTCCCTGGCTCCGCGACACGGCACGCGGCCGTTCATGGGCACCTGGAGCGACATCGGCACCAGCCAACTGAACGGGGGCGCCTTCAATTGGAGCAGTCTCTGGAGCGGGCTTAAGAATTTCGGGTCCACGCTTAAAACCTATGGCAGCAAGGCGTGGAACAGCACCACAGGGCAGGCGCTGAGGGATAAGCTGAAAGAGCAGAACTTCCAGCAGAAGGTGGTCGATGGGCTCGCCTCGGGCATCAACGGGGTGGTGGACCTGGCCAACCAGGCCGTGCAGCGGCAGATCAACAGCCGCCTGGACCCGGTGCCGCCCGCCGGCTCCGTGGAGATGCCGCAGGTGGAGGAGGAGCTGCCTCCCCTGGACAAGCGGGGCGAGAAGCGACCCCGCCCCGATGCGGAGGAGACGCTGCTGACGCACACGGACGAGCCGCCCCCGTACGAGGAGGCGGTGAAACTGGGTCTGCCCACCACGCGGCCCATCGCGCCCCTGGCCACCGGGGTGCTGAAACCCGAAAAGCCCGCGACCCTGGACTTGCCTCCTCCCCAGCCTTCCCGCCCCTCTACAGTGGCTAAGCCCCTGCCGCCGGTGGCCGTGGCCCGCGCGCGACCCGGGGGCACCGCCCGCCCTCATGCGAACTGGCAGAGCACTCTGAACAGCATCGTGGGTCTGGGAGTGCAGAGTGTGAAGCGCCGCCGCTGCTATTAAACCTACCGTAGCGCTTAACTTGCTTGTCTGTGTGTGTATGTATTATGTCGCCGCCGCCGCTGTCCACCAGAAGGAGGAGTGAAGAGGCGCGTCGCCGAGTTGCAAGATGGCCACCCCATCGATGCTGCCCCAGTGGGCGTACATGCACATCGCCGGACAGGACGCTTCGGAGTACCTGAGTCCGGGTCTGGTGCAGTTTGCCCGCGCCACAGACACCTACTTCAGTCTGGGGAACAAGTTTAGGAACCCCACGGTGGCGCCCACGCACGATGTGACCACCGACCGCAGCCAGCGGCTGACGCTGCGCTTCGTGCCCGTGGACCGCGAGGACAACACCTACTCGTACAAAGTGCGCTACACGCTGGCCGTGGGCGACAACCGCGTGCTGGACATGGCCAGCACCTACTTTGACATCCGCGGCGTGCTGGATCGGGGCCCTAGCTTCAAACCCTACTCCGGCACCGCCTACAACAGTCTGGCCCCCAAGGGAGCACCCAACACTTGTCAGTGGACATATAAAGCCGATGGTGAAACTGCCACAGAAAAAACCTATACATATGGAAATGCACCCGTGCAGGGCATTAACATCACAAAAGATGGTATTCAACTTGGAACTGACACCGATGATCAGCCAATCTACGCAGATAAAACCTATCAGCCTGAACCTCAAGTGGGTGATGCTGAATGGCATGACATCACTGGTACTGATGAAAAGTATGGAGGCAGAGCTCTTAAGCCTGATACCAAAATGAAGCCTTGTTATGGTTCTTTTGCCAAGCCTACTAATAAAGAAGGAGGTCAGGCAAATGTGAAAACAGGAACAGGCACTACTAAAGAATATGACATAGACATGGCTTTCTTTGACAACAGAAGTGCGGCTGCTGCTGGCCTAGCTCCAGAAATTGTTTTGTATACTGAAAATGTGGATTTGGAAACTCCAGATACCCATATTGTATACAAAGCAGGCACAGATGACAGCAGCTCTTCTATTAATTTGGGTCAGCAAGCCATGCCCAACAGACCTAACTACATTGGTTTCAGAGACAACTTTATCGGGCTCATGTACTACAACAGCACTGGCAATATGGGGGTGCTGGCCGGTCAGGCTTCTCAGCTGAATGCTGTGGTTGACTTGCAAGACAGAAACACCGAGCTGTCCTACCAGCTCTTGCTTGACTCTCTGGGTGACAGAACCCGGTATTTCAGTATGTGGAATCAGGCGGTGGACAGCTATGATCCTGATGTGCGCATTATTGAAAATCATGGTGTGGAGGATGAACTTCCCAACTATTGTTTCCCTCTGGATGCTGTTGGCAGAACAGATACTTATCAGGGAATTAAGGCTAATGGAACTGATCAAACCACATGGACCAAAGATGACAGTGTCAATGATGCTAATGAGATAGGCAAGGGTAATCCATTCGCCATGGAAATCAACATCCAAGCCAACCTGTGGAGGAACTTCCTCTACGCCAACGTGGCCCTGTACCTGCCCGACTCTTACAAGTACACGCCGGCCAATGTTACCCTGCCCACCAACACCAACACCTACGATTACATGAACGGCCGGGTGGTGGCGCCCTCGCTGGTGGACTCCTACATCAACATCGGGGCGCGCTGGTCGCTGGATCCCATGGACAACGTGAACCCCTTCAACCACCACCGCAATGCGGGGCTGCGCTACCGCTCCATGCTCCTGGGCAACGGGCGCTACGTGCCCTTCCACATCCAGGTGCCCCAGAAATTTTTCGCCATCAAGAGCCTCCTGCTCCTGCCCGGGTCCTACACCTACGAGTGGAACTTCCGCAAGGACGTCAACATGATCCTGCAGAGCTCCCTCGGCAACGACCTGCGCACGGACGGGGCCTCCATCTCCTTCACCAGCATCAACCTCTACGCCACCTTCTTCCCCATGGCGCACAACACGGCCTCCACGCTCGAGGCCATGCTGCGCAACGACACCAACGACCAGTCCTTCAACGACTACCTCTCGGCGGCCAACATGCTCTACCCCATCCCGGCCAACGCCACCAACGTGCCCATCTCCATCCCCTCGCGCAACTGGGCCGCCTTCCGCGGCTGGTCCTTCACGCGTCTCAAGACCAAGGAGACGCCCTCGCTGGGCTCCGGGTTCGACCCCTACTTCGTCTACTCGGGCTCCATCCCCTACCTCGACGGCACCTTCTACCTCAACCACACCTTCAAGAAGGTCTCCATCACCTTCGACTCCTCCGTCAGCTGGCCCGGCAACGACCGGCTCCTGACGCCCAACGAGTTCGAAATCAAGCGCACCGTCGACGGCGAGGGCTACAACGTGGCCCAGTGCAACATGACCAAGGACTGGTTCCTGGTCCAGATGCTGGCCCACTACAACATCGGCTACCAGGGCTTCTACGTGCCCGAGGGCTACAAGGACCGCATGTACTCCTTCTTCCGCAACTTCCAGCCCATGAGCCGCCAGGTGGTGGACGAGGTCAACTACAAGGACTACCAGGCCGTCACCCTGGCCTACCAGCACAACAACTCGGGCTTCGTCGGCTACCTCGCGCCCACCATGCGCCAGGGCCAGCCCTACCCCGCCAACTACCCCTACCCGCTCATCGGCAAGAGCGCCGTCACCAGCGTCACCCAGAAAAAGTTCCTCTGCGACAGGGTCATGTGGCGCATCCCCTTCTCCAGCAACTTCATGTCCATGGGCGCGCTCACCGACCTCGGCCAGAACATGCTCTATGCCAACTCCGCCCACGCGCTAGACATGAATTTCGAAGTCGACCCCATGGATGAGTCCACCCTTCTCTATGTTGTCTTCGAAGTCTTCGACGTCGTCCGAGTGCACCAGCCCCACCGCGGCGTCATCGAGGCCGTCTACCTGCGCACCCCCTTCTCGGCCGGTAACGCCACCACCTAAGCTCTTGCTTCTTGCAAGCCATGGCCGCGGGCTCCGGCGAGCAGGAGCTCAGGGCCATCATCCGCGACCTGGGCTGCGGGCCCTACTTCCTGGGCACCTTCGATAAGCGCTTCCCGGGATTCATGGCCCCGCACAAGCTGGCCTGCGCCATCGTCAACACGGCCGGCCGCGAGACCGGGGGCGAGCACTGGCTGGCCTTCGCCTGGAACCCGCGCTCGAACACCTGCTACCTCTTCGACCCCTTCGGGTTCTCGGACGAGCGCCTCAAGCAGATCTACCAGTTCGAGTACGAGGGCCTGCTGCGCCGCAGCGCCCTGGCCACCGAGGACCGCTGCGTCACCCTGGAAAAGTCCACCCAGACCGTGCAGGGTCCGCGCTCGGCCGCCTGCGGGCTCTTCTGCTGCATGTTCCTGCACGCCTTCGTGCACTGGCCCGACCGCCCCATGGACAAGAACCCCACCATGAACTTGCTGACGGGGGTGCCCAACGGCATGCTCCAGTCGCCCCAGGTGGAACCCACCCTGCGCCGCAACCAGGAGGCGCTCTACCGCTTCCTCAACTCCCACTCCGCCTACTTTCGCTCCCACCGCGCGCGCATCGAGAAGGCCACCGCCTTCGACCGCATGAATCAAGACATGTAAACCGTGTGTGTATGTTAAATGTCTTTAATAAACAGCACTTTCATGTTACACATGCATCTGAGATGATTTATTTAGAAATCGAAAGGGTTCTGCCGGGTCTCGGCATGGCCCGCGGGCAGGGACACGTTGCGGAACTGGTACTTGGCCAGCCACTTGAACTCGGGGATCAGCAGTTTGGGCAGCGGGGTGTCGGGGAAGGAGTCGGTCCACAGCTTCCGCGTCAGTTGCAGGGCGCCCAGCAGGTCGGGCGCGGAGATCTTGAAATCGCAGTTGGGACCCGCGTTCTGCGCGCGGGAGTTGCGGTACACGGGGTTGCAGCACTGGAACACCATCAGGGCCGGGTGCTTCACGCTCGCCAGCACCGTCGCGTCGGTGATGCTCTCCACGTCGAGGTCCTCGGCGTTGGCCATCCCGAAGGGGGTCATCTTGCAGGTCTGCCTTCCCATGGTGGGCACGCACCCGGGCTTGTGGTTGCAATCGCAGTGCAGGGGGATCAGCATCATCTGGGCCTGGTCGGCGTTCATCCCCGGGTACATGGCCTTCATGAAAGCCTCCAATTGCCTGAACGCCTGCTGGGCCTTGGCTCCCTCGGTGAAGAAGACCCCGCAGGACTTGCTAGAGAACTGGTTGGTGGCGCACCCGGCGTCGTGCACGCAGCAGCGCGCGTCGTTGTTGGCCAGCTGCACCACGCTGCGCCCCCAGCGGTTCTGGGTGATCTTGGCCCGGTCGGGGTTCTCCTTCAGCGCGCGCTGCCCGTTCTCGCTCGCCACATCCATCTCGATCATGTGCTCCTTCTGGATCATGGTGGTCCCGTGCAGGCACCGCAGCTTGCCCTCGGCCTCGGTGCACCCGTGCAGCCACAGCGCGCACCCGGTGCACTCCCAGTTCTTGTGGGCGATCTGGGAATGCGCGTGCACGAAGCCCTGCAGGAAGCGGCCCATCATGGTGGTCAGGGTCTTGTTGCTAGTGAAGGTCAGCGGAATGCCGCGGTGCTCCTCGTTGATGTACAGGTGGCAGATGCGGCGGTACACCTCGCCCTGCTCGGGCATCAGCTGGAAGTTGGCTTTCAGGTCGGTCTCCACGCGGTAGCGGTCCATCAGCATAGTCATGATTTCCATACCCTTCTCCCAGGCCGAGACGATGGGCAGGCTCATAGGGTTCTTCACCATCATCTTAGCGCTAGCAGCCGCGGCCAGGGGGTCGCTCTCGTCCAGGGTCTCAAAGCTCCGCTTGCCGTCCTTCTCGGTGATCCGCACCGGGGGGTAGCTGAAGCCCACGGCCGCCAGCTCCTCCTCGGCCTGTCTTTCGTCCTCGCTGTCCTGGCTGACGTCCTGCAGGACCACATGCTTGGTCTTGCGGGGTTTCTTCTTGGGCGGCAGCGGCGGCGGAGATGTTGGAGATGGCGAGGGGGAGCGCGAGTTCTCGCTCACCACTACTATCTCTTCCTCTTCTTGGTCCGAGGCCACGCGGCGGTAGGTATGTCTCTTCGGGGGCAGAGGCGGAGGCGACGGGCTCTCGCCGCCGCGACTTGGCGGATGGCTGGCAGAGCCCCTTCCGCGTTCGGGGGTGCGCTCCCGGCGGCGCTCTGACTGACTTCCTCCGCGGCCGGCCATTGTGTTCTCCTAGGGAGGAACAACAAGCATGGAGACTCAGCCATCGCCAACCTCGCCATCTGCCCCCACCGCCGACGAGAAGCAGCAGCAGCAGAATGAAAGCTTAACCGCCCCGCCGCCCAGCCCCGCCACCTCCGACGCGGCCGTCCCAGACATGCAAGAGATGGAGGAATCCATCGAGATTGACCTGGGCTATGTGACGCCCGCGGAGCACGAGGAGGAGCTGGCAGTGCGCTTTTCACAAGAAGAGATACACCAAGAACAGCCAGAGCAGGAAGCAGAGAATGAGCAGAGTCAGGCTGGGCTCGAGCATGACGGCGACTACCTCCACCTGAGCGGGGGGGAGGACGCGCTCATCAAGCATCTGGCCCGGCAGGCCACCATCGTCAAGGATGCGCTGCTCGACCGCACCGAGGTGCCCCTCAGCGTGGAGGAGCTCAGCCGCGCCTACGAGTTGAACCTCTTCTCGCCGCGCGTGCCCCCCAAGCGCCAGCCCAATGGCACCTGCGAGCCCAACCCGCGCCTCAACTTCTACCCGGTCTTCGCGGTGCCCGAGGCCCTGGCCACCTACCACATCTTTTTCAAGAACCAAAAGATCCCCGTCTCCTGCCGCGCCAACCGCACCCGCGCCGACGCCCTTTTCAACCTGGGTCCCGGCGCCCGCCTACCTGATATCGCCTCCTTGGAAGAGGTTCCCAAGATCTTCGAGGGTCTGGGCAGCGACGAGACTCGGGCCGCGAACGCTCTGCAAGGAGAAGGAGGAGAGCATGAGCACCACAGCGCCCTGGTCGAGTTGGAAGGCGACAACGCGCGGCTGGCGGTGCTCAAACGCACGGTCGAGCTGACCCATTTCGCCTACCCGGCTCTGAACCTGCCCCCCAAAGTCATGAGCGCGGTCATGGACCAGGTGCTCATCAAGCGCGCGTCGCCCATCTCCGAGGACGAGGGCATGCAAGACTCCGAGGAGGGCAAGCCCGTGGTCAGCGACGAGCAGCTGGCCCGGTGGCTGGGTCCTAATGCTAGTCCCCAGAGTTTGGAAGAGCGGCGCAAACTCATGATGGCCGTGGTCCTGGTGACCGTGGAGCTGGAGTGCCTGCGCCGCTTCTTCGCCGACGCGGAGACCCTGCGCAAGGTCGAGGAGAACCTGCACTACCTCTTCAGGCACGGGTTCGTGCGCCAGGCCTGCAAGATCTCCAACGTGGAGCTGACCAACCTGGTCTCCTACATGGGCATCTTGCACGAGAACCGCCTGGGGCAGAACGTGCTGCACACCACCCTGCGCGGGGAGGCCCGGCGCGACTACATCCGCGACTGCGTCTACCTCTACCTCTGCCACACCTGGCAGACGGGCATGGGCGTGTGGCAGCAGTGTCTGGAGGAGCAGAACCTGAAAGAGCTCTGCAAGCTCCTGCAGAAGAACCTCAAGGGTCTGTGGACCGGGTTCGACGAGCGCACCACCGCCTCGGACCTGGCCGACCTCATTTTCCCCGAGCGCCTCAGGCTGACGCTGCGCAACGGCCTGCCCGACTTTATGAGCCAAAGCATGTTGCAAAACTTTCGCTCTTTCATCCTCGAACGCTCCGGAATCCTGCCCGCCACCTGCTCCGCGCTGCCCTCGGACTTCGTGCCGCTGACCTTCCGCGAGTGCCCCCCGCCGCTGTGGAGCCACTGCTACCTGCTGCGCCTGGCCAACTACCTGGCCTACCACTCGGACGTGATCGAGGACGTCAGCGGCGAGGGCCTGCTCGAGTGCCACTGCCGCTGCAACCTCTGCACGCCGCACCGCTCCCTGGCCTGCAACCCCCAGCTGCTGAGCGAGACCCAGATCATCGGCACCTTCGAGTTGCAAGGGCCCAGCGAAGGCGAGGGTTCAGCCGCCAAGGGGGGTCTGAAACTCACCCCGGGGCTGTGGACCTCGGCCTACTTGCGCAAGTTCGTGCCCGAGGACTACCATCCCTTCGAGATCAGGTTCTACGAGGACCAATCCCATCCGCCCAAGGCCGAGCTGTCGGCCTGCGTCATCACCCAGGGGGCGATCCTGGCCCAATTGCAAGCCATCCAGAAATCCCGCCAAGAATTCTTGCTGAAAAAGGGCCGCGGGGTCTACCTCGACCCCCAGACCGGTGAGGAGCTCAACCCCGGCTTCCCCCAGGATGCCCCGAGGAAACAAGAAGCTGAAAGTGGAGCTGCCGCCCGTGGAGGATTTGGAGGAAGACTGGGAGAACAGCAGTCAGGCAGAGGAGGAGGAGATGGAGGAAGACTGGGACAGCACTCAGGCAGAGGAGGACAGCCTGCAAGACAGTCTGGAGGAAGACGAGGAGGAGGCAGAGGAGGAGGTGGAAGAAGCAGCCGCCGCCAGACCGTCGTCCTCGGCGGGGGAGAAAGCAAGCAGCACGGATACCATCTCCGCTCCGGGTCGGGGTCCCGCTCGACCACACAGTAGATGGGACGAGACCGGACGATTCCCGAACCCCACCACCCAGACCGGTAAGAAGGAGCGGCAGGGATACAAGTCCTGGCGGGGGCACAAAAACGCCATCGTCTCCTGCTTGCAGGCCTGCGGGGGCAACATCTCCTTCACCCGGCGCTACCTGCTCTTCCACCGCGGGGTGAACTTTCCCCGCAACATCTTGCATTACTACCGTCACCTCCACAGCCCCTACTACTTCCAAGAAGAGGCAGCAGCAGCAGAAAAAGACCAGCAGAAAACCAGCAGCTAGAAAATCCACAGCGGCGGCAGCAGGTGGACTGAGGATCGCGGCGAACGAGCCGGCGCAAACCCGGGAGCTGAGGAACCGGATCTTTCCCACCCTCTATGCCATCTTCCAGCAGAGTCGGGGGCAGGAGCAGGAACTGAAAGTCAAGAACCGTTCTCTGCGCTCGCTCACCCGCAGTTGTCTGTATCACAAGAGCGAAGACCAACTTCAGCGCACTCTCGAGGACGCCGAGGCTCTCTTCAACAAGTACTGCGCGCTCACTCTTAAAGAGTAGCCCGCGCCCGCCCAGTCGCAGAAAAAGGCGGGAATTACGTCACCTGTGCCCTTCGCCCTAGCCGCCTCCACCCATCATCATGAGCAAAGAGATTCCCACGCCTTACATGTGGAGCTACCAGCCCCAGATGGGCCTGGCCGCCGGTGCCGCCCAGGACTACTCCACCCGCATGAATTGGCTCAGCGCCGGGCCCGCGATGATCTCACGGGTGAATGACATCCGCGCCCACCGAAACCAGATACTCCTAGAACAGTCAGCGCTCACCGCCACGCCCCGCAATCACCTCAATCCGCGTAATTGGCCCGCCGCCCTGGTGTACCAGGAAATTCCCCAGCCCACGACCGTACTACTTCCGCGAGACGCCCAGGCCGAAGTCCAGCTGACTAACTCAGGTGTCCAGCTGGCGGGCGGCGCCACCCTGTGTCGTCACCGCCCCGCTCAGGGTATAAAGCGGCTGGTGATCCGGGGCAGAGGCACACAGCTCAACGACGAGGTGGTGAGCTCTTCGCTGGGTCTGCGACCTGACGGAGTCTTCCAACTCGCCGGATCGGGGAGATCTTCCTTCACGCCTCGTCAGGCCGTCCTGACTTTGGAGAGTTCGTCCTCGCAGCCCCGCTCGGGTGGCATCGGCACTCTCCAGTTCGTGGAGGAGTTCACTCCCTCGGTCTACTTCAACCCCTTCTCCGGCTCCCCCGGCCACTACCCGGACGAGTTCATCCCGAACTTCGACGCCATCAGCGAGTCGGTGGACGGCTACGATTGAATGTCCCATGGTGGCGCAGCTGACCTAGCTCGGCTTCGACACCTGGACCACTGCCGCCGCTTCCGCTGCTTCGCTCGGGATCTCGCCGAGTTTGCCTACTTTGAGCTGCCCGAGGAGCACCCTCAGGGCCCGGCCCACGGAGTGCGGATCGTCGTCGAAGGGGGCCTCGACTCCCACCTGCTTCGGATCTTCAGCCAGCGTCCGATCCTGGTCGAGCGCGAGCAAGGACAGACCCTTCTGACTCTGTACTGCATCTGCAACCACCCCGGCCTGCATGAAAGTCTTTGTTGTCTGCTGTGTACTGAGTATAATAAAAGCTGAGATCAGCGACTACTCCGGACTTCCGTGTGTTCCTGAATCCATCAACCAGTCTTTGTTCTTCACCGGGAACGAGACCGAGCTCCAGCTCCAGTGTAAGCCCCACAAGAAGTACCTCACCTGGCTGTTCCAGGGCTCCCCGATCGCCGTTGTCAACCACTGCGACAACGACGGAGTCCTGCTGAGCGGCCCTGCCAACCTTACTTTTTCCACCCGCAGAAGCAAGCTCCAGCTCTTCCAACCCTTCCTCCCCGGGACCTATCAGTGCGTCTCGGGACCCTGCCATCACACCTTCCACCTGATCCCGAATACCACAGCGTCGCTCCCCGCTACTAACAACCAAACTAACCTCCACCAACGCCACCGTCGCGACCTTTCTGAATCTAATACTACCACCCACACCGGAGGTGAGCTCCGAGGTCAACCAACCTCTGGGATTTACTACGGCCCCTGGGAGGTGGTTGGGTTAATAGCGCTAGGCCTAGTTGCGGGTGGGCTTTTGGTTCTCTGCTACCTATACCTCCCTTGCTGTTCGTACTTAGTGGTGCTGTGTTGCTGGTTTAAGAAATGGGGAAGATCACCCTAGTGAGCTGCGGTGCGCTGGTGGCGGTGTTGCTTTCGATTGTGGGACTGGGCGGTGCGGCTGTAGTGAAGGAGAAGGCCGATCCCTGCTTGCATTTCAATCCCAACAAATGCCAGCTGAGTTTTCAGCCCGATGGCAATCGGTGCGCGGTACTGATCAAGTGCGGATGGGAATGCGAGAACGTGAGAATCGAGTACAATAACAAGACTCGGAACAATACTCTCGCGTCCGTGTGGCAGCCCGGGGACCCCGAGTGGTACACCGTCTCTGTCCCCGGTGCTGACGGCTCCCCGCGCACCGTGAATAATACTTTCATTTTTGCGCACATGTGCGACACGGTCATGTGGATGAGCAAGCAGTACGATATGTGGCCCCCCACGAAGGAGAACATCGTGGTCTTCTCCATCGCTTACAGCCTGTGCACGGCGCTAATCACCGCTATCGTGTGCCTGAGCATTCACATGCTCATCGCTATTCGCCCCAGAAATAATGCCGAAAAAGAAAAACAGCCATAACGTTTTTTTTCACACCTTTTTCAGACCATGGCCTCTGTTAAATTTTTGCTTTTATTTGCCAGTCTCATTGCCGTCATTCATGGAATGAGTAATGAGAAAATTACTATTTACACTGGCACTAATCACACATTGAAAGGTCCAGAAAAAGCCACAGAAGTTTCATGGTATTGTTATTTTAATGAATCAGATGTATCTACTGAACTCTGTGGAAACAATAACAAAAAAAATGAGAGCATTACTCTCATCAAGTTTCAATGTGGATCTGACTTAACCCTAATTAACATCACTAGAGACTATGTAGGTATGTATTATGGAACTACAGCAGGCATTTCGGACATGGAATTTTATCAAGTTTCTGTGTCTGAACCCACCACGCCTAGAATGACCACAACCACAAAAACTACACCTGTTACCACTATGCAGCTCACTACCAATAACATTTTTGCCATGCGTCAAATGGTCAACAATAGCACTCAACCCACCCCACCCAGTGAGGAAATTCCCAAATCCATGATTGGCATTATTGTTGCTGTAGTGGTGTGCATGTTGATCATCGCCTTGTGCATGGTGTACTATGCCTTCTGCTACAGAAAGCACAGACTGAACGACAAGCTGGAACACTTACTAAGTGTTGAATTTTAATTTTTTAGAACCATGAAGATCCTAGGCCTTTTAATTTTTTCTATCATTACCTCTGCTCTATGCAATTCTGACAATGAGGACGTTACTGTCGTTGTCGGATCAAATTATACACTGAAAGGTCCAGCGAAGGGTATGCTTTCGTGGTATTGCTATTTTGGATCTGACACTACAGAAACTGAATTATGCAATCTTAAGAATGGCAAAATTCAAAATTCTAAAATTAACAATTATATATGCAATGGTACTGATCTGATACTCCTCAATATCACGAAATCATATGCTGGCAGTTACACCTGCCCTGGAGATGATGCTGACAGTATGATTTTTTACAAAGTAACTGTTGTTGATCCCACTACTCCACCTCCACCCACCACAACTACTCACACCACACACACAGATCAAACCGCAGCAGAGGAGGCAGCAAAGTTAGCCTTGCAGGTCCAAGACAGTTCATTTGTTGGCATTACCCCTACACCTGATCAGCGGTGTCCGGGGCTGCTAGTCAGCGGCATTGTCGGTGTGCTTTCGGGATTAGCAGTCATAATCATCTGCATGTTCATTTTTGCTTGCTGCTATAGAAGGCTTTACCGACAAAAATCAGACCCACTGCTGAACCTCTATGTTTAATTTTTTCCAGAGTCATGAAGGCAGTTAGCGCTCTAGTTTTTTGTTCTTTGATTGGCATTGTTTTTTGCAATCCTATTCCTAAAGTTAGCTTTATTAAAGATGTGAATGTTACTGAGGGGGGCAATGTGACACTGGTAGGTGTAGAGGGTGCTGAAAACACCACCTGGACAAAATACCACCTCAATGGGTGGAAAGATATTTGCAATTGGAGTGTATTAGTTTATACATGTGAGGGAGTTAATCTTACCATTGTCAATGCCACCTCAGCTCAAAATGGTAGAATTCAAGGACAAAGTGTCAGTGTATCTAATGGGTATTTTACCCAACATACTTTTATCTATGACGTTAAAGTCATACCACTGCCTACGCCTAGCCCACCTAGCACTACCACACAGACAACCCACACTACACAGACAACCACATACAGTACATTAAATCAGCCTACCACCACTACAGCAGCAGAGGTTGCCAGCTCGTCTGGGGTCCGAGTGGCATTTTTGATGTGGGCCCCATCTAGCAGTCCCACTGCTAGTACCAATGAGCAGACTACTGAATTTTTGTCCACTGTCGAGAGCCACACCACAGCTACCTCCAGTGCCTTCTCTAGCACCGCCAATCTCTCCTCGCTTTCCTCTACACCAATCAGTCCCGCTACTACTCCTAGCCCCGCTCCTCTTCCCACTCCCCTGAAGCAAACAGACGGCGGCATGCAATGGCAGATCACCCTGCTCATTGTGATCGGGTTGGTCATCCTGGCCGTGTTGCTCTACTACATCTTCTGCCGCCGCATTCCCAACGCGCACCGCAAGCCGGTCTACAAGCCCATCATTGTCGGGCAGCCGGAGCCGCTTCAGGTGGAAGGGGGTCTAAGGAATCTTCTCTTCTCTTTTACAGTATGGTGATTGAACTATGATTCCTAGACAATTCTTGATCACTATTCTTATCTGCCTCCTCCAAGTCTGTGCCACCCTCGCTCTGGTGGCCAACGCCAGTCCAGACTGTATTGGGCCCTTCGCCTCCTACGTGCTCTTTGCCTTCACCACCTGCATCTGCTGCTGTAGCATAGTCTGCCTGCTTATCACCTTCTTCCAGTTCATTGACTGGATCTTTGTGCGCATCGCCTACCTGCGCCACCACCCCCAGTACCGCGACCAGCGAGTGGCGCGGCTGCTCAGGCTCCTCTGATAAGCATGCGGGCTCTGCTACTTCTCGCGCTTCTGCTGTTAGTGCTCCCCCGTCCCGTCGACCCCCGGTCCCCCACCCAGTCCCCCGAGGAGGTCCGCAAATGCAAATTCCAAGAACCCTGGAAATTCCTCAAATGCTACCGCCAAAAATCAGACATGCATCCCAGCTGGATCATGATCATTGGGATCGTGAACATTCTGGCCTGCACCCTCATCTCCTTTGTGATTTACCCCTGCTTTGACTTTGGTTGGAACTCGCCAGAGGCGCTCTATCTCCCGCCTGAACCTGACACACCACCACAGCAACCTCAGGCACACGCACTACCACCACTACAGCCTAGGCCACAATACATGCCCATATTAGACTATGAGGCCGAGCCACAGCGACCCATGCTCCCCGCTATTAGTTACTTCAATCTAACCGGCGGAGATGACTGACCCACTGGCCAACAACAACGTCAACGACCTTCTCCTGGACATGGACGGCCGCGCCTCGGAGCAGCGACTCGCCCAACTTCGCATTCGCCAGCAGCAGGAGAGAGCCGTCAAGGAGCTGCAGGATGCGGTGGCCATCCACCAGTGCAAGAGAGGCATCTTCTGCCTGGTGAAACAGGCCAAGATCTCCTACGAGGTCACTCCAAACGACCATCGCCTCTCCTACGAGCTCCTGCAGCAGCGCCAGAAGTTCACCTGCCTGGTCGGAGTCAACCCCATCGTCATCACCCAGCAGTCTGGCGATACCAAGGGGTGCATCCACTGCTCCTGCGACTCCCCCGACTGCGTCCACACTCTGATCAAGACCCTCTGCGGCCTCCGCGACCTCCTCCCCATGAACTAATCACCCCCTTATCCAGTGAAATAAAGATCATATTGATGATGATTTTACAGAAATAAAAAATAATCATTTGATTTGAAATAAAGATACAATCATATTGATGATTTGAGTTTAACAAAAAAATAAAGAATCACTTACTTGAAATCTGATACCAGGTCTCTGTCCATGTTTTCTGCCAACACCACTTCACTCCCCTCTTCCCAGCTCTGGTACTGCAGGCCCCGGCGGGCTGCAAACTTCCTCCACACGCTGAAGGGGATGTCAAATTCCTCCTGTCCCTCAATCTTCATTTTATCTTCTATCAGATGTCCAAAAAGCGCGTCCGGGTGGATGATGACTTCGACCCCGTCTACCCCTACGATGCAGACAACGCACCGACCGTGCCCTTCATCAACCCCCCCTTCGTCTCTTCAGATGGATTCCAAGAGAAGCCCCTGGGGGTGTTGTCCCTGCGACTGGCCGACCCCGTCACCACCAAGAACGGGGAAATCACCCTCAAGCTGGGAGAGGGGGTGGACCTCGATTCCTCGGGAAAACTCATCTCCAACACGGCCACCAAGGCCGCCGCCCCTCTCAGTTTTTCCAACAACACCATTTCCCTTAACATGGATCACCCCTTTTACACTAAAGATGGAAAATTATCCTTACAAGTTTCTCCACCATTAAATATACTGAGAACAAGCATTCTAAACACACTAGCTTTAGGTTTTGGATCAGGTTTAGGACTCCGTGGCTCTGCCTTGGCAGTACAGTTAGTCTCTCCACTTACATTTGATACTGATGGAAACATAAAGCTTACCTTAGACAGAGGTTTGCATGTTACAACAGGAGATGCAATTGAAAGCAACATAAGCTGGGCTAAAGGTTTAAAATTTGAAGATGGAGCCATAGCAACCAACATTGGAAATGGGTTAGAGTTTGGAAGCAGTAGTACAGAAACAGGTGTTGATGATGCTTACCCAATCCAAGTTAAACTTGGATCTGGCCTTAGCTTTGACAGTACAGGAGCCATAATGGCTGGTAACAAAGAAGACGATAAACTCACTTTGTGGACAACACCTGATCCATCACCAAACTGTCAAATACTCGCAGAAAATGATGCAAAACTAACACTTTGCTTGACTAAATGTGGTAGTCAAATACTGGCCACTGTGTCAGTCTTAGTTGTAGGAAGTGGAAACCTAAACCCCATTACTGGCACCGTAAGCAGTGCTCAGGTGTTTCTACGTTTTGATGCAAACGGTGTTCTTTTAACAGAACATTCTACACTAAAAAAATACTGGGGGTATAGGCAGGGAGATAGCATAGATGGCACTCCATATACCAATGCTGTAGGATTCATGCCCAATTTAAAAGCTTATCCAAAGTCACAAAGTTCTACTACTAAAAATAATATAGTAGGGCAAGTATACATGAATGGAGATGTTTCAAAACCTATGCTTCTCACTATAACCCTCAATGGTACTGATGACAGCAACAGTACATATTCAATGTCATTTTCATACACCTGGACTAATGGAAGCTATGTTGGAGCAACATTTGGGGCTAACTCTTATACCTTCTCATACATCGCCCAAGAATGAACACTGTATCCCACCCTGCATGCCAACCCTTCCCACCCCACTCTGTGGAACAAACTCTGAAACACAAAATAAAATAAAGTTCAAGTGTTTTATTGATTCAACAGTTTTACAGGATTCGAGCAGTTATTTTTCCTCCACCCTCCCAGGACATGGAATACACCACCCTCTCCCCCCGCACAGCCTTGAACATCTGAATGCCATTGGTGATGGACATGCTTTTGGTCTCCACGTTCCACACAGTTTCAGAGCGAGCCAGTCTCGGGTCGGTCAGGGAGATGAAACCCTCCGGGCACTCCCGCATCTGCACCTCACAGCTCAACAGCTGAGGATTGTCCTCGGTGGTCGGGATCACGGTTATCTGGAAGAAGCAGAAGAGCGGCGGTGGGAATCATAGTCCGCGAACGGGATCGGCCGGTGGTGTCGCATCAGGCCCCGCAGCAGTCGCTGCCGCCGCCGCTCCGTCAAGCTGCTGCTCAGGGGGTCCGGGTCCAGGGACTCCCTCAGCATGATGCCCACGGCCCTCAGCATCAGTCGTCTGGTGCGGCGGGCGCAGCAGCGCATGCGGATCTCGCTCAGGTCGCTGCAGTACGTGCAACACAGAACCACCAGGTTGTTCAACAGTCCATAGTTCAACACGCTCCAGCCGAAACTCATCGCGGGAAGGATGCTACCCACGTGGCCGTCGTACCAGATCCTCAGGTAAATCAAGTGGTGCCCCCTCCAGAACACGCTGCCCACGTACATGATCTCCTTGGGCATGTGGCGGTTCACCACCTCCCGGTACCACATCACCCTCTGGTTGAACATGCAGCCCCGGATGATCCTGCGGAACCACAGGGCCAGCACCGCCCCGCCCGCCATGCAGCGAAGAGACCCCGGGTCCCGGCAATGGCAATGGAGGACCCACCGCTCGTACCCGTGGATCATCTGGGAGCTGAACAAGTCTATGTTGGCACAGCACAGGCATATGCTCATGCATCTCTTCAGCACTCTCAACTCCTCGGGGGTCAAAACCATATCCCAGGGCACGGGGAACTCTTGCAGGACAGCGAACCCCGCAGAACAGGGCAATCCTCGCACAGAACTTACATTGTGCATGGACAGGGTATCGCAATCAGGCAGCACCGGGTGATCCTCCACCAGAGAAGCGCGGGTCTCGGTCTCCTCACAGCGTGGTAAGGGGGCCGGCCGATACGGGTGATGGCGGGACGCGGCTGATCGTGTTCGCGACCGTGTCATGATGCAGTTGCTTTCGGACATTTTCGTACTTGCTGTAGCAGAACCTGGTCCGGGCGCTGCACACCGATCGCCGGCGGCGGTCTCGGCGCTTGGAACGCTCGGTGTTGAAATTGTAAAACAGCCACTCTCTCAGACCGTGCAGCAGATCTAGGGCCTCAGGAGTGATGAAGATCCCATCATGCCTGATGGCTCTGATCACATCGACCACCGTGGAATGGGCCAGACCCAGCCAGATGATGCAATTTTGTTGGGTTTCGGTGACGGCGGGGGAGGGAAGAACAGGAAGAACCATGATTAACTTTTAATCCAAACGGTCTCGGAGTACTTCAAAATGAAGATCGCGGAGATGGCACCTCTCGCCCCCGCTGTGTTGGTGGAAAATAACAGCCAGGTCAAAGGTGATACGGTTCTCGAGATGTTCCACGGTGGCTTCCAGCAAAGCCTCCACGCGCACATCCAGAAACAAGACAATAGCGAAAGCGGGAGGGTTCTCTAATTCCTCAATCATCATGTTACACTCCTGCACCATCCCCAGATAATTTTCATTTTTCCAGCCTTGAATGATTCGAACTAGTTCcTGAGGTAAATCCAAGCCAGCCATGATAAAGAGCTCGCGCAGAGCGCCCTCCACCGGCATTCTTAAGCACACCCTCATAATTCCAAGATATTCTGCTCCTGGTTCACCTGCAGCAGATTGACAAGCGGAATATCAAAATCTCTGCCGCGATCCCTGAGCTCCTCCCTCAGCAATAACTGTAAGTACTCTTTCATATCCTCTCCGAAATTTTTAGCCATAGGACCACCAGGAATAAGATTAGGGCAAGCCACAGTACAGATAAACCGAAGTCCTCCCCAGTGAGCATTGCCAAATGCAAGACTGCTATAAGCATGCTGGCTAGACCCGGTGATATCTTCCAGATAACTGGACAGAAAATCGCCCAGGCAATTTTTAAGAAAATCAACAAAAGAAAAATCCTCCAGGTGGACGTTTAGAGCCTCGGGAACAACGATGAAGTAAATGCAAGCGGTGCGTTCCAGCATGGTTAGTTAGCTGATCTGTAGAAAAAACAAAAATGAACATTAAACCATGCTAGCCTGGCGAACAGGTGGGTAAATCGTTCTCTCCAGCACCAGGCAGGCCACGGGGTCTCCGGCGCGACCCTCGTAAAAATTGTCGCTATGATTGAAAACCATCACAGAGAGACGTTCCCGGTGGCCGGCGTGAATGATTCGACAAGATGAATACACCCCCGGAACATTGGCGTCCGCGAGTGAAAAAAAGCGCCCGAGGAAGCAATAAGGCACTACAATGCTCAGTCTCAAGTCCAGCAAAGCGATGCCATGCGGATGAAGCACAAAATTCTCAGGTGCGTACAAAATGTAATTACTCCCCTCCTGCACAGGCAGCAAAGCCCCCGATCCCTCCAGGTACACATACAAAGCCTCAGCGTCCATAGCTTACCGAGCAGCAGCACACAACAGGCGCAAGAGTCAGAGAAAGGCTGAGCTCTAACCTGTCCACCCGCTCTCTGCTCAATATATAGCCCAGATCTACACTGACGTAAAGGCCAAAGTCTAAAAATACCCGCCAAATAATCACACACGCCCAGCACACGCCCAGAAACCGGTGACACACTCAAAAAAATACGCGCACTTCCTCAAACGCCCAAAACTGCCGTCATTTCCGGGTTCCCACGCTACGTCATCAAAACACGACTTTCAAATTCCGTCGACCGTTAAAAACGTCACCCGCCCCGCCCCTAACGGTCGCCCGTCTCTCAGCCAATCAGCGCCCCGCATCCCCAAATTCAAACACCTCATTTGCATATTAACGCGCACAAAAAGTTTGAGGTATATTATTGATGATGG
曲美單抗VL (SEQ ID NO:16)
曲美單抗VH (SEQ ID NO:17)
曲美單抗VH CDR1 (SEQ ID NO:18)
曲美單抗VH CDR2 (SEQ ID NO:19)
曲美單抗VH CDR3 (SEQ ID NO:20)
曲美單抗VL CDR1 (SEQ ID NO:21)
曲美單抗VL CDR2 (SEQ ID NO:22)
曲美單抗VL CDR3 (SEQ ID NO:23)
德瓦魯單抗(MEDI4736) VL (SEQ ID NO:24)
MEDI4736 VH (SEQ ID NO:25)
MEDI4736 VH CDR1 (SEQ ID NO:26)
MEDI4736 VH CDR2 (SEQ ID NO:27)
MEDI4736 VH CDR3 (SEQ ID NO:28)
MEDI4736 VL CDR1 (SEQ ID NO:29)
MEDI4736 VL CDR2 (SEQ ID NO:30)
MEDI4736 VL CDR3 (SEQ ID NO:31)
UbA76-25merPDTT核苷酸(SEQ ID NO:32)
UbA76-25merPDTT多肽(SEQ ID NO:33)
MAG-25merPDTT核苷酸(SEQ ID NO:34)
MAG-25merPDTT多肽(SEQ ID NO:35)
Ub7625merPDTT_NoSFL核苷酸(SEQ ID NO:36)
Ub7625merPDTT_NoSFL多肽(SEQ ID NO:37)
ChAdV68.5WTnt.MAG25mer (SEQ ID NO:2)；缺失E1 (nt 577至3403)及E3 (nt 27,125-31,825)序列之AC_000011.1；相應ATCC VR-594核苷酸在五個位置處經取代；插入處於CMV啟動子/強化子控制下之模型新抗原卡匣代替缺失之E1；卡匣3'具有SV40 polyA
委內瑞拉馬腦炎病毒[VEE] (SEQ ID NO:3) GenBank: L01442.2
VEE-MAG25mer (SEQ ID NO:4)；含有MAG-25merPDTT核苷酸(鹼基30-1755)
委內瑞拉馬腦炎病毒病毒株TC-83 [TC-83](SEQ ID NO:5) GenBank: L01443.1
VEE遞送載體(SEQ ID NO:6)；缺失核苷酸7544-11175 [α病毒結構蛋白移除]之VEE基因組
TC-83遞送載體(SEQ ID NO:7)；缺失核苷酸7544-11175 [α病毒結構蛋白移除]之TC-83基因組
VEE產生載體(SEQ ID NO: 8)；缺失核苷酸7544-11175、添加5' T7啟動子、添加3'限制性位點之VEE基因組
TC-83產生載體(SEQ ID NO: 9)；缺失核苷酸7544-11175、添加5' T7啟動子、添加3'限制性位點之TC-83基因組
VEE-UbAAY (SEQ ID NO:14)；插入I類MHC小鼠腫瘤抗原決定基SIINFEKL及AH1-A5之VEE遞送載體
VEE-螢光素酶(SEQ ID NO: 15)；在7545處插入螢光素酶基因之VEE遞送載體
泛素(SEQ ID NO:38)＞UbG76 0-228
泛素A76 (SEQ ID NO:39)＞UbA76 0-228
HLA-A2 (MHC I類)信號肽(SEQ ID NO:40)＞MHC SignalPep 0-78
HLA-A2 (MHC I類)反式膜結構域(SEQ ID NO:41)＞HLA A2 TM結構域0-201
IgK前導序列(SEQ ID NO:42)＞IgK前導序列0-60
人類DC-Lamp (SEQ ID NO:43)＞人類DCLAMP 0-3178
小鼠LAMP1 (SEQ ID NO:44)＞小鼠Lamp1 0-1858
人類Lamp1 cDNA (SEQ ID NO:45)＞人類Lamp1 0-2339
破傷風類毒素核酸序列(SEQ ID NO:46)
破傷風類毒素胺基酸序列(SEQ ID NO:47)
PADRE核苷酸序列(SEQ ID NO:48)
PADRE胺基酸序列(SEQ ID NO:49)
WPRE (SEQ ID NO:50)＞WPRE 0-593
IRES (SEQ ID NO:51)＞eGFP_IRES_SEAP_插入1746-2335
GFP (SEQ ID NO:52)
SEAP (SEQ ID NO:53)
螢火蟲螢光素酶(SEQ ID NO:54)
FMDV 2A (SEQ ID NO:55)
ChAdV68-MAG-E4缺失(SEQ ID NO: 57)
CATCaTCAATAATATACCTCAAACTTTTTGTGCGCGTTAATATGCAAATGAGGCGTTTGAATTTGGGGAGGAAGGGCGGTGATTGGTCGAGGGATGAGCGACCGTTAGGGGCGGGGCGAGTGACGTTTTGATGACGTGGTTGCGAGGAGGAGCCAGTTTGCAAGTTCTCGTGGGAAAAGTGACGTCAAACGAGGTGTGGTTTGAACACGGAAATACTCAATTTTCCCGCGCTCTCTGACAGGAAATGAGGTGTTTCTGGGCGGATGCAAGTGAAAACGGGCCATTTTCGCGCGAAAACTGAATGAGGAAGTGAAAATCTGAGTAATTTCGCGTTTATGGCAGGGAGGAGTATTTGCCGAGGGCCGAGTAGACTTTGACCGATTACGTGGGGGTTTCGATTACCGTGTTTTTCACCTAAATTTCCGCGTACGGTGTCAAAGTCCGGTGTTTTTACGTAGGTGTCAGCTGATCGCCAGGGTATTTAAACCTGCGCTCTCCAGTCAAGAGGCCACTCTTGAGTGCCAGCGAGAAGAGTTTTCTCCTCCGCGCCGCGAGTCAGATCTACACTTTGAAAGTAGGGATAACAGGGTAATgacattgattattgactagttGttaaTAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTCCGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTACGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGgTGATGCGGTTTTGGCAGTACACCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAATAACCCCGCCCCGTTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAgcTCGTTTAGTGAACCGTCAGATCGCCTGGAACGCCATCCACGCTGTTTTGACCTCCATAGAAGACAGCGATCGCGccaccATGGCCGGGATGTTCCAGGCACTGTCCGAAGGCTGCACACCCTATGATATTAACCAGATGCTGAATGTCCTGGGAGACCACCAGGTCTCTGGCCTGGAGCAGCTGGAGAGCATCATCAACTTCGAGAAGCTGACCGAGTGGACAAGCTCCAATGTGATGCCTATCCTGTCCCCACTGACCAAGGGCATCCTGGGCTTCGTGTTTACCCTGACAGTGCCTTCTGAGCGGGGCCTGTCTTGCATCAGCGAGGCAGACGCAACCACACCAGAGTCCGCCAATCTGGGCGAGGAGATCCTGTCTCAGCTGTACCTGTGGCCCCGGGTGACATATCACTCCCCTTCTTACGCCTATCACCAGTTCGAGCGGAGAGCCAAGTACAAGAGACACTTCCCAGGCTTTGGCCAGTCTCTGCTGTTCGGCTACCCCGTGTACGTGTTCGGCGATTGCGTGCAGGGCGACTGGGATGCCATCCGGTTTAGATACTGCGCACCACCTGGATATGCACTGCTGAGGTGTAACGACACCAATTATTCCGCCCTGCTGGCAGTGGGCGCCCTGGAGGGCCCTCGCAATCAGGATTGGCTGGGCGTGCCAAGGCAGCTGGTGACACGCATGCAGGCCATCCAGAACGCAGGCCTGTGCACCCTGGTGGCAATGCTGGAGGAGACAATCTTCTGGCTGCAGGCCTTTCTGATGGCCCTGACCGACAGCGGCCCCAAGACAAACATCATCGTGGATTCCCAGTACGTGATGGGCATCTCCAAGCCTTCTTTCCAGGAGTTTGTGGACTGGGAGAACGTGAGCCCAGAGCTGAATTCCACCGATCAGCCATTCTGGCAGGCAGGAATCCTGGCAAGGAACCTGGTGCCTATGGTGGCCACAGTGCAGGGCCAGAATCTGAAGTACCAGGGCCAGAGCCTGGTCATCAGCGCCTCCATCATCGTGTTTAACCTGCTGGAGCTGGAGGGCGACTATCGGGACGATGGCAACGTGTGGGTGCACACCCCACTGAGCCCCAGAACACTGAACGCCTGGGTGAAGGCCGTGGAGGAGAAGAAGGGCATCCCAGTGCACCTGGAGCTGGCCTCCATGACCAATATGGAGCTGATGTCTAGCATCGTGCACCAGCAGGTGAGGACATACGGACCCGTGTTCATGTGCCTGGGAGGCCTGCTGACCATGGTGGCAGGAGCCGTGTGGCTGACAGTGCGGGTGCTGGAGCTGTTCAGAGCCGCCCAGCTGGCCAACGATGTGGTGCTGCAGATCATGGAGCTGTGCGGAGCAGCCTTTCGCCAGGTGTGCCACACCACAGTGCCATGGCCCAATGCCTCCCTGACCCCCAAGTGGAACAATGAGACAACACAGCCTCAGATCGCCAACTGTAGCGTGTACGACTTCTTCGTGTGGCTGCACTACTATAGCGTGAGGGATACCCTGTGGCCCCGCGTGACATACCACATGAATAAGTACGCCTATCACATGCTGGAGAGGCGCGCCAAGTATAAGAGAGGCCCTGGCCCAGGCGCAAAGTTTGTGGCAGCATGGACCCTGAAGGCCGCCGCCGGCCCCGGCCCCGGCCAGTATATCAAGGCTAACAGTAAGTTCATTGGAATCACAGAGCTGGGACCCGGACCTGGATAATGAGTTTAAACTCCCATTTAAATGTGAGGGTTAATGCTTCGAGCAGACATGATAAGATACATTGATGAGTTTGGACAAACCACAACTAGAATGCAGTGAAAAAAATGCTTTATTTGTGAAATTTGTGATGCTATTGCTTTATTTGTAACCATTATAAGCTGCAATAAACAAGTTAACAACAACAATTGCATTCATTTTATGTTTCAGGTTCAGGGGGAGATGTGGGAGGTTTTTTAAAGCAAGTAAAACCTCTACAAATGTGGTAAAATAACTATAACGGTCCTAAGGTAGCGAGTGAGTAGTGTTCTGGGGCGGGGGAGGACCTGCATGAGGGCCAGAATAACTGAAATCTGTGCTTTTCTGTGTGTTGCAGCAGCATGAGCGGAAGCGGCTCCTTTGAGGGAGGGGTATTCAGCCCTTATCTGACGGGGCGTCTCCCCTCCTGGGCGGGAGTGCGTCAGAATGTGATGGGATCCACGGTGGACGGCCGGCCCGTGCAGCCCGCGAACTCTTCAACCCTGACCTATGCAACCCTGAGCTCTTCGTCGTTGGACGCAGCTGCCGCCGCAGCTGCTGCATCTGCCGCCAGCGCCGTGCGCGGAATGGCCATGGGCGCCGGCTACTACGGCACTCTGGTGGCCAACTCGAGTTCCACCAATAATCCCGCCAGCCTGAACGAGGAGAAGCTGTTGCTGCTGATGGCCCAGCTCGAGGCCTTGACCCAGCGCCTGGGCGAGCTGACCCAGCAGGTGGCTCAGCTGCAGGAGCAGACGCGGGCCGCGGTTGCCACGGTGAAATCCAAATAAAAAATGAATCAATAAATAAACGGAGACGGTTGTTGATTTTAACACAGAGTCTGAATCTTTATTTGATTTTTCGCGCGCGGTAGGCCCTGGACCACCGGTCTCGATCATTGAGCACCCGGTGGATCTTTTCCAGGACCCGGTAGAGGTGGGCTTGGATGTTGAGGTACATGGGCATGAGCCCGTCCCGGGGGTGGAGGTAGCTCCATTGCAGGGCCTCGTGCTCGGGGGTGGTGTTGTAAATCACCCAGTCATAGCAGGGGCGCAGGGCATGGTGTTGCACAATATCTTTGAGGAGGAGACTGATGGCCACGGGCAGCCCTTTGGTGTAGGTGTTTACAAATCTGTTGAGCTGGGAGGGATGCATGCGGGGGGAGATGAGGTGCATCTTGGCCTGGATCTTGAGATTGGCGATGTTACCGCCCAGATCCCGCCTGGGGTTCATGTTGTGCAGGACCACCAGCACGGTGTATCCGGTGCACTTGGGGAATTTATCATGCAACTTGGAAGGGAAGGCGTGAAAGAATTTGGCGACGCCTTTGTGCCCGCCCAGGTTTTCCATGCACTCATCCATGATGATGGCGATGGGCCCGTGGGCGGCGGCCTGGGCAAAGACGTTTCGGGGGTCGGACACATCATAGTTGTGGTCCTGGGTGAGGTCATCATAGGCCATTTTAATGAATTTGGGGCGGAGGGTGCCGGACTGGGGGACAAAGGTtCCCTCGATCCCGGGGGCGTAGTTCCCCTCACAGATCTGCATCTCCCAGGCTTTGAGCTCGGAGGGGGGGATCATGTCCACCTGCGGGGCGATAAAGAACACGGTTTCCGGGGCGGGGGAGATGAGCTGGGCCGAAAGCAAGTTCCGGAGCAGCTGGGACTTGCCGCAGCCGGTGGGGCCGTAGATGACCCCGATGACCGGCTGCAGGTGGTAGTTGAGGGAGAGACAGCTGCCGTCCTCCCGGAGGAGGGGGGCCACCTCGTTCATCATCTCGCGCACGTGCATGTTCTCGCGCACCAGTTCCGCCAGGAGGCGCTCTCCCCCCAGGGATAGGAGCTCCTGGAGCGAGGCGAAGTTTTTCAGCGGCTTGAGTCCGTCGGCCATGGGCATTTTGGAGAGGGTTTGTTGCAAGAGTTCCAGGCGGTCCCAGAGCTCGGTGATGTGCTCTACGGCATCTCGATCCAGCAGACCTCCTCGTTTCGCGGGTTGGGACGGCTGCGGGAGTAGGGCACCAGACGATGGGCGTCCAGCGCAGCCAGGGTCCGGTCCTTCCAGGGTCGCAGCGTCCGCGTCAGGGTGGTCTCCGTCACGGTGAAGGGGTGCGCGCCGGGCTGGGCGCTTGCGAGGGTGCGCTTCAGGCTCATCCGGCTGGTCGAAAACCGCTCCCGATCGGCGCCCTGCGCGTCGGCCAGGTAGCAATTGACCATGAGTTCGTAGTTGAGCGCCTCGGCCGCGTGGCCTTTGGCGCGGAGCTTACCTTTGGAAGTCTGCCCGCAGGCGGGACAGAGGAGGGACTTGAGGGCGTAGAGCTTGGGGGCGAGGAAGACGGACTCGGGGGCGTAGGCGTCCGCGCCGCAGTGGGCGCAGACGGTCTCGCACTCCACGAGCCAGGTGAGGTCGGGCTGGTCGGGGTCAAAAACCAGTTTCCCGCCGTTCTTTTTGATGCGTTTCTTACCTTTGGTCTCCATGAGCTCGTGTCCCCGCTGGGTGACAAAGAGGCTGTCCGTGTCCCCGTAGACCGACTTTATGGGCCGGTCCTCGAGCGGTGTGCCGCGGTCCTCCTCGTAGAGGAACCCCGCCCACTCCGAGACGAAAGCCCGGGTCCAGGCCAGCACGAAGGAGGCCACGTGGGACGGGTAGCGGTCGTTGTCCACCAGCGGGTCCACCTTTTCCAGGGTATGCAAACACATGTCCCCCTCGTCCACATCCAGGAAGGTGATTGGCTTGTAAGTGTAGGCCACGTGACCGGGGGTCCCGGCCGGGGGGGTATAAAAGGGTGCGGGTCCCTGCTCGTCCTCACTGTCTTCCGGATCGCTGTCCAGGAGCGCCAGCTGTTGGGGTAGGTATTCCCTCTCGAAGGCGGGCATGACCTCGGCACTCAGGTTGTCAGTTTCTAGAAACGAGGAGGATTTGATATTGACGGTGCCGGCGGAGATGCCTTTCAAGAGCCCCTCGTCCATCTGGTCAGAAAAGACGATCTTTTTGTTGTCGAGCTTGGTGGCGAAGGAGCCGTAGAGGGCGTTGGAGAGGAGCTTGGCGATGGAGCGCATGGTCTGGTTTTTTTCCTTGTCGGCGCGCTCCTTGGCGGCGATGTTGAGCTGCACGTACTCGCGCGCCACGCACTTCCATTCGGGGAAGACGGTGGTCAGCTCGTCGGGCACGATTCTGACCTGCCAGCCCCGATTATGCAGGGTGATGAGGTCCACACTGGTGGCCACCTCGCCGCGCAGGGGCTCATTAGTCCAGCAGAGGCGTCCGCCCTTGCGCGAGCAGAAGGGGGGCAGGGGGTCCAGCATGACCTCGTCGGGGGGGTCGGCATCGATGGTGAAGATGCCGGGCAGGAGGTCGGGGTCAAAGTAGCTGATGGAAGTGGCCAGATCGTCCAGGGCAGCTTGCCATTCGCGCACGGCCAGCGCGCGCTCGTAGGGACTGAGGGGCGTGCCCCAGGGCATGGGATGGGTAAGCGCGGAGGCGTACATGCCGCAGATGTCGTAGACGTAGAGGGGCTCCTCGAGGATGCCGATGTAGGTGGGGTAGCAGCGCCCCCCGCGGATGCTGGCGCGCACGTAGTCATACAGCTCGTGCGAGGGGGCGAGGAGCCCCGGGCCCAGGTTGGTGCGACTGGGCTTTTCGGCGCGGTAGACGATCTGGCGGAAAATGGCATGCGAGTTGGAGGAGATGGTGGGCCTTTGGAAGATGTTGAAGTGGGCGTGGGGCAGTCCGACCGAGTCGCGGATGAAGTGGGCGTAGGAGTCTTGCAGCTTGGCGACGAGCTCGGCGGTGACTAGGACGTCCAGAGCGCAGTAGTCGAGGGTCTCCTGGATGATGTCATACTTGAGCTGTCCCTTTTGTTTCCACAGCTCGCGGTTGAGAAGGAACTCTTCGCGGTCCTTCCAGTACTCTTCGAGGGGGAACCCGTCCTGATCTGCACGGTAAGAGCCTAGCATGTAGAACTGGTTGACGGCCTTGTAGGCGCAGCAGCCCTTCTCCACGGGGAGGGCGTAGGCCTGGGCGGCCTTGCGCAGGGAGGTGTGCGTGAGGGCGAAAGTGTCCCTGACCATGACCTTGAGGAACTGGTGCTTGAAGTCGATATCGTCGCAGCCCCCCTGCTCCCAGAGCTGGAAGTCCGTGCGCTTCTTGTAGGCGGGGTTGGGCAAAGCGAAAGTAACATCGTTGAAGAGGATCTTGCCCGCGCGGGGCATAAAGTTGCGAGTGATGCGGAAAGGTTGGGGCACCTCGGCCCGGTTGTTGATGACCTGGGCGGCGAGCACGATCTCGTCGAAGCCGTTGATGTTGTGGCCCACGATGTAGAGTTCCACGAATCGCGGACGGCCCTTGACGTGGGGCAGTTTCTTGAGCTCCTCGTAGGTGAGCTCGTCGGGGTCGCTGAGCCCGTGCTGCTCGAGCGCCCAGTCGGCGAGATGGGGGTTGGCGCGGAGGAAGGAAGTCCAGAGATCCACGGCCAGGGCGGTTTGCAGACGGTCCCGGTACTGACGGAACTGCTGCCCGACGGCCATTTTTTCGGGGGTGACGCAGTAGAAGGTGCGGGGGTCCCCGTGCCAGCGATCCCATTTGAGCTGGAGGGCGAGATCGAGGGCGAGCTCGACGAGCCGGTCGTCCCCGGAGAGTTTCATGACCAGCATGAAGGGGACGAGCTGCTTGCCGAAGGACCCCATCCAGGTGTAGGTTTCCACATCGTAGGTGAGGAAGAGCCTTTCGGTGCGAGGATGCGAGCCGATGGGGAAGAACTGGATCTCCTGCCACCAATTGGAGGAATGGCTGTTGATGTGATGGAAGTAGAAATGCCGACGGCGCGCCGAACACTCGTGCTTGTGTTTATACAAGCGGCCACAGTGCTCGCAACGCTGCACGGGATGCACGTGCTGCACGAGCTGTACCTGAGTTCCTTTGACGAGGAATTTCAGTGGGAAGTGGAGTCGTGGCGCCTGCATCTCGTGCTGTACTACGTCGTGGTGGTCGGCCTGGCCCTCTTCTGCCTCGATGGTGGTCATGCTGACGAGCCCGCGCGGGAGGCAGGTCCAGACCTCGGCGCGAGCGGGTCGGAGAGCGAGGACGAGGGCGCGCAGGCCGGAGCTGTCCAGGGTCCTGAGACGCTGCGGAGTCAGGTCAGTGGGCAGCGGCGGCGCGCGGTTGACTTGCAGGAGTTTTTCCAGGGCGCGCGGGAGGTCCAGATGGTACTTGATCTCCACCGCGCCATTGGTGGCGACGTCGATGGCTTGCAGGGTCCCGTGCCCCTGGGGTGTGACCACCGTCCCCCGTTTCTTCTTGGGCGGCTGGGGCGACGGGGGCGGTGCCTCTTCCATGGTTAGAAGCGGCGGCGAGGACGCGCGCCGGGCGGCAGGGGCGGCTCGGGGCCCGGAGGCAGGGGCGGCAGGGGCACGTCGGCGCCGCGCGCGGGTAGGTTCTGGTACTGCGCCCGGAGAAGACTGGCGTGAGCGACGACGCGACGGTTGACGTCCTGGATCTGACGCCTCTGGGTGAAGGCCACGGGACCCGTGAGTTTGAACCTGAAAGAGAGTTCGACAGAATCAATCTCGGTATCGTTGACGGCGGCCTGCCGCAGGATCTCTTGCACGTCGCCCGAGTTGTCCTGGTAGGCGATCTCGGTCATGAACTGCTCGATCTCCTCCTCTTGAAGGTCTCCGCGGCCGGCGCGCTCCACGGTGGCCGCGAGGTCGTTGGAGATGCGGCCCATGAGCTGCGAGAAGGCGTTCATGCCCGCCTCGTTCCAGACGCGGCTGTAGACCACGACGCCCTCGGGATCGCgGGCGCGCATGACCACCTGGGCGAGGTTGAGCTCCACGTGGCGCGTGAAGACCGCGTAGTTGCAGAGGCGCTGGTAGAGGTAGTTGAGCGTGGTGGCGATGTGCTCGGTGACGAAGAAATACATGATCCAGCGGCGGAGCGGCATCTCGCTGACGTCGCCCAGCGCCTCCAAACGTTCCATGGCCTCGTAAAAGTCCACGGCGAAGTTGAAAAACTGGGAGTTGCGCGCCGAGACGGTCAACTCCTCCTCCAGAAGACGGATGAGCTCGGCGATGGTGGCGCGCACCTCGCGCTCGAAGGCCCCCGGGAGTTCCTCCACTTCCTCTTCTTCCTCCTCCACTAACATCTCTTCTACTTCCTCCTCAGGCGGCAGTGGTGGCGGGGGAGGGGGCCTGCGTCGCCGGCGGCGCACGGGCAGACGGTCGATGAAGCGCTCGATGGTCTCGCCGCGCCGGCGTCGCATGGTCTCGGTGACGGCGCGCCCGTCCTCGCGGGGCCGCAGCGTGAAGACGCCGCCGCGCATCTCCAGGTGGCCGGGGGGGTCCCCGTTGGGCAGGGAGAGGGCGCTGACGATGCATCTTATCAATTGCCCCGTAGGGACTCCGCGCAAGGACCTGAGCGTCTCGAGATCCACGGGATCTGAAAACCGCTGAACGAAGGCTTCGAGCCAGTCGCAGTCGCAAGGTAGGCTGAGCACGGTTTCTTCTGGCGGGTCATGTTGGTTGGGAGCGGGGCGGGCGATGCTGCTGGTGATGAAGTTGAAATAGGCGGTTCTGAGACGGCGGATGGTGGCGAGGAGCACCAGGTCTTTGGGCCCGGCTTGCTGGATGCGCAGACGGTCGGCCATGCCCCAGGCGTGGTCCTGACACCTGGCCAGGTCCTTGTAGTAGTCCTGCATGAGCCGCTCCACGGGCACCTCCTCCTCGCCCGCGCGGCCGTGCATGCGCGTGAGCCCGAAGCCGCGCTGGGGCTGGACGAGCGCCAGGTCGGCGACGACGCGCTCGGCGAGGATGGCTTGCTGGATCTGGGTGAGGGTGGTCTGGAAGTCATCAAAGTCGACGAAGCGGTGGTAGGCTCCGGTGTTGATGGTGTAGGAGCAGTTGGCCATGACGGACCAGTTGACGGTCTGGTGGCCCGGACGCACGAGCTCGTGGTACTTGAGGCGCGAGTAGGCGCGCGTGTCGAAGATGTAGTCGTTGCAGGTGCGCACCAGGTACTGGTAGCCGATGAGGAAGTGCGGCGGCGGCTGGCGGTAGAGCGGCCATCGCTCGGTGGCGGGGGCGCCGGGCGCGAGGTCCTCGAGCATGGTGCGGTGGTAGCCGTAGATGTACCTGGACATCCAGGTGATGCCGGCGGCGGTGGTGGAGGCGCGCGGGAACTCGCGGACGCGGTTCCAGATGTTGCGCAGCGGCAGGAAGTAGTTCATGGTGGGCACGGTCTGGCCCGTGAGGCGCGCGCAGTCGTGGATGCTCTATACGGGCAAAAACGAAAGCGGTCAGCGGCTCGACTCCGTGGCCTGGAGGCTAAGCGAACGGGTTGGGCTGCGCGTGTACCCCGGTTCGAATCTCGAATCAGGCTGGAGCCGCAGCTAACGTGGTATTGGCACTCCCGTCTCGACCCAAGCCTGCACCAACCCTCCAGGATACGGAGGCGGGTCGTTTTGCAACTTTTTTTTGGAGGCCGGATGAGACTAGTAAGCGCGGAAAGCGGCCGACCGCGATGGCTCGCTGCCGTAGTCTGGAGAAGAATCGCCAGGGTTGCGTTGCGGTGTGCCCCGGTTCGAGGCCGGCCGGATTCCGCGGCTAACGAGGGCGTGGCTGCCCCGTCGTTTCCAAGACCCCATAGCCAGCCGACTTCTCCAGTTACGGAGCGAGCCCCTCTTTTGTTTTGTTTGTTTTTGCCAGATGCATCCCGTACTGCGGCAGATGCGCCCCCACCACCCTCCACCGCAACAACAGCCCCCTCCACAGCCGGCGCTTCTGCCCCCGCCCCAGCAGCAACTTCCAGCCACGACCGCCGCGGCCGCCGTGAGCGGGGCTGGACAGAGTTATGATCACCAGCTGGCCTTGGAAGAGGGCGAGGGGCTGGCGCGCCTGGGGGCGTCGTCGCCGGAGCGGCACCCGCGCGTGCAGATGAAAAGGGACGCTCGCGAGGCCTACGTGCCCAAGCAGAACCTGTTCAGAGACAGGAGCGGCGAGGAGCCCGAGGAGATGCGCGCGGCCCGGTTCCACGCGGGGCGGGAGCTGCGGCGCGGCCTGGACCGAAAGAGGGTGCTGAGGGACGAGGATTTCGAGGCGGACGAGCTGACGGGGATCAGCCCCGCGCGCGCGCACGTGGCCGCGGCCAACCTGGTCACGGCGTACGAGCAGACCGTGAAGGAGGAGAGCAACTTCCAAAAATCCTTCAACAACCACGTGCGCACCCTGATCGCGCGCGAGGAGGTGACCCTGGGCCTGATGCACCTGTGGGACCTGCTGGAGGCCATCGTGCAGAACCCCACCAGCAAGCCGCTGACGGCGCAGCTGTTCCTGGTGGTGCAGCATAGTCGGGACAACGAAGCGTTCAGGGAGGCGCTGCTGAATATCACCGAGCCCGAGGGCCGCTGGCTCCTGGACCTGGTGAACATTCTGCAGAGCATCGTGGTGCAGGAGCGCGGGCTGCCGCTGTCCGAGAAGCTGGCGGCCATCAACTTCTCGGTGCTGAGTTTGGGCAAGTACTACGCTAGGAAGATCTACAAGACCCCGTACGTGCCCATAGACAAGGAGGTGAAGATCGACGGGTTTTACATGCGCATGACCCTGAAAGTGCTGACCCTGAGCGACGATCTGGGGGTGTACCGCAACGACAGGATGCACCGTGCGGTGAGCGCCAGCAGGCGGCGCGAGCTGAGCGACCAGGAGCTGATGCATAGTCTGCAGCGGGCCCTGACCGGGGCCGGGACCGAGGGGGAGAGCTACTTTGACATGGGCGCGGACCTGCACTGGCAGCCCAGCCGCCGGGCCTTGGAGGCGGCGGCAGGACCCTACGTAGAAGAGGTGGACGATGAGGTGGACGAGGAGGGCGAGTACCTGGAAGACTGATGGCGCGACCGTATTTTTGCTAGATGCAACAACAACAGCCACCTCCTGATCCCGCGATGCGGGCGGCGCTGCAGAGCCAGCCGTCCGGCATTAACTCCTCGGACGATTGGACCCAGGCCATGCAACGCATCATGGCGCTGACGACCCGCAACCCCGAAGCCTTTAGACAGCAGCCCCAGGCCAACCGGCTCTCGGCCATCCTGGAGGCCGTGGTGCCCTCGCGCTCCAACCCCACGCACGAGAAGGTCCTGGCCATCGTGAACGCGCTGGTGGAGAACAAGGCCATCCGCGGCGACGAGGCCGGCCTGGTGTACAACGCGCTGCTGGAGCGCGTGGCCCGCTACAACAGCACCAACGTGCAGACCAACCTGGACCGCATGGTGACCGACGTGCGCGAGGCCGTGGCCCAGCGCGAGCGGTTCCACCGCGAGTCCAACCTGGGATCCATGGTGGCGCTGAACGCCTTCCTCAGCACCCAGCCCGCCAACGTGCCCCGGGGCCAGGAGGACTACACCAACTTCATCAGCGCCCTGCGCCTGATGGTGACCGAGGTGCCCCAGAGCGAGGTGTACCAGTCCGGGCCGGACTACTTCTTCCAGACCAGTCGCCAGGGCTTGCAGACCGTGAACCTGAGCCAGGCTTTCAAGAACTTGCAGGGCCTGTGGGGCGTGCAGGCCCCGGTCGGGGACCGCGCGACGGTGTCGAGCCTGCTGACGCCGAACTCGCGCCTGCTGCTGCTGCTGGTGGCCCCCTTCACGGACAGCGGCAGCATCAACCGCAACTCGTACCTGGGCTACCTGATTAACCTGTACCGCGAGGCCATCGGCCAGGCGCACGTGGACGAGCAGACCTACCAGGAGATCACCCACGTGAGCCGCGCCCTGGGCCAGGACGACCCGGGCAACCTGGAAGCCACCCTGAACTTTTTGCTGACCAACCGGTCGCAGAAGATCCCGCCCCAGTACGCGCTCAGCACCGAGGAGGAGCGCATCCTGCGTTACGTGCAGCAGAGCGTGGGCCTGTTCCTGATGCAGGAGGGGGCCACCCCCAGCGCCGCGCTCGACATGACCGCGCGCAACATGGAGCCCAGCATGTACGCCAGCAACCGCCCGTTCATCAATAAACTGATGGACTACTTGCATCGGGCGGCCGCCATGAACTCTGACTATTTCACCAACGCCATCCTGAATCCCCACTGGCTCCCGCCGCCGGGGTTCTACACGGGCGAGTACGACATGCCCGACCCCAATGACGGGTTCCTGTGGGACGATGTGGACAGCAGCGTGTTCTCCCCCCGACCGGGTGCTAACGAGCGCCCCTTGTGGAAGAAGGAAGGCAGCGACCGACGCCCGTCCTCGGCGCTGTCCGGCCGCGAGGGTGCTGCCGCGGCGGTGCCCGAGGCCGCCAGTCCTTTCCCGAGCTTGCCCTTCTCGCTGAACAGTATCCGCAGCAGCGAGCTGGGCAGGATCACGCGCCCGCGCTTGCTGGGCGAAGAGGAGTACTTGAATGACTCGCTGTTGAGACCCGAGCGGGAGAAGAACTTCCCCAATAACGGGATAGAAAGCCTGGTGGACAAGATGAGCCGCTGGAAGACGTATGCGCAGGAGCACAGGGACGATCCCCGGGCGTCGCAGGGGGCCACGAGCCGGGGCAGCGCCGCCCGTAAACGCCGGTGGCACGACAGGCAGCGGGGACAGATGTGGGACGATGAGGACTCCGCCGACGACAGCAGCGTGTTGGACTTGGGTGGGAGTGGTAACCCGTTCGCTCACCTGCGCCCCCGTATCGGGCGCATGATGTAAGAGAAACCGAAAATAAATGATACTCACCAAGGCCATGGCGACCAGCGTGCGTTCGTTTCTTCTCTGTTGTTGTTGTATCTAGTATGATGAGGCGTGCGTACCCGGAGGGTCCTCCTCCCTCGTACGAGAGCGTGATGCAGCAGGCGATGGCGGCGGCGGCGATGCAGCCCCCGCTGGAGGCTCCTTACGTGCCCCCGCGGTACCTGGCGCCTACGGAGGGGCGGAACAGCATTCGTTACTCGGAGCTGGCACCCTTGTACGATACCACCCGGTTGTACCTGGTGGACAACAAGTCGGCGGACATCGCCTCGCTGAACTACCAGAACGACCACAGCAACTTCCTGACCACCGTGGTGCAGAACAATGACTTCACCCCCACGGAGGCCAGCACCCAGACCATCAACTTTGACGAGCGCTCGCGGTGGGGCGGCCAGCTGAAAACCATCATGCACACCAACATGCCCAACGTGAACGAGTTCATGTACAGCAACAAGTTCAAGGCGCGGGTGATGGTCTCCCGCAAGACCCCCAATGGGGTGACAGTGACAGAGGATTATGATGGTAGTCAGGATGAGCTGAAGTATGAATGGGTGGAATTTGAGCTGCCCGAAGGCAACTTCTCGGTGACCATGACCATCGACCTGATGAACAACGCCATCATCGACAATTACTTGGCGGTGGGGCGGCAGAACGGGGTGCTGGAGAGCGACATCGGCGTGAAGTTCGACACTAGGAACTTCAGGCTGGGCTGGGACCCCGTGACCGAGCTGGTCATGCCCGGGGTGTACACCAACGAGGCTTTCCATCCCGATATTGTCTTGCTGCCCGGCTGCGGGGTGGACTTCACCGAGAGCCGCCTCAGCAACCTGCTGGGCATTCGCAAGAGGCAGCCCTTCCAGGAAGGCTTCCAGATCATGTACGAGGATCTGGAGGGGGGCAACATCCCCGCGCTCCTGGATGTCGACGCCTATGAGAAAAGCAAGGAGGATGCAGCAGCTGAAGCAACTGCAGCCGTAGCTACCGCCTCTACCGAGGTCAGGGGCGATAATTTTGCAAGCGCCGCAGCAGTGGCAGCGGCCGAGGCGGCTGAAACCGAAAGTAAGATAGTCATTCAGCCGGTGGAGAAGGATAGCAAGAACAGGAGCTACAACGTACTACCGGACAAGATAAACACCGCCTACCGCAGCTGGTACCTAGCCTACAACTATGGCGACCCCGAGAAGGGCGTGCGCTCCTGGACGCTGCTCACCACCTCGGACGTCACCTGCGGCGTGGAGCAAGTCTACTGGTCGCTGCCCGACATGATGCAAGACCCGGTCACCTTCCGCTCCACGCGTCAAGTTAGCAACTACCCGGTGGTGGGCGCCGAGCTCCTGCCCGTCTACTCCAAGAGCTTCTTCAACGAGCAGGCCGTCTACTCGCAGCAGCTGCGCGCCTTCACCTCGCTTACGCACGTCTTCAACCGCTTCCCCGAGAACCAGATCCTCGTCCGCCCGCCCGCGCCCACCATTACCACCGTCAGTGAAAACGTTCCTGCTCTCACAGATCACGGGACCCTGCCGCTGCGCAGCAGTATCCGGGGAGTCCAGCGCGTGACCGTTACTGACGCCAGACGCCGCACCTGCCCCTACGTCTACAAGGCCCTGGGCATAGTCGCGCCGCGCGTCCTCTCGAGCCGCACCTTCTAAATGTCCATTCTCATCTCGCCCAGTAATAACACCGGTTGGGGCCTGCGCGCGCCCAGCAAGATGTACGGAGGCGCTCGCCAACGCTCCACGCAACACCCCGTGCGCGTGCGCGGGCACTTCCGCGCTCCCTGGGGCGCCCTCAAGGGCCGCGTGCGGTCGCGCACCACCGTCGACGACGTGATCGACCAGGTGGTGGCCGACGCGCGCAACTACACCCCCGCCGCCGCGCCCGTCTCCACCGTGGACGCCGTCATCGACAGCGTGGTGGCcGACGCGCGCCGGTACGCCCGCGCCAAGAGCCGGCGGCGGCGCATCGCCCGGCGGCACCGGAGCACCCCCGCCATGCGCGCGGCGCGAGCCTTGCTGCGCAGGGCCAGGCGCACGGGACGCAGGGCCATGCTCAGGGCGGCCAGACGCGCGGCTTCAGGCGCCAGCGCCGGCAGGACCCGGAGACGCGCGGCCACGGCGGCGGCAGCGGCCATCGCCAGCATGTCCCGCCCGCGGCGAGGGAACGTGTACTGGGTGCGCGACGCCGCCACCGGTGTGCGCGTGCCCGTGCGCACCCGCCCCCCTCGCACTTGAAGATGTTCACTTCGCGATGTTGATGTGTCCCAGCGGCGAGGAGGATGTCCAAGCGCAAATTCAAGGAAGAGATGCTCCAGGTCATCGCGCCTGAGATCTACGGCCCTGCGGTGGTGAAGGAGGAAAGAAAGCCCCGCAAAATCAAGCGGGTCAAAAAGGACAAAAAGGAAGAAGAAAGTGATGTGGACGGATTGGTGGAGTTTGTGCGCGAGTTCGCCCCCCGGCGGCGCGTGCAGTGGCGCGGGCGGAAGGTGCAACCGGTGCTGAGACCCGGCACCACCGTGGTCTTCACGCCCGGCGAGCGCTCCGGCACCGCTTCCAAGCGCTCCTACGACGAGGTGTACGGGGATGATGATATTCTGGAGCAGGCGGCCGAGCGCCTGGGCGAGTTTGCTTACGGCAAGCGCAGCCGTTCCGCACCGAAGGAAGAGGCGGTGTCCATCCCGCTGGACCACGGCAACCCCACGCCGAGCCTCAAGCCCGTGACCTTGCAGCAGGTGCTGCCGACCGCGGCGCCGCGCCGGGGGTTCAAGCGCGAGGGCGAGGATCTGTACCCCACCATGCAGCTGATGGTGCCCAAGCGCCAGAAGCTGGAAGACGTGCTGGAGACCATGAAGGTGGACCCGGACGTGCAGCCCGAGGTCAAGGTGCGGCCCATCAAGCAGGTGGCCCCGGGCCTGGGCGTGCAGACCGTGGACATCAAGATTCCCACGGAGCCCATGGAAACGCAGACCGAGCCCATGATCAAGCCCAGCACCAGCACCATGGAGGTGCAGACGGATCCCTGGATGCCATCGGCTCCTAGTCGAAGACCCCGGCGCAAGTACGGCGCGGCCAGCCTGCTGATGCCCAACTACGCGCTGCATCCTTCCATCATCCCCACGCCGGGCTACCGCGGCACGCGCTTCTACCGCGGTCATACCAGCAGCCGCCGCCGCAAGACCACCACTCGCCGCCGCCGTCGCCGCACCGCCGCTGCAACCACCCCTGCCGCCCTGGTGCGGAGAGTGTACCGCCGCGGCCGCGCACCTCTGACCCTGCCGCGCGCGCGCTACCACCCGAGCATCGCCATTTAAACTTTCGCCtGCTTTGCAGATCAATGGCCCTCACATGCCGCCTTCGCGTTCCCATTACGGGCTACCGAGGAAGAAAACCGCGCCGTAGAAGGCTGGCGGGGAACGGGATGCGTCGCCACCACCACCGGCGGCGGCGCGCCATCAGCAAGCGGTTGGGGGGAGGCTTCCTGCCCGCGCTGATCCCCATCATCGCCGCGGCGATCGGGGCGATCCCCGGCATTGCTTCCGTGGCGGTGCAGGCCTCTCAGCGCCACTGAGACACACTTGGAAACATCTTGTAATAAACCaATGGACTCTGACGCTCCTGGTCCTGTGATGTGTTTTCGTAGACAGATGGAAGACATCAATTTTTCGTCCCTGGCTCCGCGACACGGCACGCGGCCGTTCATGGGCACCTGGAGCGACATCGGCACCAGCCAACTGAACGGGGGCGCCTTCAATTGGAGCAGTCTCTGGAGCGGGCTTAAGAATTTCGGGTCCACGCTTAAAACCTATGGCAGCAAGGCGTGGAACAGCACCACAGGGCAGGCGCTGAGGGATAAGCTGAAAGAGCAGAACTTCCAGCAGAAGGTGGTCGATGGGCTCGCCTCGGGCATCAACGGGGTGGTGGACCTGGCCAACCAGGCCGTGCAGCGGCAGATCAACAGCCGCCTGGACCCGGTGCCGCCCGCCGGCTCCGTGGAGATGCCGCAGGTGGAGGAGGAGCTGCCTCCCCTGGACAAGCGGGGCGAGAAGCGACCCCGCCCCGATGCGGAGGAGACGCTGCTGACGCACACGGACGAGCCGCCCCCGTACGAGGAGGCGGTGAAACTGGGTCTGCCCACCACGCGGCCCATCGCGCCCCTGGCCACCGGGGTGCTGAAACCCGAAAAGCCCGCGACCCTGGACTTGCCTCCTCCCCAGCCTTCCCGCCCCTCTACAGTGGCTAAGCCCCTGCCGCCGGTGGCCGTGGCCCGCGCGCGACCCGGGGGCACCGCCCGCCCTCATGCGAACTGGCAGAGCACTCTGAACAGCATCGTGGGTCTGGGAGTGCAGAGTGTGAAGCGCCGCCGCTGCTATTAAACCTACCGTAGCGCTTAACTTGCTTGTCTGTGTGTGTATGTATTATGTCGCCGCCGCCGCTGTCCACCAGAAGGAGGAGTGAAGAGGCGCGTCGCCGAGTTGCAAGATGGCCACCCCATCGATGCTGCCCCAGTGGGCGTACATGCACATCGCCGGACAGGACGCTTCGGAGTACCTGAGTCCGGGTCTGGTGCAGTTTGCCCGCGCCACAGACACCTACTTCAGTCTGGGGAACAAGTTTAGGAACCCCACGGTGGCGCCCACGCACGATGTGACCACCGACCGCAGCCAGCGGCTGACGCTGCGCTTCGTGCCCGTGGACCGCGAGGACAACACCTACTCGTACAAAGTGCGCTACACGCTGGCCGTGGGCGACAACCGCGTGCTGGACATGGCCAGCACCTACTTTGACATCCGCGGCGTGCTGGATCGGGGCCCTAGCTTCAAACCCTACTCCGGCACCGCCTACAACAGTCTGGCCCCCAAGGGAGCACCCAACACTTGTCAGTGGACATATAAAGCCGATGGTGAAACTGCCACAGAAAAAACCTATACATATGGAAATGCACCCGTGCAGGGCATTAACATCACAAAAGATGGTATTCAACTTGGAACTGACACCGATGATCAGCCAATCTACGCAGATAAAACCTATCAGCCTGAACCTCAAGTGGGTGATGCTGAATGGCATGACATCACTGGTACTGATGAAAAGTATGGAGGCAGAGCTCTTAAGCCTGATACCAAAATGAAGCCTTGTTATGGTTCTTTTGCCAAGCCTACTAATAAAGAAGGAGGTCAGGCAAATGTGAAAACAGGAACAGGCACTACTAAAGAATATGACATAGACATGGCTTTCTTTGACAACAGAAGTGCGGCTGCTGCTGGCCTAGCTCCAGAAATTGTTTTGTATACTGAAAATGTGGATTTGGAAACTCCAGATACCCATATTGTATACAAAGCAGGCACAGATGACAGCAGCTCTTCTATTAATTTGGGTCAGCAAGCCATGCCCAACAGACCTAACTACATTGGTTTCAGAGACAACTTTATCGGGCTCATGTACTACAACAGCACTGGCAATATGGGGGTGCTGGCCGGTCAGGCTTCTCAGCTGAATGCTGTGGTTGACTTGCAAGACAGAAACACCGAGCTGTCCTACCAGCTCTTGCTTGACTCTCTGGGTGACAGAACCCGGTATTTCAGTATGTGGAATCAGGCGGTGGACAGCTATGATCCTGATGTGCGCATTATTGAAAATCATGGTGTGGAGGATGAACTTCCCAACTATTGTTTCCCTCTGGATGCTGTTGGCAGAACAGATACTTATCAGGGAATTAAGGCTAATGGAACTGATCAAACCACATGGACCAAAGATGACAGTGTCAATGATGCTAATGAGATAGGCAAGGGTAATCCATTCGCCATGGAAATCAACATCCAAGCCAACCTGTGGAGGAACTTCCTCTACGCCAACGTGGCCCTGTACCTGCCCGACTCTTACAAGTACACGCCGGCCAATGTTACCCTGCCCACCAACACCAACACCTACGATTACATGAACGGCCGGGTGGTGGCGCCCTCGCTGGTGGACTCCTACATCAACATCGGGGCGCGCTGGTCGCTGGATCCCATGGACAACGTGAACCCCTTCAACCACCACCGCAATGCGGGGCTGCGCTACCGCTCCATGCTCCTGGGCAACGGGCGCTACGTGCCCTTCCACATCCAGGTGCCCCAGAAATTTTTCGCCATCAAGAGCCTCCTGCTCCTGCCCGGGTCCTACACCTACGAGTGGAACTTCCGCAAGGACGTCAACATGATCCTGCAGAGCTCCCTCGGCAACGACCTGCGCACGGACGGGGCCTCCATCTCCTTCACCAGCATCAACCTCTACGCCACCTTCTTCCCCATGGCGCACAACACGGCCTCCACGCTCGAGGCCATGCTGCGCAACGACACCAACGACCAGTCCTTCAACGACTACCTCTCGGCGGCCAACATGCTCTACCCCATCCCGGCCAACGCCACCAACGTGCCCATCTCCATCCCCTCGCGCAACTGGGCCGCCTTCCGCGGCTGGTCCTTCACGCGTCTCAAGACCAAGGAGACGCCCTCGCTGGGCTCCGGGTTCGACCCCTACTTCGTCTACTCGGGCTCCATCCCCTACCTCGACGGCACCTTCTACCTCAACCACACCTTCAAGAAGGTCTCCATCACCTTCGACTCCTCCGTCAGCTGGCCCGGCAACGACCGGCTCCTGACGCCCAACGAGTTCGAAATCAAGCGCACCGTCGACGGCGAGGGCTACAACGTGGCCCAGTGCAACATGACCAAGGACTGGTTCCTGGTCCAGATGCTGGCCCACTACAACATCGGCTACCAGGGCTTCTACGTGCCCGAGGGCTACAAGGACCGCATGTACTCCTTCTTCCGCAACTTCCAGCCCATGAGCCGCCAGGTGGTGGACGAGGTCAACTACAAGGACTACCAGGCCGTCACCCTGGCCTACCAGCACAACAACTCGGGCTTCGTCGGCTACCTCGCGCCCACCATGCGCCAGGGCCAGCCCTACCCCGCCAACTACCCCTACCCGCTCATCGGCAAGAGCGCCGTCACCAGCGTCACCCAGAAAAAGTTCCTCTGCGACAGGGTCATGTGGCGCATCCCCTTCTCCAGCAACTTCATGTCCATGGGCGCGCTCACCGACCTCGGCCAGAACATGCTCTATGCCAACTCCGCCCACGCGCTAGACATGAATTTCGAAGTCGACCCCATGGATGAGTCCACCCTTCTCTATGTTGTCTTCGAAGTCTTCGACGTCGTCCGAGTGCACCAGCCCCACCGCGGCGTCATCGAGGCCGTCTACCTGCGCACCCCCTTCTCGGCCGGTAACGCCACCACCTAAGCTCTTGCTTCTTGCAAGCCATGGCCGCGGGCTCCGGCGAGCAGGAGCTCAGGGCCATCATCCGCGACCTGGGCTGCGGGCCCTACTTCCTGGGCACCTTCGATAAGCGCTTCCCGGGATTCATGGCCCCGCACAAGCTGGCCTGCGCCATCGTCAACACGGCCGGCCGCGAGACCGGGGGCGAGCACTGGCTGGCCTTCGCCTGGAACCCGCGCTCGAACACCTGCTACCTCTTCGACCCCTTCGGGTTCTCGGACGAGCGCCTCAAGCAGATCTACCAGTTCGAGTACGAGGGCCTGCTGCGCCGCAGCGCCCTGGCCACCGAGGACCGCTGCGTCACCCTGGAAAAGTCCACCCAGACCGTGCAGGGTCCGCGCTCGGCCGCCTGCGGGCTCTTCTGCTGCATGTTCCTGCACGCCTTCGTGCACTGGCCCGACCGCCCCATGGACAAGAACCCCACCATGAACTTGCTGACGGGGGTGCCCAACGGCATGCTCCAGTCGCCCCAGGTGGAACCCACCCTGCGCCGCAACCAGGAGGCGCTCTACCGCTTCCTCAACTCCCACTCCGCCTACTTTCGCTCCCACCGCGCGCGCATCGAGAAGGCCACCGCCTTCGACCGCATGAATCAAGACATGTAAACCGTGTGTGTATGTTAAATGTCTTTAATAAACAGCACTTTCATGTTACACATGCATCTGAGATGATTTATTTAGAAATCGAAAGGGTTCTGCCGGGTCTCGGCATGGCCCGCGGGCAGGGACACGTTGCGGAACTGGTACTTGGCCAGCCACTTGAACTCGGGGATCAGCAGTTTGGGCAGCGGGGTGTCGGGGAAGGAGTCGGTCCACAGCTTCCGCGTCAGTTGCAGGGCGCCCAGCAGGTCGGGCGCGGAGATCTTGAAATCGCAGTTGGGACCCGCGTTCTGCGCGCGGGAGTTGCGGTACACGGGGTTGCAGCACTGGAACACCATCAGGGCCGGGTGCTTCACGCTCGCCAGCACCGTCGCGTCGGTGATGCTCTCCACGTCGAGGTCCTCGGCGTTGGCCATCCCGAAGGGGGTCATCTTGCAGGTCTGCCTTCCCATGGTGGGCACGCACCCGGGCTTGTGGTTGCAATCGCAGTGCAGGGGGATCAGCATCATCTGGGCCTGGTCGGCGTTCATCCCCGGGTACATGGCCTTCATGAAAGCCTCCAATTGCCTGAACGCCTGCTGGGCCTTGGCTCCCTCGGTGAAGAAGACCCCGCAGGACTTGCTAGAGAACTGGTTGGTGGCGCACCCGGCGTCGTGCACGCAGCAGCGCGCGTCGTTGTTGGCCAGCTGCACCACGCTGCGCCCCCAGCGGTTCTGGGTGATCTTGGCCCGGTCGGGGTTCTCCTTCAGCGCGCGCTGCCCGTTCTCGCTCGCCACATCCATCTCGATCATGTGCTCCTTCTGGATCATGGTGGTCCCGTGCAGGCACCGCAGCTTGCCCTCGGCCTCGGTGCACCCGTGCAGCCACAGCGCGCACCCGGTGCACTCCCAGTTCTTGTGGGCGATCTGGGAATGCGCGTGCACGAAGCCCTGCAGGAAGCGGCCCATCATGGTGGTCAGGGTCTTGTTGCTAGTGAAGGTCAGCGGAATGCCGCGGTGCTCCTCGTTGATGTACAGGTGGCAGATGCGGCGGTACACCTCGCCCTGCTCGGGCATCAGCTGGAAGTTGGCTTTCAGGTCGGTCTCCACGCGGTAGCGGTCCATCAGCATAGTCATGATTTCCATACCCTTCTCCCAGGCCGAGACGATGGGCAGGCTCATAGGGTTCTTCACCATCATCTTAGCGCTAGCAGCCGCGGCCAGGGGGTCGCTCTCGTCCAGGGTCTCAAAGCTCCGCTTGCCGTCCTTCTCGGTGATCCGCACCGGGGGGTAGCTGAAGCCCACGGCCGCCAGCTCCTCCTCGGCCTGTCTTTCGTCCTCGCTGTCCTGGCTGACGTCCTGCAGGACCACATGCTTGGTCTTGCGGGGTTTCTTCTTGGGCGGCAGCGGCGGCGGAGATGTTGGAGATGGCGAGGGGGAGCGCGAGTTCTCGCTCACCACTACTATCTCTTCCTCTTCTTGGTCCGAGGCCACGCGGCGGTAGGTATGTCTCTTCGGGGGCAGAGGCGGAGGCGACGGGCTCTCGCCGCCGCGACTTGGCGGATGGCTGGCAGAGCCCCTTCCGCGTTCGGGGGTGCGCTCCCGGCGGCGCTCTGACTGACTTCCTCCGCGGCCGGCCATTGTGTTCTCCTAGGGAGGAACAACAAGCATGGAGACTCAGCCATCGCCAACCTCGCCATCTGCCCCCACCGCCGACGAGAAGCAGCAGCAGCAGAATGAAAGCTTAACCGCCCCGCCGCCCAGCCCCGCCACCTCCGACGCGGCCGTCCCAGACATGCAAGAGATGGAGGAATCCATCGAGATTGACCTGGGCTATGTGACGCCCGCGGAGCACGAGGAGGAGCTGGCAGTGCGCTTTTCACAAGAAGAGATACACCAAGAACAGCCAGAGCAGGAAGCAGAGAATGAGCAGAGTCAGGCTGGGCTCGAGCATGACGGCGACTACCTCCACCTGAGCGGGGGGGAGGACGCGCTCATCAAGCATCTGGCCCGGCAGGCCACCATCGTCAAGGATGCGCTGCTCGACCGCACCGAGGTGCCCCTCAGCGTGGAGGAGCTCAGCCGCGCCTACGAGTTGAACCTCTTCTCGCCGCGCGTGCCCCCCAAGCGCCAGCCCAATGGCACCTGCGAGCCCAACCCGCGCCTCAACTTCTACCCGGTCTTCGCGGTGCCCGAGGCCCTGGCCACCTACCACATCTTTTTCAAGAACCAAAAGATCCCCGTCTCCTGCCGCGCCAACCGCACCCGCGCCGACGCCCTTTTCAACCTGGGTCCCGGCGCCCGCCTACCTGATATCGCCTCCTTGGAAGAGGTTCCCAAGATCTTCGAGGGTCTGGGCAGCGACGAGACTCGGGCCGCGAACGCTCTGCAAGGAGAAGGAGGAGAGCATGAGCACCACAGCGCCCTGGTCGAGTTGGAAGGCGACAACGCGCGGCTGGCGGTGCTCAAACGCACGGTCGAGCTGACCCATTTCGCCTACCCGGCTCTGAACCTGCCCCCCAAAGTCATGAGCGCGGTCATGGACCAGGTGCTCATCAAGCGCGCGTCGCCCATCTCCGAGGACGAGGGCATGCAAGACTCCGAGGAGGGCAAGCCCGTGGTCAGCGACGAGCAGCTGGCCCGGTGGCTGGGTCCTAATGCTAGTCCCCAGAGTTTGGAAGAGCGGCGCAAACTCATGATGGCCGTGGTCCTGGTGACCGTGGAGCTGGAGTGCCTGCGCCGCTTCTTCGCCGACGCGGAGACCCTGCGCAAGGTCGAGGAGAACCTGCACTACCTCTTCAGGCACGGGTTCGTGCGCCAGGCCTGCAAGATCTCCAACGTGGAGCTGACCAACCTGGTCTCCTACATGGGCATCTTGCACGAGAACCGCCTGGGGCAGAACGTGCTGCACACCACCCTGCGCGGGGAGGCCCGGCGCGACTACATCCGCGACTGCGTCTACCTCTACCTCTGCCACACCTGGCAGACGGGCATGGGCGTGTGGCAGCAGTGTCTGGAGGAGCAGAACCTGAAAGAGCTCTGCAAGCTCCTGCAGAAGAACCTCAAGGGTCTGTGGACCGGGTTCGACGAGCGCACCACCGCCTCGGACCTGGCCGACCTCATTTTCCCCGAGCGCCTCAGGCTGACGCTGCGCAACGGCCTGCCCGACTTTATGAGCCAAAGCATGTTGCAAAACTTTCGCTCTTTCATCCTCGAACGCTCCGGAATCCTGCCCGCCACCTGCTCCGCGCTGCCCTCGGACTTCGTGCCGCTGACCTTCCGCGAGTGCCCCCCGCCGCTGTGGAGCCACTGCTACCTGCTGCGCCTGGCCAACTACCTGGCCTACCACTCGGACGTGATCGAGGACGTCAGCGGCGAGGGCCTGCTCGAGTGCCACTGCCGCTGCAACCTCTGCACGCCGCACCGCTCCCTGGCCTGCAACCCCCAGCTGCTGAGCGAGACCCAGATCATCGGCACCTTCGAGTTGCAAGGGCCCAGCGAAGGCGAGGGTTCAGCCGCCAAGGGGGGTCTGAAACTCACCCCGGGGCTGTGGACCTCGGCCTACTTGCGCAAGTTCGTGCCCGAGGACTACCATCCCTTCGAGATCAGGTTCTACGAGGACCAATCCCATCCGCCCAAGGCCGAGCTGTCGGCCTGCGTCATCACCCAGGGGGCGATCCTGGCCCAATTGCAAGCCATCCAGAAATCCCGCCAAGAATTCTTGCTGAAAAAGGGCCGCGGGGTCTACCTCGACCCCCAGACCGGTGAGGAGCTCAACCCCGGCTTCCCCCAGGATGCCCCGAGGAAACAAGAAGCTGAAAGTGGAGCTGCCGCCCGTGGAGGATTTGGAGGAAGACTGGGAGAACAGCAGTCAGGCAGAGGAGGAGGAGATGGAGGAAGACTGGGACAGCACTCAGGCAGAGGAGGACAGCCTGCAAGACAGTCTGGAGGAAGACGAGGAGGAGGCAGAGGAGGAGGTGGAAGAAGCAGCCGCCGCCAGACCGTCGTCCTCGGCGGGGGAGAAAGCAAGCAGCACGGATACCATCTCCGCTCCGGGTCGGGGTCCCGCTCGACCACACAGTAGATGGGACGAGACCGGACGATTCCCGAACCCCACCACCCAGACCGGTAAGAAGGAGCGGCAGGGATACAAGTCCTGGCGGGGGCACAAAAACGCCATCGTCTCCTGCTTGCAGGCCTGCGGGGGCAACATCTCCTTCACCCGGCGCTACCTGCTCTTCCACCGCGGGGTGAACTTTCCCCGCAACATCTTGCATTACTACCGTCACCTCCACAGCCCCTACTACTTCCAAGAAGAGGCAGCAGCAGCAGAAAAAGACCAGCAGAAAACCAGCAGCTAGAAAATCCACAGCGGCGGCAGCAGGTGGACTGAGGATCGCGGCGAACGAGCCGGCGCAAACCCGGGAGCTGAGGAACCGGATCTTTCCCACCCTCTATGCCATCTTCCAGCAGAGTCGGGGGCAGGAGCAGGAACTGAAAGTCAAGAACCGTTCTCTGCGCTCGCTCACCCGCAGTTGTCTGTATCACAAGAGCGAAGACCAACTTCAGCGCACTCTCGAGGACGCCGAGGCTCTCTTCAACAAGTACTGCGCGCTCACTCTTAAAGAGTAGCCCGCGCCCGCCCAGTCGCAGAAAAAGGCGGGAATTACGTCACCTGTGCCCTTCGCCCTAGCCGCCTCCACCCATCATCATGAGCAAAGAGATTCCCACGCCTTACATGTGGAGCTACCAGCCCCAGATGGGCCTGGCCGCCGGTGCCGCCCAGGACTACTCCACCCGCATGAATTGGCTCAGCGCCGGGCCCGCGATGATCTCACGGGTGAATGACATCCGCGCCCACCGAAACCAGATACTCCTAGAACAGTCAGCGCTCACCGCCACGCCCCGCAATCACCTCAATCCGCGTAATTGGCCCGCCGCCCTGGTGTACCAGGAAATTCCCCAGCCCACGACCGTACTACTTCCGCGAGACGCCCAGGCCGAAGTCCAGCTGACTAACTCAGGTGTCCAGCTGGCGGGCGGCGCCACCCTGTGTCGTCACCGCCCCGCTCAGGGTATAAAGCGGCTGGTGATCCGGGGCAGAGGCACACAGCTCAACGACGAGGTGGTGAGCTCTTCGCTGGGTCTGCGACCTGACGGAGTCTTCCAACTCGCCGGATCGGGGAGATCTTCCTTCACGCCTCGTCAGGCCGTCCTGACTTTGGAGAGTTCGTCCTCGCAGCCCCGCTCGGGTGGCATCGGCACTCTCCAGTTCGTGGAGGAGTTCACTCCCTCGGTCTACTTCAACCCCTTCTCCGGCTCCCCCGGCCACTACCCGGACGAGTTCATCCCGAACTTCGACGCCATCAGCGAGTCGGTGGACGGCTACGATTGAAACTAATCACCCCCTTATCCAGTGAAATAAAGATCATATTGATGATGATTTTACAGAAATAAAAAATAATCATTTGATTTGAAATAAAGATACAATCATATTGATGATTTGAGTTTAACAAAAAAATAAAGAATCACTTACTTGAAATCTGATACCAGGTCTCTGTCCATGTTTTCTGCCAACACCACTTCACTCCCCTCTTCCCAGCTCTGGTACTGCAGGCCCCGGCGGGCTGCAAACTTCCTCCACACGCTGAAGGGGATGTCAAATTCCTCCTGTCCCTCAATCTTCATTTTATCTTCTATCAGATGTCCAAAAAGCGCGTCCGGGTGGATGATGACTTCGACCCCGTCTACCCCTACGATGCAGACAACGCACCGACCGTGCCCTTCATCAACCCCCCCTTCGTCTCTTCAGATGGATTCCAAGAGAAGCCCCTGGGGGTGTTGTCCCTGCGACTGGCCGACCCCGTCACCACCAAGAACGGGGAAATCACCCTCAAGCTGGGAGAGGGGGTGGACCTCGATTCCTCGGGAAAACTCATCTCCAACACGGCCACCAAGGCCGCCGCCCCTCTCAGTTTTTCCAACAACACCATTTCCCTTAACATGGATCACCCCTTTTACACTAAAGATGGAAAATTATCCTTACAAGTTTCTCCACCATTAAATATACTGAGAACAAGCATTCTAAACACACTAGCTTTAGGTTTTGGATCAGGTTTAGGACTCCGTGGCTCTGCCTTGGCAGTACAGTTAGTCTCTCCACTTACATTTGATACTGATGGAAACATAAAGCTTACCTTAGACAGAGGTTTGCATGTTACAACAGGAGATGCAATTGAAAGCAACATAAGCTGGGCTAAAGGTTTAAAATTTGAAGATGGAGCCATAGCAACCAACATTGGAAATGGGTTAGAGTTTGGAAGCAGTAGTACAGAAACAGGTGTTGATGATGCTTACCCAATCCAAGTTAAACTTGGATCTGGCCTTAGCTTTGACAGTACAGGAGCCATAATGGCTGGTAACAAAGAAGACGATAAACTCACTTTGTGGACAACACCTGATCCATCACCAAACTGTCAAATACTCGCAGAAAATGATGCAAAACTAACACTTTGCTTGACTAAATGTGGTAGTCAAATACTGGCCACTGTGTCAGTCTTAGTTGTAGGAAGTGGAAACCTAAACCCCATTACTGGCACCGTAAGCAGTGCTCAGGTGTTTCTACGTTTTGATGCAAACGGTGTTCTTTTAACAGAACATTCTACACTAAAAAAATACTGGGGGTATAGGCAGGGAGATAGCATAGATGGCACTCCATATACCAATGCTGTAGGATTCATGCCCAATTTAAAAGCTTATCCAAAGTCACAAAGTTCTACTACTAAAAATAATATAGTAGGGCAAGTATACATGAATGGAGATGTTTCAAAACCTATGCTTCTCACTATAACCCTCAATGGTACTGATGACAGCAACAGTACATATTCAATGTCATTTTCATACACCTGGACTAATGGAAGCTATGTTGGAGCAACATTTGGGGCTAACTCTTATACCTTCTCATACATCGCCCAAGAATGAACACTGTATCCCACCCTGCATGCCAACCCTTCCCACCCCACTCTGTGGAACAAACTCTGAAACACAAAATAAAATAAAGTTCAAGTGTTTTATTGATTCAACAGTTTTACAGGATTCGAGCAGTTATTTTTCCTCCACCCTCCCAGGACATGGAATACACCACCCTCTCCCCCCGCACAGCCTTGAACATCTGAATGCCATTGGTGATGGACATGCTTTTGGTCTCCACGTTCCACACAGTTTCAGAGCGAGCCAGTCTCGGGTCGGTCAGGGAGATGAAACCCTCCGGGCACTCCCGCATCTGCACCTCACAGCTCAACAGCTGAGGATTGTCCTCGGTGGTCGGGATCACGGTTATCTGGAAGAAGCAGAAGAGCGGCGGTGGGAATCATAGTCCGCGAACGGGATCGGCCGGTGGTGTCGCATCAGGCCCCGCAGCAGTCGCTGCCGCCGCCGCTCCGTCAAGCTGCTGCTCAGGGGGTCCGGGTCCAGGGACTCCCTCAGCATGATGCCCACGGCCCTCAGCATCAGTCGTCTGGTGCGGCGGGCGCAGCAGCGCATGCGGATCTCGCTCAGGTCGCTGCAGTACGTGCAACACAGAACCACCAGGTTGTTCAACAGTCCATAGTTCAACACGCTCCAGCCGAAACTCATCGCGGGAAGGATGCTACCCACGTGGCCGTCGTACCAGATCCTCAGGTAAATCAAGTGGTGCCCCCTCCAGAACACGCTGCCCACGTACATGATCTCCTTGGGCATGTGGCGGTTCACCACCTCCCGGTACCACATCACCCTCTGGTTGAACATGCAGCCCCGGATGATCCTGCGGAACCACAGGGCCAGCACCGCCCCGCCCGCCATGCAGCGAAGAGACCCCGGGTCCCGGCAATGGCAATGGAGGACCCACCGCTCGTACCCGTGGATCATCTGGGAGCTGAACAAGTCTATGTTGGCACAGCACAGGCATATGCTCATGCATCTCTTCAGCACTCTCAACTCCTCGGGGGTCAAAACCATATCCCAGGGCACGGGGAACTCTTGCAGGACAGCGAACCCCGCAGAACAGGGCAATCCTCGCACAGAACTTACATTGTGCATGGACAGGGTATCGCAATCAGGCAGCACCGGGTGATCCTCCACCAGAGAAGCGCGGGTCTCGGTCTCCTCACAGCGTGGTAAGGGGGCCGGCCGATACGGGTGATGGCGGGACGCGGCTGATCGTGTTCGCGACCGTGTCATGATGCAGTTGCTTTCGGACATTTTCGTACTTGCTGTAGCAGAACCTGGTCCGGGCGCTGCACACCGATCGCCGGCGGCGGTCTCGGCGCTTGGAACGCTCGGTGTTGAAATTGTAAAACAGCCACTCTCTCAGACCGTGCAGCAGATCTAGGGCCTCAGGAGTGATGAAGATCCCATCATGCCTGATGGCTCTGATCACATCGACCACCGTGGAATGGGCCAGACCCAGCCAGATGATGCAATTTTGTTGGGTTTCGGTGACGGCGAGCCTCGGGAACAACGATGAAGTAAATGCAAGCGGTGCGTTCCAGCATGGTTAGTTAGCTGATCTGTAGAAAAAACAAAAATGAACATTAAACCATGCTAGCCTGGCGAACAGGTGGGTAAATCGTTCTCTCCAGCACCAGGCAGGCCACGGGGTCTCCGGCGCGACCCTCGTAAAAATTGTCGCTATGATTGAAAACCATCACAGAGAGACGTTCCCGGTGGCCGGCGTGAATGATTCGACAAGATGAATACACCCCCGGAACATTGGCGTCCGCGAGTGAAAAAAAGCGCCCGAGGAAGCAATAAGGCACTACAATGCTCAGTCTCAAGTCCAGCAAAGCGATGCCATGCGGATGAAGCACAAAATTCTCAGGTGCGTACAAAATGTAATTACTCCCCTCCTGCACAGGCAGCAAAGCCCCCGATCCCTCCAGGTACACATACAAAGCCTCAGCGTCCATAGCTTACCGAGCAGCAGCACACAACAGGCGCAAGAGTCAGAGAAAGGCTGAGCTCTAACCTGTCCACCCGCTCTCTGCTCAATATATAGCCCAGATCTACACTGACGTAAAGGCCAAAGTCTAAAAATACCCGCCAAATAATCACACACGCCCAGCACACGCCCAGAAACCGGTGACACACTCAAAAAAATACGCGCACTTCCTCAAACGCCCAAAACTGCCGTCATTTCCGGGTTCCCACGCTACGTCATCAAAACACGACTTTCAAATTCCGTCGACCGTTAAAAACGTCACCCGCCCCGCCCCTAACGGTCGCCCGTCTCTCAGCCAATCAGCGCCCCGCATCCCCAAATTCAAACACCTCATTTGCATATTAACGCGCACAAAAAGTTTGAGGTATATTATTGATGATG
ChAdV68-GFP-E4deleted (SEQ ID NO: 58); Bold italicized=GFP transgene
CATCaTCAATAATATACCTCAAACTTTTTGTGCGCGTTAATATGCAAATGAGGCGTTTGAATTTGGGGAGGAAGGGCGGTGATTGGTCGAGGGATGAGCGACCGTTAGGGGCGGGGCGAGTGACGTTTTGATGACGTGGTTGCGAGGAGGAGCCAGTTTGCAAGTTCTCGTGGGAAAAGTGACGTCAAACGAGGTGTGGTTTGAACACGGAAATACTCAATTTTCCCGCGCTCTCTGACAGGAAATGAGGTGTTTCTGGGCGGATGCAAGTGAAAACGGGCCATTTTCGCGCGAAAACTGAATGAGGAAGTGAAAATCTGAGTAATTTCGCGTTTATGGCAGGGAGGAGTATTTGCCGAGGGCCGAGTAGACTTTGACCGATTACGTGGGGGTTTCGATTACCGTGTTTTTCACCTAAATTTCCGCGTACGGTGTCAAAGTCCGGTGTTTTTACGTAGGTGTCAGCTGATCGCCAGGGTATTTAAACCTGCGCTCTCCAGTCAAGAGGCCACTCTTGAGTGCCAGCGAGAAGAGTTTTCTCCTCCGCGCCGCGAGTCAGATCTACACTTTGAAAGTAGGGATAACAGGGTAATgacattgattattgactagttGttaaTAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTCCGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTACGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGgTGATGCGGTTTTGGCAGTACACCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAATAACCCCGCCCCGTTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAgcTCGTTTAGTGAACCGTCAGATCGCCTGGAACGCCATCCACGCTGTTTTGACCTCCATAGAAGACAGCGATCGCGccacc ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATCCTGGTCGAGCTGGACGGCGACGTAAACGGCCACAAGTTCAGCGTGTCCGGCGAGGGCGAGGGCGATGCCACCTACGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCCACCCTCGTGACCACCCTGACCTACGGCGTGCAGTGCTTCAGCCGCTACCCCGACCACATGAAGCAGCACGACTTCTTCAAGTCCGCCATGCCCGAAGGCTACGTCCAGGAGCGCACCATCTTCTTCAAGGACGACGGCAACTACAAGACCCGCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTGGTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGCATCGACTTCAAGGAGGACGGCAACATCCTGGGGCACAAGCTGGAGTACAACTACAACAGCCACAACGTCTATATCATGGCCGACAAGCAGAAGAACGGCATCAAGGTGAACTTCAAGATCCGCCACAACATCGAGGACGGCAGCGTGCAGCTCGCCGACCACTACCAGCAGAACACCCCCATCGGCGACGGCCCCGTGCTGCTGCCCGACAACCACTACCTGAGCACCCAGTCCGCCCTGAGCAAAGACCCCAACGAGAAGCGCGATCACATGGTCCTGCTGGAGTTCGTGACCGCCGCCGGGATCACTCTCGGCATGGACGAGCTtTACAAGTAG tgaGTTTAAACTCCCATTTAAATGTGAGGGTTAATGCTTCGAGCAGACATGATAAGATACATTGATGAGTTTGGACAAACCACAACTAGAATGCAGTGAAAAAAATGCTTTATTTGTGAAATTTGTGATGCTATTGCTTTATTTGTAACCATTATAAGCTGCAATAAACAAGTTAACAACAACAATTGCATTCATTTTATGTTTCAGGTTCAGGGGGAGATGTGGGAGGTTTTTTAAAGCAAGTAAAACCTCTACAAATGTGGTAAAATAACTATAACGGTCCTAAGGTAGCGAGTGAGTAGTGTTCTGGGGCGGGGGAGGACCTGCATGAGGGCCAGAATAACTGAAATCTGTGCTTTTCTGTGTGTTGCAGCAGCATGAGCGGAAGCGGCTCCTTTGAGGGAGGGGTATTCAGCCCTTATCTGACGGGGCGTCTCCCCTCCTGGGCGGGAGTGCGTCAGAATGTGATGGGATCCACGGTGGACGGCCGGCCCGTGCAGCCCGCGAACTCTTCAACCCTGACCTATGCAACCCTGAGCTCTTCGTCGTTGGACGCAGCTGCCGCCGCAGCTGCTGCATCTGCCGCCAGCGCCGTGCGCGGAATGGCCATGGGCGCCGGCTACTACGGCACTCTGGTGGCCAACTCGAGTTCCACCAATAATCCCGCCAGCCTGAACGAGGAGAAGCTGTTGCTGCTGATGGCCCAGCTCGAGGCCTTGACCCAGCGCCTGGGCGAGCTGACCCAGCAGGTGGCTCAGCTGCAGGAGCAGACGCGGGCCGCGGTTGCCACGGTGAAATCCAAATAAAAAATGAATCAATAAATAAACGGAGACGGTTGTTGATTTTAACACAGAGTCTGAATCTTTATTTGATTTTTCGCGCGCGGTAGGCCCTGGACCACCGGTCTCGATCATTGAGCACCCGGTGGATCTTTTCCAGGACCCGGTAGAGGTGGGCTTGGATGTTGAGGTACATGGGCATGAGCCCGTCCCGGGGGTGGAGGTAGCTCCATTGCAGGGCCTCGTGCTCGGGGGTGGTGTTGTAAATCACCCAGTCATAGCAGGGGCGCAGGGCATGGTGTTGCACAATATCTTTGAGGAGGAGACTGATGGCCACGGGCAGCCCTTTGGTGTAGGTGTTTACAAATCTGTTGAGCTGGGAGGGATGCATGCGGGGGGAGATGAGGTGCATCTTGGCCTGGATCTTGAGATTGGCGATGTTACCGCCCAGATCCCGCCTGGGGTTCATGTTGTGCAGGACCACCAGCACGGTGTATCCGGTGCACTTGGGGAATTTATCATGCAACTTGGAAGGGAAGGCGTGAAAGAATTTGGCGACGCCTTTGTGCCCGCCCAGGTTTTCCATGCACTCATCCATGATGATGGCGATGGGCCCGTGGGCGGCGGCCTGGGCAAAGACGTTTCGGGGGTCGGACACATCATAGTTGTGGTCCTGGGTGAGGTCATCATAGGCCATTTTAATGAATTTGGGGCGGAGGGTGCCGGACTGGGGGACAAAGGTtCCCTCGATCCCGGGGGCGTAGTTCCCCTCACAGATCTGCATCTCCCAGGCTTTGAGCTCGGAGGGGGGGATCATGTCCACCTGCGGGGCGATAAAGAACACGGTTTCCGGGGCGGGGGAGATGAGCTGGGCCGAAAGCAAGTTCCGGAGCAGCTGGGACTTGCCGCAGCCGGTGGGGCCGTAGATGACCCCGATGACCGGCTGCAGGTGGTAGTTGAGGGAGAGACAGCTGCCGTCCTCCCGGAGGAGGGGGGCCACCTCGTTCATCATCTCGCGCACGTGCATGTTCTCGCGCACCAGTTCCGCCAGGAGGCGCTCTCCCCCCAGGGATAGGAGCTCCTGGAGCGAGGCGAAGTTTTTCAGCGGCTTGAGTCCGTCGGCCATGGGCATTTTGGAGAGGGTTTGTTGCAAGAGTTCCAGGCGGTCCCAGAGCTCGGTGATGTGCTCTACGGCATCTCGATCCAGCAGACCTCCTCGTTTCGCGGGTTGGGACGGCTGCGGGAGTAGGGCACCAGACGATGGGCGTCCAGCGCAGCCAGGGTCCGGTCCTTCCAGGGTCGCAGCGTCCGCGTCAGGGTGGTCTCCGTCACGGTGAAGGGGTGCGCGCCGGGCTGGGCGCTTGCGAGGGTGCGCTTCAGGCTCATCCGGCTGGTCGAAAACCGCTCCCGATCGGCGCCCTGCGCGTCGGCCAGGTAGCAATTGACCATGAGTTCGTAGTTGAGCGCCTCGGCCGCGTGGCCTTTGGCGCGGAGCTTACCTTTGGAAGTCTGCCCGCAGGCGGGACAGAGGAGGGACTTGAGGGCGTAGAGCTTGGGGGCGAGGAAGACGGACTCGGGGGCGTAGGCGTCCGCGCCGCAGTGGGCGCAGACGGTCTCGCACTCCACGAGCCAGGTGAGGTCGGGCTGGTCGGGGTCAAAAACCAGTTTCCCGCCGTTCTTTTTGATGCGTTTCTTACCTTTGGTCTCCATGAGCTCGTGTCCCCGCTGGGTGACAAAGAGGCTGTCCGTGTCCCCGTAGACCGACTTTATGGGCCGGTCCTCGAGCGGTGTGCCGCGGTCCTCCTCGTAGAGGAACCCCGCCCACTCCGAGACGAAAGCCCGGGTCCAGGCCAGCACGAAGGAGGCCACGTGGGACGGGTAGCGGTCGTTGTCCACCAGCGGGTCCACCTTTTCCAGGGTATGCAAACACATGTCCCCCTCGTCCACATCCAGGAAGGTGATTGGCTTGTAAGTGTAGGCCACGTGACCGGGGGTCCCGGCCGGGGGGGTATAAAAGGGTGCGGGTCCCTGCTCGTCCTCACTGTCTTCCGGATCGCTGTCCAGGAGCGCCAGCTGTTGGGGTAGGTATTCCCTCTCGAAGGCGGGCATGACCTCGGCACTCAGGTTGTCAGTTTCTAGAAACGAGGAGGATTTGATATTGACGGTGCCGGCGGAGATGCCTTTCAAGAGCCCCTCGTCCATCTGGTCAGAAAAGACGATCTTTTTGTTGTCGAGCTTGGTGGCGAAGGAGCCGTAGAGGGCGTTGGAGAGGAGCTTGGCGATGGAGCGCATGGTCTGGTTTTTTTCCTTGTCGGCGCGCTCCTTGGCGGCGATGTTGAGCTGCACGTACTCGCGCGCCACGCACTTCCATTCGGGGAAGACGGTGGTCAGCTCGTCGGGCACGATTCTGACCTGCCAGCCCCGATTATGCAGGGTGATGAGGTCCACACTGGTGGCCACCTCGCCGCGCAGGGGCTCATTAGTCCAGCAGAGGCGTCCGCCCTTGCGCGAGCAGAAGGGGGGCAGGGGGTCCAGCATGACCTCGTCGGGGGGGTCGGCATCGATGGTGAAGATGCCGGGCAGGAGGTCGGGGTCAAAGTAGCTGATGGAAGTGGCCAGATCGTCCAGGGCAGCTTGCCATTCGCGCACGGCCAGCGCGCGCTCGTAGGGACTGAGGGGCGTGCCCCAGGGCATGGGATGGGTAAGCGCGGAGGCGTACATGCCGCAGATGTCGTAGACGTAGAGGGGCTCCTCGAGGATGCCGATGTAGGTGGGGTAGCAGCGCCCCCCGCGGATGCTGGCGCGCACGTAGTCATACAGCTCGTGCGAGGGGGCGAGGAGCCCCGGGCCCAGGTTGGTGCGACTGGGCTTTTCGGCGCGGTAGACGATCTGGCGGAAAATGGCATGCGAGTTGGAGGAGATGGTGGGCCTTTGGAAGATGTTGAAGTGGGCGTGGGGCAGTCCGACCGAGTCGCGGATGAAGTGGGCGTAGGAGTCTTGCAGCTTGGCGACGAGCTCGGCGGTGACTAGGACGTCCAGAGCGCAGTAGTCGAGGGTCTCCTGGATGATGTCATACTTGAGCTGTCCCTTTTGTTTCCACAGCTCGCGGTTGAGAAGGAACTCTTCGCGGTCCTTCCAGTACTCTTCGAGGGGGAACCCGTCCTGATCTGCACGGTAAGAGCCTAGCATGTAGAACTGGTTGACGGCCTTGTAGGCGCAGCAGCCCTTCTCCACGGGGAGGGCGTAGGCCTGGGCGGCCTTGCGCAGGGAGGTGTGCGTGAGGGCGAAAGTGTCCCTGACCATGACCTTGAGGAACTGGTGCTTGAAGTCGATATCGTCGCAGCCCCCCTGCTCCCAGAGCTGGAAGTCCGTGCGCTTCTTGTAGGCGGGGTTGGGCAAAGCGAAAGTAACATCGTTGAAGAGGATCTTGCCCGCGCGGGGCATAAAGTTGCGAGTGATGCGGAAAGGTTGGGGCACCTCGGCCCGGTTGTTGATGACCTGGGCGGCGAGCACGATCTCGTCGAAGCCGTTGATGTTGTGGCCCACGATGTAGAGTTCCACGAATCGCGGACGGCCCTTGACGTGGGGCAGTTTCTTGAGCTCCTCGTAGGTGAGCTCGTCGGGGTCGCTGAGCCCGTGCTGCTCGAGCGCCCAGTCGGCGAGATGGGGGTTGGCGCGGAGGAAGGAAGTCCAGAGATCCACGGCCAGGGCGGTTTGCAGACGGTCCCGGTACTGACGGAACTGCTGCCCGACGGCCATTTTTTCGGGGGTGACGCAGTAGAAGGTGCGGGGGTCCCCGTGCCAGCGATCCCATTTGAGCTGGAGGGCGAGATCGAGGGCGAGCTCGACGAGCCGGTCGTCCCCGGAGAGTTTCATGACCAGCATGAAGGGGACGAGCTGCTTGCCGAAGGACCCCATCCAGGTGTAGGTTTCCACATCGTAGGTGAGGAAGAGCCTTTCGGTGCGAGGATGCGAGCCGATGGGGAAGAACTGGATCTCCTGCCACCAATTGGAGGAATGGCTGTTGATGTGATGGAAGTAGAAATGCCGACGGCGCGCCGAACACTCGTGCTTGTGTTTATACAAGCGGCCACAGTGCTCGCAACGCTGCACGGGATGCACGTGCTGCACGAGCTGTACCTGAGTTCCTTTGACGAGGAATTTCAGTGGGAAGTGGAGTCGTGGCGCCTGCATCTCGTGCTGTACTACGTCGTGGTGGTCGGCCTGGCCCTCTTCTGCCTCGATGGTGGTCATGCTGACGAGCCCGCGCGGGAGGCAGGTCCAGACCTCGGCGCGAGCGGGTCGGAGAGCGAGGACGAGGGCGCGCAGGCCGGAGCTGTCCAGGGTCCTGAGACGCTGCGGAGTCAGGTCAGTGGGCAGCGGCGGCGCGCGGTTGACTTGCAGGAGTTTTTCCAGGGCGCGCGGGAGGTCCAGATGGTACTTGATCTCCACCGCGCCATTGGTGGCGACGTCGATGGCTTGCAGGGTCCCGTGCCCCTGGGGTGTGACCACCGTCCCCCGTTTCTTCTTGGGCGGCTGGGGCGACGGGGGCGGTGCCTCTTCCATGGTTAGAAGCGGCGGCGAGGACGCGCGCCGGGCGGCAGGGGCGGCTCGGGGCCCGGAGGCAGGGGCGGCAGGGGCACGTCGGCGCCGCGCGCGGGTAGGTTCTGGTACTGCGCCCGGAGAAGACTGGCGTGAGCGACGACGCGACGGTTGACGTCCTGGATCTGACGCCTCTGGGTGAAGGCCACGGGACCCGTGAGTTTGAACCTGAAAGAGAGTTCGACAGAATCAATCTCGGTATCGTTGACGGCGGCCTGCCGCAGGATCTCTTGCACGTCGCCCGAGTTGTCCTGGTAGGCGATCTCGGTCATGAACTGCTCGATCTCCTCCTCTTGAAGGTCTCCGCGGCCGGCGCGCTCCACGGTGGCCGCGAGGTCGTTGGAGATGCGGCCCATGAGCTGCGAGAAGGCGTTCATGCCCGCCTCGTTCCAGACGCGGCTGTAGACCACGACGCCCTCGGGATCGCgGGCGCGCATGACCACCTGGGCGAGGTTGAGCTCCACGTGGCGCGTGAAGACCGCGTAGTTGCAGAGGCGCTGGTAGAGGTAGTTGAGCGTGGTGGCGATGTGCTCGGTGACGAAGAAATACATGATCCAGCGGCGGAGCGGCATCTCGCTGACGTCGCCCAGCGCCTCCAAACGTTCCATGGCCTCGTAAAAGTCCACGGCGAAGTTGAAAAACTGGGAGTTGCGCGCCGAGACGGTCAACTCCTCCTCCAGAAGACGGATGAGCTCGGCGATGGTGGCGCGCACCTCGCGCTCGAAGGCCCCCGGGAGTTCCTCCACTTCCTCTTCTTCCTCCTCCACTAACATCTCTTCTACTTCCTCCTCAGGCGGCAGTGGTGGCGGGGGAGGGGGCCTGCGTCGCCGGCGGCGCACGGGCAGACGGTCGATGAAGCGCTCGATGGTCTCGCCGCGCCGGCGTCGCATGGTCTCGGTGACGGCGCGCCCGTCCTCGCGGGGCCGCAGCGTGAAGACGCCGCCGCGCATCTCCAGGTGGCCGGGGGGGTCCCCGTTGGGCAGGGAGAGGGCGCTGACGATGCATCTTATCAATTGCCCCGTAGGGACTCCGCGCAAGGACCTGAGCGTCTCGAGATCCACGGGATCTGAAAACCGCTGAACGAAGGCTTCGAGCCAGTCGCAGTCGCAAGGTAGGCTGAGCACGGTTTCTTCTGGCGGGTCATGTTGGTTGGGAGCGGGGCGGGCGATGCTGCTGGTGATGAAGTTGAAATAGGCGGTTCTGAGACGGCGGATGGTGGCGAGGAGCACCAGGTCTTTGGGCCCGGCTTGCTGGATGCGCAGACGGTCGGCCATGCCCCAGGCGTGGTCCTGACACCTGGCCAGGTCCTTGTAGTAGTCCTGCATGAGCCGCTCCACGGGCACCTCCTCCTCGCCCGCGCGGCCGTGCATGCGCGTGAGCCCGAAGCCGCGCTGGGGCTGGACGAGCGCCAGGTCGGCGACGACGCGCTCGGCGAGGATGGCTTGCTGGATCTGGGTGAGGGTGGTCTGGAAGTCATCAAAGTCGACGAAGCGGTGGTAGGCTCCGGTGTTGATGGTGTAGGAGCAGTTGGCCATGACGGACCAGTTGACGGTCTGGTGGCCCGGACGCACGAGCTCGTGGTACTTGAGGCGCGAGTAGGCGCGCGTGTCGAAGATGTAGTCGTTGCAGGTGCGCACCAGGTACTGGTAGCCGATGAGGAAGTGCGGCGGCGGCTGGCGGTAGAGCGGCCATCGCTCGGTGGCGGGGGCGCCGGGCGCGAGGTCCTCGAGCATGGTGCGGTGGTAGCCGTAGATGTACCTGGACATCCAGGTGATGCCGGCGGCGGTGGTGGAGGCGCGCGGGAACTCGCGGACGCGGTTCCAGATGTTGCGCAGCGGCAGGAAGTAGTTCATGGTGGGCACGGTCTGGCCCGTGAGGCGCGCGCAGTCGTGGATGCTCTATACGGGCAAAAACGAAAGCGGTCAGCGGCTCGACTCCGTGGCCTGGAGGCTAAGCGAACGGGTTGGGCTGCGCGTGTACCCCGGTTCGAATCTCGAATCAGGCTGGAGCCGCAGCTAACGTGGTATTGGCACTCCCGTCTCGACCCAAGCCTGCACCAACCCTCCAGGATACGGAGGCGGGTCGTTTTGCAACTTTTTTTTGGAGGCCGGATGAGACTAGTAAGCGCGGAAAGCGGCCGACCGCGATGGCTCGCTGCCGTAGTCTGGAGAAGAATCGCCAGGGTTGCGTTGCGGTGTGCCCCGGTTCGAGGCCGGCCGGATTCCGCGGCTAACGAGGGCGTGGCTGCCCCGTCGTTTCCAAGACCCCATAGCCAGCCGACTTCTCCAGTTACGGAGCGAGCCCCTCTTTTGTTTTGTTTGTTTTTGCCAGATGCATCCCGTACTGCGGCAGATGCGCCCCCACCACCCTCCACCGCAACAACAGCCCCCTCCACAGCCGGCGCTTCTGCCCCCGCCCCAGCAGCAACTTCCAGCCACGACCGCCGCGGCCGCCGTGAGCGGGGCTGGACAGAGTTATGATCACCAGCTGGCCTTGGAAGAGGGCGAGGGGCTGGCGCGCCTGGGGGCGTCGTCGCCGGAGCGGCACCCGCGCGTGCAGATGAAAAGGGACGCTCGCGAGGCCTACGTGCCCAAGCAGAACCTGTTCAGAGACAGGAGCGGCGAGGAGCCCGAGGAGATGCGCGCGGCCCGGTTCCACGCGGGGCGGGAGCTGCGGCGCGGCCTGGACCGAAAGAGGGTGCTGAGGGACGAGGATTTCGAGGCGGACGAGCTGACGGGGATCAGCCCCGCGCGCGCGCACGTGGCCGCGGCCAACCTGGTCACGGCGTACGAGCAGACCGTGAAGGAGGAGAGCAACTTCCAAAAATCCTTCAACAACCACGTGCGCACCCTGATCGCGCGCGAGGAGGTGACCCTGGGCCTGATGCACCTGTGGGACCTGCTGGAGGCCATCGTGCAGAACCCCACCAGCAAGCCGCTGACGGCGCAGCTGTTCCTGGTGGTGCAGCATAGTCGGGACAACGAAGCGTTCAGGGAGGCGCTGCTGAATATCACCGAGCCCGAGGGCCGCTGGCTCCTGGACCTGGTGAACATTCTGCAGAGCATCGTGGTGCAGGAGCGCGGGCTGCCGCTGTCCGAGAAGCTGGCGGCCATCAACTTCTCGGTGCTGAGTTTGGGCAAGTACTACGCTAGGAAGATCTACAAGACCCCGTACGTGCCCATAGACAAGGAGGTGAAGATCGACGGGTTTTACATGCGCATGACCCTGAAAGTGCTGACCCTGAGCGACGATCTGGGGGTGTACCGCAACGACAGGATGCACCGTGCGGTGAGCGCCAGCAGGCGGCGCGAGCTGAGCGACCAGGAGCTGATGCATAGTCTGCAGCGGGCCCTGACCGGGGCCGGGACCGAGGGGGAGAGCTACTTTGACATGGGCGCGGACCTGCACTGGCAGCCCAGCCGCCGGGCCTTGGAGGCGGCGGCAGGACCCTACGTAGAAGAGGTGGACGATGAGGTGGACGAGGAGGGCGAGTACCTGGAAGACTGATGGCGCGACCGTATTTTTGCTAGATGCAACAACAACAGCCACCTCCTGATCCCGCGATGCGGGCGGCGCTGCAGAGCCAGCCGTCCGGCATTAACTCCTCGGACGATTGGACCCAGGCCATGCAACGCATCATGGCGCTGACGACCCGCAACCCCGAAGCCTTTAGACAGCAGCCCCAGGCCAACCGGCTCTCGGCCATCCTGGAGGCCGTGGTGCCCTCGCGCTCCAACCCCACGCACGAGAAGGTCCTGGCCATCGTGAACGCGCTGGTGGAGAACAAGGCCATCCGCGGCGACGAGGCCGGCCTGGTGTACAACGCGCTGCTGGAGCGCGTGGCCCGCTACAACAGCACCAACGTGCAGACCAACCTGGACCGCATGGTGACCGACGTGCGCGAGGCCGTGGCCCAGCGCGAGCGGTTCCACCGCGAGTCCAACCTGGGATCCATGGTGGCGCTGAACGCCTTCCTCAGCACCCAGCCCGCCAACGTGCCCCGGGGCCAGGAGGACTACACCAACTTCATCAGCGCCCTGCGCCTGATGGTGACCGAGGTGCCCCAGAGCGAGGTGTACCAGTCCGGGCCGGACTACTTCTTCCAGACCAGTCGCCAGGGCTTGCAGACCGTGAACCTGAGCCAGGCTTTCAAGAACTTGCAGGGCCTGTGGGGCGTGCAGGCCCCGGTCGGGGACCGCGCGACGGTGTCGAGCCTGCTGACGCCGAACTCGCGCCTGCTGCTGCTGCTGGTGGCCCCCTTCACGGACAGCGGCAGCATCAACCGCAACTCGTACCTGGGCTACCTGATTAACCTGTACCGCGAGGCCATCGGCCAGGCGCACGTGGACGAGCAGACCTACCAGGAGATCACCCACGTGAGCCGCGCCCTGGGCCAGGACGACCCGGGCAACCTGGAAGCCACCCTGAACTTTTTGCTGACCAACCGGTCGCAGAAGATCCCGCCCCAGTACGCGCTCAGCACCGAGGAGGAGCGCATCCTGCGTTACGTGCAGCAGAGCGTGGGCCTGTTCCTGATGCAGGAGGGGGCCACCCCCAGCGCCGCGCTCGACATGACCGCGCGCAACATGGAGCCCAGCATGTACGCCAGCAACCGCCCGTTCATCAATAAACTGATGGACTACTTGCATCGGGCGGCCGCCATGAACTCTGACTATTTCACCAACGCCATCCTGAATCCCCACTGGCTCCCGCCGCCGGGGTTCTACACGGGCGAGTACGACATGCCCGACCCCAATGACGGGTTCCTGTGGGACGATGTGGACAGCAGCGTGTTCTCCCCCCGACCGGGTGCTAACGAGCGCCCCTTGTGGAAGAAGGAAGGCAGCGACCGACGCCCGTCCTCGGCGCTGTCCGGCCGCGAGGGTGCTGCCGCGGCGGTGCCCGAGGCCGCCAGTCCTTTCCCGAGCTTGCCCTTCTCGCTGAACAGTATCCGCAGCAGCGAGCTGGGCAGGATCACGCGCCCGCGCTTGCTGGGCGAAGAGGAGTACTTGAATGACTCGCTGTTGAGACCCGAGCGGGAGAAGAACTTCCCCAATAACGGGATAGAAAGCCTGGTGGACAAGATGAGCCGCTGGAAGACGTATGCGCAGGAGCACAGGGACGATCCCCGGGCGTCGCAGGGGGCCACGAGCCGGGGCAGCGCCGCCCGTAAACGCCGGTGGCACGACAGGCAGCGGGGACAGATGTGGGACGATGAGGACTCCGCCGACGACAGCAGCGTGTTGGACTTGGGTGGGAGTGGTAACCCGTTCGCTCACCTGCGCCCCCGTATCGGGCGCATGATGTAAGAGAAACCGAAAATAAATGATACTCACCAAGGCCATGGCGACCAGCGTGCGTTCGTTTCTTCTCTGTTGTTGTTGTATCTAGTATGATGAGGCGTGCGTACCCGGAGGGTCCTCCTCCCTCGTACGAGAGCGTGATGCAGCAGGCGATGGCGGCGGCGGCGATGCAGCCCCCGCTGGAGGCTCCTTACGTGCCCCCGCGGTACCTGGCGCCTACGGAGGGGCGGAACAGCATTCGTTACTCGGAGCTGGCACCCTTGTACGATACCACCCGGTTGTACCTGGTGGACAACAAGTCGGCGGACATCGCCTCGCTGAACTACCAGAACGACCACAGCAACTTCCTGACCACCGTGGTGCAGAACAATGACTTCACCCCCACGGAGGCCAGCACCCAGACCATCAACTTTGACGAGCGCTCGCGGTGGGGCGGCCAGCTGAAAACCATCATGCACACCAACATGCCCAACGTGAACGAGTTCATGTACAGCAACAAGTTCAAGGCGCGGGTGATGGTCTCCCGCAAGACCCCCAATGGGGTGACAGTGACAGAGGATTATGATGGTAGTCAGGATGAGCTGAAGTATGAATGGGTGGAATTTGAGCTGCCCGAAGGCAACTTCTCGGTGACCATGACCATCGACCTGATGAACAACGCCATCATCGACAATTACTTGGCGGTGGGGCGGCAGAACGGGGTGCTGGAGAGCGACATCGGCGTGAAGTTCGACACTAGGAACTTCAGGCTGGGCTGGGACCCCGTGACCGAGCTGGTCATGCCCGGGGTGTACACCAACGAGGCTTTCCATCCCGATATTGTCTTGCTGCCCGGCTGCGGGGTGGACTTCACCGAGAGCCGCCTCAGCAACCTGCTGGGCATTCGCAAGAGGCAGCCCTTCCAGGAAGGCTTCCAGATCATGTACGAGGATCTGGAGGGGGGCAACATCCCCGCGCTCCTGGATGTCGACGCCTATGAGAAAAGCAAGGAGGATGCAGCAGCTGAAGCAACTGCAGCCGTAGCTACCGCCTCTACCGAGGTCAGGGGCGATAATTTTGCAAGCGCCGCAGCAGTGGCAGCGGCCGAGGCGGCTGAAACCGAAAGTAAGATAGTCATTCAGCCGGTGGAGAAGGATAGCAAGAACAGGAGCTACAACGTACTACCGGACAAGATAAACACCGCCTACCGCAGCTGGTACCTAGCCTACAACTATGGCGACCCCGAGAAGGGCGTGCGCTCCTGGACGCTGCTCACCACCTCGGACGTCACCTGCGGCGTGGAGCAAGTCTACTGGTCGCTGCCCGACATGATGCAAGACCCGGTCACCTTCCGCTCCACGCGTCAAGTTAGCAACTACCCGGTGGTGGGCGCCGAGCTCCTGCCCGTCTACTCCAAGAGCTTCTTCAACGAGCAGGCCGTCTACTCGCAGCAGCTGCGCGCCTTCACCTCGCTTACGCACGTCTTCAACCGCTTCCCCGAGAACCAGATCCTCGTCCGCCCGCCCGCGCCCACCATTACCACCGTCAGTGAAAACGTTCCTGCTCTCACAGATCACGGGACCCTGCCGCTGCGCAGCAGTATCCGGGGAGTCCAGCGCGTGACCGTTACTGACGCCAGACGCCGCACCTGCCCCTACGTCTACAAGGCCCTGGGCATAGTCGCGCCGCGCGTCCTCTCGAGCCGCACCTTCTAAATGTCCATTCTCATCTCGCCCAGTAATAACACCGGTTGGGGCCTGCGCGCGCCCAGCAAGATGTACGGAGGCGCTCGCCAACGCTCCACGCAACACCCCGTGCGCGTGCGCGGGCACTTCCGCGCTCCCTGGGGCGCCCTCAAGGGCCGCGTGCGGTCGCGCACCACCGTCGACGACGTGATCGACCAGGTGGTGGCCGACGCGCGCAACTACACCCCCGCCGCCGCGCCCGTCTCCACCGTGGACGCCGTCATCGACAGCGTGGTGGCcGACGCGCGCCGGTACGCCCGCGCCAAGAGCCGGCGGCGGCGCATCGCCCGGCGGCACCGGAGCACCCCCGCCATGCGCGCGGCGCGAGCCTTGCTGCGCAGGGCCAGGCGCACGGGACGCAGGGCCATGCTCAGGGCGGCCAGACGCGCGGCTTCAGGCGCCAGCGCCGGCAGGACCCGGAGACGCGCGGCCACGGCGGCGGCAGCGGCCATCGCCAGCATGTCCCGCCCGCGGCGAGGGAACGTGTACTGGGTGCGCGACGCCGCCACCGGTGTGCGCGTGCCCGTGCGCACCCGCCCCCCTCGCACTTGAAGATGTTCACTTCGCGATGTTGATGTGTCCCAGCGGCGAGGAGGATGTCCAAGCGCAAATTCAAGGAAGAGATGCTCCAGGTCATCGCGCCTGAGATCTACGGCCCTGCGGTGGTGAAGGAGGAAAGAAAGCCCCGCAAAATCAAGCGGGTCAAAAAGGACAAAAAGGAAGAAGAAAGTGATGTGGACGGATTGGTGGAGTTTGTGCGCGAGTTCGCCCCCCGGCGGCGCGTGCAGTGGCGCGGGCGGAAGGTGCAACCGGTGCTGAGACCCGGCACCACCGTGGTCTTCACGCCCGGCGAGCGCTCCGGCACCGCTTCCAAGCGCTCCTACGACGAGGTGTACGGGGATGATGATATTCTGGAGCAGGCGGCCGAGCGCCTGGGCGAGTTTGCTTACGGCAAGCGCAGCCGTTCCGCACCGAAGGAAGAGGCGGTGTCCATCCCGCTGGACCACGGCAACCCCACGCCGAGCCTCAAGCCCGTGACCTTGCAGCAGGTGCTGCCGACCGCGGCGCCGCGCCGGGGGTTCAAGCGCGAGGGCGAGGATCTGTACCCCACCATGCAGCTGATGGTGCCCAAGCGCCAGAAGCTGGAAGACGTGCTGGAGACCATGAAGGTGGACCCGGACGTGCAGCCCGAGGTCAAGGTGCGGCCCATCAAGCAGGTGGCCCCGGGCCTGGGCGTGCAGACCGTGGACATCAAGATTCCCACGGAGCCCATGGAAACGCAGACCGAGCCCATGATCAAGCCCAGCACCAGCACCATGGAGGTGCAGACGGATCCCTGGATGCCATCGGCTCCTAGTCGAAGACCCCGGCGCAAGTACGGCGCGGCCAGCCTGCTGATGCCCAACTACGCGCTGCATCCTTCCATCATCCCCACGCCGGGCTACCGCGGCACGCGCTTCTACCGCGGTCATACCAGCAGCCGCCGCCGCAAGACCACCACTCGCCGCCGCCGTCGCCGCACCGCCGCTGCAACCACCCCTGCCGCCCTGGTGCGGAGAGTGTACCGCCGCGGCCGCGCACCTCTGACCCTGCCGCGCGCGCGCTACCACCCGAGCATCGCCATTTAAACTTTCGCCtGCTTTGCAGATCAATGGCCCTCACATGCCGCCTTCGCGTTCCCATTACGGGCTACCGAGGAAGAAAACCGCGCCGTAGAAGGCTGGCGGGGAACGGGATGCGTCGCCACCACCACCGGCGGCGGCGCGCCATCAGCAAGCGGTTGGGGGGAGGCTTCCTGCCCGCGCTGATCCCCATCATCGCCGCGGCGATCGGGGCGATCCCCGGCATTGCTTCCGTGGCGGTGCAGGCCTCTCAGCGCCACTGAGACACACTTGGAAACATCTTGTAATAAACCaATGGACTCTGACGCTCCTGGTCCTGTGATGTGTTTTCGTAGACAGATGGAAGACATCAATTTTTCGTCCCTGGCTCCGCGACACGGCACGCGGCCGTTCATGGGCACCTGGAGCGACATCGGCACCAGCCAACTGAACGGGGGCGCCTTCAATTGGAGCAGTCTCTGGAGCGGGCTTAAGAATTTCGGGTCCACGCTTAAAACCTATGGCAGCAAGGCGTGGAACAGCACCACAGGGCAGGCGCTGAGGGATAAGCTGAAAGAGCAGAACTTCCAGCAGAAGGTGGTCGATGGGCTCGCCTCGGGCATCAACGGGGTGGTGGACCTGGCCAACCAGGCCGTGCAGCGGCAGATCAACAGCCGCCTGGACCCGGTGCCGCCCGCCGGCTCCGTGGAGATGCCGCAGGTGGAGGAGGAGCTGCCTCCCCTGGACAAGCGGGGCGAGAAGCGACCCCGCCCCGATGCGGAGGAGACGCTGCTGACGCACACGGACGAGCCGCCCCCGTACGAGGAGGCGGTGAAACTGGGTCTGCCCACCACGCGGCCCATCGCGCCCCTGGCCACCGGGGTGCTGAAACCCGAAAAGCCCGCGACCCTGGACTTGCCTCCTCCCCAGCCTTCCCGCCCCTCTACAGTGGCTAAGCCCCTGCCGCCGGTGGCCGTGGCCCGCGCGCGACCCGGGGGCACCGCCCGCCCTCATGCGAACTGGCAGAGCACTCTGAACAGCATCGTGGGTCTGGGAGTGCAGAGTGTGAAGCGCCGCCGCTGCTATTAAACCTACCGTAGCGCTTAACTTGCTTGTCTGTGTGTGTATGTATTATGTCGCCGCCGCCGCTGTCCACCAGAAGGAGGAGTGAAGAGGCGCGTCGCCGAGTTGCAAGATGGCCACCCCATCGATGCTGCCCCAGTGGGCGTACATGCACATCGCCGGACAGGACGCTTCGGAGTACCTGAGTCCGGGTCTGGTGCAGTTTGCCCGCGCCACAGACACCTACTTCAGTCTGGGGAACAAGTTTAGGAACCCCACGGTGGCGCCCACGCACGATGTGACCACCGACCGCAGCCAGCGGCTGACGCTGCGCTTCGTGCCCGTGGACCGCGAGGACAACACCTACTCGTACAAAGTGCGCTACACGCTGGCCGTGGGCGACAACCGCGTGCTGGACATGGCCAGCACCTACTTTGACATCCGCGGCGTGCTGGATCGGGGCCCTAGCTTCAAACCCTACTCCGGCACCGCCTACAACAGTCTGGCCCCCAAGGGAGCACCCAACACTTGTCAGTGGACATATAAAGCCGATGGTGAAACTGCCACAGAAAAAACCTATACATATGGAAATGCACCCGTGCAGGGCATTAACATCACAAAAGATGGTATTCAACTTGGAACTGACACCGATGATCAGCCAATCTACGCAGATAAAACCTATCAGCCTGAACCTCAAGTGGGTGATGCTGAATGGCATGACATCACTGGTACTGATGAAAAGTATGGAGGCAGAGCTCTTAAGCCTGATACCAAAATGAAGCCTTGTTATGGTTCTTTTGCCAAGCCTACTAATAAAGAAGGAGGTCAGGCAAATGTGAAAACAGGAACAGGCACTACTAAAGAATATGACATAGACATGGCTTTCTTTGACAACAGAAGTGCGGCTGCTGCTGGCCTAGCTCCAGAAATTGTTTTGTATACTGAAAATGTGGATTTGGAAACTCCAGATACCCATATTGTATACAAAGCAGGCACAGATGACAGCAGCTCTTCTATTAATTTGGGTCAGCAAGCCATGCCCAACAGACCTAACTACATTGGTTTCAGAGACAACTTTATCGGGCTCATGTACTACAACAGCACTGGCAATATGGGGGTGCTGGCCGGTCAGGCTTCTCAGCTGAATGCTGTGGTTGACTTGCAAGACAGAAACACCGAGCTGTCCTACCAGCTCTTGCTTGACTCTCTGGGTGACAGAACCCGGTATTTCAGTATGTGGAATCAGGCGGTGGACAGCTATGATCCTGATGTGCGCATTATTGAAAATCATGGTGTGGAGGATGAACTTCCCAACTATTGTTTCCCTCTGGATGCTGTTGGCAGAACAGATACTTATCAGGGAATTAAGGCTAATGGAACTGATCAAACCACATGGACCAAAGATGACAGTGTCAATGATGCTAATGAGATAGGCAAGGGTAATCCATTCGCCATGGAAATCAACATCCAAGCCAACCTGTGGAGGAACTTCCTCTACGCCAACGTGGCCCTGTACCTGCCCGACTCTTACAAGTACACGCCGGCCAATGTTACCCTGCCCACCAACACCAACACCTACGATTACATGAACGGCCGGGTGGTGGCGCCCTCGCTGGTGGACTCCTACATCAACATCGGGGCGCGCTGGTCGCTGGATCCCATGGACAACGTGAACCCCTTCAACCACCACCGCAATGCGGGGCTGCGCTACCGCTCCATGCTCCTGGGCAACGGGCGCTACGTGCCCTTCCACATCCAGGTGCCCCAGAAATTTTTCGCCATCAAGAGCCTCCTGCTCCTGCCCGGGTCCTACACCTACGAGTGGAACTTCCGCAAGGACGTCAACATGATCCTGCAGAGCTCCCTCGGCAACGACCTGCGCACGGACGGGGCCTCCATCTCCTTCACCAGCATCAACCTCTACGCCACCTTCTTCCCCATGGCGCACAACACGGCCTCCACGCTCGAGGCCATGCTGCGCAACGACACCAACGACCAGTCCTTCAACGACTACCTCTCGGCGGCCAACATGCTCTACCCCATCCCGGCCAACGCCACCAACGTGCCCATCTCCATCCCCTCGCGCAACTGGGCCGCCTTCCGCGGCTGGTCCTTCACGCGTCTCAAGACCAAGGAGACGCCCTCGCTGGGCTCCGGGTTCGACCCCTACTTCGTCTACTCGGGCTCCATCCCCTACCTCGACGGCACCTTCTACCTCAACCACACCTTCAAGAAGGTCTCCATCACCTTCGACTCCTCCGTCAGCTGGCCCGGCAACGACCGGCTCCTGACGCCCAACGAGTTCGAAATCAAGCGCACCGTCGACGGCGAGGGCTACAACGTGGCCCAGTGCAACATGACCAAGGACTGGTTCCTGGTCCAGATGCTGGCCCACTACAACATCGGCTACCAGGGCTTCTACGTGCCCGAGGGCTACAAGGACCGCATGTACTCCTTCTTCCGCAACTTCCAGCCCATGAGCCGCCAGGTGGTGGACGAGGTCAACTACAAGGACTACCAGGCCGTCACCCTGGCCTACCAGCACAACAACTCGGGCTTCGTCGGCTACCTCGCGCCCACCATGCGCCAGGGCCAGCCCTACCCCGCCAACTACCCCTACCCGCTCATCGGCAAGAGCGCCGTCACCAGCGTCACCCAGAAAAAGTTCCTCTGCGACAGGGTCATGTGGCGCATCCCCTTCTCCAGCAACTTCATGTCCATGGGCGCGCTCACCGACCTCGGCCAGAACATGCTCTATGCCAACTCCGCCCACGCGCTAGACATGAATTTCGAAGTCGACCCCATGGATGAGTCCACCCTTCTCTATGTTGTCTTCGAAGTCTTCGACGTCGTCCGAGTGCACCAGCCCCACCGCGGCGTCATCGAGGCCGTCTACCTGCGCACCCCCTTCTCGGCCGGTAACGCCACCACCTAAGCTCTTGCTTCTTGCAAGCCATGGCCGCGGGCTCCGGCGAGCAGGAGCTCAGGGCCATCATCCGCGACCTGGGCTGCGGGCCCTACTTCCTGGGCACCTTCGATAAGCGCTTCCCGGGATTCATGGCCCCGCACAAGCTGGCCTGCGCCATCGTCAACACGGCCGGCCGCGAGACCGGGGGCGAGCACTGGCTGGCCTTCGCCTGGAACCCGCGCTCGAACACCTGCTACCTCTTCGACCCCTTCGGGTTCTCGGACGAGCGCCTCAAGCAGATCTACCAGTTCGAGTACGAGGGCCTGCTGCGCCGCAGCGCCCTGGCCACCGAGGACCGCTGCGTCACCCTGGAAAAGTCCACCCAGACCGTGCAGGGTCCGCGCTCGGCCGCCTGCGGGCTCTTCTGCTGCATGTTCCTGCACGCCTTCGTGCACTGGCCCGACCGCCCCATGGACAAGAACCCCACCATGAACTTGCTGACGGGGGTGCCCAACGGCATGCTCCAGTCGCCCCAGGTGGAACCCACCCTGCGCCGCAACCAGGAGGCGCTCTACCGCTTCCTCAACTCCCACTCCGCCTACTTTCGCTCCCACCGCGCGCGCATCGAGAAGGCCACCGCCTTCGACCGCATGAATCAAGACATGTAAACCGTGTGTGTATGTTAAATGTCTTTAATAAACAGCACTTTCATGTTACACATGCATCTGAGATGATTTATTTAGAAATCGAAAGGGTTCTGCCGGGTCTCGGCATGGCCCGCGGGCAGGGACACGTTGCGGAACTGGTACTTGGCCAGCCACTTGAACTCGGGGATCAGCAGTTTGGGCAGCGGGGTGTCGGGGAAGGAGTCGGTCCACAGCTTCCGCGTCAGTTGCAGGGCGCCCAGCAGGTCGGGCGCGGAGATCTTGAAATCGCAGTTGGGACCCGCGTTCTGCGCGCGGGAGTTGCGGTACACGGGGTTGCAGCACTGGAACACCATCAGGGCCGGGTGCTTCACGCTCGCCAGCACCGTCGCGTCGGTGATGCTCTCCACGTCGAGGTCCTCGGCGTTGGCCATCCCGAAGGGGGTCATCTTGCAGGTCTGCCTTCCCATGGTGGGCACGCACCCGGGCTTGTGGTTGCAATCGCAGTGCAGGGGGATCAGCATCATCTGGGCCTGGTCGGCGTTCATCCCCGGGTACATGGCCTTCATGAAAGCCTCCAATTGCCTGAACGCCTGCTGGGCCTTGGCTCCCTCGGTGAAGAAGACCCCGCAGGACTTGCTAGAGAACTGGTTGGTGGCGCACCCGGCGTCGTGCACGCAGCAGCGCGCGTCGTTGTTGGCCAGCTGCACCACGCTGCGCCCCCAGCGGTTCTGGGTGATCTTGGCCCGGTCGGGGTTCTCCTTCAGCGCGCGCTGCCCGTTCTCGCTCGCCACATCCATCTCGATCATGTGCTCCTTCTGGATCATGGTGGTCCCGTGCAGGCACCGCAGCTTGCCCTCGGCCTCGGTGCACCCGTGCAGCCACAGCGCGCACCCGGTGCACTCCCAGTTCTTGTGGGCGATCTGGGAATGCGCGTGCACGAAGCCCTGCAGGAAGCGGCCCATCATGGTGGTCAGGGTCTTGTTGCTAGTGAAGGTCAGCGGAATGCCGCGGTGCTCCTCGTTGATGTACAGGTGGCAGATGCGGCGGTACACCTCGCCCTGCTCGGGCATCAGCTGGAAGTTGGCTTTCAGGTCGGTCTCCACGCGGTAGCGGTCCATCAGCATAGTCATGATTTCCATACCCTTCTCCCAGGCCGAGACGATGGGCAGGCTCATAGGGTTCTTCACCATCATCTTAGCGCTAGCAGCCGCGGCCAGGGGGTCGCTCTCGTCCAGGGTCTCAAAGCTCCGCTTGCCGTCCTTCTCGGTGATCCGCACCGGGGGGTAGCTGAAGCCCACGGCCGCCAGCTCCTCCTCGGCCTGTCTTTCGTCCTCGCTGTCCTGGCTGACGTCCTGCAGGACCACATGCTTGGTCTTGCGGGGTTTCTTCTTGGGCGGCAGCGGCGGCGGAGATGTTGGAGATGGCGAGGGGGAGCGCGAGTTCTCGCTCACCACTACTATCTCTTCCTCTTCTTGGTCCGAGGCCACGCGGCGGTAGGTATGTCTCTTCGGGGGCAGAGGCGGAGGCGACGGGCTCTCGCCGCCGCGACTTGGCGGATGGCTGGCAGAGCCCCTTCCGCGTTCGGGGGTGCGCTCCCGGCGGCGCTCTGACTGACTTCCTCCGCGGCCGGCCATTGTGTTCTCCTAGGGAGGAACAACAAGCATGGAGACTCAGCCATCGCCAACCTCGCCATCTGCCCCCACCGCCGACGAGAAGCAGCAGCAGCAGAATGAAAGCTTAACCGCCCCGCCGCCCAGCCCCGCCACCTCCGACGCGGCCGTCCCAGACATGCAAGAGATGGAGGAATCCATCGAGATTGACCTGGGCTATGTGACGCCCGCGGAGCACGAGGAGGAGCTGGCAGTGCGCTTTTCACAAGAAGAGATACACCAAGAACAGCCAGAGCAGGAAGCAGAGAATGAGCAGAGTCAGGCTGGGCTCGAGCATGACGGCGACTACCTCCACCTGAGCGGGGGGGAGGACGCGCTCATCAAGCATCTGGCCCGGCAGGCCACCATCGTCAAGGATGCGCTGCTCGACCGCACCGAGGTGCCCCTCAGCGTGGAGGAGCTCAGCCGCGCCTACGAGTTGAACCTCTTCTCGCCGCGCGTGCCCCCCAAGCGCCAGCCCAATGGCACCTGCGAGCCCAACCCGCGCCTCAACTTCTACCCGGTCTTCGCGGTGCCCGAGGCCCTGGCCACCTACCACATCTTTTTCAAGAACCAAAAGATCCCCGTCTCCTGCCGCGCCAACCGCACCCGCGCCGACGCCCTTTTCAACCTGGGTCCCGGCGCCCGCCTACCTGATATCGCCTCCTTGGAAGAGGTTCCCAAGATCTTCGAGGGTCTGGGCAGCGACGAGACTCGGGCCGCGAACGCTCTGCAAGGAGAAGGAGGAGAGCATGAGCACCACAGCGCCCTGGTCGAGTTGGAAGGCGACAACGCGCGGCTGGCGGTGCTCAAACGCACGGTCGAGCTGACCCATTTCGCCTACCCGGCTCTGAACCTGCCCCCCAAAGTCATGAGCGCGGTCATGGACCAGGTGCTCATCAAGCGCGCGTCGCCCATCTCCGAGGACGAGGGCATGCAAGACTCCGAGGAGGGCAAGCCCGTGGTCAGCGACGAGCAGCTGGCCCGGTGGCTGGGTCCTAATGCTAGTCCCCAGAGTTTGGAAGAGCGGCGCAAACTCATGATGGCCGTGGTCCTGGTGACCGTGGAGCTGGAGTGCCTGCGCCGCTTCTTCGCCGACGCGGAGACCCTGCGCAAGGTCGAGGAGAACCTGCACTACCTCTTCAGGCACGGGTTCGTGCGCCAGGCCTGCAAGATCTCCAACGTGGAGCTGACCAACCTGGTCTCCTACATGGGCATCTTGCACGAGAACCGCCTGGGGCAGAACGTGCTGCACACCACCCTGCGCGGGGAGGCCCGGCGCGACTACATCCGCGACTGCGTCTACCTCTACCTCTGCCACACCTGGCAGACGGGCATGGGCGTGTGGCAGCAGTGTCTGGAGGAGCAGAACCTGAAAGAGCTCTGCAAGCTCCTGCAGAAGAACCTCAAGGGTCTGTGGACCGGGTTCGACGAGCGCACCACCGCCTCGGACCTGGCCGACCTCATTTTCCCCGAGCGCCTCAGGCTGACGCTGCGCAACGGCCTGCCCGACTTTATGAGCCAAAGCATGTTGCAAAACTTTCGCTCTTTCATCCTCGAACGCTCCGGAATCCTGCCCGCCACCTGCTCCGCGCTGCCCTCGGACTTCGTGCCGCTGACCTTCCGCGAGTGCCCCCCGCCGCTGTGGAGCCACTGCTACCTGCTGCGCCTGGCCAACTACCTGGCCTACCACTCGGACGTGATCGAGGACGTCAGCGGCGAGGGCCTGCTCGAGTGCCACTGCCGCTGCAACCTCTGCACGCCGCACCGCTCCCTGGCCTGCAACCCCCAGCTGCTGAGCGAGACCCAGATCATCGGCACCTTCGAGTTGCAAGGGCCCAGCGAAGGCGAGGGTTCAGCCGCCAAGGGGGGTCTGAAACTCACCCCGGGGCTGTGGACCTCGGCCTACTTGCGCAAGTTCGTGCCCGAGGACTACCATCCCTTCGAGATCAGGTTCTACGAGGACCAATCCCATCCGCCCAAGGCCGAGCTGTCGGCCTGCGTCATCACCCAGGGGGCGATCCTGGCCCAATTGCAAGCCATCCAGAAATCCCGCCAAGAATTCTTGCTGAAAAAGGGCCGCGGGGTCTACCTCGACCCCCAGACCGGTGAGGAGCTCAACCCCGGCTTCCCCCAGGATGCCCCGAGGAAACAAGAAGCTGAAAGTGGAGCTGCCGCCCGTGGAGGATTTGGAGGAAGACTGGGAGAACAGCAGTCAGGCAGAGGAGGAGGAGATGGAGGAAGACTGGGACAGCACTCAGGCAGAGGAGGACAGCCTGCAAGACAGTCTGGAGGAAGACGAGGAGGAGGCAGAGGAGGAGGTGGAAGAAGCAGCCGCCGCCAGACCGTCGTCCTCGGCGGGGGAGAAAGCAAGCAGCACGGATACCATCTCCGCTCCGGGTCGGGGTCCCGCTCGACCACACAGTAGATGGGACGAGACCGGACGATTCCCGAACCCCACCACCCAGACCGGTAAGAAGGAGCGGCAGGGATACAAGTCCTGGCGGGGGCACAAAAACGCCATCGTCTCCTGCTTGCAGGCCTGCGGGGGCAACATCTCCTTCACCCGGCGCTACCTGCTCTTCCACCGCGGGGTGAACTTTCCCCGCAACATCTTGCATTACTACCGTCACCTCCACAGCCCCTACTACTTCCAAGAAGAGGCAGCAGCAGCAGAAAAAGACCAGCAGAAAACCAGCAGCTAGAAAATCCACAGCGGCGGCAGCAGGTGGACTGAGGATCGCGGCGAACGAGCCGGCGCAAACCCGGGAGCTGAGGAACCGGATCTTTCCCACCCTCTATGCCATCTTCCAGCAGAGTCGGGGGCAGGAGCAGGAACTGAAAGTCAAGAACCGTTCTCTGCGCTCGCTCACCCGCAGTTGTCTGTATCACAAGAGCGAAGACCAACTTCAGCGCACTCTCGAGGACGCCGAGGCTCTCTTCAACAAGTACTGCGCGCTCACTCTTAAAGAGTAGCCCGCGCCCGCCCAGTCGCAGAAAAAGGCGGGAATTACGTCACCTGTGCCCTTCGCCCTAGCCGCCTCCACCCATCATCATGAGCAAAGAGATTCCCACGCCTTACATGTGGAGCTACCAGCCCCAGATGGGCCTGGCCGCCGGTGCCGCCCAGGACTACTCCACCCGCATGAATTGGCTCAGCGCCGGGCCCGCGATGATCTCACGGGTGAATGACATCCGCGCCCACCGAAACCAGATACTCCTAGAACAGTCAGCGCTCACCGCCACGCCCCGCAATCACCTCAATCCGCGTAATTGGCCCGCCGCCCTGGTGTACCAGGAAATTCCCCAGCCCACGACCGTACTACTTCCGCGAGACGCCCAGGCCGAAGTCCAGCTGACTAACTCAGGTGTCCAGCTGGCGGGCGGCGCCACCCTGTGTCGTCACCGCCCCGCTCAGGGTATAAAGCGGCTGGTGATCCGGGGCAGAGGCACACAGCTCAACGACGAGGTGGTGAGCTCTTCGCTGGGTCTGCGACCTGACGGAGTCTTCCAACTCGCCGGATCGGGGAGATCTTCCTTCACGCCTCGTCAGGCCGTCCTGACTTTGGAGAGTTCGTCCTCGCAGCCCCGCTCGGGTGGCATCGGCACTCTCCAGTTCGTGGAGGAGTTCACTCCCTCGGTCTACTTCAACCCCTTCTCCGGCTCCCCCGGCCACTACCCGGACGAGTTCATCCCGAACTTCGACGCCATCAGCGAGTCGGTGGACGGCTACGATTGAAACTAATCACCCCCTTATCCAGTGAAATAAAGATCATATTGATGATGATTTTACAGAAATAAAAAATAATCATTTGATTTGAAATAAAGATACAATCATATTGATGATTTGAGTTTAACAAAAAAATAAAGAATCACTTACTTGAAATCTGATACCAGGTCTCTGTCCATGTTTTCTGCCAACACCACTTCACTCCCCTCTTCCCAGCTCTGGTACTGCAGGCCCCGGCGGGCTGCAAACTTCCTCCACACGCTGAAGGGGATGTCAAATTCCTCCTGTCCCTCAATCTTCATTTTATCTTCTATCAGATGTCCAAAAAGCGCGTCCGGGTGGATGATGACTTCGACCCCGTCTACCCCTACGATGCAGACAACGCACCGACCGTGCCCTTCATCAACCCCCCCTTCGTCTCTTCAGATGGATTCCAAGAGAAGCCCCTGGGGGTGTTGTCCCTGCGACTGGCCGACCCCGTCACCACCAAGAACGGGGAAATCACCCTCAAGCTGGGAGAGGGGGTGGACCTCGATTCCTCGGGAAAACTCATCTCCAACACGGCCACCAAGGCCGCCGCCCCTCTCAGTTTTTCCAACAACACCATTTCCCTTAACATGGATCACCCCTTTTACACTAAAGATGGAAAATTATCCTTACAAGTTTCTCCACCATTAAATATACTGAGAACAAGCATTCTAAACACACTAGCTTTAGGTTTTGGATCAGGTTTAGGACTCCGTGGCTCTGCCTTGGCAGTACAGTTAGTCTCTCCACTTACATTTGATACTGATGGAAACATAAAGCTTACCTTAGACAGAGGTTTGCATGTTACAACAGGAGATGCAATTGAAAGCAACATAAGCTGGGCTAAAGGTTTAAAATTTGAAGATGGAGCCATAGCAACCAACATTGGAAATGGGTTAGAGTTTGGAAGCAGTAGTACAGAAACAGGTGTTGATGATGCTTACCCAATCCAAGTTAAACTTGGATCTGGCCTTAGCTTTGACAGTACAGGAGCCATAATGGCTGGTAACAAAGAAGACGATAAACTCACTTTGTGGACAACACCTGATCCATCACCAAACTGTCAAATACTCGCAGAAAATGATGCAAAACTAACACTTTGCTTGACTAAATGTGGTAGTCAAATACTGGCCACTGTGTCAGTCTTAGTTGTAGGAAGTGGAAACCTAAACCCCATTACTGGCACCGTAAGCAGTGCTCAGGTGTTTCTACGTTTTGATGCAAACGGTGTTCTTTTAACAGAACATTCTACACTAAAAAAATACTGGGGGTATAGGCAGGGAGATAGCATAGATGGCACTCCATATACCAATGCTGTAGGATTCATGCCCAATTTAAAAGCTTATCCAAAGTCACAAAGTTCTACTACTAAAAATAATATAGTAGGGCAAGTATACATGAATGGAGATGTTTCAAAACCTATGCTTCTCACTATAACCCTCAATGGTACTGATGACAGCAACAGTACATATTCAATGTCATTTTCATACACCTGGACTAATGGAAGCTATGTTGGAGCAACATTTGGGGCTAACTCTTATACCTTCTCATACATCGCCCAAGAATGAACACTGTATCCCACCCTGCATGCCAACCCTTCCCACCCCACTCTGTGGAACAAACTCTGAAACACAAAATAAAATAAAGTTCAAGTGTTTTATTGATTCAACAGTTTTACAGGATTCGAGCAGTTATTTTTCCTCCACCCTCCCAGGACATGGAATACACCACCCTCTCCCCCCGCACAGCCTTGAACATCTGAATGCCATTGGTGATGGACATGCTTTTGGTCTCCACGTTCCACACAGTTTCAGAGCGAGCCAGTCTCGGGTCGGTCAGGGAGATGAAACCCTCCGGGCACTCCCGCATCTGCACCTCACAGCTCAACAGCTGAGGATTGTCCTCGGTGGTCGGGATCACGGTTATCTGGAAGAAGCAGAAGAGCGGCGGTGGGAATCATAGTCCGCGAACGGGATCGGCCGGTGGTGTCGCATCAGGCCCCGCAGCAGTCGCTGCCGCCGCCGCTCCGTCAAGCTGCTGCTCAGGGGGTCCGGGTCCAGGGACTCCCTCAGCATGATGCCCACGGCCCTCAGCATCAGTCGTCTGGTGCGGCGGGCGCAGCAGCGCATGCGGATCTCGCTCAGGTCGCTGCAGTACGTGCAACACAGAACCACCAGGTTGTTCAACAGTCCATAGTTCAACACGCTCCAGCCGAAACTCATCGCGGGAAGGATGCTACCCACGTGGCCGTCGTACCAGATCCTCAGGTAAATCAAGTGGTGCCCCCTCCAGAACACGCTGCCCACGTACATGATCTCCTTGGGCATGTGGCGGTTCACCACCTCCCGGTACCACATCACCCTCTGGTTGAACATGCAGCCCCGGATGATCCTGCGGAACCACAGGGCCAGCACCGCCCCGCCCGCCATGCAGCGAAGAGACCCCGGGTCCCGGCAATGGCAATGGAGGACCCACCGCTCGTACCCGTGGATCATCTGGGAGCTGAACAAGTCTATGTTGGCACAGCACAGGCATATGCTCATGCATCTCTTCAGCACTCTCAACTCCTCGGGGGTCAAAACCATATCCCAGGGCACGGGGAACTCTTGCAGGACAGCGAACCCCGCAGAACAGGGCAATCCTCGCACAGAACTTACATTGTGCATGGACAGGGTATCGCAATCAGGCAGCACCGGGTGATCCTCCACCAGAGAAGCGCGGGTCTCGGTCTCCTCACAGCGTGGTAAGGGGGCCGGCCGATACGGGTGATGGCGGGACGCGGCTGATCGTGTTCGCGACCGTGTCATGATGCAGTTGCTTTCGGACATTTTCGTACTTGCTGTAGCAGAACCTGGTCCGGGCGCTGCACACCGATCGCCGGCGGCGGTCTCGGCGCTTGGAACGCTCGGTGTTGAAATTGTAAAACAGCCACTCTCTCAGACCGTGCAGCAGATCTAGGGCCTCAGGAGTGATGAAGATCCCATCATGCCTGATGGCTCTGATCACATCGACCACCGTGGAATGGGCCAGACCCAGCCAGATGATGCAATTTTGTTGGGTTTCGGTGACGGCGAGCCTCGGGAACAACGATGAAGTAAATGCAAGCGGTGCGTTCCAGCATGGTTAGTTAGCTGATCTGTAGAAAAAACAAAAATGAACATTAAACCATGCTAGCCTGGCGAACAGGTGGGTAAATCGTTCTCTCCAGCACCAGGCAGGCCACGGGGTCTCCGGCGCGACCCTCGTAAAAATTGTCGCTATGATTGAAAACCATCACAGAGAGACGTTCCCGGTGGCCGGCGTGAATGATTCGACAAGATGAATACACCCCCGGAACATTGGCGTCCGCGAGTGAAAAAAAGCGCCCGAGGAAGCAATAAGGCACTACAATGCTCAGTCTCAAGTCCAGCAAAGCGATGCCATGCGGATGAAGCACAAAATTCTCAGGTGCGTACAAAATGTAATTACTCCCCTCCTGCACAGGCAGCAAAGCCCCCGATCCCTCCAGGTACACATACAAAGCCTCAGCGTCCATAGCTTACCGAGCAGCAGCACACAACAGGCGCAAGAGTCAGAGAAAGGCTGAGCTCTAACCTGTCCACCCGCTCTCTGCTCAATATATAGCCCAGATCTACACTGACGTAAAGGCCAAAGTCTAAAAATACCCGCCAAATAATCACACACGCCCAGCACACGCCCAGAAACCGGTGACACACTCAAAAAAATACGCGCACTTCCTCAAACGCCCAAAACTGCCGTCATTTCCGGGTTCCCACGCTACGTCATCAAAACACGACTTTCAAATTCCGTCGACCGTTAAAAACGTCACCCGCCCCGCCCCTAACGGTCGCCCGTCTCTCAGCCAATCAGCGCCCCGCATCCCCAAATTCAAACACCTCATTTGCATATTAACGCGCACAAAAAGTTTGAGGTATATTATTGATGATG
ChAdV68-空-E4缺失(SEQ ID NO:59)
CATCTTCAATAATATACCTCAAACTTTTTGTGCGCGTTAATATGCAAATGAGGCGTTTGAATTTGGGGAGGAAGGGCGGTGATTGGTCGAGGGATGAGCGACCGTTAGGGGCGGGGCGAGTGACGTTTTGATGACGTGGTTGCGAGGAGGAGCCAGTTTGCAAGTTCTCGTGGGAAAAGTGACGTCAAACGAGGTGTGGTTTGAACACGGAAATACTCAATTTTCCCGCGCTCTCTGACAGGAAATGAGGTGTTTCTGGGCGGATGCAAGTGAAAACGGGCCATTTTCGCGCGAAAACTGAATGAGGAAGTGAAAATCTGAGTAATTTCGCGTTTATGGCAGGGAGGAGTATTTGCCGAGGGCCGAGTAGACTTTGACCGATTACGTGGGGGTTTCGATTACCGTGTTTTTCACCTAAATTTCCGCGTACGGTGTCAAAGTCCGGTGTTTTTACGTAGGTGTCAGCTGATCGCCAGGGTATTTAAACCTGCGCTCTCCAGTCAAGAGGCCACTCTTGAGTGCCAGCGAGAAGAGTTTTCTCCTCCGCGCCGCGAGTCAGATCTACACTTTGAAAGTAGGGataaGGTAGCGAGTGAGTAGTGTTCTGGGGCGGGGGAGGACCTGCATGAGGGCCAGAATAACTGAAATCTGTGCTTTTCTGTGTGTTGCAGCAGCATGAGCGGAAGCGGCTCCTTTGAGGGAGGGGTATTCAGCCCTTATCTGACGGGGCGTCTCCCCTCCTGGGCGGGAGTGCGTCAGAATGTGATGGGATCCACGGTGGACGGCCGGCCCGTGCAGCCCGCGAACTCTTCAACCCTGACCTATGCAACCCTGAGCTCTTCGTCGTTGGACGCAGCTGCCGCCGCAGCTGCTGCATCTGCCGCCAGCGCCGTGCGCGGAATGGCCATGGGCGCCGGCTACTACGGCACTCTGGTGGCCAACTCGAGTTCCACCAATAATCCCGCCAGCCTGAACGAGGAGAAGCTGTTGCTGCTGATGGCCCAGCTCGAGGCCTTGACCCAGCGCCTGGGCGAGCTGACCCAGCAGGTGGCTCAGCTGCAGGAGCAGACGCGGGCCGCGGTTGCCACGGTGAAATCCAAATAAAAAATGAATCAATAAATAAACGGAGACGGTTGTTGATTTTAACACAGAGTCTGAATCTTTATTTGATTTTTCGCGCGCGGTAGGCCCTGGACCACCGGTCTCGATCATTGAGCACCCGGTGGATCTTTTCCAGGACCCGGTAGAGGTGGGCTTGGATGTTGAGGTACATGGGCATGAGCCCGTCCCGGGGGTGGAGGTAGCTCCATTGCAGGGCCTCGTGCTCGGGGGTGGTGTTGTAAATCACCCAGTCATAGCAGGGGCGCAGGGCATGGTGTTGCACAATATCTTTGAGGAGGAGACTGATGGCCACGGGCAGCCCTTTGGTGTAGGTGTTTACAAATCTGTTGAGCTGGGAGGGATGCATGCGGGGGGAGATGAGGTGCATCTTGGCCTGGATCTTGAGATTGGCGATGTTACCGCCCAGATCCCGCCTGGGGTTCATGTTGTGCAGGACCACCAGCACGGTGTATCCGGTGCACTTGGGGAATTTATCATGCAACTTGGAAGGGAAGGCGTGAAAGAATTTGGCGACGCCTTTGTGCCCGCCCAGGTTTTCCATGCACTCATCCATGATGATGGCGATGGGCCCGTGGGCGGCGGCCTGGGCAAAGACGTTTCGGGGGTCGGACACATCATAGTTGTGGTCCTGGGTGAGGTCATCATAGGCCATTTTAATGAATTTGGGGCGGAGGGTGCCGGACTGGGGGACAAAGGTACCCTCGATCCCGGGGGCGTAGTTCCCCTCACAGATCTGCATCTCCCAGGCTTTGAGCTCGGAGGGGGGGATCATGTCCACCTGCGGGGCGATAAAGAACACGGTTTCCGGGGCGGGGGAGATGAGCTGGGCCGAAAGCAAGTTCCGGAGCAGCTGGGACTTGCCGCAGCCGGTGGGGCCGTAGATGACCCCGATGACCGGCTGCAGGTGGTAGTTGAGGGAGAGACAGCTGCCGTCCTCCCGGAGGAGGGGGGCCACCTCGTTCATCATCTCGCGCACGTGCATGTTCTCGCGCACCAGTTCCGCCAGGAGGCGCTCTCCCCCCAGGGATAGGAGCTCCTGGAGCGAGGCGAAGTTTTTCAGCGGCTTGAGTCCGTCGGCCATGGGCATTTTGGAGAGGGTTTGTTGCAAGAGTTCCAGGCGGTCCCAGAGCTCGGTGATGTGCTCTACGGCATCTCGATCCAGCAGACCTCCTCGTTTCGCGGGTTGGGACGGCTGCGGGAGTAGGGCACCAGACGATGGGCGTCCAGCGCAGCCAGGGTCCGGTCCTTCCAGGGTCGCAGCGTCCGCGTCAGGGTGGTCTCCGTCACGGTGAAGGGGTGCGCGCCGGGCTGGGCGCTTGCGAGGGTGCGCTTCAGGCTCATCCGGCTGGTCGAAAACCGCTCCCGATCGGCGCCCTGCGCGTCGGCCAGGTAGCAATTGACCATGAGTTCGTAGTTGAGCGCCTCGGCCGCGTGGCCTTTGGCGCGGAGCTTACCTTTGGAAGTCTGCCCGCAGGCGGGACAGAGGAGGGACTTGAGGGCGTAGAGCTTGGGGGCGAGGAAGACGGACTCGGGGGCGTAGGCGTCCGCGCCGCAGTGGGCGCAGACGGTCTCGCACTCCACGAGCCAGGTGAGGTCGGGCTGGTCGGGGTCAAAAACCAGTTTCCCGCCGTTCTTTTTGATGCGTTTCTTACCTTTGGTCTCCATGAGCTCGTGTCCCCGCTGGGTGACAAAGAGGCTGTCCGTGTCCCCGTAGACCGACTTTATGGGCCGGTCCTCGAGCGGTGTGCCGCGGTCCTCCTCGTAGAGGAACCCCGCCCACTCCGAGACGAAAGCCCGGGTCCAGGCCAGCACGAAGGAGGCCACGTGGGACGGGTAGCGGTCGTTGTCCACCAGCGGGTCCACCTTTTCCAGGGTATGCAAACACATGTCCCCCTCGTCCACATCCAGGAAGGTGATTGGCTTGTAAGTGTAGGCCACGTGACCGGGGGTCCCGGCCGGGGGGGTATAAAAGGGTGCGGGTCCCTGCTCGTCCTCACTGTCTTCCGGATCGCTGTCCAGGAGCGCCAGCTGTTGGGGTAGGTATTCCCTCTCGAAGGCGGGCATGACCTCGGCACTCAGGTTGTCAGTTTCTAGAAACGAGGAGGATTTGATATTGACGGTGCCGGCGGAGATGCCTTTCAAGAGCCCCTCGTCCATCTGGTCAGAAAAGACGATCTTTTTGTTGTCGAGCTTGGTGGCGAAGGAGCCGTAGAGGGCGTTGGAGAGGAGCTTGGCGATGGAGCGCATGGTCTGGTTTTTTTCCTTGTCGGCGCGCTCCTTGGCGGCGATGTTGAGCTGCACGTACTCGCGCGCCACGCACTTCCATTCGGGGAAGACGGTGGTCAGCTCGTCGGGCACGATTCTGACCTGCCAGCCCCGATTATGCAGGGTGATGAGGTCCACACTGGTGGCCACCTCGCCGCGCAGGGGCTCATTAGTCCAGCAGAGGCGTCCGCCCTTGCGCGAGCAGAAGGGGGGCAGGGGGTCCAGCATGACCTCGTCGGGGGGGTCGGCATCGATGGTGAAGATGCCGGGCAGGAGGTCGGGGTCAAAGTAGCTGATGGAAGTGGCCAGATCGTCCAGGGCAGCTTGCCATTCGCGCACGGCCAGCGCGCGCTCGTAGGGACTGAGGGGCGTGCCCCAGGGCATGGGATGGGTAAGCGCGGAGGCGTACATGCCGCAGATGTCGTAGACGTAGAGGGGCTCCTCGAGGATGCCGATGTAGGTGGGGTAGCAGCGCCCCCCGCGGATGCTGGCGCGCACGTAGTCATACAGCTCGTGCGAGGGGGCGAGGAGCCCCGGGCCCAGGTTGGTGCGACTGGGCTTTTCGGCGCGGTAGACGATCTGGCGGAAAATGGCATGCGAGTTGGAGGAGATGGTGGGCCTTTGGAAGATGTTGAAGTGGGCGTGGGGCAGTCCGACCGAGTCGCGGATGAAGTGGGCGTAGGAGTCTTGCAGCTTGGCGACGAGCTCGGCGGTGACTAGGACGTCCAGAGCGCAGTAGTCGAGGGTCTCCTGGATGATGTCATACTTGAGCTGTCCCTTTTGTTTCCACAGCTCGCGGTTGAGAAGGAACTCTTCGCGGTCCTTCCAGTACTCTTCGAGGGGGAACCCGTCCTGATCTGCACGGTAAGAGCCTAGCATGTAGAACTGGTTGACGGCCTTGTAGGCGCAGCAGCCCTTCTCCACGGGGAGGGCGTAGGCCTGGGCGGCCTTGCGCAGGGAGGTGTGCGTGAGGGCGAAAGTGTCCCTGACCATGACCTTGAGGAACTGGTGCTTGAAGTCGATATCGTCGCAGCCCCCCTGCTCCCAGAGCTGGAAGTCCGTGCGCTTCTTGTAGGCGGGGTTGGGCAAAGCGAAAGTAACATCGTTGAAGAGGATCTTGCCCGCGCGGGGCATAAAGTTGCGAGTGATGCGGAAAGGTTGGGGCACCTCGGCCCGGTTGTTGATGACCTGGGCGGCGAGCACGATCTCGTCGAAGCCGTTGATGTTGTGGCCCACGATGTAGAGTTCCACGAATCGCGGACGGCCCTTGACGTGGGGCAGTTTCTTGAGCTCCTCGTAGGTGAGCTCGTCGGGGTCGCTGAGCCCGTGCTGCTCGAGCGCCCAGTCGGCGAGATGGGGGTTGGCGCGGAGGAAGGAAGTCCAGAGATCCACGGCCAGGGCGGTTTGCAGACGGTCCCGGTACTGACGGAACTGCTGCCCGACGGCCATTTTTTCGGGGGTGACGCAGTAGAAGGTGCGGGGGTCCCCGTGCCAGCGATCCCATTTGAGCTGGAGGGCGAGATCGAGGGCGAGCTCGACGAGCCGGTCGTCCCCGGAGAGTTTCATGACCAGCATGAAGGGGACGAGCTGCTTGCCGAAGGACCCCATCCAGGTGTAGGTTTCCACATCGTAGGTGAGGAAGAGCCTTTCGGTGCGAGGATGCGAGCCGATGGGGAAGAACTGGATCTCCTGCCACCAATTGGAGGAATGGCTGTTGATGTGATGGAAGTAGAAATGCCGACGGCGCGCCGAACACTCGTGCTTGTGTTTATACAAGCGGCCACAGTGCTCGCAACGCTGCACGGGATGCACGTGCTGCACGAGCTGTACCTGAGTTCCTTTGACGAGGAATTTCAGTGGGAAGTGGAGTCGTGGCGCCTGCATCTCGTGCTGTACTACGTCGTGGTGGTCGGCCTGGCCCTCTTCTGCCTCGATGGTGGTCATGCTGACGAGCCCGCGCGGGAGGCAGGTCCAGACCTCGGCGCGAGCGGGTCGGAGAGCGAGGACGAGGGCGCGCAGGCCGGAGCTGTCCAGGGTCCTGAGACGCTGCGGAGTCAGGTCAGTGGGCAGCGGCGGCGCGCGGTTGACTTGCAGGAGTTTTTCCAGGGCGCGCGGGAGGTCCAGATGGTACTTGATCTCCACCGCGCCATTGGTGGCGACGTCGATGGCTTGCAGGGTCCCGTGCCCCTGGGGTGTGACCACCGTCCCCCGTTTCTTCTTGGGCGGCTGGGGCGACGGGGGCGGTGCCTCTTCCATGGTTAGAAGCGGCGGCGAGGACGCGCGCCGGGCGGCAGGGGCGGCTCGGGGCCCGGAGGCAGGGGCGGCAGGGGCACGTCGGCGCCGCGCGCGGGTAGGTTCTGGTACTGCGCCCGGAGAAGACTGGCGTGAGCGACGACGCGACGGTTGACGTCCTGGATCTGACGCCTCTGGGTGAAGGCCACGGGACCCGTGAGTTTGAACCTGAAAGAGAGTTCGACAGAATCAATCTCGGTATCGTTGACGGCGGCCTGCCGCAGGATCTCTTGCACGTCGCCCGAGTTGTCCTGGTAGGCGATCTCGGTCATGAACTGCTCGATCTCCTCCTCTTGAAGGTCTCCGCGGCCGGCGCGCTCCACGGTGGCCGCGAGGTCGTTGGAGATGCGGCCCATGAGCTGCGAGAAGGCGTTCATGCCCGCCTCGTTCCAGACGCGGCTGTAGACCACGACGCCCTCGGGATCGCgGGCGCGCATGACCACCTGGGCGAGGTTGAGCTCCACGTGGCGCGTGAAGACCGCGTAGTTGCAGAGGCGCTGGTAGAGGTAGTTGAGCGTGGTGGCGATGTGCTCGGTGACGAAGAAATACATGATCCAGCGGCGGAGCGGCATCTCGCTGACGTCGCCCAGCGCCTCCAAACGTTCCATGGCCTCGTAAAAGTCCACGGCGAAGTTGAAAAACTGGGAGTTGCGCGCCGAGACGGTCAACTCCTCCTCCAGAAGACGGATGAGCTCGGCGATGGTGGCGCGCACCTCGCGCTCGAAGGCCCCCGGGAGTTCCTCCACTTCCTCTTCTTCCTCCTCCACTAACATCTCTTCTACTTCCTCCTCAGGCGGCAGTGGTGGCGGGGGAGGGGGCCTGCGTCGCCGGCGGCGCACGGGCAGACGGTCGATGAAGCGCTCGATGGTCTCGCCGCGCCGGCGTCGCATGGTCTCGGTGACGGCGCGCCCGTCCTCGCGGGGCCGCAGCGTGAAGACGCCGCCGCGCATCTCCAGGTGGCCGGGGGGGTCCCCGTTGGGCAGGGAGAGGGCGCTGACGATGCATCTTATCAATTGCCCCGTAGGGACTCCGCGCAAGGACCTGAGCGTCTCGAGATCCACGGGATCTGAAAACCGCTGAACGAAGGCTTCGAGCCAGTCGCAGTCGCAAGGTAGGCTGAGCACGGTTTCTTCTGGCGGGTCATGTTGGTTGGGAGCGGGGCGGGCGATGCTGCTGGTGATGAAGTTGAAATAGGCGGTTCTGAGACGGCGGATGGTGGCGAGGAGCACCAGGTCTTTGGGCCCGGCTTGCTGGATGCGCAGACGGTCGGCCATGCCCCAGGCGTGGTCCTGACACCTGGCCAGGTCCTTGTAGTAGTCCTGCATGAGCCGCTCCACGGGCACCTCCTCCTCGCCCGCGCGGCCGTGCATGCGCGTGAGCCCGAAGCCGCGCTGGGGCTGGACGAGCGCCAGGTCGGCGACGACGCGCTCGGCGAGGATGGCTTGCTGGATCTGGGTGAGGGTGGTCTGGAAGTCATCAAAGTCGACGAAGCGGTGGTAGGCTCCGGTGTTGATGGTGTAGGAGCAGTTGGCCATGACGGACCAGTTGACGGTCTGGTGGCCCGGACGCACGAGCTCGTGGTACTTGAGGCGCGAGTAGGCGCGCGTGTCGAAGATGTAGTCGTTGCAGGTGCGCACCAGGTACTGGTAGCCGATGAGGAAGTGCGGCGGCGGCTGGCGGTAGAGCGGCCATCGCTCGGTGGCGGGGGCGCCGGGCGCGAGGTCCTCGAGCATGGTGCGGTGGTAGCCGTAGATGTACCTGGACATCCAGGTGATGCCGGCGGCGGTGGTGGAGGCGCGCGGGAACTCGCGGACGCGGTTCCAGATGTTGCGCAGCGGCAGGAAGTAGTTCATGGTGGGCACGGTCTGGCCCGTGAGGCGCGCGCAGTCGTGGATGCTCTATACGGGCAAAAACGAAAGCGGTCAGCGGCTCGACTCCGTGGCCTGGAGGCTAAGCGAACGGGTTGGGCTGCGCGTGTACCCCGGTTCGAATCTCGAATCAGGCTGGAGCCGCAGCTAACGTGGTATTGGCACTCCCGTCTCGACCCAAGCCTGCACCAACCCTCCAGGATACGGAGGCGGGTCGTTTTGCAACTTTTTTTTGGAGGCCGGATGAGACTAGTAAGCGCGGAAAGCGGCCGACCGCGATGGCTCGCTGCCGTAGTCTGGAGAAGAATCGCCAGGGTTGCGTTGCGGTGTGCCCCGGTTCGAGGCCGGCCGGATTCCGCGGCTAACGAGGGCGTGGCTGCCCCGTCGTTTCCAAGACCCCATAGCCAGCCGACTTCTCCAGTTACGGAGCGAGCCCCTCTTTTGTTTTGTTTGTTTTTGCCAGATGCATCCCGTACTGCGGCAGATGCGCCCCCACCACCCTCCACCGCAACAACAGCCCCCTCCACAGCCGGCGCTTCTGCCCCCGCCCCAGCAGCAACTTCCAGCCACGACCGCCGCGGCCGCCGTGAGCGGGGCTGGACAGAGTTATGATCACCAGCTGGCCTTGGAAGAGGGCGAGGGGCTGGCGCGCCTGGGGGCGTCGTCGCCGGAGCGGCACCCGCGCGTGCAGATGAAAAGGGACGCTCGCGAGGCCTACGTGCCCAAGCAGAACCTGTTCAGAGACAGGAGCGGCGAGGAGCCCGAGGAGATGCGCGCGGCCCGGTTCCACGCGGGGCGGGAGCTGCGGCGCGGCCTGGACCGAAAGAGGGTGCTGAGGGACGAGGATTTCGAGGCGGACGAGCTGACGGGGATCAGCCCCGCGCGCGCGCACGTGGCCGCGGCCAACCTGGTCACGGCGTACGAGCAGACCGTGAAGGAGGAGAGCAACTTCCAAAAATCCTTCAACAACCACGTGCGCACCCTGATCGCGCGCGAGGAGGTGACCCTGGGCCTGATGCACCTGTGGGACCTGCTGGAGGCCATCGTGCAGAACCCCACCAGCAAGCCGCTGACGGCGCAGCTGTTCCTGGTGGTGCAGCATAGTCGGGACAACGAAGCGTTCAGGGAGGCGCTGCTGAATATCACCGAGCCCGAGGGCCGCTGGCTCCTGGACCTGGTGAACATTCTGCAGAGCATCGTGGTGCAGGAGCGCGGGCTGCCGCTGTCCGAGAAGCTGGCGGCCATCAACTTCTCGGTGCTGAGTTTGGGCAAGTACTACGCTAGGAAGATCTACAAGACCCCGTACGTGCCCATAGACAAGGAGGTGAAGATCGACGGGTTTTACATGCGCATGACCCTGAAAGTGCTGACCCTGAGCGACGATCTGGGGGTGTACCGCAACGACAGGATGCACCGTGCGGTGAGCGCCAGCAGGCGGCGCGAGCTGAGCGACCAGGAGCTGATGCATAGTCTGCAGCGGGCCCTGACCGGGGCCGGGACCGAGGGGGAGAGCTACTTTGACATGGGCGCGGACCTGCACTGGCAGCCCAGCCGCCGGGCCTTGGAGGCGGCGGCAGGACCCTACGTAGAAGAGGTGGACGATGAGGTGGACGAGGAGGGCGAGTACCTGGAAGACTGATGGCGCGACCGTATTTTTGCTAGATGCAACAACAACAGCCACCTCCTGATCCCGCGATGCGGGCGGCGCTGCAGAGCCAGCCGTCCGGCATTAACTCCTCGGACGATTGGACCCAGGCCATGCAACGCATCATGGCGCTGACGACCCGCAACCCCGAAGCCTTTAGACAGCAGCCCCAGGCCAACCGGCTCTCGGCCATCCTGGAGGCCGTGGTGCCCTCGCGCTCCAACCCCACGCACGAGAAGGTCCTGGCCATCGTGAACGCGCTGGTGGAGAACAAGGCCATCCGCGGCGACGAGGCCGGCCTGGTGTACAACGCGCTGCTGGAGCGCGTGGCCCGCTACAACAGCACCAACGTGCAGACCAACCTGGACCGCATGGTGACCGACGTGCGCGAGGCCGTGGCCCAGCGCGAGCGGTTCCACCGCGAGTCCAACCTGGGATCCATGGTGGCGCTGAACGCCTTCCTCAGCACCCAGCCCGCCAACGTGCCCCGGGGCCAGGAGGACTACACCAACTTCATCAGCGCCCTGCGCCTGATGGTGACCGAGGTGCCCCAGAGCGAGGTGTACCAGTCCGGGCCGGACTACTTCTTCCAGACCAGTCGCCAGGGCTTGCAGACCGTGAACCTGAGCCAGGCTTTCAAGAACTTGCAGGGCCTGTGGGGCGTGCAGGCCCCGGTCGGGGACCGCGCGACGGTGTCGAGCCTGCTGACGCCGAACTCGCGCCTGCTGCTGCTGCTGGTGGCCCCCTTCACGGACAGCGGCAGCATCAACCGCAACTCGTACCTGGGCTACCTGATTAACCTGTACCGCGAGGCCATCGGCCAGGCGCACGTGGACGAGCAGACCTACCAGGAGATCACCCACGTGAGCCGCGCCCTGGGCCAGGACGACCCGGGCAACCTGGAAGCCACCCTGAACTTTTTGCTGACCAACCGGTCGCAGAAGATCCCGCCCCAGTACGCGCTCAGCACCGAGGAGGAGCGCATCCTGCGTTACGTGCAGCAGAGCGTGGGCCTGTTCCTGATGCAGGAGGGGGCCACCCCCAGCGCCGCGCTCGACATGACCGCGCGCAACATGGAGCCCAGCATGTACGCCAGCAACCGCCCGTTCATCAATAAACTGATGGACTACTTGCATCGGGCGGCCGCCATGAACTCTGACTATTTCACCAACGCCATCCTGAATCCCCACTGGCTCCCGCCGCCGGGGTTCTACACGGGCGAGTACGACATGCCCGACCCCAATGACGGGTTCCTGTGGGACGATGTGGACAGCAGCGTGTTCTCCCCCCGACCGGGTGCTAACGAGCGCCCCTTGTGGAAGAAGGAAGGCAGCGACCGACGCCCGTCCTCGGCGCTGTCCGGCCGCGAGGGTGCTGCCGCGGCGGTGCCCGAGGCCGCCAGTCCTTTCCCGAGCTTGCCCTTCTCGCTGAACAGTATCCGCAGCAGCGAGCTGGGCAGGATCACGCGCCCGCGCTTGCTGGGCGAAGAGGAGTACTTGAATGACTCGCTGTTGAGACCCGAGCGGGAGAAGAACTTCCCCAATAACGGGATAGAAAGCCTGGTGGACAAGATGAGCCGCTGGAAGACGTATGCGCAGGAGCACAGGGACGATCCCCGGGCGTCGCAGGGGGCCACGAGCCGGGGCAGCGCCGCCCGTAAACGCCGGTGGCACGACAGGCAGCGGGGACAGATGTGGGACGATGAGGACTCCGCCGACGACAGCAGCGTGTTGGACTTGGGTGGGAGTGGTAACCCGTTCGCTCACCTGCGCCCCCGTATCGGGCGCATGATGTAAGAGAAACCGAAAATAAATGATACTCACCAAGGCCATGGCGACCAGCGTGCGTTCGTTTCTTCTCTGTTGTTGTTGTATCTAGTATGATGAGGCGTGCGTACCCGGAGGGTCCTCCTCCCTCGTACGAGAGCGTGATGCAGCAGGCGATGGCGGCGGCGGCGATGCAGCCCCCGCTGGAGGCTCCTTACGTGCCCCCGCGGTACCTGGCGCCTACGGAGGGGCGGAACAGCATTCGTTACTCGGAGCTGGCACCCTTGTACGATACCACCCGGTTGTACCTGGTGGACAACAAGTCGGCGGACATCGCCTCGCTGAACTACCAGAACGACCACAGCAACTTCCTGACCACCGTGGTGCAGAACAATGACTTCACCCCCACGGAGGCCAGCACCCAGACCATCAACTTTGACGAGCGCTCGCGGTGGGGCGGCCAGCTGAAAACCATCATGCACACCAACATGCCCAACGTGAACGAGTTCATGTACAGCAACAAGTTCAAGGCGCGGGTGATGGTCTCCCGCAAGACCCCCAATGGGGTGACAGTGACAGAGGATTATGATGGTAGTCAGGATGAGCTGAAGTATGAATGGGTGGAATTTGAGCTGCCCGAAGGCAACTTCTCGGTGACCATGACCATCGACCTGATGAACAACGCCATCATCGACAATTACTTGGCGGTGGGGCGGCAGAACGGGGTGCTGGAGAGCGACATCGGCGTGAAGTTCGACACTAGGAACTTCAGGCTGGGCTGGGACCCCGTGACCGAGCTGGTCATGCCCGGGGTGTACACCAACGAGGCTTTCCATCCCGATATTGTCTTGCTGCCCGGCTGCGGGGTGGACTTCACCGAGAGCCGCCTCAGCAACCTGCTGGGCATTCGCAAGAGGCAGCCCTTCCAGGAAGGCTTCCAGATCATGTACGAGGATCTGGAGGGGGGCAACATCCCCGCGCTCCTGGATGTCGACGCCTATGAGAAAAGCAAGGAGGATGCAGCAGCTGAAGCAACTGCAGCCGTAGCTACCGCCTCTACCGAGGTCAGGGGCGATAATTTTGCAAGCGCCGCAGCAGTGGCAGCGGCCGAGGCGGCTGAAACCGAAAGTAAGATAGTCATTCAGCCGGTGGAGAAGGATAGCAAGAACAGGAGCTACAACGTACTACCGGACAAGATAAACACCGCCTACCGCAGCTGGTACCTAGCCTACAACTATGGCGACCCCGAGAAGGGCGTGCGCTCCTGGACGCTGCTCACCACCTCGGACGTCACCTGCGGCGTGGAGCAAGTCTACTGGTCGCTGCCCGACATGATGCAAGACCCGGTCACCTTCCGCTCCACGCGTCAAGTTAGCAACTACCCGGTGGTGGGCGCCGAGCTCCTGCCCGTCTACTCCAAGAGCTTCTTCAACGAGCAGGCCGTCTACTCGCAGCAGCTGCGCGCCTTCACCTCGCTTACGCACGTCTTCAACCGCTTCCCCGAGAACCAGATCCTCGTCCGCCCGCCCGCGCCCACCATTACCACCGTCAGTGAAAACGTTCCTGCTCTCACAGATCACGGGACCCTGCCGCTGCGCAGCAGTATCCGGGGAGTCCAGCGCGTGACCGTTACTGACGCCAGACGCCGCACCTGCCCCTACGTCTACAAGGCCCTGGGCATAGTCGCGCCGCGCGTCCTCTCGAGCCGCACCTTCTAAATGTCCATTCTCATCTCGCCCAGTAATAACACCGGTTGGGGCCTGCGCGCGCCCAGCAAGATGTACGGAGGCGCTCGCCAACGCTCCACGCAACACCCCGTGCGCGTGCGCGGGCACTTCCGCGCTCCCTGGGGCGCCCTCAAGGGCCGCGTGCGGTCGCGCACCACCGTCGACGACGTGATCGACCAGGTGGTGGCCGACGCGCGCAACTACACCCCCGCCGCCGCGCCCGTCTCCACCGTGGACGCCGTCATCGACAGCGTGGTGGCcGACGCGCGCCGGTACGCCCGCGCCAAGAGCCGGCGGCGGCGCATCGCCCGGCGGCACCGGAGCACCCCCGCCATGCGCGCGGCGCGAGCCTTGCTGCGCAGGGCCAGGCGCACGGGACGCAGGGCCATGCTCAGGGCGGCCAGACGCGCGGCTTCAGGCGCCAGCGCCGGCAGGACCCGGAGACGCGCGGCCACGGCGGCGGCAGCGGCCATCGCCAGCATGTCCCGCCCGCGGCGAGGGAACGTGTACTGGGTGCGCGACGCCGCCACCGGTGTGCGCGTGCCCGTGCGCACCCGCCCCCCTCGCACTTGAAGATGTTCACTTCGCGATGTTGATGTGTCCCAGCGGCGAGGAGGATGTCCAAGCGCAAATTCAAGGAAGAGATGCTCCAGGTCATCGCGCCTGAGATCTACGGCCCTGCGGTGGTGAAGGAGGAAAGAAAGCCCCGCAAAATCAAGCGGGTCAAAAAGGACAAAAAGGAAGAAGAAAGTGATGTGGACGGATTGGTGGAGTTTGTGCGCGAGTTCGCCCCCCGGCGGCGCGTGCAGTGGCGCGGGCGGAAGGTGCAACCGGTGCTGAGACCCGGCACCACCGTGGTCTTCACGCCCGGCGAGCGCTCCGGCACCGCTTCCAAGCGCTCCTACGACGAGGTGTACGGGGATGATGATATTCTGGAGCAGGCGGCCGAGCGCCTGGGCGAGTTTGCTTACGGCAAGCGCAGCCGTTCCGCACCGAAGGAAGAGGCGGTGTCCATCCCGCTGGACCACGGCAACCCCACGCCGAGCCTCAAGCCCGTGACCTTGCAGCAGGTGCTGCCGACCGCGGCGCCGCGCCGGGGGTTCAAGCGCGAGGGCGAGGATCTGTACCCCACCATGCAGCTGATGGTGCCCAAGCGCCAGAAGCTGGAAGACGTGCTGGAGACCATGAAGGTGGACCCGGACGTGCAGCCCGAGGTCAAGGTGCGGCCCATCAAGCAGGTGGCCCCGGGCCTGGGCGTGCAGACCGTGGACATCAAGATTCCCACGGAGCCCATGGAAACGCAGACCGAGCCCATGATCAAGCCCAGCACCAGCACCATGGAGGTGCAGACGGATCCCTGGATGCCATCGGCTCCTAGTCGAAGACCCCGGCGCAAGTACGGCGCGGCCAGCCTGCTGATGCCCAACTACGCGCTGCATCCTTCCATCATCCCCACGCCGGGCTACCGCGGCACGCGCTTCTACCGCGGTCATACCAGCAGCCGCCGCCGCAAGACCACCACTCGCCGCCGCCGTCGCCGCACCGCCGCTGCAACCACCCCTGCCGCCCTGGTGCGGAGAGTGTACCGCCGCGGCCGCGCACCTCTGACCCTGCCGCGCGCGCGCTACCACCCGAGCATCGCCATTTAAACTTTCGCCtGCTTTGCAGATCAATGGCCCTCACATGCCGCCTTCGCGTTCCCATTACGGGCTACCGAGGAAGAAAACCGCGCCGTAGAAGGCTGGCGGGGAACGGGATGCGTCGCCACCACCACCGGCGGCGGCGCGCCATCAGCAAGCGGTTGGGGGGAGGCTTCCTGCCCGCGCTGATCCCCATCATCGCCGCGGCGATCGGGGCGATCCCCGGCATTGCTTCCGTGGCGGTGCAGGCCTCTCAGCGCCACTGAGACACACTTGGAAACATCTTGTAATAAACCaATGGACTCTGACGCTCCTGGTCCTGTGATGTGTTTTCGTAGACAGATGGAAGACATCAATTTTTCGTCCCTGGCTCCGCGACACGGCACGCGGCCGTTCATGGGCACCTGGAGCGACATCGGCACCAGCCAACTGAACGGGGGCGCCTTCAATTGGAGCAGTCTCTGGAGCGGGCTTAAGAATTTCGGGTCCACGCTTAAAACCTATGGCAGCAAGGCGTGGAACAGCACCACAGGGCAGGCGCTGAGGGATAAGCTGAAAGAGCAGAACTTCCAGCAGAAGGTGGTCGATGGGCTCGCCTCGGGCATCAACGGGGTGGTGGACCTGGCCAACCAGGCCGTGCAGCGGCAGATCAACAGCCGCCTGGACCCGGTGCCGCCCGCCGGCTCCGTGGAGATGCCGCAGGTGGAGGAGGAGCTGCCTCCCCTGGACAAGCGGGGCGAGAAGCGACCCCGCCCCGATGCGGAGGAGACGCTGCTGACGCACACGGACGAGCCGCCCCCGTACGAGGAGGCGGTGAAACTGGGTCTGCCCACCACGCGGCCCATCGCGCCCCTGGCCACCGGGGTGCTGAAACCCGAAAAGCCCGCGACCCTGGACTTGCCTCCTCCCCAGCCTTCCCGCCCCTCTACAGTGGCTAAGCCCCTGCCGCCGGTGGCCGTGGCCCGCGCGCGACCCGGGGGCACCGCCCGCCCTCATGCGAACTGGCAGAGCACTCTGAACAGCATCGTGGGTCTGGGAGTGCAGAGTGTGAAGCGCCGCCGCTGCTATTAAACCTACCGTAGCGCTTAACTTGCTTGTCTGTGTGTGTATGTATTATGTCGCCGCCGCCGCTGTCCACCAGAAGGAGGAGTGAAGAGGCGCGTCGCCGAGTTGCAAGATGGCCACCCCATCGATGCTGCCCCAGTGGGCGTACATGCACATCGCCGGACAGGACGCTTCGGAGTACCTGAGTCCGGGTCTGGTGCAGTTTGCCCGCGCCACAGACACCTACTTCAGTCTGGGGAACAAGTTTAGGAACCCCACGGTGGCGCCCACGCACGATGTGACCACCGACCGCAGCCAGCGGCTGACGCTGCGCTTCGTGCCCGTGGACCGCGAGGACAACACCTACTCGTACAAAGTGCGCTACACGCTGGCCGTGGGCGACAACCGCGTGCTGGACATGGCCAGCACCTACTTTGACATCCGCGGCGTGCTGGATCGGGGCCCTAGCTTCAAACCCTACTCCGGCACCGCCTACAACAGTCTGGCCCCCAAGGGAGCACCCAACACTTGTCAGTGGACATATAAAGCCGATGGTGAAACTGCCACAGAAAAAACCTATACATATGGAAATGCACCCGTGCAGGGCATTAACATCACAAAAGATGGTATTCAACTTGGAACTGACACCGATGATCAGCCAATCTACGCAGATAAAACCTATCAGCCTGAACCTCAAGTGGGTGATGCTGAATGGCATGACATCACTGGTACTGATGAAAAGTATGGAGGCAGAGCTCTTAAGCCTGATACCAAAATGAAGCCTTGTTATGGTTCTTTTGCCAAGCCTACTAATAAAGAAGGAGGTCAGGCAAATGTGAAAACAGGAACAGGCACTACTAAAGAATATGACATAGACATGGCTTTCTTTGACAACAGAAGTGCGGCTGCTGCTGGCCTAGCTCCAGAAATTGTTTTGTATACTGAAAATGTGGATTTGGAAACTCCAGATACCCATATTGTATACAAAGCAGGCACAGATGACAGCAGCTCTTCTATTAATTTGGGTCAGCAAGCCATGCCCAACAGACCTAACTACATTGGTTTCAGAGACAACTTTATCGGGCTCATGTACTACAACAGCACTGGCAATATGGGGGTGCTGGCCGGTCAGGCTTCTCAGCTGAATGCTGTGGTTGACTTGCAAGACAGAAACACCGAGCTGTCCTACCAGCTCTTGCTTGACTCTCTGGGTGACAGAACCCGGTATTTCAGTATGTGGAATCAGGCGGTGGACAGCTATGATCCTGATGTGCGCATTATTGAAAATCATGGTGTGGAGGATGAACTTCCCAACTATTGTTTCCCTCTGGATGCTGTTGGCAGAACAGATACTTATCAGGGAATTAAGGCTAATGGAACTGATCAAACCACATGGACCAAAGATGACAGTGTCAATGATGCTAATGAGATAGGCAAGGGTAATCCATTCGCCATGGAAATCAACATCCAAGCCAACCTGTGGAGGAACTTCCTCTACGCCAACGTGGCCCTGTACCTGCCCGACTCTTACAAGTACACGCCGGCCAATGTTACCCTGCCCACCAACACCAACACCTACGATTACATGAACGGCCGGGTGGTGGCGCCCTCGCTGGTGGACTCCTACATCAACATCGGGGCGCGCTGGTCGCTGGATCCCATGGACAACGTGAACCCCTTCAACCACCACCGCAATGCGGGGCTGCGCTACCGCTCCATGCTCCTGGGCAACGGGCGCTACGTGCCCTTCCACATCCAGGTGCCCCAGAAATTTTTCGCCATCAAGAGCCTCCTGCTCCTGCCCGGGTCCTACACCTACGAGTGGAACTTCCGCAAGGACGTCAACATGATCCTGCAGAGCTCCCTCGGCAACGACCTGCGCACGGACGGGGCCTCCATCTCCTTCACCAGCATCAACCTCTACGCCACCTTCTTCCCCATGGCGCACAACACGGCCTCCACGCTCGAGGCCATGCTGCGCAACGACACCAACGACCAGTCCTTCAACGACTACCTCTCGGCGGCCAACATGCTCTACCCCATCCCGGCCAACGCCACCAACGTGCCCATCTCCATCCCCTCGCGCAACTGGGCCGCCTTCCGCGGCTGGTCCTTCACGCGTCTCAAGACCAAGGAGACGCCCTCGCTGGGCTCCGGGTTCGACCCCTACTTCGTCTACTCGGGCTCCATCCCCTACCTCGACGGCACCTTCTACCTCAACCACACCTTCAAGAAGGTCTCCATCACCTTCGACTCCTCCGTCAGCTGGCCCGGCAACGACCGGCTCCTGACGCCCAACGAGTTCGAAATCAAGCGCACCGTCGACGGCGAGGGCTACAACGTGGCCCAGTGCAACATGACCAAGGACTGGTTCCTGGTCCAGATGCTGGCCCACTACAACATCGGCTACCAGGGCTTCTACGTGCCCGAGGGCTACAAGGACCGCATGTACTCCTTCTTCCGCAACTTCCAGCCCATGAGCCGCCAGGTGGTGGACGAGGTCAACTACAAGGACTACCAGGCCGTCACCCTGGCCTACCAGCACAACAACTCGGGCTTCGTCGGCTACCTCGCGCCCACCATGCGCCAGGGCCAGCCCTACCCCGCCAACTACCCCTACCCGCTCATCGGCAAGAGCGCCGTCACCAGCGTCACCCAGAAAAAGTTCCTCTGCGACAGGGTCATGTGGCGCATCCCCTTCTCCAGCAACTTCATGTCCATGGGCGCGCTCACCGACCTCGGCCAGAACATGCTCTATGCCAACTCCGCCCACGCGCTAGACATGAATTTCGAAGTCGACCCCATGGATGAGTCCACCCTTCTCTATGTTGTCTTCGAAGTCTTCGACGTCGTCCGAGTGCACCAGCCCCACCGCGGCGTCATCGAGGCCGTCTACCTGCGCACCCCCTTCTCGGCCGGTAACGCCACCACCTAAGCTCTTGCTTCTTGCAAGCCATGGCCGCGGGCTCCGGCGAGCAGGAGCTCAGGGCCATCATCCGCGACCTGGGCTGCGGGCCCTACTTCCTGGGCACCTTCGATAAGCGCTTCCCGGGATTCATGGCCCCGCACAAGCTGGCCTGCGCCATCGTCAACACGGCCGGCCGCGAGACCGGGGGCGAGCACTGGCTGGCCTTCGCCTGGAACCCGCGCTCGAACACCTGCTACCTCTTCGACCCCTTCGGGTTCTCGGACGAGCGCCTCAAGCAGATCTACCAGTTCGAGTACGAGGGCCTGCTGCGCCGCAGCGCCCTGGCCACCGAGGACCGCTGCGTCACCCTGGAAAAGTCCACCCAGACCGTGCAGGGTCCGCGCTCGGCCGCCTGCGGGCTCTTCTGCTGCATGTTCCTGCACGCCTTCGTGCACTGGCCCGACCGCCCCATGGACAAGAACCCCACCATGAACTTGCTGACGGGGGTGCCCAACGGCATGCTCCAGTCGCCCCAGGTGGAACCCACCCTGCGCCGCAACCAGGAGGCGCTCTACCGCTTCCTCAACTCCCACTCCGCCTACTTTCGCTCCCACCGCGCGCGCATCGAGAAGGCCACCGCCTTCGACCGCATGAATCAAGACATGTAAACCGTGTGTGTATGTTAAATGTCTTTAATAAACAGCACTTTCATGTTACACATGCATCTGAGATGATTTATTTAGAAATCGAAAGGGTTCTGCCGGGTCTCGGCATGGCCCGCGGGCAGGGACACGTTGCGGAACTGGTACTTGGCCAGCCACTTGAACTCGGGGATCAGCAGTTTGGGCAGCGGGGTGTCGGGGAAGGAGTCGGTCCACAGCTTCCGCGTCAGTTGCAGGGCGCCCAGCAGGTCGGGCGCGGAGATCTTGAAATCGCAGTTGGGACCCGCGTTCTGCGCGCGGGAGTTGCGGTACACGGGGTTGCAGCACTGGAACACCATCAGGGCCGGGTGCTTCACGCTCGCCAGCACCGTCGCGTCGGTGATGCTCTCCACGTCGAGGTCCTCGGCGTTGGCCATCCCGAAGGGGGTCATCTTGCAGGTCTGCCTTCCCATGGTGGGCACGCACCCGGGCTTGTGGTTGCAATCGCAGTGCAGGGGGATCAGCATCATCTGGGCCTGGTCGGCGTTCATCCCCGGGTACATGGCCTTCATGAAAGCCTCCAATTGCCTGAACGCCTGCTGGGCCTTGGCTCCCTCGGTGAAGAAGACCCCGCAGGACTTGCTAGAGAACTGGTTGGTGGCGCACCCGGCGTCGTGCACGCAGCAGCGCGCGTCGTTGTTGGCCAGCTGCACCACGCTGCGCCCCCAGCGGTTCTGGGTGATCTTGGCCCGGTCGGGGTTCTCCTTCAGCGCGCGCTGCCCGTTCTCGCTCGCCACATCCATCTCGATCATGTGCTCCTTCTGGATCATGGTGGTCCCGTGCAGGCACCGCAGCTTGCCCTCGGCCTCGGTGCACCCGTGCAGCCACAGCGCGCACCCGGTGCACTCCCAGTTCTTGTGGGCGATCTGGGAATGCGCGTGCACGAAGCCCTGCAGGAAGCGGCCCATCATGGTGGTCAGGGTCTTGTTGCTAGTGAAGGTCAGCGGAATGCCGCGGTGCTCCTCGTTGATGTACAGGTGGCAGATGCGGCGGTACACCTCGCCCTGCTCGGGCATCAGCTGGAAGTTGGCTTTCAGGTCGGTCTCCACGCGGTAGCGGTCCATCAGCATAGTCATGATTTCCATACCCTTCTCCCAGGCCGAGACGATGGGCAGGCTCATAGGGTTCTTCACCATCATCTTAGCGCTAGCAGCCGCGGCCAGGGGGTCGCTCTCGTCCAGGGTCTCAAAGCTCCGCTTGCCGTCCTTCTCGGTGATCCGCACCGGGGGGTAGCTGAAGCCCACGGCCGCCAGCTCCTCCTCGGCCTGTCTTTCGTCCTCGCTGTCCTGGCTGACGTCCTGCAGGACCACATGCTTGGTCTTGCGGGGTTTCTTCTTGGGCGGCAGCGGCGGCGGAGATGTTGGAGATGGCGAGGGGGAGCGCGAGTTCTCGCTCACCACTACTATCTCTTCCTCTTCTTGGTCCGAGGCCACGCGGCGGTAGGTATGTCTCTTCGGGGGCAGAGGCGGAGGCGACGGGCTCTCGCCGCCGCGACTTGGCGGATGGCTGGCAGAGCCCCTTCCGCGTTCGGGGGTGCGCTCCCGGCGGCGCTCTGACTGACTTCCTCCGCGGCCGGCCATTGTGTTCTCCTAGGGAGGAACAACAAGCATGGAGACTCAGCCATCGCCAACCTCGCCATCTGCCCCCACCGCCGACGAGAAGCAGCAGCAGCAGAATGAAAGCTTAACCGCCCCGCCGCCCAGCCCCGCCACCTCCGACGCGGCCGTCCCAGACATGCAAGAGATGGAGGAATCCATCGAGATTGACCTGGGCTATGTGACGCCCGCGGAGCACGAGGAGGAGCTGGCAGTGCGCTTTTCACAAGAAGAGATACACCAAGAACAGCCAGAGCAGGAAGCAGAGAATGAGCAGAGTCAGGCTGGGCTCGAGCATGACGGCGACTACCTCCACCTGAGCGGGGGGGAGGACGCGCTCATCAAGCATCTGGCCCGGCAGGCCACCATCGTCAAGGATGCGCTGCTCGACCGCACCGAGGTGCCCCTCAGCGTGGAGGAGCTCAGCCGCGCCTACGAGTTGAACCTCTTCTCGCCGCGCGTGCCCCCCAAGCGCCAGCCCAATGGCACCTGCGAGCCCAACCCGCGCCTCAACTTCTACCCGGTCTTCGCGGTGCCCGAGGCCCTGGCCACCTACCACATCTTTTTCAAGAACCAAAAGATCCCCGTCTCCTGCCGCGCCAACCGCACCCGCGCCGACGCCCTTTTCAACCTGGGTCCCGGCGCCCGCCTACCTGATATCGCCTCCTTGGAAGAGGTTCCCAAGATCTTCGAGGGTCTGGGCAGCGACGAGACTCGGGCCGCGAACGCTCTGCAAGGAGAAGGAGGAGAGCATGAGCACCACAGCGCCCTGGTCGAGTTGGAAGGCGACAACGCGCGGCTGGCGGTGCTCAAACGCACGGTCGAGCTGACCCATTTCGCCTACCCGGCTCTGAACCTGCCCCCCAAAGTCATGAGCGCGGTCATGGACCAGGTGCTCATCAAGCGCGCGTCGCCCATCTCCGAGGACGAGGGCATGCAAGACTCCGAGGAGGGCAAGCCCGTGGTCAGCGACGAGCAGCTGGCCCGGTGGCTGGGTCCTAATGCTAGTCCCCAGAGTTTGGAAGAGCGGCGCAAACTCATGATGGCCGTGGTCCTGGTGACCGTGGAGCTGGAGTGCCTGCGCCGCTTCTTCGCCGACGCGGAGACCCTGCGCAAGGTCGAGGAGAACCTGCACTACCTCTTCAGGCACGGGTTCGTGCGCCAGGCCTGCAAGATCTCCAACGTGGAGCTGACCAACCTGGTCTCCTACATGGGCATCTTGCACGAGAACCGCCTGGGGCAGAACGTGCTGCACACCACCCTGCGCGGGGAGGCCCGGCGCGACTACATCCGCGACTGCGTCTACCTCTACCTCTGCCACACCTGGCAGACGGGCATGGGCGTGTGGCAGCAGTGTCTGGAGGAGCAGAACCTGAAAGAGCTCTGCAAGCTCCTGCAGAAGAACCTCAAGGGTCTGTGGACCGGGTTCGACGAGCGCACCACCGCCTCGGACCTGGCCGACCTCATTTTCCCCGAGCGCCTCAGGCTGACGCTGCGCAACGGCCTGCCCGACTTTATGAGCCAAAGCATGTTGCAAAACTTTCGCTCTTTCATCCTCGAACGCTCCGGAATCCTGCCCGCCACCTGCTCCGCGCTGCCCTCGGACTTCGTGCCGCTGACCTTCCGCGAGTGCCCCCCGCCGCTGTGGAGCCACTGCTACCTGCTGCGCCTGGCCAACTACCTGGCCTACCACTCGGACGTGATCGAGGACGTCAGCGGCGAGGGCCTGCTCGAGTGCCACTGCCGCTGCAACCTCTGCACGCCGCACCGCTCCCTGGCCTGCAACCCCCAGCTGCTGAGCGAGACCCAGATCATCGGCACCTTCGAGTTGCAAGGGCCCAGCGAAGGCGAGGGTTCAGCCGCCAAGGGGGGTCTGAAACTCACCCCGGGGCTGTGGACCTCGGCCTACTTGCGCAAGTTCGTGCCCGAGGACTACCATCCCTTCGAGATCAGGTTCTACGAGGACCAATCCCATCCGCCCAAGGCCGAGCTGTCGGCCTGCGTCATCACCCAGGGGGCGATCCTGGCCCAATTGCAAGCCATCCAGAAATCCCGCCAAGAATTCTTGCTGAAAAAGGGCCGCGGGGTCTACCTCGACCCCCAGACCGGTGAGGAGCTCAACCCCGGCTTCCCCCAGGATGCCCCGAGGAAACAAGAAGCTGAAAGTGGAGCTGCCGCCCGTGGAGGATTTGGAGGAAGACTGGGAGAACAGCAGTCAGGCAGAGGAGGAGGAGATGGAGGAAGACTGGGACAGCACTCAGGCAGAGGAGGACAGCCTGCAAGACAGTCTGGAGGAAGACGAGGAGGAGGCAGAGGAGGAGGTGGAAGAAGCAGCCGCCGCCAGACCGTCGTCCTCGGCGGGGGAGAAAGCAAGCAGCACGGATACCATCTCCGCTCCGGGTCGGGGTCCCGCTCGACCACACAGTAGATGGGACGAGACCGGACGATTCCCGAACCCCACCACCCAGACCGGTAAGAAGGAGCGGCAGGGATACAAGTCCTGGCGGGGGCACAAAAACGCCATCGTCTCCTGCTTGCAGGCCTGCGGGGGCAACATCTCCTTCACCCGGCGCTACCTGCTCTTCCACCGCGGGGTGAACTTTCCCCGCAACATCTTGCATTACTACCGTCACCTCCACAGCCCCTACTACTTCCAAGAAGAGGCAGCAGCAGCAGAAAAAGACCAGCAGAAAACCAGCAGCTAGAAAATCCACAGCGGCGGCAGCAGGTGGACTGAGGATCGCGGCGAACGAGCCGGCGCAAACCCGGGAGCTGAGGAACCGGATCTTTCCCACCCTCTATGCCATCTTCCAGCAGAGTCGGGGGCAGGAGCAGGAACTGAAAGTCAAGAACCGTTCTCTGCGCTCGCTCACCCGCAGTTGTCTGTATCACAAGAGCGAAGACCAACTTCAGCGCACTCTCGAGGACGCCGAGGCTCTCTTCAACAAGTACTGCGCGCTCACTCTTAAAGAGTAGCCCGCGCCCGCCCAGTCGCAGAAAAAGGCGGGAATTACGTCACCTGTGCCCTTCGCCCTAGCCGCCTCCACCCATCATCATGAGCAAAGAGATTCCCACGCCTTACATGTGGAGCTACCAGCCCCAGATGGGCCTGGCCGCCGGTGCCGCCCAGGACTACTCCACCCGCATGAATTGGCTCAGCGCCGGGCCCGCGATGATCTCACGGGTGAATGACATCCGCGCCCACCGAAACCAGATACTCCTAGAACAGTCAGCGCTCACCGCCACGCCCCGCAATCACCTCAATCCGCGTAATTGGCCCGCCGCCCTGGTGTACCAGGAAATTCCCCAGCCCACGACCGTACTACTTCCGCGAGACGCCCAGGCCGAAGTCCAGCTGACTAACTCAGGTGTCCAGCTGGCGGGCGGCGCCACCCTGTGTCGTCACCGCCCCGCTCAGGGTATAAAGCGGCTGGTGATCCGGGGCAGAGGCACACAGCTCAACGACGAGGTGGTGAGCTCTTCGCTGGGTCTGCGACCTGACGGAGTCTTCCAACTCGCCGGATCGGGGAGATCTTCCTTCACGCCTCGTCAGGCCGTCCTGACTTTGGAGAGTTCGTCCTCGCAGCCCCGCTCGGGTGGCATCGGCACTCTCCAGTTCGTGGAGGAGTTCACTCCCTCGGTCTACTTCAACCCCTTCTCCGGCTCCCCCGGCCACTACCCGGACGAGTTCATCCCGAACTTCGACGCCATCAGCGAGTCGGTGGACGGCTACGATTGAAACTAATCACCCCCTTATCCAGTGAAATAAAGATCATATTGATGATGATTTTACAGAAATAAAAAATAATCATTTGATTTGAAATAAAGATACAATCATATTGATGATTTGAGTTTAACAAAAAAATAAAGAATCACTTACTTGAAATCTGATACCAGGTCTCTGTCCATGTTTTCTGCCAACACCACTTCACTCCCCTCTTCCCAGCTCTGGTACTGCAGGCCCCGGCGGGCTGCAAACTTCCTCCACACGCTGAAGGGGATGTCAAATTCCTCCTGTCCCTCAATCTTCATTTTATCTTCTATCAGATGTCCAAAAAGCGCGTCCGGGTGGATGATGACTTCGACCCCGTCTACCCCTACGATGCAGACAACGCACCGACCGTGCCCTTCATCAACCCCCCCTTCGTCTCTTCAGATGGATTCCAAGAGAAGCCCCTGGGGGTGTTGTCCCTGCGACTGGCCGACCCCGTCACCACCAAGAACGGGGAAATCACCCTCAAGCTGGGAGAGGGGGTGGACCTCGATTCCTCGGGAAAACTCATCTCCAACACGGCCACCAAGGCCGCCGCCCCTCTCAGTTTTTCCAACAACACCATTTCCCTTAACATGGATCACCCCTTTTACACTAAAGATGGAAAATTATCCTTACAAGTTTCTCCACCATTAAATATACTGAGAACAAGCATTCTAAACACACTAGCTTTAGGTTTTGGATCAGGTTTAGGACTCCGTGGCTCTGCCTTGGCAGTACAGTTAGTCTCTCCACTTACATTTGATACTGATGGAAACATAAAGCTTACCTTAGACAGAGGTTTGCATGTTACAACAGGAGATGCAATTGAAAGCAACATAAGCTGGGCTAAAGGTTTAAAATTTGAAGATGGAGCCATAGCAACCAACATTGGAAATGGGTTAGAGTTTGGAAGCAGTAGTACAGAAACAGGTGTTGATGATGCTTACCCAATCCAAGTTAAACTTGGATCTGGCCTTAGCTTTGACAGTACAGGAGCCATAATGGCTGGTAACAAAGAAGACGATAAACTCACTTTGTGGACAACACCTGATCCATCACCAAACTGTCAAATACTCGCAGAAAATGATGCAAAACTAACACTTTGCTTGACTAAATGTGGTAGTCAAATACTGGCCACTGTGTCAGTCTTAGTTGTAGGAAGTGGAAACCTAAACCCCATTACTGGCACCGTAAGCAGTGCTCAGGTGTTTCTACGTTTTGATGCAAACGGTGTTCTTTTAACAGAACATTCTACACTAAAAAAATACTGGGGGTATAGGCAGGGAGATAGCATAGATGGCACTCCATATACCAATGCTGTAGGATTCATGCCCAATTTAAAAGCTTATCCAAAGTCACAAAGTTCTACTACTAAAAATAATATAGTAGGGCAAGTATACATGAATGGAGATGTTTCAAAACCTATGCTTCTCACTATAACCCTCAATGGTACTGATGACAGCAACAGTACATATTCAATGTCATTTTCATACACCTGGACTAATGGAAGCTATGTTGGAGCAACATTTGGGGCTAACTCTTATACCTTCTCATACATCGCCCAAGAATGAACACTGTATCCCACCCTGCATGCCAACCCTTCCCACCCCACTCTGTGGAACAAACTCTGAAACACAAAATAAAATAAAGTTCAAGTGTTTTATTGATTCAACAGTTTTACAGGATTCGAGCAGTTATTTTTCCTCCACCCTCCCAGGACATGGAATACACCACCCTCTCCCCCCGCACAGCCTTGAACATCTGAATGCCATTGGTGATGGACATGCTTTTGGTCTCCACGTTCCACACAGTTTCAGAGCGAGCCAGTCTCGGGTCGGTCAGGGAGATGAAACCCTCCGGGCACTCCCGCATCTGCACCTCACAGCTCAACAGCTGAGGATTGTCCTCGGTGGTCGGGATCACGGTTATCTGGAAGAAGCAGAAGAGCGGCGGTGGGAATCATAGTCCGCGAACGGGATCGGCCGGTGGTGTCGCATCAGGCCCCGCAGCAGTCGCTGCCGCCGCCGCTCCGTCAAGCTGCTGCTCAGGGGGTCCGGGTCCAGGGACTCCCTCAGCATGATGCCCACGGCCCTCAGCATCAGTCGTCTGGTGCGGCGGGCGCAGCAGCGCATGCGGATCTCGCTCAGGTCGCTGCAGTACGTGCAACACAGAACCACCAGGTTGTTCAACAGTCCATAGTTCAACACGCTCCAGCCGAAACTCATCGCGGGAAGGATGCTACCCACGTGGCCGTCGTACCAGATCCTCAGGTAAATCAAGTGGTGCCCCCTCCAGAACACGCTGCCCACGTACATGATCTCCTTGGGCATGTGGCGGTTCACCACCTCCCGGTACCACATCACCCTCTGGTTGAACATGCAGCCCCGGATGATCCTGCGGAACCACAGGGCCAGCACCGCCCCGCCCGCCATGCAGCGAAGAGACCCCGGGTCCCGGCAATGGCAATGGAGGACCCACCGCTCGTACCCGTGGATCATCTGGGAGCTGAACAAGTCTATGTTGGCACAGCACAGGCATATGCTCATGCATCTCTTCAGCACTCTCAACTCCTCGGGGGTCAAAACCATATCCCAGGGCACGGGGAACTCTTGCAGGACAGCGAACCCCGCAGAACAGGGCAATCCTCGCACAGAACTTACATTGTGCATGGACAGGGTATCGCAATCAGGCAGCACCGGGTGATCCTCCACCAGAGAAGCGCGGGTCTCGGTCTCCTCACAGCGTGGTAAGGGGGCCGGCCGATACGGGTGATGGCGGGACGCGGCTGATCGTGTTCGCGACCGTGTCATGATGCAGTTGCTTTCGGACATTTTCGTACTTGCTGTAGCAGAACCTGGTCCGGGCGCTGCACACCGATCGCCGGCGGCGGTCTCGGCGCTTGGAACGCTCGGTGTTGAAATTGTAAAACAGCCACTCTCTCAGACCGTGCAGCAGATCTAGGGCCTCAGGAGTGATGAAGATCCCATCATGCCTGATGGCTCTGATCACATCGACCACCGTGGAATGGGCCAGACCCAGCCAGATGATGCAATTTTGTTGGGTTTCGGTGACGGCGAGCCTCGGGAACAACGATGAAGTAAATGCAAGCGGTGCGTTCCAGCATGGTTAGTTAGCTGATCTGTAGAAAAAACAAAAATGAACATTAAACCATGCTAGCCTGGCGAACAGGTGGGTAAATCGTTCTCTCCAGCACCAGGCAGGCCACGGGGTCTCCGGCGCGACCCTCGTAAAAATTGTCGCTATGATTGAAAACCATCACAGAGAGACGTTCCCGGTGGCCGGCGTGAATGATTCGACAAGATGAATACACCCCCGGAACATTGGCGTCCGCGAGTGAAAAAAAGCGCCCGAGGAAGCAATAAGGCACTACAATGCTCAGTCTCAAGTCCAGCAAAGCGATGCCATGCGGATGAAGCACAAAATTCTCAGGTGCGTACAAAATGTAATTACTCCCCTCCTGCACAGGCAGCAAAGCCCCCGATCCCTCCAGGTACACATACAAAGCCTCAGCGTCCATAGCTTACCGAGCAGCAGCACACAACAGGCGCAAGAGTCAGAGAAAGGCTGAGCTCTAACCTGTCCACCCGCTCTCTGCTCAATATATAGCCCAGATCTACACTGACGTAAAGGCCAAAGTCTAAAAATACCCGCCAAATAATCACACACGCCCAGCACACGCCCAGAAACCGGTGACACACTCAAAAAAATACGCGCACTTCCTCAAACGCCCAAAACTGCCGTCATTTCCGGGTTCCCACGCTACGTCATCAAAACACGACTTTCAAATTCCGTCGACCGTTAAAAACGTCACCCGCCCCGCCCCTAACGGTCGCCCGTCTCTCAGCCAATCAGCGCCCCGCATCCCCAAATTCAAACACCTCATTTGCATATTAACGCGCACAAAAAGTTTGAGGTATATTATTGATGATG
參考文獻
Figure 02_image007
Figure 02_image008
Figure 02_image009
Figure 02_image010
Figure 02_image011
Figure 02_image012
就以下描述及隨附圖式將更好地理解本發明之此等及其他特徵、態樣及優勢，其中：
圖 1 說明活體外T細胞活化分析之研究。示意性展示該分析，其中將疫苗盒遞送至抗原呈現細胞引起獨特肽抗原之表現、加工及MHC限制性呈現。經工程改造成具有匹配特定肽-MHC組合之T細胞受體的報導體T細胞經活化，引起螢光素酶表現。圖 2A 說明對短卡匣中連接子序列之評價且顯示在相對於彼此相同之位置中串接的五個I類MHC限制性抗原決定基(抗原決定基1至5)，繼之以兩個通用的II類MHC抗原決定基(MHC-II)。使用不同連接子產生各種迭代。在一些情況下，T細胞抗原決定基彼此直接連接。在其他情況下，T細胞抗原決定基側接於其天然序列之一側或兩側上。在其他迭代中，T細胞抗原決定基藉由非天然序列AAY、RR及DPP連接。圖 2B 說明對短卡匣中連接子序列之評價且顯示有關嵌入該等短卡匣中之T細胞抗原決定基的序列資訊。圖 3 說明對添加至模型疫苗卡匣中之細胞靶向序列之評價。該等靶向卡匣用泛素(Ub)、信號肽(SP)及/或跨膜(TM)結構域延伸該短卡匣設計，特徵在於緊鄰該五個標記物人類T細胞抗原決定基(抗原決定基1至5)以及兩個小鼠T細胞抗原決定基SIINFEKL (SII)及SPSYAYHQF(A5)，且使用非天然連接子AAY-或天然連接子側接兩側上的T細胞抗原決定基(25聚體)。圖 4 說明對短卡匣中連接子序列之活體內評價。A)使用HLA-A2轉殖基因小鼠進行疫苗卡匣之活體內評價的實驗設計。圖 5A 說明對21聚體長卡匣中抗原決定基位置之影響的活體內評價且顯示長卡匣之設計需要用25聚體天然序列中所包含之另外的熟知T細胞I類抗原決定基(抗原決定基6至21)隔開的包含在25聚體天然序列中之五個標記物I類抗原決定基(抗原決定基1至5)(連接子=天然側接序列)，及兩個通用的II類抗原決定基(MHC-II0，其中僅I類抗原決定基之相對位置變化。圖 5B 說明對21聚體長卡匣中抗原決定基位置之影響的活體內評價且顯示有關所用T細胞抗原決定基之序列資訊。圖 6A 說明臨床前IND授權研究(IND-enabling study)之最終卡匣設計且顯示最終卡匣之設計包含在25聚體天然序列中所含有之20個MHC I抗原決定基(連接子=天然側接序列)以及2個通用MHC II類抗原決定基，該20個MHC I抗原決定基由6個非人類靈長類動物(NHP)抗原決定基、5個人類抗原決定基、9個鼠類抗原決定基構成。圖 6B 說明臨床前IND授權研究之最終卡匣設計且顯示呈現於非人類靈長類動物、小鼠及人類來源之I類MHC上的所用T細胞抗原決定基之序列資訊，以及2個通用MHC II類抗原決定基PADRE及破傷風類毒素之序列。圖 7A 說明在轉染之後產生ChAdV68.4WTnt.GFP病毒。使用磷酸鈣方案，用ChAdV68.4WTnt.GFP DNA轉染HEK293A細胞。在轉染之後10天，觀測到病毒複製且使用光學顯微鏡檢查(40×放大率)觀測到ChAdV68.4WTnt.GFP病毒蝕斑。圖 7B 說明在轉染之後產生ChAdV68.4WTnt.GFP病毒。使用磷酸鈣方案，用ChAdV68.4WTnt.GFP DNA轉染HEK293A細胞。在轉染之後10天，觀測到病毒複製且使用螢光顯微鏡檢查，在40×放大率下觀測到ChAdV68.4WTnt.GFP病毒蝕斑。圖 7C 說明在轉染之後產生ChAdV68.4WTnt .GFP病毒。使用磷酸鈣方案，用ChAdV68.4WTnt.GFP DNA轉染HEK293A細胞。在轉染之後10天，觀測到病毒複製且使用螢光顯微鏡檢查，在100×放大率下觀測到ChAdV68.4WTnt.GFP病毒蝕斑。圖 8A 說明轉染之後產生ChAdV68.5WTnt.GFP病毒。使用脂染胺方案，用ChAdV68.5WTnt.GFP DNA轉染HEK293A細胞。在轉染之後10天，觀測到病毒複製(蝕斑)。製備溶解產物且用於再感染T25燒瓶中之293A細胞。3天後，使用光學顯微鏡檢查(40×放大率)觀測到ChAdV68.5WTnt.GFP病毒蝕斑且拍照。 圖8B 說明轉染之後產生ChAdV68.5WTnt.GFP病毒。使用脂染胺方案，用ChAdV68.5WTnt.GFP DNA轉染HEK293A細胞。在轉染之後10天，觀測到病毒複製(蝕斑)。製備溶解產物且用於再感染T25燒瓶中之293A細胞。3天後，使用螢光顯微鏡檢查，在40×放大率下觀測到ChAdV68.5WTnt.GFP病毒蝕斑且拍照。圖 8C 說明轉染之後產生ChAdV68.5WTnt.GFP病毒。使用脂染胺方案，用ChAdV68.5WTnt.GFP DNA轉染HEK293A細胞。在轉染之後10天，觀測到病毒複製(蝕斑)。製備溶解產物且用於再感染T25燒瓶中之293A細胞。3天後，使用螢光顯微鏡檢查，在100×放大率下觀測到ChAdV68.5WTnt.GFP病毒蝕斑且拍照。圖 9 說明病毒粒子製造方案。圖 10 說明α病毒源性VEE自我複製型RNA (srRNA)載體。圖 11 說明在用VEE-螢光素酶srRNA接種C57BL/6J小鼠之後的活體內報導體表現。顯示出在各種時間點用VEE-螢光素酶srRNA免疫接種C57BL/6J小鼠(每隻小鼠10 ug，兩側肌肉內注射，MC3封裝)之後的代表性螢光素酶信號圖像。圖 12A 說明在帶有B16-OVA腫瘤之小鼠中免疫接種用MC3LNP調配之VEE srRNA之後14天量測的T細胞反應。向帶有B16-OVA腫瘤之C57BL/6J小鼠注射10 ug VEE- 螢光素酶srRNA (對照)、VEEUbAAY srRNA (Vax)、VEE-螢光素酶srRNA及抗CTLA-4 (aCTLA-4)或VEE-UbAAY srRNA及抗CTLA-4 (Vax+aCTLA-4)。此外，自第7天開始，用抗PD1 mAb治療所有小鼠。每組由8隻小鼠組成。在免疫接種之後14天，處死小鼠且收集脾及淋巴結。藉由IFN-γ ELISPOT評估SIINFEKL特異性T細胞反應且以每106個脾細胞之斑點形成細胞(SFC)數報導。線表示中值。圖 12B 說明在帶有B16-OVA腫瘤之小鼠中免疫接種用MC3LNP調配之VEE srRNA之後14天量測的T細胞反應。向帶有B16-OVA腫瘤之C57BL/6J 小鼠注射10 ug VEE- 螢光素酶srRNA (對照)、VEE-UbAAY srRNA (Vax)、VEE-螢光素酶srRNA及抗CTLA-4 (aCTLA-4)或VEE-UbAAY srRNA及抗CTLA-4 (Vax+aCTLA-4)。此外，自第7天開始，用抗PD1 mAb治療所有小鼠。每組由8隻小鼠組成。在免疫接種之後14天，處死小鼠且收集脾及淋巴結。藉由MHCI-五聚體染色評估SIINFEKL特異性T細胞反應，以五聚體陽性細胞佔CD8陽性細胞之百分比報導。線表示中值。圖 13A 說明在帶有B16-OVA腫瘤之小鼠中進行異源初免/增強免疫之後的抗原特異性T細胞反應。向帶有B16-OVA腫瘤之C57BL/6J小鼠注射表現GFP之腺病毒(Ad5-GFP)且用經MC3 LNP調配之VEE-螢光素酶srRNA (對照)增強免疫或注射Ad5-UbAAY且用VEE-UbAAY srRNA(Vax)增強免疫。還用IgG對照mAb治療對照組及Vax組。第三組用Ad5-GFP初免/VEE-螢光素酶srRNA增強免疫與抗CTLA-4之組合(aCTLA-4)治療，而第四組用Ad5-UbAAY初免/VEE-UbAAY增強免疫與抗CTLA-4之組合(Vax+aCTLA-4)治療。此外，自第21天開始，用抗PD-1 mAb治療所有小鼠。藉由IFN-γ ELISPOT量測T細胞反應。在用腺病毒免疫接種後14天，處死小鼠且收集脾及淋巴結。圖 13B 說明在帶有B16-OVA腫瘤之小鼠中進行異源初免/增強免疫之後的抗原特異性T細胞反應。向帶有B16-OVA腫瘤之C57BL/6J小鼠注射表現GFP之腺病毒(Ad5-GFP)且用經MC3 LNP調配之VEE-螢光素酶srRNA (對照)增強免疫或注射Ad5-UbAAY且用VEE-UbAAY srRNA(Vax)增強免疫。還用IgG對照mAb治療對照組及Vax組。第三組用Ad5-GFP初免/VEE-螢光素酶srRNA增強免疫與抗CTLA-4之組合(aCTLA-4)治療，而第四組用Ad5-UbAAY初免/VEE-UbAAY增強免疫與抗CTLA-4之組合(Vax+aCTLA-4)治療。此外，自第21天開始，用抗PD-1 mAb治療所有小鼠。藉由IFN-γ ELISPOT量測T細胞反應。在用腺病毒免疫接種後14天及在用srRNA增強免疫後14天(初免之後第28天)，處死小鼠且收集脾及淋巴結。圖 13C 說明在帶有B16-OVA腫瘤之小鼠中進行異源初免/增強免疫之後的抗原特異性T細胞反應。向帶有B16-OVA腫瘤之C57BL/6J小鼠注射表現GFP之腺病毒(Ad5-GFP)且用經MC3 LNP調配之VEE-螢光素酶srRNA (對照)增強免疫或注射Ad5-UbAAY且用VEE-UbAAY srRNA(Vax)增強免疫。還用IgG對照mAb治療對照組及Vax組。第三組用Ad5-GFP初免/VEE-螢光素酶srRNA增強免疫與抗CTLA-4之組合(aCTLA-4)治療，而第四組用Ad5-UbAAY初免/VEE-UbAAY增強免疫與抗CTLA-4之組合(Vax+aCTLA-4)治療。此外，自第21天開始，用抗PD-1 mAb治療所有小鼠。藉由MHC I類五聚體染色量測T細胞反應。在用腺病毒免疫接種後14天，處死小鼠且收集脾及淋巴結。圖 13D 說明在帶有B16-OVA腫瘤之小鼠中進行異源初免/增強免疫之後的抗原特異性T細胞反應。向帶有B16-OVA腫瘤之C57BL/6J小鼠注射表現GFP之腺病毒(Ad5-GFP)且用經MC3 LNP調配之VEE-螢光素酶srRNA (對照)增強免疫或注射Ad5-UbAAY且用VEE-UbAAY srRNA(Vax)增強免疫。還用IgG對照mAb治療對照組及Vax組。第三組用Ad5-GFP初免/VEE-螢光素酶srRNA增強免疫與抗CTLA-4之組合(aCTLA-4)治療，而第四組用Ad5-UbAAY初免/VEE-UbAAY增強免疫與抗CTLA-4之組合(Vax+aCTLA-4)治療。此外，自第21天開始，用抗PD-1 mAb治療所有小鼠。藉由MHC I類五聚體染色量測T細胞反應。在用腺病毒免疫接種後14天及在用srRNA增強免疫後14天(初免之後第28天)，處死小鼠且收集脾及淋巴結。圖 14A 說明在帶有CT26(Balb/c)腫瘤之小鼠中進行異源初免/增強免疫之後的抗原特異性T細胞反應。對小鼠免疫接種Ad5-GFP且在腺病毒初免之後15天，用經MC3 LNP調配之VEE-螢光素酶srRNA (對照)增強免疫，或用Ad5-UbAAY進行初免且用VEE-UbAAY srRNA(Vax)增強免疫。還用IgG對照mAb治療對照組及Vax組。向一個獨立組投與Ad5-GFP/VEE-螢光素酶srRNA初免/增強免疫與抗PD-1之組合(aPD1)，而第四組接受Ad5-UbAAY/VEE-UbAAY srRNA初免/增強免疫與抗PD-1 mAb之組合(Vax+aPD1)。使用IFN-γ ELISPOT量測T細胞對AH1肽之反應。在用腺病毒免疫接種後12天，處死小鼠且收集脾及淋巴結。圖 14B 說明在帶有CT26(Balb/c)腫瘤之小鼠中進行異源初免/增強免疫之後的抗原特異性T細胞反應。對小鼠免疫接種Ad5-GFP且在腺病毒初免之後15天，用經MC3 LNP調配之VEE-螢光素酶srRNA (對照)增強免疫，或用Ad5-UbAAY進行初免且用VEE-UbAAY srRNA(Vax)增強免疫。還用IgG對照mAb治療對照組及Vax組。向一個獨立組投與Ad5-GFP/VEE-螢光素酶srRNA初免/增強免疫與抗PD-1之組合(aPD1)，而第四組接受Ad5-UbAAY/VEE-UbAAY srRNA初免/增強免疫與抗PD-1 mAb之組合(Vax+aPD1)。使用IFN-γ ELI SPOT量測T細胞對AH1肽之反應。在用腺病毒免疫接種後12天及在用srRNA增強免疫後6 天(初免之後第21天)，處死小鼠且收集脾及淋巴結。圖 15 說明ChAdV68引起針對小鼠中小鼠腫瘤抗原之T細胞反應。對小鼠免疫接種ChAdV68.5WTnt.MAG25mer，且在C57BL/6J 雌性小鼠中量測針對MHC I類抗原決定基SIINFEKL (OVA)之T細胞反應且在Balb/c小鼠中量測針對MHC I類抗原決定基AH1-A5之T細胞反應。呈現在ELISpot分析中量測的每106 個脾細胞之平均斑點形成細胞(SFC)數。誤差條表示標準差。圖 16 說明在CT26腫瘤模型中單次免疫接種ChAdV6、ChAdV+抗PD-1、srRNA、srRNA+抗PD-1或單獨抗PD-1之後的細胞免疫反應。使用ELISpot量測來自每組之6隻小鼠之脾細胞中抗原特異性IFN-γ的產生。結果呈現為每106 個脾細胞之斑點形成細胞(SFC)數。每個組之中值以水平線指示。P值使用鄧尼特氏多重比較(Dunnett's multiple comparison)測試測定；***P＜0.0001，**P＜0.001，*P＜0.05。ChAdV=ChAdV68.5WTnt.MAG25mer；srRNA=VEE-MAG25mer srRNA。圖 17 說明在CT26 腫瘤模型中單次免疫接種ChAdV6、ChAdV+抗PD-1、srRNA、srRNA+抗PD-1或單獨抗PD-1之後的CD8 T細胞反應。使用ICS量測CD8 T細胞中抗原特異性IFN-γ的產生且結果呈現為抗原特異性CD8 T細胞佔總CD8T細胞之百分含量。每個組之中值以水平線指示。P值使用鄧尼特氏多重比較測試測定；***P＜0.0001，**P＜0.001，*P＜0.05。ChAdV=ChAdV68.5WTnt.MAG25mer；srRNA=VEE-MAG25mer srRNA。圖 18 說明在CT26腫瘤模型中用ChAdV/srRNA異源初免/增強免疫、srRNA/ChAdV異源初免/增強免疫或srRNA/srRNA同源初免/增強免疫進行免疫接種之後的腫瘤生長情況。亦示出與在初免及增強免疫期間投與或不投與抗PD1的初免/增強免疫之比較。每週兩次量測腫瘤體積且呈現研究之前21天之平均腫瘤體積。在研究起始時每組22-28隻小鼠。誤差條表示平均值之標準誤差(SEM)。P值使用鄧尼特氏測試測定；***P＜0.0001，**P＜0.001，*P＜0.05。ChAdV=ChAdV68.5WTnt.MAG25mer；srRNA=VEE-MAG25mer srRNA。圖 19 說明在CT26腫瘤模型中用ChAdV/srRNA異源初免/增強免疫、srRNA/ChAdV異源初免/增強免疫或srRNA/srRNA同源初免/增強免疫進行免疫接種之後的存活情況。亦示出與在初免及增強免疫期間投與或不投與抗PD1的初免/增強免疫之比較。P值使用對數等級分析測定；***P ＜ 0.0001，**P ＜ 0.001，*P ＜ 0.01。ChAdV = ChAdV68.5WTnt. MAG25mer；srRNA = VEE-MAG25mer srRNA。圖 20 說明使用ELISpot來量測之抗原特異性細胞免疫反應。在第一增強免疫免疫接種(每組6隻恆河猴) 1、2、3、4、5、6、8、9或10週之後，使用ELISpot針對VEE-MAG25mer srRNA-LNP1 (30 μg)(圖20A )、VEE-MAG25mer srRNA-LNP1 (100 μg) (圖20B )或VEEMAG25mer srRNA-LNP2 (100 μg) (圖20C )同源初免/增強免疫或ChAdV68.5WTnt.MAG25mer/VEE-MAG25mer srRNA異源初免/增強免疫組(圖20D )在PBMC中量測之對六種不同mamu A01限制性抗原決定基的抗原特異性IFN-γ產量。結果以堆疊條形圖形式呈現對於各抗原決定基，每106 個PBMC之平均斑點形成細胞(SFC)數。相對於在放血前(第0週)之水準歸一化各動物之值。圖 21 展示使用ELISpot來量測之抗原特異性細胞免疫反應。在免疫接種之前及初始免疫接種4、5、6、7、8、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或24週之後，在用ChAdV68.5WTnt.MAG25mer/VEE-MAG25mer srRNA異源初免/增強免疫方案免疫接種之後，使用ELISpot在PBMC中量測對六種不同mamu A01限制性抗原決定基之抗原特異性IFN-γ產量。結果以堆疊條形圖形式呈現對於各抗原決定基(每組6隻恆河猴)，每106 個PBMC之平均斑點形成細胞(SFC)數。圖 22 展示使用ELISpot來量測之抗原特異性細胞免疫反應。在免疫接種之前及初始免疫接種4、5、6、7、8、10、11、12、13、14或15週之後，在用VEE-MAG25mer srRNA LNP2同源初免/增強免疫方案免疫接種之後，使用ELISpot在PBMC中量測對六種不同mamu A01限制性抗原決定基之抗原特異性IFN-γ產量。結果以堆疊條形圖形式呈現對於各抗原決定基(每組6隻恆河猴)，每106 個PBMC之平均斑點形成細胞(SFC)數。圖 23 展示使用ELISpot來量測之抗原特異性細胞免疫反應。在免疫接種之前及初始免疫接種4、5、6、7、8、10、11、12、13、14或15週之後，在用VEE-MAG25mer srRNA LNP1同源初免/增強免疫方案免疫接種之後，使用ELISpot在PBMC中量測對六種不同mamu A01限制性抗原決定基之抗原特異性IFN-γ產量。結果以堆疊條形圖形式呈現對於各抗原決定基(每組6隻恆河猴)，每106 個PBMC之平均斑點形成細胞(SFC)數。圖 24A 及圖 24B 展示由Promega動態範圍標準產生之實例肽光譜。圖 25 展示與非純化之匯集病毒相比，藉由IU力價評估之八種選定之ChAdV68-MAG快速生長蝕斑之生產能力。圖中各欄上方之數字表示在受控感染中在MOI為0.1時，匯集病毒之提高倍數。圖 26 展示純系1A中鑑別之E4基因座及E4orf2-E4orf4之間727 bp缺失之示意圖。圖 27 展示病毒加上及減去E4缺失之病毒生產能力。條柱上方之數字表示與非E4缺失病毒相比之提高倍數。ChAdV68-MAG與ChAdV68-MAG-E4病毒之比較係於3次獨立情況下進行。在每種情況下，利用兩種病毒之400 mL生產操作係在MOI為1.0下進行。展示病毒粒子(VP)力價(左圖)及感染單位(IU)力價(右圖)。圖 28 展示在用ChAdV68.5WTnt.MAG25mer (「MAG」)及ChAdV68-MAG-E4缺失(「MAG-E4」)病毒感染之細胞中使用兔抗II類抗原決定基抗體表現之MAG表現的西方墨點法分析(Western blot analysis)。如加號及減號所示，利用及不利用蛋白酶體抑制劑MG-132處理樣品。圖 29 說明具有30個(L)、40個(XL)或50個(XXL)抗原決定基之大抗原卡匣之各種物種的模型抗原決定基之一般組織。圖 30 展示ChAd載體表現長卡匣，如由使用識別為所有卡匣所共用之序列之抗II類(PADRE)抗體的上述西方墨點法指示。HEK293細胞經表現不同大小之大卡匣(ChAdV68-50XXL、ChAdV68-40XL及ChAdV68-30L)之ChAdV68載體感染。感染設定在0.2之MOI下。在感染二十四小時後，將蛋白酶體抑制劑MG132添加至一組感染孔(由加號標誌指示)。另一組經病毒處理之孔未用MG132處理(由負號指示)。未感染之HEK293細胞(293F)用作陰性對照。在感染四十八小時後，收集細胞集結粒且藉由SDS/PAGE電泳及使用兔抗II類PADRE抗體之免疫墨點法分析。將HRP抗兔抗體及ECL化學發光基質用於偵測。圖 31 展示藉由ICS對AH1 (頂部)及SIINFEKL (底部)偵測之經ChAdV68大卡匣免疫接種之小鼠中之CD8+免疫反應。資料呈現為對模型抗原決定基佔總CD8細胞之百分比的IFNg+細胞。圖 32 展示在ChAdV68大卡匣疫苗接種後對LD-AH1+ (頂部)及Kb-SIINFEKL+ (底部)四聚體之CD8+反應。資料呈現為對模型四聚體肽複合物具有反應性之總CD8細胞之百分比。利用杜凱氏測試藉由ANOVA獲得*p＜0.05，**p＜0.01。所有p值均與MAG 20-抗原卡匣比較。圖 33 展示藉由ICS對AH1 (頂部)及SIINFEKL (底部)偵測之經α病毒大卡匣處理之小鼠中之CD8+免疫反應。資料呈現為對模型抗原決定基佔總CD8 細胞之百分比的IFNg+細胞。利用杜凱氏測試藉由ANOVA獲得*p＜0.05，**p＜0.01，**p＜0.001。所有p值均與MAG 20-抗原卡匣比較。圖 34 說明用於評估恆河猴中含有抗原卡匣之載體之免疫原性。三角形指示第0週及第32週之ChAdV68疫苗接種(1e12 vp/動物)。圓形表示第0週、第4週、第12週、第20週、第28週及第32週之α病毒疫苗接種。方塊表示抗CTLA4抗體之投藥。圖 35 展示用單獨chAd-MAG給藥之恆河猴中之CD8+抗抗原決定基反應之時程(第4組)。展示平均SFC/1e6脾細胞。圖 36 展示用IV遞送之chAd-MAG加抗CTLA4抗體(伊匹單抗(Ipilimumab))給藥之恆河猴中的CD8+抗抗原決定基反應之時程(第5組)。展示平均SFC/1e6脾細胞。圖 37 展示用SC遞送之chAd-MAG加抗CTLA4抗體(伊匹單抗)給藥之恆河猴中的CD8+抗抗原決定基反應之時程(第6組)。展示平均SFC/1e6脾細胞。圖 38 展示藉由ELISpot量測之由ChAdV68/samRNA疫苗方案產生之抗原特異性記憶反應。結果呈現為個體點圖，其中各點表示單個動物。展示免疫接種前基線(左圖)及初免後18個月時的記憶反應(右圖)。圖 39 展示藉由使用組合四聚體染色及CD45RA/CCR7共同染色之流式細胞量測術的抗原特異性CD8+ T細胞之記憶細胞表型。圖 40 展示在研究第18個月時四個Mamu-A*01四聚體+CD8+ T細胞群體之總和內記憶細胞類型之分佈。記憶細胞表徵如下：CD45RA+CCR7+ =初始，CD45RA+CCR7- =效應(Teff)，CD45RACCR7+ =中央記憶(Tcm)，CD45RA-CCR7- =效應記憶(Tem)。圖 41 展示識別CT26腫瘤攜帶小鼠中之CT26腫瘤抗原AH1之CD8+ T細胞的頻率。P值使用單向ANOVA以及杜凱氏多重比較測試測定；**P＜0.001，*P＜0.05。ChAdV=ChAdV68.5WTnt.MAG25mer；aCTLA4=抗CTLA4抗體，純系9D9。圖 42A 展示在用ChAdV68-MAG及ChAdV68-E4δ-MAG載體處理之Balb/c小鼠中用AH1 (鼠類白血病病毒包膜蛋白gp70之顯性抗原決定基)刺激後，藉由ICS評估IFN-γ產生之CD8+免疫反應。藉由向股四頭肌雙側注射50 uL病毒(總計100 uL，50 uL/腿)來對Balb/c小鼠實施免疫。圖 42B 展示在用ChAdV68-CMV-MAG (左圖)及ChAdV68-E4d-CMT-MAG (右圖)免疫之恆河猴中在第2週用6種不同恆河猴Mamu-A*01 I類抗原決定基刺激後藉由ELISpot評估IFN-γ產生之T細胞反應，且兩種情況均投與抗CTLA4抗體(伊匹单抗(Ipilimumab))。圖 42C 展示在用ChAdV68-CMV-MAG (左圖)及ChAdV68-E4d-CMT-MAG (右圖)免疫之恆河猴中在一段時間內用6種不同的恆河猴Mamu-A*01 I類抗原決定基刺激後藉由ELISpot評估IFN-γ產生之T細胞反應，且兩種情況均投與抗CTLA4抗體(伊匹单抗)。圖 43 說明使用抗原編碼疫苗實例之四環素控制之病毒生產系統的一般策略。圖 44A 呈現展示關於欲表現之啟動子及卡匣之「TETo」反應區之排列的示意圖。圖 44B 呈現展示關於欲表現之啟動子及卡匣之「CMT」反應區之排列的示意圖。圖 45A 展示TETr介導之自具有TETo序列之ChAdV68載體表現之GFP的調控。相對於親本293F細胞株(左圖)，GFP在表現TETr之293F細胞(純系17，右圖)中顯著減少。用ChAdV68-TETo-GFP以1之MOI感染細胞，且24小時後藉由螢光顯微鏡在10X物鏡下評價GFP。圖 45B 展示TETr介導之自具有CMT序列之ChAdV68載體表現之SEAP的調控。相對於親本293F細胞株(左欄)，在表現TETr之293F細胞(純系17，左起第二欄)中，SEAP顯著減少。使用表現對照表現卡匣之ChAdV68載體建立背景信號(右兩欄)。293F細胞以0.3之MOI感染，且24小時後收集培養基用於SEAP分析(Phospha-LightTM System (Applied Biosystems)，使用化學發光受質偵測分泌之鹼性磷酸酶)，其根據製造商之說明進行操作。圖 46 展示相對於親本293F株中之產生，在293F TETr阻遏株(純系17)中ChAdV68-Teto-MAG載體之病毒產生。實驗以一式三份進行(操作1-3)。在每個實驗中，以約3之MOI感染400 mL 293F細胞且在收集前培育48-72小時。藉由兩個不連續之CsCl超速離心步驟純化病毒，且透析至存儲緩衝液中。藉由在260 nm處之吸光度量測病毒粒子。展示病毒粒子(VP；上圖)及感染單位(IU；下圖)力價。圖 47A 展示相對於正常293F細胞株中具有相同卡匣之非調控病毒(「MAG」)，在293F TETr株(純系17)中Tet調控病毒(「TETo-MAG」)之總體生產能力。展示來自多個400 mL生產操作且接著進行離心之資料。圖上方之數字表示Tet調控病毒之提高倍數。圖 47B 展示ChAdV68-CT-TSNA、ChAdV68-TETo-TSNA、ChAdV68-CMT-TSNA及ChAdV68-E4d-CMT-TSNA病毒相對於ChAdV68-CMV-TSNA之病毒產生。圖 47C 展示在表現tTS之細胞株中使用具有CMT反應區之腺病毒載體對模型抗原卡匣50XXL及M2.2之病毒產生。圖 48 展示用調控載體與未調控載體接種疫苗後之抗原特異性T細胞反應。使用ICS量測CD8 T細胞中之抗原特異性IFN-γ產生，且結果以抗原特異性CD8 T細胞占總CD8 T細胞之百分比呈現。水平線表示各組之中值。在正常CMV啟動子(ChAdV-MAG)或TETo調控啟動子(TET-ChAdV-MAG)之控制下，用1x1010 VP之表現模型抗原卡匣之ChAdV68疫苗對Balb/c小鼠實施免疫。接種疫苗後12天收集脾臟且製成單細胞懸浮液。
Figure 12_A0101_SEQ_0001
Figure 12_A0101_SEQ_0002
Figure 12_A0101_SEQ_0003
Figure 12_A0101_SEQ_0004
Figure 12_A0101_SEQ_0005
Figure 12_A0101_SEQ_0006
Figure 12_A0101_SEQ_0007
Figure 12_A0101_SEQ_0008
Figure 12_A0101_SEQ_0009
Figure 12_A0101_SEQ_0010
Figure 12_A0101_SEQ_0011
Figure 12_A0101_SEQ_0012
Figure 12_A0101_SEQ_0013
Figure 12_A0101_SEQ_0014
Figure 12_A0101_SEQ_0015
Figure 12_A0101_SEQ_0016
Figure 12_A0101_SEQ_0017
Figure 12_A0101_SEQ_0018
Figure 12_A0101_SEQ_0019
Figure 12_A0101_SEQ_0020
Figure 12_A0101_SEQ_0021
Figure 12_A0101_SEQ_0022
Figure 12_A0101_SEQ_0023
Figure 12_A0101_SEQ_0024
Figure 12_A0101_SEQ_0025
Figure 12_A0101_SEQ_0026
Figure 12_A0101_SEQ_0027
Figure 12_A0101_SEQ_0028
Figure 12_A0101_SEQ_0029
Figure 12_A0101_SEQ_0030
Figure 12_A0101_SEQ_0031
Figure 12_A0101_SEQ_0032
Figure 12_A0101_SEQ_0033
Figure 12_A0101_SEQ_0034
Figure 12_A0101_SEQ_0035
Figure 12_A0101_SEQ_0036
Figure 12_A0101_SEQ_0037
Figure 12_A0101_SEQ_0038
Figure 12_A0101_SEQ_0039
Figure 12_A0101_SEQ_0040
Figure 12_A0101_SEQ_0041
Figure 12_A0101_SEQ_0042
Figure 12_A0101_SEQ_0043
Figure 12_A0101_SEQ_0044
Figure 12_A0101_SEQ_0045
Figure 12_A0101_SEQ_0046
Figure 12_A0101_SEQ_0047
Figure 12_A0101_SEQ_0048
Figure 12_A0101_SEQ_0049
Figure 12_A0101_SEQ_0050
Figure 12_A0101_SEQ_0051
Figure 12_A0101_SEQ_0052
Figure 12_A0101_SEQ_0053
Figure 12_A0101_SEQ_0054
Figure 12_A0101_SEQ_0055
Figure 12_A0101_SEQ_0056
Figure 12_A0101_SEQ_0057
Figure 12_A0101_SEQ_0058
Figure 12_A0101_SEQ_0059
Figure 12_A0101_SEQ_0060
Figure 12_A0101_SEQ_0061
Figure 12_A0101_SEQ_0062
Figure 12_A0101_SEQ_0063
Figure 12_A0101_SEQ_0064
Figure 12_A0101_SEQ_0065
Figure 12_A0101_SEQ_0066
Figure 12_A0101_SEQ_0067
Figure 12_A0101_SEQ_0068
Figure 12_A0101_SEQ_0069
Figure 12_A0101_SEQ_0070
Figure 12_A0101_SEQ_0071
Figure 12_A0101_SEQ_0072
Figure 12_A0101_SEQ_0073
Figure 12_A0101_SEQ_0074
Figure 12_A0101_SEQ_0075
Figure 12_A0101_SEQ_0076
Figure 12_A0101_SEQ_0077
Figure 12_A0101_SEQ_0078
Figure 12_A0101_SEQ_0079
Figure 12_A0101_SEQ_0080
Figure 12_A0101_SEQ_0081
Figure 12_A0101_SEQ_0082
Figure 12_A0101_SEQ_0083
Figure 12_A0101_SEQ_0084
Figure 12_A0101_SEQ_0085
Figure 12_A0101_SEQ_0086
Figure 12_A0101_SEQ_0087
Figure 12_A0101_SEQ_0088
Figure 12_A0101_SEQ_0089
Figure 12_A0101_SEQ_0090
Figure 12_A0101_SEQ_0091
Figure 12_A0101_SEQ_0092
Figure 12_A0101_SEQ_0093
Figure 12_A0101_SEQ_0094
Figure 12_A0101_SEQ_0095
Figure 12_A0101_SEQ_0096
Figure 12_A0101_SEQ_0097
Figure 12_A0101_SEQ_0098
Figure 12_A0101_SEQ_0099
Figure 12_A0101_SEQ_0100
Figure 12_A0101_SEQ_0101
Figure 12_A0101_SEQ_0102
Figure 12_A0101_SEQ_0103
Figure 12_A0101_SEQ_0104
Figure 12_A0101_SEQ_0105
Figure 12_A0101_SEQ_0106
Figure 12_A0101_SEQ_0107
Figure 12_A0101_SEQ_0108
Figure 12_A0101_SEQ_0109
Figure 12_A0101_SEQ_0110
Figure 12_A0101_SEQ_0111
Figure 12_A0101_SEQ_0112
Figure 12_A0101_SEQ_0113
Figure 12_A0101_SEQ_0114
Figure 12_A0101_SEQ_0115
Figure 12_A0101_SEQ_0116
Figure 12_A0101_SEQ_0117
Figure 12_A0101_SEQ_0118
Figure 12_A0101_SEQ_0119
Figure 12_A0101_SEQ_0120
Figure 12_A0101_SEQ_0121
Figure 12_A0101_SEQ_0122
Figure 12_A0101_SEQ_0123
Figure 12_A0101_SEQ_0124
Figure 12_A0101_SEQ_0125
Figure 12_A0101_SEQ_0126
Figure 12_A0101_SEQ_0127
Figure 12_A0101_SEQ_0128
Figure 12_A0101_SEQ_0129
Figure 12_A0101_SEQ_0130
Figure 12_A0101_SEQ_0131
Figure 12_A0101_SEQ_0132
Figure 12_A0101_SEQ_0133
Figure 12_A0101_SEQ_0134
Figure 12_A0101_SEQ_0135
Figure 12_A0101_SEQ_0136
Figure 12_A0101_SEQ_0137
Figure 12_A0101_SEQ_0138
Figure 12_A0101_SEQ_0139
Figure 12_A0101_SEQ_0140
Figure 12_A0101_SEQ_0141
Figure 12_A0101_SEQ_0142
Figure 12_A0101_SEQ_0143
Figure 12_A0101_SEQ_0144
Figure 12_A0101_SEQ_0145
Figure 12_A0101_SEQ_0146
Figure 12_A0101_SEQ_0147
Figure 12_A0101_SEQ_0148
Figure 12_A0101_SEQ_0149
Figure 12_A0101_SEQ_0150
Figure 12_A0101_SEQ_0151
Figure 12_A0101_SEQ_0152
Figure 12_A0101_SEQ_0153
Figure 12_A0101_SEQ_0154
Figure 12_A0101_SEQ_0155
Figure 12_A0101_SEQ_0156
Figure 12_A0101_SEQ_0157
Figure 12_A0101_SEQ_0158
Figure 12_A0101_SEQ_0159
Figure 12_A0101_SEQ_0160
Figure 12_A0101_SEQ_0161
Figure 12_A0101_SEQ_0162
Figure 12_A0101_SEQ_0163
Figure 12_A0101_SEQ_0164
Figure 12_A0101_SEQ_0165
Figure 12_A0101_SEQ_0166
Figure 12_A0101_SEQ_0167
Figure 12_A0101_SEQ_0168
Figure 12_A0101_SEQ_0169
Figure 12_A0101_SEQ_0170
Figure 12_A0101_SEQ_0171
Figure 12_A0101_SEQ_0172
Figure 12_A0101_SEQ_0173
Figure 12_A0101_SEQ_0174
Figure 12_A0101_SEQ_0175
Figure 12_A0101_SEQ_0176
Figure 12_A0101_SEQ_0177
Figure 12_A0101_SEQ_0178
Figure 12_A0101_SEQ_0179
Figure 12_A0101_SEQ_0180
Figure 12_A0101_SEQ_0181
Figure 12_A0101_SEQ_0182
Figure 12_A0101_SEQ_0183
Figure 12_A0101_SEQ_0184
Figure 12_A0101_SEQ_0185
Figure 12_A0101_SEQ_0186
Figure 12_A0101_SEQ_0187
Figure 12_A0101_SEQ_0188
Figure 12_A0101_SEQ_0189
Figure 12_A0101_SEQ_0190
Figure 12_A0101_SEQ_0191
Figure 12_A0101_SEQ_0192
Figure 12_A0101_SEQ_0193
Figure 12_A0101_SEQ_0194
Figure 12_A0101_SEQ_0195
Figure 12_A0101_SEQ_0196
Figure 12_A0101_SEQ_0197
Figure 12_A0101_SEQ_0198
Figure 12_A0101_SEQ_0199
Figure 12_A0101_SEQ_0200
Figure 12_A0101_SEQ_0201
Figure 12_A0101_SEQ_0202
Figure 12_A0101_SEQ_0203
Figure 12_A0101_SEQ_0204
Figure 12_A0101_SEQ_0205
Figure 12_A0101_SEQ_0206
Figure 12_A0101_SEQ_0207
Figure 12_A0101_SEQ_0208
Figure 12_A0101_SEQ_0209
Figure 12_A0101_SEQ_0210
Figure 12_A0101_SEQ_0211
Figure 12_A0101_SEQ_0212
Figure 12_A0101_SEQ_0213
Figure 12_A0101_SEQ_0214
Figure 12_A0101_SEQ_0215
Figure 12_A0101_SEQ_0216
Figure 12_A0101_SEQ_0217
Figure 12_A0101_SEQ_0218
Figure 12_A0101_SEQ_0219
Figure 12_A0101_SEQ_0220
Figure 12_A0101_SEQ_0221
Figure 12_A0101_SEQ_0222
Figure 12_A0101_SEQ_0223
Figure 12_A0101_SEQ_0224
Figure 12_A0101_SEQ_0225
Figure 12_A0101_SEQ_0226

Claims (145)

  1. 一種腺病毒載體，其包含： 腺病毒主鏈，其包含腺病毒基因組之一或多個基因或調控序列，且 其中該腺病毒主鏈包含關於該腺病毒基因組之部分缺失之E4基因，其中該部分缺失之E4基因包含缺失或部分缺失之E4orf2區及缺失或部分缺失之E4orf3區，及視情況存在之缺失或部分缺失之E4orf4區，且 視情況，其中該腺病毒載體進一步包含卡匣，該卡匣包含： (1) 至少一個有效負載核酸序列，視情況其中該至少一個有效負載核酸序列編碼多肽，視情況其中該多肽包含抗原，視情況其中該抗原包含： - MHC I類抗原決定基， - MHC II類抗原決定基， - 能夠刺激B細胞反應之抗原決定基，或 - 其組合，且 視情況其中該至少一個有效負載核酸序列進一步包含5'連接子序列及/或3'連接子序列，且視情況其中； (2) 可操作地連接於該至少一個有效負載核酸序列之至少一個啟動子序列， (3) 視情況存在之至少一個通用的編碼MHC II類抗原之核酸序列； (4) 視情況存在之至少一個編碼GPGPG之連接子序列(SEQ ID NO:56)；及 (5) 視情況存在之至少一個聚腺苷酸化序列。
  2. 一種包含經修飾之ChAdV68序列之黑猩猩腺病毒載體，其中該經修飾之ChAdV68序列包含： (a) 以SEQ ID NO:1所示之E4基因序列之部分缺失之E4基因，且其至少缺少以SEQ ID NO:1所示之序列之核苷酸34,916至35,642；及 (b) 以SEQ ID NO: 1所示之該ChAdV68序列之一或多個基因或調控序列，視情況其中該一或多個基因或調控序列包含以SEQ ID NO: 1所示之序列之黑猩猩腺病毒反向末端重複序列(ITR)、E1A、E1B、E2A、E2B、E3、E4、L1、L2、L3、L4及L5基因中的至少一者；且 視情況，其中該黑猩猩腺病毒載體進一步包含卡匣，其中該卡匣包含至少一個有效負載核酸序列，且其中該卡匣包含可操作地連接於該至少一個有效負載核酸序列之至少一個啟動子序列。
  3. 一種包含經修飾之ChAdV68序列之黑猩猩腺病毒載體，其中該經修飾之ChAdV68序列包含：  (a) 以SEQ ID NO:1所示之E4基因序列之部分缺失之E4基因，且其至少缺少以SEQ ID NO:1所示之序列之核苷酸34,916至35,642； (b) 以SEQ ID NO:1所示之序列之核苷酸2至34,916，其中該部分缺失之E4基因為該等核苷酸2至34,916之3'，且視情況該等核苷酸2至34,916另外缺少以SEQ ID NO:1所示之序列之核苷酸577至3403，對應於E1缺失，及/或缺少以SEQ ID NO:1所示之序列之核苷酸27,125至31,825，對應於E3缺失；及 (c) 以SEQ ID NO:1所示之序列之核苷酸35,643至36,518，且其中該部分缺失之E4基因為該等核苷酸35,643至36,518之5'，且 視情況，其中該黑猩猩腺病毒載體進一步包含卡匣，其中該卡匣包含至少一個有效負載核酸序列，且其中該卡匣包含可操作地連接於該至少一個有效負載核酸序列之至少一個啟動子序列。
  4. 一種黑猩猩腺病毒載體，其包含：  a. 經修飾之ChAdV68序列，其中該經修飾之ChAdV68序列包含： (i) 以SEQ ID NO:1所示之E4基因序列之部分缺失之E4基因，且其至少缺少以SEQ ID NO:1所示之序列之核苷酸34,916至35,642； (ii) 以SEQ ID NO:1所示之序列的核苷酸2至34,916，其中該部分缺失之E4基因為該等核苷酸2至34,916之3'，且視情況該等核苷酸2至34,916另外缺少以SEQ ID NO:1所示之序列的核苷酸577至3403，對應於E1缺失，及/或缺少以SEQ ID NO:1所示之序列的核苷酸27,125至31,825，對應於E3缺失；及 (iii) 及以SEQ ID NO:1所示之序列的核苷酸35,643至36,518，且其中該部分缺失之E4基因為該等核苷酸35,643至36,518之5'，及； b. CMV衍生之啟動子序列； c. SV40聚腺苷酸化信號核苷酸序列；及 d. 卡匣，該卡匣包含至少一個至少一個有效負載核酸序列，其編碼： - 至少一個MHC I類抗原決定基，視情況其中該至少一個MHC I類抗原決定基包含至少2個不同的MHC I類抗原決定基，該至少2個不同的MHC I類抗原決定基彼此線性連接，且各自視情況包含： (A) 使所編碼之肽序列不同於由野生型核酸序列編碼之相應肽序列的至少一個改變，其中該不同的MHC I抗原決定基之長度為7-15個胺基酸， (B) N末端連接子，其包含該不同的MHC I抗原決定基之長度為至少3個胺基酸之天然N末端胺基酸序列， (C) C末端連接子，其包含該不同的MHC I抗原決定基之長度為至少3個胺基酸之天然C末端酸序列，或 (D) 其組合， - 至少一個MHC II類抗原決定基，視情況其中該至少一個MHC II類抗原決定基包含至少2個不同的MHC II類抗原決定基， - 至少一個能夠刺激B細胞反應之抗原決定基，或 - 其組合，且 其中該卡匣經插入ChAdV68之缺失區域內，且該CMV衍生之啟動子序列可操作地連接於該卡匣。
  5. 如請求項1至4中任一項之載體，其中該卡匣包含以下式描述之有序序列，自5'至3'包含：Pa -(L5b -Nc -L3d )X -(G5e -Uf )Y -G3g -Ah 其中， N包含該至少一個有效負載核酸序列之一，視情況其中各N編碼MHC I類抗原決定基、MHC II類抗原決定基、能夠刺激B細胞反應之抗原決定基或其組合，視情況存在至少一個改變，該改變使得所編碼之抗原決定基序列不同於由野生型核酸序列編碼之相應肽序列，其中c = 1， P包含可操作地連接於該至少一個有效負載核酸序列中之至少一者之至少一個啟動子序列，其中a = 1， L5包含5'連接子序列，其中b = 0或1， L3包含3'連接子序列，其中d = 0或1， G5包含至少一個編碼GPGPG胺基酸連接子之核酸序列之一，其中e = 0或1， G3包含至少一個編碼GPGPG胺基酸連接子之核酸序列之一，其中g = 0或1， U包含至少一個通用的編碼MHC II類抗原之核酸序列之一，其中f = 1， A包含至少一個聚腺苷酸化序列，其中h = 0或1， X = 2至400，其中對於各X，相應之Nc 為有效負載核酸序列，視情況其中對於各X，相應之Nc 為不同的有效負載核酸序列，且 Y = 0-2，其中對於各Y，相應之Uf 為通用的編碼MHC II類抗原之核酸序列，視情況其中對於各Y，相應之Uf 為不同的通用的編碼MHC II類抗原之核酸序列。
  6. 如請求項5之載體，其中該卡匣進一步包含至少一個未編碼在該有序序列中之額外有效負載核酸序列。
  7. 如請求項5或6之載體，其中：  b = 1，d = 1，e = 1，g = 1，h = 1，X = 10，Y = 2， P為CMV衍生之啟動子序列， 各N編碼MHC I類抗原決定基、MHC II類抗原決定基、能夠刺激B細胞反應之抗原決定基或其組合， L5編碼該抗原決定基之天然N末端胺基酸序列，且其中該5'連接子序列編碼長度為至少3個胺基酸之肽， L3編碼該抗原決定基之天然C末端胺基酸序列，且其中該3'連接子序列編碼長度為至少3個胺基酸之肽， U為PADRE II類序列及破傷風類毒素MHC II類序列中之每一者，且 該載體包含經修飾之ChAdV68序列，其中該經修飾之ChAdV68序列包含： (a) 以SEQ ID NO:1所示之E4基因序列的部分缺失之E4基因，且其至少缺少以SEQ ID NO:1所示之序列之核苷酸34,916至35,642； (b) 以SEQ ID NO:1所示之序列之核苷酸2至34,916，其中該部分缺失之E4基因為該等核苷酸2至34,916之3'，且視情況該等核苷酸2至34,916另外缺少以SEQ ID NO:1所示之序列之核苷酸577至3403，對應於E1缺失，及/或缺少以SEQ ID NO:1所示之序列之核苷酸27,125至31,825，對應於E3缺失；及 (c) 以SEQ ID NO:1所示之序列的核苷酸35,643至36,518，且其中該部分缺失之E4基因為該等核苷酸35,643至36,518之5'。
  8. 如請求項2至4或7除外之前述請求項中任一項之載體，其中該載體為黑猩猩腺病毒載體，視情況其中該黑猩猩腺病毒載體為ChAdV68載體。
  9. 如請求項2至4或7除外之前述請求項中任一項之載體，其中該部分缺失之E4基因包含： A. 以SEQ ID NO:1中所示之E4基因序列，且其至少缺少以SEQ ID NO:1所示之序列的核苷酸34,916至35,642， B. 以SEQ ID NO:1所示之E4基因序列，且其至少缺少以SEQ ID NO:1所示之序列的核苷酸34,916至34,942、核苷酸34,952至35,305、以SEQ ID NO:1所示之序列的核苷酸35,302至35,642，且其中該載體至少包含以SEQ ID NO:1所示之序列的核苷酸2至36,518， C. 以SEQ ID NO:1所示之E4基因序列，且其至少缺少以SEQ ID NO:1所示之序列的核苷酸34,980至36516，且其中該載體至少包含以SEQ ID NO:1所示之序列的核苷酸2至36,518， D. 以SEQ ID NO:1所示之E4基因序列，且其至少缺少以SEQ ID NO:1所示之序列的核苷酸34,979至35,642，且其中該載體至少包含以SEQ ID NO:1所示之序列的核苷酸2至36,518， E. 至少部分缺失E4Orf2、完全缺失E4Orf3及至少部分缺失E4Orf4之E4缺失， F. 至少部分缺失E4Orf2、至少部分缺失E4Orf3及至少部分缺失E4Orf4之E4缺失， G. 至少部分缺失E4Orf1、完全缺失E4Orf2及至少部分缺失E4Orf3之E4缺失，或 H. 至少部分缺失E4Orf2及至少部分缺失E4Orf3之E4缺失。
  10. 如請求項2至4或7除外之前述請求項中任一項之載體，其中該載體包含以SEQ ID NO: 1所示之ChAdV68序列之一或多個基因或調控序列，視情況其中該一或多個基因或調控序列選自由以下組成之群：以SEQ ID NO: 1所示之序列的黑猩猩腺病毒反向末端重複序列(ITR)、E1A、E1B、E2A、E2B、E3、E4、L1、L2、L3、L4及L5基因。
  11. 如前述請求項中任一項之載體，其中該腺病毒主鏈或經修飾之ChAdV68序列進一步包含關於腺病毒基因組或關於以SEQ ID NO: 1所示之序列的在選自由腺病毒E1A、E1B、E2A、E2B、E3、L1、L2、L3、L4及L5基因組成之群的至少一個基因中的功能性缺失，視情況其中該腺病毒主鏈或經修飾之ChAdV68序列完全缺失或功能性缺失以下各者：(1) E1A及E1B；或(2) E1A、E1B及E3，關於腺病毒基因組或關於以SEQ ID NO: 1所示之序列，視情況其中該E1基因經由關於以SEQ ID NO: 1所示之序列之至少核苷酸577至3403之E1缺失而功能性缺失，且視情況其中該E3基因經由關於以SEQ ID NO: 1所示之序列之至少核苷酸27,125至31,825之E3缺失而功能性缺失。
  12. 如前述請求項中任一項之載體，其中該卡匣存在且插入該載體中之E1區、E3區及/或允許併入該卡匣之任何缺失AdV區中。
  13. 如請求項2至4或7除外之前述請求項中任一項之載體，其中該載體係自第一代、第二代或輔助依賴性腺病毒載體中之一者產生。
  14. 如請求項2至13中任一項之載體，其中該經修飾之ChAdV68序列包含以SEQ ID NO:1所示之序列的核苷酸2至34,916，其中該部分缺失之E4基因為該等核苷酸2至34,916之3'。
  15. 如請求項14之載體，其中該等核苷酸2至34,916缺少以SEQ ID NO:1所示之序列的核苷酸577至3403，對應於E1缺失。
  16. 如請求項14之載體，其中該等核苷酸2至34,916缺少關於以SEQ ID NO: 1所示之序列的核苷酸456-3014。
  17. 如請求項14至16中任一項之載體，其中該等核苷酸2至34,916缺少關於以SEQ ID NO: 1所示之序列的核苷酸27,125-31,825，對應於E3缺失。
  18. 如請求項14至16中任一項之載體，其中該等核苷酸2至34,916缺少關於以SEQ ID NO:1所示之序列的核苷酸27,816-31,333。
  19. 如請求項14至16中任一項之載體，其中該等核苷酸2至34,916缺少以SEQ ID NO:1所示之序列的核苷酸577至3403，對應於E1缺失，且缺少以SEQ ID NO:1所示之序列的核苷酸27,125至31,825，對應於E3缺失。
  20. 如請求項14至19中任一項之載體，其中該等核苷酸2至34,916進一步缺少關於以SEQ ID NO: 1所示之序列的核苷酸3957-10346、核苷酸21787-23370、核苷酸33486-36193或其組合。
  21. 如前述請求項中任一項之載體，其中該至少一個有效負載核酸序列中之至少一者編碼抗原，其中該抗原包含： - MHC I類抗原決定基， - MHC II類抗原決定基， -能夠刺激B細胞反應之抗原決定基，或 -其組合。
  22. 如前述請求項中任一項之載體，其中該至少一個有效負載核酸序列中之至少一者編碼能夠進行抗原加工為抗原決定基之多肽序列，視情況其中該抗原決定基已知或疑似由MHC I類呈現於細胞表面上，視情況其中該細胞表面為腫瘤細胞表面或受感染細胞表面。
  23. 如前述請求項中任一項之載體，其中該至少一個有效負載核酸序列中之至少一者編碼由MHC I類及/或MHC II類呈現於細胞表面上之多肽序列或其部分，視情況其中該細胞表面為腫瘤細胞表面或受感染細胞表面。
  24. 如請求項22或23之載體，其中該腫瘤細胞選自由以下組成之群：肺癌、黑素瘤、乳癌、卵巢癌、前列腺癌、腎癌、胃癌、結腸癌、睪丸癌、頭頸癌、胰臟癌、腦癌、B細胞淋巴瘤、急性骨髓性白血病、慢性骨髓性白血病、慢性淋巴球性白血病、T細胞淋巴球性白血病、非小細胞肺癌及小細胞肺癌，或 其中該受感染細胞選自由以下組成之群：病原體感染細胞、病毒感染細胞、細菌感染細胞、真菌感染細胞及寄生蟲感染細胞，視情況其中該病毒感染細胞選自由以下組成之群：HIV感染細胞、嚴重急性呼吸症候群相關冠狀病毒(SARS)感染細胞、嚴重急性呼吸症候群冠狀病毒2 (SARS-CoV-2)感染細胞、埃博拉病毒感染細胞、B型肝炎病毒(HBV)感染細胞、流感感染細胞及C型肝炎病毒(HCV)感染細胞。
  25. 如前述請求項中任一項之載體，其中該至少一個有效負載核酸序列中之至少一者編碼包含能夠刺激B細胞反應之抗原決定基的多肽序列或其部分，視情況其中該多肽序列或其部分包含經預測或已知能夠由抗體結合之全長蛋白質、蛋白質結構域、蛋白質次單元或抗原片段。
  26. 如前述請求項中任一項之載體，其中該至少一個有效負載核酸序列中之至少一者編碼選自由以下組成之群的感染性疾病生物體肽：病原體衍生肽、病毒衍生肽、細菌衍生肽、真菌衍生肽及寄生蟲衍生肽。
  27. 如前述請求項中任一項之載體，其中該至少一個有效負載核酸序列中之至少一者編碼具有至少一個改變之抗原決定基，該改變使得所編碼之抗原決定基序列不同於由野生型核酸序列編碼之相應肽序列。
  28. 如前述請求項中任一項之載體，其中該至少一個有效負載核酸序列中之至少一者編碼具有至少一個改變之MHC I類抗原決定基或MHC II類抗原決定基，該改變使得所編碼之肽序列不同於由野生型核酸序列編碼之相應肽序列，視情況其中所編碼之多肽序列或其部分相對於經轉譯之相應野生型核酸序列具有增加之結合親和力、增加之結合穩定性及/或增加之在其相應MHC對偶基因上呈現之可能性。
  29. 11至12或14至28之載體，其中該至少一個改變包括點突變、讀框移位突變、非讀框移位突變、缺失突變、插入突變、剪接變異體、基因組重排或蛋白酶體產生之剪接抗原。
  30. 如前述請求項中任一項之載體，其中該至少一個有效負載核酸序列中之至少一者編碼全長蛋白質、蛋白質結構域或蛋白質次單元。
  31. 如前述請求項中任一項之載體，其中該至少一個有效負載核酸序列中之至少一者編碼抗體、細胞介素、嵌合抗原受體(CAR)、T細胞受體及基因組編輯系統核酸酶。
  32. 如前述請求項中任一項之載體，其中該至少一個有效負載核酸序列中之至少一者包括非編碼核酸序列。
  33. 如請求項32之載體，其中該非編碼核酸序列包含RNA干擾(RNAi)聚核苷酸或基因組編輯系統聚核苷酸。
  34. 如請求項4或7除外之前述請求項中任一項之載體，其中該至少一個有效負載核酸序列中之每一者彼此直接連接。
  35. 如請求項4或7除外之前述請求項中任一項之載體，其中該至少一個有效負載核酸序列中之至少一者利用編碼連接子之核酸序列連接至不同的有效負載核酸序列。
  36. 如請求項35之載體，其中該連接子將編碼MHC I類抗原決定基之兩個有效負載核酸序列連接或將編碼MHC I類抗原決定基之第一有效負載核酸序列連接至編碼MHC II類抗原決定基或編碼能夠刺激B細胞反應之抗原決定基序列之第二有效負載核酸序列。
  37. 如請求項36之載體，其中該連接子選自由以下組成之群：(1)連續甘胺酸殘基，長度為至少2、3、4、5、6、7、8、9或10個殘基；(2)連續丙胺酸殘基，長度為至少2、3、4、5、6、7、8、9或10個殘基；(3)兩個精胺酸殘基(RR)；(4)丙胺酸、丙胺酸、酪胺酸(AAY)；(5)由哺乳動物蛋白酶體有效加工之長度為至少2、3、4、5、6、7、8、9或10個胺基酸殘基的共同序列；及(6)側接源自同源蛋白之抗原且長度為至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20個或2-20個胺基酸殘基的一或多個天然序列。
  38. 如請求項35之載體，其中該連接子將兩個編碼MHC II類抗原決定基之有效負載核酸序列連接或將編碼MHC II類抗原決定基之第一有效負載核酸序列連接至編碼MHC I類抗原決定基或編碼能夠刺激B細胞反應之抗原決定基序列之第二有效負載核酸序列。
  39. 如請求項38之載體，其中該連接子包含序列GPGPG。
  40. 如請求項4或7除外之前述請求項中任一項之載體，其中該至少一個有效負載核酸序列中之至少一者可操作地或直接地連接至增強該至少一個有效負載核酸序列之表現、穩定性、細胞運輸、加工及呈現及/或免疫原性，及視情況由該至少一個有效負載核酸序列編碼之多肽之表現、穩定性、細胞運輸、加工及呈現及/或免疫原性的分離或連續序列。
  41. 如請求項40之載體，其中該分離或連續之序列包含以下中之至少一者：泛素序列；經修飾以增加蛋白酶體靶向之泛素序列，視情況其中該泛素序列在位置76處含有Gly至Ala之取代；免疫球蛋白信號序列，視情況其中該免疫球蛋白信號序列包含IgK；主要組織相容性I類序列；溶酶體相關膜蛋白(LAMP)-1；人類樹突狀細胞溶酶體相關膜蛋白；及主要組織相容性II類序列；視情況其中該經修飾以增加蛋白酶體靶向之泛素序列為A76。
  42. 如前述請求項中任一項之載體，其中該至少一個有效負載核酸序列中之每一者之表現由該至少一個啟動子驅動。
  43. 如請求項7除外之前述請求項中任一項之載體，其中該至少一個有效負載核酸序列包括至少2、3、4、5、6、7、8、9或10個有效負載核酸序列。
  44. 如請求項7除外之前述請求項中任一項之載體，其中該至少一個有效負載核酸序列包括至少11、12、13、14、15、16、17、18、19、20個或至多400個有效負載核酸序列。
  45. 如請求項7除外之前述請求項中任一項之載體，其中該至少一個有效負載核酸序列包括至少2-400個有效負載核酸序列，且其中該至少一個有效負載核酸序列中之至少一者編碼MHC I類抗原決定基、MHC II類抗原決定基、能夠刺激B細胞反應之抗原決定基或其組合。
  46. 如請求項4或7除外之前述請求項中任一項之載體，其中該至少一個有效負載核酸序列包括至少2-400個有效負載核酸序列，且其中，當投與至該個體且經轉譯時，該至少一個有效負載核酸序列中之至少一者編碼呈現於抗原呈現細胞上之抗原，產生靶向該抗原之免疫反應。
  47. 如前述請求項中任一項之載體，其中該至少一個有效負載核酸序列包含至少2-400個MHC I類及/或II類抗原編碼核酸序列，其中當投與至該個體且經轉譯時，該等MHC I類或II類抗原中之至少一者呈現於抗原呈現細胞上，產生靶向細胞表面上之該等抗原之至少一者的免疫反應，且視情況其中該至少2-400個MHC I類或II類抗原編碼核酸序列中之每一者之表現由該至少一個啟動子驅動。
  48. 如前述請求項中任一項之載體，其中各MHC I類抗原決定基之長度獨立地介於8至35個胺基酸之間，視情況長度為7-15、9-17、9-25、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34或35個胺基酸。
  49. 如請求項7除外之前述請求項中任一項之載體，其中存在該至少一個通用的編碼MHC II類抗原之核酸序列。
  50. 如請求項7除外之前述請求項中任一項之載體，其中存在該至少一個通用的編碼MHC II類抗原之核酸序列，且包含至少一個包含至少一個改變之通用的編碼MHC II類抗原之核酸序列，該改變使得所編碼之肽序列不同於由野生型核酸序列編碼之相應肽序列。
  51. 如請求項7除外之前述請求項中任一項之載體，其中該至少一個通用的編碼MHC II類抗原之核酸序列之長度為12-20、12、13、14、15、16、17、18、19、20或20-40個胺基酸。
  52. 如請求項7除外之前述請求項中任一項之載體，其中存在該至少一個通用的編碼MHC II類抗原之核酸序列，且其中該至少一個通用序列包括破傷風類毒素及PADRE中之至少一者。
  53. 如前述請求項中任一項之載體，其中該至少一個啟動子序列為可調控啟動子，視情況其中該可調控啟動子為四環素(TET)阻遏蛋白(TETr)控制之啟動子，視情況其中該可調控啟動子包括在該啟動子之RNA聚合酶結合序列之5'或3'的多個TET操縱子(TETo)序列。
  54. 如前述請求項中任一項之載體，其中該至少一個啟動子序列為組成型的。
  55. 如請求項4或7除外之前述請求項中任一項之載體，其中該至少一個啟動子序列為CMV、SV40、EF-1、RSV、PGK、HSA、MCK或EBV啟動子序列。
  56. 如前述請求項中任一項之載體，其中該卡匣進一步包含至少一個可操作地連接於該至少一個有效負載核酸序列中之至少一者的聚腺苷酸化(polyA)序列，視情況其中該polyA序列位於該至少一個有效負載核酸序列之3'。
  57. 如請求項56之載體，其中該polyA序列包含SV40或牛生長激素(BGH) polyA序列。
  58. 如前述請求項中任一項之載體，其中該卡匣進一步包含以下中之至少一者：內含子序列，土撥鼠肝炎病毒轉錄後調控元件(WPRE)序列，內部核糖體進入序列(IRES)序列，編碼2A自裂解肽序列之核苷酸序列，編碼弗林蛋白酶裂解位點之核苷酸序列，編碼TEV裂解位點之核苷酸序列，或已知增強可操作地連接於該至少一個有效負載核酸序列中之至少一者之mRNA之核輸出、穩定性或轉譯效率的5'或3'非編碼區中之序列。
  59. 如前述請求項中任一項之載體，其中該卡匣包含報導基因，該報導基因包括但不限於綠色螢光蛋白(GFP)、GFP變異體、分泌之鹼性磷酸酶、螢光素酶或螢光素酶變異體。
  60. 如前述請求項中任一項之載體，其中該載體進一步包含一或多個編碼至少一種免疫調節因子之有效負載核酸序列，視情況其中該至少一種免疫調節因子抑制免疫檢查點分子。
  61. 如請求項60之載體，其中該免疫調節因子為抗CTLA4抗體或其抗原結合片段、抗PD-1抗體或其抗原結合片段、抗PD-L1抗體或其抗原結合片段、抗4-1BB抗體或其抗原結合片段、或抗OX-40抗體或其抗原結合片段。
  62. 如請求項61之載體，其中該抗體或其抗原結合片段為Fab片段、Fab'片段、單鏈Fv (scFv)、呈單特異性或連接在一起之多特異性形式的單結構域抗體(sdAb) (例如駱駝科抗體結構域)、或全長單鏈抗體(例如具有藉由可撓性連接子連接之重鏈及輕鏈的全長IgG)。
  63. 如請求項61或62之載體，其中該抗體之重鏈及輕鏈序列係由諸如2A之自裂解序列或IRES序列分隔開的連續序列，視情況其中該自裂解序列在該自裂解序列之5'具有弗林蛋白酶裂解位點序列；或該抗體之該等重鏈及輕鏈序列由可撓性連接子，諸如連續甘胺酸殘基連接。
  64. 如請求項60之載體，其中該免疫調節因子為細胞介素。
  65. 如請求項64之載體，其中該細胞介素為IL-2、IL-7、IL-12、IL-15或IL-21或其各自變異體中之至少一者。
  66. 如前述請求項中任一項之載體，其中該至少一個有效負載核酸序列中之至少一者藉由執行以下步驟選擇： (a) 自腫瘤細胞、受感染細胞或感染性疾病生物體獲得外顯子組、轉錄組或全基因組核苷酸定序資料中之至少一者，其中該核苷酸定序資料用於獲得代表抗原集合中之每一者之肽序列的資料； (b) 將各抗原之肽序列輸入至呈現模型中，以產生該等抗原中之每一者由該等MHC對偶基因中之一或多者呈現在細胞表面、視情況腫瘤細胞表面或受感染細胞表面上的數值可能性集合，該數值可能性集合已至少基於所接受之質譜資料進行鑑別；及 (c) 基於該數值可能性集合選擇該抗原集合之子集以產生一組選擇抗原，該組抗原用於產生該至少一個有效負載核酸序列。
  67. 如前述請求項中任一項之載體，其中該至少一個有效負載核酸序列中之每一者藉由執行以下步驟選擇： (a) 自腫瘤細胞、受感染細胞或感染性疾病生物體獲得外顯子組、轉錄組或全基因組核苷酸定序資料中之至少一者，其中該核苷酸定序資料用於獲得代表抗原集合中之每一者之肽序列的資料； (b) 將各抗原之肽序列輸入至呈現模型中，以產生該等抗原中之每一者由該等MHC對偶基因中之一或多者呈現在細胞表面、視情況腫瘤細胞表面或受感染細胞表面上的數值可能性集合，該數值可能性集合已至少基於所接受之質譜資料進行鑑別；及 (c) 基於該數值可能性集合選擇該抗原集合之子集以產生一組選擇抗原，該組抗原用於產生該至少一個有效負載核酸序列中之每一者。
  68. 如請求項66或67之載體，其中該組選擇抗原之數目為2-20個。
  69. 如請求項66或67之載體，其中該呈現模型表示以下兩者之間的依賴性： (a) 該等MHC對偶基因中之一對特定對偶基因及在肽序列之特定位置處之特定胺基酸的存在；及 (b) 由在該特定位置處包含該特定胺基酸之此類肽序列之該對MHC對偶基因中之特定一者呈現在細胞表面、視情況腫瘤細胞表面或受感染細胞表面上的可能性。
  70. 如請求項66或67之載體，其中選擇該選擇抗原之集合包括基於該呈現模型選擇相對於未選擇之抗原，呈現在該細胞表面上之可能性增加的抗原。
  71. 如請求項66或67之載體，其中選擇該選擇抗原之集合包括基於該呈現模型選擇相對於未選擇之抗原，能夠誘發該個體中之細胞特異性免疫反應之可能性增加的抗原。
  72. 如請求項66或67之載體，其中選擇該選擇抗原之集合包括基於該呈現模型選擇相對於未選擇之抗原，能夠由專職抗原呈現細胞(APC)呈現於初始T細胞之可能性增加的抗原，視情況其中該APC為樹突狀細胞(DC)。
  73. 如請求項66或67之載體，其中選擇該選擇抗原之集合包括基於該呈現模型，選擇相對於未選擇之抗原經由中心或外周耐受性受抑制之可能性降低的抗原。
  74. 如請求項66或67之載體，其中選擇該選擇抗原之集合包括基於該呈現模型選擇相對於未選擇之抗原，能夠誘發對該個體中之正常組織之自身免疫反應的可能性降低之抗原。
  75. 如請求項66或67之載體，其中外顯子組或轉錄組核苷酸定序資料係藉由對腫瘤細胞或組織、受感染細胞或感染性疾病生物體進行定序而獲得。
  76. 如請求項66或67之載體，其中該定序為下一代定序(NGS)或任何大規模平行定序方法。
  77. 如前述請求項中任一項之載體，其中該卡匣包含由該卡匣中之鄰近序列形成的連接抗原決定基序列。
  78. 如請求項77之載體，其中至少一個或每個連接抗原決定基序列對MHC之親和力大於500 nM。
  79. 如請求項77或78之載體，其中每個連接抗原決定基序列為非自身的。
  80. 如前述請求項中任一項之載體，其中該卡匣不編碼非治療性MHC I類或II類抗原決定基，其中預測該非治療性抗原決定基呈現於個體之MHC對偶基因上。
  81. 如請求項80之載體，其中該經預測之非治療性MHC I類或II類抗原決定基序列為由該卡匣中之鄰近序列形成的連接抗原決定基序列。
  82. 如請求項77至81中任一項之載體，其中該預測係基於藉由將該等非治療性抗原決定基之序列輸入至呈現模型中而產生之呈現可能性。
  83. 如請求項77至82中任一項之載體，其中該卡匣中之該至少一個有效負載核酸序列之順序係藉由一系列步驟確定，該等步驟包括： i. 產生一組候選卡匣序列，其對應於該至少一個有效負載核酸序列之不同順序； ii. 對於各候選卡匣序列，基於該候選卡匣序列中非治療性抗原決定基之呈現來確定呈現評分；及 iii. 選擇與低於預定臨限值之呈現評分相關的候選卡匣序列作為該卡匣序列。
  84. 如前述請求項中任一項之組合物，其中該等MHC I類及/或II類抗原決定基中之每一者經預測或驗證為能夠由存在於至少5%之人類群體中之至少一個HLA對偶基因呈現。
  85. 如前述請求項中任一項之組合物，其中該等MHC I類及/或II類抗原決定基中之每一者經預測或驗證為能夠由至少一個HLA對偶基因呈現，其中各抗原/HLA對在人類群體中具有至少0.01%之抗原/HLA發生率。
  86. 如前述請求項中任一項之組合物，其中該等MHC I類及/或II類抗原決定基中之每一者經預測或驗證為能夠由至少一個HLA對偶基因呈現，其中各抗原/HLA對在人類群體中具有至少0.1%之抗原/HLA發生率。
  87. 如前述請求項中任一項之組合物，其中相對於直接自個體組織或樣品中提取之天然核酸序列，對編碼該多肽之該至少一個有效負載核酸序列進行密碼子優化。
  88. 一種醫藥組合物，其包含如前述請求項中任一項之載體及醫藥學上可接受之載劑。
  89. 如請求項88之醫藥組合物，其中該組合物進一步包含佐劑。
  90. 如請求項88或89之醫藥組合物，其中該組合物進一步包含免疫調節因子。
  91. 如請求項90之醫藥組合物，其中該免疫調節因子為抗CTLA4抗體或其抗原結合片段、抗PD-1抗體或其抗原結合片段、抗PD-L1抗體或其抗原結合片段、抗4-1BB抗體或其抗原結合片段、或抗OX-40抗體或其抗原結合片段。
  92. 一種分離之核苷酸序列，其包含如前述載體請求項中任一項之卡匣及序列SEQ ID NO: 1之基因，視情況其中該基因選自由以下組成之群：以SEQ ID NO: 1所示之序列之黑猩猩腺病毒ITR、E1A、E1B、E2A、E2B、E3、E4、L1、L2、L3、L4及L5基因，且視情況其中該核苷酸序列為cDNA。
  93. 一種分離之細胞，其包含如請求項92之核苷酸序列，視情況其中該細胞為CHO、HEK293或其變異體、911、HeLa、A549、LP-293、PER.C6或AE1-2a細胞。
  94. 一種載體，其包含如請求項92之核苷酸序列。
  95. 一種套組，其包含如前述載體請求項中任一項之載體及使用說明書。
  96. 一種在個體中刺激免疫反應之方法，該方法包括向該個體投與如前述載體請求項中任一項之載體或如請求項88至91中任一項之醫藥組合物。
  97. 如請求項96之方法，其中該載體或組合物係肌肉內(IM)、皮內(ID)或皮下(SC)投與。
  98. 如請求項96或97之方法，其進一步包括向該個體投與免疫調節因子，視情況其中該免疫調節因子係在投與該載體或該醫藥組合物之前、同時或之後投與。
  99. 如請求項98之方法，其中該免疫調節因子為抗CTLA4抗體或其抗原結合片段、抗PD-1抗體或其抗原結合片段、抗PD-L1抗體或其抗原結合片段、抗4-1BB抗體或其抗原結合片段、或抗OX-40抗體或其抗原結合片段。
  100. 如請求項98之方法，其中該免疫調節因子係靜脈內(IV)、肌肉內(IM)、皮內(ID)或皮下(SC)投與。
  101. 如請求項100之方法，其中該皮下投與靠近該載體或該組合物投與部位或非常接近於一或多個載體或組合物引流淋巴結。
  102. 如請求項96至101中任一項之方法，其進一步包括向該個體投與第二疫苗組合物。
  103. 如請求項102之方法，其中該第二疫苗組合物係在投與如請求項88至91中任一項之載體或醫藥組合物之前投與。
  104. 如請求項102之方法，其中該第二疫苗組合物係在投與如請求項88至91中任一項之載體或醫藥組合物之後投與。
  105. 如請求項103或104之方法，其中該第二疫苗組合物與如請求項88至91中任一項之載體或醫藥組合物相同。
  106. 如請求項103或104之方法，其中該第二疫苗組合物與如請求項88至91中任一項之載體或醫藥組合物不同。
  107. 如請求項106之方法，其中該第二疫苗組合物包含編碼至少一個有效負載核酸序列之自擴增RNA (samRNA)載體。
  108. 如請求項107之方法，其中由該samRNA載體編碼之該至少一個有效負載核酸序列與如前述載體請求項中任一項之至少一個有效負載核酸序列中的至少一者相同。
  109. 一種製造如前述載體請求項中任一項之載體的方法，該方法包括： 獲得包含腺病毒載體或黑猩猩腺病毒載體之質體序列； 將該質體序列轉染至一或多個宿主細胞中；及 自該一或多個宿主細胞分離該載體。
  110. 如請求項109之製造方法，其中該分離包括： 溶解該一或多種宿主細胞以獲得包含該載體之細胞溶解物；及 自該細胞溶解物及視情況另外自用於培養該一或多種宿主細胞之培養基純化該載體。
  111. 如請求項109或110之製造方法，其中該質體序列係使用以下中之一者產生；在細菌細胞中的DNA重組或細菌重組或全基因組DNA合成或擴增合成之DNA的全基因組DNA合成。
  112. 如請求項109至111中任一項之製造方法，其中該一或多種宿主細胞為CHO、HEK293或其變異體、911、HeLa、A549、LP-293、PER.C6及AE1-2a細胞中之至少一者。
  113. 如請求項110至112中任一項之製造方法，其中自該細胞溶解物純化該載體涉及層析分離、離心、病毒沈澱及過濾中之一或多者。
  114. 一種在個體中刺激免疫反應之方法，該方法包括向該個體投與腺病毒載體，該腺病毒載體包含： 腺病毒主鏈，其包含腺病毒基因組之一或多個基因或調控序列，且 其中該腺病毒主鏈包含關於該腺病毒基因組之部分缺失之E4基因，其中該部分缺失之E4基因包含缺失或部分缺失之E4orf2區及缺失或部分缺失之E4orf3區，及視情況存在之缺失或部分缺失之E4orf4區，且 其中該腺病毒載體進一步包含卡匣，該卡匣包含： (1) 至少一個有效負載核酸序列，視情況其中該至少一個有效負載核酸序列編碼多肽，視情況其中該多肽包含抗原，視情況其中該抗原包含： - MHC I類抗原決定基， - MHC II類抗原決定基， - 能夠刺激B細胞反應之抗原決定基，或 - 其組合，且 視情況其中該至少一個有效負載核酸序列進一步包含5'連接子序列及/或3'連接子序列，及視情況其中； (2) 可操作地連接於該至少一個有效負載核酸序列之至少一個啟動子序列， (3) 視情況存在之至少一個通用的編碼MHC II類抗原之核酸序列； (4) 視情況存在之至少一個編碼GPGPG之連接子序列(SEQ ID NO:56)；及 (5) 視情況存在之至少一個聚腺苷酸化序列。
  115. 一種用於治療患有疾病之個體之方法，視情況其中該疾病為癌症或感染，該方法包括向該個體投與腺病毒載體，該腺病毒載體包含： 腺病毒主鏈，其包含腺病毒基因組之一或多個基因或調控序列，且 其中該腺病毒主鏈包含關於該腺病毒基因組之部分缺失之E4基因，其中該部分缺失之E4基因包含缺失或部分缺失之E4orf2區及缺失或部分缺失之E4orf3區，及視情況存在之缺失或部分缺失之E4orf4區，且 其中該腺病毒載體進一步包含卡匣，該卡匣包含： (1) 至少一個有效負載核酸序列，視情況其中該至少一個有效負載核酸序列編碼多肽，視情況其中該多肽包含抗原，視情況其中該抗原包含： - MHC I類抗原決定基， - MHC II類抗原決定基， - 能夠刺激B細胞反應之抗原決定基，或 - 其組合，且 視情況其中該至少一個有效負載核酸序列進一步包含5'連接子序列及/或3'連接子序列，且視情況其中； (2) 可操作地連接於該至少一個有效負載核酸序列之至少一個啟動子序列， (3) 視情況存在之至少一個通用的編碼MHC II類抗原之核酸序列； (4) 視情況存在之至少一個編碼GPGPG之連接子序列(SEQ ID NO:56)；及 (5) 視情況存在之至少一個聚腺苷酸化序列。
  116. 一種在個體中刺激免疫反應之方法，該方法包括向該個體投與包含經修飾之ChAdV68序列之腺病毒載體，其中該經修飾之ChAdV68序列包含： (a) 以SEQ ID NO:1所示之E4基因序列之部分缺失之E4基因，且其至少缺少以SEQ ID NO:1所示之序列之核苷酸34,916至35,642；及 (b) 以SEQ ID NO: 1所示之該ChAdV68序列之一或多個基因或調控序列，視情況其中該一或多個基因或調控序列包含以SEQ ID NO: 1所示之序列之黑猩猩腺病毒反向末端重複序列(ITR)、E1A、E1B、E2A、E2B、E3、E4、L1、L2、L3、L4及L5基因中的至少一者；且 其中該黑猩猩腺病毒載體進一步包含卡匣，其中該卡匣包含至少一個有效負載核酸序列，且其中該卡匣包含可操作地連接於該至少一個有效負載核酸序列之至少一個啟動子序列。
  117. 一種用於治療患有疾病之個體之方法，視情況其中該疾病為癌症或感染，該方法包括向該個體投與包含經修飾之ChAdV68序列之腺病毒載體，其中該經修飾之ChAdV68序列包含： (a) 以SEQ ID NO:1所示之E4基因序列之部分缺失之E4基因，且其至少缺少以SEQ ID NO:1所示之序列之核苷酸34,916至35,642；及 (b) 以SEQ ID NO: 1所示之該ChAdV68序列之一或多個基因或調控序列，視情況其中該一或多個基因或調控序列包含以SEQ ID NO: 1所示之序列之黑猩猩腺病毒反向末端重複序列(ITR)、E1A、E1B、E2A、E2B、E3、E4、L1、L2、L3、L4及L5基因中的至少一者；且 其中該黑猩猩腺病毒載體進一步包含卡匣，其中該卡匣包含至少一個有效負載核酸序列，且其中該卡匣包含可操作地連接於該至少一個有效負載核酸序列之至少一個啟動子序列。
  118. 一種產生病毒之方法，其中該病毒係使用如前述載體請求項中任一項產生。
  119. 如請求項118之方法，其中相對於使用不具有該部分缺失之E4基因之載體產生之病毒的產生，使用包含該部分缺失之E4基因之該載體該病毒之產生增加。
  120. 如請求項118或119之方法，其中相對於使用不具有該部分缺失之E4基因之載體產生之病毒的感染單位力價，使用包含該部分缺失之E4基因之該載體該病毒的感染單位力價增加。
  121. 如請求項120之方法，其中該產生增加係相對於使用不具有該部分缺失之E4基因之載體的產生增加至少1.5倍、至少2倍、至少2.5倍、至少4倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍、至少8倍或至少9倍。
  122. 如請求項121之方法，其中該產生增加係相對於使用不具有該部分缺失之E4基因之載體的產生增加至少10倍、至少18倍、至少20倍、至少25倍或至少27倍。
  123. 一種產生病毒之方法，其中該方法包括以下步驟： a. 提供包含卡匣之病毒載體，該卡匣包含： (i) 至少一個有效負載核酸序列，視情況其中該至少一個有效負載核酸序列編碼多肽，視情況其中該多肽包含抗原，視情況其中該抗原包含： - MHC I類抗原決定基， - MHC II類抗原決定基， - 能夠刺激B細胞反應之抗原決定基，或 - 其組合，且 視情況其中該至少一個有效負載核酸序列進一步包含5'連接子序列及/或3'連接子序列，且視情況其中； (ii) 可操作地連接於該至少一個有效負載核酸序列之至少一個啟動子序列，其中該至少一個啟動子為四環素(TET)阻遏蛋白(TETr)控制之啟動子， (iii) 視情況存在之至少一個編碼MHC II類抗原之核酸序列； (iv) 視情況存在之至少一個編碼GPGPG之連接子序列(SEQ ID NO:56)；及 (v) 視情況存在之至少一個聚腺苷酸化序列； b. 提供經工程改造以表現該TETr蛋白之細胞；及 c. 在足以產生該病毒之條件下使該病毒載體與該細胞接觸。
  124. 如請求項123之方法，其中該病毒載體包括黑猩猩腺病毒載體，視情況其中該黑猩猩腺病毒載體為ChAdV68載體。
  125. 如請求項123或124之方法，其中相對於使用不具有該TETr控制之啟動子之載體產生之病毒的產生，使用包含該TETr控制之啟動子之載體該病毒之產生增加。
  126. 如請求項125之方法，其中該產生增加係相對於使用不具有該TETr控制之啟動子之載體的產生增加至少1.5倍、至少2倍、至少2.5倍、至少4倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍、至少8倍、至少9倍或至少10倍。
  127. 如請求項125之方法，其中該產生增加係相對於使用不具有該TETr控制之啟動子之載體的產生增加至少15倍、至少20倍、至少25倍、至少30倍、至少35倍、至少40倍、至少50倍、至少60倍、至少70倍、至少80倍、至少90倍或至少100倍。
  128. 如請求項123至127中任一項之方法，其中相對於使用未經工程改造以表現該TETr蛋白之細胞產生之病毒的產生，使用包含該TETr控制之啟動子之載體該病毒之產生增加。
  129. 如請求項128之方法，其中該產生增加係相對於使用未經工程改造以表現該TETr蛋白之細胞的產生增加至少1.5倍、至少2倍、至少2.5倍、至少4倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍、至少8倍、至少9倍或至少10倍。
  130. 一種病毒載體，其包含卡匣，該卡匣包含： (i) 至少一個有效負載核酸序列，視情況其中該至少一個有效負載核酸序列編碼多肽，視情況其中該多肽包含抗原，視情況其中該抗原包含： - MHC I類抗原決定基， - MHC II類抗原決定基， - 能夠刺激B細胞反應之抗原決定基，或 - 其組合，且 視情況其中該至少一個有效負載核酸序列進一步包含5'連接子序列及/或3'連接子序列，且視情況其中； (ii) 可操作地連接於該至少一個有效負載核酸序列之至少一個啟動子序列，其中該至少一個啟動子為四環素(TET)阻遏蛋白(TETr)控制之啟動子， (iii) 視情況存在之至少一個編碼MHC II類抗原之核酸序列； (iv) 視情況存在之至少一個編碼GPGPG之連接子序列(SEQ ID NO:56)；及 (v) 視情況存在之至少一個聚腺苷酸化序列。
  131. 如請求項123至130中任一項之方法或載體，其中該TETr控制之啟動子包含一或多個TET操縱子(TETo)核酸序列，視情況其中該一或多個TETo核酸序列包含以SEQ ID NO:60所示之核苷酸序列。
  132. 如請求項131之載體，其中該一或多個TETo核酸序列包括2、3、4、5、6、7、8、9或10個或更多個TETo核酸序列，視情況其中TETo核酸序列各自包含以SEQ ID NO:60所示之核苷酸序列。
  133. 如請求項132之載體，其中該2個或更多個TETo核酸序列連接在一起。
  134. 如請求項133之載體，其中該2個或更多個TETo核酸序列直接連接在一起。
  135. 如請求項133之載體，其中該2個或更多個TETo核酸序列係利用連接子序列連接在一起，其中該連接子包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個或更多個核苷酸，且視情況其中該連接子序列包含以SEQ ID NO:61所示之連接子核苷酸序列。
  136. 如請求項131至135中任一項之載體，其中該一或多個TETo核酸序列為該啟動子序列之RNA聚合酶結合序列之5′。
  137. 如請求項131至135中任一項之載體，其中該一或多個TETo核酸序列為該啟動子序列之RNA聚合酶結合序列之3′。
  138. 如請求項130至137中任一項之載體，其中該至少一個啟動子序列包括CMV、SV40、EF-1、RSV、PGK、HSA、MCK或EBV啟動子序列。
  139. 如請求項130至137中任一項之載體，其中該至少一個啟動子序列為CMV衍生之啟動子序列，視情況其中該CMV啟動子序列包含以SEQ ID NO:64所示之CMV啟動子核苷酸序列。
  140. 如請求項139之載體，其中該CMV衍生之啟動子序列為最小CMV啟動子序列，視情況其中該最小CMV啟動子序列包含以SEQ ID NO:61所示之最小CMV啟動子核苷酸序列。
  141. 如請求項130至140中任一項之載體，其中可操作地連接於該至少一個有效負載核酸序列之該TETr控制之啟動子包含以下式描述之有序序列，自5'至3'包含：(T-LY )X -P-N 其中， N包含該至少一個有效負載核酸序列之一，視情況其中各N編碼MHC I類抗原決定基、MHC II類抗原決定基、能夠刺激B細胞反應之抗原決定基或其組合，視情況存在至少一個改變，該改變使得所編碼之抗原決定基序列不同於由野生型核酸序列編碼之相應肽序列 P，可操作地連接於該至少一個有效負載核酸序列中之至少一者之該啟動子序列之RNA聚合酶結合序列， T包含TETo核酸序列，其包含以SEQ ID NO:60所示之核苷酸序列， L包含連接子序列，其中對於各X，Y = 0或1，且 其中X = 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20。
  142. 如請求項130至140中任一項之載體，其中可操作地連接於該至少一個有效負載核酸序列之該TETr控制之啟動子包含以下式描述之有序序列，自5'至3'包含：P-(T-LY )X -N 其中， N包含該至少一個有效負載核酸序列之一，視情況其中各N編碼MHC I類抗原決定基、MHC II類抗原決定基、能夠刺激B細胞反應之抗原決定基或其組合，視情況存在至少一個改變，該改變使得所編碼之抗原決定基序列不同於由野生型核酸序列編碼之相應肽序列 P，可操作地連接於該至少一個有效負載核酸序列中之至少一者之該啟動子序列之RNA聚合酶結合序列， T包含TETo核酸序列，其包含以SEQ ID NO:60所示之核苷酸序列， L包含連接子序列，其中對於各X，Y = 0或1，且 其中X = 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20。
  143. 如請求項130之載體，其中該TETr控制之啟動子包含： (1) 最小CMV啟動子序列； (2) 7個TETo核酸序列，其中TETo核酸序列各自包含以SEQ ID NO:60所示之核苷酸序列，且 其中該等TETo核酸序列各自利用連接子序列連接在一起，該7個TETo核酸序列為該最小CMV啟動子序列之5'，且視情況其中該TETr控制之啟動子包含以SEQ ID NO:61所示之核苷酸序列。
  144. 如請求項130之載體，其中該TETr控制之啟動子包含： (1) CMV啟動子序列； (2) 2個TETo核酸序列，其中該等TETo核酸序列各自包含以SEQ ID NO:60所示之核苷酸序列，且 其中該等TETo核酸序列各自直接連接在一起，該2個TETo核酸序列為該CMV啟動子序列之3'，且視情況其中該TETr控制之啟動子包含以SEQ ID NO:64所示之核苷酸序列。
  145. 如請求項130至144中任一項之載體，其中該病毒載體包含載體主鏈，其中該載體主鏈包含黑猩猩腺病毒載體，視情況其中該黑猩猩腺病毒載體為ChAdV68載體。
TW109118370A 2019-05-30 2020-06-01 經修飾之腺病毒 TW202110870A (zh)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201962854865P 2019-05-30 2019-05-30
US62/854,865 2019-05-30

Publications (1)

Publication Number Publication Date
TW202110870A true TW202110870A (zh) 2021-03-16

Family

ID=73553330

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
TW109118370A TW202110870A (zh) 2019-05-30 2020-06-01 經修飾之腺病毒

Country Status (13)

Country Link
US (2) US11591619B2 (zh)
EP (1) EP3976075A4 (zh)
JP (1) JP7457733B2 (zh)
KR (1) KR20220016137A (zh)
CN (1) CN114072516A (zh)
AU (1) AU2020282369A1 (zh)
BR (2) BR122024002387A2 (zh)
CA (1) CA3140019A1 (zh)
IL (1) IL288283A (zh)
MX (1) MX2021014525A (zh)
SG (1) SG11202113187WA (zh)
TW (1) TW202110870A (zh)
WO (1) WO2020243719A1 (zh)

Families Citing this family (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2018208856A1 (en) 2017-05-08 2018-11-15 Gritstone Oncology, Inc. Alphavirus neoantigen vectors
TW202043256A (zh) 2019-01-10 2020-12-01 美商健生生物科技公司 前列腺新抗原及其用途
WO2021119545A1 (en) * 2019-12-11 2021-06-17 Gritstone Bio, Inc. Durable vaccination
WO2022032196A2 (en) 2020-08-06 2022-02-10 Gritstone Bio, Inc. Multiepitope vaccine cassettes
RU2743963C1 (ru) * 2021-02-09 2021-03-01 федеральное государственное бюджетное учреждение «Национальный исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф. Гамалеи» Министерства здравоохранения Российской Федерации Средство для индукции специфического иммунитета против вируса тяжелого острого респираторного синдрома SARS-CoV-2 в жидкой форме (варианты)
RU2743962C1 (ru) * 2021-02-10 2021-03-01 федеральное государственное бюджетное учреждение «Национальный исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф. Гамалеи» Министерства здравоохранения Российской Федерации Средство для индукции специфического иммунитета против вируса тяжелого острого респираторного синдрома SARS-CoV-2 в лиофилизированной форме (варианты)
WO2023069551A1 (en) * 2021-10-20 2023-04-27 The Regents Of The University Of California Multi-epitope mrna sars-cov-2 vaccine for boosting immunity through the activation of cd4 and cd8 t cells as well as b lymphocytes
CN114410689B (zh) * 2022-03-29 2022-06-17 北京循生生物医学研究有限公司 一种增强肿瘤浸润淋巴细胞杀伤力的制备方法

Family Cites Families (218)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4235871A (en) 1978-02-24 1980-11-25 Papahadjopoulos Demetrios P Method of encapsulating biologically active materials in lipid vesicles
US4722848A (en) 1982-12-08 1988-02-02 Health Research, Incorporated Method for immunizing animals with synthetically modified vaccinia virus
US4501728A (en) 1983-01-06 1985-02-26 Technology Unlimited, Inc. Masking of liposomes from RES recognition
GB8311018D0 (en) 1983-04-22 1983-05-25 Amersham Int Plc Detecting mutations in dna
US6090406A (en) 1984-04-12 2000-07-18 The Liposome Company, Inc. Potentiation of immune responses with liposomal adjuvants
US5019369A (en) 1984-10-22 1991-05-28 Vestar, Inc. Method of targeting tumors in humans
US4837028A (en) 1986-12-24 1989-06-06 Liposome Technology, Inc. Liposomes with enhanced circulation time
US5223427A (en) 1987-03-31 1993-06-29 The Scripps Research Institute Hybridomas producing monoclonal antibodies reactive with human tissue-factor glycoprotein heavy chain
US5217879A (en) 1989-01-12 1993-06-08 Washington University Infectious Sindbis virus vectors
US5703055A (en) 1989-03-21 1997-12-30 Wisconsin Alumni Research Foundation Generation of antibodies through lipid mediated DNA delivery
FR2650840B1 (fr) 1989-08-11 1991-11-29 Bertin & Cie Procede rapide de detection et/ou d'identification d'une seule base sur une sequence d'acide nucleique, et ses applications
ATE157012T1 (de) 1989-11-03 1997-09-15 Univ Vanderbilt Verfahren zur in vivo-verabreichung von funktionsfähigen fremden genen
US5670488A (en) * 1992-12-03 1997-09-23 Genzyme Corporation Adenovirus vector for gene therapy
US5279833A (en) 1990-04-04 1994-01-18 Yale University Liposomal transfection of nucleic acids into animal cells
US5204253A (en) 1990-05-29 1993-04-20 E. I. Du Pont De Nemours And Company Method and apparatus for introducing biological substances into living cells
US6770283B1 (en) 1990-12-13 2004-08-03 Bioption Ab DNA expression systems based on alphaviruses
US6004744A (en) 1991-03-05 1999-12-21 Molecular Tool, Inc. Method for determining nucleotide identity through extension of immobilized primer
US6037135A (en) 1992-08-07 2000-03-14 Epimmune Inc. Methods for making HLA binding peptides and their uses
CA2134773A1 (en) 1992-06-04 1993-12-09 Robert J. Debs Methods and compositions for in vivo gene therapy
US9340577B2 (en) 1992-08-07 2016-05-17 Epimmune Inc. HLA binding motifs and peptides and their uses
US5662907A (en) 1992-08-07 1997-09-02 Cytel Corporation Induction of anti-tumor cytotoxic T lymphocytes in humans using synthetic peptide epitopes
US20050271676A1 (en) 1993-03-05 2005-12-08 Epimmune Inc. Inducing cellular immune responses to human immunodeficiency virus-1 using peptide and nucleic acid compositions
CN1135181A (zh) 1993-09-14 1996-11-06 Cytel有限公司 使用泛dr结合肽改变免疫应答
US6413935B1 (en) 1993-09-14 2002-07-02 Epimmune Inc. Induction of immune response against desired determinants
EP0711829A3 (en) 1993-09-15 1997-07-09 Viagene Inc Recombinant alphavirus vector
US6015686A (en) 1993-09-15 2000-01-18 Chiron Viagene, Inc. Eukaryotic layered vector initiation systems
WO1995013392A1 (en) 1993-11-09 1995-05-18 Medical College Of Ohio Stable cell lines capable of expressing the adeno-associated virus replication gene
US5505947A (en) 1994-05-27 1996-04-09 The University Of North Carolina At Chapel Hill Attenuating mutations in Venezuelan Equine Encephalitis virus
US5851806A (en) 1994-06-10 1998-12-22 Genvec, Inc. Complementary adenoviral systems and cell lines
FR2726285B1 (fr) 1994-10-28 1996-11-29 Centre Nat Rech Scient Adenovirus depourvus de particules contaminantes viables, preparation et utilisation
PT787200E (pt) 1994-10-28 2005-08-31 Univ Pennsylvania Adenovirus melhorado e metodos para a sua utilizacao
US5552350A (en) 1994-12-12 1996-09-03 Ceramco Inc. Low-fusing temperature porcelain
JPH10510987A (ja) * 1994-12-12 1998-10-27 ジェネティック セラピー，インコーポレイテッド 改良アデノウイルスベクターおよび生産者細胞
US5792462A (en) 1995-05-23 1998-08-11 University Of North Carolina At Chapel Hill Alphavirus RNA replicon systems
US5851796A (en) * 1995-06-07 1998-12-22 Yale University Autoregulatory tetracycline-regulated system for inducible gene expression in eucaryotes
UY24367A1 (es) 1995-11-23 2000-10-31 Boehringer Ingelheim Int Vacunas contra tumores y procedimiento para su produccion
US5849589A (en) 1996-03-11 1998-12-15 Duke University Culturing monocytes with IL-4, TNF-α and GM-CSF TO induce differentiation to dendric cells
US6451592B1 (en) 1996-04-05 2002-09-17 Chiron Corporation Recombinant alphavirus-based vectors with reduced inhibition of cellular macromolecular synthesis
EP0803573A1 (en) 1996-04-25 1997-10-29 Gesellschaft für Biotechnologische Forschung mbH (GBF) Polycistronic expression construct with cytokines for multivalent vaccines
US6514731B1 (en) 1996-05-24 2003-02-04 Chiron Corporation Methods for the preparation of hepatitis C virus multiple copy epitope fusion antigens
EP0910343A1 (en) 1996-07-03 1999-04-28 University Of Pittsburgh Emulsion formulations for hydrophilic active agents
US6083716A (en) 1996-09-06 2000-07-04 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Chimpanzee adenovirus vectors
US5994132A (en) * 1996-10-23 1999-11-30 University Of Michigan Adenovirus vectors
US7732129B1 (en) 1998-12-01 2010-06-08 Crucell Holland B.V. Method for the production and purification of adenoviral vectors
US5849561A (en) 1997-05-22 1998-12-15 Cornell Research Foundation, Inc. Method for the production of non-group C adenoviral vectors
ES2180258T3 (es) 1998-07-07 2003-02-01 Transgene Sa Utilizacion de pautas de lectura abierta adenovirales de e4 para mejorar la expresion de genes.
EP1000628A1 (en) 1998-09-28 2000-05-17 Fondation Mondiale Recherche et Prevention SIDA Use of antigenic complexes of HIV envelope and HLA class I antigens as HIV vaccine
US20030072767A1 (en) 1998-09-30 2003-04-17 Alexander Gaiger Compositions and methods for WT1 specific immunotherapy
US20080050393A1 (en) 1998-12-03 2008-02-28 Tang Y Tom Novel nucleic acids and polypeptides
WO2000034445A2 (en) 1998-12-07 2000-06-15 U.S. Medical Research Institute Of Infectious Diseases Live attenuated venezuelan equine encephalitis vaccine
AU2992600A (en) 1999-02-11 2000-08-29 Genzyme Corporation Antigenic peptide concatomers
US7262049B2 (en) * 1999-03-16 2007-08-28 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Pseudotyped lentiviral vectors and uses thereof
DE60038011T2 (de) 1999-04-08 2009-02-12 Novartis Vaccines and Diagnostics, Inc., Emeryville Verbesserung der immunantwort als anwendung in impfstoff und gentherapie
JP4637368B2 (ja) 1999-04-14 2011-02-23 ノバルティス バクシンズ アンド ダイアグノスティックス，インコーポレーテッド アルファウイルスに基づくベクター系を利用する免疫応答を生成するための組成物および方法
US8647864B2 (en) 1999-04-14 2014-02-11 Novartis Ag Compositions and methods for generating an immune response utilizing alphavirus-based vector systems
US6365394B1 (en) 1999-09-29 2002-04-02 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Cell lines and constructs useful in production of E1-deleted adenoviruses in absence of replication competent adenovirus
EP1244465A4 (en) 1999-12-21 2005-01-12 Epimmune Inc INDUCTION OF CELLULAR IMMUNE RESPONSE TO PROSTATE CANCER BY MEANS OF PEPTIDE AND NUCLEIC ACID COMPOUNDS
US20040248113A1 (en) 1999-12-28 2004-12-09 Alessandro Sette Method and system for optimizing multi-epitope nucleic acid constructs and peptides encoded thereby
US7462354B2 (en) 1999-12-28 2008-12-09 Pharmexa Inc. Method and system for optimizing minigenes and peptides encoded thereby
CA2397998A1 (en) 2000-01-28 2001-08-02 Statens Serum Institut Hiv peptides and nucleic acids encoding them for diagnosis and control of hiv infection
US7619057B2 (en) 2000-01-28 2009-11-17 The United States Of America As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services MHC class II restricted T cell epitopes from the cancer antigen, NY ESO-1
US20010055596A1 (en) 2000-03-24 2001-12-27 Meagher Madeleine Joy Compositions and methods for therapy and diagnosis of colon cancer
US6436703B1 (en) 2000-03-31 2002-08-20 Hyseq, Inc. Nucleic acids and polypeptides
US20040115625A1 (en) 2000-10-02 2004-06-17 Reinhard Ebner Cancer gene determination and therapeutic screening using signature gene sets
US6783939B2 (en) 2000-07-07 2004-08-31 Alphavax, Inc. Alphavirus vectors and virosomes with modified HIV genes for use in vaccines
EP1320620B1 (en) 2000-09-25 2015-01-21 The Regents Of The University Of Michigan Production of viral vectors
US20020137081A1 (en) 2001-01-08 2002-09-26 Olga Bandman Genes differentially expressed in vascular tissue activation
EP1363660A4 (en) 2001-02-01 2006-06-21 Univ Johns Hopkins HIGHER MOLECULAR VACCINE BASED ON AUTOMPLICATIVE RNA, SUICIDE DNA OR UNDNA DNA VECTOR, WHICH LINKS ANTIGEN WITH A POLYPEPTIDE WHICH PROMOTES THE PRESENTATION OF THE ANTIGEN
CN1147587C (zh) * 2001-05-30 2004-04-28 方炳良 一种增强细胞特异性目的基因表达的方法
EP1399183B1 (en) 2001-05-31 2010-06-30 Novartis Vaccines and Diagnostics, Inc. Chimeric alphavirus replicon particles
US20030232324A1 (en) 2001-05-31 2003-12-18 Chiron Corporation Chimeric alphavirus replicon particles
CA2450470C (en) 2001-06-22 2012-08-28 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Method for rapid screening of bacterial transformants and novel simian adenovirus proteins
PT1497438E (pt) 2002-04-25 2010-02-04 Crucell Holland Bv Meios e métodos para a produção de vectores de adenovírus
ATE405663T1 (de) 2002-04-25 2008-09-15 Crucell Holland Bv Stabile adenovirale vektoren und methoden für deren vermehrung
AU2003289716A1 (en) 2002-09-12 2004-04-30 Incyte Corporation Molecules for diagnostics and therapeutics
US20070224201A1 (en) 2002-10-02 2007-09-27 Genentech, Inc. Compositions and methods for the diagnosis and treatment of tumor
EP1571909A4 (en) 2002-10-03 2009-11-11 Idm Pharma Inc OPTIMIZED CONSTRUCTIONS WITH SEVERAL EPITOPES AND USES THEREOF
WO2004055166A2 (en) 2002-12-13 2004-07-01 Alphavax, Inc. Multi-antigenic alphavirus replicon particles and methods
BRPI0317276B8 (pt) 2002-12-13 2021-05-25 Alphavax Inc método para a preparação de partículas de replicon de alfavírus (arps)
GB2398300A (en) 2003-02-17 2004-08-18 Isis Innovation Method and compositions for boosting immune response
US7425328B2 (en) 2003-04-22 2008-09-16 Purdue Pharma L.P. Tissue factor antibodies and uses thereof
WO2005033265A2 (en) 2003-04-25 2005-04-14 Epimmune Inc. Optimized multi-epitope constructs and uses thereof
US7605235B2 (en) 2003-05-30 2009-10-20 Centocor, Inc. Anti-tissue factor antibodies and compositions
SI1629004T1 (sl) 2003-06-05 2008-12-31 Wyeth Corp Imunogeni sestavki, ki vsebujejo vektorski replikon virusa venezuelskega konjskega encefalitisa in antigen za protein paramiksovirusa
US7291498B2 (en) 2003-06-20 2007-11-06 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Methods of generating chimeric adenoviruses and uses for such chimeric adenoviruses
DE10347710B4 (de) 2003-10-14 2006-03-30 Johannes-Gutenberg-Universität Mainz Rekombinante Impfstoffe und deren Verwendung
PL2163260T3 (pl) 2004-01-23 2017-12-29 Msd Italia S.R.L. Szympansie adenowirusowe nośniki szczepionek
US8119336B2 (en) 2004-03-03 2012-02-21 Ibis Biosciences, Inc. Compositions for use in identification of alphaviruses
ATE497785T1 (de) * 2004-04-28 2011-02-15 Univ Pennsylvania Sequenzielle freisetzung immunogener moleküle über adenoviren und adeno-assoziierte viren vermittelte abgaben
CA2563500C (en) * 2004-04-28 2016-06-28 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Immunization regimen with e4-deleted adenovirus prime and e1-deleted adenovirus boost
WO2006078294A2 (en) 2004-05-21 2006-07-27 Novartis Vaccines And Diagnostics Inc. Alphavirus vectors for respiratory pathogen vaccines
EP1751290B1 (en) 2004-05-25 2014-10-15 Novartis Vaccines and Diagnostics, Inc. Alphavirus replicon packaging constructs
US20060051405A1 (en) 2004-07-19 2006-03-09 Protiva Biotherapeutics, Inc. Compositions for the delivery of therapeutic agents and uses thereof
JP2008515795A (ja) 2004-10-04 2008-05-15 バイオバクシム リミテッド Ｈｉｖ感染患者を治療するための、サブタイプを一致させた不活化全粒子ウイルスワクチン
US20060198854A1 (en) 2004-12-28 2006-09-07 Peter Pushko Vector platforms derived from the alphavirus vaccines
US7220549B2 (en) 2004-12-30 2007-05-22 Helicos Biosciences Corporation Stabilizing a nucleic acid for nucleic acid sequencing
FR2882557A1 (fr) 2005-02-25 2006-09-01 Centre Nat Rech Scient Epitopes de vih et composition pharmaceutique les contenant
US7283337B2 (en) 2005-03-04 2007-10-16 Headway Technologies, Inc. Abutted exchange bias design for sensor stabilization
EP2002003B1 (en) 2005-05-27 2015-12-30 Ospedale San Raffaele S.r.l. Gene vector comprising mi-rna
ES2735531T3 (es) 2005-08-23 2019-12-19 Univ Pennsylvania ARN que contiene nucleósidos modificados y métodos de uso del mismo
WO2007047749A1 (en) 2005-10-18 2007-04-26 Novartis Vaccines And Diagnostics Inc. Mucosal and systemic immunizations with alphavirus replicon particles
US8252574B2 (en) 2006-02-27 2012-08-28 The Board Of Regents Of The University Of Texas System Pseudoinfectious flavivirus and uses thereof
US20090022760A1 (en) 2006-09-12 2009-01-22 Alphavax Alphavirus Replicon Particles Matched to Protein Antigens as Immunological Adjuvants
US9085638B2 (en) 2007-03-07 2015-07-21 The Johns Hopkins University DNA vaccine enhancement with MHC class II activators
GB0706914D0 (en) 2007-04-10 2007-05-16 Isis Innovation Novel adenovirus vectors
CA2687141C (en) 2007-05-22 2014-04-01 Amgen Inc. Compositions and methods for producing bioactive fusion proteins
ES2440974T3 (es) 2007-05-31 2014-01-31 Genimmune N.V. Constructos poliepitópicos del VPH y uso de los mismos
AU2008266807B2 (en) 2007-06-21 2012-08-16 Alphavax, Inc. Promoterless cassettes for expression of alphavirus structural proteins
US20100015179A1 (en) 2007-08-16 2010-01-21 Frolov Ilya V Attenuation of encephalitogenic alphavirus and uses thereof
EP2201023A2 (en) 2007-09-14 2010-06-30 GENimmune N.V. Affinity tag
US20100285050A1 (en) 2007-10-05 2010-11-11 Isis Innovation Limited Compositions and Methods
GB0719526D0 (en) 2007-10-05 2007-11-14 Isis Innovation Compositions and methods
JP5627464B2 (ja) 2007-11-26 2014-11-19 ノバルティス アーゲー アルファウイルス粒子を生成する方法
US20110091496A1 (en) 2008-01-19 2011-04-21 Graham Barney S Methods and compositions for the delivery of vaccines to disrupted epithelium
US20090253184A1 (en) 2008-01-23 2009-10-08 Introgen Therapeutics, Inc. Compositions and methods related to an adenoviral trans-complementing cell line
NZ587502A (en) 2008-01-24 2012-12-21 Univ Texas Attenuated recombinant alphaviruses incapable of replicating in mosquitoes and uses thereof
US20110142880A1 (en) 2008-03-28 2011-06-16 Franck Yann Lemiale Lentivirus-based immunogenic vectors
AU2009254168A1 (en) 2008-06-03 2009-12-10 Okairos Ag A vaccine for the prevention and therapy of HCV infections
WO2010005704A2 (en) 2008-06-13 2010-01-14 New York University Novel helper plasmid, defective sindbis viral vectors and methods of use thereof
ES2902787T3 (es) 2008-07-17 2022-03-29 Medigen Inc Vacunas de ADNi y procedimientos para utilizar las mismas
US10369204B2 (en) 2008-10-02 2019-08-06 Dako Denmark A/S Molecular vaccines for infectious disease
WO2010044515A1 (ko) 2008-10-17 2010-04-22 Lee Jeong-Min 병뚜껑
SG171828A1 (en) 2008-11-26 2011-07-28 Us Gov Health & Human Serv Virus like particle compositions and methods of use
ES2525707T3 (es) 2008-12-01 2014-12-29 Alphavax, Inc. Uso de microRNAs para el control de ácidos nucleicos colaboradores de virus
DE102008061522A1 (de) 2008-12-10 2010-06-17 Biontech Ag Verwendung von Flt3-Ligand zur Verstärkung von Immunreaktionen bei RNA-Immunisierung
NZ594355A (en) * 2009-02-02 2012-11-30 Okairos Ag Simian adenovirus nucleic acid- and amino acid-sequences, vectors containing same, and uses thereof
CN101579528B (zh) 2009-06-24 2011-06-29 中国人民解放军军事医学科学院军事兽医研究所 一种hiv复合多表位dna疫苗及其应用
GB0918154D0 (en) 2009-10-16 2009-12-02 Isis Innovation Mycobacterial vaccines
US9101572B2 (en) 2009-12-31 2015-08-11 Medigen, Inc. Infectious DNA vaccines against chikungunya virus
GB201006405D0 (en) 2010-04-16 2010-06-02 Isis Innovation Poxvirus expression system
CN105648056A (zh) 2010-05-14 2016-06-08 综合医院公司 鉴定肿瘤特异性新抗原的组合物和方法
US9192661B2 (en) 2010-07-06 2015-11-24 Novartis Ag Delivery of self-replicating RNA using biodegradable polymer particles
US10487332B2 (en) 2010-07-06 2019-11-26 Glaxosmithkline Biologicals Sa Immunisation of large mammals with low doses of RNA
MX2013000164A (es) 2010-07-06 2013-03-05 Novartis Ag Liposomas con lipidos que tienen valor de pka ventajoso para suministro de arn.
BR112013000391B8 (pt) 2010-07-06 2022-10-04 Novartis Ag Composição de emulsão catiônica de óleo em água e seu uso
PL3243526T3 (pl) 2010-07-06 2020-05-18 Glaxosmithkline Biologicals S.A. Dostarczanie rna w celu wyzwolenia wielu szlaków immunologicznych
US9770463B2 (en) 2010-07-06 2017-09-26 Glaxosmithkline Biologicals Sa Delivery of RNA to different cell types
CN103052400B (zh) 2010-07-06 2016-11-16 诺华股份有限公司 自我复制rna分子的病毒样递送颗粒
WO2012024350A2 (en) 2010-08-16 2012-02-23 Salk Institute For Biological Studies Anti-cancer adenoviruses
DK3981427T3 (da) 2010-08-31 2022-07-11 Glaxosmithkline Biologicals Sa Pegylerede liposomer til afgivelse af immunogen-kodende RNA
FI4043040T3 (fi) 2010-08-31 2023-04-04 Glaxosmithkline Biologicals Sa Pieniä liposomeja immunogeeniä koodaavan rna:n toimittamiseksi
ES2727583T3 (es) 2010-08-31 2019-10-17 Glaxosmithkline Biologicals Sa Lípidos adecuados para la administración liposómica de ARN que codifica proteínas
KR20210131432A (ko) 2010-12-30 2021-11-02 파운데이션 메디신 인코포레이티드 종양 샘플의 다유전자 분석의 최적화
US9487563B2 (en) 2011-01-31 2016-11-08 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Virus-like particles and methods of use
US8722044B2 (en) 2011-03-15 2014-05-13 Janssen Biotech, Inc. Human tissue factor antibody and uses thereof
WO2012158613A1 (en) 2011-05-13 2012-11-22 Novartis Ag Pre-fusion rsv f antigens
RS64230B1 (sr) 2011-05-24 2023-06-30 BioNTech SE Individualizovane vakcine protiv kancera
GB201108879D0 (en) 2011-05-25 2011-07-06 Isis Innovation Vector
WO2012171541A1 (en) 2011-06-15 2012-12-20 Scil Proteins Gmbh Human fusion proteins comprising interferons and hetero-dimeric modified ubiquitin proteins
SG10201605537XA (en) 2011-07-06 2016-09-29 Novartis Ag Liposomes having useful n:p ratio for delivery of rna molecules
ES2656050T3 (es) 2011-07-06 2018-02-22 Glaxosmithkline Biologicals Sa Composiciones de combinación inmunogénica y usos de las mismas
CA2841047A1 (en) 2011-07-06 2013-01-10 Novartis Ag Immunogenic compositions and uses thereof
KR102067760B1 (ko) 2011-08-16 2020-01-17 삼성전자주식회사 세포 내 전달용 단백질 복합체 및 그의 용도
TR201900264T4 (tr) 2011-08-31 2019-02-21 Glaxosmithkline Biologicals Sa İmmünojen şifreleyici rna'nın verilmesi için pegile edilmiş lipozomlar.
WO2013055905A1 (en) 2011-10-11 2013-04-18 Novartis Ag Recombinant self-replicating polycistronic rna molecules
AP2014007864A0 (en) 2012-02-16 2014-08-31 Vlp Therapeutics Llc Virus like particle composition
US20160289674A1 (en) 2012-04-02 2016-10-06 Moderna Therapeutics, Inc. Modified polynucleotides for the production of membrane proteins
US9283287B2 (en) 2012-04-02 2016-03-15 Moderna Therapeutics, Inc. Modified polynucleotides for the production of nuclear proteins
CA2873509A1 (en) 2012-05-18 2013-11-21 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Subfamily e simian adenoviruses a1302, a1320, a1331 and a1337 and uses thereof
ES2663688T3 (es) 2012-07-04 2018-04-16 Sirion Biotech Gmbh Medios y métodos para aumentar la producción de adenovirus
WO2014005958A1 (en) 2012-07-06 2014-01-09 Novartis Ag Immunogenic compositions and uses thereof
US8961995B2 (en) 2012-09-20 2015-02-24 Uab Research Foundation Methods and compositions for alphavirus replicons
GB201220119D0 (en) 2012-11-08 2012-12-26 Univ Cork Vector
SG11201503864TA (en) 2012-11-16 2015-06-29 Beth Israel Hospital Recombinant adenoviruses and use thereof
KR101429696B1 (ko) * 2012-11-21 2014-08-13 국립암센터 안전성 및 항암활성이 증가된 재조합 아데노바이러스 및 이의 용도
US9402888B2 (en) 2013-03-14 2016-08-02 The Wistar Institute Of Anatomy And Biology Methods and compositions for treating cancer
KR102341899B1 (ko) 2013-04-07 2021-12-21 더 브로드 인스티튜트, 인코퍼레이티드 개인맞춤화 신생물 백신을 위한 조성물 및 방법
CA2913832C (en) 2013-06-03 2023-07-04 Vlp Therapeutics, Llc A virus-like particle comprising a malaria antigen and use thereof as a malaria vaccine
HUE043042T2 (hu) * 2013-11-01 2019-07-29 Pfizer Vektorok prosztatához kapcsolódó antigének expressziójára
GB201319446D0 (en) 2013-11-04 2013-12-18 Immatics Biotechnologies Gmbh Personalized immunotherapy against several neuronal and brain tumors
BR112016012862A2 (pt) 2013-12-06 2017-09-26 Broad Inst Inc formulações para vacinas para neoplasia
WO2015095811A2 (en) 2013-12-20 2015-06-25 The Board Institute Inc. Combination therapy with neoantigen vaccine
KR20190062617A (ko) 2014-09-03 2019-06-05 버베리안 노딕 에이/에스 면역 반응을 증대시키기 위한 방법 및 조성물
PL3223850T3 (pl) 2014-11-26 2020-08-24 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Receptory limfocytów t przeciwko zmutowanemu kras
WO2016100975A1 (en) 2014-12-19 2016-06-23 Massachsetts Institute Ot Technology Molecular biomarkers for cancer immunotherapy
EP3757211A1 (en) 2014-12-19 2020-12-30 The Broad Institute, Inc. Methods for profiling the t-cell-receptor repertoire
CN107405393A (zh) 2015-01-29 2017-11-28 新加坡科技研究局 携带基孔肯亚相关肽的纳米胶囊
US20180030140A1 (en) 2015-02-06 2018-02-01 Navigo Proteins Gmbh Novel binding proteins comprising a ubiquitin mutein and antibodies or antibody fragments
WO2016154047A2 (en) 2015-03-20 2016-09-29 Memorial Sloan-Kettering Cancer Center Monoclonal antigen-binding proteins to intracellular oncogene products
CN115873129A (zh) 2015-03-23 2023-03-31 约翰·霍普金斯大学 由体细胞突变基因编码的hla限制性表位
KR20180010229A (ko) 2015-05-20 2018-01-30 더 브로드 인스티튜트, 인코퍼레이티드 공유 신생항원
DK4104687T3 (da) 2015-09-21 2024-03-04 Trilink Biotechnologies Llc Sammensætninger og fremgangsmåder til syntetisering af RNA'er med 5-kappe
CN108601820A (zh) 2015-10-12 2018-09-28 南托米克斯有限责任公司 用于病毒癌症新表位的组合物和方法
AU2016369519B2 (en) 2015-12-16 2023-04-20 Gritstone Bio, Inc. Neoantigen identification, manufacture, and use
KR20220018627A (ko) 2016-02-29 2022-02-15 파운데이션 메디신 인코포레이티드 종양 돌연변이 부담을 평가하기 위한 방법 및 시스템
AU2017225787B2 (en) 2016-03-03 2021-09-23 Cue Biopharma, Inc. T-cell modulatory multimeric polypeptides and methods of use thereof
US20190307868A1 (en) 2016-03-31 2019-10-10 Neon Therapeutics, Inc. Neoantigens and methods of their use
AU2017254477A1 (en) 2016-04-18 2018-11-01 Jennifer G. ABELIN Improved HLA epitope prediction
CA3022267A1 (en) 2016-05-04 2017-11-09 Fred Hutchinson Cancer Research Center Cell-based neoantigen vaccines and uses thereof
WO2017208191A1 (en) 2016-06-02 2017-12-07 Glaxosmithkline Biologicals Sa Zika viral antigen constructs
EP3471758A1 (en) 2016-06-20 2019-04-24 ISA Pharmaceuticals B.V Formulation of a peptide vaccine
GB2549809C (en) 2016-06-23 2022-11-30 Univ Oxford Innovation Ltd Vector
CN107698593A (zh) 2016-08-09 2018-02-16 南京天印健华医药科技有限公司 作为fgfr抑制剂的杂环化合物
WO2018039131A1 (en) 2016-08-22 2018-03-01 Protiva Biotherapeutics, Inc. Anti-pd-1 antibodies, or fragments thereof, for treating hepatitis b
WO2018098362A1 (en) * 2016-11-23 2018-05-31 Gritstone Oncology, Inc. Viral delivery of neoantigens
WO2018102585A1 (en) 2016-11-30 2018-06-07 Advaxis, Inc. Personalized immunotherapy in combination with immunotherapy targeting recurrent cancer mutations
EP3551644B1 (en) 2016-12-09 2023-08-16 GlaxoSmithKline Biologicals SA Chimpanzee adenovirus constructs with lyssavirus antigens
GB201620968D0 (en) * 2016-12-09 2017-01-25 Glaxosmithkline Biologicals Sa Adenovirus polynucleotides and polypeptides
GB201621732D0 (en) 2016-12-20 2017-02-01 Agricultural Research Council A multi-epitope dna vaccine for heartwater
AU2017379901B2 (en) 2016-12-21 2024-02-15 Arbutus Biopharma Corporation Methods for ameliorating infusion reactions
CN108064305B (zh) * 2017-03-24 2021-10-08 清华大学 可编程的溶瘤病毒疫苗系统及其应用
CN111093691A (zh) 2017-04-03 2020-05-01 内恩疗法公司 蛋白质抗原及其用途
WO2018208856A1 (en) 2017-05-08 2018-11-15 Gritstone Oncology, Inc. Alphavirus neoantigen vectors
CA3066635A1 (en) 2017-06-09 2018-12-13 Gritstone Oncology, Inc. Neoantigen identification, manufacture, and use
AR112166A1 (es) 2017-06-16 2019-09-25 Arbutus Biopharma Corp Composiciones terapéuticas y métodos para el tratamiento de hepatitis b
KR20200093518A (ko) 2017-07-21 2020-08-05 제넨테크, 인크. 암에 대한 치료 및 진단 방법
JP7232476B2 (ja) 2017-08-07 2023-03-08 ザ ジョンズ ホプキンス ユニバーシティ がんを評価及び治療するための方法及び物質
WO2019090156A1 (en) 2017-11-03 2019-05-09 Guardant Health, Inc. Normalizing tumor mutation burden
EP3762512A1 (en) 2018-03-06 2021-01-13 Cancer Research Technology Limited Improvements in variant detection
US20210213122A1 (en) 2018-05-23 2021-07-15 Gritstone Oncology, Inc. Immune checkpoint inhibitor co-expression vectors
EP3796927A4 (en) 2018-05-23 2022-04-20 Gritstone bio, Inc. SHARED ANTIGENS
AU2019374874A1 (en) 2018-11-07 2021-06-10 Gritstone Bio, Inc. Alphavirus neoantigen vectors and interferon inhibitors
KR20220041844A (ko) 2019-07-02 2022-04-01 그릿스톤 바이오, 인코포레이티드 Hiv 항원 및 mhc 복합체
EP4125973A4 (en) 2019-11-04 2024-03-13 Gritstone Bio Inc NEOANTIGEN VACCINE THERAPY
WO2021119545A1 (en) 2019-12-11 2021-06-17 Gritstone Bio, Inc. Durable vaccination
WO2021142437A1 (en) 2020-01-10 2021-07-15 Gritstone Bio, Inc. Cell-free dna monitoring
KR20230014694A (ko) 2020-04-21 2023-01-30 그릿스톤 바이오, 인코포레이티드 항원-코딩 카세트
WO2022032196A2 (en) 2020-08-06 2022-02-10 Gritstone Bio, Inc. Multiepitope vaccine cassettes

Also Published As

Publication number Publication date
BR122024002387A2 (pt) 2024-03-12
IL288283A (en) 2022-01-01
US20220090138A1 (en) 2022-03-24
SG11202113187WA (en) 2021-12-30
BR112021024127A2 (pt) 2022-04-26
MX2021014525A (es) 2022-03-17
CN114072516A (zh) 2022-02-18
US20230407332A1 (en) 2023-12-21
EP3976075A4 (en) 2023-08-16
KR20220016137A (ko) 2022-02-08
EP3976075A1 (en) 2022-04-06
US11591619B2 (en) 2023-02-28
WO2020243719A1 (en) 2020-12-03
JP2022534282A (ja) 2022-07-28
JP7457733B2 (ja) 2024-03-28
CA3140019A1 (en) 2020-12-03
AU2020282369A1 (en) 2022-01-20

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20210196806A1 (en) Shared antigens
JP7457733B2 (ja) 改変アデノウイルス
US20230047979A1 (en) Durable vaccination
US20220125919A1 (en) Alphavirus neoantigen vectors and interferon inhibitors
TW202000906A (zh) 免疫檢查點抑制劑共表現載體
US20230310563A1 (en) Antigen-encoding cassettes
US11771747B2 (en) Multiepitope vaccine cassettes
WO2021092095A1 (en) Neoantigen vaccine therapy
EP4281110A2 (en) Modified alphavirus vectors
US20240050550A1 (en) Infectious disease antigens and vaccines
US20240093235A1 (en) Homologous adenoviral vaccination