CN111093691A - 蛋白质抗原及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明的领域涉及免疫治疗肽、肽结合剂以及它们在例如癌症免疫治疗中的用途。

Description

蛋白质抗原及其用途
交叉引用
本申请要求2017年4月3日提交的第62/480,593号美国临时申请、2017年4月3日提交的第62/480,596号美国临时申请和2017年4月3日提交的第62/480,597号美国临时申请的优先权，这些临时申请各自通过引用整体并入本文。
技术领域
本发明的领域涉及免疫治疗肽、编码该肽的核酸、肽结合剂以及它们在例如癌症免疫治疗中的用途。在一个方面，本发明提供了在癌细胞中表达的非突变蛋白质表位，其可单独使用或与其它肿瘤相关肽、抗癌剂或免疫调节剂联合使用以治疗癌症。
背景技术
肿瘤疫苗通常由肿瘤抗原和免疫刺激分子(例如佐剂、细胞因子或TLR配体)组成，它们共同作用以诱导识别并裂解肿瘤细胞的抗原特异性细胞毒性T细胞(CTL)。这类疫苗含有共有的组织限制性肿瘤抗原或完整肿瘤细胞制品形式的共有抗原和患者特异性抗原的混合物。共有的组织限制性肿瘤抗原是在许多个体的肿瘤中具有选择性表达的理想的免疫原性蛋白质，并且通常作为合成肽或重组蛋白递送给患者。相比之下，完整肿瘤细胞制品作为自体辐照的细胞、细胞裂解物、细胞融合物、热休克蛋白制品或总mRNA递送给患者。由于完整肿瘤细胞是从自体患者中分离的，因此该细胞可以包括患者特异性肿瘤抗原以及共有的肿瘤抗原。最后，还有第三类肿瘤抗原——新抗原，其由具有导致氨基酸序列改变的肿瘤特异性突变(可以是患者特异性的或共有的)的蛋白质组成。因此，仍然需要开发另外的癌症治疗剂。
发明内容
本文提供了分离的抗原肽，其包含来自表1或表2中的序列的表位。本公开还涉及长度为100个或更少氨基酸的分离的抗原肽，其包含来自表1或表2中的序列的表位。本公开还涉及分离的抗原肽，其包含来自表3或表4中的序列的表位。本公开还涉及长度为100个或更少氨基酸的分离的抗原肽，其包含来自表3或表4中的序列的表位。本公开还涉及分离的抗原肽，其包含来自表5或表6中的序列的表位。本公开还涉及长度为100个或更少氨基酸的分离的抗原肽，其包含来自表5或表6中的序列的表位。
在一个实施方案中，所述分离的抗原肽是逆转录病毒抗原。在另一个实施方案中，所述分离的抗原肽是非突变的过表达的抗原。在另一个实施方案中，所述分离的抗原肽是病毒抗原。
在一个实施方案中，所述分离的抗原肽的长度为约5至约50个氨基酸。在另一个实施方案中，所述分离的抗原肽的长度为约15至约35个氨基酸。在另一个实施方案中，所述分离的抗原肽的长度为约15个或更少的氨基酸。在另一个实施方案中，所述分离的抗原肽的长度为约8至约11个氨基酸。在另一个实施方案中，所述分离的抗原肽的长度为9或10个氨基酸。在一个实施方案中，所述分离的抗原肽结合主要组织相容性复合体(MHC)I类。在另一个实施方案中，所述分离的抗原肽以小于约500nM的结合亲和力结合MHC I类。
在一个实施方案中，所述分离的抗原肽的长度为约30个或更少的氨基酸。在另一个实施方案中，所述分离的抗原肽的长度为约6至约25个氨基酸。在另一个实施方案中，所述分离的抗原肽的长度为约15至约24个氨基酸。在另一个实施方案中，所述分离的抗原肽的长度为约9至约15个氨基酸。在一个实施方案中，所述分离的抗原肽结合MHC II类。在另一个实施方案中，所述分离的抗原肽以小于约1000nM的结合亲和力结合MHC II类。
在一个实施方案中，所述分离的抗原肽进一步包含侧翼氨基酸。在另一个实施方案中，该侧翼氨基酸不是天然的侧翼氨基酸。在一个实施方案中，所述分离的抗原肽与至少第二抗原肽连接。在另一个实施方案中，所述肽使用聚甘氨酸或聚丝氨酸连接体连接。在另一个实施方案中，所述第二抗原肽以小于约1000nM的结合亲和力结合MHC I类或II类。在另一个实施方案中，所述第二抗原肽以小于约500nM的结合亲和力结合MHC I类或II类。在另一个实施方案中，这两种表位均与人白细胞抗原(HLA)-A、-B、-C、-DP、-DQ或-DR结合。在另一个实施方案中，所述分离的抗原肽结合I类HLA，并且所述第二抗原肽结合II类HLA。在另一个实施方案中，所述分离的抗原肽结合II类HLA，并且所述第二抗原肽结合I类HLA。
在一个实施方案中，所述分离的抗原肽进一步包含增加体内半衰期、细胞靶向、抗原摄取、抗原加工、MHC亲和力、MHC稳定性或抗原呈递的修饰。在另一个实施方案中，所述修饰是与载体蛋白缀合、与配体缀合、与抗体缀合、PEG化、多唾液酸化、HES化、重组PEG模拟物、Fc融合、白蛋白融合、纳米颗粒附着、纳米颗粒包封、胆固醇融合、铁融合、酰化、酰胺化、糖基化、侧链氧化、磷酸化、生物素化、添加表面活性材料、添加氨基酸模拟物或添加非天然氨基酸。在一个实施方案中，所靶向的细胞是抗原呈递细胞。在另一个实施方案中，所述抗原呈递细胞是树突细胞。在另一个实施方案中，使用DEC205、XCR1、CD197、CD80、CD86、CD123、CD209、CD273、CD283、CD289、CD184、CD85h、CD85j、CD85k、CD85d、CD85g、CD85a、CD141、CD11c、CD83、TSLP受体或CD1a标志物来靶向所述树突细胞。在另一个实施方案中，使用CD141、DEC205或XCR1标志物来靶向所述树突细胞。
在一个实施方案中，本文提供了一种体内递送系统，其包含本文所述的分离的抗原肽。在另一个实施方案中，所述递送系统包括细胞穿透肽、纳米颗粒包封、病毒样颗粒或脂质体。在另一个实施方案中，所述细胞穿透肽是TAT肽、单纯疱疹病毒VP22、转运蛋白(transportan)或Antp。
在一个实施方案中，本文提供了一种细胞，其包含本文所述的分离的抗原肽。在另一个实施方案中，所述细胞是抗原呈递细胞。在另一个实施方案中，所述细胞是树突细胞。
在一个实施方案中，本文提供了一种组合物，其包含本文所述的分离的抗原肽。在另一个实施方案中，所述组合物包含至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25、至少26、至少27、至少28、至少29或至少30种分离的抗原肽，所述抗原肽包含表1或表2中限定的肿瘤特异性表位。在另一个实施方案中，所述组合物包含至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25、至少26、至少27、至少28、至少29或至少30种分离的抗原肽，所述抗原肽包含表3或表4中限定的肿瘤特异性表位。在另一个实施方案中，所述组合物包含至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25、至少26、至少27、至少28、至少29或至少30种分离的抗原肽，所述抗原肽包含表5或表6中限定的肿瘤特异性表位。在另一个实施方案中，所述组合物包含2至20种抗原肽。在另一个实施方案中，所述组合物进一步包含至少1、至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24或至少25、至少26、至少27、至少28、至少29或至少30种附加抗原肽。在另一个实施方案中，所述组合物包含约4至约20种附加抗原肽。在另一个实施方案中，所述附加抗原肽对个体患者的肿瘤是特异性的。在另一个实施方案中，抗原肽通过鉴定所述患者的肿瘤样品的转录组或蛋白质组与非肿瘤样品的转录组或蛋白质组之间的表达差异来选择。在另一个实施方案中，所述样品是新鲜的或福尔马林固定、石蜡包埋的肿瘤组织、新鲜分离的细胞或循环肿瘤细胞。在一些实施方案中，所述抗原肽的序列通过下一代测序来确定。
在一个实施方案中，本文提供了一种分离的多核苷酸，其编码本文所述的分离的抗原肽。在另一个实施方案中，所述分离的多核苷酸是RNA，任选地是自扩增RNA。在另一个实施方案中，对所述RNA进行修饰，以增加稳定性，增加细胞靶向，提高翻译效率、佐剂性、胞质可及性，并且/或者降低细胞毒性。在另一个实施方案中，所述修饰是与载体蛋白缀合、与配体缀合、与抗体缀合、密码子优化、增加GC含量、掺入修饰的核苷、掺入5’-帽或帽类似物和/或掺入未掩蔽的聚-A序列。
在一个实施方案中，本文提供了包含本文所述的多核苷酸的细胞。
在一个实施方案中，本文提供了包含本文所述的多核苷酸的载体。在另一个实施方案中，所述多核苷酸可操作地连接至启动子。在另一个实施方案中，所述载体是自扩增RNA复制子、质粒、噬菌体、转座子、粘粒、病毒或病毒体。在另一个实施方案中，所述载体是腺相关病毒、疱疹病毒、慢病毒或其假型。
在一个实施方案中，本文提供了一种体内递送系统，其包含本文所述的分离的多核苷酸。在另一个实施方案中，所述递送系统包括球形核酸、病毒、病毒样颗粒、质粒、细菌质粒或纳米颗粒。
在一个实施方案中，本文提供了一种细胞，其包含本文所述的载体或递送系统。在另一个实施方案中，所述细胞为抗原呈递细胞。在另一个实施方案中，所述细胞为树突细胞。在另一个实施方案中，所述细胞为未成熟的树突细胞。
在一个实施方案中，本文提供了一种组合物，其包含至少一种本文所述的多核苷酸。在另一个实施方案中，所述组合物包含至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25、至少26、至少27、至少28、至少29或至少30种分离的多核苷酸。在另一个实施方案中，所述组合物包含约2至约20种多核苷酸。在另一个实施方案中，所述组合物进一步包含至少1、至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25、至少26、至少27、至少28、至少29或至少30种编码附加抗原肽的附加抗原多核苷酸。在另一个实施方案中，所述组合物包含约4至约20种附加抗原多核苷酸。在另一个实施方案中，所述分离的多核苷酸和所述附加抗原多核苷酸连接起来。在另一个实施方案中，所述多核苷酸使用编码聚甘氨酸或聚丝氨酸连接体的核酸进行连接。在另一个实施方案中，至少一种所述附加抗原肽对个体患者的肿瘤是特异性的。在另一个实施方案中，所述抗原肽通过鉴定所述患者的肿瘤样品的转录组或蛋白质组与非肿瘤样品的转录组或蛋白质组之间的表达差异来选择。在另一个实施方案中，所述样品是新鲜的或福尔马林固定、石蜡包埋的肿瘤组织、新鲜分离的细胞或循环肿瘤细胞。在一些实施方案中，所述抗原肽的序列通过下一代测序来确定。
在一个实施方案中，本文提供了一种T细胞受体(TCR)，其能够结合至少一种本文所述的抗原肽。在另一个实施方案中，所述TCR能够在MHC I类或II类的环境中结合分离的抗原肽。
在一个实施方案中，本文提供了一种嵌合抗原受体，其包含：(i)T细胞活化分子；(ii)跨膜区；以及(iii)能够结合本文所述的分离的抗原肽的抗原识别部分。在另一个实施方案中，CD3-ζ是所述T细胞活化分子。在另一个实施方案中，所述嵌合抗原受体进一步包含至少一个共刺激信号传导域。在另一个实施方案中，所述信号传导域是CD28、4-1BB、ICOS、OX40、ITAM或FcεRI-γ。在另一个实施方案中，所述抗原识别部分能够在MHC I类或II类的环境中结合所述分离的抗原肽。在另一个实施方案中，所述嵌合抗原受体包含CD3-ζ、CD28、CTLA-4、ICOS、BTLA、KIR、LAG3、CD137、OX40、CD27、CD40L、Tim-3、A2aR或PD-1跨膜区。在另一个实施方案中，所述肿瘤特异性表位位于肿瘤相关多肽的细胞外结构域中。
在一个实施方案中，本文提供了一种T细胞，其包含本文所述的T细胞受体或嵌合抗原受体。在一个实施方案中，所述T细胞为辅助T细胞或细胞毒性T细胞。
在一个实施方案中，本文提供了一种核酸，其包含与编码本文所述的T细胞受体的多核苷酸可操作地连接的启动子。在另一个实施方案中，所述TCR能够在主要组织相容性复合体(MHC)I类或II类的环境中结合至少一种抗原肽。在一个实施方案中，所述核酸包含与编码本文所述的嵌合抗原受体的多核苷酸可操作地连接的启动子。在另一个实施方案中，所述抗原识别部分能够在主要组织相容性复合体(MHC)I类或II类的环境中结合至少一种抗原肽。在另一个实施方案中，所述肿瘤特异性表位位于肿瘤相关多肽的细胞外结构域中。在另一个实施方案中，所述核酸包含CD3-ζ、CD28、CTLA-4、ICOS、BTLA、KIR、LAG3、CD137、OX40、CD27、CD40L、Tim-3、A2aR或PD-1跨膜区。
在一个实施方案中，本文提供了能够结合至少一种表1或表2中列出的抗原肽的抗体。在另一个实施方案中，本文提供了能够结合至少一种表3或表4中列出的抗原肽的抗体。在另一个实施方案中，本文提供了能够结合至少一种表5或表6中列出的抗原肽的抗体。在另一个实施方案中，所述至少一种表1或表2中列出的抗原肽是逆转录病毒抗原肽。在另一个实施方案中，所述至少一种表3或表4中列出的抗原肽是非突变的过表达的抗原肽。在另一个实施方案中，所述至少一种表5或表6中列出的抗原肽是病毒抗原肽。
在一个实施方案中，本文提供了用本文所述的核酸转染或转导的修饰的细胞。在一个实施方案中，所述修饰的细胞是T细胞、肿瘤浸润淋巴细胞、NK-T细胞、表达TCR的细胞、CD4+ T细胞、CD8+ T细胞或NK细胞。
在一个实施方案中，本文提供了包含本文所述的T细胞受体或嵌合抗原受体的组合物。在另一个实施方案中，组合物包含含有本文所述的T细胞受体或嵌合抗原受体的患者自体T细胞。在另一个实施方案中，所述组合物进一步包含免疫检查点抑制剂。在另一个实施方案中，所述组合物进一步包含至少两种免疫检查点抑制剂。在另一个实施方案中，每种所述免疫检查点抑制剂均抑制选自CTLA-4、PDL1、PDL2、PD1、B7-H3、B7-H4、BTLA、HVEM、TIM3、GAL9、LAG3、VISTA、KIR、2B4、CD160、CGEN-15049、CHK 1、CHK2、A2aR和B-7家族配体或其组合的检查点蛋白。在另一个实施方案中，每种所述免疫检查点抑制剂均与选自CTLA-4、PDL1、PDL2、PD1、B7-H3、B7-H4、BTLA、HVEM、TIM3、GAL9、LAG3、VISTA、KIR、2B4、CD160、CGEN-15049、CHK1、CHK2、A2aR和B-7家族配体或其组合的检查点蛋白的配体相互作用。
在一个实施方案中，所述组合物进一步包含免疫调节剂或佐剂。在另一个实施方案中，所述免疫调节剂是共刺激配体、TNF配体、Ig超家族配体、CD28、CD80、CD86、ICOS、CD40L、OX40、CD27、GITR、CD30、DR3、CD69或4-1BB。在另一个实施方案中，所述免疫调节剂是至少一种癌细胞或癌细胞提取物。在另一个实施方案中，所述癌细胞对于需要所述组合物的受试者而言是自体的。在另一个实施方案中，所述癌细胞已经经历裂解或已经暴露于UV辐射。在另一个实施方案中，所述组合物进一步包含佐剂。在另一个实施方案中，所述佐剂选自：聚(I:C)、聚-ICLC、STING激动剂、1018ISS、铝盐、Amplivax、AS15、BCG、CP-870,893、CpG7909、CyaA、dSLIM、GM-CSF、IC30、IC31、咪喹莫特、ImuFact IMP321、IS Patch、ISS、ISCOMATRIX、JuvImmune、LipoVac、MF59、单磷酰脂质A、Montanide IMS 1312VG、MontanideISA 206VG、Montanide ISA 50V2、Montanide ISA 51VG、OK-432、OM-174、OM-197-MP-EC、ISA-TLR2激动剂、ONTAK、
Figure BDA0002301078100000081
载体系统、PLG微粒、瑞喹莫德、SRL172、病毒小体(virosomes)和其它病毒样颗粒、YF-17D、VEGF trap、R848、β-葡聚糖、Pam3Cys、Pam3CSK4、丙烯酸或甲基丙烯酸聚合物、马来酸酐共聚物和QS21刺激子。在另一个实施方案中，所述佐剂在施用于受试者时诱导体液应答。在另一个实施方案中，所述佐剂在施用于受试者时诱导1型T辅助细胞。
在一个实施方案中，本文提供了一种抑制表达表1或表2中限定的肿瘤特异性表位的肿瘤细胞生长的方法，其包括使肿瘤细胞与本发明的肽、多核苷酸、递送系统、载体、组合物、抗体或细胞接触。在另一个实施方案中，本文提供了一种抑制表达表3或表4中限定的肿瘤特异性表位的肿瘤细胞生长的方法，其包括使肿瘤细胞与本发明的肽、多核苷酸、递送系统、载体、组合物、抗体或细胞接触。在另一个实施方案中，本文提供了一种抑制表达表5或表6中限定的肿瘤特异性表位的肿瘤细胞生长的方法，其包括使肿瘤细胞与本发明的肽、多核苷酸、递送系统、载体、组合物、抗体或细胞接触。
在一个实施方案中，本文提供了一种在有需要的受试者中治疗癌症或引发、增强或延长抗肿瘤应答的方法，该方法包括向所述受试者施用本文所述的肽、多核苷酸、载体、组合物、抗体或细胞。在一个实施方案中，所述癌症选自CRC、头颈癌、胃癌、肺鳞癌、肺腺癌、前列腺癌、膀胱癌、胃癌、肾细胞癌和子宫癌。在一个实施方案中，所述癌症选自黑素瘤、肺鳞癌、DLBCL、子宫癌、头颈癌、子宫癌、肝癌和CRC。在一个实施方案中，所述癌症选自宫颈癌、头颈癌、肛门癌、胃癌、伯基特淋巴瘤和鼻咽癌。
在一个实施方案中，所述受试者是人。在另一个实施方案中，所述受试者患有癌症。在另一个实施方案中，所述癌症选自泌尿生殖系统癌症、妇科癌症、肺癌、胃肠癌、头颈癌、恶性胶质母细胞瘤、恶性间皮瘤、非转移性或转移性乳腺癌、恶性黑素瘤、三阴性乳腺癌(TNBC)、阴燃骨髓瘤(SMM)、Merkel细胞癌或骨与软组织肉瘤、血液系统肿瘤、多发性骨髓瘤、急性髓性白血病、慢性髓性白血病、骨髓增生异常综合征和急性淋巴母细胞白血病、非小细胞肺癌(NSCLC)、乳腺癌、转移性结直肠癌、激素敏感性或激素难治性前列腺癌、结直肠癌、卵巢癌、肝细胞癌、肾细胞癌、胰腺癌、胃癌、食道癌、肝细胞癌、胆管细胞癌、头颈部鳞状细胞癌、软组织肉瘤和小细胞肺癌。在另一个实施方案中，所述受试者已经经历手术切除所述肿瘤。在另一个实施方案中，所述肽、多核苷酸、载体、组合物或细胞通过静脉内、腹膜内、瘤内、皮内或皮下给药来施用。在另一个实施方案中，将所述肽、多核苷酸、载体、组合物或细胞施用于汇入淋巴结盆的解剖部位。在另一个实施方案中，所述施用是进入多个淋巴结盆。在另一个实施方案中，所述施用通过皮下或皮内途径来进行。
在所述方法的一个实施方案中，施用肽。在另一个实施方案中，所述施用是瘤内施用。在所述方法的另一个实施方案中，施用多核苷酸，任选地施用RNA。在另一个实施方案中，所述多核苷酸通过静脉内施用。在所述方法的一个实施方案中，施用细胞。在另一个实施方案中，所述细胞是T细胞或树突细胞。在另一个实施方案中，所述肽或多核苷酸包含抗原呈递细胞靶向部分。
所述方法的一个实施方案进一步包括向所述受试者施用至少一种免疫检查点抑制剂。在另一个实施方案中，所述检查点抑制剂是生物治疗剂或小分子。在另一个实施方案中，所述检查点抑制剂选自单克隆抗体、人源化抗体、完全人抗体和融合蛋白或其组合。在另一个实施方案中，所述检查点抑制剂抑制选自CTLA-4、PDL1、PDL2、PD1、B7-H3、B7-H4、BTLA、HVEM、TIM3、GAL9、LAG3、VISTA、KIR、2B4、CD160、CGEN-15049、CHK 1、CHK2、A2aR和B-7家族配体或其组合的检查点蛋白。在另一个实施方案中，所述检查点抑制剂与选自CTLA-4、PDL1、PDL2、PD1、B7-H3、B7-H4、BTLA、HVEM、TIM3、GAL9、LAG3、VISTA、KIR、2B4、CD160、CGEN-15049、CHK 1、CHK2、A2aR和B-7家族配体或其组合的检查点蛋白的配体相互作用。在另一个实施方案中，施用两种或更多种检查点抑制剂。在另一个实施方案中，所述检查点抑制剂是：(i)伊匹木单抗或曲美木单抗，以及(ii)纳武单抗。在另一个实施方案中，所述检查点抑制剂和所述组合物同时或以任何顺序依次施用。在另一个实施方案中，在所述检查点抑制剂之前施用所述肽、多核苷酸、载体、组合物或细胞。在另一个实施方案中，在所述检查点抑制剂之后施用所述肽、多核苷酸、载体、组合物或细胞。在另一个实施方案中，所述检查点抑制剂的施用在整个抗原肽、多核苷酸、载体、组合物或细胞治疗期间是持续的。在另一个实施方案中，将所述抗原肽、多核苷酸、载体、组合物或细胞治疗施用于对检查点抑制剂治疗仅部分响应或不响应的受试者。在另一个实施方案中，所述组合物通过静脉内或皮下施用。在另一个实施方案中，所述检查点抑制剂通过静脉内或皮下施用。在另一个实施方案中，所述检查点抑制剂在所述组合物的施用部位约2cm内皮下施用。在另一个实施方案中，将所述组合物施用于与所述检查点抑制剂相同的引流淋巴结。
在所述方法的一个实施方案中，施用附加药剂。在另一个实施方案中，所述药剂是化学治疗剂、免疫调节药物、免疫代谢调节药物、靶向治疗、辐射、抗血管生成剂或减少免疫抑制的药剂。在另一个实施方案中，所述化学治疗剂是烷化剂、拓扑异构酶抑制剂、抗代谢物或抗有丝分裂剂。在另一个实施方案中，所述附加药剂是抗糖皮质激素诱导的肿瘤坏死因子家族受体(GITR)激动性抗体或抗体片段、依鲁替尼、多西紫杉醇、顺铂或环磷酰胺。在另一个实施方案中，所述施用引发CD4+T细胞免疫应答。在另一个实施方案中，所述施用引发CD4+ T细胞免疫应答和CD8+ T细胞免疫应答。
在一个实施方案中，本文提供了一种刺激受试者的免疫应答的方法，其包括施用有效量的本文所述的修饰的细胞或组合物。在另一个实施方案中，所述免疫应答是细胞毒性和/或体液免疫应答。在另一个实施方案中，所述方法在受试者中刺激T细胞介导的免疫应答。在另一个实施方案中，所述T细胞介导的免疫应答针对靶细胞。在另一个实施方案中，所述靶细胞是肿瘤细胞。在另一个实施方案中，对所述修饰的细胞进行体内转染或转导。在另一个实施方案中，对所述修饰的细胞进行离体转染或转导。在另一个实施方案中，所述修饰的细胞是患者自体T细胞。在另一个实施方案中，所述患者自体T细胞从已接受抗原肽或核酸疫苗的患者获得。在另一个实施方案中，所述抗原肽或核酸疫苗包含至少一种个性化抗原。在另一个实施方案中，所述抗原肽或核酸疫苗包含至少一种表1或表2中列出的附加抗原肽。在另一个实施方案中，所述抗原肽或核酸疫苗包含至少一种表3或表4中列出的附加抗原肽。在另一个实施方案中，所述抗原肽或核酸疫苗包含至少一种表5或表6中列出的附加抗原肽。在另一个实施方案中，所述至少一种表1或表2中列出的附加抗原肽是逆转录病毒抗原肽。在另一个实施方案中，所述至少一种表3或表4中列出的附加抗原肽是非突变的过表达的抗原肽。在另一个实施方案中，所述至少一种表5或表6中列出的附加抗原肽是病毒抗原肽。在另一个实施方案中，所述患者在接受所述抗原肽或核酸疫苗之前和/或期间接受化学治疗剂、免疫调节药物、免疫代谢调节药物、靶向治疗或辐射。在另一个实施方案中，所述患者接受采用至少一种检查点抑制剂的治疗。在另一个实施方案中，所述自体T细胞从已经接受至少一轮含有抗原的T细胞治疗的患者获得。在另一个实施方案中，所述方法进一步包括过继性T细胞治疗。在另一个实施方案中，所述过继性T细胞治疗包括自体T细胞。在另一个实施方案中，所述自体T细胞靶向肿瘤抗原。在另一个实施方案中，所述过继性T细胞治疗进一步包括同种异体T细胞。在另一个实施方案中，所述同种异体T细胞靶向肿瘤抗原。在另一个实施方案中，在所述检查点抑制剂之前施用所述过继性T细胞治疗。
在一个实施方案中，本文提供了一种评价治疗的功效的方法，该方法包括：(i)在施用修饰的细胞之前测量从受试者获得的第一样品中靶细胞的数目或浓度，(ii)在施用所述修饰的细胞之后测量从所述受试者获得的第二样品中靶细胞的数目浓度，以及(iii)确定与所述第一样品中靶细胞的数目或浓度相比，所述第二样品中靶细胞的数目或浓度的增加或减少。在另一个实施方案中，通过监测以下项目来确定治疗功效：临床结果；T细胞对抗肿瘤活性的增加、增强或延长；与治疗前的数目相比，抗肿瘤T细胞或活化T细胞的数目的增加；B细胞活性；CD4 T细胞活性；或其组合。在另一个实施方案中，通过监测生物标志物来确定治疗功效。在另一个实施方案中，所述生物标志物选自CEA、Her-2/neu、膀胱肿瘤抗原、甲状腺球蛋白、甲胎蛋白、PSA、CA 125、CA19.9、CA 15.3、瘦素、催乳素、骨桥蛋白、IGF-II、CD98、肌成束蛋白、sPIgR、14-3-3η、肌钙蛋白I以及b型利钠肽。在另一个实施方案中，所述临床结果选自肿瘤消退；肿瘤缩小；肿瘤坏死；免疫系统引起的抗肿瘤应答；肿瘤扩大、复发或扩散；或其组合。在另一个实施方案中，通过T细胞的存在或通过指示T细胞炎症的基因标记的存在或其组合来预测治疗效果。
在一个实施方案中，本文提供了一种在有需要的受试者中治疗癌症或引发、增强或延长抗肿瘤应答的方法，该方法包括向所述受试者施用：(a)本文所述的肽、多核苷酸、载体、组合物、抗体或细胞；以及(b)至少一种检查点抑制剂。在另一个实施方案中，所述方法进一步包括施用免疫调节剂或佐剂。在另一个实施方案中，所述免疫调节剂或佐剂选自：聚(I:C)、聚-ICLC、STING激动剂、1018 ISS、铝盐、Amplivax、AS15、BCG、CP-870,893、CpG7909、CyaA、dSLIM、GM-CSF、IC30、IC31、咪喹莫特、ImuFact IMP321、IS Patch、ISS、ISCOMATRIX、JuvImmune、LipoVac、MF59、单磷酰脂质A、Montanide IMS 1312 VG、Montanide ISA 206VG、Montanide ISA 50 V2、Montanide ISA 51 VG、OK-432、OM-174、OM-197-MP-EC、ISA-TLR2激动剂、ONTAK、
Figure BDA0002301078100000131
载体系统、PLG微粒、瑞喹莫德、SRL172、病毒小体和其它病毒样颗粒、YF-17D、VEGF trap、R848、β-葡聚糖、Pam3Cys、Pam3CSK4、丙烯酸或甲基丙烯酸聚合物、马来酸酐共聚物以及QS21刺激子、共刺激配体、TNF配体、Ig超家族配体、CD28、CD80、CD86、ICOS、CD40L、OX40、CD27、GITR、CD30、DR3、CD69或4-1BB。在另一个实施方案中，所述免疫调节剂或佐剂是聚-ICLC。在另一个实施方案中，所述检查点抑制剂是抗PD1抗体或抗体片段。在另一个实施方案中，PD-1途径抑制剂是纳武单抗。在另一个实施方案中，所述检查点抑制剂是抗CTLA4抗体或抗体片段。在另一个实施方案中，所述抗CTLA4抗体是伊匹木单抗或曲美木单抗。在另一个实施方案中，所述方法包括施用抗PD1抗体和抗CTLA4抗体。在另一个实施方案中，在开始施用所述肽、多核苷酸、载体、组合物、抗体或细胞之前开始所述检查点抑制剂的施用。在另一个实施方案中，在开始施用所述肽、多核苷酸、载体、组合物、抗体或细胞之后开始所述检查点抑制剂的施用。在另一个实施方案中，在开始施用所述肽、多核苷酸、载体、组合物、抗体或细胞的同时开始所述检查点抑制剂的施用。在另一个实施方案中，所述肽、多核苷酸、载体、组合物、抗体或细胞通过静脉内或皮下施用。在另一个实施方案中，所述检查点抑制剂通过静脉内或皮下施用。在另一个实施方案中，所述检查点抑制剂在所述肽、多核苷酸、载体、组合物、抗体或细胞的施用部位约2cm内皮下施用。在另一个实施方案中，将所述肽、多核苷酸、载体、组合物、抗体或细胞施用于与所述检查点抑制剂相同的引流淋巴结。
在所述治疗方法的一个实施方案中，所述附加治疗剂是例如化学治疗剂或生物治疗剂、辐射或免疫治疗。可以施用针对特定癌症的任何合适的治疗性治疗。化学治疗剂及生物治疗剂的实例包括但不限于血管生成抑制剂，如羟基血管生成抑制素K1-3、DL-a-二氟甲基-鸟氨酸、内皮抑素(endostatin)、烟曲霉素、染料木黄酮、米诺环素、星形孢菌素及沙利度胺；DNA嵌入剂/交联剂，如博来霉素、卡铂、卡莫司汀(Carmustine)、苯丁酸氮芥、环磷酰胺、顺式-二胺铂(II)二氯化物(顺铂)、美法仑、米托蒽醌及奥沙利铂；DNA合成抑制剂，如(±)-甲氨蝶呤(氨甲蝶呤)、3-氨基-1,2,4-苯并三嗪1,4-二氧化物、氨基蝶呤、胞嘧啶β-D-阿拉伯呋喃糖苷、5-氟-5’-脱氧尿苷、5-氟尿嘧啶、更昔洛韦、羟基脲及丝裂霉素C；DNA-RNA转录调节剂，如放线菌素D、柔红霉素、多柔比星、高三尖杉酯碱及伊达比星；酶抑制剂，如S(-+-)-喜树碱、姜黄素、(-)-鱼藤素(Deguelin)、5,6-二氯苯并咪唑1-β-D-呋喃糖苷、依托泊苷、福美司坦、福司曲星、牛奶树碱、2-Immo-l-咪唑啉啶乙酸(环肌酸)、Mevinolin、曲古抑菌素A、酪氨酸磷酸化抑制剂AG 34及酪氨酸磷酸化抑制剂AG 879；基因调节剂，如5-氮杂-2’-脱氧胞苷、5-氮胞苷、胆钙化醇(维生素D3)、4-羟基他莫昔芬、褪黑激素、米非司酮、雷洛昔芬、全反式-视黄醛(维生素A醛)、全反式视黄酸(维生素A酸)、9-顺式-视黄酸、13-顺式-视黄酸、视黄醇(维生素A)、他莫昔芬及曲格列酮；微管抑制剂，如秋水仙碱、多西紫杉醇、多拉司他汀(Dolastatin)15、诺考达唑、紫杉醇、鬼臼毒素、根霉素、长春碱、长春新碱、长春地辛及长春瑞滨(诺维本)；以及未分类的治疗剂，如17-(烯丙基氨基)-l 7-去甲氧基格尔德霉素、4-氨基-1,8-萘二甲酰亚胺、芹黄素、布雷菲德菌素A、希美替定、二氯亚甲基-二膦酸、柳培林(亮丙瑞林)、促黄体激素释放激素、皮斐松-a、雷帕霉素、性激素结合球蛋白、毒胡萝卜素及尿胰蛋白酶抑制剂片段(Bikunin)。所述治疗剂可以是六甲蜜胺、阿米福汀、天冬酰胺酶、卡培他滨、克拉屈滨、西沙比利、cyiarahirse、达卡巴嗪(DT1C)、放线菌素D、屈大麻酚、依泊亭α、非格司亭、氟达拉滨、吉西他滨、格拉司琼、异环磷酰胺、伊立替康、兰索拉唑、左旋咪唑、甲酰四氢叶酸、甲地孕酮、美司钠、甲氧氯普胺、米托坦、奥美拉唑、昂丹司琼、毛果芸香碱、普鲁氯嗪或盐酸拓扑替康。所述治疗剂可以是单克隆抗体，如利妥昔单抗
Figure BDA0002301078100000151
阿伦单抗
Figure BDA0002301078100000152
贝伐珠单抗
Figure BDA0002301078100000153
西妥昔单抗
Figure BDA0002301078100000154
帕尼单抗
Figure BDA0002301078100000155
及曲妥珠单抗
Figure BDA0002301078100000156
维罗非尼
Figure BDA0002301078100000157
甲磺酸伊马替尼
Figure BDA0002301078100000158
厄洛替尼
Figure BDA0002301078100000159
吉非替尼
Figure BDA00023010781000001510
维莫德吉(ErivedgeTM)、90Y-替伊莫单抗、1311-托西莫单抗、ado-曲妥珠单抗(ado-trastuzumab emtansine)、拉帕替尼
Figure BDA00023010781000001511
帕妥珠单抗(PerjetaTM)、ado-曲妥珠单抗(adcylaTM)、瑞戈非尼
Figure BDA00023010781000001512
舒尼替尼
Figure BDA00023010781000001513
地诺单抗
Figure BDA00023010781000001514
索拉菲尼
Figure BDA00023010781000001515
帕唑帕尼
Figure BDA00023010781000001516
阿西替尼
Figure BDA00023010781000001517
达沙替尼
Figure BDA00023010781000001518
尼罗替尼
Figure BDA00023010781000001519
伯舒替尼
Figure BDA00023010781000001520
奥法木单抗
Figure BDA00023010781000001521
阿托珠单抗(obinutuzumab)(GazyvaTM)、依鲁替尼(ImbruvicaTM)、idelalisib
Figure BDA00023010781000001522
克唑替尼
Figure BDA00023010781000001523
厄洛替尼
Figure BDA00023010781000001524
阿法替尼二马来酸盐
Figure BDA00023010781000001525
色瑞替尼(LDK378/Zykadia)、托西莫单抗及1311-托西莫单抗
Figure BDA00023010781000001526
替伊莫单抗
Figure BDA00023010781000001527
本妥西单抗维多汀
Figure BDA00023010781000001528
硼替佐米
Figure BDA00023010781000001529
司妥昔单抗(SylvantTM)、曲美替尼
Figure BDA00023010781000001530
达拉菲尼
Figure BDA00023010781000001531
派姆单抗
Figure BDA00023010781000001532
卡非佐米
Figure BDA00023010781000001533
雷莫芦单抗(CyramzaTM)、卡博替尼(CometriqTM)、凡德他尼
Figure BDA00023010781000001534
任选地，所述治疗剂是新抗原。所述治疗剂可以是细胞因子，如干扰素(INF)、白细胞介素(IL)或造血生长因子。所述治疗剂可以是INF-α、IL-2、阿地白介素、IL-2、红细胞生成素、粒细胞-巨噬细胞群落刺激因子(GM-CSF)或粒细胞群落刺激因子。所述治疗剂可以是靶向治疗，如托瑞米芬
Figure BDA0002301078100000161
氟维司群
Figure BDA0002301078100000162
阿那曲唑
Figure BDA0002301078100000163
依西美坦
Figure BDA0002301078100000164
来曲唑
Figure BDA0002301078100000165
阿柏西普
Figure BDA0002301078100000166
Aiitretinoin
Figure BDA0002301078100000167
替西罗莫司
Figure BDA0002301078100000168
维甲酸
Figure BDA0002301078100000169
地尼白介素
Figure BDA00023010781000001610
伏立诺他
Figure BDA00023010781000001611
罗米地辛
Figure BDA00023010781000001612
贝沙罗汀
Figure BDA00023010781000001613
普拉曲沙
Figure BDA00023010781000001614
来那度胺
Figure BDA00023010781000001615
贝利司他(BeleodaqTM)、来那度胺
Figure BDA00023010781000001616
泊马度胺
Figure BDA00023010781000001617
卡巴他赛
Figure BDA00023010781000001618
恩杂鲁胺
Figure BDA00023010781000001619
乙酸阿比特龙
Figure BDA00023010781000001620
氯化镭223
Figure BDA00023010781000001621
或依维莫司
Figure BDA00023010781000001622
另外，所述治疗剂可以是表观遗传靶向药物，如HDAC抑制剂、激酶抑制剂、DNA甲基转移酶抑制剂、组蛋白去甲基酶抑制剂或组蛋白甲基化抑制剂。所述表观遗传药物可以是阿扎胞苷(Vidaza)、地西他滨(Dacogen)、伏立诺他(Zoiinza)、罗米地辛(Istodax)或鲁索利替尼(Jakafi)。对于前列腺癌治疗，可以与抗-CTLA-4组合的优选化学治疗剂是紫杉醇(TAXOL)。
在一个实施方案中，本文提供了一种试剂盒，其包含本文所述的任何抗原治疗剂。
在根据马库什群组或其它替代分组描述本发明的方面或实施方案的情况下，本发明不仅包括作为整体列出的整个群组，而且还单独包括该群组中的每个成员以及主要群组中的所有可能的亚组，并且还包括缺少一个或多个群组成员的主要群组。本发明还设想明确排除要求保护的发明中的任何群组成员中的一个或多个。
具体实施方式
基于在癌细胞中表达的非突变蛋白质表位的发现，本文描述了新型免疫治疗剂及其用途。因此，本文描述的发明提供了肽、编码该肽的多核苷酸以及肽结合剂，其可以用于例如刺激对肿瘤相关抗原的免疫应答，以产生用于治疗疾病的免疫原性组合物或癌症疫苗。
I.定义
为了便于理解本发明，下面定义了许多术语和短语。
“非突变蛋白质抗原”是指在癌症中特异性表达或以高于非癌组织中的水平表达的抗原。它们包括但不限于外源性病毒的抗原、内源性逆转录病毒的抗原和不包含体细胞突变的过表达的抗原。
“病毒抗原”是指由外源性病毒编码的抗原。
“逆转录病毒抗原”是指由内源性逆转录病毒序列编码的抗原。
“非突变的过表达的抗原”是指由癌细胞基因组编码的非突变的抗原，其表达水平高于非癌组织中的表达水平。
“肿瘤特异性表位”是指在非癌细胞或种系细胞中不表达但在癌细胞中发现表达的表位，或在癌细胞中比在非癌细胞中以更高水平表达的表位。
“参考”可以用来将本发明方法中获得的结果与肿瘤标本相关联并进行比较。通常，“参考”可以基于一个或多个正常标本获得，特别是不受癌症疾病影响的标本，其获自患者或一个或多个不同的个体，例如健康个体，特别是同一物种的个体。“参考”可以通过检测足够大量的正常标本来凭经验确定。
术语“突变”是指与参考相比核酸序列的变化或差异(核苷酸置换、添加或缺失)。“体细胞突变”可发生在除生殖细胞(精子和卵子)之外的身体的任何细胞中并因此不会传递给孩子。这些改变可以(但不总是)导致癌症或其它疾病。在一些实施方案中，突变是非同义突变。术语“非同义突变”是指导致翻译产物中的氨基酸改变如氨基酸置换的突变，例如，核苷酸置换。
在整个公开内容中，“结合数据”结果可以用“IC50”表示。IC50是结合测定中观察到标记的参考肽结合的50％抑制时测试肽的浓度。考虑到运行测定的条件(即，限制HLA蛋白和标记的参考肽浓度)，这些值接近KD值。用于确定结合的测定是本领域公知的，并且详细描述于例如PCT公开WO 94/20127和WO 94/03205以及其它出版物如Sidney等人,CurrentProtocols in Immunology 18.3.1(1998)；Sidney等人,J.Immunol.154:247(1995)；和Sette等人,Mol.Immunol.31:813(1994)中。或者，结合可以相对于参考标准肽的结合来表示。例如，可以基于其相对于参考标准肽的IC50的IC50。
结合也可以使用其它测定系统来确定，包括使用以下系统的测定系统：活细胞(例如，Ceppellini等人,Nature 339:392(1989)；Christnick等人,Nature 352:67(1991)；Busch等人,Int.Immunol.2:443(1990)；Hill等人,J.Immunol.147:189(1991)；delGuercio等人,J.Immunol.154:685(1995))、使用去污剂裂解物的无细胞系统(例如，Cerundolo等人,J.Immunol.21:2069(1991))、固定化纯化的MHC(例如，Hill等人,J.Immunol.152,2890(1994)；Marshall等人,J.Immunol.152:4946(1994))、ELISA系统(例如，Reay等人,EMBO J.11:2829(1992))、表面等离子体共振(例如，Khilko等人,J.Biol.Chem.268:15425(1993))；高通量可溶相测定(Hammer等人,J.Exp.Med.180:2353(1994))以及I类MHC稳定化或组装的测量(例如，Ljunggren等人,Nature 346:476(1990)；Schumacher等人,Cell 62:563(1990)；Townsend等人,Cell 62:285(1990)；Parker等人,J.Immunol.149:1896(1992))。
“交叉反应性结合”指示肽被多于一个HLA分子结合；同义词是简并结合。
当用来讨论表位时，术语“衍生的”是“制备的”的同义词。衍生的表位可以从天然来源分离或者可以根据本领域的标准方案合成。合成表位可以包含人工氨基酸残基“氨基酸模拟物”，如天然存在的L氨基酸残基的D异构体或诸如环己基丙氨酸的非天然氨基酸残基。衍生的或制备的表位可以是天然表位的类似物。
“稀释剂”包括无菌液体，如水和油，包括石油、动物、植物或合成来源的那些，如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等。水也是药物组合物的稀释剂。盐溶液以及右旋糖水溶液和甘油溶液也可以用作稀释剂，例如，在可注射溶液中。
“表位”是分子的特征集合，诸如一起形成被例如免疫球蛋白、T细胞受体、HLA分子或嵌合抗原受体识别的位点的一级、二级和三级肽结构和电荷。或者，表位可以被定义为参与被特定免疫球蛋白识别的一组氨基酸残基，或者在T细胞的情况下，对于被T细胞受体蛋白、嵌合抗原受体和/或主要组织相容性复合体(MHC)受体识别所必需的那些残基。表位可以通过从天然来源分离来制备，或者它们可以根据本领域的标准方案进行合成。合成表位可以包含人工氨基酸残基“氨基酸模拟物”，如天然存在的L氨基酸残基的D异构体或诸如环己基丙氨酸的非天然存在的氨基酸残基。在整个公开内容中，表位在一些情况下可以被称为肽或肽表位。
应当理解，包含本文所述的表位或类似物以及另外的氨基酸的蛋白质或肽仍在本发明的范围内。在某些实施方案中，肽包含抗原的片段。
在某些实施方案中，对本发明的肽的长度具有限制。当包含本文所述表位的蛋白质或肽包含与天然序列具有100％同一性的区域(即，连续的一系列氨基酸残基)时，发生长度受限的实施方案。为了避免表位的定义例如在整个天然分子上读取，对与天然肽序列具有100％同一性的任何区域的长度进行限制。因此，对于包含本文所述表位及与天然肽序列具有100％同一性的区域的肽，与天然序列具有100％同一性的区域通常具有以下长度：少于或等于600个氨基酸残基、少于或等于500个氨基酸残基、少于或等于400个氨基酸残基、少于或等于250个氨基酸残基、少于或等于100个氨基酸残基、少于或等于85个氨基酸残基、少于或等于75个氨基酸残基、少于或等于65个氨基酸残基以及少于或等于50个氨基酸残基。在某些实施方案中，本文所述的“表位”被包含在具有以低至5个氨基酸残基的任一增量少于51个氨基酸残基的区域的肽中，该区域与天然肽序列具有100％的同一性；具有例如50、49、48、47、46、45、44、43、42、41、40、39、38、37、36、35、34、33、32、31、30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个氨基酸残基。
“人白细胞抗原”或“HLA”是人I类或II类主要组织相容性复合体(MHC)蛋白(参见，例如，Stites等人,IMMUNOLOGY,第8版.,Lange Publishing,Los Altos,Calif.(1994))。
如本文所用的，“HLA超型或HLA家族”描述了基于共有的肽结合特异性而分组的HLA分子组。对携带某些氨基酸基序的肽共有某些相似的结合亲和力的HLA I类分子被分组为这样的HLA超型。术语HLA超家族、HLA超型家族、HLA家族和HLA xx样分子(其中“xx”表示特定的HLA类型)是同义词。
在两个或更多个肽序列或抗原片段的语境中，术语“相同”或百分比“同一性”是指当在比较窗口上针对最大对应度进行比较和比对时，如使用序列比较算法或通过手动比对和目视检查所测量的，两个或更多个序列或子序列是相同的或具有特定百分比的相同的氨基酸残基。
“免疫原性”肽或“免疫原性”表位或“肽表位”是包含等位基因特异性基序的肽，这使得该肽将结合HLA分子并且诱导细胞介导的应答或体液应答，例如，细胞毒性T淋巴细胞(CTL)、辅助性T淋巴细胞(HTL)和/或B淋巴细胞应答。因此，本文所述的免疫原性肽能够与适当的HLA分子结合，然后诱导针对肽的CTL(细胞毒性)应答或HTL(和体液)应答。
如本文所用的，“嵌合抗原受体”或“CAR”是指抗原结合蛋白，其包括免疫球蛋白抗原结合域(例如免疫球蛋白可变域)和T细胞受体(TCR)恒定域。如本文所用的，TCR多肽的“恒定域”包括膜近端TCR恒定域，并且还可以包括TCR跨膜域和/或TCR胞质尾部。例如，在一些实施方案中，CAR为二聚体，其包括：包含与TCR-β恒定域连接的免疫球蛋白重链可变域的第一多肽，以及包含与TCRα恒定域连接的免疫球蛋白轻链可变域(例如，κ或λ可变域)的第二多肽。在一些实施方案中，CAR为二聚体，其包括：包含与TCRα恒定域连接的免疫球蛋白重链可变域的第一多肽，以及包含与TCRβ恒定域连接的免疫球蛋白轻链可变域(例如，κ或λ可变域)的第二多肽。
短语“分离的”或“生物学纯的”是指这样的材料，其实质上或基本上不含在其天然状态下被发现时通常伴随该材料的组分。因此，本文所述的分离的肽不含有在其原位环境中通常与该肽关联的一些或全部物质。“分离的”表位是指不包括衍生出该表位的抗原的全序列的表位。通常，“分离的”表位不会在其上附接有导致序列在天然序列的整个长度上具有100％同一性的其它氨基酸残基。天然序列可以是诸如衍生出表位的肿瘤相关抗原的序列。因此，术语“分离的”意指将材料从其原始环境(例如，如果其为天然存在的，则为天然环境)中移出。例如，存在于活动物中的天然存在的多核苷酸或肽不是分离的，但从天然系统中的一些或全部共存物质中分离出的相同的多核苷酸或肽是分离的。这样的多核苷酸可以是载体的一部分，并且/或者这样的多核苷酸或肽可以是组合物的一部分，并且仍然是“分离的”，因为这样的载体或组合物不是其天然环境的一部分。分离的RNA分子包括本文所述的DNA分子的体内或体外RNA转录物，并且还包括以合成方式产生的这类分子。
“主要组织相容性复合体”或“MHC”是在控制导致生理免疫应答的细胞相互作用中起作用的基因簇。在人类中，MHC复合体也被称为人白细胞抗原(HLA)复合体。关于MHC和HLA复合体的详细描述，参见Paul，FUNDAMENTAL IMMUNOLOGY,第3版,Raven Press,New York(1993)。
“天然”或“野生型”序列是指在自然界中发现的序列。这样的序列本质上可以包含更长的序列。
“T细胞表位”应被理解为意指肽序列，其可以以呈递肽的MHC分子或MHC复合体的形式被MHC I类或II类分子结合，并随后以这种形式分别被细胞毒性T淋巴细胞或T辅助细胞识别并结合。
“受体”应被理解为意指能够结合配体的生物分子或分子分组。受体可以用来在细胞、细胞形成或生物体中传递信息。受体包含至少一个受体单元，例如，其中每个受体单元可以由蛋白质分子组成。受体具有与配体的结构互补的结构，并且可以作为结合配偶体与配体复合。具体通过配体在细胞表面上复合后受体的构象变化来传递信息。在一些实施方案中，受体应被理解为尤其是指能够与配体(特别是合适长度的肽或肽片段)形成受体/配体复合体的MHC I类和II类的蛋白质。
“配体”应被理解为意指具有与受体的结构互补的结构并且能够与该受体形成复合体的分子。在一些实施方案中，配体应被理解为意指在其氨基酸序列中具有合适长度和合适结合基序的肽或肽片段，以使得肽或肽片段能够与MHC I类或MHC II类的蛋白质形成复合体。
在一些实施方案中，“受体/配体复合体”还应被理解为意指“受体/肽复合体”或“受体/肽片段复合体”，其包括呈递肽或肽片段的MHC I类或II类分子。
“主要组织相容性复合体(MHC)的蛋白质或分子”、“MHC分子”、“MHC蛋白”或“HLA蛋白”应被理解为意指这样的蛋白质，其能够结合由蛋白质抗原的蛋白质水解裂解所产生的肽并且代表潜在的淋巴细胞表位(例如，T细胞表位和B细胞表位)，从而将其转运到细胞表面并在那里将其呈递给特定细胞，特别是细胞毒性T淋巴细胞、T辅助细胞或B细胞。基因组中的主要组织相容性复合体包含遗传区域，其在细胞表面上表达的基因产物对于结合和呈递内源性和/或外源性抗原至关重要，并且因此用于调节免疫过程。主要组织相容性复合体被分为编码不同蛋白质的两个基因分组，即MHC I类分子和MHC II类分子。这两种MHC类别的细胞生物学和表达模式适应于这些不同的作用。
术语“肽”和“肽表位”在本说明书中可以与“寡肽”互换使用，是指通常通过相邻氨基酸残基的α-氨基和羧基之间的肽键彼此连接的一系列残基。
“合成肽”是指从非天然来源中获得的肽，例如是人造的。可以使用诸如化学合成或重组DNA技术等方法产生这类肽。“合成肽”包括“融合蛋白”。
“PanDR结合”肽、“PanDR结合表位”是结合多于一种HLA II类DR分子的分子家族的成员。
“药学上可接受的”是指通常无毒、惰性和/或生理学相容的组合物或组合物组分。
“药用赋形剂”或“赋形剂”包括诸如佐剂、载体、pH调节剂和缓冲剂、张度调节剂、润湿剂、防腐剂等材料。“药用赋形剂”为药学上可接受的赋形剂。
术语“基序”是指所限定长度的氨基酸序列中的残基模式，例如，长度小于约15个氨基酸残基或长度小于约13个氨基酸残基的肽，例如，对于I类HLA基序，具有约8至约13个(例如，8、9、10、11、12或13个)氨基酸残基，而对于II类HLA基序，具有约6至约25个(例如，6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25个)氨基酸残基，其被特定的HLA分子所识别。对于由给定的人HLA等位基因编码的每种HLA蛋白，基序通常是不同的。这些基序的一级和二级锚定残基的模式不同。在一些实施方案中，MHC I类基序识别长度为9、10或11个氨基酸残基的肽。
“超基序”是由两个或更多个HLA等位基因编码的HLA分子所共有的肽结合特异性。在一些实施方案中，本文所述的带有超基序的肽被两种或更多种HLA抗原以高或中等亲和力(如本文所定义的)识别。
如本文所用的，术语“天然存在的”是指对象可以在自然界中发现的事实。例如，存在于生物体(包括病毒)中并且可以从自然界的来源中分离并且在实验室中没有被人工有意修饰的肽或核酸是天然存在的。
根据本发明，术语“疫苗”涉及在施用后诱导免疫应答(例如细胞或体液免疫应答)的药物制品(药物组合物)或产品，其识别并攻击病原体或病变细胞，如癌细胞。疫苗可以用于预防或治疗疾病。术语“个体化癌症疫苗”或“个性化癌症疫苗”涉及特定癌症患者，并且意指癌症疫苗适应于个体癌症患者的需要或特殊情况。
“保护性免疫应答”或“治疗性免疫应答”是指针对来源于致病性抗原(例如，肿瘤抗原)的抗原的CTL和/或HTL应答，其以某种方式阻止或至少部分地阻止疾病症状、副作用或进展。免疫应答还可以包括通过刺激辅助T细胞促进的抗体应答。
“抗原加工”或“加工”是指将多肽或抗原降解成加工产物(该加工产物是所述多肽或抗原的片段(例如，多肽降解成肽))以及将这些片段中的一个或多个(例如，经由结合)与MHC分子缔合以供由细胞(例如，抗原呈递细胞)呈递给特定T细胞。
“抗原呈递细胞”(APC)是在其细胞表面上呈递与MHC分子关联的蛋白质抗原的肽片段的细胞。一些APC可以激活抗原特异性T细胞。专职抗原呈递细胞通过吞噬作用或通过受体介导的内吞作用非常有效地内化抗原，随后在其膜上展示与II类MHC分子结合的抗原片段。T细胞识别抗原呈递细胞膜上的抗原-II类MHC分子复合体并与其相互作用。随后由抗原呈递细胞产生其它共刺激信号，从而导致T细胞的活化。共刺激分子的表达是专职抗原呈递细胞的定义性特征。
专职抗原呈递细胞的主要类型是树突细胞，其具有最广泛的抗原呈递范围，并且可能是最重要的抗原呈递细胞，还有巨噬细胞、B细胞和某些活化的上皮细胞。
树突细胞(DC)是经由MHC II类和I类抗原呈递途径将外周组织中捕获的抗原呈递给T细胞的白细胞群体。众所周知，树突细胞是免疫应答的有效诱导物，并且这些细胞的活化是诱导抗肿瘤免疫的关键步骤。
树突细胞方便地分类为“未成熟的”和“成熟的”细胞，其可以用作区分两种充分表征的表型的简单方法。然而，这种命名法不应被解释为排除所有可能的中间分化阶段。
未成熟的树突细胞被表征为具有高抗原摄取和加工能力的抗原呈递细胞，其与Fey受体和甘露糖受体的高表达相关。成熟表型的特征通常是这些标志物的较低表达以及负责T细胞活化的细胞表面分子如I类和II类MHC、粘附分子(例如，CD54和CD11)以及共刺激分子(例如，CD40、CD80、CD86和4-1 BB)的高表达。
术语“残基”是指通过酰胺键或酰胺键模拟物或编码氨基酸或氨基酸模拟物的核酸(DNA或RNA)掺入肽或蛋白质中的氨基酸残基或氨基酸模拟残基。
用于描述肽或蛋白质的命名法遵循常规实践，其中氨基基团呈现于每个氨基酸残基的左侧(氨基端或N-末端)且羧基基团呈现于右侧(羧基端或C-末端)。当在肽表位中提及氨基酸残基位置时，在氨基至羧基方向上对氨基酸残基进行编号，其中1位是位于表位或表位可能是其一部分的肽或蛋白质的氨基末端的残基。
在代表本发明所选择的具体实施方案的通式中，除非另有说明，否则氨基端和羧基端基团(尽管没有具体显示)是它们在生理pH值下呈现的形式。在氨基酸结构式中，每个残基通常用标准的三字母或单字母命名表示。氨基酸残基的L-形式由大写单字母或首字母大写的三字母符号表示，而具有D-形式的那些氨基酸残基的D-形式由小写单字母或小写三字母符号表示。然而，当使用没有大写字母的三字母符号或全名时，它们也可以指L氨基酸残基。甘氨酸没有不对称碳原子，并简称为“Gly”或“G”。本文所述的肽的氨基酸序列通常使用标准单字母符号表示。(A，丙氨酸；C，半胱氨酸；D，天冬氨酸；E，谷氨酸；F，苯丙氨酸；G，甘氨酸；H，组氨酸；I，异亮氨酸；K，赖氨酸；L，亮氨酸；M，甲硫氨酸；N，天冬酰胺；P，脯氨酸；Q，谷氨酰胺；R，精氨酸；S，丝氨酸；T，苏氨酸；V，缬氨酸；W，色氨酸；Y，酪氨酸)。
术语“多核苷酸”和“核酸”在本文中可以互换使用，并且指任何长度的核苷酸聚合物，包括DNA和RNA(例如，mRNA)。核苷酸可以是脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、修饰的核苷酸或碱基和/或它们的类似物，或可以通过DNA或RNA聚合酶掺入聚合物中的任何底物。在一些实施方案中，多核苷酸和核酸可以是体外转录的mRNA。在一些实施方案中，施用的多核苷酸是mRNA。
在两个或更多个核酸或多肽的语境中，术语“相同”或百分比“同一性”是指当针对最大对应度进行比较和比对(如果必要，引入空位)时，两个或更多个序列或子序列是相同的或具有特定百分比的相同核苷酸或氨基酸残基，不考虑任何保守氨基酸置换作为序列同一性的一部分。可以使用序列比较软件或算法或通过目视检查来测量百分比同一性。可用来获得氨基酸或核苷酸序列比对的各种算法和软件是本领域公知的。这些包括但不限于BLAST、ALIGN、Megalign、BestFit、GCG Wisconsin Package及其变化形式。在一些实施方案中，本文所述的两种核酸或多肽基本上相同，意指当针对最大对应度进行比较和比对时，如使用序列比较算法或通过目视检查所测量的，它们具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％并且在一些实施方案中具有至少95％、96％、97％、98％、99％的核苷酸或氨基酸残基同一性。在一些实施方案中，在长度为至少约10、至少约20、至少约40-60个残基、至少约60-80个残基或其间任何整数值个残基的序列区域中存在同一性。在一些实施方案中，同一性存在于长于60-80个残基如至少约80-100个残基的区域中，并且在一些实施方案中，该序列在所比较的序列的全长，如核苷酸序列的编码区上基本相同。
“保守氨基酸置换”是其中一个氨基酸残基被另一个具有相似侧链的氨基酸残基替代的氨基酸置换。本领域已经定义了具有相似侧链的氨基酸残基家族，包括碱性侧链(例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如，天冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷的极性侧链(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非极性侧链(例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、β-分支侧链(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳香侧链(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。例如，用苯丙氨酸置换酪氨酸是保守置换。鉴定不消除肽功能的核苷酸和氨基酸保守置换的方法是本领域公知的。
如本文所用的术语“载体”意指构建体，其能够在宿主细胞中递送并通常表达一种或多种感兴趣的基因或序列。载体的实例包括但不限于病毒载体、裸DNA或RNA表达载体、质粒、粘粒或噬菌体载体、与阳离子缩合剂相关的DNA或RNA表达载体，以及包封在脂质体中的DNA或RNA表达载体。
“分离的”多肽、抗体、多核苷酸、载体、细胞或组合物是未在自然界中发现的形式的多肽、抗体、多核苷酸、载体、细胞或组合物。分离的多肽、抗体、多核苷酸、载体、细胞或组合物包括已经纯化至其不再是在自然界中发现的形式的程度的多肽、抗体、多核苷酸、载体、细胞或组合物。在一些实施方案中，分离的多肽、抗体、多核苷酸、载体、细胞或组合物是基本上纯的。在一个实施方案中，“分离的多核苷酸”涵盖包含在PCR或定量PCR反应中扩增的多核苷酸的PCR或定量PCR反应。
如本文所用的术语“基本上纯的”是指至少50％纯(即，不含污染物)、至少90％纯、至少95％纯、至少98％纯或至少99％纯的物质。
术语“受试者”是指任何动物(例如哺乳动物)，包括但不限于人、非人灵长类动物、犬科动物、猫科动物、啮齿动物等，其将是特定治疗的接受者。通常，在提到人类受试者时，术语“受试者”和“患者”在本文中可互换使用。
术语“有效量”或“治疗有效量”或“治疗效果”是指对于“治疗”受试者或哺乳动物的疾病或病症有效的治疗剂的量。治疗有效量的药物具有治疗效果，因此可以预防疾病或病症的发展；减缓疾病或病症的发展；减缓疾病或病症的进展；在一定程度上缓解与疾病或病症相关的一种或多种症状；降低发病率和死亡率；提高生活质量；或这些效果的组合。
术语“治疗”或“缓解”是指：1)治愈、减缓、减轻经诊断的病理状况或病症的症状，和/或中止该病理状况或病症的进展的治疗措施；和2)预防或减缓目标病理状况或病症的发展的预防性或防范性措施。因此，需要治疗的受试者包括已经患有该病症的受试者；易于患该病症的受试者；以及要预防该病症的受试者。
除非上下文另有明确规定，否则如说明书和权利要求书中所使用的，单数形式“一个”、“一种”和“该”包括复数形式。
应当理解，诸如“包含”等术语可以具有美国专利法中赋予它的含义；例如，该术语可以意指“包括”、“含有”等；而诸如“基本上由......组成”和“基本由......组成”的术语具有美国专利法中赋予它们的含义，例如，其允许有未明确引述的元素，但排除现有技术中发现的或影响本发明的基本特征或新颖特征的元素。本文中的任何内容均不作为承诺。
在诸如“A和/或B”的短语中使用的术语“和/或”在本文中旨在包括A和B两者；A或B；A(单独)；和B(单独)。同样地，在诸如“A、B和/或C”的短语中使用的术语“和/或”旨在包含以下实施方案中的每一个：A、B和C；A、B或C；A或C；A或B；B或C；A和C；A和B；B和C；A(单独)；B(单独)；和C(单独)。
II.在癌细胞中表达的非突变蛋白质抗原
申请人已发现由以下基因编码的由癌细胞表达的抗原：ERVH-2基质蛋白、ERVH-2gag、ERVH48-1外壳蛋白、ERVH48-1合胞素、ERVE-4逆转录酶、ERVK-5 gag、env、pol蛋白和ERVI-1包膜蛋白。
申请人已发现由以下基因编码的由癌症表达的抗原：TYR、MAGEC1、MAGEA10、MAGEB17、MAGEA4、MABEB16、MAGEA1、MAGEA8、MAGEB4、CT45A5、ALPPL2、MMP13、CTAG1B、DCT、CLDN6、MLANA、AFP、DKK4、ASCL2、GAGE1、GAGE10、SLC45A2、PAGE5、PAGE2和PMEL。
申请人已发现由以下基因编码的由癌症表达的抗原：HPV-16、E6、HPV-16 E7、EBVLF2、EBV BALF5、EBV RPMS1、EBV A73、EBV BALF4、EBV BALF3和EBV BARF0。
非突变蛋白质表位多肽
在各方面，本发明提供了分离的肽，其包含在癌细胞中表达的非突变蛋白质表位。在一些实施方案中，该非突变蛋白质表位是逆转录病毒抗原。在一些实施方案中，该非突变蛋白质表位是非突变的过表达的抗原。在一些实施方案中，该非突变蛋白质表位是病毒抗原。
在各方面，本发明提供了分离的肽，其包含来自表1-6的肽。术语“肽”在本说明书中用来指定通常通过相邻氨基酸的α-氨基与羧基之间的肽键彼此连接的一系列残基，通常为L-氨基酸。类似地，术语“多肽”在本说明书中用来指定通常通过相邻氨基酸的α-氨基与羧基之间的肽键彼此连接的一系列残基，例如L-氨基酸。多肽或肽可以是多种长度，其呈中性(不带电荷)形式或盐形式，并且不含诸如糖基化、侧链氧化或磷酸化等修饰，或者含有这些修饰，条件是该修饰不会破坏本文所述的多肽的生物活性。
在一些实施方案中，使用测序方法来鉴定肿瘤特异性表位。根据本发明可以使用任何合适的测序方法，例如，下一代测序(NGS)技术。第三代测序方法可能在未来取代NGS技术以加速该方法的测序步骤。为了阐明的目的：在本发明上下文中的术语“下一代测序”或“NGS”意指与被称为Sanger化学法的“常规”测序方法相比的所有新型高通量测序技术，其通过将整个基因组分成小块，沿整个基因组平行随机读取核酸模板。这类NGS技术(也称为大规模平行测序技术)能够在非常短的时间内，例如1-2周内，例如1-7天内或少于24个小时内，提供全基因组、外显子组、转录组(基因组的所有转录序列)或甲基化组(基因组的所有甲基化序列)的核酸序列信息，并且原则上允许单细胞测序方法。可商购获得的或文献中提到的多个NGS平台可以在本发明的背景中使用，例如，在WO 2012/159643中详细描述的那些NGS平台。
在某些实施方案中，本文所述的非突变蛋白质表位肽分子可以包含但不限于约5、约6、约7、约8、约9、约10、约11、约12、约13、约14、约15、约16、约17、约18、约19、约20、约21、约22、约23、约24、约25、约26、约27、约28、约29、约30、约31、约32、约33、约34、约35、约36、约37、约38、约39、约40、约41、约42、约43、约44、约45、约46、约47、约48、约49、约50、约60、约70、约80、约90、约100、约110、约120个或更多个氨基酸残基以及其中可得出的任何范围。在具体的实施方案中，非突变蛋白质表位肽分子等于或少于100个氨基酸。
在一些实施方案中，本文所述的MHC I类的非突变蛋白质表位肽和多肽的长度为13个或更少的残基，并且通常由约8至约11个残基，尤其是9或10个残基组成。在一些实施方案中，本文所述的MHC II类的非突变蛋白质表位肽和多肽的长度为9-24个残基。
可以用几种方式设计较长的非突变蛋白质表位肽。在一些实施方案中，当HLA结合肽被预测或已知时，较长的非突变蛋白质表位肽可以由以下组成：(1)向每个相应肽的N-末端及C-末端延伸2-5个氨基酸的单个结合肽；或(2)一些或所有结合肽与每个结合肽的延伸序列的串接。在一些实施方案中，推测使用较长的肽允许患者细胞进行内源性加工，并且可以导致更有效的抗原呈递和T细胞应答诱导。在一些实施方案中，可以使用两种或更多种肽，其中肽重叠并铺在长的非突变蛋白质表位肽上。
在一些实施方案中，非突变蛋白质表位肽和多肽结合HLA蛋白(例如，HLA I类或HLA II类)。在具体的实施方案中，非突变蛋白质表位肽或多肽的IC50至少低于5000nM、至少低于500nM、至少低于100nM、至少低于50nM或更低。
在一些实施方案中，本文所述的非突变蛋白质表位肽可以包括诸如本领域公知的那些载体，例如甲状腺球蛋白、诸如人血清白蛋白的白蛋白、破伤风类毒素、聚氨基酸残基(诸如聚L-赖氨酸、聚L-谷氨酸)、流感病毒蛋白、乙型肝炎病毒核心蛋白等。
在一些实施方案中，本文所述的非突变蛋白质表位肽可以通过末端-NH2酰化(例如通过烷酰基(C1-C20)或硫代羟乙酰基乙酰化)、末端羧基酰胺化(例如氨、甲胺等)进行修饰。在一些实施方案中，这些修饰可以提供用于与支持体或其它分子连接的位点。
在一些实施方案中，本文所述的非突变蛋白质表位肽可以包含修饰，诸如但不限于糖基化、侧链氧化、生物素化、磷酸化、添加表面活性材料(例如脂质)，或可以进行化学修饰，例如乙酰化等。此外，肽中的键可以是除了肽键之外的键，例如共价键、酯键或醚键、二硫键、氢键、离子键等。
在一些实施方案中，本文所述的非突变蛋白质表位肽可以包含置换以改变所得肽的物理性质(例如，稳定性或溶解性)。例如，可以通过用α-氨基丁酸(“B”)置换半胱氨酸(C)来修饰非突变蛋白质表位肽。由于其化学性质，半胱氨酸具有形成二硫键的倾向，并且在结构上充分改变肽以降低结合能力。用α-氨基丁酸置换C不仅可以缓解这个问题，而且在某些情况下实际上改善了结合和交叉结合能力。用α-氨基丁酸置换半胱氨酸可以发生在非突变蛋白质表位肽的任何残基上，例如在肽内表位或类似物的锚定或非锚定位置或肽的其它位置上。
在一些实施方案中，本文所述的非突变蛋白质表位肽可以包含氨基酸模拟物或非天然氨基酸残基，例如D-或L-萘丙氨酸；D-或L-苯基甘氨酸；D-或L-2-噻吩基丙氨酸；D-或L-1、-2、3-或4-芘基丙氨酸；D-或L-3噻吩基丙氨酸；D-或L-(2-吡啶基)-丙氨酸；D-或L-(3-吡啶基)-丙氨酸；D-或L-(2-吡嗪基)-丙氨酸；D-或L-(4-异丙基)-苯基甘氨酸；D-(三氟甲基)-苯基甘氨酸；D-(三氟-甲基)-苯丙氨酸；D-ρ-氟苯丙氨酸；D-或L-ρ-联苯基-苯丙氨酸；D-或L-ρ-甲氧基联苯基苯丙氨酸；D-或L-2-吲哚(烯丙基)丙氨酸；以及D-或L-烷基丙氨酸，其中烷基可以是取代或未取代的甲基、乙基、丙基、己基、丁基、戊基、异丙基、异丁基、仲异基(sec-isotyl)、异戊基或非酸性氨基酸残基。非天然氨基酸的芳环包括例如噻唑基、噻吩基、吡唑基、苯并咪唑基、萘基、呋喃基、吡咯基和吡啶基芳环。具有各种氨基酸模拟物或非天然氨基酸残基的修饰肽是特别有用的，因为它们倾向于显示增加的体内稳定性。这样的肽还可以具有改善的保质期或制备性质。
可以用多种方式测定肽稳定性。例如，肽酶和各种生物介质如人血浆和血清已经用于测定稳定性。参见，例如，Verhoef等人,Eur.J.Drug Metab.Pharmacokinetics 11:291(1986)。使用25％人血清(v/v)测定方便地测定本文所述肽的半衰期。方案如下：将合并的人血清(AB型，非热灭活的)在使用前通过离心进行破坏。然后用RPMI-1640或另一种合适的组织培养基将血清稀释至25％。以预定的时间间隔，将少量反应溶液取出并添加至6％三氯乙酸(TCA)水溶液或乙醇中。将混浊的反应样品冷却(4℃)15分钟，然后进行旋转以使沉淀的血清蛋白成团。然后使用稳定性特异性色谱条件，通过反相HPLC确定肽的存在。
在一些实施方案中，本文所述的非突变蛋白质表位肽可以是溶液、冻干的或可以是晶体形式。
在一些实施方案中，本文所述的非突变蛋白质表位肽可以通过重组DNA技术或化学合成经由合成而制备，或者可以从诸如原始肿瘤或病原生物体的天然来源中分离。表位可以单独合成或直接或间接地连接在肽中。尽管本文所述的非突变蛋白质表位肽基本上不含其它天然存在的宿主细胞蛋白质及其片段，但在一些实施方案中，肽可以通过合成进行缀合以与天然片段或颗粒连接。
在一些实施方案中，本文所述的非突变蛋白质表位肽可以用很多种方式进行制备。在一些实施方案中，可以根据常规技术在溶液中或在固体支持体上合成肽。各种自动合成器可商购获得，并可根据已知方案进行使用。(参见，例如，Stewart&Young,SOLID PHASEPEPTIDE SYNTHESIS,2D.ED.,Pierce Chemical Co.,1984)。此外，可以使用化学连接将各个肽进行连接，以产生仍然在本发明范围内的较大的肽。
或者，可以使用重组DNA技术，其中将插入表达载体中的编码肽的核苷酸序列转化或转染到合适的宿主细胞中，并在适于表达的条件下培养。这些方法通常是本领域已知的，如在Sambrook等人,MOLECULAR CLONING,A LABORATORY MANUAL,Cold Spring HarborPress,Cold Spring Harbor,N.Y.(1989)中所概述的。因此，包含一个或多个本文所述的表位或由其组成的重组肽可以用于呈递合适的T细胞表位。
在一个方面，本文所述的发明还提供了包含一种、至少两种或多于两种非突变蛋白质表位肽的组合物。在一些实施方案中，本文所述的组合物含有至少两种不同的肽。在一些实施方案中，所述至少两种不同的肽来源于相同的多肽。不同的多肽是指肽的长度不同、氨基酸序列不同或两者均不同。所述肽来源于已知或已被发现含有肿瘤特异性表位的任何多肽。
非突变蛋白质表位多核苷酸
编码本文所述的每种肽的多核苷酸也是本发明的一部分。如本领域普通技术人员所理解的，由于遗传密码的冗余，多种核酸将编码相同的肽。这些核酸中的每一种都落入本发明的范围内。本发明的该实施方案包含DNA和RNA，例如mRNA，并且在某些实施方案中，包含DNA和RNA的组合。在一个实施方案中，该mRNA是自扩增mRNA。(Brito等人,Adv.Genet.2015；89:179-233)。应当理解，编码本文所述肽的任何多核苷酸都落入本发明的范围内。
术语“RNA”包括并且在一些实施方案中涉及“mRNA”。术语“mRNA”意指“信使RNA”，并且涉及通过使用DNA模板而产生的并编码肽或多肽的“转录物”。通常，mRNA包含5’-UTR、蛋白质编码区和3’-UTR。mRNA在细胞中和在体外仅具有有限的半衰期。在一个实施方案中，该mRNA是自扩增mRNA。在本发明的上下文中，mRNA可以通过DNA模板的体外转录生成。体外转录方法是技术人员已知的。例如，多种体外转录试剂盒可商购获得。
可以根据需要改变RNA的稳定性和翻译效率。例如，RNA可以被稳定化，并且其翻译通过一种或多种具有稳定作用和/或提高RNA翻译效率的修饰而增加。例如，在PCT/EP2006/009448中描述了这样的修饰，该文献通过引用并入本文。为了增加根据本发明使用的RNA的表达，可以在编码区(即编码表达的肽或蛋白质的序列)内修饰该RNA，而不改变表达的肽或蛋白质的序列，从而增加GC含量以增加mRNA稳定性并进行密码子优化，从而增强在细胞中的翻译。
在本发明中使用的RNA语境中的术语“修饰”包括对RNA的任何修饰，该修饰在所述RNA中不是天然存在的。在本发明的一个实施方案中，根据本发明使用的RNA不具有未加帽的5’-三磷酸。通过用磷酸酶处理RNA可以除去这种未加帽的5’-三磷酸。根据本发明的RNA可以具有修饰的核糖核苷酸，以增加其稳定性和/或降低细胞毒性。例如，在一个实施方案中，在根据本发明使用的RNA中，用5-甲基胞苷部分地或完全地置换(例如，完全置换)胞苷。可替代地或另外，在一个实施方案中，在根据本发明使用的RNA中，对于，用假尿苷部分地或完全地置换(例如完全置换)尿苷。
在一个实施方案中，术语“修饰”涉及提供具有5’-帽或5’-帽类似物的RNA。术语“5’-帽”是指在mRNA分子的5’-末端上发现的帽结构，并且通常由经由不寻常的5’至5’三磷酸键与mRNA连接的鸟苷核苷酸组成。在一个实施方案中，这种鸟苷在7位上被甲基化。术语“常规5’-帽”是指天然存在的RNA 5’-帽、7-甲基鸟苷帽(m G)。在本发明的上下文中，术语“5’-帽”包括类似于RNA帽结构的5’-帽类似物，并且被修饰为具有稳定RNA和/或增强体内和/或细胞内的RNA翻译(如果与RNA附接)的能力。
在某些实施方案中，将编码非突变蛋白质表位的mRNA施用于有需要的受试者。在一个实施方案中，本发明提供包含修饰的核苷的RNA、寡核糖核苷酸和多核糖核苷酸分子，包含修饰的核苷的基因治疗载体，包含修饰的基因治疗方法和核苷的基因转录沉默方法。在一个实施方案中，待施用的mRNA包含至少一种修饰的核苷。
编码本文所述的肽的多核苷酸可以通过化学技术合成，例如，Matteucci等人,J.Am.Chem.Soc.103:3185(1981)的磷酸三酯方法。编码包含类似物或由类似物组成的肽的多核苷酸可以简单地通过用合适的和期望的核酸碱基置换编码天然表位的那些碱基来制备。
适用于产生和施用本文所述的非突变蛋白质表位肽的大量载体和宿主系统是本领域技术人员已知的，并且是可商购获得的。举例来说，提供以下载体。细菌：pQE70、pQE60、pQE-9(Qiagen)、pBS、pD10、phagescript、psiX174、pBluescript SK、pbsks、pNH8A、pNH16a、pNH18A、pNH46A(Stratagene)；ptrc99a、pKK223-3、pKK233-3、pDR540、pRIT5(Pharmacia)；pCR(Invitrogen)。真核生物：pWLNEO、pSV2CAT、pOG44、pXT1、pSG(Stratagene pSVK3、pBPV、pMSG、pSVL(Pharmacia)；p75.6(Valentis)；pCEP(Invitrogen)；pCEI(Epimmune)。然而，可以使用其它任何质粒或载体，只要它在宿主中是可复制的且可存活的。
作为适当宿主的代表性实例，可以提及：细菌细胞，如大肠杆菌(E.coli)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)和假单胞菌属(Pseudomonas)、链霉菌属(Streptomyces)和葡萄球菌属(Staphylococcus)内的各个种；真菌细胞，如酵母；昆虫细胞，如果蝇和Sf9；动物细胞，如在Gluzman,Cell 23:175(1981)中描述的COS-7猴肾成纤维细胞系，以及能够表达相容性载体的其它细胞系，例如C127、3T3、CHO、HeLa和BHK细胞系或鲍斯黑素瘤(Bowes melanoma)；植物细胞等。根据本文的教导，适当宿主的选择被认为在本领域技术人员的能力范围内。
因此，本公开还涉及可用于产生和施用本文所述的非突变蛋白质表位肽的载体和表达载体，以及包含这类载体的宿主细胞。
用载体对宿主细胞进行基因工程化(转导或转化或转染)，所述载体可以是例如克隆载体或表达载体。该载体可以是，例如，质粒、病毒小体、噬菌体等形式。工程化宿主细胞可以在适当改变的常规营养培养基中培养以用于激活启动子、选择转化子或扩增多核苷酸。诸如温度、pH等培养条件是先前与被选择用于表达的宿主细胞一起使用的那些条件，并且对于普通技术人员是显而易见的。
为了表达本文所述的非突变蛋白质表位肽，将向编码序列提供可操作地连接的起始及终止密码子、启动子及终止子区，并且在一些实施方案中，提供复制系统，以提供用于在所需的细胞宿主中表达的表达载体。例如，在含有适当的限制性酶切位点的质粒中提供与细菌宿主相容的启动子序列，以供插入期望的编码序列。将得到的表达载体转化到合适的细菌宿主中。
通常，重组表达载体将包括复制起点及允许转化宿主细胞的选择性标记，例如大肠杆菌(E.coli)和酿酒酵母(S.cerevisiae)TRP1基因的氨苄青霉素抗性基因以及用来引导下游结构序列的转录的来源于高表达基因的启动子。这样的启动子可以来源于编码糖酵解酶如3-磷酸甘油酸激酶(PGK)、酸性磷酸酶或热休克蛋白等的操纵子。异源结构序列在适当的阶段与翻译起始及终止序列，以及在一些实施方案中，与能够指导翻译的蛋白质分泌至周质空间或细胞外培养基中的前导序列一起组装。任选地，异源序列可以编码包括赋予所需特性(例如，表达的重组产物的稳定或简化纯化)的N-末端标识肽的融合蛋白。
也可以使用采用合适的载体和控制序列的酵母、昆虫或哺乳动物细胞宿主。哺乳动物表达系统的实例包括由Gluzman，Cell 23：175(1981)描述的COS-7猴肾成纤维细胞系，以及能够表达相容载体的其它细胞系，例如C127、3T3、CHO、HeLa及BHK细胞系。哺乳动物表达载体将包含复制起点、合适的启动子和增强子以及任何必需的核糖体结合位点、聚腺苷酸化位点、剪接供体及受体位点、转录终止序列和5’侧翼非转录序列。这样的启动子还可以来源于病毒来源，例如人巨细胞病毒(CMV-IE启动子)或1型单纯疱疹病毒(HSV TK启动子)。来源于SV40剪接的核酸序列和聚腺苷酸化位点可以用来提供非转录遗传元件。
编码本文所述的非突变蛋白质表位肽的多核苷酸还可以包含泛素化信号序列，和/或靶向序列，如内质网(ER)信号序列，以促进所得肽向内质网中的移动。
本文所述的多核苷酸可以在人类细胞(例如，免疫细胞，包括树突细胞)中施用和表达。可以使用人类密码子使用表来指导每种氨基酸的密码子选择。这样的多核苷酸包含表位和/或类似物之间的间隔氨基酸残基，诸如上述那些，或可以包含与表位和/或类似物(和/或CTL、HTL及B细胞表位)相邻的天然存在的侧翼序列。
在一些实施方案中，本文所述的非突变蛋白质表位肽也可以通过病毒或细菌载体进行施用/表达。表达载体的实例包括减毒病毒宿主，如牛痘或禽痘。作为该方法的一个例子，牛痘病毒用作载体以表达编码本文所述的非突变蛋白质表位肽的核苷酸序列。用于免疫方案的牛痘载体和方法在例如美国专利4,722,848中描述。另一种载体是BCG(卡介苗(Bacille Calmette Guerin))。在Stover等人,Nature 351:456-460(1991)中描述了BCG载体。根据本文的描述，可用于本文所述非突变蛋白质表位多肽的治疗性施用或免疫的多种其它载体，例如腺病毒和腺相关病毒载体、逆转录病毒载体、伤寒沙门氏菌载体、解毒炭疽毒素载体、仙台病毒载体、痘病毒载体、金丝雀痘载体和禽痘载体等，对本领域技术人员来说将是显而易见的。在一些实施方案中，该载体是修饰的安卡拉牛痘(Vaccinia Ankara(VA))(例如，Bavarian Noridic(MVA-BN))。
载体中可以包含本领域技术人员熟知的标准调节序列以确保在人靶细胞中表达。需要几种载体元件：具有多核苷酸的下游克隆位点的启动子，例如小基因插入；用于有效转录终止的聚腺苷酸化信号；大肠杆菌复制起点；以及大肠杆菌选择性标记(例如氨苄青霉素或卡那霉素抗性)。许多启动子可以用于此目的，例如人巨细胞病毒(hCMV)启动子。关于其它合适的启动子序列，参见，例如,美国专利5,580,859和5,589,466。在一些实施方案中，该启动子是CMV-IE启动子。
本文所述的多核苷酸可以在转录区中包含一个或多个合成或天然存在的内含子。还可以考虑在哺乳动物细胞中包含mRNA稳定序列及用于复制的序列以增加多核苷酸表达。
另外，本文所述的多核苷酸可以包含免疫刺激序列(ISS或CpG)。这些序列可以包含在载体中的多核苷酸编码序列之外，以增强免疫原性。
非突变蛋白质表位结合肽
在某些实施方案中，本发明提供了结合蛋白(例如，抗体或其抗原结合片段)或T细胞受体(TCR)或嵌合抗原受体(CAR)，其能够以高亲和力与非突变蛋白质表位肽:人白细胞抗原(HLA)复合体结合。在一些实施方案中，本发明提供了能够以高亲和力与来源于蛋白质细胞外结构域的非突变蛋白质表位肽结合的CAR。在某些实施方案中，如本文所述的抗原特异性结合蛋白或TCR或CAR包括在天然氨基酸序列中具有一个或多个氨基酸置换、插入或缺失的变异多肽种类，条件是该结合蛋白保留或基本保留其特异性结合功能。氨基酸的保守置换是已知的，并且其可以天然存在或者可以在重组产生结合蛋白或TCR时引入。可以使用本领域已知的诱变方法将氨基酸置换、缺失和添加引入蛋白质中(参见，例如，Sambrook等人,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,3d ed.,Cold Spring Harbor LaboratoryPress,N Y,2001)。可以使用寡核苷酸引导的位点特异性(或片段特异性)诱变程序来提供具有根据期望的置换、缺失或插入而改变的特定密码子的改变的多核苷酸。或者，可以使用随机或饱和诱变技术如丙氨酸扫描诱变、易错聚合酶链反应诱变和寡核苷酸引导的诱变来制备免疫原多肽变体(参见，例如，Sambrook等人，同上)。
本领域技术人员已知的多种标准指示在肽或多肽中的特定位置被置换的氨基酸是否是保守的(或类似的)。例如，类似的氨基酸或保守的氨基酸置换是这样的置换，其中氨基酸残基被具有相似侧链的氨基酸残基替换。类似的氨基酸可包括在以下类别中：具有碱性侧链的氨基酸(例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸)；具有酸性侧链的氨基酸(例如，天冬氨酸、谷氨酸)；具有不带电荷的极性侧链的氨基酸(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸，组氨酸)；具有非极性侧链的氨基酸(例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)；具有β-支链侧链的氨基酸(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)，和具有芳族侧链的氨基酸(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸)。被认为更难分类的脯氨酸与具有脂肪族侧链的氨基酸(例如，亮氨酸、缬氨酸、异亮氨酸和丙氨酸)共有性质。在某些情况下，用谷氨酰胺置换谷氨酸或用天冬酰胺置换天冬氨酸被认为是相似置换，因为谷氨酰胺和天冬酰胺分别是谷氨酸和天冬氨酸的酰胺衍生物。如本领域所理解的，通过将多肽的氨基酸序列及其保守的氨基酸替代物与第二多肽的序列进行比较(例如，使用GENEWORKS、Align、BLAST算法或本文所述及本领域实践的其它算法)来确定两个多肽之间的“相似性”。
在某些实施方案中，非突变蛋白质表位特异性结合蛋白、TCR或CAR能够(a)独立地或在不存在CD8的情况下特异性结合细胞表面上的抗原:HLA复合体。在某些实施方案中，非突变蛋白质表位特异性结合蛋白是T细胞受体(TCR)、嵌合抗原受体或TCR的抗原结合片段，其中任何一种都可以是嵌合的、人源化的或人的。在进一步的实施方案中，TCR的抗原结合片段包含单链TCR(scTCR)。
在某些实施方案中，提供了包含根据任一个上述实施方案的非突变蛋白质表位特异性结合蛋白或高亲和力重组TCR以及药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂的组合物。
例如，可用于分离并纯化重组产生的可溶性TCR的方法可包括从将重组可溶性TCR分泌到培养基中的合适的宿主细胞/载体系统获得上清液，随后使用市售过滤器浓缩该培养基。浓缩后，可将浓缩物施加于单一合适的纯化基质或一系列合适的基质，如亲和基质或离子交换树脂。可以使用一个或多个反相HPLC步骤来进一步纯化重组多肽。当将免疫原从其天然环境中分离时，也可以使用这些纯化方法。用于大规模生产一种或多种本文所述的分离的/重组可溶性TCR的方法包括分批细胞培养，监测并控制该培养以维持适当的培养条件。可溶性TCR的纯化可根据本文所述和本领域已知的方法进行。
III.免疫原性和疫苗组合物
在一个实施方案中，本文提供了一种免疫原性组合物，例如能够产生非突变蛋白质表位特异性应答(例如，体液或细胞介导的免疫应答)的疫苗组合物。在一些实施方案中，该免疫原性组合物包含与本文鉴定的肿瘤特异性非突变蛋白质表位相对应的本文所述的非突变蛋白质表位治疗剂(例如，肽、多核苷酸、TCR、CAR、含有TCR或CAR的细胞、含有多肽的树突细胞、含有多核苷酸的树突细胞、抗体等)。
本领域技术人员能够通过检测例如T细胞的体外产生以及它们的效率和总体存在，某些T细胞对某些肽的增殖、亲和力和扩充，以及T细胞的功能，例如通过分析T细胞的IFN-γ产生或肿瘤杀伤，来选择非突变蛋白质表位治疗剂。随后可以将最有效的肽组合为免疫原性组合物。
在本发明的一个实施方案中，选择不同的非突变蛋白质表位肽和/或多肽，以使得一种免疫原性组合物包含能够与不同MHC分子如不同MHC I类分子缔合的非突变蛋白质表位肽和/或多肽。在一些实施方案中，免疫原性组合物包含能够与最常存在的MHC I类分子缔合的非突变蛋白质表位肽和/或多肽。因此，本文所述的免疫原性组合物包含能够与至少2种、至少3种或至少4种MHC I类或II类分子缔合的不同肽。
在一个实施方案中，本文所述的免疫原性组合物能够引起特异性细胞毒性T细胞应答、特异性辅助T细胞应答或B细胞应答。
在一些实施方案中，本文所述的免疫原性组合物可进一步包含佐剂和/或载体。有用的佐剂和载体的实例在下文给出。组合物中的多肽和/或多核苷酸可以与载体缔合，该载体例如是蛋白质或抗原呈递细胞，例如能够将肽呈递给T细胞或B细胞的树突细胞(DC)。在进一步的实施方案中，DC结合肽用作载体，以将非突变蛋白质表位肽和编码非突变蛋白质表位肽的多核苷酸靶向至树突细胞(Sioud等人,FASEB J 27:3272-3283(2013))。
在实施方案中，非突变蛋白质表位多肽或多核苷酸可以作为含有这类多肽或多核苷酸的抗原呈递细胞(例如，树突细胞)而提供。在其它实施方案中，这类抗原呈递细胞用来刺激用于患者的T细胞。
在一些实施方案中，所述抗原呈递细胞是树突细胞。在相关实施方案中，该树突细胞是用非突变蛋白质表位肽或核酸脉冲的自体树突细胞。该非突变蛋白质表位肽可以是产生适当T细胞应答的任何合适的肽。使用以来自肿瘤相关抗原的肽脉冲的自体树突细胞的T细胞治疗在Murphy等人(1996)The Prostate 29,371-380和Tjua等人(1997)The Prostate32,272-278中公开。在一些实施方案中，该T细胞是CTL。在一些实施方案中，该T细胞是HTL。
因此，本发明的一个实施方案是一种免疫原性组合物，其含有至少一种用一种或多种本文所述非突变蛋白质表位多肽或多核苷酸脉冲或加载的抗原呈递细胞(例如树突细胞)。在实施方案中，这样的APC是自体的(例如，自体树突细胞)。或者，从患者中分离的外周血单核细胞(PBMC)可以离体加载非突变蛋白质表位肽或多核苷酸。在相关实施方案中，将这样的APC或PBMC注射回患者体内。
所述多核苷酸可以是能够转导树突细胞的任何合适的多核苷酸，从而导致非突变蛋白质表位肽的呈递和免疫的诱导。在一个实施方案中，该多核苷酸可以是通过被动加载被细胞摄取的裸DNA。在另一个实施方案中，该多核苷酸是诸如脂质体、病毒样颗粒、质粒或表达载体等递送媒介物的一部分。在另一个实施方案中，通过无载体递送系统，例如高效电穿孔和高速细胞变形，来递送该多核苷酸。在实施方案中，这样的抗原呈递细胞(APC)(例如，树突细胞)或外周血单核细胞(PBMC)用来刺激T细胞(例如，自体T细胞)。在相关实施方案中，该T细胞是CTL。在其它相关的实施方案中，该T细胞是HTL。然后将这样的T细胞注射到患者体内。在一些实施方案中，将CTL注射到患者体内。在一些实施方案中，将HTL注射到患者体内。在一些实施方案中，将CTL和HTL均注射到患者体内。任一治疗剂的施用可以同时或依次且以任何顺序进行。
本文所述的用于治疗性处置的药物组合物(例如免疫原性组合物)旨在用于肠胃外、局部、经鼻、口服或外部施用。在一些实施方案中，本文所述的药物组合物通过肠胃外施用，例如静脉内、皮下、皮内或肌肉内施用。在实施方案中，该组合物可以肿瘤内施用。可以在手术切除部位施用该组合物以诱导对肿瘤的局部免疫应答。在一些实施方案中，本文描述了用于肠胃外施用的组合物，其包含非突变蛋白质表位肽的溶液，并且将免疫原性组合物溶解或悬浮在可接受的载体例如水性载体中。可以使用多种水性载体，例如水、缓冲水、0.9％盐水、0.3％甘氨酸、透明质酸等。这些组合物可以通过常规的公知灭菌技术灭菌，或者可以过滤除菌。所得的水溶液可以被包装以供原样使用，或冻干，在施用前将冻干的制品与无菌溶液合并。该组合物可含有为接近生理条件所需的药学上可接受的辅助性物质，如pH调节剂和缓冲剂、张度调节剂、润湿剂等，例如乙酸钠、乳酸钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙、失水山梨醇单月桂酸酯、三乙醇胺油酸酯等。
本文所述的非突变蛋白质表位肽和多核苷酸在药物制剂中的浓度可以广泛不同，即，按重量计小于约0.1％，通常在或至少约2％至多至20％至50％或更多，并且根据所选的特定给药模式，根据液体体积、粘度等来选择。
本文所述的非突变蛋白质表位肽和多核苷酸也可以经由脂质体施用，该脂质体将肽靶向至特定的细胞组织，如淋巴组织。脂质体也可用于延长肽的半衰期。脂质体包括乳液、泡沫、胶束、不溶性单层、液晶、磷脂分散体、层状层等。在这些制品中，待递送的肽单独地或与结合例如淋巴细胞中普遍存在的受体的分子(诸如与DEC205抗原结合的单克隆抗体)一起或与其它治疗剂或免疫原性组合物一起掺入，作为脂质体的一部分。因此，可以将填充有本文所述的所需肽或多核苷酸的脂质体引导至淋巴细胞的部位，随后该脂质体递送所选的治疗性/免疫原性多肽/多核苷酸组合物。脂质体可以由标准的形成囊泡的脂质形成，该脂质通常包括中性的和带负电荷的磷脂和甾醇，例如胆固醇。通常通过考虑例如脂质体大小、酸不稳定性和脂质体在血流中的稳定性来指导脂质的选择。有多种方法可用于制备脂质体，例如在Szoka等人,Ann.Rev.Biophys.Bioeng.9；467(1980)、美国专利4,235,871、4,501,728、4,501,728、4,837,028和5,019,369中所描述的。
为了靶向免疫细胞，针对所需免疫系统细胞的细胞表面决定簇，将非突变蛋白质表位多肽或多核苷酸掺入脂质体中。含有肽的脂质体悬浮液可以静脉内、局部、外部等施用，其剂量根据给药方式、所递送的多肽或多核苷酸以及所治疗疾病的阶段等而不同。
在一些实施方案中，非突变蛋白质表位多肽和多核苷酸被靶向至树突细胞。在一个实施方案中，使用标志物DEC205、XCR1、CD197、CD80、CD86、CD123、CD209、CD273、CD283、CD289、CD184、CD85h、CD85j、CD85k、CD85d、CD85g、CD85a、TSLP受体或CD1a将非突变蛋白质表位多肽和多核苷酸靶向至树突细胞。
对于固体组合物，可以使用常规或纳米颗粒无毒性固体载体，其包括例如药物级的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、滑石、纤维素、葡萄糖、蔗糖、碳酸镁等。对于口服给药，通过掺入任何常用的赋形剂，如先前列出的那些载体，和通常10％-95％的活性成分，即浓度为25％-75％的一种或多种本文所述的非突变蛋白质表位多肽或多核苷酸，来形成药学上可接受的无毒性组合物。
对于气雾剂给药，非突变蛋白质表位多肽或多核苷酸可以与表面活性剂和推进剂一起以细碎的形式提供。这类试剂的代表是含有6至22个碳原子的脂肪酸如己酸、辛酸、月桂酸、棕榈酸、硬脂酸、亚油酸、亚麻酸、油硬质酸和油酸与肪族多元醇或其环酐形成的酯或偏酯。可以使用混合酯，如混合甘油酯或天然甘油酯。表面活性剂可占组合物的0.1％-20％或0.25％-5％(重量)。组合物的其余部分可以是推进剂。如果需要，也可以包括载体，例如用于鼻内递送的卵磷脂。
用于递送本文所述的非突变蛋白质表位多核苷酸的其它方法也是本领域已知的。例如，核酸可以作为“裸DNA”直接递送。例如，在Wolff等人,Science 247:1465-1468(1990)以及美国专利5,580,859和5,589,466中描述了该方法。核酸也可以使用弹道递送施用，例如，如美国专利5,204,253中所述。可以施用仅由DNA组成的颗粒。或者，可以将DNA附着到颗粒如金颗粒上。
为了治疗或免疫目的，还可以向患者施用编码非突变蛋白质表位肽或肽结合剂的mRNA。在一个实施方案中，该mRNA是自扩增RNA。在进一步的实施方案中，该自扩增RNA是合成脂质纳米颗粒制剂的一部分(Geall等人,Proc Natl Acad Sci U S A.109:14604–14609(2012))。
核酸也可以与阳离子化合物如阳离子脂质复合递送。脂质介导的基因递送方法描述于例如WO 96/18372、WO 93/24640；Mannino&Gould-Fogerite,BioTechniques 6(7):682-691(1988)；美国专利5,279,833；WO 91/06309；及Felgner等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84:7413-7414(1987)。
本文所述的非突变蛋白质表位肽和多肽也可以由减毒病毒如痘苗病毒或禽痘病毒表达。该方法涉及使用痘苗病毒作为载体来表达编码本文所述肽的核苷酸序列。在引入到急性或慢性感染的宿主或未感染的宿主中后，该重组痘苗病毒表达免疫原性肽，从而引发宿主CTL应答。可用于免疫方案的痘苗病毒载体和方法在美国专利4,722,848中描述。另一种载体是BCG(卡介苗(Bacille Calmette Guerin))。Stover等人(Nature 351:456-460(1991))描述了BCG载体。根据本文的描述，可用于本文所述肽的治疗性施用或免疫的多种其它载体对本领域技术人员而言是显而易见的。
佐剂是其与免疫原性组合物的混合物增加或以其它方式改变对治疗剂的免疫应答的任何物质。载体是非突变蛋白质表位多肽或多核苷酸能够与其缔合的支架结构、例如多肽或多糖。任选地，佐剂与本文所述的多肽或多核苷酸共价或非共价缀合。
佐剂增加对抗原的免疫应答的能力通常体现为免疫介导的反应的显著增加或疾病症状的减少。例如，体液免疫的增加可以体现为针对抗原的抗体滴度的显著增加，并且T细胞活性的增加可以体现为增加的细胞增殖或细胞毒性或细胞因子分泌。佐剂还可以改变免疫应答，例如，通过将主要为体液或2型T辅助细胞的应答改变为主要为细胞或1型T辅助细胞的应答。
合适的佐剂是本领域已知的(参见WO2015/095811)，并且包括但不限于聚(I:C)、聚-ICLC、STING激动剂、1018ISS、铝盐、Amplivax、AS15、BCG、CP-870,893、CpG7909、CyaA、dSLIM、GM-CSF、IC30、IC31、咪喹莫特、ImuFact IMP321、IS Patch、ISS、ISCOMATRIX、JuvImmune、LipoVac、MF59、单磷酰脂质A、Montanide IMS 1312、Montanide ISA 206、Montanide ISA 50V、Montanide ISA-51、OK-432、OM-174、OM-197-MP-EC、ONTAK、
Figure BDA0002301078100000431
载体系统、PLG微粒、瑞喹莫德、SRL172、病毒小体和其它病毒样颗粒、YF-17D、VEGF trap、R848、β-葡聚糖、Pam3Cys、Pam3CSK4、衍生自皂苷的Aquila的QS21刺激子(Aquila Biotech,Worcester,Mass.,USA)、分枝杆菌提取物和合成细菌细胞壁模拟物以及其它专有佐剂，如Ribi的Detox.Quil或Superfos。佐剂还包括不完全弗氏佐剂或GM-CSF。先前已经描述了几种对树突细胞特异性的免疫佐剂(Dupuis M等人,Cell Immunol.1998；186(1):18-27；Allison A C；Dev Biol Stand.1998；92:3-11)(Mosca等人,Frontiers in Bioscience,2007；12:4050-4060)(Gamvrellis等人,Immunol&Cell Biol.2004；82:506-516)。也可以使用细胞因子。几种细胞因子与影响树突细胞向淋巴组织迁移(例如TNF-α)、加速树突细胞成熟为T淋巴细胞的有效抗原呈递细胞(例如，GM-CSF、PGE1、PGE2、IL-1、IL-1b、IL-4、IL-6和CD40L)(美国专利5,849,589，其通过引用整体并入本文)以及充当免疫佐剂(例如，IL-12)(Gabrilovich D I等人,J Immunother Emphasis Tumor Immunol.1996(6):414-418)直接相关。
还报道了CpG免疫刺激性寡核苷酸在疫苗环境中增强佐剂的效果。不受理论束缚，CpG寡核苷酸通过经由Toll样受体(TLR)(主要是TLR9)激活先天(非适应性)免疫系统起作用。CpG触发的TLR9活化增强对多种抗原的抗原特异性体液和细胞应答，该抗原包括肽或蛋白质抗原、活病毒或杀死的病毒、树突细胞疫苗、自体细胞疫苗和预防性及治疗性疫苗二者中的多糖缀合物。重要的是，它增强了树突细胞的成熟和分化，导致增强的TH1细胞的活化和强细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的生成，即使在不存在CD4 T细胞帮助的情况下。即使在诸如明矾或不完全弗氏佐剂(IFA)等通常促进TH2偏倚的疫苗佐剂的存在下，由TLR9刺激所诱导的TH1偏倚也得以维持。当与其它佐剂一起配制或共同施用或在制剂如微粒、纳米颗粒、脂质乳剂或类似制剂中时，CpG寡核苷酸显示出甚至更大的佐剂活性，这对于在抗原相对较弱时诱导强烈应答尤其必要。它们还加速免疫应答并使抗原剂量能够降低，在一些试验中与不含CpG的全剂量疫苗具有相当的抗体应答(Arthur M.Krieg,Nature Reviews,DrugDiscovery,5,2006年6月,471-484)。美国专利6,406,705B1描述了组合使用CpG寡核苷酸、非核酸佐剂和抗原来诱导抗原特异性免疫应答。一种可商购获得的CpG TLR9拮抗剂是Mologen(Berlin，GERMANY)的dSLIM(双茎环免疫调节剂)，其为本文所述的药物组合物的组分。还可以使用其它TLR结合分子，如RNA结合TLR 7、TLR 8和/或TLR 9。
有用的佐剂的其它实例包括但不限于化学修饰的CpG(例如CpR，Idera)、聚(I:C)(例如聚i:CI2U)、非CpG细菌DNA或RNA、针对TLR8的ssRNA40以及免疫活性小分子和抗体，如环磷酰胺、舒尼替尼、贝伐珠单抗、西乐葆(Celebrex)、NCX-4016、西地那非、他达拉非、伐地那非、索拉非尼、XL-999、CP-547632、帕唑帕尼、ZD2171、AZD2171、伊匹木单抗、曲美木单抗和SC58175，它们可以治疗性地和/或作为佐剂起作用。可用于本发明上下文中的佐剂和添加剂的量和浓度可由技术人员容易地确定，而无需过多的实验。另外的佐剂包括集落刺激因子，如粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF，沙格司亭)。
在一些实施方案中，根据本发明的免疫原性组合物可包含超过一种不同的佐剂。此外，本发明包括治疗性组合物，其包含任何佐剂物质，包括上述任何佐剂及其组合。还设想了非突变蛋白质表位治疗剂(例如，体液或细胞介导的免疫应答)。在一些实施方案中，该免疫原性组合物包含非突变蛋白质表位治疗剂(例如，肽、多核苷酸、TCR、CAR、含有TCR或CAR的细胞、含有多肽的树突细胞、含有多核苷酸的树突细胞、抗体等)，并且佐剂可以以任何合适的顺序单独施用。
载体可以独立于佐剂存在。载体的功能可以例如是增加特别是突变体的分子量，以增加其活性或免疫原性、赋予稳定性、增加生物活性或延长血清半衰期。此外，载体可以帮助将肽呈递给T细胞。载体可以是本领域技术人员已知的任何合适的载体，例如蛋白质或抗原呈递细胞。载体蛋白质可以是但不限于匙孔
Figure BDA0002301078100000451
血蓝蛋白、血清蛋白质如转铁蛋白、牛血清白蛋白、人血清白蛋白、甲状腺球蛋白或卵白蛋白、免疫球蛋白或激素，如胰岛素或棕榈酸。在一个实施方案中，载体包含人III型纤连蛋白结构域(Koide等人,MethodsEnzymol.2012；503:135-56)。对于人类的免疫，载体必须是人类可接受且安全的生理学上可接受的载体。然而，在本发明的一个实施方案中，破伤风类毒素和/或白喉类毒素是合适的载体。或者，该载体可以是葡聚糖，例如琼脂糖。
在一些实施方案中，所述多肽可以被合成为多重连接的肽，作为将多肽与载体偶联以增加免疫原性的替代方案。这类分子也被称为多重抗原肽(MAPS)。
IV.CTL肽和HTL肽的组合
可以修饰具有免疫刺激活性的包含本文所述非突变蛋白质表位多肽和多核苷酸或其类似物的免疫原性或疫苗组合物，以提供所需属性，如改善的血清半衰期，或增强免疫原性。
例如，通过将肽连接至含有至少一个能诱导T辅助细胞应答的表位的序列，可以增强非突变蛋白质表位肽诱导CTL活性的能力。在一个实施方案中，CTL表位/HTL表位缀合物通过间隔体分子连接。该间隔体通常由在生理条件下基本上不带电荷的相对较小的中性分子，如氨基酸或氨基酸模拟物组成。该间隔体通常选自例如Ala、Gly或非极性氨基酸或中性极性氨基酸的其它中性间隔体。应当理解，任选地存在的间隔体不必由相同的残基组成，因此可以是异源或同源寡聚物。当存在时，间隔体通常为至少一个或两个残基，更通常为3至6个残基。或者，CTL肽可以不用间隔体与T辅助肽连接。
虽然CTL肽表位可以直接与T辅助肽表位连接，但是CTL表位/HTL表位缀合物可以通过间隔体分子连接。该间隔体通常由在生理条件下基本上不带电荷的相对较小的中性分子，如氨基酸或氨基酸模拟物组成。该间隔体通常选自例如Ala、Gly或非极性氨基酸或中性极性氨基酸的其它中性间隔体。应当理解，任选地存在的间隔体不必由相同的残基组成，因此可以是异源或同源寡聚物。当存在时，间隔体通常为至少一个或两个残基，更通常为3至6个残基。CTL肽表位可以直接或通过在CTL肽的氨基或羧基末端的间隔体与T辅助肽表位连接。免疫原性肽或T辅助肽的氨基末端可以被酰化。
还可以修饰HTL肽表位以改变它们的生物学性质。例如，包含HTL表位的肽可含有D-氨基酸以增加其对蛋白酶的抗性并因此延长其血清半衰期。另外，表位肽可以缀合至其它分子，如脂质、蛋白质或糖，或其它任何合成化合物，以增加其生物活性。例如，T辅助肽可在氨基或羧基末端与一个或多个棕榈酸链缀合。
在某些实施方案中，T辅助肽是被存在于大多数群体中的T辅助细胞识别的肽。这可以通过选择与许多、大多数或所有HLA II类分子结合的氨基酸序列来实现。这些序列被称为“松散HLA限制性”或“混杂的”T辅助序列。混杂的氨基酸序列的实例包括来自以下抗原的序列：例如在830-843位置处的破伤风类毒素(QYIKANSKFIGITE)、在378-398位置处的恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)CS蛋白(DIEKKIAKMEKASSVFNVVNS)和在116位置处的链球菌18kD蛋白(GAVDSILGGVATYGAA)。其它实例包括具有DR 1-4-7超基序或任一种DR3基序的肽。
或者，可以使用自然界中未发现的氨基酸序列来制备能够以松散HLA限制性方式刺激T辅助淋巴细胞的合成肽(参见，例如，PCT公开WO 95/07707)。这些被称为泛-DR-结合表位(例如，PADRE，Epimmune,Inc.,San Diego,CA)的合成化合物被设计成结合大多数HLA-DR(人HLA II类)分子。例如，已经发现具有下式的泛-DR结合表位肽与大多数HLA-DR等位基因结合，并刺激来自大多数个体的T辅助淋巴细胞的应答，而无论其HLA类型如何：aKXVWANTLKAAa，其中“X”为环己基丙氨酸、苯丙氨酸或酪氨酸，并且a为D-丙氨酸或L-丙氨酸。泛-DR结合表位的替代物包含所有“L”天然氨基酸，并且可以以编码所述表位的核酸的形式提供。
在一些实施方案中，可能希望在药物组合物(例如，免疫原性组合物)中包含非突变蛋白质表位治疗剂(例如，肽、多核苷酸、TCR、CAR、含有TCR或CAR的细胞、含有多肽的树突细胞、含有多核苷酸的树突细胞、抗体等)，该药物组合物中的至少一种组分引发细胞毒性T淋巴细胞。已经将脂质鉴定为能够在体内引发针对病毒抗原的CTL的药剂。例如，棕榈酸残基可附接至赖氨酸残基的ε-和α-氨基上，然后例如通过一个或多个连接残基如Gly、Gly-Gly-、Ser、Ser-Ser等连接至免疫原性非突变蛋白质表位肽上。脂质化的肽然后可以在胶束或颗粒中直接施用、掺入脂质体中或在佐剂中乳化。在一个实施方案中，特别有效的免疫原性构建体包含附接至Lys的ε-和α-氨基上的棕榈酸，该Lys通过连接，例如Ser-Ser，附接至免疫原性肽的氨基末端上。
作为脂质引发CTL应答的另一个实例，当共价连接至适当的肽时，大肠杆菌脂蛋白如三棕榈酰基-S-甘油基半胱氨酰基丝氨酰基-丝氨酸(P3CSS)可以用来引发病毒特异性CTL。(参见，例如，Deres等人,Nature 342:561,1989)。例如，可以将本文所述的非突变蛋白质表位肽偶联至P3CSS，并且将脂肽施用于个体以特异性地引发对靶抗原的CTL应答。此外，由于中和抗体的诱导也可以用P3CSS-缀合的表位来引发，所以可以组合两种这样的组合物以便更有效地引发针对感染的体液应答和细胞介导的应答。
如本文所述，可以将另外的氨基酸添加到非突变蛋白质表位肽的末端，以使肽易于彼此连接，以便偶联至载体支持体或较大的肽、改变肽或寡肽的物理或化学性质等。可以在肽或寡肽的C-或N-末端引入氨基酸，如酪氨酸、半胱氨酸、赖氨酸、谷氨酸或天冬氨酸等。然而，应当注意，在一些情况下，T细胞表位的羧基末端的修饰可改变肽的结合特性。另外，通过末端-NH2酰化，例如通过烷酰基(C1-C20)或硫代乙醇酰基乙酰化，通过末端羧基酰胺化，例如氨、甲胺等进行的修饰，肽或寡肽序列可以不同于天然序列。在一些情况下，这些修饰可以提供用于连接到支持体或其它分子的位点。
本文所述的免疫原性组合物的实施方案包括向来自患者血液的PBMC或从其中分离的DC离体施用带有表位的非突变蛋白质表位多肽或多核苷酸的混合物。可以使用促进收获树突细胞(DC)的药物，包括GM-CSF、IL-4、IL-6、IL-1β和TNFα。在用肽或编码所述肽的多核苷酸脉冲DC后，并且在再输注到患者体内之前，洗涤DC以去除未结合的肽。在该实施方案中，疫苗或免疫原性组合物包含肽脉冲的DC，该DC在其表面上呈递与HLA分子复合的脉冲肽表位。然后将该组合物施用于患者。在其它实施方案中，使用这类脉冲的DC刺激适合用于T细胞治疗的T细胞。
V.多表位免疫原性组合物
允许同时递送多个表位的许多不同的方法是可用的。编码本文所述的非突变蛋白质表位肽的核酸是本发明尤其有用的实施方案。在一个实施方案中，该核酸是RNA。在一些实施方案中，使用编码包含一个或多个本文所述表位的非突变蛋白质表位肽的小基因构建体施用编码本文所述的非突变蛋白质表位肽的核酸。
多表位小基因的使用描述于An,L.和Whitton,J.L.,J.Virol.71:2292,1997；Thomson,S.A.等人,J.Immunol.157:822,1996；Whitton,J.L.等人,J.Virol.67:348,1993；Hanke,R.等人,Vaccine 16:426,1998。例如，可以工程改造编码带有超基序和/或基序的抗原肽、通用辅助T细胞表位(或多个肿瘤相关抗原HTL表位)和内质网转位信号序列的多表位DNA质粒。
可以在转基因小鼠中检测多表位小基因的免疫原性，以评价针对所测试表位诱导的免疫应答的量级。进一步地，DNA编码的表位在体内的免疫原性可能与特异性CTL系针对用DNA质粒转染的靶细胞的体外应答相关。因此，这些实验可以显示，小基因用来：1.)产生细胞介导的应答和/或体液应答，和2.)诱导的免疫细胞识别表达所编码的表位的细胞。
例如，为了产生编码所选择的非突变蛋白质表位(小基因)的DNA序列以供在人细胞中表达，可以反向翻译表位的氨基酸序列。可以使用人密码子使用表来指导每种氨基酸的密码子选择。这些编码非突变蛋白质表位的DNA序列可以直接邻接，因此当翻译时，产生连续的多肽序列。为了优化表达和/或免疫原性，可以将另外的元件引入小基因设计中。可以反向翻译并包含在小基因序列内的氨基酸序列的实例包括：HLA I类表位、HLA II类表位、泛素化信号序列和/或内质网靶向信号。另外，通过包含与CTL或HTL表位相邻的合成的(例如聚丙氨酸)或天然存在的侧翼序列，可以改善CTL和HTL表位的HLA呈递；这些包含表位的较大的肽在本发明的范围内。
通过组装编码小基因的正链和负链的寡核苷酸，可以将小基因序列转化为DNA。可以使用熟知的技术在适当的条件下合成、磷酸化、纯化和退火重叠的寡核苷酸(30-100个碱基长)。例如，可以使用T4 DNA连接酶连接寡核苷酸的末端。然后可以将编码表位多肽的该合成小基因克隆到所需的表达载体中。
可以将本领域技术人员熟知的标准调节序列包含在载体中以确保在靶细胞中表达。例如，具有用于小基因插入的下游克隆位点的启动子；用于有效转录终止的聚腺苷酸化信号；大肠杆菌复制起点；和大肠杆菌选择性标记(例如氨苄青霉素或卡那霉素抗性)。多种启动子可用于该目的，例如，人巨细胞病毒(hCMV)启动子。关于其它合适的启动子序列，参见，例如，美国专利5,580,859和5,589,466。
可以使用另外的载体修饰来优化小基因表达和免疫原性。在一些情况下，内含子用于有效的基因表达，并且一个或多个合成的或天然存在的内含子可以引入小基因的转录区域中。还可以考虑在哺乳动物细胞中包含mRNA稳定化序列和复制序列以增加小基因表达。
一旦选择了表达载体，就可以将小基因克隆到启动子下游的多连接体区域。将该质粒转化到合适的大肠杆菌菌株中，并使用标准技术制备DNA。可以使用限制酶图谱和DNA序列分析来确认小基因以及载体内包含的所有其它元件的取向和DNA序列。携带正确质粒的细菌细胞可以作为主细胞库和工作细胞库储存。
另外，免疫调节序列似乎在DNA疫苗的免疫原性中起作用。如果需要增强免疫原性，则可以将这些序列包含在载体中小基因编码序列之外。在一个实施方案中，所述序列具有免疫刺激性。在另一个实施方案中，所述序列是ISS或CpG。
在一些实施方案中，可以使用双顺反子表达载体，其允许产生小基因编码的表位和第二蛋白质(包括在内以增强或降低免疫原性)。如果共表达则可以有益地增强免疫应答的蛋白质或多肽的实例包括细胞因子(例如，IL-2、IL-12、GM-CSF)、细胞因子诱导分子(例如，LeIF)、共刺激分子，或者对于HTL应答，包括泛-DR结合蛋白。辅助(HTL)表位可与细胞内靶向信号连接，并与表达的CTL表位分开表达；这允许将HTL表位引导至与CTL表位不同的细胞区室。如果需要，这可以促进HTL表位更有效地进入HLA II类途径，从而改善HTL诱导。与HTL或CTL诱导相反，通过免疫抑制分子(例如TGF-β)的共表达特异性降低免疫应答可能在某些疾病中是有益的。
例如，通过在大肠杆菌中发酵，然后纯化，可以产生治疗量的质粒DNA。来自工作细胞库的等分试样用来接种生长培养基，并根据熟知的技术在摇瓶或生物反应器中生长至饱和。质粒DNA可使用标准生物分离技术如QIAGEN,Inc.(Valencia,California)提供的固相阴离子交换树脂来纯化。如果需要，可以使用凝胶电泳或其它方法将超螺旋DNA与开环和线性形式分离。
可以制备纯化的质粒DNA以供使用多种制剂进行注射。其中最简单的方法是在无菌磷酸盐缓冲盐水(PBS)中重建冻干的DNA。这种被称为“裸DNA”的方法目前用于临床试验中的肌肉内(IM)施用。为了使小基因DNA疫苗的免疫治疗效果最大化，可以使用配制纯化的质粒DNA的替代方法。已经描述了多种方法，并且新技术可以是可用的。阳离子脂质也可以在制剂中使用(参见，例如，WO 93/24640；Mannino&Gould-Fogerite,BioTechniques 6(7):682(1988)；美国专利5,279,833；WO 91/06309；和Felgner等人,Proc.Nat'l Acad.Sci.USA84:7413(1987)所描述的)。另外，统称为保护性、相互作用、非凝聚性化合物(PINC)的糖脂、融合脂质体、肽和化合物也可与纯化的质粒DNA复合，以影响诸如稳定性、肌肉内分散或向特定器官和细胞类型运输等变量。
在另一个实施方案中，通过使用高速细胞变形将核酸引入细胞中。在高速变形期间，挤压细胞使得在细胞膜中发生暂时破坏，从而允许核酸进入细胞。或者，可以从表达载体——例如在细菌表达载体中产生蛋白质，然后可以将蛋白质递送至细胞。
靶细胞致敏可以用作对小基因编码的CTL表位的表达和HLA I类呈递的功能分析。例如，将质粒DNA引入适合作为标准CTL铬释放试验的靶标的哺乳动物细胞系中。所用转染方法将取决于最终制剂。电穿孔可用于“裸”DNA，而阳离子脂质允许直接体外转染。可以共转染表达绿色荧光蛋白(GFP)的质粒，以允许使用荧光激活细胞分选术(FACS)富集转染的细胞。然后对这些细胞进行铬-51(51Cr)标记并用作表位特异性CTL系的靶细胞；通过51Cr释放来检测的细胞溶解表明小基因编码的CTL表位的产生和HLA呈递。可以使用评估HTL活性的试验以类似方法来评价HTL表位的表达。
体内免疫原性是用于小基因DNA制剂功能检测的第二种方法。用DNA产物对表达合适的人HLA蛋白的转基因小鼠进行免疫。施用剂量和途径是制剂依赖性的(例如，PBS中的DNA采用IM，脂质复合的DNA采用腹膜内(IP))。示例性方案是：免疫后21天，收获脾细胞，并在编码每种待测表位的肽的存在下再刺激1周。此后，对于CTL效应细胞，使用标准技术对负载肽的、51Cr标记的靶细胞的细胞溶解进行分析。通过负载有与小基因编码的表位相对应的肽表位的HLA所致敏的靶细胞溶解，证明了用于体内诱导CTL的DNA疫苗功能。在转基因小鼠中以类似方法评价HTL表位的免疫原性。
或者，可以使用弹道递送施用核酸，如例如美国专利5,204,253中所述。使用该技术，施用仅由DNA组成的颗粒。在进一步的替代实施方案中，DNA可以附着于颗粒，如金颗粒。
VI.细胞
在一个方面，本发明还提供了表达激活免疫应答性细胞的非突变蛋白质表位识别受体(例如，T细胞受体(TCR)或嵌合抗原受体(CAR))的细胞，以及使用这类细胞治疗需要增强免疫应答的疾病的方法。
这类细胞包括表达与本文所述的非突变蛋白质表位肽之一结合的抗原识别受体(例如，TCR或CAR)的基因修饰的免疫应答细胞(例如，T细胞、自然杀伤(NK)细胞、细胞毒性T淋巴(CTL)细胞、辅助T淋巴(HTL)细胞)，以及因此用于治疗瘤形成和其它需要增加抗原特异性免疫应答的病理的方法。T细胞活化由靶向至抗原的TCR或CAR介导。
本发明提供了表达激活免疫应答性细胞的抗原识别受体(例如，TCR、CAR)与嵌合共刺激受体(CCR)的组合的细胞，以及使用这类细胞治疗需要增强免疫应答的疾病的方法。在一个实施方案中，使用肿瘤抗原特异性T细胞、NK细胞、CTL细胞或其它免疫应答性细胞作为穿梭物，用于选择性富集一种或多种共刺激配体，以供治疗或预防瘤形成。将这类细胞施用于需要它的人类受试者，以供治疗或预防特定癌症。
在一个实施方案中，可以在本发明方法中使用的肿瘤抗原特异性人淋巴细胞包括但不限于经遗传修饰以表达嵌合抗原受体(CAR)的外周供体淋巴细胞(Sadelain,M.等人,2003 Nat Rev Cancer 3:35-45)、经遗传修饰以表达包含a和p异二聚体的全长肿瘤抗原识别T细胞受体复合体的外周供体淋巴细胞(Morgan,R.A.等人,2006 Science 314:126-129)、来源于肿瘤活检物中肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的淋巴细胞培养物(Panelli,M.C.等人,2000J Immunol 164:495-504；Panelli,M.C.等人,2000J Immunol 164:4382-4392)以及使用人工抗原呈递细胞(AAPC)或脉冲树突细胞选择性地体外扩充的抗原特异性外周血白细胞(Dupont,J.等人,2005 Cancer Res 65:5417-5427；Papanicolaou,G.A.等人,2003Blood 102:2498-2505)。T细胞可以是自体的、同种异体的或在体外来源于工程化祖细胞或干细胞。
共刺激配体
在一个实施方案中，本发明的细胞与至少一种共刺激配体一起提供，该共刺激配体是对免疫细胞完全活化至关重要的非抗原特异性信号。共刺激配体包括但不限于肿瘤坏死因子(TNF)配体、细胞因子(如IL-2、IL-12、IL-15或IL21)和免疫球蛋白(Ig)超家族配体。
肿瘤坏死因子(TNF)是一种参与全身炎症的细胞因子，并且刺激急性期反应。其主要作用是调节免疫细胞。肿瘤坏死因子(TNF)配体共有许多共同特征。大多数配体被合成为含有短细胞质区段和相对较长的细胞外区域的II型跨膜蛋白。TNF配体包括但不限于神经生长因子(NGF)、CD4OL(CD4OL)/CD154、CD137L/4-1BBL、肿瘤坏死因子α(TNFα)、CD134L/OX4OL/CD252、CD27L/CD70、Fas配体(FasL)、CD3OL/CD153、肿瘤坏死因子β(TNF(3)/淋巴毒素-α(LTa)、淋巴毒素-β(ur(3)、CD257/B细胞活化因子(BAFF)/Blys/THANK/Ta11-1、糖皮质激素诱导的TNF受体配体(GITRL)和TNF相关的凋亡诱导配体(TRAIL)、LIGHT(TNFSF14)。免疫球蛋白(Ig)超家族是一大组参与细胞的识别、结合或粘附过程的细胞表面和可溶性蛋白质。这些蛋白质与免疫球蛋白共有结构特征——它们具有免疫球蛋白结构域(折叠)。免疫球蛋白超家族配体包括但不限于CD80和CD86，两者都是CD28的配体。
可以将包含本发明的遗传修饰的免疫应答性细胞的组合物全身或直接提供给受试者以治疗瘤形成。在一个实施方案中，将本发明的细胞直接注射到目的器官(例如，受肿瘤影响的器官)中。或者，将包含遗传修饰的免疫应答性细胞的组合物间接提供至目的器官，例如，通过施用到循环系统(例如，肿瘤血管系统)内。可在施用细胞之前、期间或之后提供扩充剂和分化剂，以在体外或体内增加T细胞、NK细胞或CTL细胞的产生。
修饰的细胞可以在任何生理学上可接受的媒介物中，通常是在血管内施用，尽管也可以将它们引入骨骼或其它适宜的部位，其中细胞可以找到适当的再生和分化部位(例如，胸腺)。本发明的遗传修饰的免疫应答性细胞可包含纯化的细胞群体。本领域技术人员可以使用各种熟知的方法如荧光激活细胞分选术(FACS)容易地确定群体中遗传修饰的免疫应答性细胞的百分比。本领域技术人员可以容易地调整剂量(例如，纯度降低可能需要增加剂量)。可以通过注射、导管等引入所述细胞。如果需要，还可以包括因子，包括但不限于白细胞介素，例如IL-2、IL-3、IL-6和IL-11，以及其它白细胞介素、集落刺激因子，如G-CSF、M-CSF和GM-CSF，干扰素，例如γ-干扰素，和促红细胞生成素。
本发明的组合物包括含有遗传修饰的免疫应答性细胞或其祖细胞和药学上可接受的载体的药物组合物。施用可以是自体的或异源的。例如，免疫应答性细胞或祖细胞可以从一个受试者获得，并施用于相同受试者或不同的相容受试者。本发明的外周血来源的免疫应答性细胞或其后代(例如，体内、离体或体外衍生的)可以通过局部注射施用，包括导管施用、全身注射、局部注射、静脉内注射或肠胃外施用。当施用本发明的治疗性组合物(例如，含有遗传修饰的免疫应答性细胞的药物组合物)时，通常将其配制成单位剂量可注射形式(溶液、悬浮液、乳液)。
VII.使用方法及药物组合物
本文所述的非突变蛋白质表位治疗剂(例如，肽、多核苷酸、TCR、CAR、含有TCR或CAR的细胞、含有多肽的树突细胞、含有多核苷酸的树突细胞、抗体等)可用于多种应用，包括但不限于治疗性处置方法，如癌症的治疗。在一些实施方案中，治疗性处置方法包括免疫疗法。在某些实施方案中，非突变蛋白质表位肽可用于激活、促进、增加和/或增强免疫应答、将现有免疫应答重定向至新靶标、增加肿瘤的免疫原性、抑制肿瘤生长、减小肿瘤体积、增加肿瘤细胞凋亡和/或降低肿瘤的致瘤性。所述使用方法可以是体外、离体或体内方法。
在一些方面，本发明提供了使用本文所述的非突变蛋白质表位治疗剂激活受试者的免疫应答的方法。在一些实施方案中，本发明提供了使用本文所述的非突变蛋白质表位治疗剂促进受试者的免疫应答的方法。在一些实施方案中，本发明提供了使用本文所述的非突变蛋白质表位肽增加受试者的免疫应答的方法。在一些实施方案中，本发明提供了使用非突变蛋白质表位肽增强免疫应答的方法。在一些实施方案中，免疫应答的激活、促进、增加和/或增强包括增加细胞介导的免疫。在一些实施方案中，免疫应答的激活、促进、增加和/或增强包括增加T细胞活性或体液免疫。在一些实施方案中，免疫应答的激活、促进、增加和/或增强包括增加CTL或HTL活性。在一些实施方案中，免疫应答的激活、促进、增加和/或增强包括增加CTL或HTL活性。在一些实施方案中，免疫应答的激活、促进、增加和/或增强包括增加NK细胞活性。在一些实施方案中，免疫应答的激活、促进、增加和/或增强包括增加T细胞活性和增加NK细胞活性。在一些实施方案中，免疫应答的激活、促进、增加和/或增强包括增加CTL活性和增加NK细胞活性。在一些实施方案中，免疫应答的激活、促进、增加和/或增强包括抑制或降低Treg的抑制活性。在一些实施方案中，免疫应答是抗原刺激的结果。在一些实施方案中，该抗原刺激是肿瘤细胞。在一些实施方案中，该抗原刺激是癌症。
在一些实施方案中，本发明提供了使用本文所述的非突变蛋白质表位治疗剂激活、促进、增加和/或增强免疫应答的方法。在一些实施方案中，方法包括向有需要的受试者施用治疗有效量的非突变蛋白质表位治疗剂，该治疗剂将非突变蛋白质表位多肽或多核苷酸递送至肿瘤细胞。在一些实施方案中，方法包括向有需要的受试者施用治疗有效量的非突变蛋白质表位治疗剂，该治疗剂结合肿瘤相关抗原并被肿瘤细胞内化。在一些实施方案中，方法包括向有需要的受试者施用治疗有效量的被肿瘤细胞内化的非突变蛋白质表位多肽，并且该非突变蛋白质表位肽被所述细胞加工。在一些实施方案中，方法包括向有需要的受试者施用治疗有效量的被肿瘤细胞内化的非突变蛋白质表位多肽，并且抗原肽呈递于肿瘤细胞的表面上。在一些实施方案中，方法包括向有需要的受试者施用治疗有效量的被肿瘤细胞内化、被所述细胞加工的非突变蛋白质表位多肽，并且抗原肽呈递于肿瘤细胞的表面上。
在一些实施方案中，方法包括向有需要的受试者施用治疗有效量的本文所述的非突变蛋白质表位多肽或多核苷酸，该多肽或多核苷酸将包含至少一种抗原肽的外源性多肽递送至肿瘤细胞，其中该抗原肽呈递于肿瘤细胞表面上。在一些实施方案中，该抗原肽与MHC I类分子复合地呈递于肿瘤细胞表面上。在一些实施方案中，该抗原肽与MHC II类分子复合地呈递于肿瘤细胞表面上。
在一些实施方案中，方法包括使肿瘤细胞与本文所述的非突变蛋白质表位多肽或多核苷酸接触，该多肽或多核苷酸将包含至少一种抗原肽的外源性多肽递送至肿瘤细胞，其中该抗原肽呈递于肿瘤细胞表面上。在一些实施方案中，该抗原肽与MHC I类分子复合地呈递于肿瘤细胞表面上。在一些实施方案中，该抗原肽与MHC II类分子复合地呈递于肿瘤细胞表面上。
在一些实施方案中，方法包括向有需要的受试者施用治疗有效量的本文所述的非突变蛋白质表位多肽或多核苷酸，该多肽或多核苷酸将包含至少一种抗原肽的外源多肽递送至肿瘤细胞，其中该抗原肽呈递于肿瘤细胞表面上，并且诱导针对肿瘤细胞的免疫应答。在一些实施方案中，针对肿瘤细胞的免疫应答得到增加。在一些实施方案中，该非突变蛋白质表位多肽或多核苷酸将包含至少一种抗原肽的外源性多肽递送至肿瘤细胞，其中该抗原肽呈递于肿瘤细胞表面上，并且抑制肿瘤生长。
在一些实施方案中，方法包括向有需要的受试者施用治疗有效量的本文所述的非突变蛋白质表位多肽或多核苷酸，该多肽或多核苷酸将包含至少一种抗原肽的外源多肽递送至肿瘤细胞，其中该抗原肽呈递于肿瘤细胞表面上，并且诱导针对肿瘤细胞的T细胞杀伤。在一些实施方案中，针对肿瘤细胞的T细胞杀伤得到增强。在一些实施方案中，针对肿瘤细胞的T细胞杀伤得到增加。
在一些实施方案中，增加受试者的免疫应答的方法包括向受试者施用治疗有效量的本文所述的非突变蛋白质表位治疗剂，其中该治疗剂是特异性结合本文所述的非突变蛋白质表位的抗体。在一些实施方案中，增加受试者的免疫应答的方法包括向受试者施用治疗有效量的抗体。
本发明提供了将现有免疫应答重定向至肿瘤的方法。在一些实施方案中，将现有免疫应答重定向至肿瘤的方法包括向受试者施用治疗有效量的本文所述的非突变蛋白质表位治疗剂。在一些实施方案中，现有免疫应答针对病毒。在一些实施方案中，该病毒选自：麻疹病毒、水痘-带状疱疹病毒(VZV；水痘病毒)、流感病毒、腮腺炎病毒、脊髓灰质炎病毒、风疹病毒、轮状病毒、甲型肝炎病毒(HAV)、乙型肝炎病毒(HBV)、EB病毒(EBV)和巨细胞病毒(CMV)。在一些实施方案中，该病毒是水痘-带状疱疹病毒。在一些实施方案中，该病毒是巨细胞病毒。在一些实施方案中，该病毒是麻疹病毒。在一些实施方案中，现有免疫应答在自然病毒感染之后获得。在一些实施方案中，现有免疫应答在针对病毒的疫苗接种之后获得。在一些实施方案中，现有免疫应答是细胞介导的应答。在一些实施方案中，现有免疫应答包括细胞毒性T细胞(CTL)或HTL。
在一些实施方案中，将现有免疫应答重定向至受试者的肿瘤的方法包括施用融合蛋白，该融合蛋白包含(i)特异性结合非突变蛋白质表位的抗体和(ii)至少一种本文所述的非突变蛋白质表位肽，其中(a)该融合蛋白在与肿瘤相关抗原结合后被肿瘤细胞内化；(b)将所述非突变蛋白质表位肽加工并与MHC I类分子相缔合地呈递于肿瘤细胞表面上；并且(c)所述非突变蛋白质表位肽/MHC I类复合体被细胞毒性T细胞识别。在一些实施方案中，该细胞毒性T细胞是记忆T细胞。在一些实施方案中，该记忆T细胞是用非突变蛋白质表位肽进行接种的结果。
本发明提供了增加肿瘤免疫原性的方法。在一些实施方案中，增加肿瘤免疫原性的方法包括使肿瘤或肿瘤细胞与有效量的本文所述的非突变蛋白质表位治疗剂接触。在一些实施方案中，增加肿瘤免疫原性的方法包括向受试者施用治疗有效量的本文所述的非突变蛋白质表位治疗剂。
本发明还提供了使用本文所述的非突变蛋白质表位治疗剂抑制肿瘤生长的方法。在某些实施方案中，抑制肿瘤生长的方法包括在体外使细胞混合物与非突变蛋白质表位治疗剂接触。例如，与免疫细胞(例如，T细胞)混合的永生化细胞系或癌细胞系在添加了非突变蛋白质表位肽的培养基中培养。在一些实施方案中，从诸如组织活检物、胸腔积液或血液样品等患者样品中分离肿瘤细胞，与免疫细胞(例如，T细胞)混合，并在添加抗原治疗剂的培养基中培养。在一些实施方案中，非突变蛋白质表位治疗剂增加、促进和/或增强免疫细胞的活性。在一些实施方案中，非突变蛋白质表位治疗剂抑制肿瘤细胞生长。在一些实施方案中，非突变蛋白质表位治疗剂激活肿瘤细胞的杀伤。
在某些实施方案中，所述受试者是人。在某些实施方案中，所述受试者具有肿瘤或者所述受试者具有至少部分去除的肿瘤。
在一些实施方案中，抑制肿瘤生长的方法包括将现有免疫应答重定向至新靶标，其包括向受试者施用治疗有效量的非突变蛋白质表位治疗剂，其中该现有免疫应答针对由所述非突变蛋白质表位肽递送至肿瘤细胞的抗原肽。
在某些实施方案中，所述肿瘤包含癌症干细胞。在某些实施方案中，通过施用非突变蛋白质表位治疗剂来降低肿瘤中癌症干细胞的频率。在一些实施方案中，提供了降低肿瘤中癌症干细胞的频率的方法，其包括向受试者施用治疗有效量的非突变蛋白质表位治疗剂。
另外，在一些方面，本发明提供了降低受试者的肿瘤致肿瘤性的方法，其包括向受试者施用治疗有效量的本文所述的非突变蛋白质表位治疗剂。在某些实施方案中，该肿瘤包含癌症干细胞。在一些实施方案中，通过降低肿瘤中癌症干细胞的频率来降低肿瘤的致瘤性。在一些实施方案中，所述方法包括使用本文所述的非突变蛋白质表位治疗剂。在某些实施方案中，通过施用本文所述的非突变蛋白质表位治疗剂来降低肿瘤中癌症干细胞的频率。
在一些实施方案中，所述肿瘤是实体瘤。在某些实施方案中，所述肿瘤是选自下组的肿瘤：结直肠肿瘤、胰腺肿瘤、肺肿瘤、卵巢肿瘤、肝肿瘤、乳腺肿瘤、肾肿瘤、前列腺肿瘤、神经内分泌肿瘤、胃肠肿瘤、黑素瘤、宫颈肿瘤、膀胱肿瘤、胶质母细胞瘤及头颈肿瘤。在一些实施方案中，该肿瘤是结直肠肿瘤。在一些实施方案中，该肿瘤是卵巢肿瘤。在一些实施方案中，该肿瘤是乳腺肿瘤。在一些实施方案中，该肿瘤是肺肿瘤。在一些实施方案中，该肿瘤是胰腺肿瘤。在一些实施方案中，该肿瘤是黑素瘤肿瘤。在一些实施方案中，该肿瘤是实体瘤。
本发明进一步提供了治疗受试者的癌症的方法，其包括向受试者施用治疗有效量的本文所述的非突变蛋白质表位治疗剂。
在一些实施方案中，治疗癌症的方法包括将现有免疫应答重定向至新靶标，该方法包括向受试者施用治疗有效量的非突变蛋白质表位治疗剂，其中该现有免疫应答针对由所述非突变蛋白质表位肽递送至癌细胞的抗原肽。
本发明提供了治疗受试者的癌症的方法，其包括向受试者(例如，需要治疗的受试者)施用治疗有效量的本文所述的非突变蛋白质表位治疗剂。在某些实施方案中，该受试者是人。在某些实施方案中，该受试者具有癌性肿瘤。在某些实施方案中，该受试者具有至少部分去除的肿瘤。
在某些实施方案中，所述癌症是选自下组的癌症：结直肠癌、肾癌、胰腺癌、肺癌、卵巢癌、肝癌、乳腺癌、肾癌、前列腺癌、胃肠癌、黑素瘤、宫颈癌、神经内分泌癌、膀胱癌、胶质母细胞瘤、三阴性乳腺癌(TNBC)、阴燃骨髓瘤(SMM)和头颈癌。在一些实施方案中，该癌症是胰腺癌。在一些实施方案中，该癌症是卵巢癌。在一些实施方案中，该癌症是结直肠癌。在一些实施方案中，该癌症是乳腺癌。在一些实施方案中，该癌症是前列腺癌。在一些实施方案中，该癌症是肺癌。在一些实施方案中，该癌症是黑素瘤。在一些实施方案中，该癌症是实体癌。在一些实施方案中，该癌症包括实体瘤。
在一些实施方案中，所述癌症是血液系统癌症。在一些实施方案中，该癌症选自：急性髓性白血病(AML)、霍奇金淋巴瘤、多发性骨髓瘤、T细胞急性淋巴母细胞白血病(T-ALL)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、毛细胞白血病、慢性髓性白血病(CML)、非霍奇金淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、套细胞淋巴瘤(MCL)和皮肤T细胞淋巴瘤(CTCL)。
在一些实施方案中，所述非突变蛋白质表位治疗剂作为联合治疗施用。具有两种或更多种治疗剂的联合治疗使用通过不同作用机制起作用的药剂，尽管这不是必需的。使用具有不同作用机制的药剂的联合治疗可引起累加或协同效应。联合治疗可以允许每种药剂的剂量低于单一疗法中所使用的剂量，从而降低毒性副作用和/或增加药剂的治疗指数。联合治疗可以降低耐药性癌细胞发展的可能性。在一些实施方案中，联合治疗包含影响免疫应答(例如，增强或激活该应答)的治疗剂和影响(例如，抑制或杀死)肿瘤/癌细胞的治疗剂。
在一些实施方案中，本文所述药剂与至少一种附加治疗剂的组合产生累加或协同结果。在一些实施方案中，联合治疗导致药剂的治疗指数增加。在一些实施方案中，联合治疗导致附加治疗剂的治疗指数增加。在一些实施方案中，联合治疗导致药剂的毒性和/或副作用降低。在一些实施方案中，联合治疗导致附加治疗剂的毒性和/或副作用降低。
在某些实施方案中，除了施用本文所述的非突变蛋白质表位治疗剂之外，所述方法或治疗进一步包括施用至少一种附加治疗剂。附加治疗剂可在药剂施用之前、同时和/或之后施用。在一些实施方案中，所述至少一种附加治疗剂包含1、2、3种或更多种险别治疗剂。
可以与本文所述的非突变蛋白质表位治疗剂联合施用的治疗剂包括化学治疗剂。因此，在一些实施方案中，所述方法或治疗涉及将本文所述的药剂与化学治疗剂联合或与化学治疗剂的混合物联合施用。使用药剂的治疗可以在施用化学疗法之前、同时或之后进行。联合施用可包括以单一药物制剂或使用分开的制剂进行共同施用，或以任一顺序连续施用，但通常在一段时间内进行，使得所有活性剂可同时发挥其生物活性。这类化学治疗剂的制备和给药方案可根据制造商的说明书使用或由技术人员凭经验确定。这类化学疗法的制备和给药方案也描述于The Chemotherapy Source Book,第4版,2008,M.C.Perry编,Lippincott,Williams&Wilkins,Philadelphia,PA中。
有用的化学治疗剂类别包括，例如，抗微管蛋白剂、奥利斯他汀(auristatin)、DNA小沟结合剂、DNA复制抑制剂、烷化剂(例如，铂络合物，例如顺铂、单(铂)、双(铂)和三核铂络合物以及卡铂)、蒽环类、抗生素、抗叶酸剂、抗代谢物、化疗增敏剂、多卡米星(duocarmycin)、依托泊苷、氟化嘧啶、离子载体、来西托辛(lexitropsin)、亚硝基脲、普拉汀诺(platinol)、嘌呤抗代谢物、嘌呤霉素(puromycin)、辐射增敏剂、类固醇、紫杉烷、拓朴异构酶抑制剂、长春花生物碱(vinca alkaloid)等。在某些实施方案中，第二治疗剂是烷化剂、抗代谢物、抗有丝分裂剂、拓朴异构酶抑制剂或血管生成抑制剂。
可用于本发明中的化学治疗剂包括但不限于烷化剂，例如塞替派(thiotepa)和环磷酰胺(CYTOXAN)；烷基磺酸盐，例如白消安(busulfan)、英丙舒凡(improsulfan)和哌泊舒凡(piposulfan)；氮丙啶类，例如苯并多巴(benzodopa)、卡波醌(carboquone)、美妥替哌(meturedopa)和乌瑞替哌(uredopa)；次乙亚胺及甲基蜜胺，包括六甲蜜胺(altretamine)、三乙烯三聚氰胺、三亚乙基磷酰胺、三亚乙基硫代磷酰胺和三羟甲基蜜胺；氮芥，例如苯丁酸氮芥(chlorambucil)、萘氮芥(chlornaphazine)、胆磷酰胺(cholophosphamide)、雌二醇氮芥(estramustine)、异环磷酰胺、甲基二氯乙基胺、盐酸氧氮芥(mechiorethamine oxidehydrochloride)、美法仑(melphalan)、新氮芥(novembichin)、胆甾醇对苯乙酸氮芥(phenesterine)、泼尼莫司汀(prednimustine)、曲磷胺(trofosfamide)、尿嘧啶氮芥(uracil mustard)；亚硝基脲，例如卡莫司汀(carmustine)、氯脲菌素(chlorozotocin)、福莫司汀(fotemustine)、洛莫司汀(lomustine)、尼莫司汀(nimustine)、雷莫司汀(ranimnustine)；抗生素，例如阿克拉霉素(aclacinomysin)、放线菌素、安曲霉素(authramycin)、重氮丝氨酸、博来霉素(bleomycin)、放线菌素c、卡奇霉素(calicheamicin)、卡柔比星(carabicin)、卡波霉素(carnomycin)、嗜癌菌素(carzinophilin)、色霉素(chromomycin)、放线菌素D、柔红霉素(daunorubicin)、地托比星(detorubicin)、6-重氮-5-氧代-L-正亮氨酸、多柔比星(doxorubicin)、表柔比星(epirubicin)、依索比星(esorubicin)、伊达比星(idarubicin)、麻西罗霉素(marcellomycin)、丝裂霉素、霉酚酸(mycophenolic acid)、诺加霉素(nogalamycin)、橄榄霉素(olivomycins)、培洛霉素(peplomycin)、泊非霉素(potfiromycin)、嘌呤霉素、三铁阿霉素(quelamycin)、罗多比星(rodorubicin)、链黑菌素(streptonigrin)、链脲菌素(streptozocin)、杀结核菌素(tubercidin)、乌苯美司(ubenimex)、净司他丁(zinostatin)、佐柔比星(zorubicin)；抗代谢物，例如甲氨蝶呤和5-氟尿嘧啶(5-FU)；叶酸类似物，例如二甲叶酸、甲氨蝶呤、蝶罗呤(pteropterin)、三甲曲沙(trimetrexate)；嘌呤类似物，例如氟达拉滨(fludarabine)、6-巯嘌呤、硫咪嘌呤(thiamiprine)、硫鸟嘌呤；嘧啶类似物，例如安西他滨(ancitabine)、阿扎胞苷、6-氮尿苷、卡莫氟(carmofur)、胞嘧啶阿拉伯糖苷、二脱氧尿苷、去氧氟尿苷(doxifluridine)、依诺他滨(enocitabine)、氟尿苷、5-FU；雄激素，例如卡鲁睾酮(calusterone)、屈他雄酮丙酸酯(dromostanolonepropionate)、环硫雄醇(epitiostanol)、美雄烷(mepitiostane)、睾内酯；抗肾上腺，例如氨鲁米特(aminoglutethimide)、米托坦(mitotane)、曲洛司坦(trilostane)；叶酸补充剂，例如亚叶酸；醋葡醛内酯；醛磷酰胺糖苷；氨基乙酰丙酸；安吖啶(amsacrine)；贝拉布昔(bestrabucil)；比生群(bisantrene)；依达曲沙(edatraxate)；地磷酰胺(defofamine)；秋水仙胺(demecolcine)；地吖醌(diaziquone)；依氟鸟氨酸(elformithine)；依利醋铵(elliptinium acetate)；依托格鲁(etoglucid)；硝酸镓；羟基脲；香菇多醣；氯尼达明(lonidamine)；米托胍腙(mitoguazone)；米托蒽醌(mitoxantrone)；莫哌达醇(mopidamol)；硝氨丙吖啶(nitracrine)；喷司他丁(pentostatin)；蛋氨氮芥(phenamet)；吡柔比星(pirarubicin)；鬼臼酸(podophyllinic acid)；2-乙基酰肼；甲基苄肼(procarbazine)；PSK；雷佐生(razoxane)；西佐喃(sizofuran)；螺旋锗(spirogermanium)；细交链孢菌酮酸(tenuazonic acid)；三亚胺醌；2,2’,2”-三氯三乙胺；乌拉坦(urethan)；长春地辛；达卡巴嗪(dacarbazine)；甘露醇氮芥(mannomustine)；二溴甘露醇(mitobronitol)；二溴卫矛醇(mitolactol)；哌泊溴烷(pipobroman)；加赛特辛(gacytosine)；阿糖胞苷(Ara-C)；紫杉烷，例如紫杉醇(TAXOL)和多西紫杉醇(TAXOTERE))；苯丁酸氮芥；吉西他滨(gemcitabine)；6-硫鸟嘌呤；巯嘌呤；铂类似物，例如顺铂和卡铂；长春碱；铂；依托泊苷(VP-16)；异环磷酰胺；丝裂霉素C；米托蒽醌(mitoxantrone)；长春新碱；长春瑞滨；诺维本(navelbine)；诺消灵(novantrone)；替尼泊苷(teniposide)；柔红霉素；氨蝶呤；伊班膦酸盐(ibandronate)；CPT11；拓朴异构酶抑制剂RFS 2000；二氟甲基鸟氨酸(DMFO)；维甲酸；埃斯培拉霉素(esperamicin)；卡培他滨(XELODA)；以及上述任何药物的药学上可接受的盐、酸或衍生物。化学治疗剂还包括用于调节或抑制激素对肿瘤的作用的抗激素剂，例如抗雌激素，包括例如他莫昔芬(tamoxifen)、雷洛昔芬(raloxifene)、芳香化酶抑制性4(5)-咪唑、4羟基他莫昔芬、曲沃昔芬(trioxifene)、可昔芬(keoxifene)、LY117018、奥那司酮(onapristone)和托瑞米芬(FARESTON)；和抗雄激素，例如氟他胺(flutamide)、尼鲁米特(nilutamide)、比卡鲁胺(bicalutamide)、亮丙瑞林(leuprolide)和戈舍瑞林(goserelin)；以及上述任何药物的药学上可接受的盐、酸或衍生物。在某些实施方案中，附加治疗剂是顺铂。在某些实施方案中，附加治疗剂是卡铂。
在某些实施方案中，所述化学治疗剂是拓扑异构酶抑制剂。扑异构酶抑制剂是干扰拓扑异构酶(例如，拓扑异构酶I或II)的作用的化学治疗剂。拓朴异构酶抑制剂包括但不限于盐酸多柔比星、柠檬酸柔红霉素、盐酸米托蒽醌、放线菌素D、依托泊苷、盐酸拓扑替康、替尼泊苷(VM-26)和伊立替康(irinotecan)以及任何这些药物的药学上可接受的盐、酸或衍生物。在一些实施方案中，附加治疗剂是伊立替康。
在某些实施方案中，所述化学治疗剂是抗代谢物。抗代谢物是这样的化学物质：其结构类似于用于正常生化反应的代谢物，但其差异足以干扰细胞的一种或多种正常功能，如细胞分裂。抗代谢物包括但不限于吉西他滨、氟尿嘧啶、卡培他滨、甲氨蝶呤钠、雷替曲塞(ralitrexed)、培美曲塞(pemetrexed)、替加氟(tegafur)、胞嘧啶阿拉伯糖苷、硫鸟嘌呤、5-氮胞苷、6巯嘌呤、硫唑嘌呤、6-硫鸟嘌呤、喷司他丁、磷酸氟达拉滨和克拉屈滨(cladribine)以及任何这些药物的药学上可接受的盐、酸或衍生物。在某些实施方案中，附加治疗剂是吉西他滨。
在某些实施方案中，所述化学治疗剂是抗有丝分裂剂，包括但不限于结合微管蛋白的药剂。在一些实施方案中，该药剂是紫杉烷。在某些实施方案中，该药剂是紫杉醇或多西紫杉醇，或者是紫杉醇或多西紫杉醇的药学上可接受的盐、酸或衍生物。在某些实施方案中，该药剂是紫杉醇(TAXOL)、多西紫杉醇(TAXOTERE)、白蛋白结合型紫杉醇(ABRAXANE)、DHA-紫杉醇或PG-紫杉醇。在某些替代实施方案中，所述抗有丝分裂剂包含长春花生物碱，如长春新碱、长春碱、长春瑞滨或长春地辛，或其药学上可接受的盐、酸或衍生物。在一些实施方案中，所述抗有丝分裂剂是驱动蛋白Eg5的抑制剂或有丝分裂激酶的抑制剂，如AuroraA或Plk1。在某些实施方案中，附加治疗剂是紫杉醇。在一些实施方案中，附加治疗剂是白蛋白结合型紫杉醇。
在一些实施方案中，附加治疗剂包含诸如小分子的药剂。例如，治疗可涉及将本发明的药剂与充当针对肿瘤相关抗原(包括但不限于EGFR、HER2(ErbB2)和/或VEGF)的抑制剂的小分子联合施用。在一些实施方案中，药剂与选自下组的蛋白激酶抑制剂联合施用：吉非替尼(IRESSA)、厄洛替尼(TARCEVA)、舒尼替尼(SUTENT)、拉帕替尼(lapatanib)、凡德他尼(ZACTIMA)、AEE788、CI-1033、西地尼布(RECENTIN)、索拉菲尼(NEXAVAR)和帕唑帕尼(GW786034B)。在一些实施方案中，附加治疗剂包含mTOR抑制剂。在另一个实施方案中，附加治疗剂是减少Treg细胞数的化学疗法或其它抑制剂。在某些实施方案中，所述治疗剂是环磷酰胺或抗CTLA4抗体。在另一个实施方案中，附加治疗剂减少骨髓来源的抑制细胞的存在。在进一步的实施方案中，附加治疗剂是卡铂紫杉醇(carbotaxol)。在另一个实施方案中，附加治疗剂将细胞转移至1型T辅助细胞应答。在进一步的实施方案中，附加治疗剂是依鲁替尼。
在一些实施方案中，附加治疗剂包含生物分子，如抗体。例如，治疗可涉及将本发明的药剂与针对肿瘤相关抗原的抗体(包括但不限于结合EGFR、HER2/ErbB2和/或VEGF的抗体)联合施用。在某些实施方案中，附加治疗剂是对癌症干细胞标志物具有特异性的抗体。在某些实施方案中，附加治疗剂是作为血管生成抑制剂的抗体(例如，抗VEGF或VEGF受体抗体)。在某些实施方案中，附加治疗剂是贝伐珠单抗(AVASTIN)、雷莫芦单抗(ramucirumab)、曲妥珠单抗(HERCEPTIN)、帕妥珠单抗(OMNITARG)、帕尼单抗(VECTIBIX)、尼妥珠单抗(nimotuzumab)、扎鲁木单抗(zalutumumab)或西妥昔单抗(ERBITUX)。
在某些实施方案中，附加治疗剂包含第二免疫治疗剂。在一些实施方案中，附加免疫治疗剂包括但不限于集落刺激因子、白细胞介素、阻断免疫抑制功能的抗体(例如，抗CTLA-4抗体、抗CD28抗体、抗CD3抗体、抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体、抗TIGIT抗体)、增强免疫细胞功能的抗体(例如，抗GITR抗体、抗OX-40抗体、抗CD40抗体或抗4-1BB抗体)、toll样受体(例如，TLR4、TLR7、TLR9)、可溶性配体(例如，GITRL、GITRL-Fc、OX-40L、OX-40L-Fc、CD40L、CD40L-Fc、4-1BB配体或4-1BB配体-Fc)或B7家族成员(例如，CD80、CD86)。在一些实施方案中，附加免疫治疗剂靶向CTLA-4、CD28、CD3、PD-1、PD-L1、TIGIT、GITR、OX-40、CD-40或4-1BB。
在一些实施方案中，附加治疗剂是免疫检查点抑制剂。在一些实施方案中，该免疫检查点抑制剂是抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体、抗CTLA-4抗体、抗CD28抗体、抗TIGIT抗体、抗LAG3抗体、抗TIM3抗体、抗GITR抗体、抗4-1BB抗体或抗OX-40抗体。在一些实施方案中，附加治疗剂是抗TIGIT抗体。在一些实施方案中，附加治疗剂是选自纳武单抗(OPDIVO)、派姆单抗(KEYTRUDA)、匹地珠单抗(pidilzumab)、MEDI0680、REGN2810、BGB-A317和PDR001的抗PD-1抗体。在一些实施方案中，附加治疗剂是选自BMS935559(MDX-1105)、阿特利珠单抗(atexolizumab)(MPDL3280A)、德瓦鲁单抗(MEDI4736)和阿维鲁单抗(MSB0010718C)的抗PD-L1抗体。在一些实施方案中，附加治疗剂是选自伊匹木单抗(YERVOY)和曲美木单抗的抗CTLA-4抗体。在一些实施方案中，附加治疗剂是选自BMS-986016和LAG525的抗LAG-3抗体。在一些实施方案中，附加治疗剂是选自MEDI6469、MEDI0562和MOXR0916的抗OX-40抗体。在一些实施方案中，附加治疗剂是选自PF-05082566的抗4-1BB抗体。
在一些实施方案中，所述非突变蛋白质表位治疗剂可与选自下组的生物分子联合施用：肾上腺髓质素(AM)、血管生成素(Ang)、BMP、BDNF、EGF、促红细胞生成素(EPO)、FGF、GDNF、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)、干细胞因子(SCF)、GDF9、HGF、HDGF、IGF、迁移刺激因子、肌肉生长抑制素(GDF-8)、NGF、神经营养蛋白、PDGF、促血小板生成素、TGF-α、TGF-β、TNF-α、VEGF、PlGF、γ-IFN、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-12、IL-15和IL-18。
在一些实施方案中，采用本文所述的非突变蛋白质表位治疗剂的治疗可以伴随着手术切除肿瘤、去除癌细胞或治疗医师认为必需的其它任何手术疗法。
在某些实施方案中，治疗涉及与放射疗法联合施用本文所述的非突变蛋白质表位治疗剂。用药剂治疗可以在施用放射疗法之前、同时或之后进行。这类放射疗法的给药方案可由熟练的执业医师确定。
联合施用可包括以单一药物制剂或使用分开的制剂进行共同施用，或以任一顺序连续施用，但通常在一段时间内进行，以使得所有活性剂可同时发挥其生物活性。
应当理解，本文所述的非突变蛋白质表位治疗剂与至少一种附加治疗剂的组合可以以任何顺序或同时施用。在一些实施方案中，将所述药剂施用于先前已经接受第二治疗剂治疗的患者。在某些其它实施方案中，非突变蛋白质表位治疗剂和第二治疗剂基本上同时或并行施用。例如，可以在进行采用第二治疗剂(例如，化学疗法)的疗程的同时给予受试者药剂。在某些实施方案中，在用第二治疗剂治疗的1年内施用非突变蛋白质表位治疗剂。应进一步理解，可在几小时或几分钟内(即，基本上同时)将两种(或更多种)药剂或治疗施用于受试者。
对于疾病的治疗，本文所述的非突变蛋白质表位治疗剂的适当剂量取决于待治疗疾病的类型、疾病的严重程度和病程、疾病的反应性、施用药剂是用于治疗还是预防目的、既往治疗、患者的临床病史等，所有均由治疗医师决定。非突变蛋白质表位治疗剂可以一次性施用或在持续数天至数月的一系列治疗期间施用，或施用直至实现治愈或达到疾病状态减轻(例如，肿瘤大小减小)。最佳给药方案可以根据患者体内药物累积的测量来计算，并且将根据单独药剂的相对效力而不同。施用医师可以确定最佳剂量、给药方法和重复频率。
在一些实施方案中，非突变蛋白质表位治疗剂可以以初始较高的“负荷”剂量施用，然后以一个或多个较低剂量施用。在一些实施方案中，施用频率也可以改变。在一些实施方案中，给药方案可包括施用初始剂量，然后每周一次、每两周一次、每三周一次或每月一次施用额外的剂量(或“维持”剂量)。例如，给药方案可以包括施用初始负荷剂量，然后每周施用例如初始剂量的一半的维持剂量。或者给药方案可以包括施用初始负荷剂量，然后每隔一周施用例如初始剂量的一半的维持剂量。或者给药方案可以包括施用三个初始剂量3周，然后每隔一周施用例如相同量的维持剂量。
如本领域技术人员已知的，任何治疗剂的施用可导致副作用和/或毒性。在一些情况下，副作用和/或毒性非常严重，以至于阻止以治疗有效剂量施用特定药剂。在一些情况下，必须停止治疗，并且可以尝试其它药剂。然而，同一治疗类别中的许多药剂显示出相似的副作用和/或毒性，这意味着患者必须停止治疗，或者如果可能的话，遭受与治疗剂相关的令人不愉快的副作用。
在一些实施方案中，给药方案可以限于特定次数的施用或“循环”。在一些实施方案中，所述药剂施用3、4、5、6、7、8个或更多个循环。例如，所述药剂每2周施用，持续6个循环，所述药剂每3周施用，持续6个循环，所述药剂每2周施用，持续4个循环，所述药剂每3周施用，持续4个循环，等等。给药方案可以由本领域技术人员决定并随后进行修改。
本发明提供了向受试者施用本文所述的非突变蛋白质表位治疗剂的方法，其包括使用间歇给药策略施用一种或多种药剂，这可以减少与药剂、化学治疗剂等的施用相关的副作用和/或毒性。在一些实施方案中，用于治疗人类受试者的癌症的方法包括向受试者施用治疗有效剂量的非突变蛋白质表位治疗剂联合治疗有效剂量的化学治疗剂，其中一种或两种所述药剂根据间歇给药策略施用。在一些实施方案中，用于治疗人类受试者的癌症的方法包括向受试者施用治疗有效剂量的非突变蛋白质表位治疗剂联合治疗有效剂量的第二免疫治疗剂，其中一种或两种所述药剂根据间歇给药策略施用。在一些实施方案中，该间歇给药策略包括向受试者施用初始剂量的非突变蛋白质表位治疗剂，并且大约每2周一次施用后续剂量的药剂。在一些实施方案中，该间歇给药策略包括向受试者施用初始剂量的非突变蛋白质表位治疗剂，并且大约每3周一次施用后续剂量的药剂。在一些实施方案中，该间歇给药策略包括向受试者施用初始剂量的非突变蛋白质表位治疗剂，并且大约每4周一次施用后续剂量的药剂。在一些实施方案中，使用间歇给药策略施用所述药剂，并且每周施用附加治疗剂。
本发明提供了包含本文所述的非突变蛋白质表位治疗剂的组合物。本发明还提供了包含本文所述的非突变蛋白质表位治疗剂和药学上可接受的媒介物的药物组合物。在一些实施方案中，该药物组合物可用于免疫治疗。在一些实施方案中，该组合物可用于抑制肿瘤生长。在一些实施方案中，该药物组合物可用于抑制受试者(例如，人类患者)中的肿瘤生长。在一些实施方案中，该组合物可用于治疗癌症。在一些实施方案中，该药物组合物可用于治疗受试者(例如，人类患者)中的癌症。
通过将本发明的抗原治疗剂与药学上可接受的媒介物(例如，载体或赋形剂)组合，制备制剂以供储存和使用。本领域技术人员通常认为药学上可接受的载体、赋形剂和/或稳定剂是制剂或药物组合物的非活性成分。示例性制剂在WO 2015/095811中列出。
合适的药学上可接受的媒介物包括但不限于无毒性缓冲液，例如磷酸盐、柠檬酸盐和其它有机酸；盐，例如氯化钠；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂，例如十八烷基二甲基苄基氯化铵、氯化六烃季铵、苯扎氯铵、苄索氯铵(benzethonium chloride)、苯酚、丁醇或苯甲醇、对羟苯甲酸烷基酯(如对羟苯甲酸甲酯或对羟苯甲酸丙酯)、邻苯二酚、间苯二酚、环己醇、3-戊醇和间甲酚；低分子量多肽(例如，少于约10个氨基酸残基)；蛋白质，例如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水聚合物，例如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，例如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；碳水化合物，例如单糖、二糖、葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，例如EDTA；糖，例如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；成盐反离子，例如钠；金属络合物，例如Zn-蛋白质络合物；以及非离子表面活性剂，例如吐温(TWEEN)或聚乙二醇(PEG)。(Remington:The Science and Practice of Pharmacy,第22版,2012,Pharmaceutical Press,London)。在一个实施方案中，所述媒介物是5％右旋糖水溶液。
本文所述的药物组合物可以以任何数量的用于局部或全身治疗的方式施用。施用可以是通过表皮或透皮贴剂、软膏、洗剂、乳膏、凝胶、滴剂、栓剂、喷雾剂、液体和粉末的局部施用；通过吸入或吹入粉末或气雾剂(包括通过雾化器、气管内和鼻内)的肺部施用；口服；或胃肠外施用，包括静脉内、动脉内、肿瘤内、皮下、腹膜内、肌肉内(例如，注射或输注)或颅内(例如，鞘内或脑室内)。
治疗制剂可以是单位剂型。这类制剂包括片剂、丸剂、胶囊、粉末、颗粒、水或非水性介质中的溶液或悬浮物或栓剂。
本文所述的非突变蛋白质表位肽也可以包埋在微胶囊中。这类微胶囊例如通过凝聚技术或通过界面聚合来制备，例如分别在胶体药物递送系统(例如，脂质体、白蛋白微球、微乳液、纳米颗粒及纳米胶囊)或粗乳液中的羟甲基纤维素或明胶微胶囊和聚-(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊，如Remington:The Science and Practice of Pharmacy,第22版,2012,Pharmaceutical Press,London中所述。
在某些实施方案中，药物制剂包括与脂质体复合的本文所述的非突变蛋白质表位治疗剂。产生脂质体的方法是本领域技术人员已知的。例如，一些脂质体可以用包含磷脂酰胆碱、胆固醇和PEG衍生的磷脂酰乙醇胺(PEG-PE)的脂质组合物通过反相蒸发产生。通过具有确定孔径的过滤器可挤出脂质体，以产生具有所需直径的脂质体。
在某些实施方案中，可以产生包含本文所述的非突变蛋白质表位肽的缓释制剂。缓释制剂的合适的实例包括含有药剂的固体疏水性聚合物的半透性基质，其中该基质是成型制品(例如，膜或微胶囊)的形式。缓释基质的实例包括聚酯、水凝胶如聚(甲基丙烯酸2-羟乙酯)或聚(乙烯醇)、聚乳酸、L-谷氨酸与L-谷氨酸7乙酯的共聚物、不可降解的乙烯-醋酸乙烯酯、可降解的乳酸-乙醇酸共聚物如LUPRON DEPOTTM(由乳酸-乙醇酸共聚物和醋酸亮丙瑞林组成的可注射微球)、乙酸异丁酸蔗糖酯和聚-D-(-)-3-羟基丁酸。
VIII.试剂盒
本文所述的非突变蛋白质表位治疗剂可连同给药说明书一起以试剂盒形式提供。通常，该试剂盒包括在容器中的单位剂型形式的所需抗原治疗剂和给药说明书。该试剂盒中还可包括附加治疗剂，例如细胞因子、淋巴因子、检查点抑制剂、抗体。其它可能需要的试剂盒组分包括，例如，无菌注射器、加强剂量和其它所需的赋形剂。
将通过具体实施例更详细地描述本发明。提供以下实施例是为了说明的目的，并非旨在以任何方式限制本发明。本领域技术人员将会容易地认识到可以被改变或修改以产生根据本发明的替代实施方案的多种非关键参数。本文列出的所有专利、专利申请和印刷出版物均通过引用整体并入本文。
实施例
实施例1：具有免疫原性潜力的突变序列的鉴别
申请人已发现以下表位在癌症患者中经常出现。
表1
Figure BDA0002301078100000721
Figure BDA0002301078100000731
对于每个表位，都得出非突变蛋白质表位的全长氨基酸序列。标记出在种系蛋白质序列中未发现的任何组成9mer或10mer，并使用可用的算法对在六个常见HLA等位基因(HLA-A01:01、HLA-A02:01、HLA-A03:01、HLA-A24:02、HLA-B07:02和HLA-B08:01)上的结合潜力进行评分。提名评分高于1000nM的任何肽。
表2
Figure BDA0002301078100000732
Figure BDA0002301078100000741
表3
Figure BDA0002301078100000742
Figure BDA0002301078100000751
Figure BDA0002301078100000761
Figure BDA0002301078100000771
Figure BDA0002301078100000781
Figure BDA0002301078100000791
对于每个表位，都得出非突变蛋白质表位的全长氨基酸序列。标记出在种系蛋白质序列中未发现的任何组成9mer或10mer，并使用可用的算法对在六个常见HLA等位基因(HLA-A01:01、HLA-A02:01、HLA-A03:01、HLA-A24:02、HLA-B07:02和HLA-B08:01)上的结合潜力进行评分。提名评分高于1000nM的任何肽。
表4
Figure BDA0002301078100000801
Figure BDA0002301078100000811
Figure BDA0002301078100000821
Figure BDA0002301078100000831
Figure BDA0002301078100000841
表5
Figure BDA0002301078100000851
Figure BDA0002301078100000861
Figure BDA0002301078100000871
对于每个表位，都得出非突变蛋白质表位的全长氨基酸序列。标记出在种系蛋白质序列中未发现的任何组成9mer或10mer，并使用可用的算法对在六个常见HLA等位基因(HLA-A01:01、HLA-A02:01、HLA-A03:01、HLA-A24:02、HLA-B07:02和HLA-B08:01)上的结合潜力进行评分。提名评分高于1000nM的任何肽。
表6
Figure BDA0002301078100000872
Figure BDA0002301078100000881
Figure BDA0002301078100000891
Figure BDA0002301078100000901
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Figure BDA0002301078100000991
Figure BDA0002301078100001001
Figure BDA0002301078100001011
Figure BDA0002301078100001021
Figure BDA0002301078100001031
Figure BDA0002301078100001041
Figure BDA0002301078100001051
Figure BDA0002301078100001061
实施例2：HLA I类和II类结合测定
与HLA分子结合的肽的以下实例证明了HLA I类和II类肽的结合亲和力的定量。可以用带有基序或不带有基序的肽进行结合测定。
EB病毒(EBV)转化的纯合细胞系、成纤维细胞、CIR或721.22转染子用作HLA I类分子的来源。制备细胞裂解物，并按照公开的方案纯化HLA分子(Sidney等人,CurrentProtocols in Immunology 18.3.1(1998)；Sidney等人,J.Immunol.154:247(1995)；Sette等人,Mol.Immunol.31:813(1994))。通过亲和色谱法从裂解物中纯化HLA分子。使裂解物通过与适当抗体偶联的Sepharose CL-4B珠子的柱。然后用1％NP-40、PBS和含有0.4％正辛基葡糖苷的PBS中的10mM Tris-HCL(pH 8.0)洗涤抗HLA柱，并用含有0.4％正辛基葡糖苷的0.15M NaCl中的50mM二乙胺(pH 11.5)洗脱HLA分子。将1/25体积的2.0M Tris(pH6.8)加入洗脱液中以使pH降低至约8.0。然后通过在Centriprep 30浓缩器(Amicon，Beverly，MA)中离心来浓缩洗脱液。通过BCA蛋白质测定(Pierce Chemical Co.，Rockford，IL)评价蛋白质含量，并通过SDS-PAGE来确认。
已经发表了用来测定肽与I类和II类MHC的结合的方案的详细描述(Sette等人,Mol.Immunol.31:813,1994；Sidney等人,in Current Protocols in Immunology,Margulies,Ed.,John Wiley&Sons,New York,Section 18.3,1998)。简言之，在蛋白酶抑制剂混合物的存在下，将纯化的MHC分子(5至500nM)与各种未标记的肽抑制剂和1-10nM 125I-放射性标记的探针肽在含有0.05％Nonidet P-40(NP40)(或者对于H-2IA测定为20％w/v毛地黄皂苷)的PBS中孵育48小时。除了在pH 4.5下进行的DRB1*0301和在pH 5.0下进行的DRB1*1601(DR2w21β1)和DRB4*0101(DRw53)以外，所有测定均在pH 7.0下进行。
孵育后，通过在7.8mm×15cm TSK200柱(TosoHaas 16215，Montgomery ville，PA)上的凝胶过滤使MHC-肽复合体与游离肽分离。因为用于DRB1*1501(DR2w2β1)测定的放射性标记的肽的大尺寸使得在这些条件下结合峰与未结合峰的分离更加困难，所以使用7.8mm×30cm TSK2000柱以0.6mL/min洗脱来进行所有DRB1*1501(DR2w2β1)测定。使来自TSK柱的洗脱液通过Beckman 170放射性同位素检测器，并使用Hewlett-Packard 3396A积分仪绘制并积分放射性，并测定结合肽的分数。
放射性标记的肽使用氯胺-T方法进行碘化。通常，在预实验中，在固定量的放射性标记肽的存在下滴定每种MHC制品，以确定结合总放射性的10-20％所必需的HLA分子的浓度。使用这些HLA浓度进行所有后续抑制和直接结合测定。
因为在这些条件下[标记]<[HLA]且IC50≥[HLA]，所以测得的IC50值是真实KD值的合理近似值。肽抑制剂通常以120μg/ml至1.2ng/ml范围内的浓度进行检测，并在2-4次完全独立的实验中检测。为了允许比较在不同实验中获得的数据，通过将阳性对照的抑制IC50除以每种测试肽(通常是放射性标记的探针肽的未标记形式)的IC50，计算每种肽的相对结合数。对于数据库的目的和实验间的比较，编译相对结合值。随后通过将阳性对照的抑制IC50nM除以目的肽的相对结合来将这些值转换回IC50nM值。已经证明这种数据编译方法对于比较在不同日期或用不同批次的纯化MHC检测的肽是最准确且一致的。
因为用于HLA-DR纯化的抗体(LB3.1)是α-链特异性的，所以β1分子不与β3(和/或β4和β5)分子分离。在没有表达β3的DRB1*0101(DR1)、DRB1*0802(DR8w2)和DRB1*0803(DR8w3)的情况下，结合测定的β1特异性是明显的。对于DRB1*0301(DR3)和DRB3*0101(DR52a)、DRB1*0401(DR4w4)、DRB1*0404(DR4w14)、DRB1*0405(DR4w15)、DRB1*1101(DR5)、DRB1*1201(DR5w12)、DRB1*1302(DR6w19)和DRB1*0701(DR7)也已经得到证明。通过使用成纤维细胞来规避DRB1*1501(DR2w2β1)、DRB5*0101(DR2w2β2)、DRB1*1601(DR2w21β1)、DRB5*0201(DR51Dw21)和DRB4*0101(DRw53)测定的β链特异性的问题。先前已经描述了关于DRβ分子特异性测定的建立和验证(参见，例如，Southwood等人,J.Immunol.160:3363-3373,1998)。
还可以使用基于活细胞/流式细胞术的测定。这是已经确立的使用TAP缺陷型杂交瘤细胞系T2(美国典型培养物保藏中心(ATCC保藏号CRL-1992)，Manassas,VA.)的测定。该细胞系中的TAP缺陷导致ER中MHCI的无效负载和空MHCI的过量。Salter和Cresswell,EMBOJ.5:943-49(1986)；Salter,Immunogenetics 21:235-46(1985)。空MHCI高度不稳定，因此寿命短。当T2细胞在降低的温度下培养时，空MHCI瞬时出现在细胞表面上，在那里它们可以通过外源添加MHCI结合肽来稳定。为了进行该结合测定，通过在26℃下在单独的无血清AIM-V培养基中或在含有递增浓度(0.1至100μM)肽的培养基中培养107个T2细胞的等分试样过夜来诱导肽接受性MHCI。然后用PBS洗涤细胞两次，随后与荧光标记的HLA-A0201特异性单克隆抗体BB7.2一起孵育，以对细胞表面表达进行定量。在FACSCalibur仪器(BectonDickinson)上获得样品，并使用随附的Cellquest软件确定平均荧光强度(MFI)。
实施例3：免疫原性的确认
使用体外教育(IVE)试验来检测每种测试肽扩充CD8+ T细胞的能力。通过以下方式为这些试验准备成熟的专职APC。将从健康人类供体分离的80-90×106个PBMC接种于20ml含有2％人AB血清的RPMI培养基中，并在37℃下孵育2小时，以允许单核细胞的塑料贴附。除去非贴附细胞，并将贴附细胞在RPMI，2％人AB血清，800IU/ml GM-CSF和500IU/mlIL-4中培养。6天后，加入TNF-α至终浓度为10ng/ml。在第7天，通过添加12.5μg/ml聚I:C或0.3μg/ml CD40L使树突细胞(DC)成熟。在第8天收获成熟的树突细胞(mDC)，洗涤，并直接使用或冷冻保存以备将来使用。
对于CD8+ T细胞的IVE，以100μM的终浓度用每种肽对2×105个mDC的等分试样进行脉冲，在37℃下孵育4小时，然后辐照(2500拉德)。将肽脉冲的mDC在含有2％人AB血清的RPMI中洗涤两次。将2×105个mDC和2×106个自体CD8+细胞在24孔板的每个孔中接种在2ml含有2％人AB、20ng/ml IL-7和100pg/ml IL-12的RPMI中，并孵育12天。然后，用肽脉冲的、辐照的mDC重新刺激CD8+ T细胞。两到三天后，加入20IU/ml IL-2和20ng/IL7。每8-10天重新刺激扩充的CD8+ T细胞，并维持在含有IL-2和IL-7的培养基中。使用功能分析和/或四聚体染色的组合监测培养物的肽特异性T细胞。使用修饰的肽和亲本肽的平行IVE允许比较所述肽扩充肽特异性T细胞的相对效率
CD8+ T细胞的定量和功能评估
四聚体染色
MHC四聚体是购买的或现场制备的，并且用来在IVE试验中测定肽特异性T细胞扩充。为了进行评估，根据制造商的说明书将四聚体加入到含有1％FCS和0.1％叠氮钠(FACS缓冲液)的PBS中的1×105个细胞中。将细胞在室温下在黑暗中孵育20分钟。然后添加对T细胞标志物如CD8具有特异性的抗体至制造商建议的最终浓度，并将细胞在4℃下在黑暗中孵育20分钟。用冷的FACS缓冲液洗涤细胞，并将其重悬浮于含有1％甲醛的缓冲液中。在FACSCalibur(Becton Dickinson)仪器上获得细胞，并通过使用Cellquest软件(BectonDickinson)进行分析。为了分析四聚体阳性细胞，从前向和侧向散射图上选取淋巴细胞门(gate)。数据被报告为CD8+/四聚体+细胞的百分比。
ELISPOT
使用ELISPOT测定(BD Biosciences)对肽特异性T细胞进行功能性计数，该测定在单细胞基础上测定IFNγ从T细胞的释放。将靶细胞(T2或HLA-A0201转染的C1R)用10μM肽在37℃下脉冲1小时，并洗涤三次。将1×105个肽脉冲的靶标在ELISPOT板孔中与取自IVE培养物的不同浓度的T细胞(5×102至2×103)共培养。根据制造商的方案对板进行显色，并在ELISPOT读取仪(Cellular Technology Ltd.)上使用随附的软件进行分析。将对应于产生IFNγ的T细胞数的斑点报告为绝对斑点数/接种的T细胞数。对于在修饰的肽上扩充的T细胞，不仅检测它们识别用修饰的肽脉冲的靶标的能力，而且还检测它们识别用亲本肽脉冲的靶标的能力。
CD107染色
在用同源肽活化后，CD107a和b在CD8+ T细胞的细胞表面上表达。T细胞的裂解颗粒具有含有溶酶体相关膜糖蛋白(“LAMP”)的脂双层，该溶酶体相关膜糖蛋白包括分子CD107a和b。当通过T细胞受体激活细胞毒性T细胞时，这些裂解颗粒的膜动员并与T细胞的质膜融合。颗粒内容物被释放，并且这导致靶细胞死亡。当颗粒膜与质膜融合时，C107a和b暴露在细胞表面上，因此是脱颗粒的标志物。因为如通过CD107a和b染色测定的脱颗粒是在单细胞基础上报告的，所以该测定用来对肽特异性T细胞进行功能性计数。为了进行该测定，将肽加入到HLA-A0201转染的细胞C1R中至终浓度为20μM，将细胞在37℃下孵育1小时，并洗涤三次。将1×105个肽脉冲的C1R细胞等分到试管中，并添加CD107a和b特异性抗体至制造商(Becton Dickinson)建议的最终浓度。在加入T细胞之前加入抗体，以“捕获”CD107分子，因为它们在测定过程中瞬时出现在表面上。然后加入来自IVE培养物的1×105个T细胞，并将样品在37℃下孵育4小时。针对其它细胞表面分子如CD8对T细胞进一步染色，并且在FACS Calibur仪器(Becton Dickinson)上获得所述T细胞。使用随附的Cellquest软件分析数据，并将结果报告为CD8+CD107 a和b+细胞的百分比。
CTL裂解
使用铬释放试验测定细胞毒活性。将靶T2细胞在37℃下用Na51Cr标记1小时，然后将洗涤过的5×103个靶T2细胞加入到来自IVE培养物的不同数目的T细胞。在37℃下孵育4小时后收获的上清液中测定铬释放。特异性裂解的百分比计算如下：
实验释放-自发释放/总释放-自发释放×100
实施例4：用于包含在肿瘤特异性疫苗中的CTL和HTL表位的选择。
该实施例说明了为本发明疫苗组合物选择肽表位的程序。该组合物中的肽可以是核酸序列(编码肽的单一序列或一个或多个序列(即，小基因))的形式，或者可以是单表位和/或多表位肽。
选择在施用后模拟已观察到与肿瘤清除相关的免疫应答的表位。例如，疫苗可包括来自至少一个肿瘤抗原区域的1-2个表位。来自一个区域的表位可以与来自一个或多个其它肿瘤抗原区域的表位组合使用。
可选择对HLA I类分子具有500nM或更小的IC50或对HLA II类分子具有1000nM或更小的IC50的结合亲和力的表位。
当产生多表位组合物例如小基因时，通常需要产生包含感兴趣的表位的可能的最小肽。所采用的原理与在选择包含嵌套表位的肽时所采用的原理相似(如果不相同的话)。然而，另外，在确定要作为小基因提供的核酸序列时，分析由其编码的肽序列以确定是否已经产生任何“连接表位”。连接表位是潜在的HLA结合表位，例如，如通过基序分析所预测的。通常要避免连接表位，因为受体可以与HLA分子结合并产生对该表位的免疫应答，该表位在天然蛋白质序列中不存在。
用于包含在疫苗组合物中的肽表位，例如，选自表中列出的那些肽表位。当施用时，由所选肽组成的疫苗组合物是安全、有效的，并且引发类似于抑制肿瘤生长的免疫应答的量级的免疫应答。
实施例6：用于预防或治疗应用的肽组合物
本发明的免疫原性或疫苗组合物用来抑制肿瘤生长。例如，将含有多个CTL和HTL表位的多表位组合物(或包含该表位的核酸)施用于具有肿瘤的个体。该组合物作为包含多个表位的单一酯化多肽提供。该组合物在由明矾组成的水性载体中施用。对于70kg的患者，用于初始免疫的肽的剂量为约1μg至约50,000μg，通常为100-5,000μg。初始施用后在4周时施用加强剂量，然后通过确定PBMC样品中是否存在表位特异性CTL群体的技术评估患者中免疫应答的量级。根据需要施用额外的加强剂量。发现所述组合物对于抑制肿瘤生长既安全又有效。
或者，根据本领域已知的和本文公开的方法，所述多表位组合物可以作为核酸施用，例如作为RNA施用。
非突变蛋白质表位结合剂，如TCR或CAR，可以根据本领域已知的和本文公开的方法施用。所述结合剂可以作为编码结合剂的多肽或多核苷酸(例如RNA)施用，或者作为细胞疗法通过施用表达该结合剂的细胞来施用。
非突变蛋白质表位肽、多核苷酸、结合剂或表达这些分子的细胞可以通过本领域已知的多种方法递送至相同的患者，并且可以进一步与其它癌症疗法(例如，化学治疗、手术、放射、检查点抑制剂等)联合。
实施例6：使用树突细胞施用组合物
可以使用树突细胞施用包含本发明的表位的疫苗。在该实施例中，可以将肽脉冲的树突细胞施用于患者以在体内刺激CTL应答。在该方法中，将树突细胞分离、扩充，并用包含本发明的肽CTL和HTL表位的疫苗脉冲。将所述树突细胞输注回患者体内，以在体内引发CTL和HTL应答。诱导的CTL和HTL然后破坏(CTL)或促进特异性靶肿瘤细胞的破坏(HTL)，所述特异性靶肿瘤细胞携带衍生出疫苗中的表位的蛋白质。
或者，可以通过在组织培养物中孵育患者的或遗传上相容的CTL或HTL前体细胞与抗原呈递细胞如树突细胞来源和适当的免疫原性肽，来诱导对特定肿瘤相关抗原的离体CTL或HTL应答。
在使得前体细胞被活化并扩充成效应细胞的适当孵育时间(通常约7-28天)后，将所述细胞输注回患者体内，在其中它们将破坏(CTL)或促进其特异性靶细胞(即，肿瘤细胞)的破坏(HTL)。
实施方案段落
一种分离的抗原肽，其包含来自表1或表2中的序列的表位。
一种分离的抗原肽，其长度为100个或更少的氨基酸，其包含来自表1或表2中的序列的表位。
一种分离的抗原肽，其包含来自表3或4中的序列的表位。
一种分离的抗原肽，其长度为100个或更少的氨基酸，其包含表3或4中的序列的表位。
一种分离的抗原肽，其包含来自表5或表6中的序列的表位。
一种分离的抗原肽，其长度为100个或更少的氨基酸，其包含来自表5或表6中的序列的表位。
第[00291]或[00292]段的分离的抗原肽，其中所述分离的抗原肽是逆转录病毒抗原。
第[00293]或[00294]段的分离的抗原肽，其中所述分离的抗原肽是非突变的过表达的抗原。
第[00295]或[00296]段的分离的抗原肽，其中所述分离的抗原肽是病毒抗原。
第[00291]-[00299]段中任一段的分离的抗原肽，其长度为约5至约50个氨基酸。
第[00291]-[00300]段中任一段的分离的抗原肽，其长度为约15至约35个氨基酸。
第[00301]段的分离的抗原肽，其长度为约15个或更少的氨基酸。
第[00302]段的分离的抗原肽，其长度为约8至约11个氨基酸。
第[00303]段的分离的抗原肽，其长度为9或10个氨基酸。
第[00291]-[00304]段中任一段的分离的抗原肽，其结合主要组织相容性复合体(MHC)I类。
第[00305]段的分离的抗原肽，其以小于约500nM的结合亲和力结合MHC I类。
第[00291]-[00296]段中任一段的分离的抗原肽，其长度为约30个或更少的氨基酸。
第[00307]段的分离的抗原肽，其长度为约6至约25个氨基酸。
第[00308]段的分离的抗原肽，其长度为约15至约24个氨基酸。
第[00308]段的分离的抗原肽，其长度为约9至约15个氨基酸。
第[00291]-[00296]和[00307]-[00310]段中任一段的分离的抗原肽，其结合MHCII类。
第[00311]段的分离的抗原肽，其以小于约1000nM的结合亲和力结合MHC II类。
第[00291]-[00312]段中任一段的分离的抗原肽，其进一步包含侧翼氨基酸。
第[00313]段的分离的抗原肽，其中所述侧翼氨基酸不是天然的侧翼氨基酸。
第[00291]-[00314]段中任一段的分离的抗原肽，其与至少第二抗原肽连接。
第[00315]段的分离的抗原肽，其中所述肽使用聚甘氨酸或聚丝氨酸连接体连接。
第[00315]或[00316]段的分离的抗原肽，其中所述第二抗原肽以小于约1000nM的结合亲和力结合MHC I类或II类。
第[00317]段的分离的抗原肽，其中所述第二抗原肽以小于约500nM的结合亲和力结合MHC I类或II类。
第[00317]或[00318]段的分离的抗原肽，其中所述两种表位均与人白细胞抗原(HLA)-A、-B、-C、-DP、-DQ或-DR结合。
第[00317]-[00319]段中任一段的分离的抗原肽，其中所述分离的抗原肽结合I类HLA，并且所述第二抗原肽结合II类HLA。
第[00317]-[00319]段中任一段的分离的抗原肽，其中所述分离的抗原肽结合II类HLA，并且所述第二抗原肽结合I类HLA。
第[00291]-[00321]段中任一段的分离的抗原肽，其进一步包含增加体内半衰期、细胞靶向、抗原摄取、抗原加工、MHC亲和力、MHC稳定性或抗原呈递的修饰。
第[00322]段的分离的抗原肽，其中所述修饰是与载体蛋白缀合、与配体缀合、与抗体缀合、PEG化、多唾液酸化、HES化、重组PEG模拟物、Fc融合、白蛋白融合、纳米颗粒附着、纳米颗粒包封、胆固醇融合、铁融合、酰化、酰胺化、糖基化、侧链氧化、磷酸化、生物素化、添加表面活性材料、添加氨基酸模拟物或添加非天然氨基酸。
第[00322]段的分离的抗原肽，其中所靶向的细胞是抗原呈递细胞。
第[00324]段的分离的抗原肽，其中所述抗原呈递细胞是树突细胞。
第[00325]段的分离的抗原肽，其中使用DEC205、XCR1、CD197、CD80、CD86、CD123、CD209、CD273、CD283、CD289、CD184、CD85h、CD85j、CD85k、CD85d、CD85g、CD85a、CD141、CD11c、CD83、TSLP受体或CD1a标志物来靶向所述树突细胞。
第[00326]段的分离的抗原肽，其中使用CD141、DEC205或XCR1标志物来靶向所述树突细胞。
一种体内递送系统，其包含第[00291]-[00327]段中任一段的分离的抗原肽。
第[00328]段的递送系统，其中所述递送系统包括细胞穿透肽、纳米颗粒包封、病毒样颗粒或脂质体。
第[00328]段的递送系统，其中所述细胞穿透肽是TAT肽、单纯疱疹病毒VP22、转运蛋白或Antp。
一种细胞，其包含第[00291]-[00327]段中任一段的分离的抗原肽。
第[00331]段的细胞，其为抗原呈递细胞。
第[00332]段的细胞，其为树突细胞。
一种组合物，其包含第[00291]-[00327]段中任一段的分离的抗原肽。
第[00334]段的组合物，其中所述组合物包含至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25、至少26、至少27、至少28、至少29或至少30种分离的抗原肽，所述抗原肽包含表1或表2中限定的肿瘤特异性表位。
第[00334]段的组合物，其中所述组合物包含至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25、至少26、至少27、至少28、至少29或至少30种分离的抗原肽，所述抗原肽包含表3或表4中限定的肿瘤特异性表位。
第[00334]段的组合物，其中所述组合物包含至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25、至少26、至少27、至少28、至少29或至少30种分离的抗原肽，所述抗原肽包含表5或表6中限定的肿瘤特异性表位。
第[00335]-[00337]段中任一段的组合物，其中所述组合物包含2-20种抗原肽。
第[00334]-[00338]段中任一段的组合物，其中所述组合物进一步包含至少1、至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24或至少25、至少26、至少27、至少28、至少29或至少30种附加抗原肽。
第[00339]段的组合物，其中所述组合物包含约4至约20种附加抗原肽。
第[00334]-[00340]段中任一段的组合物，其中所述附加抗原肽对个体患者的肿瘤是特异性的。
第[00341]段的组合物，其中所述患者特异性抗原肽通过鉴定所述患者的肿瘤样品的基因组、外显子组和/或转录组与非肿瘤样品的基因组、外显子组和/或转录组之间的序列差异来选择。
第[00337]段的组合物，其中所述样品是新鲜的或福尔马林固定、石蜡包埋的肿瘤组织、新鲜分离的细胞或循环肿瘤细胞。
第[00342]或[00343]段的组合物，其中所述序列差异通过下一代测序来确定。
一种分离的多核苷酸，其编码第[00291]-[00300]段中任一段的分离的抗原肽。
第[00345]段的分离的多核苷酸，其为RNA，任选地为自扩增RNA。
第[00346]段的分离的多核苷酸，其中对所述RNA进行修饰，以增加稳定性，增加细胞靶向，提高翻译效率、佐剂性、胞质可及性，并且/或者降低细胞毒性。
第[00347]段的分离的多核苷酸，其中所述修饰是与载体蛋白缀合、与配体缀合、与抗体缀合、密码子优化、增加GC含量、掺入修饰的核苷、掺入5’-帽或帽类似物和/或掺入未掩蔽的聚-A序列。
一种细胞，其包含第[00345]-[00348]段中任一段的多核苷酸。
一种载体，其包含第[00345]-[00348]段中任一段的多核苷酸。
第[00350]段的载体，其中所述多核苷酸可操作地连接至启动子。
第[00350]或[00351]段的载体，其为自扩增RNA复制子、质粒、噬菌体、转座子、粘粒、病毒或病毒体。
第[00352]段的载体，其为腺相关病毒、疱疹病毒、慢病毒或其假型。
一种体内递送系统，其包含第[00345]-[00348]段中任一段的分离的多核苷酸。
第[00350]段的递送系统，其中所述递送系统包括球形核酸、病毒、病毒样颗粒、质粒、细菌质粒或纳米颗粒。
一种细胞，其包含第[00350]-[00355]段中任一段的载体或递送系统。
第[00356]段的细胞，其为抗原呈递细胞。
第[00357]段的细胞，其为树突细胞。
第[00358]段的细胞，其为未成熟的树突细胞。
一种组合物，其包含至少一种第[00345]-[00348]段中任一段的多核苷酸。
第[00360]段的组合物，其中所述组合物包含至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25、至少26、至少27、至少28、至少29或至少30种分离的多核苷酸。
第[00361]段的组合物，其中所述组合物包含约2至约20种多核苷酸。
第[00360]-[00362]段中任一段的组合物，其中所述组合物进一步包含至少1、至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25、至少26、至少27、至少28、至少29或至少30种编码附加抗原肽的附加抗原多核苷酸。
第[00363]段的组合物，其中所述组合物包含约4至约20种附加抗原多核苷酸。
第[00363]段的组合物，其中所述分离的多核苷酸和所述附加抗原多核苷酸连接起来。
第[00365]段的组合物，其中所述多核苷酸使用编码聚甘氨酸或聚丝氨酸连接体的核酸进行连接。
第[00360]-[00366]段中任一段的组合物，其中至少一种所述附加抗原肽对个体患者的肿瘤是特异性的。
第[00367]段的组合物，其中所述患者特异性抗原肽通过鉴定所述患者的肿瘤样品的基因组、外显子组和/或转录组与非肿瘤样品的基因组、外显子组和/或转录组之间的序列差异来选择。
第[00368]段的组合物，其中所述样品是新鲜的或福尔马林固定、石蜡包埋的肿瘤组织、新鲜分离的细胞或循环肿瘤细胞。
第[00368]或[00369]段的组合物，其中所述序列差异通过下一代测序来确定。
一种T细胞受体(TCR)，其能够结合至少一种在第[00291]-[00324]段的任一段中列出的抗原肽。
第[00371]段的TCR，其能够在MHC I类或II类的环境中结合所述分离的抗原肽。
一种嵌合抗原受体，其包含：(i)T细胞活化分子；(ii)跨膜区；以及(iii)能够结合第[00291]-[00324]段中任一段的分离的抗原肽的抗原识别部分。
第[00373]段的嵌合抗原受体，其中CD3-ζ是所述T细胞活化分子。
第[00373]或[00374]段的嵌合抗原受体，其进一步包含至少一个共刺激信号传导域。
第[00373]-[00375]段中任一段的嵌合抗原受体，其中所述信号传导域是CD28、4-1BB、ICOS、OX40、ITAM或FcεRI-γ。
第[00373]-[00376]段中任一段的嵌合抗原受体，其中所述抗原识别部分能够在MHC I类或II类的环境中结合所述分离的抗原肽。
第[00373]-[00377]段中任一段的嵌合抗原受体，其包含CD3-ζ、CD28、CTLA-4、ICOS、BTLA、KIR、LAG3、CD137、OX40、CD27、CD40L、Tim-3、A2aR或PD-1跨膜区。
第[00373]-[00378]段中任一段的嵌合抗原受体，其中所述肿瘤特异性表位位于肿瘤相关多肽的细胞外结构域中。
一种T细胞，其包含第[00371]-[00379]段中任一段的T细胞受体或嵌合抗原受体。
第[00380]段的T细胞，其为辅助T细胞或细胞毒性T细胞。
一种核酸，其包含与编码第[00371]或[00372]段的T细胞受体的多核苷酸可操作地连接的启动子。
第[00382]段的核酸，其中所述TCR能够在主要组织相容性复合体(MHC)I类或II类的环境中结合所述至少一种抗原肽。
一种核酸，其包含与编码第[00373]-[00379]段中任一段的嵌合抗原受体的多核苷酸可操作地连接的启动子。
第[00384]段的核酸，其中所述抗原识别部分能够在主要组织相容性复合体(MHC)I类或II类的环境中结合所述至少一种抗原肽。
第[00384]或[00385]段的核酸，其中所述肿瘤特异性表位位于肿瘤相关多肽的细胞外结构域中。
第[00384]-[00386]段中任一段的核酸，其包含CD3-ζ、CD28、CTLA-4、ICOS、BTLA、KIR、LAG3、CD137、OX40、CD27、CD40L、Tim-3、A2aR或PD-1跨膜区。
能够结合至少一种表1或表2中列出的抗原肽的抗体。
能够结合至少一种表3或表4中列出的抗原肽的抗体。
能够结合至少一种表5或表6中列出的抗原肽的抗体。
第[00388]段的抗体，其中所述至少一种表1或表2中列出的抗原肽是逆转录病毒抗原肽。
第[00389]段的抗体，其中所述至少一种表3或表4中列出的抗原肽是非突变的过表达的抗原肽。
第[00390]段的抗体，其中所述至少一种表5或表6中列出的抗原肽是病毒抗原肽。
用第[00382]-[00387]段中任一段的核酸转染或转导的修饰的细胞。
第[00394]段的修饰的细胞，其中所述修饰的细胞是T细胞、肿瘤浸润淋巴细胞、NK-T细胞、表达TCR的细胞、CD4+ T细胞、CD8+ T细胞或NK细胞。
一种组合物，其包含第[00371]-[00379]段中任一段的T细胞受体或嵌合抗原受体。
一种包含自体患者T细胞的组合物，所述患者自体T细胞包含第[00371]-[00379]段中任一段的T细胞受体或嵌合抗原受体。
第[00395]或[00396]段的组合物，其进一步包含免疫检查点抑制剂。
第[00396]或[00397]段的组合物，其进一步包含至少两种免疫检查点抑制剂。
第[00398]或[00399]段的组合物，其中每种所述免疫检查点抑制剂抑制选自CTLA-4、PDL1、PDL2、PD1、B7-H3、B7-H4、BTLA、HVEM、TIM3、GAL9、LAG3、VISTA、KIR、2B4、CD160、CGEN-15049、CHK1、CHK2、A2aR和B-7家族配体或其组合的检查点蛋白。
第[00398]或[00399]段的组合物，其中每种所述免疫检查点抑制剂与选自CTLA-4、PDL1、PDL2、PD1、B7-H3、B7-H4、BTLA、HVEM、TIM3、GAL9、LAG3、VISTA、KIR、2B4、CD160、CGEN-15049、CHK1、CHK2、A2aR和B-7族配体或其组合的检查点蛋白的配体相互作用。
第[00334]-[00344]、[00360]-[00369]和[00396]-[00401]段中任一段的组合物，其进一步包含免疫调节剂或佐剂。
第[00402]段的组合物，其中所述免疫调节剂是共刺激配体、TNF配体、Ig超家族配体、CD28、CD80、CD86、ICOS、CD40L、OX40、CD27、GITR、CD30、DR3、CD69或4-1BB。
第[00402]段的组合物，其中所述免疫调节剂是至少一种癌细胞或癌细胞提取物。
第[00404]段的组合物，其中所述癌细胞对于需要该组合物的受试者是自体的。
第[00405]段的组合物，其中所述癌细胞已经经历裂解或已经暴露于UV辐射。
第[00402]段的组合物，其中所述组合物进一步包含佐剂。
第[00407]段的组合物，其中所述佐剂选自：聚(I:C)、聚-ICLC、STING激动剂、1018ISS、铝盐、Amplivax、AS15、BCG、CP-870,893、CpG7909、CyaA、dSLIM、GM-CSF、IC30、IC31、咪喹莫特、ImuFact IMP321、IS Patch、ISS、ISCOMATRIX、JuvImmune、LipoVac、MF59、单磷酰脂质A、Montanide IMS 1312 VG、Montanide ISA 206 VG、Montanide ISA 50 V2、Montanide ISA 51 VG、OK-432、OM-174、OM-197-MP-EC、ISA-TLR2激动剂、ONTAK、
Figure BDA0002301078100001221
载体系统、PLG微粒、瑞喹莫德、SRL172、病毒小体和其它病毒样颗粒、YF-17D、VEGF trap、R848、β-葡聚糖、Pam3Cys、Pam3CSK4、丙烯酸或甲基丙烯酸聚合物、马来酸酐共聚物和QS21刺激子。
第[00407]或[00408]段的组合物，其中所述佐剂在施用于受试者时诱导体液应答。
第[00409]段的组合物，其中所述佐剂在施用于受试者时诱导1型T辅助细胞。
一种抑制表达表1或表2中限定的肿瘤特异性表位的肿瘤细胞生长的方法，其包括使所述肿瘤细胞与第[00291]-[00410]段中任一段的肽、多核苷酸、递送系统、载体、组合物、抗体或细胞接触。
一种抑制表达表3或表4中限定的肿瘤特异性表位的肿瘤细胞生长的方法，其包括使所述肿瘤细胞与第[00291]-[00410]段中任一段的肽、多核苷酸、递送系统、载体、组合物、抗体或细胞接触。
一种抑制表达表5或表6中限定的肿瘤特异性表位的肿瘤细胞生长的方法，其包括使所述肿瘤细胞与第[00291]-[00410]段中任一段的肽、多核苷酸、递送系统、载体、组合物、抗体或细胞接触。
一种在有需要的受试者中治疗癌症或引发、增强或延长抗肿瘤应答的方法，该方法包括向所述受试者施用第[00291]-[00410]段中任一段的肽、多核苷酸、载体、组合物、抗体或细胞。
第[00411]-[00414]段中任一段的方法，其中所述受试者是人。
第[00415]段的方法，其中所述受试者患有癌症。
第[00416]段的方法，其中所述癌症选自泌尿生殖系统癌症、肾癌、妇科癌症、肺癌、胃肠癌、头颈癌、恶性胶质母细胞瘤、恶性间皮瘤、非转移性或转移性乳腺癌、恶性黑素瘤、Merkel细胞癌或骨与软组织肉瘤、血液系统肿瘤、多发性骨髓瘤、急性髓性白血病、慢性髓性白血病、骨髓增生异常综合征和急性淋巴母细胞白血病、非小细胞肺癌(NSCLC)、三阴性乳腺癌(TNBC)、阴燃骨髓瘤(SMM)、乳腺癌、转移性结直肠癌、激素敏感性或激素难治性前列腺癌、结直肠癌、卵巢癌、肝细胞癌、肾细胞癌、胰腺癌、胃癌、食道癌、肝细胞癌、胆管细胞癌、头颈部鳞状细胞癌、软组织肉瘤和小细胞肺癌。
第[00411]-[00417]段中任一段的方法，其中所述受试者已经经历手术切除所述肿瘤。
第[00411]-[00418]段中任一段的方法，其中所述肽、多核苷酸、载体、组合物或细胞通过静脉内、腹膜内、瘤内、皮内或皮下给药来施用。
第[00419]段的方法，其中将所述肽、多核苷酸、载体、组合物或细胞施用于汇入淋巴结盆的解剖部位。
第[00420]段的方法，其中所述施用是进入多个淋巴结盆。
第[00411]-[00421]段中任一段的方法，其中所述施用通过皮下或皮内途径进行。
第[00419]段的方法，其中施用肽。
第[00423]段的方法，其中所述施用是瘤内施用。
第[00419]段的方法，其中施用多核苷酸，任选地施用RNA。
第[00419]或[00425]段的方法，其中所述多核苷酸通过静脉内施用。
第[00419]段的方法，其中所述细胞是T细胞或树突细胞。
第[00419]或[00427]段的方法，其中所述肽或多核苷酸包含抗原呈递细胞靶向部分。
第[00411]-[00428]段中任一段的方法，其进一步包括向所述受试者施用至少一种免疫检查点抑制剂。
第[00429]段的方法，其中所述检查点抑制剂是生物治疗剂或小分子。
第[00429]或[00430]段的方法，其中所述检查点抑制剂选自单克隆抗体、人源化抗体、完全人抗体和融合蛋白或其组合。
第[00429]-[00431]段中任一段的方法，其中所述检查点抑制剂抑制选自CTLA-4、PDL1、PDL2、PD1、B7-H3、B7-H4、BTLA、HVEM、TIM3、GAL9、LAG3、VISTA、KIR、2B4、CD160、CGEN-15049、CHK1、CHK2、A2aR和B-7家族配体或其组合的检查点蛋白。
第[00429]-[00432]段中任一段的方法，其中所述检查点抑制剂与选自CTLA-4、PDL1、PDL2、PD1、B7-H3、B7-H4、BTLA、HVEM、TIM3、GAL9、LAG3、VISTA、KIR、2B4、CD160、CGEN-15049、CHK 1、CHK2、A2aR和B-7家族配体或其组合的检查点蛋白的配体相互作用。
第[00429]-[00433]段中任一段的方法，其中施用两种或更多种检查点抑制剂。
第[00434]段的方法，其中所述检查点抑制剂是：(i)伊匹木单抗或曲美木单抗，以及(ii)纳武单抗。
第[00429]-[00435]段中任一段的方法，其中所述检查点抑制剂和所述组合物同时或以任何顺序依次施用。
第[00436]段的方法，其中在所述检查点抑制剂之前施用所述肽、多核苷酸、载体、组合物或细胞。
第[00436]段的方法，其中在所述检查点抑制剂之后施用所述肽、多核苷酸、载体、组合物或细胞。
第[00436]段的方法，其中所述检查点抑制剂的施用在整个抗原肽、多核苷酸、载体、组合物或细胞治疗期间是持续的。
第[00429]-[00439]段中任一段的方法，其中将所述抗原肽、多核苷酸、载体、组合物或细胞治疗施用于对检查点抑制剂治疗仅部分响应或不响应的受试者。
第[00411]-[00428]段中任一段的方法，其中所述组合物通过静脉内或皮下施用。
第[00429]-[00440]段中任一段的方法，其中所述检查点抑制剂通过静脉内或皮下施用。
第[00429]-[00441]段中任一段的方法，其中所述检查点抑制剂在所述组合物的施用部位约2cm内皮下施用。
第[00443]段的方法，其中将所述组合物施用于与所述检查点抑制剂相同的引流淋巴结。
第[00411]-[00444]段中任一段的方法，其进一步包括在用所述肽、多核苷酸、载体、组合物或细胞治疗之前、同时或之后向所述受试者施用附加治疗剂。
第[00445]段的方法，其中所述附加药剂是化学治疗剂、免疫调节药物、免疫代谢调节药物、靶向治疗、辐射、抗血管生成剂或减少免疫抑制的药剂。
第[00446]段的方法，其中所述化学治疗剂是烷化剂、拓扑异构酶抑制剂、抗代谢物或抗有丝分裂剂。
第[00445]段的方法，其中所述附加药剂是抗糖皮质激素诱导的肿瘤坏死因子家族受体(GITR)激动性抗体或抗体片段、依鲁替尼、多西紫杉醇、顺铂或环磷酰胺。
第[00411]-[00448]段中任一段的方法，其引发CD4+ T细胞免疫应答。
第[00411]-[00449]段中任一段的方法，其引发CD4+ T细胞免疫应答和CD8+ T细胞免疫应答。
一种刺激受试者的免疫应答的方法，其包括施用有效量的第[00394]-[00410]段中任一段的修饰的细胞或组合物。
第[00451]段的方法，其中所述免疫应答是细胞毒性和/或体液免疫应答。
第[00451]段的方法，其中所述方法在受试者中刺激T细胞介导的免疫应答。
第[00453]段的方法，其中所述T细胞介导的免疫应答针对靶细胞。
第[00454]段的方法，其中所述靶细胞是肿瘤细胞。
第[00451]-[00455]段中任一段的方法，其中对所述修饰的细胞进行体内转染或转导。
第[00451]-[00456]段中任一段的方法，其中对所述修饰的细胞进行离体转染或转导。
第[00451]-[00457]段中任一段的方法，其中所述修饰的细胞是患者自体T细胞。
第[00458]段的方法，其中所述患者自体T细胞从已接受抗原肽或核酸疫苗的患者获得。
第[00459]段的方法，其中所述抗原肽或核酸疫苗包含至少一种个性化抗原。
第[00460]段的方法，其中所述抗原肽或核酸疫苗包含至少一种表1或表2中列出的附加抗原肽。
第[00460]段的方法，其中所述抗原肽或核酸疫苗包含至少一种表3或表4中列出的附加抗原肽。
第[00460]段的方法，其中所述抗原肽或核酸疫苗包含至少一种表5或表6中列出的附加抗原肽。
第[00461]段的方法，其中所述至少一种表1或表2中列出的附加抗原肽是逆转录病毒抗原肽。
第[00462]段的方法，其中所述至少一种表3或表4中列出的附加抗原肽是非突变的过表达的抗原肽。
第[00463]段的方法，其中所述至少一种表5或表6中列出的附加抗原肽是病毒抗原肽。
第[00461]-[00466]段中任一段的方法，其中所述患者在接受所述抗原肽或核酸疫苗之前和/或期间接受化学治疗剂、免疫调节药物、免疫代谢调节药物、靶向治疗或辐射。
第[00459]-[00467]段中任一段的方法，其中所述患者接受采用至少一种检查点抑制剂的治疗。
第[00459]-[00468]段中任一段的方法，其中所述自体T细胞从已经接受至少一轮含有抗原的T细胞治疗的患者获得。
第[00459]-[00469]段中任一段的方法，其中所述方法进一步包括过继性T细胞治疗。
第[00470]段的方法，其中所述过继性T细胞治疗包括自体T细胞。
第[00471]段的方法，其中所述自体T细胞靶向肿瘤抗原。
第[00470]或[00471]段的方法，其中所述过继性T细胞治疗进一步包括同种异体T细胞。
第[00473]段的方法，其中所述同种异体T细胞靶向肿瘤抗原。
第[00470]-[00474]段中任一段的方法，其中在所述检查点抑制剂之前施用所述过继性T细胞治疗。
一种评价第[00411]-[00475]段中任一段的功效的方法，其包括：(i)在施用修饰的细胞之前测量从受试者获得的第一样品中靶细胞的数目或浓度，(ii)在施用所述修饰的细胞之后测量从所述受试者获得的第二样品中靶细胞的数目浓度，以及(iii)确定与所述第一样品中靶细胞的数目或浓度相比，所述第二样品中靶细胞的数目或浓度的增加或减少。
第[00476]段的方法，其中通过监测以下项目来确定治疗功效：临床结果；T细胞对抗肿瘤活性的增加、增强或延长；与治疗前的数目相比，抗肿瘤T细胞或活化T细胞的数目的增加；B细胞活性；CD4 T细胞活性；或其组合。
第[00477]段的方法，其中通过监测生物标志物来确定治疗功效。
第[00478]段的方法，其中所述生物标志物选自CEA、Her-2/neu、膀胱肿瘤抗原、甲状腺球蛋白、甲胎蛋白、PSA、CA 125、CA19.9、CA 15.3、瘦素、催乳素、骨桥蛋白、IGF-II、CD98、肌成束蛋白、sPIgR、14-3-3η、肌钙蛋白I以及b型利钠肽。
第[00477]段的方法，其中所述临床结果选自肿瘤消退；肿瘤缩小；肿瘤坏死；免疫系统引起的抗肿瘤应答；肿瘤扩大、复发或扩散；或其组合。
第[00477]段的方法，其中通过T细胞的存在或通过指示T细胞炎症的基因标记的存在或其组合来预测治疗效果。
一种在有需要的受试者中治疗癌症或引发、增强或延长抗肿瘤应答的方法，该方法包括向该受试者施用：
第[00291]-[00410]段中任一段的肽、多核苷酸、载体、组合物、抗体或细胞；以及
至少一种检查点抑制剂。
第[00482]段的方法，其进一步包括施用免疫调节剂或佐剂。
第[00483]段的方法，其中所述免疫调节剂或佐剂选自：聚(I:C)、聚-ICLC、STING激动剂、1018ISS、铝盐、Amplivax、AS15、BCG、CP-870,893、CpG7909、CyaA、dSLIM、GM-CSF、IC30、IC31、咪喹莫特、ImuFact IMP321、IS Patch、ISS、ISCOMATRIX、JuvImmune、LipoVac、MF59、单磷酰脂质A、Montanide IMS 1312 VG、Montanide ISA 206 VG、Montanide ISA 50V2、Montanide ISA 51 VG、OK-432、OM-174、OM-197-MP-EC、ISA-TLR2激动剂、ONTAK、
Figure BDA0002301078100001281
载体系统、PLG微粒、瑞喹莫德、SRL172、病毒小体和其它病毒样颗粒、YF-17D、VEGF trap、R848、β-葡聚糖、Pam3Cys、Pam3CSK4、丙烯酸或甲基丙烯酸聚合物、马来酸酐共聚物以及QS21刺激子、共刺激配体、TNF配体、Ig超家族配体、CD28、CD80、CD86、ICOS、CD40L、OX40、CD27、GITR、CD30、DR3、CD69或4-1BB。
第[00484]段的方法，其中所述免疫调节剂或佐剂是聚-ICLC。
第[00482]-[00485]段中任一段的方法，其中所述检查点抑制剂是抗PD1抗体或抗体片段。
第[00486]段的方法，其中所述PD-1途径抑制剂是纳武单抗。
第[00482]-[00485]段中任一段的方法，其中所述检查点抑制剂是抗CTLA4抗体或抗体片段。
第[00488]段的方法，其中所述抗CTLA4抗体是伊匹木单抗或曲美木单抗。
第[00482]-[00489]段中任一段的方法，其中所述方法包括施用抗PD1抗体和抗CTLA4抗体。
第[00482]-[00489]段中任一段的方法，其中在开始施用所述肽、多核苷酸、载体、组合物、抗体或细胞之前开始所述检查点抑制剂的施用。
第[00482]-[00489]段中任一段的方法，其中在开始施用所述肽、多核苷酸、载体、组合物、抗体或细胞之后开始所述检查点抑制剂的施用。
第[00482]-[00489]段中任一段的方法，其中在开始施用所述肽、多核苷酸、载体、组合物、抗体或细胞的同时开始所述检查点抑制剂的施用。
第[00482]-[00493]段中任一段的方法，其中所述肽、多核苷酸、载体、组合物、抗体或细胞通过静脉内或皮下施用。
第[00482]-[00493]段中任一段的方法，其中所述检查点抑制剂通过静脉内或皮下施用。
第[00482]-[00495]段中任一段的方法，其中所述检查点抑制剂在所述肽、多核苷酸、载体、组合物、抗体或细胞的施用部位约2cm内皮下施用。
第[00496]段的方法，其中将所述肽、多核苷酸、载体、组合物、抗体或细胞施用于与所述检查点抑制剂相同的引流淋巴结。
一种试剂盒，其包含第[00291]-[00410]段中任一段的抗原治疗剂。
第[00414]段的方法，其中所述癌症选自：CRC、头颈癌、胃癌、肺鳞癌、肺腺癌、前列腺癌、膀胱癌、胃癌、肾细胞癌和子宫癌。
第[00414]段的方法，其中所述癌症选自：黑素瘤、肺鳞癌、DLBCL、子宫癌、头颈癌、子宫癌、肝癌和CRC。
第[00414]段的方法，其中所述癌症选自：宫颈癌、头颈癌、肛门癌、胃癌、伯基特淋巴瘤和鼻咽癌。
本文提供了一种免疫原性疫苗组合物，其包含肽，该肽包含表1-6任一个中的序列的至少8个连续氨基酸。在一些实施方案中，该肽是合成肽。在一些实施方案中，该肽是重组肽。在一些实施方案中，该肽包含来自内源性逆转录病毒蛋白的序列。在一些实施方案中，该肽包含来自外源性病毒蛋白的序列。在一些实施方案中，该肽包含由患有癌症的受试者的癌细胞表达的蛋白质的序列，其中该蛋白质被所述癌细胞表达的水平高于被该受试者的非癌细胞表达的水平。在一些实施方案中，该肽的长度为100个或更少的氨基酸。在一些实施方案中，该肽的长度为约5至约50个氨基酸或者长度为约15至约35个氨基酸。在一些实施方案中，该肽的长度为约30个或更少的氨基酸，或者长度为约15个或更少的氨基酸。在一些实施方案中，该肽包含以小于约500nM的结合亲和力结合主要组织相容性复合体(MHC)I类的序列。在一些实施方案中，所述肽包含以小于约1000nM的结合亲和力结合主要组织相容性复合体(MHC)II类的序列。在一些实施方案中，该肽进一步包含在所述至少8个连续氨基酸侧翼的非天然氨基酸。在一些实施方案中，所述组合物进一步包含第二肽，第二肽包含表1-6任一个中的序列的至少8个连续氨基酸，其中第二抗原肽以小于约1000nM的结合亲和力结合MHC I类或II类。在一些实施方案中，使用聚甘氨酸或聚丝氨酸连接体连接肽。在一些实施方案中，第二抗原肽以小于约1000nM或小于约500nM的结合亲和力结合MHC I类或II类。在一些实施方案中，该肽进一步包含增加体内半衰期、细胞靶向、抗原摄取、抗原加工、MHC亲和力、MHC稳定性或抗原呈递的修饰。在一些实施方案中，该修饰是与载体蛋白缀合、与配体缀合、与抗体缀合、PEG化、多唾液酸化、HES化、重组PEG模拟物、Fc融合、白蛋白融合、纳米颗粒附着、纳米颗粒包封、胆固醇融合、铁融合、酰化、酰胺化、糖基化、侧链氧化、磷酸化、生物素化、添加表面活性材料、添加氨基酸模拟物或添加非天然氨基酸。在一些实施方案中，该肽包含增加抗原呈递细胞靶向的修饰。在一些实施方案中，该抗原呈递细胞是树突细胞。在一些实施方案中，增加树突细胞靶向的修饰是DEC205、XCR1、CD197、CD80、CD86、CD123、CD209、CD273、CD283、CD289、CD184、CD85h、CD85j、CD85k、CD85d、CD85g、CD85a、CD141、CD11c、CD83、TSLP受体或CD1a标志物。在一些实施方案中，所述组合物包含至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25、至少26、至少27、至少28、至少29或至少30种肽，所述肽各自包含表1-6任一个中的序列的至少8个连续氨基酸。在一些实施方案中，该组合物包含2至20种肽，所述肽各自包含表1-6任一个中的序列的至少8个连续氨基酸。在一些实施方案中，该组合物进一步包含至少1、至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24或至少25、至少26、至少27、至少28、至少29或至少30种附加抗原肽。在一些实施方案中，该附加抗原肽对个体患者的肿瘤是特异性的。在一些实施方案中，该附加抗原肽通过鉴定所述患者的肿瘤样品的基因组、外显子组和/或转录组与非肿瘤样品的基因组、外显子组和/或转录组之间的序列差异来选择。在一些实施方案中，鉴定序列差异包括进行下一代测序。本文提供了包含抗原呈递细胞的组合物，该抗原呈递细胞包含肽，该肽包含表1-6任一个中的序列的至少8个连续氨基酸。在一些实施方案中，该抗原呈递细胞是树突细胞。
本文提供了包含本文所述的组合物的体内递送系统。在一些实施方案中，该递送系统包括细胞穿透肽、纳米颗粒包封、病毒样颗粒或脂质体。在一些实施方案中，该细胞穿透肽是TAT肽、单纯疱疹病毒VP22、转运蛋白或Antp。
本文提供了一种免疫原性疫苗组合物，其包含重组多核苷酸，该重组多核苷酸编码包含表1-6任一个中的序列的至少8个连续氨基酸的肽。在一些实施方案中，该重组多核苷酸是RNA，任选地是自扩增RNA。在一些实施方案中，对该RNA进行修饰，以增加稳定性，增加细胞靶向，提高翻译效率、佐剂性、胞质可及性，并且/或者降低细胞毒性。在一些实施方案中，该修饰是与载体蛋白缀合、与配体缀合、与抗体缀合、密码子优化、增加GC含量、掺入修饰的核苷、掺入5’-帽或帽类似物和/或掺入未掩蔽的聚-A序列。
本文提供了一种包含细胞的组合物，该细胞包含重组多核苷酸，该重组多核苷酸编码包含表1-6任一个中的序列的至少8个连续氨基酸的肽。
本文提供了一种包含载体的组合物，该载体包含含有以下序列的多核苷酸，该序列编码包含表1-6任一个中的序列的至少8个连续氨基酸的肽。在一些实施方案中，该多核苷酸可操作地连接至启动子。在一些实施方案中，该多核苷酸是自扩增RNA复制子、质粒、噬菌体、转座子、粘粒、病毒或病毒体。在一些实施方案中，该病毒是腺相关病毒、疱疹病毒、慢病毒或其假型。
本文提供了包含本文所述的组合物的体内递送系统。在一些实施方案中，该递送系统包括球形核酸、病毒、病毒样颗粒、质粒、细菌质粒或纳米颗粒。
本文提供了一种与肽:MHC复合体特异性结合的T细胞受体(TCR)，其中所述肽:MHC复合体的肽中的肽是包含表1-6任一个中的序列的至少8个连续氨基酸的肽。
本文提供了一种包含与肽:MHC复合体特异性结合的T细胞受体(TCR)的T细胞，其中所述肽:MHC复合体的肽中的肽是包含表1-6任一个中的序列的至少8个连续氨基酸的肽。在一些实施方案中，该T细胞是辅助T细胞或细胞毒性T细胞。在一些实施方案中，该T细胞是患者自体T细胞。
本文提供了一种治疗有需要的受试者中的癌症的方法，其包括向该受试者施用本文所述的组合物；其中该受试者包含癌细胞，所述癌细胞表达包含表1-6任一个中的序列的至少8个连续氨基酸的蛋白质。在一些实施方案中，所述受试者是人。在一些实施方案中，所述癌症选自泌尿生殖系统癌症、妇科癌症、肺癌、胃肠癌、头颈癌、恶性胶质母细胞瘤、恶性间皮瘤、非转移性或转移性乳腺癌、三阴性乳腺癌(TNBC)、恶性黑素瘤、Merkel细胞癌或骨与软组织肉瘤、血液系统肿瘤、多发性骨髓瘤、阴燃骨髓瘤(SMM)、急性髓性白血病、慢性髓性白血病、骨髓增生异常综合征和急性淋巴母细胞白血病、非小细胞肺癌(NSCLC)、乳腺癌、转移性结直肠癌、激素敏感性或激素难治性前列腺癌、结直肠癌、卵巢癌、肝细胞癌、肾细胞癌、胰腺癌、胃癌、食道癌、肝细胞癌、胆管细胞癌、头颈部鳞状细胞癌、软组织肉瘤和小细胞肺癌。在一些实施方案中，该方法进一步包括向所述受试者施用至少一种免疫检查点抑制剂。在一些实施方案中，该检查点抑制剂抑制选自CTLA-4、PDL1、PDL2、PD1、B7-H3、B7-H4、BTLA、HVEM、TIM3、GAL9、LAG3、VISTA、KIR、2B4、CD160、CGEN-15049、CHK 1、CHK2、A2aR和B-7家族配体或其组合的检查点蛋白。

Claims (51)

1.一种免疫原性疫苗组合物，其包含肽，该肽包含表1-6任一个中的序列的至少8个连续氨基酸。
2.根据权利要求1所述的免疫原性疫苗组合物，其中所述肽是合成肽。
3.根据权利要求1所述的免疫原性疫苗组合物，其中所述肽是重组肽。
4.根据权利要求1所述的免疫原性疫苗组合物，其中所述肽包含来自内源性逆转录病毒蛋白的序列。
5.根据权利要求1所述的免疫原性疫苗组合物，其中所述肽包含来自外源性病毒蛋白的序列。
6.根据权利要求1所述的免疫原性疫苗组合物，其中所述肽包含由患有癌症的受试者的癌细胞表达的蛋白质的序列，其中所述蛋白质被所述癌细胞表达的水平高于被所述受试者的非癌细胞表达的水平。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的免疫原性疫苗组合物，其中所述肽的长度为100个或更少的氨基酸。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的免疫原性疫苗组合物，其中所述肽的长度为约5至约50个氨基酸或者长度为约15至约35个氨基酸。
9.根据权利要求1-8中任一项所述的免疫原性疫苗组合物，其中所述肽的长度为约30个或更少的氨基酸，或者长度为约15个或更少的氨基酸。
10.根据权利要求1-9中任一项所述的免疫原性疫苗组合物，其中所述肽包含以小于约500nM的结合亲和力结合主要组织相容性复合体(MHC)I类的序列。
11.根据权利要求1-9中任一项所述的免疫原性疫苗组合物，其中所述肽包含以小于约1000nM的结合亲和力结合主要组织相容性复合体(MHC)II类的序列。
12.根据权利要求1-11中任一项所述的免疫原性疫苗组合物，其中所述肽进一步包含在所述至少8个连续氨基酸侧翼的非天然氨基酸。
13.根据权利要求1-12中任一项所述的免疫原性疫苗组合物，其中所述组合物进一步包含第二肽，所述第二肽包含表1-6任一个中的序列的至少8个连续氨基酸，其中所述第二抗原肽以小于约1000nM的结合亲和力结合MHC I类或II类。
14.根据权利要求13所述的免疫原性疫苗组合物，其中使用聚甘氨酸或聚丝氨酸连接体连接肽。
15.根据权利要求13或14所述的免疫原性疫苗组合物，其中所述第二抗原肽以小于约1000nM或小于约500nM的结合亲和力结合MHCI类或II类。
16.根据权利要求1-15中任一项所述的免疫原性疫苗组合物，其中所述肽进一步包含增加体内半衰期、细胞靶向、抗原摄取、抗原加工、MHC亲和力、MHC稳定性或抗原呈递的修饰。
17.根据权利要求16所述的免疫原性疫苗组合物，其中所述修饰是与载体蛋白缀合、与配体缀合、与抗体缀合、PEG化、多唾液酸化、HES化、重组PEG模拟物、Fc融合、白蛋白融合、纳米颗粒附着、纳米颗粒包封、胆固醇融合、铁融合、酰化、酰胺化、糖基化、侧链氧化、磷酸化、生物素化、添加表面活性材料、添加氨基酸模拟物或添加非天然氨基酸。
18.根据权利要求16所述的免疫原性疫苗组合物，其中所述肽包含增加抗原呈递细胞靶向的修饰。
19.根据权利要求18所述的免疫原性疫苗组合物，其中所述抗原呈递细胞是树突细胞。
20.根据权利要求19所述的免疫原性疫苗组合物，其中所述增加树突细胞靶向的修饰是DEC205、XCR1、CD197、CD80、CD86、CD123、CD209、CD273、CD283、CD289、CD184、CD85h、CD85j、CD85k、CD85d、CD85g、CD85a、CD141、CD11c、CD83、TSLP受体或CD1a标志物。
21.根据权利要求1-20中任一项所述的免疫原性疫苗组合物，其中所述组合物包含至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25、至少26、至少27、至少28、至少29或至少30种肽，所述肽各自包含表1-6任一个中的序列的至少8个连续氨基酸。
22.根据权利要求1-20中任一项所述的免疫原性疫苗组合物，其中所述组合物包含2至20种肽，所述肽各自包含表1-6任一个中的序列的至少8个连续氨基酸。
23.根据权利要求1-22中任一项所述的免疫原性疫苗组合物，其中所述组合物进一步包含至少1、至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24或至少25、至少26、至少27、至少28、至少29或至少30种附加抗原肽。
24.根据权利要求23所述的免疫原性疫苗组合物，其中所述附加抗原肽对个体患者的肿瘤是特异性的。
25.根据权利要求24所述的免疫原性疫苗组合物，其中所述附加抗原肽通过鉴定所述患者的肿瘤样品的基因组、外显子组和/或转录组与非肿瘤样品的基因组、外显子组和/或转录组之间的序列差异来选择。
26.根据权利要求25所述的免疫原性疫苗组合物，其中鉴定序列差异包括进行下一代测序。
27.一种包含抗原呈递细胞的组合物，所述抗原呈递细胞包含肽，所述肽包含表1-6任一个中的序列的至少8个连续氨基酸。
28.根据权利要求27所述的组合物，其中所述抗原呈递细胞是树突细胞。
29.一种体内递送系统，其包含根据权利要求1-28中任一项所述的组合物。
30.根据权利要求29所述的递送系统，其中所述递送系统包括细胞穿透肽、纳米颗粒包封、病毒样颗粒或脂质体。
31.根据权利要求29所述的递送系统，其中所述细胞穿透肽是TAT肽、单纯疱疹病毒VP22、转运蛋白或Antp。
32.一种免疫原性疫苗组合物，其包含重组多核苷酸，所述重组多核苷酸编码包含表1-6任一个中的序列的至少8个连续氨基酸的肽。
33.根据权利要求32所述的免疫原性疫苗组合物，其中所述重组多核苷酸是RNA，任选地是自扩增RNA。
34.根据权利要求33所述的免疫原性疫苗组合物，其中对所述RNA进行修饰，以增加稳定性，增加细胞靶向，提高翻译效率、佐剂性、胞质可及性，并且/或者降低细胞毒性。
35.根据权利要求34所述的免疫原性疫苗组合物，其中所述修饰是与载体蛋白缀合、与配体缀合、与抗体缀合、密码子优化、增加GC含量、掺入修饰的核苷、掺入5’-帽或帽类似物和/或掺入未掩蔽的聚-A序列。
36.一种包含细胞的组合物，所述细胞包含重组多核苷酸，所述重组多核苷酸编码包含表1-6任一个中的序列的至少8个连续氨基酸的肽。
37.一种包含载体的组合物，所述载体包含含有以下序列的多核苷酸，该序列编码包含表1-6任一个中的序列的至少8个连续氨基酸的肽。
38.根据权利要求37所述的组合物，其中所述多核苷酸可操作地连接至启动子。
39.根据权利要求37或38所述的组合物，其中所述多核苷酸是自扩增RNA复制子、质粒、噬菌体、转座子、粘粒、病毒或病毒体。
40.根据权利要求39所述的组合物，其中所述病毒是腺相关病毒、疱疹病毒、慢病毒或其假型。
41.一种体内递送系统，其包含根据权利要求32-40中任一项所述的组合物。
42.根据权利要求41所述的递送系统，其中所述递送系统包括球形核酸、病毒、病毒样颗粒、质粒、细菌质粒或纳米颗粒。
43.一种与肽:MHC复合体特异性结合的T细胞受体(TCR)，其中所述肽:MHC复合体的肽中的肽是包含表1-6任一个中的序列的至少8个连续氨基酸的肽。
44.一种包含与肽:MHC复合体特异性结合的T细胞受体(TCR)的T细胞，其中所述肽:MHC复合体的肽中的肽是包含表1-6任一个中的序列的至少8个连续氨基酸的肽。
45.根据权利要求44所述的T细胞，其为辅助T细胞或细胞毒性T细胞。
46.根据权利要求44或45所述的T细胞，其为患者自体T细胞。
47.一种治疗有需要的受试者中的癌症的方法，其包括向该受试者施用根据权利要求1-28和32-40中任一项所述的组合物；根据权利要求29-31、41和42中任一项所述的递送系统；根据权利要求43所述的TCR；或根据权利要求44-46中任一项所述的T细胞；其中所述受试者包含癌细胞，所述癌细胞表达包含表1-6任一个中的序列的至少8个连续氨基酸的蛋白质。
48.根据权利要求47所述的方法，其中所述受试者是人。
49.根据权利要求47或48所述的方法，其中所述癌症选自泌尿生殖系统癌症、妇科癌症、肺癌、胃肠癌、头颈癌、恶性胶质母细胞瘤、恶性间皮瘤、非转移性或转移性乳腺癌、三阴性乳腺癌(TNBC)、恶性黑素瘤、Merkel细胞癌或骨与软组织肉瘤、血液系统肿瘤、多发性骨髓瘤、阴燃骨髓瘤(SMM)、急性髓性白血病、慢性髓性白血病、骨髓增生异常综合征和急性淋巴母细胞白血病、非小细胞肺癌(NSCLC)、乳腺癌、转移性结直肠癌、激素敏感性或激素难治性前列腺癌、结直肠癌、卵巢癌、肝细胞癌、肾细胞癌、胰腺癌、胃癌、食道癌、肝细胞癌、胆管细胞癌、头颈部鳞状细胞癌、软组织肉瘤和小细胞肺癌。
50.根据权利要求47-49中任一项所述的方法，其进一步包括向所述受试者施用至少一种免疫检查点抑制剂。
51.根据权利要求50所述的方法，其中所述检查点抑制剂抑制选自CTLA-4、PDL1、PDL2、PD1、B7-H3、B7-H4、BTLA、HVEM、TIM3、GAL9、LAG3、VISTA、KIR、2B4、CD160、CGEN-15049、CHK1、CHK2、A2aR和B-7家族配体或其组合的检查点蛋白。
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