CN1678344A - 人乳头状瘤病毒治疗 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了通过给个体施用组合物来治疗个体中的疣的方法，所述组合物含有(1)热激蛋白或其免疫刺激片段和(2)人乳头状瘤病毒蛋白或其抗原片段。本发明还公开了通过给个体施用组合物来治疗已感染或怀疑正被感染第一类型人乳头状瘤病毒的个体所感染的人乳头状瘤病毒的方法，所述组合物含有(1)热激蛋白或其抗原片段和(2)第二类型人乳头状瘤病毒蛋白或其抗原片段，其中第一类型和第二类型不同。

Description

人乳头状瘤病毒治疗
发明领域
本发明涉及治疗人乳头状瘤病毒感染。
发明背景
人乳头状瘤病毒(HPV)感染是常见病。HPV可通过性传播，据估计20-80％的有性活动的成年人已感染了此病毒。但大多数感染没有症状，感染可导致生殖器疣(其在成年人中约有1-5％具有流行性)以及肛殖道癌症的发展。另一类型的癌症，宫颈癌就与HPV密切相关(Frazer，Genitourin.Med.72：398-403，1996)。HPV6、11、16、18、31和33型通常与癌症风险的增加相关，而在90％以上的宫颈癌中检测出有16和/或18型(van Driel等，Ann.Med.28：471-477，1996)。6和11型也与肛殖疣相关。对于乳头状瘤病毒及其相关的病理的综述参见Fields等编，病毒学(Virology)，第3版，Shah等的“第66章：人乳头瘤病毒，”Raven Press，Philadephia，第2077-2109页，1996以及zur Hausen，J.Natl.Cancer Inst.92：690-698，2000。
当前还没有安全可靠的途径通过靶向免疫系统来治疗或预防上述的疣或疾病。开发这样的治疗方法的努力由于若干原因受到阻碍，其中原因之一是来自一个法则，即单一的HPV类型的抗原引起一种限制的类型特异的免疫应答。结果这暗示含有来自若干不同HPV类型的抗原的鸡尾酒对广泛有效的HPV治疗是必需的(Caine等，Science288：1753，2000)。
发明概述
本发明部分基于下列发现：含有来自一种类型HPV的蛋白的融合蛋白可用于治疗由另一类型的HPV感染所引起的疾病或症状。例如，与细菌热激蛋白(hsp)融合的第16型HPV抗原在治疗由除第16型以外的HPV类型(如第6和11型的HPV)所引起的人肛殖疣是有效的。此结果支持两个论点：(1)疣可用HPV蛋白治疗和(2)为了广泛有效，针对HPV的治疗剂不需要含有来自不同HPV类型的蛋白抗原。
因此，本发明的特征是通过给个体施用组合物来治疗个体的疣的方法，所述组合物含有(1)hsp或其免疫刺激片段和(2)HPV蛋白(例如，抗原蛋白如第16型HPV的E7蛋白)或其抗原片段。这些组分本文可分别称为“组分(1)”和“组分(2)”。hsp(或其免疫刺激片段)和HPV蛋白(或其抗原片段)既可被简单地组合在同一种的制剂中也可通过化学共轭或融合而更紧密地结合在一起(即个体可施用具有本文所述组分的融合蛋白或可施用编码该融合蛋白的核酸分子)。组分(1)和组分(2)组合、共轭或融合后将被同时施用。然而，各组分也可分开施用(如按序施用)，以及组分(2)可在没有组分(1)的情况下施用。上述方法包括步骤，其鉴定个体是患有或怀疑患有疣(在治疗个体的情况下，开始施用治疗剂之前要进行鉴定)。医师和本领域中其他普通技术人员能很好地鉴别这些个体。
本发明方法也可用于预防疣，在这种情况下，想要预防疣或将从预防疣中获益的个体(而非已患有疣的个体)要作鉴定。
本发明的特征还是通过给个体施用组合物来治疗个体的方法，所述个体患有以第一类型的HPV(如第5、6、11、18、31、33、35、45、54、60或70型)感染所导致的疾病或症状，所述组合物含有(1)hsp或其免疫刺激片段和(2)第二类型的HPV(如第16型)的蛋白或其抗原片段。即“第一类型”的HPV和“第二类型”的HPV相互是有区别的；它们属于两种不同的HPV类型。hsp(或其免疫刺激片段)和HPV蛋白(或其抗原片段)可被简单地组合在同一种的制剂中或者通过化学共轭或融合而更紧密结合(即人们可施用具有本文描述的组分的融合蛋白或可施用编码该融合蛋白的核酸分子)。组分(1)和组分(2)组合、共轭或融合后将被同时施用。然而，各组分也可分开施用(如按序施用)，以及组分(2)可在没有组分(1)的情况下施用。这里该方法也可包括这步骤，其中对患有或怀疑患有HPV感染(或与此相关的疾病或症状)的个体进行鉴定。
当由第一类型的HPV感染的个体施给包括第二类型的HPV的组合物时，在HPV感染被定型之前，在其一目了然之前或在其已发生之前，可实施该方法(即在治疗或预防开始之前，人们无需了解个体已被感染或将要感染的特定的HPV类型)。当方法是预防性时，它们可包括步骤，其中对想要预防HPV感染或将从预防HPV感染中获益的个体要进行鉴定。
本文所述的组合物施用的量要足以治疗疣(例如通过减小疣的大小或改变疣的形状，或通过缓解与疣相关的症状(如通常与跖疣相关的疼痛)；当个体患有一种以上的疣时，治疗可包括减少疣的数目)。同样，本文所述的组合物施用的量是足以治疗由HPV感染所引起的或与HPV感染相关的疾病(例如，癌症(如宫颈癌或直肠癌))或其他症状(例如，发育异常(如宫颈或直肠发育异常))。尽管上文分别地提及疣，疣也构成由HPV导致或与HPV相关的症状。当与疣或疾病或症状相关的不良的生理效应有减少时，医师和本领域的其他普通技术人员将认可疣或HPV相关疾病或症状的有效“治疗”。疣的临床和生理表现以及与HPV感染相关的疾病或症状的那些表现在例如Fauci等，Harrison’s Principles of Internal Medicine，第14版，McGraw-Hill Press，New York，第302-303页和第1098-1100页，1998中讨论。
从本文所述方法中可获益的“个体”是那些能被乳头状瘤病毒感染的个体(例如，哺乳动物如人、牲畜(如奶牛、马、猪、绵羊和山羊)，家畜(如猫和狗))。疣可以是发生在个体的生殖器、皮肤或内脏上(如出现在声带上的疣，是复发的呼吸性乳头状瘤病(RRP；也已知是青少年喉部乳头状瘤病(JLP)或成人发作的RRP))。
本发明进一步包括依据本文所述的方法，将本文所述的一种或多种组合物(包括那些含有蛋白、蛋白共轭物或融合蛋白或编码它们的核酸分子)用于治疗患有疣或与HPV感染相关(或由HPV感染所导致)的疾病或症状的个体。本发明还包括依据本文所述的方法，利用一种或多种如此组合物来制造药物，用于治疗患有疣或与HPV感染相关(或由HPV感染所导致)的疾病或症状的个体。
蛋白(如HPV蛋白)的“抗原片段”是蛋白的任意部分，当依据本文所述方法施用时，其在个体体内引发免疫反应，所述免疫反应是特异的片段或特异于从中获得该片段的蛋白。免疫反应可以是体液或细胞介导的反应。例如，抗原片段是HLA第I型肽抗原，如下文所述。本领域普通技术人员将认识到本发明上下文中所要的免疫反应不仅可通过完整的蛋白及其片段产生，而且可通过突变蛋白(如那些在其氨基酸序列中含有一个或多个添加、替换(如保守氨基酸替换)或缺失的突变蛋白)产生免疫反应。突变HPV抗原可容易被制备以及对它们在本发明情况下作用的能力进行测试。
蛋白(如hsp)的“免疫刺激片段”是蛋白的任意部分，当依据本文所述的方法施用时，其促进由抗原导致的免疫反应。例如，当HPV蛋白与hsp片段一起(如融合)施用时，如果对HPV蛋白的免疫反应受到促进，则该片段就是hsp的免疫刺激片段。本领域普通技术人员将认识到免疫反应还可通过突变hsp(如在氨基酸序列中含有一个或多个添加、替换(如保守氨基酸替换)或缺失的hsp)受到促进。突变hsp可容易被制备以及对它们促进HPV抗原的免疫反应的能力进行测试。
本发明方法提供了以(即利用)含有另一类型HPV的组合物来进行下列治疗和预防的一个有效方法：(1)治疗和预防疣和(2)治疗和预防用一种类型HPV感染所导致(或与此相关)的疾病或症状。结果，不管它们感染(或它们可变成感染)的是什么类型的HPV，含有单一类型HPV的HPV抗原的组合物可用于许多个体中，如果不是大多数个体。令人惊奇的是HPV组合物在这些情形(即要求交叉反应的情形)下是有效的。人们一直认为一种类型的HPV抗原不能引发有效的抗另一种类型HPV抗原的免疫反应。本发明的其他特征或优点从以下详细的描述以及权利要求书中将表明清楚。
详细描述
本发明涉及广泛有效的含有hsp和HPV蛋白(如蛋白抗原)的基于PHV的治疗剂。无需将本发明限制在其中基于HPV的疗法通过特定机制发挥其效果的方法中，认为该药剂产生免疫反应，改善疣和其他与HPV感染相关的症状(如发育异常)和疾病(如癌症)。特别是当本发明的组合物含有来自一种以上类型HPV的HPV蛋白时，它们可含有来自只有单一类型的HPV蛋白。此外，含有来自单一类型HPV的HPV蛋白的组合物在治疗或预防疣或其他由另一种(即不同)类型的HPV感染所导致的HPV相关的疾病或症状是有用的。适用于本发明有关的各种材料和程序在下文讨论。
融合蛋白的制备
编码hsp和HPV蛋白的核酸序列对本领域普通技术人员来说是已知和可获得的。因此，利用常规方法(同样，这些核酸分子可用于单独生产hsp和HPV蛋白；然后，单个hsp和HPV蛋白可物理地组合(如简单混合在一起)或通过化学共轭(参见下文)或二硫键连接)，可容易制备编码本发明方法中有用的融合多肽的核酸构建体。编码任选与抗原(如HPV抗原)融合的hsp的核酸序列的例子可在下列文献中找到：国际公开号WO 89/12455、WO 94/29459、WO 98/23735和WO 99/07860以及其中引入的参考文献。表达和纯化蛋白包括融合蛋白的方法下文进一步讨论。
蛋白共轭物的制备
组分(1)和组分(2)也可通过单个hsp和单个HPV抗原的平移后的共轭作用来连接。化学共轭两种蛋白(或其部分)的方法本领域中是已知的(参见，如在Hermanson，Bioconjugate Techniques，Academic Press，San Diego，CA，1996；Lussow等，Eur.J.Immun.21：2297-2302，1991以及Barrios等，Eur.J.Immun.22：1365-1372，1992中所述的技术)。共轭物的制备方法可采用交联剂，如戊二醛(其变成所得共轭物的一部分)，或通过二硫键连接组分(1)和组分(2)。人们可采用在hsp、HPV抗原中天然存在或重组插入的或两者皆有的半胱氨酸残基来促进分子间二硫键的形成。含有与HPV抗原非共价结合的hsp或其免疫刺激片段(即组分(1))的组合物可按下列文献所述来生产：美国专利号6,048,530、6,017,544、6,017,540、6,007,821、5,985,270、5,948,646、5,935,576、5,837,251、5,830,464或5,750,119。也可参见美国专利号5,997,873、5,961,979、6,030,618、6,139,841、6,156,302、6,168,793以及国际公开号WO 97/06821。
不管所施用的组合物最终结构如何，组分(1)和组分(2)可包括下列物质。
HPV蛋白抗原
任何HPV抗原都适用于本发明的组合物(如本文所述的混合物、共轭物和融合蛋白)中。然而，表达HPV感染细胞表面上的可识别表位的HPV抗原应尤其有用。HPV表达6或7种非结构蛋白以及两个结构蛋白，以及这些蛋白的每一个在本文所述的免疫预防或免疫治疗方法中可充当靶子。
病毒衣壳蛋白L1和L2是晚期结构蛋白。L1是主要的衣壳蛋白，其氨基酸序列在不同种类的HPV中是高度保守的。有7种早期非结构蛋白。蛋白E1、E2和E4在病毒复制中发挥重要作用。蛋白E4还在病毒成熟中起作用。对E5的作用了解不多。蛋白E6和E7是癌基因蛋白，它们对病毒复制以及宿主细胞永生化和转化至关重要。
Hsp
各种hsp已从大批生物体中经分离、克隆和特征鉴定(Mizzen，Biotherapy 10：173-189，1998；如本文所用，术语“热激蛋白”或其缩写(hsp)与称为“应激蛋白”的蛋白同义或包括此蛋白)。免疫刺激hsp或其免疫刺激片段适用于本文所述的组合物(如用作融合多肽的一部分)。Hsp70、hsp60、hsp20-30和hsp10是其中由宿主针对结核分枝杆菌(Mycobaterium tuberculosis)和麻风分枝杆菌(Mycobacteriumleprae)感染的免疫反应所识别的主要决定因素。此外，牛分枝杆菌(Mycobacterium bovis)菌株Bacille Calmette Guerin(BCG)的hsp65发现是有效的免疫刺激剂，如在以下实施例中所述。
如本文所述，其中任一种可用于组分(1)的Hsp基因和hsp的家族在本领域中是众所周知的。这些家族包括例如Hsp100-200、Hsp100、Hsp90、Lon、Hsp70、Hsp60、TF55、Hsp40、FKBP、亲环蛋白、Hsp20-30、ClpP、GrpE、Hsp10、遍在蛋白质、钙联接蛋白以及蛋白二硫化物异构酶。参见，例如Macario，Cold Spring HarborLaboratory Res.25：59-70，1995；Parsell等，Rev.Genet.27：437-496，1993以及美国专利号5,232,833。Hsp可以是但不限于哺乳动物hsp、细菌hsp和分枝杆菌hsp。
Grp170(指葡萄糖调节蛋白)是hsp100-200家族中hsp的例子。Grp170存在于前高尔基体区室中的内质网腔内，并在免疫球蛋白折叠和装配中发挥作用。
hsp100家族中hsp的例子包括哺乳动物Hsp110、酵母Hsp104以及大肠杆菌(E.coli)hsp ClpA、ClpB、ClpC、ClpX和ClpY。
Hsp90家族中hsp的例子包括大肠杆菌中的HtpG、酵母中的Hsp83和Hsc83以及人中的Hsp90α、Hsp90β和Grp94。Hsp90结合蛋白质基因，它通常是细胞调节分子，如在信号转导机制中发挥作用的类固醇激素受体(如糖皮质激素、雌激素、孕酮和睾甾酮受体)、转录因子以及蛋白激酶。Hsp蛋白也参与大的高丰度蛋白复合体的形成，该复合体包括其他应激蛋白。
Lon是降解大肠杆菌中非天然蛋白质的四聚体依赖ATP的蛋白酶。
Hsp70家族中hsp的例子包括来自哺乳动物细胞的Hsp72和Hsc73、来自细菌或分枝杆菌如麻风分枝杆菌、结核分枝杆菌和牛分枝杆菌(Bacille-Calmette Guerin；本文称为hsp71)的DnaK、来自大肠杆菌、酵母和其他原核生物的DnaK以及BiP和Grp78。Hsp70能特异结合ATP以及未折叠的多肽和肽；hsp70参与蛋白折叠和未折叠以及蛋白复合体的装配和解体。
来自Hsp60家族的hsp的例子是来自分枝杆菌的Hsp65。细菌Hsp60也是一般公知的GroEL。Hsp60形成大的同型寡聚体复合体，并且似乎是在蛋白折叠中起关键作用。Hsp60同系物存在于真核生物的线粒体和叶绿体中。
TF55家族中hsp的例子包括Tcpl、TRiC和热小体(thermosome)。这些蛋白通常出现在真核生物的胞质和一些古细菌中，它们形成多元环，促进蛋白折叠。它们还与Hsp60具有弱的同源性。
Hsp40家族中的hsp的例子包括来自原核生物如大肠杆菌和分枝杆菌的DnaJ以及HSJ1、HDJ1和Hsp40。Hsp40作为分子伴侣在蛋白折叠、耐热性和DNA复制等其他细胞活性中发挥作用。
FKBP的例子包括FKBP12、FKBP13、FKBP25以及FKBP59、Fprl和Nepl。这些蛋白通常具有肽基脯氨酰基异构酶活性并与免疫抑制剂如FK506和纳巴霉素(rapamycin)相互作用。这些蛋白通常在胞质和内质网中找到。
亲环蛋白的例子包括亲环蛋白A、B和C。这些蛋白具有肽基脯氨酰基异构酶活性并与免疫抑制剂环孢菌素A(cyclosporin A)相互作用。
Hsp20-30也称为小Hsp。Hsp20-30通常发现于大的同型寡聚体复合体或可能的异型寡聚体复合体中。生物体或细胞类型可表达若干种不同类型的小Hsp。Hsp20-30与细胞骨架结构相互作用，并可在肌动蛋白的聚合/解聚中起调节作用。在静息细胞应激或暴露于生长因子之后，Hsp20-30快速磷酸化。Hsp20-30同系物包括α-晶体蛋白。
ClpP是参与异常蛋白降解的大肠杆菌蛋白酶。ClpP的同系物在叶绿体中找到。ClpP与ClpA形成异型寡聚体复合体。
GrpE是约20kDa的大肠杆菌蛋白，其参与应激受损蛋白的拯救以及受损蛋白的降解。GrpE在调节大肠杆菌应激基因的表达中发挥作用。
Hsp10的例子包括GroES和Cpn10。Hsp10发现于大肠杆菌以及真核细胞的线粒体和叶绿体中。Hsp10与Hsp60寡聚体结合形成7元环。Hsp10也参与蛋白折叠。
已发现遍在蛋白结合蛋白，这与通过ATP依赖的胞质蛋白酶来蛋白水解去除蛋白协调一致。
本发明中有用的应激蛋白可从肠杆菌(如大肠杆菌)、分枝杆菌(尤其是麻风分枝杆菌、结核分枝杆菌、母牛分枝杆菌(Mycobacteriumvaccae)、耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis)和牛分枝杆菌)、酵母、果蝇、脊椎动物(如鸟类或哺乳动物如啮齿类或灵长类动物包括人类)中获得。
蛋白表达和纯化
可重组生产蛋白。更具体而言，可被单独使用或组合或共轭之后施用的hsp(或其片段)和HPV抗原(或其片段)以及含有组分(1)和组分(2)的融合蛋白都能在细菌、酵母、植物或植物细胞、或动物或动物细胞中重组生产。例如，hsp、HPV抗原以及含有它们的融合蛋白可用合适的表达载体中的核酸序列转化(即转染、转导或感染)宿主细胞来进行生产。合适的表达载体包括质粒、病毒颗粒以及噬菌体。对于昆虫细胞，杆状病毒表达载体是合适的。完整的表达载体或其部分都可被整合到宿主细胞基因组中。在一些情形中，理想的是采用诱导型表达载体例如LACSWITCH诱导型表达系统(Stratagene；LaJolla，CA)。
分子生物领域中的那些专业技术人员将理解各种表达系统的任一种都可提供重组蛋白使用(如融合蛋白)，所述重组蛋白在本文所述的方法中是有用的。所用的明确的宿主细胞和载体对本发明来说无关紧要。
如上所述，组分(1)、组分(2)和含有它们的融合蛋白可通过植物细胞生产。对于植物细胞来说，病毒表达载体(如花椰菜花叶病毒和烟草花叶病毒)和质粒表达载体(如Ti质粒)是合适的。这些细胞可从广范围的来源(如美国典型培养物保藏中心(ATCC)，Manassas，VA；也可参见，例如Ausubel等，Current Protocols inMoleucular Biology，John Wiley & Sons，New York，1994)中获得。转化方法和表达载体的选择将取决于所选择的宿主系统。转化方法在例如Ausubel(同上)中描述。表达载体可从在例如Pouwels等，CloningVectors：A Laboratory Manual，1985，增刊，1987中所提供的那些载体中挑选。
内含表达载体的宿主细胞可培养在常规的营养培养基中，所述培养基按需要适合于选择基因的激活或阻遏、转化子的筛选或选择基因的扩增。
如果合适或有益，编码融合蛋白的核酸可包括分泌融合蛋白的信号序列以便例如促进蛋白从细胞培养物中分离。特定的起始信号对有效翻译插入的核酸序列也是需要的。这些信号包括ATG起始密码子和邻近序列。在一些情况下，必须提供外源的翻译控制信号，也许包括ATG起始密码子。此外，起始密码子必须与所需编码序列的读框协调以确保完整插入子的翻译。这些外源翻译控制信号和起始密码子可属于多种起源，无论是天然还是合成的。表达效率可通过包括合适的转录或翻译增强子元件来提高(如在Bittner等，Methods in Enzymol.153：516，1987中公开的元件)。
组分(1)、组分(2)和含有它们的融合蛋白在正常生理条件下是可溶的。此外，这些融合蛋白可包括一种或多种不相关(即非hsp非HPV)蛋白(全部或部分)从而创造出至少三联融合蛋白。“第三”蛋白可以是促进融合蛋白纯化、检测或增溶的蛋白或是提供一些其他功能的蛋白。例如，表达载体pUR278(Ruther等，EMBO J.2：1791，1983)可用于创建lacZ融合蛋白，以及pGEX载体可用于表达外源多肽作为含有谷胱甘肽S转移酶(GST)的融合蛋白。一般而言，这些融合蛋白是可溶的，并能从溶解细胞中容易地纯化，其方法是吸附到谷胱甘肽琼脂糖珠上，接着在游离谷胱甘肽存在下进行洗脱。pGEX载体设计成包括凝血酶或Xa因子蛋白酶切割位点，以便克隆的靶基因产物能从GST部分释放。“第三”蛋白也可以是免疫球蛋白Fc结构域。利用亲和柱可容易纯化此种融合蛋白。当然，本发明方法中所用的融合蛋白可包括一种以上的组分(1)和/或一种以上的组分(2)，以及组分(1)和组分(2)能直接或间接连接(如一个或多个氨基酸残基可存在于它们当中)。
蛋白(如hsp、HPV抗原或含有hsp的融合蛋白)纯化的方法可利用与该蛋白特异结合的抗体。本领域专业技术人员可采用基于亲和的纯化方法来纯化蛋白。例如，对于人细胞系中表达的非变性融合蛋白的纯化，参见Janknecht等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.88：8972，1981。在该系统中，将目的基因亚克隆到牛痘重组质粒中，以便将基因的可读框翻译性地融合到由6个组氨酸残基组成的氨基端标志上。将用重组痘苗病毒感染的细胞的抽提物装载到Ni2+氮川乙酸琼脂糖柱上，并用含有咪唑的缓冲液选择性洗脱组氨酸标志的蛋白。同样程序可用于细菌培养物。
蛋白包括融合蛋白(尤其是那些含有短抗原片段的蛋白)也可通过化学合成法(如在Solid Phase Peptide Synthesis，第2版，1984 ThePierce Chemical Co.，Rockford，IL中所述的方法)来进行生产。
一旦分离，如果需要，蛋白可进一步纯化和/或浓缩，只要进一步处理不损伤引发免疫反应的能力，所述免疫反应在本发明方法中足以有效。纯化和浓缩蛋白的多种方法是本领域中众所周知的(参见，例如Fisher，Laboratory Techniques In Biochemistry And MolecularBiology，Work和Burdon编，Elsevier，1980)，包括超速离心和/或沉淀(如采用硫酸铵)、微滤(如通过0.45μm醋酸纤维素滤膜)、超滤(如使用筛分膜和再循环过滤)、凝胶过滤(如填充有Sepharose CL-6B、CL-4B、CL-2B、6B、4B或2B、Sephacryl S-400或S-300、Superose6或Ultrogel A2、A4或A6的柱；全部获自Pharmacia公司)、快速蛋白液相色谱(FPLC)以及高效液相色谱(HPLC)。
交叉反应性HPV序列
本领域普通技术人员可确定含有第一类型的HPV抗原的组合物能否用于治疗已有第二类型的HPV感染的个体。这种确定可依据的测定包括预测性测定(如那些采用计算机模型的测定)和生物学测定(其中有一个测定真正测定交叉反应性)。可采用一种或两种测定(毫不奇怪，人们将希望在预测性测定中所获得的结果有待于在生物学测定中进一步测试)。各个例子如下。
利用成熟的免疫学方法人们可测试交叉反应性(即测试含有一种类型的HPV抗原的组合物有效地治疗个体的能力，所述个体是由另一类型的HPV感染的个体或患有与另一类型的HPV相关的疾病或症状的个体)。例如，使用改造的双重转基因小鼠表达人第I型MHC分子和人CD8基因的抗原结合区(Lustgarten等，Human Immunol.52：109，1997；Vitiello等，J.Exp.Med.173：1007，1991)可证实免疫交叉反应性。
更具体而言，利用标准免疫学技术(参见，例如Coligan等编，Current Protocols in Immunology，John Wiley & Sons，1999)，HLA-A2/CD8双重转基因小鼠(Lustgarten等，同上)可用来证明胞毒T淋巴细胞(CTL)的交叉反应性，所述CTL是针对抗从HPV6和11的E7蛋白衍生的肽产生HPV16E7而出现的。简而言之，小鼠用HspE7融合蛋白(基于BCG Hsp65和HPV16E7分子)每隔7-21天免疫1-3次。将HspE7悬浮于磷酸缓冲的盐水(PBS)中，并以每只小鼠皮下施用范围从1μg到1000μg的剂量。最后施用HspE7之后7天，将小鼠处死，去除它们的脾脏，并将组织离解成单个细胞悬浮液。特异于HPV E7的CTL细胞通过将衍生自HPV16E7、HPV6E7和HPV11E7的HLA-A2结合肽加入到浓度为1μM的培养基中而得到再刺激。细胞可在例如6孔板中受到再刺激，所述6孔板在其各孔中有不同的肽。如计算机算法所规定，与HLA-A2结合亲和性预测最高的一些肽(如十个肽)都可用于各个HPV16、HPV6和HPV11(或任何其他HPV类型；参见Parker等，J.Immunol.152：163，1994；算法也可通过全国卫生研究所(National Institutes of Health)的BIMAS(生物信息学&分子分析部门(Bioinformatics & Molecular Analysis Section))网址(2001年6月26日存取在http：//bimas.dcrt.nih.gov/上)从因特网上获得。此外，如果不同，来自其他两个HPV基因型的相应肽也可使用(即HPV16E7肽11-20和HPV6和11肽11-20)。
在体外再刺激周期(如一周)之后，通过用衍生自HPV16E7、HPV6E7和HPV11E7的HLA-A2结合肽脉冲溶解的T2靶细胞将可测定CTL活性。此外，利用前述的方法(Asal等，Clin.Diagn.Lab.Immunol.7：145，2000)，通过ELISPOT分析IFN-γ分泌细胞，可测定抗原特异的T淋巴细胞识别衍生自HPV16E7、HPV6E7和HPV11E7的HLA-A2结合肽。这些分析可在其他HLA等位基因的转基因小鼠中进行。
或者，人们可测定CTL与衍生自人HLA-A2阳性个体中的HPV6或11E7蛋白的肽交叉反应的能力，所述CTL是由用HspE7免疫所诱导的，所述人HLA-A2阳性个体经受用HspE7治疗生殖器疣。在治疗之前和各用HspE7治疗之后若干天(如7天)，可将外周血单核细胞(PBMC)从个体(如病人)中分离出来。细胞的分析方法可通过产生荧光的MHC-肽复合物(四聚体，Altman等，Science 274：94，1996)或通过ELISPOT分析法(Asal等，Clin.Diagn.Lab.Immunol.7：145，2000)进行。细胞可从外周血中直接进行测定以及如Youde等(CancerRes.60：365，2000)所述在体外接着再刺激。对于体外再刺激，将2×106/ml的PBMC培养在含有10％人AB血清(RAB)和浓度为10μg/ml肽的RPMI1640中。再刺激肽就自HPV16 E7衍生出来，并包含预示HLA-A2结合亲和性最高的肽(如十个肽)，如通过计算机算法所规定(Parker等，同上)。第4天，将1ml含有25单位/ml的IL-2的RAB加入到各个孔中。第6天，把1ml培养基用1ml含有10单位/ml的IL-2的培养基替换。第7天，将被辐射的自体PBMC(新鲜或冻融的)重悬浮于3×106个细胞/ml的含有10μg/ml肽和3μg/ml β2微球蛋白的RAB中。抗原呈递细胞允许附着2小时，然后洗涤以去除非粘着性细胞，再加入1-2×106个效应细胞/ml。第9天，将1ml的含有25单位/ml的IL-2的RAB加入到各个孔中。第13天，将孔中的内含物分到多个板中，并把培养基(含有10单位/ml的IL-2)恢复到原始体积。第14天使用细胞。对于FACS分析，四聚体的制备如前所述(Altman等，Science 274：94，1996)。用于装载四聚体的肽是衍生自HPV16、HPV6和HPV11的E7分子的HLA-2结合肽。如计算机算法所规定(Parker等，同上)，HLA-A2结合亲和性预测最高的肽(如十个肽)可用于各个HPV16、HPV6和HPV11中。此外，如果不同，来自其他两个HPV基因型的对应的肽也可使用(即HPV16 E7肽11-20和HPV6和11肽11-20)。新鲜的或再刺激的PBMC用PE标记的HPV-E7肽四聚体和FITC标记的抗-CD8抗体染色，并通过流式细胞仪分析，正如上文已述。利用前述方法(Asal等，Clin.Diagn.Lab.Immunol.7：145，2000)对识别HLA-A2结合肽的抗原特异的T淋巴细胞进行ELISPOT分析，所述HLA-A2结合肽衍生自HPV16 E7、HPV6 E7和HPV11 E7，存在于新鲜和再刺激的PBMC中。同样，这些技术可适用于具有其他HLA单元型的个体。
此外，有可能用HspE7蛋白或衍生自第16E7型HPV的肽体外刺激后的人PBMC与脉冲细胞进行交叉反应测试人PBMC能力，采用来自以前未用HspE7治疗的HLA-A2阳性健康志愿者的人PBMC，所述脉冲细胞是用来自其他两个HPV基因型(6和11)所对应的肽脉冲。使用本领域普通程序，对细胞进行刺激和分析。简而言之，PBMC从外周血中分离，粘着性细胞与非粘着性细胞分开，以及粘着性细胞经培养后生成树突细胞(DC)，正如在Current Protocols in Immunology(Coligan等编，John Wiley & Sons，第7.32.7-8页，1999)中所述。非粘着性细胞低温储藏在90％FCS/10％DMSO中以在测定后期备用。
对于刺激，DC用50μg/ml的HspE7或用40μg/ml的合适肽和3μg/mlβ2微球蛋白在37℃、5％CO2下脉冲24小时(Kawashima等，Human Immunol.59：1，1998)。所用的肽是衍生自HPV16、HPV6和HPV11的E7分子的HLA-A2结合肽。如计算机算法所定义(Parker等，同上)，HLA-A2结合亲和性预测最高的肽(如十个肽)可用于各个HPV16、HPV6和HPV11中。此外，如果不同，来自其他两个HPV基因型的对应肽也可使用(即HPV16 E7肽11-20和HPV6和11肽11-20)。利用免疫磁珠(Miltenyi Biotec)通过阳性筛选将CD8+细胞从低温保藏的自体非粘着细胞中分离出来。装载肽/蛋白的DC以4200拉德进行辐射，并与自体CD8+细胞在例如48孔板中以1∶20的比例混合，所述48孔板在0.5ml的RAB中含有0.25×105个DC和5×105个CD8+细胞以及10ng/ml的IL-7。第7和14天，把细胞用自体肽脉冲的粘着APC再刺激(Kawashima等，Human Immunol.59：1，1998)。每2-3天向培养物中添加10单位/ml的hIL-2。在体外刺激7和14天之后，对HPV E7肽特异的T淋巴细胞通过产生荧光的MHC肽复合体(四聚体，Altman等，Science 274：94，1996)或通过ELISPOT分析法(Asal等，Clin.Diagn.Lab.Immunol.7：145，2000)进行分析。对于FACS分析，四聚体的制备如前所述(Altman等，Science 274：94，1996)。用于装载四聚体的肽如上所述是衍生自HPV16、HPV6和HPV11的E7分子的HLA-2结合肽。肽特异的T淋巴细胞用PE标记的HPV-E7肽四聚体和FITC标记的抗-CD8抗体进行染色，并通过流式细胞仪分析(Youde等，Cancer Res.60：365，2000)。利用前述方法(Asal等，Clin.Diagn.Lab.Immunol.7：145，2000)对识别HLA-A2结合肽的抗原特异的T淋巴细胞进行ELISPOT分析，所述HLA-A2结合肽衍生自HPV16E7、HPV6 E7和HPV11 E7。同样，这些技术可适用于具有其他HLA单元型的个体。
组合物的施用
本发明包括的组合物含有至少一种HPV蛋白抗原(如HPV蛋白抗原(或其抗原片段)，HPV蛋白抗原与hsp(或其免疫刺激片段)混合或共轭或含有HPV蛋白抗原(或其抗原片段)与hsp(或其免疫刺激片段)的融合蛋白。任选地，可将这些蛋白悬浮于可药用载体，如稀释剂(如PBS)或碳酸氢盐溶液(如0.24M NaHCO3)。根据施用的方式和路径以及标准制药准则选择有用的载体。对应用合适的药物载体和稀释剂以及药物必需品描述在Remington’s PharmaceuticalSciences中。佐剂如霍乱毒素、大肠杆菌热不稳定的肠毒素(LT)、脂质体或免疫刺激复合体(ISCOM)也可包括在内。
蛋白(如融合蛋白)无需给个体直接施用。相反，编码该蛋白的核酸序列可施用；所述蛋白在个体体内表达。所述核酸可以是载体的部分(如病毒载体，例如病毒载体基因组的部分)或密封在例如脂质体中。或者，所述核酸可作为裸体核酸被传递。
组合物可制成溶液、悬浮液、栓剂、片剂、颗粒、粉末、胶囊、药膏或面霜。如上所述，在制备这些组合物中，可包括一个或多个药物载体。可药用载体或其他添加剂另外的例子包括溶剂(如水或生理盐水)、增溶剂(如乙醇、聚山梨酸酯或Cremophor EL)、提供等渗性的药剂、防腐剂、抗氧化剂、赋形剂(如乳糖、淀粉、晶体纤维素、甘露糖、麦芽糖、磷酸氢钙、轻质硅酸酐或碳酸钙)、接头(淀粉、聚乙烯吡咯烷酮、羟基丙基纤维素、乙基纤维素、羧基甲基纤维素或阿拉伯胶)、润滑剂(如硬脂酸镁、滑石粉或硬化油)或稳定剂(如乳糖、甘露糖、麦芽糖、聚山梨酸酯、大粒凝胶或聚氧化乙烯固化的蓖麻油)。如果必须(或所需)，可加入甘油、二甲基乙酰胺、乳酸钠、表面活性剂、氢氧化钠、乙二胺、乙醇胺、碳酸氢钠、精氨酸、甲葡胺或三氨基甲烷。如果需要缓释组合物，可用生物可降解的聚合体如聚-D，L-丙交酯-共聚-乙交酯或聚乙交酯作填充基质(参见，例如美国专利号5,417,986、4,675,381和4,450,150)。采用这些组分可制成药物制剂如溶液、片剂、颗粒或胶囊。如果组合物是口服，可加入调味剂和颜料。
治疗性组合物的施用可通过任何适当的路径进行例如静脉内、动脉内、局部、腹膜内、胸膜内、口服、皮下、肌内、皮内、舌下、表皮内、鼻腔、肺内(如通过吸入)、阴道或直肠。
所施用的组合物的量将取决于例如特定的组合物、佐剂是否与组合物共施用、共施用佐剂的类型、施用方式和频率以及所需的效果(如预防或治疗)。剂量通常由那些本领域专业技术人员在开发药物或预防剂的过程中确定。一般而言，本发明组合物的施用剂量范围是每个成年人1μg-100mg。如果佐剂与组合物一起施用，则一般可采用的剂量范围是每成年人1ng-1mg。如必须可反复施用，如由本领域专业技术人员所确定。例如，初始剂量之后可接着三次加强剂量，每次间隔一周或一个月。加强注射可在第一次施用后的3-12周进行，以及第二次加强使用相同制剂再于3-12周后进行。血清或T细胞可从测试免疫反应的个体中采集，所述免疫反应是由抗HPV抗原的组合物引发，抗包括在例如融合蛋白或蛋白共轭物中的HPV抗原。测定抗特异抗原的抗体或胞毒T细胞的方法是本领域众所周知的。如需要进行另外的加强。依据例如组合物中融合蛋白的量的变化，免疫方案可使引发最大的免疫反应最佳化。
当然，本文所述的蛋白可通过施用核酸如病毒载体(如反转录病毒或腺病毒载体)来传递。
无需进一步详述，相信本领域专业技术人员依据以上公开和以下实施例，可最大程度地利用本发明。下列实施例仅作为本领域专业技术人员如何分离和利用融合多肽的说明来解释，而并非是以任何方式来限制本公开的剩余部分。
实施例
如在WO 99/07860中所述，通过重组生产含有与第16型HPV的E7蛋白偶联的牛分枝杆菌BCG Hsp65的融合多肽，并将其制成制剂。Hsp65是应激蛋白的Hsp60家族的成员。在人临床试验测试此融合多肽在治疗肛门高级鳞状上皮内损伤(HSIL)的功效的过程中，进行了下列观察。
在治疗肛门HSIL中，22个患者参与了随机、双盲、安慰剂对照的HspE7的多通道试验。合格患者通过活检已确认了肛门HSIL，并且是人免疫缺陷病毒(HIV)阴性。利用从肛门棉拭中获得的细胞对患者的HPV进行定型，但病人不要求患有HPV-16。个别损伤不被定型为HPV。患者接受三次100μg的HpsE7或安慰剂的皮下注射，每次间隔一个月。通过肛门巴氏涂片、带有活检的高分辨肛镜(HRA)以及全科医师评估，对他们的治疗反应进行评价。非反应者(即那些患有持久肛门HSIL的患者)在对照试验中12或24周之后，允许跨接到公开标记的试验中，其中他们接受三次500μg的HspE7注射，每次间隔一个月。在安慰剂对照试验中治疗分配是双盲的，并且盲区一直未被打开。
为了确定感染患者的HPV类型，仅在活检之前，在随机的安慰剂对照试验的筛选拜访处，用达可纶棉拭从患者的肛门中采集样品。在样品运送培养基(Sample Transport Medium)(Digene)中运送之后，分离DNA并用于测定HPV类型。简而言之，通过聚合酶链式反应(PCR)将共有序列引物组MY09/MY11用于扩增HPV DNA。在扩增步骤后，把样品印迹到尼龙膜上并用生物素标记的寡核苷酸以探针进行探查，所述寡核苷酸特异于29种不同的HPV类型(6、11、16、18、26、31、32、33、35、39、40、45、51、52、53、54、55、56、58、59、61、66、68、69、70、73、AE2、Pap155以及Pap291)，以及收集的探针含有10种HPV类型的引物(2、13、34、42、57、62、64、67、72和W13B)。通过与标准化的对照比较，使用5点等级，将产生斑点印迹的样品对HPV类型计算分值为阳性或阴性；分值是1或大于1的是阳性。
为了证实PCR是成功的，对各个样品进行β-球蛋白对照扩增以及探针检测。如果样品对β-球蛋白的存在不是阳性，则认为PCR步骤是技术失败的。如果共有探针不导致分值2或更多，则认为样品是“HPV阴性”。
在他们进入公开标记试验中的时，22个患者中的14个(64％)患有生殖器疣，所述疣一直持续在以前的双盲试验全程中，在所述试验中，他们接受三次100μg的HspE7或安慰剂的注射，每月一次。在这14个患者至跨接到公开标记的试验中时，其中8个患者(57％)已经恶化，4个患者(29％)无变化，以及2个患者(14％)有改善(一个显著改善而另一个最低程度地改善)。另有一患者在双盲试验开始时患有湿疣，所述湿疣在公开标记的试验开始之前消除了，因此从此分析中删除，如同其他7个患者在任何试验过程中未患有可检测的疣一样。在全部14个患者(100％)中，湿疣存在于肛门直肠道内，以及其中还有6个患者(43％)存在于肛门周围的皮肤上。在公开标记的试验开始时，现场调查员确定14个带疣的患者中有11个患者(79％)需要手术切除，有2个患者(14％)需要局部切除(如液氮、电烙术)以及有1个患者(7％)需要局部治疗(即imiquimod)。这些患者选择推迟现场调查员推荐的治疗，而非同意在公开标记的试验中接受三次500μg的HspE7的注射，每次间隔一个月。
在最终用500μg的HspE7治疗后一个月，有2个患者(14％)没有可检测的疣，有11个患者(79％)在疣的大小和数目上下降，如与他们刚开始进入公开标记的试验比较，以及有1个患者(7％)发现疣体积增大(表1)。至公开标记试验的主要评价点的时候(最终剂量后4个月)，另有一个患者发现改善从部分到完全反应(即没有可见的疣)，从而产生总共3个患者(21％)完全痊愈(表1)。这些痊愈者在公开标记试验中6个月的评价过程中没有一个复发。10个患者(71％)继续表现出部分反应(即疣在大小上进一步显著缩小，去除剩余的疣而需要的治疗程度持续减少)。至公开标记试验结束时，仍有1个非反应者(7％)没有改善。
              表1
用HspE7治疗后对生殖器疣的反应总结
                         患者数(％)
                   第12周*        第24周+
结果               (n＝14)         (n＝14)
完全反应者         2(14)           3(21)
部分反应者         11(79)          10(71)
非反应者           1(7)            1(7)
*用500μg的HspE7最终治疗后一个月。
+用500μg的HspE7最终治疗后四个月。
在试验结束时，现场调查员对3个完全反应者没有推荐进一步治疗。如表2所列，现场调查员建议对部分反应者的治疗是切除疗法(14个中有6个，43％)或用局部药剂治疗(14个中有4个，29％)；对非反应者建议另外的手术(14个中有1个，7％)。为了长期随访他们的反应，全部22个患者办理了注册协议，并且他们同意推迟调查员建议的治疗。
                             表2
              生殖器疣反应评价以及临床大夫推荐的治疗
              基线*            第12周+                 第24周※
患者编号    推荐的治疗    疣反应     推荐的治疗    疣反应     推荐的治疗
003         手术          CR         局部          CR         无
004         手术          PR         切除          PR         切除
005         局部          PR         局部          CR         无
006         手术          PR         手术          PR         切除
008         切除          PR         局部          PR         局部
009         手术          PR         切除          PR         局部
010         手术          PR         切除          PR         切除
011         手术          CR         局部          CR         无
014         手术          PR         局部          PR         局部
016         手术          恶化       手术          恶化       手术
017         切除          PR         局部          PR         局部
020         手术          PR         切除          PR         切除
021         手术          PR         切除          PR         切除
022         手术          PR         切除          PR         切除
*基线指公开标记试验的开始。
+用500μg的HspE7最终治疗后一个月。
※用500μg的HspE7最终治疗后四个月。
缩写：CR＝完全反应；PR＝部分反应
对第一次随机对照的试验进行筛选的过程中，所有14个诊断有生殖器疣的患者的肛门棉拭样品都检测到了多种HPV类型的HPVDNA(表3)。HPV-6和/或11存在于12个患者中(86％)。一患者仅有HPV-16及相关类型，而另一个患者不能定型。14个患者中有3个(21％)是HPV-16阳性的。其疣改善的大多数患者(13个中有11个，85％)没有HPV-16。非反应者也没有HPV-16(参见表3)。
                        表3
             患有生殖器疣的患者中的HPV类型
患者编号     筛选时肛门棉拭样品中的     第24周+时的疣反应
             HPV类型*
003          6、11、16                  CR
004          6、54                      PR
005          6、70                      CR
006          6、11、45                  PR
008          16、31、55                 PR
009          6、11、59                  PR
010          6、11、45、54              PR
011          HPV阳性，类型未知          CR
014          6、11                      PR
016          11、61                     恶化
017          HPV阴性                    PR
020          6、11、16                  PR
021          6、31、53、58、59、61、66  PR
022          6                          PR
*随机安慰剂对照的临床试验的筛选探访。
+用500μg的HspE7最终治疗后一个月。
缩写：HPV＝人乳头状瘤病毒；CR＝完全反应；PR＝部分反应
在这种HspE7的公开标记的跨接试验中(500μg 3次，每次间隔一个月)，涉及持久的肛门HSIL和伴随的生殖器疣的患者，在基线处有疣的14个患者中有3个(17％)在最终剂量后四个月不再患有疣。另有10个患者(71％)表现出症状改善(即疣的大小显著缩小，以及去除剩余疣所需的治疗程度持续减少)。一个患者(7％)在试验过程中未改善，因此额外的手术由现场调查员推荐。
在公开标记试验注册之前，此试验现场的大多数患者也许将遭受手术介入以去除疣(14个患者中有11个，79％)。至试验结束时，仅有1个患者推荐手术治疗。局部切除疗法(如液氮、电烙)推荐给6个患者(43％)，而采用局部药剂(如imiquimod)治疗推荐给4个患者(29％)。有3个患者不需进一步治疗。
反应在6个月期间似乎是进行性的，没有反应者在此期间复发。湿疣逐渐和进行性的消散与由HspE7诱导细胞介导的免疫之后人们从免疫的宿主反应中所预期到的相一致。
在进入公开标记试验之前，双盲试验中2个患者他们的湿疣有一些改善。迄今为止，我们没有打开盲区，并不知道这些患者是否接受了100μg的HspE7或安慰剂。然而，根据每月一次共三次注射500μg的HspE7的公开标记试验所观察到的反应，较高的剂量似乎比100μg更有活性。
从13个患者中仅有3个(23％)的肛门棉拭样品检测出HPV-16DNA，这3个患者的疣在用HspE7治疗后有改善。在其疣对用HspE7治疗有反应的大多数患者中可检测出来自HPV-6、HPV-11的DNA或两者皆有之。这些数据暗示在它们对HspE7的反应中存在这些HPV类型之间的免疫交叉反应性。
总之，此处提供的结果暗示HspE7对生殖器疣有广谱的活性。该活性似乎不限于HPV-16阳性患者，而交叉多种类型的HPV。预测HspE7在治疗生殖器区域的HPV诱导的疾病将是有效的，以及预测该活性将不限于HPV-16阳性患者。
此处的观察报告暗示用HspE7的治疗性处理可组成新的、简单的以及非手术治疗生殖器疣的方法，该治疗方法最低程度将减轻疣的负担，由此减少治疗程度和所得的发病率。内在肛门直肠疾病常要求另外的治疗，所述治疗十分痛苦并让人衰弱。任何治疗甚至仅提供部分反应减少或消除“手术”或切除疗法的数量和程度，转化成发病率的减少、工作时间损失更少以及生活质量的提高。
这些经过说明热激蛋白/第16型HPV抗原组合物在消除或减少疣中的是有效的，所述疣被认为主要由第6和11型HPV所导致。有显著意义的是观察到(1)疣可用基于HPV的组合物根本上治疗，和(2)第16型HPV组合物在治疗推测是除第16型以外的HPV所导致的症状中是有效的。后者的交叉反应性结果完全未预料到，假定一般认为类型特异的组合物仅能引起类型特异的免疫反应。
为了对所观察到的融合多肽的交叉反应性阐明可能的机制，对各种I型HLA分子和第16、6和11类型HPV的E7肽的理论结合进行了计算。T1/2解离的计算利用了在Parker等，J.Immunol.152：163，1994中(也参见以上所述的网址)所述的算法。数据总结于表4中。
                                                       表4
HLA类型              第16型HPV             第6型HPV                 第11型HPV
  起始     序列   T1/2   起始     序列    T1/2   起始      序列     T1/2
A1     44  QAEPDRAHY   900     44 DSQPLKQHY     8     44 DAQPLTQHY     5
    16  QPETTDLYCY   23     17 PPDPVGLHCY     6     17 PPDPVGLHCY     6
    68 VVECTDGDIR     9
A_0201     11  YMLDLQPET   375
    7  TLHEYMLDL   201     7 TLKDIVLDL     7     7 TLKDIVLDL     7
    82  LLMGTLGIV   54     82 LLLGTLNIV     412     82 LLLGTLNIV     412
    28 QLVDSSEDEV     140     28 QLEDSSEDEV     9
    78  TLEDLLMGT   5     79 VQQLLLGTL     1     78 QLQDLLLGT     70
A_0205     7  TLHEYMLDL   50     7 TLKDIVLDL     4     7 TLKDIVLDL     4
    11  YMLDLQPET   27     12 VLDLQPPDPV     1     12 VLDLQPPDPV     1
    82  LLMGTLGIV   20     82 LLLGTLNIV     20     82 LLLGTLNIV     20
    78  TLEDLLMGT   2     79 VQQLLLGTL     19     78 QLQDLLLGT     42
    5  TPTLHEYML   0     5 HVTLKDIVL     14     5 LVTLKDIVL     24
A24     56  TFCCKCDSTL   20
    51  HYNIVTFCC   11     51 HYQIVTCCC     11     51 HYCILTCCC     9
    24  CYEQLNDSS   9     25 CYEQLVDSS     9     25 CYEQLEDSS     9
    4  DTPTLHEYML   6     5 HVTLKDIVL     4     4 RLVTLKDIVL     12
    39 EVDGQDSQPL     5     39 KVDKQDAQPL     10
A3     88  GIVCPICSQK   14     88 NIVCPICAPK     5     88 NIVCPICAPK     5
    7  TLHEYMLDL   8     7 TLKDIVLDL     5     7 TLKDIVLDL     5
A68.1     68  CVQSTHVDIR   200     68 VVQCTETDIR     200     68 VVECTDGDIR     200
    89  IVCPICSQK   180     89 IVCPICAPK     180     89 IVCPICAPK     180
A_1101     89  IVCPICSQK   2.0     89 IVCPICAPK     2     89 IVCPICAPK     2.0
    68  CVQSTHVDIR   1.8     68 VVQCTETDIR     1     68 VVQCTETDIR     0.6
A_3101     69  VQSTHVDIR   4.0     69 VQCTETDIR     2     68 VVECTDGDIR     2.0
    88  GIVCPICSQK   0.4     88 NIVCPICAPK     0     88 NIVCPICAPK     0.4
A_3302     68  CVQSTHVDIR   15     68 VVQCTETDIR     15     68 VVECTDGDIR     15
    58  CCKCDSTLR   3     58 CCGCDSNVR     3     58 CCGCDSNVR     3
B14     65  LRLCVQSTHV   30     65 VRLVVQCTE     1     65 VRLVVECTD     1
HLA类型             第16型HPV                第6型HPV                第11型HPV
  起始     序列    T1/2   起始     序列    T1/2   起始         序列    T1/2
    4  DTPTLHEYML     18     3  GRHVTLKDI     12     3  GRLVTLKDI     60
    5  TPTLHEYML     3     6  VTLKDIVLDL     10     6  VTLKDIVLDL     15
    76  RTLEDLLMGT     1     76  IREVQQLLL     4     76  IRQLQDLLL     20
B40     36  DEIDGPAGQA     120     35  DEVDEVDGQ     2     35  DEVDKVDKQ     2
    74  VDIRTLEDL     10     74  TDIREVQQL     10     74  GDIRQLQDL     20
    77  RTLEDLLMGT     0     77  REVQQLLLGT     16
    87  LGIVCPICS     0     87  LNIVCPICA     2     87  LNIVCPICA     2
B60     79  LEDLLMGTL     176     79  VQQLLLGTL     2     79  LQDLLLGTL     2
    20  TDLYCYEQL     44     21  VGLHCYEQL     9     21  VGLHCYEQL     9
    74  VDIRTLEDL     40     74  TDIREVQQL     44     74  GDIRQVQDL     44
    40  VDGQDSQPL     20     40  VDKQDAQPL     20
B61     36  DEIDGPAGQA     40     35  DEVDEVDG     1     35  DEVDKVDKQ     1
    34  EEDEIDGPA     20     33  SEDEVDEV     40     33  SEDEVDKV     40
    72  TETDIREV     80     72  TDGDIRQL     1
    29  NDSSEEEDEI     1     29  LEDSSEDEV     40
B62     15  LQPETTDLY     88     15  LQPPDPVGL     6     15  LQPPDPVGL     6
    43  GQAEPDRAHY     44     44  DSQPLKQHY     1     44  DAQPLTQHY     5
    7  TLHEYMLDL     3     7  TLKDIVLDL     16     7  TLKDIVLDL     16
    82  LLMGTLGIV     2     83  LLGTLNIVC     11     83  LLGTLNIVC     11
B7     5  TPTLHEYML     80     5  HVTLKDIVL     20     5  LVTLKDIVL     20
    75  DIRTLEDLL     40     75  DIREVQQLL     40     75  DIRQLQDLL     40
    46  EPDRAHYNI     2     46  QPLKQHYQI     8     46  QPLTQHYQIL     80
B8     58  CCKCDSTLRL     16     58  CCGCDSNVRL     1     58  CCGCDSNVRL     1
    75  DIRTLEDL     8     75  DIREVQQL     12     75  DIRQLQDLL     8
    7  TLKDIVLDL     12     7  TLKDIVLDL     12
B_2702     48  DRAHYNIVTF     60     49  KQHYQIVTC     6     49  TQHYQILTC     2
    76  IRTLEDLLM     20     76  IREVQQLLL     60     76  IRQLQDLLL     60
    65  LRLCVQSTH     20     65  VRLVVQCTET     20     65  VRLVVECTD     2
    2  HGDTPTLHEY     1     3  GRHVTLKDIV     20     3  GRLVTLKDIV     20
B_2705     76  IRTLEDLLM     600     76  IREVQQLLL     2000     76  IRQLQDLLL     2000
    65  LRLCVQSTHV     600     65  VRLVVQCTET     200     65  VRLVVECTD     20
    3  GRHVTLKDIV     600     3  GRLVTLKDIV     600
B_3501     5  TPTLHEYML     20     5  HVTLKDIVL     1     5  LVTLKDIVL     1
    16  QPETTDLYCY     18     15  LQPPDPVGL     2     15  LQPPDPVGL     2
    43  GQAEPDRAHY     6     44  DSQPLKQHY     10     44  DAQPLTQHY     6
    46  EPDRAHYNIV     1     46  QPLKQHYQI     8     46  QPLTQHYQIL     20
B_3701     74  VDIRTLEDLL     200     74  TDIREVQQLL     300     74  GDIRQLQDLL     200
    20  TDLYCYEQL     40     21  VGLHCYEQLV     1     21  VGLHCYEQL     1
    40  VDGQDSQPL     40     40  VDKQDAQPL     40
    80  EDLLMGTLGI     40     80  QQLLLGTLNI     1     80  QDLLLGTLNI     40
B_3801     78  TLEDLLLMGTL     8     78  EVQQLLLGTL     1     79  LQDLLLGTL     4
    50  AHYNIVTFC     4     50  QHYQIVTCC     4     50  QHYQILTCC     4
    5  TPTLHEYML     2     4  RHVTLKDIVL     30     4  RLVTLKDIVL     1
HLA类型             第16型HPV              第6型HPV               第11型HPV
   起始      序列    T1/2   起始     序列     T1/2     起始     序列     T1/2
    39  EVDGQDSQPL     6     39  KVDKQDAQPL     3
    71  STHVDIRTL     1     71  CTETDIREV     1     71  CTDGDIRQL     6
B_3901     78  TLEDLLMGTL     27     79  VQQLLLGTL     5     79  LQDLLLGTL     14
    73  HVDIRTLEDL     14     73  ETDIREVQQL     14     74  GDIRQLQDL     1
    77  RTLEDLLMGT     1     76  IREVQQLLL     45     75  DIRQLQDLL     1
    4  DTPTLHEYML     2     4  RHVTLKDIVL     90     3  GRLVTLKDI     15
B_3902     59  CKCDSTLRL     20     59  CGCDSNVRL     2     59  CGCDSNVRLV     3
    7  TLHEYMLDL     2     7  TLKDIVLDL     1     6  VTLKDIVLDL     9
    79  LEDLLMGTL     1     79  VQQLLLGTL     24     79  LQLQDLLLGTL     24
    15  LQPETTDLY     1     15  LQPPDVGL     20     15  LQPPDPVGL     20
B_4403     36  DEIDGPAGQA     90     35  DEVDEVDGQ     7     35  DEVDKVDKQ     16
    3  GDTPTLHEY     45
    44  QAEPDRAHY     6     44  DSQPLKQHY     18     44  DAQPLTQHY     27
    77  REVQQLLLGT     12
B_5101     46  EPDRAHYNI     880     46  QPLKQHYQI     440     46  QPLTQHYQI     400
    84  MGTLGIVCPI     114     84  LGTLNIVCPI     114     84  LGTLNIVCPI     114
B_5102     46  EPDRAHYNI     220     46  QPLKQHYQI     1452     46  QPLTQHYQI     1452
    84  MGTLGIVCPI     88     84  LGTLNIVCPI     88     84  LGTLNIVCPI     88
    21  VGLHCYEQLV     145     21  VGLHCYEQL     73
B_5103     46  EPDRAHYNI     58     46  QPLKQHYQI     83     46  QPLTQHYQI     58
    84  MGTLGIVCPI     44     84  LGTLNIVCPI     44     84  LGTLNIVCPI     44
    21  VGLHCYEQLV     53
B_5201     46  EPDRAHYNIV     100     46  QPLKQHYQIV     132     46  QPLTQHYQIL     22
    81  DLLMGTLGIV     33     82  LLLGTLNIV     50     82  LLLGTLNIV     50
    60  GCDSNVRLVV     40     60  GCDSNVRLVV     40
B_5801     49  RAHYNIVTF     79.0     49  KQHYQIVTCC     0     48.0  LTQHYQILTC     3.0
    77  RTLEDLLMGT     24.0     77  REVQQLLLGT     0     77.0  RQLQDLLLGT     0.1
    6  PTLHEYMLDL     0.2     6  VTLKDIVLDL     8     6.0  VTLKDIVLDL     8.0
    44  QAEPDRAHY     6.0     44  DSQPLKQHY     5     44.0  DAQPLTQHY     3.0
    85  GTLGIVCPI     4.0     85  GTLNIVCPI     4     85.0  GTLNIVCPI     4.0
Cw_0301     20  TDLYCYEQL     100     21  VGLHCYEQL     100     21  VGLHCYEQL     100
    74  VDIRTLEDL     30     74  TDIREVQQL     36     74  GDIRQLQDL     36
    46  QPLKQHYQIV     6     46  QPLTQHYQIL     120
Cw_0401     56  TFCCKCDSTL     200     57  CCCGCDSNV
    5  TPTLHEYML     88
    73  HVDIRTLEDL     14     73  ETDIREVQQL     12     73  DGDIRQLQDL     12
    46  EPDRAHYNI     17     46  QPLKQHYQIV     11     46  QPLTQHYQIL     88
Cw_0602     79  LEDLLMGTL     6     79  VQQLLLGTL     13     79  LQDLLLGTL     13
    85  GTLGIVCPI     6     85  GTLNIVCPI     6     85  GTLNIVCPI     6
    7  TLHEYMLDL     2     7  TLKDIVLDL     12     7  TLKDIVLDL     12
Cw_0702     3  GDTPTLHEY     27     3  GRHVTLKDI     1     3  GRLVTLKDI     1
    15  LQPETTDLY     8     16  QPPDPVGLHC     3     16  QPPDPVGLHC     3
   HLA类型           第16型HPV             第6型HPV            第11型HPV
  起始     序列  T1/2   起始     序列    T1/2    起始     序列     T1/2
    43  GQAEPDRAHY   2     43  QDSQPLKQHY     11     43  QDAQPLTQHY     32
    7  TLHEYMLDL   1     7  TLKDIVLDL     4     7  TLKDIVLDL     4
粗体的肽序列显示各个HLA分子顶端的两个接头以及各个来自各个类型HPV的E7蛋白顶端的两个接头。表4中的结果暗示取决于所检查的特异HLA分子，第16E7型HPV抗原可引发抗其他类型HPV的E7抗原的细胞介导的免疫反应。例如，对于HLA B 2705来说，从所有3种类型HPV的E7第76位氨基酸位置开始的肽预测是高水平的结合。因此，对于表达这种HLA分子的患者来说可能的是第16E7型HPV组合物将是交叉反应性的并用于治疗或预防由第6和11类型HPV的感染。表4中的各个粗体肽片段代表可能的抗原片段，其可包括在组合物(如本文所述的融合多肽)中作为替换全部E7病毒抗原。当然，也可使用两个或多个这种公认的HLA表位或含有这些公认HLA表位的长片段。

Claims (39)

1.一种治疗个体身上的疣的方法，所述方法包含
识别出患有或怀疑患有疣的个体；以及
给所述个体施用包含融合蛋白的组合物，所述融合蛋白包含(1)热激蛋白(hsp)或其免疫刺激片段，和(2)人乳头状瘤病毒(HPV)的蛋白或其抗原片段，其中施用所述组合物的量足以治疗所述疣。
2.权利要求1所述的方法，其中所述hsp是分枝杆菌(Mycobacterial)hsp。
3.权利要求2所述的方法，其中所述分枝杆菌hsp是牛分枝杆菌(Mycobacterium bovis)hsp。
4.权利要求3所述的方法，其中所述hsp是牛分枝杆菌(Mycobacterium bovis)Hsp65。
5.权利要求1所述的方法，其中所述hsp是Hsp60或Hsp70家族蛋白的成员
6.权利要求1所述的方法，其中所述HPV是第16型HPV。
7.权利要求1所述的方法，其中所述HPV蛋白是E7蛋白。
8.权利要求1所述的方法，其中所述组合物含有约50-5000μg的融合蛋白。
9.权利要求8所述的方法，其中所述组合物含有约100-2000μg的融合蛋白。
10.权利要求1所述的方法，其中施用的所述组合物不含佐剂。
11.权利要求1所述的方法，其中所述个体是哺乳动物。
12.权利要求11所述的方法，其中所述哺乳动物是人。
13.权利要求1所述的方法，其中所述融合蛋白所施用的量足以缩小疣的大小。
14.一种治疗个体所患的与人乳头状瘤病毒(HPV)相关的疾病或症状的方法，所述方法包含
给个体施用包含融合蛋白的组合物，所述融合蛋白包含(1)hsp或其免疫刺激片段，以及(2)HPV的蛋白或其抗原片段，其中个体被一种与给个体施用的HPV类型不同的HPV类型感染，所述施用组合物的量足以治疗疾病或症状。
15.权利要求14所述的方法，其中所述hsp是分枝杆菌(Mycobacterial)hsp。
16.权利要求15所述的方法，其中所述分枝杆菌hsp是牛分枝杆菌(Mycobacterium bovis)hsp。
17.权利要求16所述的方法，其中所述hsp是牛分枝杆菌(Mycobacterium bovis)Hsp65。
18.权利要求14所述的方法，其中所述hsp是Hsp60或Hsp70家族蛋白的成员
19.权利要求14所述的方法，其中给个体施用的HPV类型是第16型。
20.权利要求19所述的方法，其中所述个体患有与HPV的第5、6、11、18、31、33、35、45、54、60或70型相关的疾病或症状。
21.权利要求20所述的方法，其中所述个体患有与HPV的第6、11、33、45或70型相关的疾病或症状。
22.权利要求21所述的方法，其中所述个体患有与HPV第6或11型相关的疾病或症状。
23.权利要求14所述的方法，其中所述HPV蛋白是E7蛋白。
24.权利要求14所述的方法，其中所述组合物含有约50-5000g的融合蛋白。
25.权利要求24所述的方法，其中所述组合物含有约100-2000μg的融合蛋白。
26.权利要求14所述的方法，其中所述组合物不含佐剂。
27.权利要求14所述的方法，其中所述个体是哺乳动物。
28.权利要求27所述的方法，其中所述哺乳动物是人。
29.权利要求14所述的方法，其中所述个体在施用组合物之前没有被识别出受所施用的HPV类型感染。
30.一种治疗个体身上的疣的方法，所述方法包含
识别出患有或怀疑患有疣的个体；
给个体施用编码融合多肽的核酸，所述融合多肽包含(1)hsp或其免疫刺激片段，和(2)HPV的蛋白或其抗原片段；以及
在个体中表达融合多肽的量足以治疗疣。
31.权利要求30所述的方法，其中所述核酸包含在病毒载体内。
32.一种治疗个体所患的与HPV感染相关的疾病或症状方法，所述方法包含：
给个体施用编码融合蛋白的核酸，所述融合蛋白包含(1)hsp或其免疫刺激片段，和(2)HPV的蛋白，其中所述个体被一种与给个体施用的HPV类型不同的HPV类型感染；以及
在个体中表达融合蛋白，使其量足以治疗疾病或症状。
33.权利要求32所述的方法，其中所述核酸包含在病毒载体内。
34.权利要求14所述的方法，其中所述疾病或症状是生殖器疣、跖疣、宫颈癌、宫颈发育异常、肛门癌、肛门发育异常或复发性呼吸乳头状瘤病。
35.权利要求32所述的方法，其中所述疾病或症状是生殖器疣、跖疣、宫颈癌、宫颈发育异常、肛门癌、肛门发育异常或复发性呼吸乳头状瘤病。
36.组合物在制造用于治疗疣的药物中的应用，所述组合物包含(1)热激蛋白或其免疫刺激片段，和(2)人乳头状瘤病毒的蛋白或其抗原片段。
37.组合物在制造用于治疗第二类型人乳头状瘤病毒感染的药物中的应用，所述组合物包含(1)热激蛋白或其免疫刺激片段，和(2)第一类型人乳头状瘤病毒的蛋白或其抗原片段，其中所述第一类型和第二类型是不同的。
38.编码融合多肽的核酸在制造用于治疗疣的药物中的应用，所述融合多肽包含(1)热激蛋白或免疫刺激片段，和(2)人乳头状瘤病毒的蛋白或其抗原片段。
39.编码融合多肽的核酸在制造用于治疗第二类型人乳头状瘤病毒感染的药物中的应用，所述融合多肽包含(1)热激蛋白或其免疫刺激片段，和(2)第一类型人乳头状瘤病毒的蛋白或其抗原片段，其中所述第一类型和第二类型是不同的。
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