Grundlagen der Erfindung
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Obwohl die Funktion der Streßproteine nicht
vollständig geklärt ist, scheinen einige bei Zusammensetzung
und Strukturstabilisierung bestimmter zellulärer oder
viraler Proteine beteiligt zu sein, und ihr Vorhandensein
in hohen Konzentrationen kann einen zusätzlich
stabilisierenden Effekt während der Exposition bei nachteiligen
Bedingungen ausüben. Neidhardt, F.C. und R.A. VanBogelen,
In: Escherichia coli and Salmonella typhimurium, Cellular
and Molecular Biology, (eds. Neidhardt, F.C., Ingraham,
J.L., Low, K.B., Magasanik, B., Schachter, M. and
Umbarger, H.E. (Am. Soc. Microbiol., Washington, D.C.),
Seiten 1334-1345 (1987); Pelham, H.R.B. Cell, 46:959-961
(1986); Takano, T. und T. Kakefuda, Nature, 239:34-37
(1972); Georgopoulus, C. et al., New Biology, 239:38-41
(1972). Phagocytenwirtszellen bilden ein Wirtsmilieu für
fremde Organismen, und die Fähigkeit der Produktion von
Streßproteinen ist mit dem Überleben bakterieller
Pathogene in Makrophagen in Verbindung gebracht worden.
Christman, M.F. et al., Cell, 41:753-762 (1985).
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Mycobacterium (M.) tuberculosis und Mycobacterium
(M.) leprae sind die Erreger der Tuberkulose und
beziehungsweise Lepra. An diesen Krankheiten leiden 20-30
Millionen Menschen, und diese Krankheiten sind immer noch
ein großes weltweites Gesundheitsproblem. Joint
International Union Against Tuberculosis and World Health
Organization Study Group, Tubercle, 63:157-169 (1982);
Bloom, B. und T. Godal, Rev. Infect Dis. 5:765-780
(1983). Für die Entwicklung wirksamerer Mittel für
Diagnose und Prävention dieser Krankheiten ist das
Verstehen der Immunantwort auf eine Infektion mit
mycobakteriellen Pathogenen wichtig.
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Die Antikörper- und T-Zellantworten auf Infektion
oder Impfung mit abgetöteten Mycobakterien sind bei
Menschen und Tieren untersucht worden. An Tuberkulose
oder Lepra erkrankte Patienten produzieren gegen
mindestens 12 mycobakterielle Proteine gerichtete
Serumantikörper. Einige dieser Proteine werden auch von gut
charakterisierten murinen monoklonalen Antikörpern
erkannt. Mit Mycobakterien-Lysaten immunisierte Mäuse
produzieren Antikörper, die vorwiegend gegen sechs M.
tuberculosis und sechs M. leprae Proteinantigene gerichtet
sind. Engers, H.D., Infect. Immun., 48:603-605 (1985);
Engers, H.D., Infect. Immun., 51:718-720 (1986). Es sind
die Gene, die diese 12 mycobakteriellen Antigene
codieren, kloniert worden und von diesen Klonen produzierte
rekombinante Proteine hat man zur Erforschung der
menschlichen T-Lymphocyten-Antwort auf eine mycobakterielle
Infektion verwendet. Husson, R.N. und R.A. Young, Proc.
Natl. Acad. Sci., USA 84:1679-1683 (1987); Young, R.A.
et al., Nature, 316:450-452 (1985); Britton, W.J et al.,
Leer. Rev., 57, Suppl. 2, 67-75 (1986).
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Der Schutz gegen eine mycobakterielle Krankheit
umfaßt eine zellvermittelte Immunität. Joint International
Union Against Tuberculosis and World Health Organization
Study Group, Tubercle, 63:157-169 (1982); Hahn, H. und
S.H.E. Kaufman, Rev. Infect. Dis., 3: 1221-1250 (1981).
Man hat von Patienten oder freiwilligen Probanden, die
mit abgetöteten Mycobakterien immunisiert worden waren,
geklonte T-Lymphocyten auf deren Fähigkeit getestet, die
rekombinanten mycobakteriellen Proteine zu erkennen.
Lymphocyten-Proliferationstests zeigen, daß die meisten
der mit monoklonalen Antikörpern identifizierten Antigene
bei der T-Zellantwort auf eine mycobakterielle Infektion
oder Impfung bei Mäusen und Menschen beteiligt sind. Der
Verdünnungsreihentest deutet darauf, daß 20% der auf
Mycobakterien reagierenden CD&sup4;&spplus; T-Lymphocyten in M.
tuberculosis infizierten Mäusen nur ein einziges Protein,
das 65 kDa Antigen, erkennen. Kaufman, S.H.E. et al.,
Eur. J. Immunol., 17:351-357 (1987).
Zusammenfassung der Erfindung
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Die vorliegende Erfindung betrifft Streßproteine
und Verfahren zur Verstärkung der Immunantwort eines
Individuums auf ein Pathogen außer einem Mycobakterium,
und insbesondere betrifft die Erfindung die Verwendung
derartiger Streßproteine zur Herstellung eines
"Impfstoffs" für die prophylaktische Immuntherapie, die zu
einer Induktion oder Verstärkung der Immunantwort auf ein
gewähltes Pathogen bei der Immunprophylaxe führt, wobei
die Streßproteine zur Verhinderung oder Verminderung der
Wirkungen in einem Individuum eines Pathogens, das ein
beliebiger Virus, Mikroorganismus oder anderer Organismus
oder Substanz (z. B. ein Toxin oder Toxoid)sein kann,
der/das eine Krankheit verursacht, verabreicht werden.
Bei Verhinderung oder Verminderung nachteiliger Wirkungen
des nichtviralen Pathogens (z. B. Bakterien) gemäß dem
Verfahren der vorliegenden Erfindung wird eine
Immunantwort eines Individuums auf das (die)
Streßprotein(e) des nichtviralen Pathogens durch Verabreichung
eines Impfstoffs induziert oder verstärkt, der ein oder
mehrere Streßproteine des Pathogens und üblicherweise ein
Adjuvans umfaßt.
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Die Verhinderung oder Verminderung nachteiliger
Wirkungen der viralen Pathogene, ebenso wie die
Verhinderung der Zelltransformation oder die Minderung des
vorkommenden Transformationausmaßes gemäß dem
vorliegenden Verfahren, wird durch die vorübergehende Verstärkung
eines Immunüberwachungssystems des Individuums bewirkt.
In diesem Fall haben die verursachenden Pathogene (z. B.
Virus; transformierendes Agens) keine eigenen
Streßproteine. Die Verstärkung der Immunantwort kann durch
Modulation der Immunzellen mittels Stimulation mit einem
nichtviralen Streßprotein (z. B. einem bakteriellen
Streßprotein) oder Modulation der Streßantwort des
Individuums durch beliebige Mittel (z. B. lokale
Hitzeapplikation) bewirkt werden.
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In der Immuntherapie, wie sie beispielsweise bei
der Behandlung von Autoimmunkrankheiten angewendet wird,
werden die bekanntermaßen an der Immunantwort beteiligten
Streßproteine verabreicht, um die Immunantwort eines
Individuums durch Tolerierung des Streßproteins
herabzusetzen. Siehe EP-A-0.262.710. Alternativ wird die
Immunantwort auf ein Streßprotein, das bekanntermaßen bei
Autoimmunkrankheiten vorkommt, durch Beeinträchtigung der
Fähigkeit der Immunzellen vermindert, die auf
Streßproteine antworten.
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Ein gewähltes Streßprotein der vorliegenden
Erfindung kann einem Individuum gemäß dem Verfahren der
vorliegenden Erfindung verabreicht werden und zu einer
Immunantwort führen, die vor späteren Infektionen durch
einen nichtviralen Organismus (z. B. Bakterien, andere
infektiöse Agentien, die Streßproteine produzieren)
schützt.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
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Abbildung 1 ist eine graphische Darstellung der
Homologien zwischen mycobakteriellen Antigenen und
bekannten Streßproteinen. Abbildung 1A zeigt die
Sequenzähnlichkeit zwischen Bereichen des M. tuberculosis 71 kDa
Antigens (Reste 1-204; TB 71 kDa) und des E. coli DnaK
Proteins (Reste 430-469). Abbildung 1B zeigt die
Sequenzähnlichkeit
zwischen Bereichen des M. tuberculosis 65 kDa
Antigens (Reste 1-540; TB 65 kDa) und des E. coli GroEL
Proteins (Reste 1-547).
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Abbildung 2 zeigt einen Vergleich der
Aminosäuresequenz des menschlichen P1 Proteins (573 Reste) mit der
Aminosäuresequenz des GroEL Proteins (547 Reste).
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Abbildung 3 zeigt einen Vergleich der
Aminosäuresequenz des menschlichen P1 Proteins (573 Reste), das ein
Homolog des groEL-Proteins ist, mit der Aminosäuresequenz
des 65 kDa M. leprae Proteins (540 Reste).
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Abbildung 4 zeigt einen Vergleich der
Aminosäuresequenz des menschlichen P1 Proteins (573 Reste), das ein
Homolog des groEL-Proteins ist, mit der Aminosäuresequenz
des 65 kDa M. tuberculosis Proteins (540 Reste).
Genaue Beschreibung der Erfindung
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Die vorliegende Erfindung beruht auf der
Beobachtung, daß Streßproteine Vertreter der wichtigen
Antigene sind, die für Präsentation für T-Lymphozyten
verfügbar sind und gewöhnliche Immunziele in einem
breiten Spektrum von Infektionskrankheiten sein können.
Immunantworten auf Streßproteine sind an der
Immunüberwachung vom Körper beteiligt, und man hat gezeigt,
daß eine Reihe verschiedener T-Zelltypen hoch
konservierte Streßproteindeterminanten erkennen. Mehrere unten
beschriebene Beobachtungen lassen ein Modell der
Immunüberwachung postulieren, wo selbstreaktive T-Zellen eine
erste Verteidigungslinie gegen eine Infektion oder eine
andere Invasion von Pathogenen und gegen eine
Zelltransformation durch Erkennen und Hilfe zur Beseitigung
gestreßter autologer Zellen wie auch von intrazellulären
Bakterien infizierte Zellen bilden. Ohne sich streng an
dieses Modell zu halten, ist eine Erklärung möglich,
warum prokaryontische und eukaryontische Zellen auf eine
Reihe möglicherweise zerstörender Stimuli antworten, wie
beispielsweise erhöhte Temperatur, durch eine vermehrte
Synthese einer Proteinfamilie, die als Streßproteine
bezeichnet werden, die unter den am höchsten
konservierten und häufig vorkommenden Proteinen sind, die in der
Natur vorkommen.
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Untersuchungen von Antigenen, die an der
Immunantwort auf Tuberkulose- und Leprabacilli (M.
tuberculosis und M. leprae) beteiligt sind, führten zunächst
zu der Beobachtung, daß eine Reihe von Streßproteinen
sich unter den Hauptzielen der Immunantwort befinden, wie
dies unten ausführlicher beschrieben wird.
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Eine weitere Bewertung hat gezeigt, daß
Streßproteine gewöhnliche Ziele bei einem breiten Spektrum von
Infektionskrankheiten sein können. Eine Sequenzanalyse
hat ein 70-kDa Hitzeschockprotein erkennen lassen, das
homolog zu den Hauptantigenen der protozooischen
Parasiten Plasmodium falciparum (Bianco, A.E. et al., Proc.
Natl. Acad. Sci. USA, 83:8713-8717 (1986)) und
Schistosoma mansoni (Hedstrom, R. et al., J. Exp. Med.,
165:1430-1435 (1987)) und den Malaria-Parasiten Brugia
malayi (Selkirk, M.E. et al., J. Cell Biochem., 12D: 290
(1988)) ist. Entsprechend sind Homologe von GroEL unter
Antigenen gefunden worden, die an der Immunantwort auf
Salmonella typhimurium und Coxiella beteiligt sind.
Vodkin, M.H. und J.C. Williams, J. Bacteriol, 170:1227
(1988). Das Vorhandensein von Streßproteinen unter den
Hauptimmunzielen bei einer Reihe von Humanpathogenen
stützt die Vorstellung, daß die Streßantwort ein üblicher
Teil der Infektion sein kann, und daß Streßproteine als
mögliche Spalt-Impfstoffe in Betracht gezogen werden
sollten. Alle Organismen reagieren auf Hitze, in dem eine
Synthese von Hitzeschockproteinen (Hsps), eine
Proteingruppe, induziert wird. Diese Antwort ist das am
höchsten konservierte genetische System, das man kennt,
und man hat gezeigt, daß es in jedem bis heute
untersuchten Organismus, einschließlich Mikroorganismen,
Pflanen und Tiere, vorkommt. Viele dieser
Reaktionsmerkmale sind allen Organismen gemeinsam und die Hsps
sind Vertreter der am höchsten konservierten Proteine,
die man kennt. Beispielsweise sind die hsp90 und hsp70
Proteinfamilien in sehr verschiedenen Organismen
vorhanden. Die Proteine jeder Familie - selbst in derart
verschiedenen Organismen - sind fast zu 50% auf
Aminosäure-Ebene identisch und bei nichtidentischen Resten
zeigen sie viele Ähnlichkeiten. Mehrere der durch Hitze
induzierten Proteine werden auch durch eine Reihe anderer
Streßfaktoren induziert. Die hsps oder ein eng
verwandtes/ähnliches Protein kommen in allen Organismen bei
normalen Temperaturen vor, und man hat gezeigt, daß sie
eine Schlüsselfunktion im normalen Zellmetabolismus
besitzen. Lindquist, S. und E.A. Craig, Ann. Rev Genet.,
22:631-677 (1988). Weil die Streßantwort allen
Prokaryonten und Eukaryonten gemeinsam ist, und die
Streßproteine die am höchsten konservierte Sequenz besitzen,
kann man erwarten, daß ein Antigen eines Pathogens gegen
ein anderes Pathogen immunisieren könnte. Eine im Leben
frühe Exposition an fremde Streßproteine könnte
tatsächlich eine gewisse Immunität gegen zahlreiche infektiöse
Agentien induzieren. Falls dies zuträfe, könnte dies die
Beobachtung erklären, daß bei vielen Pathogenen nur bei
einem Teil der Infizierten eine klinische Erkrankung
wirklich ausbricht.
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Im folgenden wird beschrieben: Die Beziehung, die
man zwischen Streßproteinen und der Immunantwort auf eine
mycobakterielle Infektion beobachtet hat; die Beobachtung
und Belege, daß Streßproteine bei vielen nichtviralen
Infektionen Immunziele sind; die Feststellung der
Tatsache, daß Immunantworten auf konservierte
Streßproteindeterminanten eine wichtige Rolle bei der
Autoimmunpathologie bei der rheumatoiden Arthritis wie auch bei
der adjuvanten Arthritis spielen; und die Rolle der
Streßproteine bei der Immunüberwachung und ebenso ein
postuliertes Modell der Immunüberwachung, wo
selbstreaktive T-Zellen eine erste Verteidigungslinie gegen eine
Infektion und Zelltransformation bilden.
Mycobakterielle Streßproteine sind Ziele der Immunantwort
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Eine interessante Beziehung zwischen Streßproteinen
und der Immunantwort auf eine mycobakterielle Infektion
ist beobachtet worden. Eine genauere Überprüfung von
Streßproteindeterminanten und Immunantwort-Mechanismen
ist für das Verstehen der Beziehung zwischen
Streßproteinen, Infektion und Immunität notwendig.
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Aufgrund der Beteiligung von M. tuberculosis und M.
leprae Proteinen bei humoralen und zellvermittelten
Immunantworten und zum Nachweis der Funktionen dieser
Proteine in der Mycobakterienzelle ist die DNS, die
mehrere M. tuberculosis und H. leprae Antigene codiert,
sequenziert worden. Als Ergebnis hat man gezeigt, daß viele
dieser mycobakteriellen Proteinantigene eine erstaunliche
Sequenzähnlichkeit zu bekannten streßinduzierten
Proteinen zeigen. Bei drei der untersuchten M. leprae und
zwei M. tuberculosis Proteinantigenen ist eine
erstaunliche Sequenzähnlichkeit zu bekannten Streßproteinen
gezeigt worden. Aus in den Beispielen diskutierten Gründen
hat man geschlossen, daß zwei der M. leprae und zwei der
M. tuberculosis Antigene Homologe der E. coli DnaK und
GroEL Proteine sind.
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In Versuchsmäusen ruft die Immunisierung mit
mycobakteriellen Lysaten Antikörperantworten auf mindestens
sechs M. tuberculosis Proteinantigene und in etwa die
gleiche Anzahl an M. leprae Proteinantigenen hervor. Für
diese Proteine spezifische Antikörper wurden verwendet,
um Klone aus λgt11 DNS-Expressionsbibliotheken von H.
tuberculosis und M. leprae zu isolieren. Die Sequenz der
DNS-Klone zeigte, daß mycobakterielle hsp70 (alias 70 kDa
Antigen) und hsp60 (alias 65 kDa Antigen, groEL) die
Hauptziele der murinen Antikörperantwort sowohl auf M.
tuberculosis als auch auf M. leprae waren. Zwei
zusätzliche hsp's, ein 18 kDa Verteter der kleinen hsp Familie
und ein 12 kDa Homolog zu groES wurden unter den M.
leprae und M. tuberculosis Antigenen gefunden. Young, D.B.,
et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 85:4267-4270 (1988);
Shinnick, T.M., et al., Nuc. Acids Res., 17:1254 (1989).
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Die mycobakteriellen Streßproteine sind sowohl für
murine Antikörper- als auch T-Zellantworten unter den
immunodominanten Zielen. In einer Studie, in der die
Ergebnisse von 10 Labors zusammengefaßt wurden, erkannte eine
Auswahl von 24 murinen monoklonalen Antikörpern 6 M.
leprae Proteine; 7 dieser Antikörper sind gegen 6
unterschiedliche Determinanten in dem M. leprae hsp60
gerichtet. Engers, H.D., et al., Infect. Immun., 48:603-605
(1985); Mehra, V., et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA,
83:7013-7017 (1986). In einer ähnlichen Studie erkannten
3 von 33 gegen M. tuberculosis gerichtete monoklonale
Antikörper das M. tuberculosis hsp60 Protein. Engers,
H.D., et al., Infect. Immun., 51:718-720 (1986).
Schließlich zeigt eine Verdünnungsreihentest, daß 20% der auf
Mycobakterien reagierenden CD4&spplus; T-Lymphocyten in Mäusen,
die mit M. tuberculosis immunisiert wurden, dieses
Antigen erkennen. Kaufman, S.H., et al., Eur. J.
Immunol., 17:351-357 (1987).
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Obwohl von einer genauen quantitativen Analyse der
menschlichen Immunantwort auf mycobakterielle
Streßproteine bis jetzt noch nicht berichtet wurde, werden
mycobakterielle Streßproteine von menschlichen
Antikörpern und T-Lymphocyten erkannt, und dieser Sachverhalt
läßt vermuten, daß diese Proteine unter den Hauptzielen
der menschlichen zellvermittelten Immunantwort sind.
Emmrich, F., et al., J. Exp. Med., 163:1024-1029 (1985);
Mustafa, A.S., et al., Nature (London), 319:63-66 (1986);
Oftung, F., et al., J. Immunol., 138:927-931 (1987);
Lamb, J.R., et al., EMBO J., 6:1245-1249 (1987). T-
Lymphocyten von Patienten mit einer mycobakteriellen
Infektion oder von Freiwilligen, die mit Mycobakterien
immunisiert worden waren, sind kloniert und auf ihre
Fähigkeit getestet worden, mycobakterielle Streßproteine
zu erkennen. In allen Untersuchungen konnte man zeigen,
daß eine Fraktion der menschlichen T-Zellklone ein oder
mehrere mycobakterielle Streßproteine erkennt.
Streßproteine sind Immunziele bei nichtviralen
Infektionen
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Die Beobachtung, daß Streßproteine wichtige Ziele
der Immunantwort auf eine mycobakterielle Infektion sind
und das Wissen, daß die Hauptstreßproteine konserviert
sind und häufig in anderen Organismen vorkommen, ließen
vermuten, daß Streßproteine wahrscheinlich Immunziele bei
vielen nichtviralen Infektionen sind. Tatsächlich trifft
dies zu. Antigene vieler infektiöser Agentien sind als
Vertreter der Streßproteinfamilien identifiziert worden.
Das Hauptstreßproteinantigen, das von Antikörpern bei
bakteriellen Infektionen erkannt wird, ist das hsp60. Das
"gewöhnliche Antigen", ein immundominantes
Proteinantigen, von dem schon lang bekannt ist, daß es in den
meisten Bakterienarten vorkommt, wurde als hsp60
identifiziert. Shinnick, T.H., et al., Infect. Immun., 56:446
(1988); Thole, J.E.R., et al., Microbial Pathogenesis,
4:71-83 (1988). Es sind auch Streßproteine als Immunziele
bei den wichtigsten Parasiteninfektionen des Menschen
identifiziert worden. Bianco, A.E., et al., Proc. Natl.
Acad. Sci., USA, 83:8713 (1986); Nene., V., et al., Mol.
Biochem. Parasitol., 21:179 (1986); Ardeshir, F., et al.,
EMBO J., 6:493 (1987); Hedstrom, R., et al., J. Exp.
Med., 165:1430 (1987); Selkirk, M.E., et al., J. Cell
Biochem., 12D:290 (1988); Engman, D.M., et al., J. Cell
Biochem., 12D: Supplement, 290 (1988); Smith, D.F., et
al., J. Cell Biochem., 12D:296 (1988). Antikörper gegen
hsp70 sind in Sera von Patienten, die an Malaria,
Trypanosomiasis, Leishmaniasis, Schistosomiasis und
Filariasis leiden, identifiziert worden. Hsp90 ist
ebenfalls ein Antikörperziel bei Trypanosomiasis, und ein
Mitglied der kleinen hsp Familie wird bei einigen
Patienten mit Schistosomiasis erkannt.
Streßproteine und Autoimmunreaktionen
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Rheumatoide Arthritis ist durch eine chronische
Proliferations- und Entzündungsreaktion in der
Gelenkinnenhaut
gekennzeichnet, wobei angenommen wird, daß
Autoimmunreaktionen beteiligt sind. Die adjuvante
Arthritis bei Ratten ähnelt in manchem der menschlichen
rheumatoiden Arthritis und ist als ein Tierversuchsmodell
für eine Humanerkrankung verwendet worden. Pearson, C.M.,
Arthritis Rheum., 7:80-86 (1964). Adjuvante Arthritis
kann bei Ratten mit einer einzigen intradermalen
Injektion abgetöteter M. tuberculosis in einem kompletten
Freund Adjuvans ausgelöst werden. Eine Autoimmunreaktion
mit Beteiligung von T-Lymphocyten scheint für die
Krankheitsentstehung verantwortlich zu sein. Holoshitz, J., et
al., Science, 219:56-58 (1983). T-Zellinien, die durch
Lymphknotendrainage arthritischer Ratten isoliert und in
vitro durch Stimulation mit H. tuberculosis gepulsten,
syngenes Antigen präsentierenden Zellen vermehrt wurden,
können eine vorübergehende Form der Krankheit
verursachen, wenn sie in bestrahlte Ratten transferiert
werden. Da in diesen Experimenten darauf geachtet wurde, daß
ein Transfer kontaminierender H. tuberculosis
ausgeschlossen war, läßt dieses Ergebnis wirklich vermuten,
daß die klinischen Effekte der Krankheit eine Folge der
Autoimmunreaktion sind, wo das Autoantigen mit M.
tuberculosis geteilt wird.
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Die Ratten- und M. tuberculosis Antigene, die von
arthritogenen T-Zellen erkannt werden, sind schon lange
gesucht worden. Zahlreiche verschiedene Proteine in der
Gelenkinnenhaut hat man für das kreuzreagierende
Rattenantigen gehalten, wurden aber später mit Vorbehalt
aufgenommen,
als die Reinigungsverfahren für diese Proteine
verbessert waren. van Eden, W., et al., Proc. Natl. Acad.
Sci., USA, 82:5117-5120 (1985); Holoshitz, J., et al.,
Science, 219:56-58 (1983). Vor kurzem wurde gezeigt, daß
das von arthritogenen T-Zellen erkannte M. tuberculosis
Antigen ein 65 kDa Protein ist (van Eden, W., et al.,
Nature, 331:171 (1988)), und man hat jetzt gezeigt, daß
es ein hsp60 ist (siehe Beispiele). Bei Verwendung einer
Kombination verkürzter rekombinanter 65 kDa Proteine und
Peptide ist ein neun Aminosäure-Epitop von hsp60 als die
kleinste stimulierend wirkende Sequenz auf arthritogene
T-Zellklone in Proliferationstests identifiziert worden.
Da es nun offensichtlich ist, daß einige arthritogene T-
Zellen das mycobakterielle hsp60 erkennen, ist es sehr
wohl möglich, daß das Ratten-Autoantigen ebenfalls hsp60
ist.
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Die mit dem adjuvanten Arthritismodell erhaltenen
Ergebnisse veranlaßten Forscher zu bestimmen, ob
T-Lymphocyten von Patienten mit rheumatoider Arthritis auch
mycobakterielle Antigene erkennen. Diese Forscher haben
herausgefunden, daß nicht nur Patienten mit rheumatoider
Arthritis T-Zellen haben, die M. tuberculosis Antigene
erkennen, sondern daß diese T-Zellen verschiedene
Phänotypen haben Wesentliche Proliferationsreaktionen auf
mycobakterielle Extrakte werden mit nichtklonierten T-
Zellen (vorwiegend CD4&spplus;) von sowohl Gelenk-Infiltraten
als auch Peripherblut beobachtet, wenn auch die
Reaktionen normalerweise bei Gelenkinnenhaut-Infiltraten
stärker sind. Abrahamson, T.G., et al., Scand. J.
Immunol. 7:81-90 (1978); Holoshitz, J., et al., Lancet
ii, 305-306 (1986). Holoshitz et al. fanden, daß 4 von 5
T-Zellklonen, die aus der menschlichen rheumatoiden
Gelenkinnenhaut isoliert wurden, und auf H. tuberculosis
Antigene antworten, CD4&supmin; CD8&supmin; Zellen mit γ/δ
T-Zellreportern waren. Holoshitz, J, et al., Nature, 339:226-
229 (1989). Diese Beobachtung ist interessant, da man
jetzt den γ/δ T-Zellen eine Funktion bei der Immunität
zuordnen kann. Einer der γ/δ Klone wurde auf seine
Fähigkeit getestet, auf gereinigtes mycobakterielles
hsp60 zu reagieren, und er war in Proliferationstests
positiv. Aufgrund der konservierten Natur der
Streßproteine, sind diese T-Zellen potentiell autoreaktiv.
Lamb und Mitarbeiter haben gezeigt, daß polyklonale T-
Zellen aus Gelenk-Infiltraten sowohl hsp60 als auch hsp70
erkennen. Lamb, J.R., et al., Intl. Immunol., im Druck
(1989). Von der Population T-Zellen, die die
mycobakteriellen Streßproteine erkennt, konnte man zeigen,
daß sie auf E. coli hsp60 und hsp70 und
hochinteressanterweise auf menschliches hsp70, gereinigt aus
Hitzeschock behandelten Makrophagen, reagiert. Folglich
können Immunantworten auf konservierte
Streßproteindeterminanten, die möglicherweise durch eine
Bakterieninfektion (nicht notwendigerweise eine mycobakterielle)
ausgelöst werden, eine wichtige Rolle bei der
Autoimmunpathologie bei rheumatoider Arthritis wie auch bei der
adjuvanten Arthritis spielen.
Streßproteine und Immunüberwachung
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Man hat von einer Reihe verschiedener T-Zelltypen
gezeigt, daß sie hochkonservierte
Streßproteindeterminanten erkennen. Die Fähigkeit der Zellen, auf Streß durch
eine Erhöhung der Spiegel der hochkonservierten
Streßproteine zu reagieren; in Gesunden das Vorkommen von
T-Zellen verschiedener Phänotypen, die in der Lage sind,
körpereigene Streßproteindeterminanten zu erkennen; und
Beobachtungen, daß Streßreaktionen durch eine virale
Infektion und Zelltransformation ausgelöst werden, dies
alles führte zu einem Modell der Immunüberwachung, wo
selbstreaktive T-Zellen eine erste Verteidigungslinie
gegen eine Infektion und Transformation durch Erkennen
und Hilfe bei Beseitigung von gestreßten autologen Zellen
wie auch von intrazellulären Bakterien infizierten Zellen
bilden. Der Pool von Lymphocyten, die die konservierten
Streßproteindeterminanten erkennen, würde beim Herstellen
einer natürlichen Mikrobenflora auf der Haut und im Darm
induziert werden, und durch häufige bakterielle und
virale Stimulation und auch durch Streßstimuli, die im
Leben normalerweise vorkommen, aufrechterhalten werden.
Dieses Modell ist bestechend, da es eine Möglichkeit
liefert, wo das Immunsystem die Existenz konservierter
Epitope in Streßproteinen nutzen kann, um unmittelbar auf
Antigene unterschiedlicher Pathogene und zelluläre
Änderungen zu antworten, um eine erste Verteidigung zu bilden,
die keine Immunitätsentwicklung für neue Antigene
abzuwarten braucht.
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Die Streßproteininduktion geschieht in
eukaryontischen Zellen im Anschluß an eine Infektion von
verschiedenen Viren in vitro. Collins, P.L. und Hightower,
L.E., J. Virol., 44:703-707 (1982); Nevins, J.R., Cell,
29:913-939 (1982); Garry, R.F., et al., Virology,
129:391-332 (1988); Khandjian, E.W. und Turler, H., Mol.
Cell Biol., 3:1-8 (1983); LaThangue, N.E., et al., EMBO
J., 3:267-277 (1984). CTL, die diese Neoantigene
erkennen, könnten die Verbreitung des Virus durch Abtöten der
infizierten Zellen, möglicherweise bevor größere Mengen
des reifen Virus zusammengesetzt sind, und durch
Sekretion des Lymphokinins γ-Interferon einschränken.
Pestka, S., in: Methods Enzymol., Interferons, Teil A.,
Vol. 79, Academic Press, New York, Seite 667 (1981). Der
mit diesem Gedanken in Einklang stehende Sachverhalt ist
erstaunlich. Koga et al. haben gezeigt, daß eine
Infektion primärer Mäusemakrophagen mit CMV sie als Ziele für
MHCOI beschränkte CD8&spplus; CTL, die spezifisch für lineare
Epitope von H. tuberculosis hsp60 sind, empfänglich
machen. Koga, T. et al. Obwohl das von diesen CTL auf
infizierten Makrophagen erkannte Epitop nicht definiert
war, ist es doch verführerisch darüber zu spekulieren, ob
eine Kreuzreaktion mit körpereigenen hsp60 Epitopen
beobachtet wird. Tatsächlich zeigten die gleichen
Gruppen, daß ein homologes hsp60 konstitutiv in
Makrophagen vorhanden ist und von einer
γ-Interferonstimulation hochreguliert wird.
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T-Zellen, die in der Lage sind, durch eine
Transformation gestreßte autologe Zellen zu erkennen, könnten
bei Beseitigung entstehender Tumorzellen helfen.
Streßproteine scheinen in großen Mengen in mindestens einigen
transformierten Zellen gebildet zu werden. Bensaude, O.,
und Morange, M., EMBO J., 2:173-177 (1983). Man hat ein
86 kDa murines Tumorantigen gefunden, das homolog zu
Vertretern der hsp90 Familie in Hefe und Drosophila ist.
Ullrich, S.J., Proc. Natl. Acad. Sci., USA 83:3121-3125
(1986). Die Immunisierung von Mäusen mit gereinigtem
Protein führte zu einer Hemmung des Tumorwachstums in 95%
der Versuchstiere, denen man kultivierte Tumorzellen
transplantiert hatte. Alle geschützten Mäuse hatten hohe
Titer an einem anti-hsp90 Serum-Antikörper, der mit
murinem hsp90 aus Lysaten von Hitzeschock behandelten
embryonalen Mäusezellen präzipitieren konnte. Wieder sind
autoreaktive Lymphocyten beteiligt.
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Lymphocyten, die konservierte
Streßproteindeterminanten erkennen, müssen in der Lage sein, zwischen
normalen und gestreßten Zellen zu unterscheiden. Da viele
Streßproteine in normalen Zellen konstitutiv exprimiert
werden, aber in geringeren Mengen als in gestreßten
Zellen, ist eine mögliche Autoreaktivität immer gegeben.
Normale Zellen können der Zerstörung durch Expression von
nur substimulatorischen Mengen an
Streßproteindeterminanten auf ihren Oberflächen entgehen. Zusätzlich können
Streßproteine nur während des Stresses gebildet und
präsentiert werden, und es könnte wichtig sein, daß viele
Streßproteine die intrazellulären Stellen während des
Stresses geändert haben. Schließlich könnten unter
normalen Umständen regulatorische Vernetzungen die
Aktivierung selbstreaktiver T-Zellen verhindern. Die für
dieses System notwendigen regulatorischen Einschränkungen
können gelegentlich verloren gehen, möglicherweise
während des von bakteriellen oder viralen Infektionen
verursachten Stresses, was zu einer Autoimmunerkrankung führt.
Die rheumatoide Arthritis kann eine derartige Krankheit
sein.
Regulation der Immunantwort
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Die genaue Beziehung zwischen Streßproteinen und
der Immunantwort des Wirts auf eine Infektion ist bis
heute nicht definiert. Wenn Zellen verschiedenen
Streßformen unterzogen werden, antworten sie durch selektive
Steigerung der Synthese einer begrenzten Reihe von
Streßproteinen. Einige Streßproteine, einschließlich der
Produkte von dnaK und groEL, sind wichtige Bestandteile der
Zellen unter normalen Wachstumsbedingungen und werden auf
noch höhere Niveaus während des Stresses induziert.
Lindquist, S., Annu. Rev. Biochem., 55:1151-1191 (1986);
Neidhardt, F.C., und R.A. VanBogelen, In: Escherichia
coli and Salmonella Typhimurium, Cellular and Molecular
Biology, (eds. Neidhardt, F.C., Ingraham, J.L. Low, K.B.
Magasanik, B. Schaechter, M. and Umbarger, H.E.) Am. Soc.
Microbiol., Washington, D.C., Seiten 1134-1345 (1987).
Man hat nun gezeigt, daß mit Streßantwort-Proteine Ziele
der Immunantwort sind. Man erwartet verständlicherweise,
daß immundominante Antigene unter derart häufig
vorkommenden Proteinen zu finden sind, wie man das in diesem
Fall gezeigt hat.
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Streßinduzierte Proteine oder deren funktionelle
Äquivalente können zur Immunisierung eines Tiers gegen
eine nichtvirale Infektion eingesetzt werden, oder
wahlweise andere gewählte streßinduzierte Proteine oder deren
funktionellen Äquivalente können zum Auslösen einer
Immuntoleranz in einem Tier eingesetzt werden. Gemäß der
Methode des vorliegenden Verfahrens ist es möglich, die
Immunantwort eines Individuums durch eine Antwortänderung
des Individuums auf Streßproteine zu regulieren.
Insbesondere ist es möglich, die Antwort eines Individuums
auf ein Pathogen (z. B. Bakterium, Virus oder einen
anderen Organismus oder anderes Agens, wie beispielsweise
Parasiten, Toxine, Toxoide, die Krankheiten oder
Zelltransformationen verursachen) zu regulieren.
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Es ist möglich, wie hier beschrieben, die
Streßproteine als Impfstoff zu verwenden, der nach
Verabreichung einem Individuum eine Immunantwort in diesem
Individuum auslöst oder verstärkt und somit gegen eine
nachfolgende Infektion schützt. Weil dies, wie gezeigt,
Proteine sind, die Bereiche hoch konservierter
Aminosäuresequenzen enthalten, und man gezeigt hat, daß
derartige Proteine ubiquitäre Ziele bei mycobakteriellen,
bakteriellen oder anderen Infektionen sind, können diese
Proteine zum Auslösen einer gleichermaßen ubiquitären
Immunantwort eingesetzt werden.
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Wenn beispielsweise ein Pathogen Streßproteine
exprimiert, wie z. B. nichtvirale Pathogene, können zwei
Verfahren zur Verstärkung der Immunantwort eines
Individuums (und folglich zur Minderung der Pathogenwirkungen)
eingesetzt werden.
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Erstens ist es möglich, da die Streßproteine eines
nichtviralen Pathogens sich von denen des Wirts
unterscheiden, eine für die Streßproteine des Pathogens
spezifische immunoprophylaktische Antwort zu induzieren. Dies
kann durch Verabreichung eines Impfstoffs geschehen, der
das gesamte oder einen Teil (z. B. hinreichende Sequenz,
um die gewünschte Stimulationswirkung auf die
Immunantwort zu haben) des Streßproteins des Pathogens oder
eines anderen Proteins mit einer hinreichend ähnlichen
Aminosäuresequenz zu der des Streßproteins umfaßt, um die
Immunantwort auf das Pathogen zu stimulieren. Alternativ
können hoch konservierte Streßproteindeterminanten, wie
solche, von denen man gezeigt hat, daß sie von einer
Reihe T-Zellen erkannt werden, als eine Art "allgemeiner"
Impfstoff verabreicht werden. Auf jeden Fall wird die
Immunantwort auf die Streßproteinsequenz verstärkt sein,
und die Wirkungen des nichtviralen Pathogens werden
vermindert (geschwächt, verhindert oder beseitigt).
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Zweitens ist es auch möglich, das
Immunüberwachungssystem oder die Immunantwort zu induzieren oder
zu verstärken, die gegen gestreßte Wirtszellen gerichtet
ist. Dies wird ausführlicher im Zusammenhang mit der
Verstärkung der Immunantwort in den Fällen beschrieben,
wo das Pathogen (z. B. ein Virus, transformierendes
Agens) keine eigenen Streßproteine (z. B. Streßproteine,
die sich von den Streßproteinen des Wirts unterscheiden)
besitzt (exprimiert).
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Der Impfstoff, der zur Induktion oder Verstärkung
der Immunantwort auf nichtvirale Pathogene verabreicht
wird, umfaßt ein Streßprotein des Pathogens gegen das
eine Immunantwort gewünscht wird, ein Teil dieses
Proteins mit hinreichender Größe, um die gewünschte
Immunantwort zu stimulieren oder ein Protein oder eine
Aminosäuresequenz (z. B. ein Polypeptid), welche(s) das
funktionlle Äquivalent des Streßproteins des Pathogens
ist, weil es eine hinreichend homologe Sequenz zu der des
Streßproteins besitzt, das in der Lage ist, die
gewünschte Antwort auslösen zu können. Der Ausdruck
"hinreichend homologe Sequenz zu der des Streßproteins"
bedeutet, daß die Sequenz des Proteins oder Polypeptids
im allgemeinen ungefähr zu 50% identisch mit der Amino-
Säuresequenz des Streßproteins ist. Der Impfstoff kann
auch ein Adjuvans, einen geeigneten Träger und einen
geeigneten Puffer umfassen. Das Protein oder die
Aminosäuresequnz, das/die im Impfstoff vorliegt, kann mittels
bekannter Techniken hergestellt werden. Beispielsweise
kann es natürlichen Ursprungs sein und gewonnen
(isoliert) werden, es kann durch Klonieren und Exprimieren
des Gens produziert werden, das das gewünschte
Streßprotein oder einen Teil davon codiert, oder es kann
chemisch oder technisch synthetisiert werden.
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Falls ein Pathogen, wie beispielsweise ein Virus
oder ein transformierendes Agens (z. B. ein Agens, dessen
Aktivität zur Produktion oder Bildung von Krebszellen
führt), das seine eigenen Streßproteine nicht exprimiert,
wird der folgende Versuch unternommen, um die
Immunantwort oder normale Immunüberwachung (z. B. die Fähigkeit
des Immunsystems, körpereigene ebenso wie fremde Proteine
zu erkennen) zu verstärken. Ein Impfstoff, der ein
bakterielles, mycobakterielles oder anderes Streßprotein
umfaßt, kann verabreicht werden. Obwohl es keine viralen
Streßproteine gibt, die für diesen Zweck eingesetzt
werden, wird die Verabreichung eines derartigen
Impfstoffs das bestehende Immunüberwachungssystem verstärken.
Zudem kann die Immunüberwachung auch durch Applikation
lokaler Hitze oder beliebig anderer Substanzen oder
Änderungen der Bedingungen verstärkt werden, die die
Streßantwort im behandelten Individuum induzieren. (Dies
kann auch in Verbindung mit dem Impfstoff angewendet
werden, der zur Verstärkung der Immunantwort auf ein
Streßproteine produzierendes Pathogen, wie zuvor beschrieben,
verabreicht wird). Es ist bekannt, daß erhöhte
Streßproteinspiegel in vielen Krebszelltypen gebildet werden. Wie
beschrieben, kann eine Verstärkung des
Immunüberwachungssystems genutzt werden, um die Zerstörung von Krebszellen
zu erleichtern und/oder eine Progression oder Etablierung
der Krebszellen zu verhindern.
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Die vorliegende Erfindung wird durch die folgenden
Beispiele näher erläutert, aber beschränkt sich hierauf
nicht.
BEISPIELE
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Rekombinante DNS-Klone. Die Isolierung und
Charakterisierung der M. tuberculosis und M. leprae λgt11
genomischen DNS-Klone mit murinen monoklonalen Antikörpern
sind beschrieben worden. Husson, R.N. und Young, R.A.,
Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 84:1679-1683 (1987); Young,
R.A., et al., Nature (London) 316:450-452 (1985). Die DNS
wurde aus diesen Klonen isoliert und mit Hilfe
Standardtechnlken aufgearbeitet. Davis, R.W., Advanced Bacterial
Genetics: A Manual for Genetic Engineering (Cold Spring
Harbor Lab., Cold Spring Harbor, NY), (1980).
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DNS-Sequenzanalyse. Die DNS wurde in den Vektor M13mp18
oder M13mp19 (New England Biolabs) subkloniert, wie vom
Lieferanten empfohlen. Dideoxynucleotid-Kettenabbruch-
Reaktionen und Gelelektrophorese der sequenzierten
Produkte erfolgte wie beschrieben. Davis, R.W., Advanced
Bacterial Genetics: A Manual for Genetic Engineering
(Cold Spring Harbor Lab., Cold Spring Harbor, NY),
(1980). Die DNS-Sequenzen beider DNS-Stränge wurden
bestimmt. Die Computeranalyse der Sequenzen mit UWGCG
Programmen erfolgte, wie von Devereux, J., et al.,
Nucleic Acids Res., 12:387-395 (1984) beschrieben.
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Immunoblot-Analyse. Der Escherichia coli Stamm TG1 wurde
mit den folgenden Plasmiden mittels Standardverfahren
transformiert (Maniatis, T., et al., Molecular Cloning, A
Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Lab., Cold Spring
Harbor, NY) (1982), mit Selektion auf
Ampicillinresistenz: pND5, ein Derivat von pBR325, das die E. coli
groE Gene enthält (Jenkins, A.J., et al., Mol. Gen.
Genet, 202:446-454 (1986); pUC8 (Vic?, J., Gene, 19:259-
268 (1982); pUC8 mit inserierter DNS für λgt11 Klon Y3178
(M. leprae 65 kDa Antigen, Young, R.A., et al., Nature,
(London) 316:450-452 (1985)), die in die EcoRI Stelle
ligiert wurde.
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Übernachtkulturen von E. coli Stämmen in Luria-
Bertani (LB) Medium wurden zentrifugiert und in
isotonischer phosphatgepufferten Saline zu einer Zelldichte
resuspendiert, die einer Absorption von 20 bei 60 nm
entspricht. Ein gleiches Volumen Probenpuffer mit 2%
(wt/vol) Polyacrylamidgelen mit NaDodSO&sub4; wurde zugegeben,
und nach 2 min Erhitzen im kochenden Wasserbad wurden 5
ml Proben auf 12% (wt/vol) Polyacrylamidgelen mit
NaDodSO&sub4; elektrophoretisch aufgetrennt. Blots wurden
durch elektrophoretischen Transfer der Proteine auf eine
Nitrocellulose-Membran hergestellt, und das Binden der
monoklonalen Antikörper wurde mit einem
Peroxidase-gekoppelten zweiten Antikörper getestet, wie beschrieben.
Young, D.B., et al., Infect. Immun., 55:1421-1425 (1987).
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Sechs M. tuberculosis und sechs M. leprae Proteine
sind bei der Immunantwort auf mycobakterielle Pathogene
(T1)
beteiligt gewesen. Um Hinweise auf die gewöhnliche
zelluläre Funktion von einigen dieser mycobakteriellen
Antigene zu erhalten, wurden DNS-Klone, die diese
Proteine codieren, mit Hilfe monoklonaler Antikörper zur
Untersuchung von λgt11 Bibliotheken isoliert (Husson,
R.N. und Young, R.A., Proc. Natl. Acad. Sci., USA,
84:1679-1683 (1987); Young, R.A., et al., Nature (London)
316:450.452 (1985)) und einer Sequenz-Analyse unterzogen.
Mit den ermittelten Sequenzen ist die GenBank
Sequenzdatenbank durchsucht worden.
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Das mycobakterielle 71 kDa Antigen. Das 71 kDa Antigen
von M. tuberculosis wird von menschlichen T-Zellen
während der Infektion erkannt (Tabelle).
TABELLE Mycobakterielle Protein-Antigene
Erkannt von menschlichen
Der Sequenz-Analyse unterzogen
Homologie zu bekannten Proteinen
M. tuberculosis
M. leprae
keine
Pflanzliches Hsp
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Zusammengefaßt sind mycobakterielle
Proteinantigene, ihre Erkennung von menschlichen T-Zellen
und die Homologie der herleitbaren mycobakteriellen
Proteinsequenzen zu bekannten Proteinen.
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ND, nicht bestimmt; +, ja; -, nein
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* Umfaßt Daten der Untersuchung der 65 kDa Antigene
von M. bovis BCG (Bacillus Calmette-Guerin), das
identisch mit dem M. tuberculosis 65 kDa Antigen ist.
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+ A.S. Mustafa, J.R. Lamb, D. Young und R.A. Young,
unveröffentlicht.
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Die inserierte DNS des λgt11 Klons Y3271 (Husson, R.N.,
et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84:1679-1683 (1987)
wurde sequenziert, um Informationen über die
Aminosäuresequenz des 71 kDA Antigens von M. tuberculosis zu
erhalten. Dieser Klon produziert ein beta-Galactosidase
Fusionsprotein, das das Carboxyl-terminale Drittel des 71
kDa Antigens enthält, das eine 40% Aminosäuresequenz-
Identität mit vergleichbaren Abschnitten des dnaK
Genprodukts von E. coli zeigt (Bardwell, J.C., et al., Proc.
Natl. Sci. USA, 81:848-852 (1984)), (Abb. 1). Abb. 2A
zeigt das Ausmaß der Sequenzähnlichkeit zwischen
Abschnitten der mycobakteriellen und den E. coli 70 kDa
Polypeptiden. Sequenzen transkrlptional downstream von
dem mycobakteriellen 71 kDa Gen lassen ein 356
Aminosäureprotein herleiten, das homolog zum E. coli dnaJ
Genprodukt ist (unveröffentlicht), was darauf hindeutet,
daß die E. coli dnaK-dnaJ Operonstruktur in M.
tuberculosis konserviert ist und mit der Folgerung
übereinstimmt, daß das mycobakterielle 71 kDa Antigen
homolog zum E. coli dnaK Genprodukt ist. Das Produkt des
dnaK Gens ist ein Vertreter der 70 kDa Hitzeschock-
Proteinfamilie, die bei den Prokaryonten und Eukaryonten
hoch konserviert ist (Bardwell, J.C., et al., Proc. Natl.
Sci., USA, 81:848-852 (1984); Lindquist, S., Annu. Rev.
Biochem. 55:1151-1191 (1986).
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Das M. leprae 70 kDa Antigen macht Kreuzreaktionen
mit monoklonalen Antikörpern, die gegen M. tuberculosis
uns M. leprae gerichtet sind, die alle beide Vertreter
der 70 kDa Hitzeschockproteinfamilie der Streßproteine
sind.
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Das mycobakterielle 65 kDa Antigen. Die 65 kDa
Antigene von M. tuberculosis und M. leprae sind an der
Antwort der menschlichen T-Zellen auf eine
mycobakterielle Infektion beteiligt (Tabelle). Diese Proteine
codierenden Gene sind isoliert (Husson, R.N. und Young, R.A.,
Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 84:1679-1683 (1987); Young,
R.A., et al., Nature (London) 316:450-452 (1985)) und
sequenziert worden (Shinnick, T.M., J. Bacteriol.,
169:1080-1088 (1987); Mehram, V., et al., Proc. Natl.
Acad. Sci., USA, 83:7013-7017 (1986)) und es stellte sich
heraus, daß die Aminosäuresequenzen der 65 kDa Antigene
von M. tuberculosis und M. leprae zu 95% identisch sind.
Diese Proteinsequenzen zeigen keine signifikante
Sequenzähnlichkeit zu Proteinen in der GenBank Datenbank.
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Die Identifizierung dieser Proteine beruhte auf der
Beobachtung, daß einige monoklonale Antikörper, die gegen
die mycobakteriellen 65 kDa Antigene gerichtet sind, mit
einem E. coli Protein mit 60 kDa kreuzreagieren. Bei E.
coli Zellen, die mit dem Plasmid pND5 transformiert sind
(Sanger, F., et al., Proc. Natl. Acad. Sci.. USA,
74:5463-5467 (1977) und die E. coli gro E Gene enthalten,
hat man gezeigt, daß sie große Mengen an 60 kDA Protein
akkumulieren. Ein Vergleich der mycobakteriellen 65 kDa
Proteinsequenzen mit den für E. coli groEL ermittelten
Sequenzen (C. Woolford, K. Tilly, C. Georgopoulous und
R.H., unveröffentlicht) zeigte das Ausmaß der
Sequenzähnlichkeit (Abb. 1B).
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Das 60 kDa Gro EL Protein ist ein wichtiges
Streßprotein in E. coli. Lindquist, S., Annual Rev.
Biochem., 55:1151-1191 (1986); Nature, 333:330-334
(1988). Es gibt Anzeichen, daß die mycobakteriellen 65
kDa Proteine bei einer Streßreaktion akkumulieren: In
Zink-Mangelmedium gewachsene Kulturen von Mycobacterium
bovis BCG (Bacillus Calmette-Guerin) sind hauptsächlich
mit diesem Protein angereichert (De Bruyn, J., et al.,
Infect. Immun., 55:245-252 (1987)). Daraus kann man
schließen, daß die 65 kDA Proteine von H. tuberculosis
und M. leprae homolog zum E. coli Gro EL Protein sind.
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Weitere mycobakterielle Antigene. T-Lymphocyten,
die auf das M. tubercolisis 65 kDa Antigen und M. leprae
18 kDa Antigen reagieren, sind bei Menschen mit
Tuberkulose und beziehungsweise Lepra beobachtet worden
(Tabelle 1). Die DNS, die diese Antigene codiert, wurde
von Agt11 Klonen Y3148 (Husson, R.N. und Young, R.A.,
Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 84:1679-1683 (1987); und
beziehungsweise Y3179 (Young, R.A., et al., Nature,
(London) 316:450-452 (1985)) sequenziert. Die aus der DNS
abgeleitete M. tuberculosis 19 kDa Proteinsequenz zeigte
keine signifikante Sequenzähnlichkeit zu Proteinen in der
GenBank Datenbank.
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Allerdings ähnelte die M. leprae 18 kDa
Proteinsequenz dem Sojabohnen 17 kDa Hitzeschockprotein,
ein Proteinvertreter einer wichtigen Klasse von
Pflanzenhitzeschockproteinen (Schoffl, F. und Van
Bogelen, R.A., In: Escherichia coli and Salmonella
typhimurium, Cellular and Molecular Biology, Am. Soc.
Microbiol., Washington, D.C. (1987).