PT1497438E - Meios e métodos para a produção de vectores de adenovírus - Google Patents

Meios e métodos para a produção de vectores de adenovírus Download PDF

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Ronald Vogels
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Crucell Holland Bv
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Description

ΕΡ 1 497 438/ΡΤ
DESCRIÇÃO
"Meios e métodos para a produção de vectores de adenovírus" CAMPO DA INVENÇÃO A invenção refere-se a veículos de entrega de ácido nucleico e ao uso dos mesmos, a invenção refere-se mais particularmente a vectores adenovirais recombinantes e ao uso dos mesmos.
ANTERIORIDADE DA INVENÇÃO
Até hoje foram identificados 51 serotipos de adenovírus humanos que estão subdivididos em 6 subgrupos (A, B, C, D, E e F) com base em propriedades de hemaglutinação e homologia de sequências (Francki et al. 1991). 0 ciclo infeccioso do adenovírus é dividido numa fase precoce e uma fase tardia. Na fase precoce, o vírus não está revestido e o genoma é transportado para ao núcleo, após o que as regiões precoces do gene (El, E2, E3 e E4) se tornam transcricionalmente activas. A região El contém duas regiões de transcrição: EIA e E1B. EIA codifica proteínas que estão envolvidas na modificação do ciclo da célula hospedeira e na activação de outras regiões de transcrição virai (revisto por Russell. 2000) . A região E1B codifica duas proteínas principais: E1B-19K e E1B-55K, que impedem a indução de apoptose resultante da actividade das proteínas EIA (Rao et al. 1992; Yew e Berk 1992; Shenk 1996). Adicionalmente, a proteína E1B-55K é necessária na fase tardia para transporte selectivo de ARNm virai e inibição da expressão de proteínas do hospedeiro (Pilder et al. 1986). E2 também está dividido em dois subdomínios: E2A e E2B, que, em conjunto, codificam três proteínas (uma proteína de ligação ao ADN, uma polimerase virai e uma proteína pré-terminal) que estão, todas, envolvidas na replicação do genoma virai (Van der Vliet 1995) . E3 não é necessário para a replicação in vitro porém codifica diversas proteínas que subvertem o mecanismo de defesa do hospedeiro relativamente à infecção virai (Horwitz 2001) . E4 abriga pelo menos 6 quadros de leitura aberta (ORF: open reading frame) que codificam proteínas envolvidas em várias funções distintas relacionadas com splicing e transporte de ARNm virai, transporte de ARNm da célula hospedeira, transcrição e transformação virai e celular 2 ΕΡ 1 497 438/ΡΤ (revisto por Leppard 1997). As proteínas tardias, necessárias para a formação das cápsides virais e o empacotamento de genomas virais, são todas geradas a partir da unidade de transcrição tardia principal (MLTU: major late transcription unit) que se torna plenamente activa após o início da replicação. Um processo complexo de splicing diferencial e poliadenilação dá origem a mais de 15 espécies de ARNm que compartilham uma sequência de comando tripartida. As proteínas E1B-55K, E4-orf3 e E4-orf6 desempenham um papel central na regulação do processamento e transporte de ARNm virai tardio desde o núcleo. Para este processo E1B-55K interage com E4-orf6 para formar um complexo funcional que estimula o transporte de ARNm virais para o citoplasma, enquanto que o complexo também está envolvido na inibição do transporte de ARNm celulares do núcleo para o citoplasma (revisto em Leppard 1997 e 1998). A produção de vectores com deleção de EI com base em serotipos do subgrupo C de Ad5 ou Ad2 é obtida em linhagens de células de complementação de El, como 2 93 (Graham et al. 1970), 911 (Fallaux et al. 1996) e PER.C6® (Fallaux et al. 1998; n.2 de depósito ECACC 96022940). Como divulgado em WO 99/55132 e WO 01/05945, vectores e linhagem de células podem ser equiparados para evitar a geração de adenovírus competentes para replicação através de recombinação homóloga entre sequências de adenovírus na linhagem de células e o vector. Para uma produção eficiente de adenovírus incompetentes para replicação derivados do grupo C utiliza-se, de preferência, a linhagem de células PER.C6®. Utilizando esta linhagem de células podem-se equiparar vectores de adenovírus, permitindo com isso a produção de vectores adenovirais do grupo C na ausência de adenovírus competentes para replicação (Fallaux et al. 1998; patente dos E.U.A. n.2 6033908) . No
entanto, os vectores do grupo C podem não ser sempre os veículos ideais para dirigir aplicações In vivo porque a eficiência de infecção é gravemente prejudicada pela presença de títulos elevados de actividade neutralizadora na maior parte dos seres humanos e ausência de quantidades suficientes do receptor celular (receptor de adenovírus Coxsackie, CAR: Coxsackie-adenovirus receptor) em células-alvo primárias específicas (p. ex. células endoteliais, células de músculo liso, sinoviócitos, monócitos e células dendríticas) . A 3 ΕΡ 1 497 438/ΡΤ administração de quantidades maiores de vírus para incrementar a transdução pode levar a maior toxicidade e a um resultado clínico imprevisível devido à variação de títulos neutralizadores dos sujeitos são tratados. Estas limitações podem ser superadas com o uso de outros serotipos de adenovírus. Por exemplo, a parte de ligação ao receptor de uma fibra de vírus do subgrupo B (em particular de serotipo 16) quando expressa num vector à base de Ad5, mediou uma infecção significativamente incrementada de células endoteliais e células de músculo liso humanas (WO 00/31285) e de sinoviócitos humanos (WO 00/52186). A fibra de outro adenovírus do subgrupo B, Ad35, é muito eficiente para mediar a infecção de células dendríticas e monócitos humanos (WO 00/03029). Além disso, o Ad35 foi identificado como um vírus para o qual a vasta maioria da população humana não apresenta actividade neutralizadora (WO 00/70071).
Existe na técnica uma necessidade, sentida de forma geral, de se desenvolver tecnologia que apresente utilidade mais ampla em termos de serotipo. Um problema particular é a falta de linhagens de células de empacotamento adequadas para estes outros serotipos. As linhagens de células de empacotamento para vectores Ad5 compreendem tipicamente proteínas codificadas por EI derivadas de adenovírus de serotipo 5. Exemplos destas linhagens de células de empacotamento "padrão" são 293, 911 e PER.C6®. As tentativas de produzir vectores derivados de outros serotipos nestas linhagens de células de empacotamento padrão provaram-se árduas quando não infrutíferas. Ocasionalmente, observa-se alguma produção, dependendo do serotipo particular utilizado. No entanto, são baixos os rendimentos de vectores de adenovírus recombinantes derivados de subgrupos de adenovírus diferentes do subgrupo C, produzidos em linhagens de células transformadas e imortalizadas por EI de Ad5. Num artigo de Abrahamsen et al. (1997), foi observada purificação melhorada, por formação de placas fágicas, de um vector de adenovírus do serotipo 7 com deleção de EIA (subgrupo B) em células 293 compreendendo E4-orf6 derivada de adenovírus de serotipo 5, em comparação com células 293 que não apresentam a sequência de E4-orf6 de Ad5. No entanto, encontrou-se um problema com a estabilidade do vector pois observaram-se recombinações inesperadas em reservas purificadas por formação de placas fágicas. Surgiu um problema adicional durante a produção 4 ΕΡ 1 497 438/ΡΤ envolvendo contaminação virai pelo adenovírus de tipo selvagem. Além disso, para a produção em grande escala de adenovírus não é útil co-transfectar E4-orf6 para se obter títulos que sejam suficientemente altos para aplicação. Uma opção para desenvolver estes adenovírus consiste em proporcionar células com o gene de E4-orf6 integrado de forma estável no genoma da linhagem de células de complementação/de empacotamento. Células do tipo referido estão descritas no estado da técnica (p. ex. WO 96/22378). Uma desvantagem daquele sistema é o facto de ser preciso gerar novas linhagens de células estáveis, e realizar numerosas etapas de selecção antes de serrem geradas células estáveis e adequadas. Este processo é laborioso e demorado. De uma forma geral, pode-se afirmar que a geração e propagação de adenovírus a partir de serotipos diferentes do serotipo 5 (subgrupo C), como vírus do subgrupo B, provou ser difícil em células de complementação de Ad5. Como foi divulgado pelos requerentes em WO 00/70071, vírus recombinantes baseados em vírus Ad35 do subgrupo B podem ser preparados por meio de co-transfecção de uma construção de expressão contendo as sequências da região precoce 1 de Ad35 (Ad35-El). Além disso, mostrou-se que vírus à base de Ad35 com deleção apenas relativamente a sequências de EIA e não de E1B replicam eficientemente em células PER.C6, sugerindo que as proteínas EIA de Ad5 são capazes de complementar as funções de Ad35-E1A (pedido internacional da requerente PCT/NL01/00824). Além disso, as experiências mostram que a falta de Ad35-E1B resulta em baixos rendimentos em células de complementação de Ad5. WO 00/70071 também divulga linhagens de células para a produção de vectores adenovirais com deleção de EI que não são do grupo C, mediante modificação adicional de linhagens de células que são capazes de complementar adenovírus de serotipo 5. WO 00/70071 também sugere que se deveriam estabelecer novas linhagens de células portadoras de sequências de Ad35-El para a complementação de vectores de adenovírus de serotipo 35 recombinantes que não possuem a região EI (ver também o pedido internacional da requerente PCT/NL01/00824) . No entanto, como também discutido acima, desejando-se aplicar um serotipo específico para uma necessidade específica, seria necessário estabelecer uma nova linhagem de células para cada serotipo específico, ou seria necessário modificar as linhagens de células disponíveis que podem complementar adenovírus de serotipo 5 para 5 ΕΡ 1 497 438/ΡΤ complementação do serotipo de interesse. Seria claramente vantajoso utilizar as linhagens de células estabelecidas disponíveis no estado da técnica, e não modificá-las, e utilizá-las para a produção de todos os outros serotipos que não Ad5, aplicando os métodos estabelecidos e eficientes conhecidos no estado da técnica. Conclui-se que, até à presente invenção, não se encontrava disponível na técnica qualquer 'plataforma de produção' flexível e apropriada que permitisse a produção com rendimentos úteis de serotipos de adenovírus diferentes dos serotipos do subgrupo C.
BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS A Figura 1 é uma representação esquemática do plasmídeo ρΔΜΤ.Orf6.Hygro (n.2 de depósito ECACC P02041226) . Para maior clareza, a letra D maiúscula representa delta (Δ). A Figura 2 é uma representação esquemática do plasmídeo pAd35.ΔΜΤ.Orf6. Para maior clareza, a letra D maiúscula representa delta (Δ). A Figura 3 é uma representação esquemática do pUC.35-5E4. A Figura 4 é uma representação das etapas de clonagem que levam ao pUC.35-5E4. A Figura 5 é uma representação esquemática do pBr.Ad35.PRn. A Figura 6 é uma representação esquemática do pBr.Ad35.PR5E4 (n.2 de depósito ECACC P02041229). A Figura 7 é uma representação esquemática do pWE.Ad35.pIX-rITR.5E4. A Figura 8 é uma representação esquemática do pCRscriptAmp.NFI-NcoIR. A Figura 9 é uma representação esquemática de pCRscriptAmp.NcoIF-NR2. A Figura 10 é uma representação esquemática do pCR.NFl- NR2 . 6 ΕΡ 1 497 438/ΡΤ A Figura 11 mostra ο alinhamento entre a sequência de aminoácidos de E4-orf6 do Adenovirus de serotipo 5 (SEQ ID NO:21; sequência superior) com a sequência de aminoácidos da proteína E4-orf6 do Adenovirus de serotipo 5 clonada na estrutura principal de Ad35 (SEQ ID N0:21; sequência do meio; NB. idêntica a E4-orf6 de Ad5, sequência superior) conforme obtido por meio de determinação da ordem dos nucleótidos, e a sequência de aminoácidos da proteína E4-orf6 do adenovirus do serotipo 35 (SEQ ID NO:22; sequência inferior), mostrando que todo o fragmento que codifica a proteína E4-orf6 na estrutura principal do adenovirus do serotipo 35 foi substituído pelo fragmento que codifica a proteína E4-orf6 do adenovirus de serotipo 5. A Figura 12 mostra o alinhamento entre a sequência de aminoácidos da proteína E4-orf6/7 do Adenovirus de serotipo 5 (SEQ ID NO:23; sequência superior) com a sequência de aminoácidos da proteína de fusão E4-orf6/7 codificada parcialmente pelo fragmento de E4-orf6/7 de Adenovirus de serotipo 5 substituindo a parte correspondente do fragmento E4-orf6/7 do adenovirus de serotipo 35 na estrutura principal do adenovirus do serotipo 35 (SEQ ID NO:24; sequência do meio) e a sequência de aminoácidos da proteína E4-orf6/7 de adenovirus do serotipo 35 (SEQ ID NO:25; sequência inferior), mostrando que a sequência orf6/7 é parcialmente quimérica, com a fusão aproximadamente no resíduo de lisina (K) na posição 138. Para maior clareza, a notação orf6+7 deverá ser lida como o quadro de leitura aberto orf6/7, que é um quadro de leitura aberto separado dentro da região E4 dos adenovirus para além de orf6 e orf7, sendo uma notação bem conhecida dos peritos na especialidade. A Figura 13 é uma representação esquemática do pBr.Ad35.PR.50rf6 (n.2 de depósito ECACC P02041227). A Figura 14 é uma representação esquemática do pWE.Ad35.pIX-rITR.50rf6. A Figura 15 é uma representação esquemática do pBr.Ad35.PRnÁE3. Para maior clareza, a letra D maiúscula representa delta (Δ). 7 ΕΡ 1 497 438/ΡΤ A Figura 16 é uma representação esquemática do pBr.Ad35.ΔΕ3.PR5E4. Para maior clareza, a letra D maiúscula representa delta (Δ). A Figura 17 é uma representação esquemática do pBr.Ad35.ΔΕ3.PR50rf6. Para maior clareza, a letra D maiúscula representa delta (Δ). A Figura 18 mostra o sistema para produzir partículas adenovirais recombinantes em células, como PER.C6 através de um evento de recombinação homóloga duplo. A Figura 19 é uma representação esquemática do pWE.Ad35.pIX-EcoRV.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO A presente invenção proporciona vectores de adenovirus recombinantes compreendendo elementos estruturais e não estruturais de um adenovirus de um primeiro serotipo, em que o referido vector compreende adicionalmente uma sequência que codifica uma proteína E4-orf6, em que a referida sequência é seleccionada do grupo que consiste em uma sequência codificando E4-orf6 derivada de um adenovirus de um segundo serotipo diferente do referido primeiro serotipo; e uma sequência codificando E4-orf6 compreendendo uma fusão entre uma parte de uma sequência que codifica E4-orf6 derivada de um segundo serotipo diferente do referido primeiro serotipo e uma parte de uma sequência que codifica E4-orf6 derivada de um terceiro serotipo, em que o referido terceiro serotipo pode ser idêntico ou diferente do referido primeiro serotipo. A invenção proporciona adicionalmente métodos para a produção destes vectores de adenovirus recombinantes compreendendo elementos estruturais e não estruturais de um adenovirus de um primeiro serotipo, sendo que o referido método compreende as etapas de: a) proporcionar uma célula de complementação portadora de uma sequência codificante de E1B-55K, derivada de um adenovirus de um segundo serotipo em forma expressável, com os elementos necessários de um adenovirus, de forma a permitir a montagem do referido vector de adenovirus recombinante pela referida célula de complementação, em que os referidos elementos compreendem pelo 8 ΕΡ 1 497 438/ΡΤ menos alguns elementos estruturais e não estruturais de um adenovirus do referido primeiro serotipo diferente do referido segundo serotipo e uma sequência codificando uma proteína E4-orf6 funcional, que é compatível com a referida proteína E1B-55K expressável na referida célula de complementação; b) cultivar a referida célula complementar num meio sob condições que permitem que ocorra a produção e montagem do vector de adenovirus; e c) recolher o vector de adenovirus recombinante assim produzido a partir do meio e/ou da célula de complementação, em que a sequência que codifica a proteína E4-orf6 compatível está presente no vector de adenovirus recombinante assim produzido. A invenção refere-se adicionalmente a composições farmacêuticas compreendendo vectores adenovirais de acordo com a invenção e ao tratamento de indivíduos que utilizam os vectores adenovirais proporcionados pela presente invenção. A invenção também se refere a um kit de partes compreendendo linhagens de células e vectores adenovirais proporcionados pela invenção para executar os métodos proporcionados pela invenção.
DESCRIÇÃO DETALHADA A presente invenção divulga métodos e meios que resolvem determinadas dificuldades relacionadas com a complementação diminuída de vectores adenovirais que não são do grupo C em células de complementação/de empacotamento de Ad5. Embora nas linhagens de células de complementação de Ad5 esteja presente a expressão de E1B-55K de Ad5 funcional, verificou-se que só era possível produzir títulos muito baixos de vectores adenovirais quando a estrutura principal adenoviral era de origem adenoviral que não do grupo C; esta verificação implica uma especificidade realtivamente ao serotipo na interacção de E1B-55K com outra proteína (virai). Divulga-se aqui que esta dependência do serotipo pode ser contornada proporcionando a proteína E4-orf6 compatível com a proteína ElB-55k proporcionada pela linhagem de células de células de complementação. Como discutido aqui, E1B-55K e E4-orf6 formam um complexo que está envolvido na inibição do transporte de ARNm celulares do núcleo para o citoplasma, embora o complexo também esteja envolvido na estimulação do transporte de ARNm virais do núcleo para o citoplasma. Os presentes inventores 9 ΕΡ 1 497 438/ΡΤ observaram que a complementação correcta de vectores virais em células de empacotamento requer a presença de produtos génicos de E1B-55K e E4-orf6 que são compatíveis. Células de empacotamento também são referidas como células de complementação, se as células compreenderem determinadas sequências que codificam proteínas que complementam funções não proporcionadas pelo vector que deveria ser empacotado. 'Compatível' como usado aqui significa portanto que um complexo entre o produto génico de E1B-55K disponível é capaz de formar um complexo funcional com o produto génico de E4-orf6 disponível num sentido que este complexo de proteínas suporta replicação, propagação e/ou empacotamento virais num nível que é comparável com a situação de tipo selvagem ou que é comparável com a situação encontrada quando um vector de adenovírus de serotipo 5 recombinante é produzido numa linhagem de células de complementação de Ad5, como 293 ou PER.C6. A replicação do vector em células de empacotamento é eficiente se, durante o período de produção em que o vírus é formado, a célula compreende pelo menos proteína E1B-55K e proteína E4-orf6 que são compatíveis. De preferência, as sequências de E1B-55K e E4-orf6 são de adenovírus dentro do mesmo subgrupo de adenovírus (como A, B, C, D, E ou F) . De forma mais preferível, as sequências de E1B-55K e E4-orf6 são do mesmo serotipo. Como se encontram disponíveis no estado da técnica linhagens de células estabelecidas que são capazes de suportar o crescimento de adenovírus do subgrupo C, como o serotipo 5, é ainda mais preferível que os genes de E1B-55K e E4-orf6 sejam derivados de adenovírus de serotipo 5. Como entenderá um perito, é possível determinar a compatibilidade em ensaios ou testes de complementação que fazem parte dos conhecimentos dos peritos na especialidade da produção de vectoreS adenovirais 0 perito na especialidade também entenderá que a presente invenção também pode ser usada para a produção de qualquer serotipo de adenovírus em quaisquer linhagens de células de complementação desde que as proteínas E1B-55K e E4-orf6 sejam compatíveis.
Observou-se adicionalmente que o produto génico de E4-orf6, 'equiparado' com a E1B na linhagem de de células complementação, pode ser proporcionado pelo vector adenoviral, mediante substituição do E4-orf6 no vector adenoviral de escolha por uma sequência codificante de E4-orf6 que é compatível com o gene de E1B presente dentro da linhagem de 10 ΕΡ 1 497 438/ΡΤ células de empacotamento. Verificou-se surpreendentemente que esta modificação não exerce um efeito grave sobre a estabilidade, replicação, empacotamento, montagem e produção do vector.
Constitui um aspecto especifico da invenção que seja possível agora produzir eficientemente serotipos de adenovírus diferentes daqueles do subgrupo C em linhagens de células normalmente aplicadas para a produção de adenovírus de serotipo 5 ou de outro serotipo do subgrupo C, como os serotipos 1, 2 e 6. A presente invenção proporciona métodos para a produção de adenovírus que não do grupo C sem a necessidade de proporcionar separadamente a célula de complementação (de empacotamento) com E4-orf6 porque a sequência de E4-Orf6, que é compatível com a sequência de complementação de E1B-55K, é incorporada na estrutura principal adenoviral.
A presente invenção proporciona um vector de adenovírus recombinante compreendendo elementos estruturais e não estruturais de um adenovírus de um primeiro serotipo, em que o referido vector compreende adicionalmente uma sequência que codifica uma proteína E4-orf6 funcional, em que a referida sequência é seleccionada do grupo que consiste em uma sequência que codifica E4-orf6 derivada de um adenovírus de um segundo serotipo diferente do referido primeiro serotipo; e uma sequência codificante de E4-orf6 compreendendo uma fusão entre uma parte de uma sequência codificante de E4-orf6 derivada de um segundo serotipo diferente do referido primeiro serotipo e uma parte de uma sequência codificante de E4-orf6 derivada de um terceiro serotipo, em que o referido terceiro serotipo pode ser idêntico ou diferente do referido primeiro serotipo. Numa concretização, a presente invenção proporciona um vector de adenovírus recombinante de acordo com a invenção, em que o referido primeiro serotipo e o referido segundo serotipo são de subgrupos de adenovírus diferentes. Numa concretização preferida, proporciona-se um vector de adenovírus recombinante de acordo com a invenção, em que o referido primeiro serotipo é de um subgrupo diferente do subgrupo C e em que a referida sequência codificante de E4-orf6 é derivada de um serotipo de adenovírus do subgrupo C. É mais preferido um adenovírus recombinante de acordo com a invenção, em que o referido primeiro serotipo é do subgrupo B 11 ΕΡ 1 497 438/ΡΤ e ο referido segundo serotipo é do subgrupo C. De forma ainda mais preferível, a referida sequência codificante de E4-orf6 é derivada de adenovírus de serotipo 5.
Os peritos na especialidade reconheceram que circulam nos seres humanos diferentes níveis de anticorpos neutralizadores que são dirigidos contra serotipos diferentes. Verificou-se que determinados serotipos adenovirais encontraram títulos elevados destes anticorpos neutralizadores e que muitos indivíduos em diferentes populações são portadores de anticorpos neutralizadores contra estes serotipos. Verificou-se também que determinados serotipos só eram neutralizados numa minoria das amostras (WO 00/70071). Aparentemente, determinados serotipos do subgrupo B só foram neutralizados num pequeno grupo de amostras. Portanto, numa concretização preferida da presente invenção, proporcionam-se vectores de adenovírus recombinantes de acordo com a invenção, em que o referido primeiro serotipo é seleccionado do grupo que consiste nos serotipos 11, 14, 16, 21, 34, 35 e 50 de adenovírus. Preferem-se muito vectores adenovirais recombinantes, em que o referido primeiro serotipo é o serotipo 11 ou 35, embora estes só encontrassem anticorpos neutralizadores numa percentagem muito reduzida das amostras testadas.
Os vectores da presente invenção podem ser usados em diferentes contextos, como terapia génica, genómica funcional, vacinação contra tumores e/ou vacinação antiviral. Para tanto, é necessário que o vector adenoviral funcione como um veículo de fornecimento entrega de genes, em que um gene não nativo é incorporado no genoma adenoviral. Subsequentemente, a partícula adenoviral pode ser direccionada especificamente para atingir células de interesse; o adenovírus liga-se àquela célula específica, ou por meio da ligação cápside-receptor ou por outros meios, e entrega do transgene. O direccionamento de adenovírus pode ser realizado de muitas maneiras diferentes. Os peritos na especialidade do direccionamento de vectores adenovirais estarão conscientes de todas as diferentes possibilidades que são aplicadas para entregar os vectores adenovirais às células de interesse. Estas possibilidades incluem, embora sem limitação, alterações de cápsides (modificações de fibra, hexão e/ou pentão, como deleções, trocas entre fibras de diferentes serotipos, e adições de 12 ΕΡ 1 497 438/ΡΤ péptidos e/ou outras porções de ligação), em que se produzem fibras quiméricas que reconhecem um receptor presente na célula de interesse, ou em que se utiliza a ligação pentão-base. Outras possibilidades são a ligação de porções de direccionamento às proteínas das cápsides, em que, por exemplo, péptidos de ligação e proteínas de ligação forte conhecidos, ou anticorpos ou partes dos mesmos são ligados às proteínas da cápside para se obter um direccionamento específico. Todos estes vectores podem ser produzidos utilizando os métodos e meios proporcionados pela presente invenção. Portanto, a presente invenção também divulga vectores de adenovírus recombinantes de acordo com a invenção, compreendendo adicionalmente uma sequência que codifica uma proteína, polipéptido ou péptido não adenovirais. Estas sequências podem estar presentes em diferentes locais dentro da estrutura principal adenoviral, porém, de preferência, encontram-se localizadas na região El, que está ausente nos vectores adenovirais recombinantes da invenção. A região El é complementada por elementos (de complementação) presentes nas células de complementação. 0 sentido do promotor, transgene e outras sequências reguladoras pode ser dirigido para a repetição terminal invertida da esquerda e também para a da direita. A presente invenção também pode ser usada para a produção de vectores virais baseados em adenovírus e/ou em outros vírus, como o vírus adeno-associado (AAV: Adeno-Associated Virus) , em que a combinação, tal como um vírus quimérico Ad-AAV, pode integrar-se no genoma da célula hospedeira. Conhecem-se no estado da técnica diversos métodos para gerar adenovírus de integração. Genericamente, a invenção também é útil para a produção de formas de adenovírus que se podem integrar (especificamente ou não especificamente).
Conforme indicado, é possível clonar vários transgenes não adenovirais nos vectores adenovirais recombinantes da presente invenção. Estes não apenas incluem sequências de ácido nucleico reguladoras, como potenciadores, promotores (p. ex. promotores não adenovirais fortes, como o promotor de citomegalovírus, o promotor de SV40 e o promotor de RSV) e sinais de poliadenilação, mas também genes heterólogos para fins terapêuticos. Portanto, num aspecto da invenção, proporcionam-se vectores de adenovírus recombinantes de acordo 13 ΕΡ 1 497 438/ΡΤ com a invenção, em que a referida proteína, polipéptido ou péptido não adenovirais são seleccionados do grupo que consiste em: um polipéptido indutor de morte celular, um determinante antigénico de um organismo patogénico, um antigénio específico para tumores, uma proteína virai, uma hormona e uma citocina. Exemplos de organismos patogénicos são, embora sem limitação, bactérias, vírus e fungos. Exemplos não limitantes de factores, proteínas, polipéptidos e péptidos não adenovirais são factores de transcrição, proteínas de sinalização intracelular, fosfatases, quinases, factores inibidores de apoptose, antagonistas de receptores, formas solúveis de receptores ligados a membranas, inibidores de ARN, ARN anti-sentido, factores de engodo, ribozimas, e, mais especificamente, timidina-quinase, eritropoietina, proteína estimuladora de eritropoiese inédita (NESP: novel erythropoiesis stimulating protein), IL3, ceNOS, interferão gama e gplOO. É possível clonar proteínas virais não adenovirais nos vectores adenovirais recombinantes proporcionados pelos métodos e meios da presente invenção para fins de vacinação. Estas proteínas virais incluem, embora sem limitação, gag, pol, env, nef, etc. para vacinas de HIV, proteínas E6 e E7 para vacinas de papilomavírus humano, proteínas de circunsporozoíto de protozoários Plasmodium para vacinas da malária, componentes de rotavírus para vacinas de rotavírus, proteínas de ébola para vacinas de ébola, os produtos génicos F e G do vírus sincicial respiratório (RSV: Respiratory Syncytial Vírus) para vacinas de RSV, HA e NA para vacinas de influenza, etc.
Os adenovírus recombinantes da presente invenção compreendem elementos estruturais e não estruturais. São exemplos estruturais os genes que codificam as proteínas das cápsides, como proteínas de fibra, hexão e pentão, e também os próprios produtos génicos. São exemplos de elementos não estruturais os genes precoces que são expressos aquando da infecção numa célula e que são infra-regulados quando o ciclo da infecção prossegue. Outros exemplos de elementos não estruturais são os genes que codificam as proteínas activas durante a replicação, como pol e pTP. Deve-se entender que os vectores adenovirais recombinantes podem compreender elementos estruturais e não estruturais derivados de diferentes serotipos. São exemplos destes vectores, por exemplo, as partículas adenovirais portadoras de fibras quiméricas (ver 14 ΕΡ 1 497 438/ΡΤ pedido de patente da requerente WO 00/03029) . As técnicas de biologia molecular tornaram possível construir combinações infindáveis de sequências de ácido nucleico. Estará claro para o perito na especialidade da biologia molecular que a combinação de diferentes sequências pode ser realizada utilizando técnicas moleculares diferentes, como reacção em cadeia pela polimerase (PCR: polymerase chain reaction) e também subclonagem directa. Muitas das sequências usadas na presente invenção e também as sequências e construções quiméricas conhecidas na especialidade são derivadas de diferentes serotipos de adenovírus. 'Derivado' como usado aqui significa portanto que é possível obter estas combinações de sequências por meio de clonagem directa de sequências de tipo selvagem obtidas de vírus de tipo selvagem, embora também possam ser obtidas por meio de PCR com o uso de diferentes pedaços de ADN como molde. Isto também significa que estas sequências podem encontrar-se na forma de tipo selvagem mas também numa forma alterada. Outra opção para se atingir o mesmo resultado é por meio de combinação de ADN sintético. Deve-se entender que 'derivado' não significa exclusivamente uma clonagem directa do ADN de tipo selvagem. Um perito na especialidade também estará consciente das possibilidades da biologia molecular para obter formas mutantes de uma determinada peça de ácido nucleico. Estas mutações podem proporcionar uma funcionalidade diferente, mas também podem ser silenciosas de uma forma que determinadas mutações não alteram a funcionalidade da peça particular de ADN e sua proteína codificada. Portanto, os termos 'parte, derivado e/ou análogo funcional do mesmo' devem ser entendidos como equivalentes do ácido nucleico com o qual estão relacionados. Um perito na especialidade considerará o facto de que determinadas deleções, trocas, mutações (pontuais) , adições, etc. podem ainda resultar num ácido nucleico que apresenta uma função semelhante à do ácido nucleico original. Deve-se entender, portanto, que as alterações que não alteram significativamente a funcionalidades das proteínas, como o produto génico de E4-orf6 e E1B-55K, encontram-se dentro do âmbito da presente invenção.
Algumas alterações no ácido nucleico, como uma deleção, uma mutação, adição e/ou substituição num ou mais codões também podem alterar significativamente a estrutura e/ou funcionalidade do produto génico codificado. O codão pode ser 15 ΕΡ 1 497 438/ΡΤ alterado completamente para alterar o aminoácido codificado, porém também pode ser mutado parcialmente de forma a alterar o aminoácido codificado. Deleções de ácidos nucleicos podem resultar na perda de um ou mais aminoácidos codificados; embora também possam resultar em desvios de quadro. A presente invenção refere-se também a sequências de E4-orf6 presentes no ácido nucleico adenoviral que compreendem diferentes partes derivadas de diferentes serotipos, em que podem ser usados os domínios que tornam a proteína funcional, no que se refere à compatibilidade, de um serotipo, enquanto que o restante da sequência de E4-orf6 ou uma parte da mesma é derivada de outro serotipo (não)relacionado (por exemplo do mesmo subgrupo, de diferentes subgrupos ou de diferentes espécies, ou combinações dos mesmos). Portanto, encontra-se também dentro do âmbito da presente invenção aplicar proteínas de fusão de E4-orf6 que são compatíveis. Esta proteína de fusão pode ser o produto de vários pedaços de ácido nucleico.
Um perito na especialidade estará consciente do facto de que, além de todos os adenovírus humanos, numerosos adenovírus não humanos foram identificados na especialidade. Obviamente, também é possível aplicar adenovírus não humanos para se atingir os mesmos resultados como revelado pela presente invenção. Estará claro para o perito que a compatibilidade entre E1B-55K e E4-orf6 pode não se limitar a adenovírus humanos, mas que também elementos de adenovírus específicos para espécies diferentes podem ser compatíveis. Assim, constitui outro aspecto da invenção que adenovírus não humanos podem ser produzidos em títulos elevados sobre linhagens de células de empacotamento conhecidas disponíveis na especialidade desde que os produtos génicos de E1B-55K e E4-orf6 sejam compatíveis. Exemplos não limitantes de adenovírus não humanos que podem ser produzidos utilizando os métodos e meios da presente invenção são adenovírus caninos, bovinos, ovinos, de sapo, porcinos, equinos, símios e avícolas. Serotipos como usados aqui estendem-se portanto para além de serotipos restritos a espécies. Se, por exemplo, um produto génico de E4-orf6 de adenovírus de macaco é compatível com o E1B-55K proporcionado pela célula de empacotamento, então esta combinação encontra-se dentro do âmbito da presente invenção. Também, quando fusões são aplicadas entre serotipos diferentes, ou entre sequências de E4-orf6 derivadas de, por exemplo, um adenovírus humano e um adenovírus avícola que é 16 ΕΡ 1 497 438/ΡΤ compatível com ο gene de E1B da célula de empacotamento, então essa combinação particular encontra-se também dentro do âmbito da presente invenção. A presente invenção proporciona um método para produzir um vector de adenovírus recombinante compreendendo elementos estruturais e não estruturais de um adenovírus de um primeiro serotipo, sendo que o referido método compreende as etapas de: a) proporcionar uma célula de complementação portadora de uma sequência codificante de E1B-55K, derivada de um adenovírus de um segundo serotipo em forma expressável, com os elementos necessários de um adenovírus, de forma a permitir a montagem do referido vector de adenovírus recombinante pela referida célula de complementação, em que os referidos elementos compreendem pelo menos alguns elementos estruturais e não estruturais de um adenovírus do referido primeiro serotipo diferente do referido segundo serotipo e uma sequência codificando uma proteína E4-orf6 funcional, que é compatível com a referida proteína E1B-55K expressável na referida célula de complementação; b) cultivar a referida célula de complementação num meio e em condições que permitem que ocorra a produção e montagem do vector de adenovírus; e c) colher o vector de adenovírus recombinante assim produzido a partir do meio e/ou da célula de complementação, em que a sequência que codifica a proteína E4-orf6 compatível está presente no vector de adenovírus recombinante assim produzido.
Num aspecto da invenção proporciona-se um método de acordo com a invenção, em que a referida sequência codificando E4-orf6 é seleccionada do grupo que consiste de: i) uma sequência codificando E4-orf6 derivada de um adenovírus do referido segundo serotipo; uma sequência codificando E4-orf6 derivada de um adenovírus de um terceiro serotipo diferente dos referidos primeiro e segundo serotipos; e uma sequência codificando E4-orf6 compreendendo uma fusão entre uma parte de uma sequência codificando E4-orf6 derivada de um terceiro serotipo e uma parte de uma sequência codificando E4-orf6 derivada de um adenovírus do referido segundo serotipo, em que o referido terceiro serotipo pode ser idêntico, ou diferente do referido primeiro serotipo. Numa concretização preferida, o referido primeiro e o referido segundo serotipos são de subgrupos diferentes. Numa concretização mais preferida, o referido segundo serotipo é um serotipo de adenovírus do 17 ΕΡ 1 497 438/ΡΤ subgrupo C. Numa concretização ainda mais preferida, o referido segundo serotipo é o serotipo 5 de adenovirus. Noutro aspecto particular da invenção, o referido primeiro serotipo é um serotipo de adenovirus do subgrupo B. De preferência, o referido primeiro serotipo é seleccionado do grupo que consiste nos serotipos 11, 14, 16, 21, 34, 35 e 50 de adenovirus. Há várias células de empacotamento conhecidas na especialidade que são usadas para complementar vectores adenovirais recombinantes e para produzir, montar e empacotar as partículas adenovirais. Exemplos não limitantes destas linhagens de células são as células HEK-293, 911 e PER.C6™. É preferível utilizar linhagens de células que já provaram entregar títulos elevados de reservas adenovirais. Estas linhagens de células expressam proteínas EI de uma maneira estável, sendo, portanto, um aspecto preferido da invenção a utilização de linhagens de células e métodos em que a referida sequência codificando E1B-55K está integrada no genoma da referida célula de complementação. São mais preferidas células de complementação que são derivadas de uma célula primária diplóide humana, ou de uma célula sua progenitora. De forma ainda mais preferida, a referida célula de complementação é derivada de uma célula retinoblasto primária humana, uma célula de rim embrionário primária humana, uma célula neuronal primária humana ou um amniócito primário humano. Prefere-se muito o uso de uma célula de complementação nos métodos proporcionados pela presente invenção, em que a referida célula de complementação é uma célula PER.C6 ou um derivado da mesma. Células PER.C6 são bem conhecidas na especialidade por não darem origem a adenovirus competentes para replicação quando se utiliza ADN adenoviral que não se sobrepõe ao ácido nucleico proporcionado pelas células. Muitos dos vectores adenovirais usados na especialidade não apresentam a região El, portanto num aspecto da invenção a referida célula de complementação compreende, integrado no seu genoma, um ácido nucleico codificando pelo menos uma proteína EIA de adenovirus. De preferência, o referido ácido nucleico codificando pelo menos uma proteína EIA de adenovirus é derivado de um serotipo de adenovirus de um subgrupo diferente do subgrupo B. De forma mais preferível, o referido ácido nucleico codificando pelo menos uma proteína EIA de adenovirus é derivado de um serotipo de adenovirus do subgrupo C. 18 ΕΡ 1 497 438/ΡΤ
Prefere-se muito concretizações em que o referido ácido nucleico codificando pelo menos uma proteína EIA de adenovírus é derivada de um adenovírus de serotipo 5. Noutra concretização da invenção, a invenção proporciona um método em que a referida sequência codificando E4-orf6 e a referida sequência codificando E1B-55K sequência são derivadas de diferentes serotipos de adenovírus, e em que os referidos diferentes serotipos de adenovírus são membros do mesmo subgrupo de adenovírus. De preferência, a referida sequência codificando E4-orf6 e a referida sequência codificando E1B-55K são derivadas de diferentes serotipos de adenovírus e em que os referidos diferentes serotipos de adenovírus são ambos membros do subgrupo C. De forma mais preferível, a referida sequência codificando E4-orf6 e a referida sequência codificando E1B-55K são derivadas do mesmo serotipo de adenovírus. Preferem-se muito métodos em que a referida sequência codificando E4-orf6 e a referida sequência codificando E1B-55K são derivadas de adenovírus de serotipo 5. A presente invenção refere-se também a uma composição farmacêutica compreendendo um vector adenoviral recombinante de acordo com a invenção ou obtenível por um método proporcionado pela invenção. A composição farmacêutica compreende adicionalmente um veículo farmaceuticamente aceitável, geralmente aplicado por peritos na especialidade da preparação de produtos farmacêuticos. Além disso, a presente invenção refere-se a um método para tratar um corpo humano compreendendo administrar a um corpo humano um vector adenoviral recombinante de acordo com a invenção, ou uma composição farmacêutica proporcionada pela invenção. A invenção refere-se também a métodos em que é possível produzir vectores adenovirais utilizando as células de empacotamento/de complementação apropriadas e o vector adenoviral de interesse. Para um processo de produção eficiente é útil aplicar as células correctas com o vector adenoviral apropriado. Portanto, a invenção refere-se também a um kit de partes que compreende: a) uma célula de complementação para produzir um vector de adenovírus recombinante compreendendo elementos estruturais e não estruturais de um adenovírus de um primeiro serotipo, em que a referida célula é portadora de uma sequência codificando E1B-55K, derivada de um adenovírus de um segundo serotipo em forma expressável; e b) num ou mais vectores de ácido nucleico replicáveis, todos os elementos 19 ΕΡ 1 497 438/ΡΤ adenovirais necessários de forma a permitir a montagem do referido vector de adenovirus recombinante pela referida célula de complementação, em que os referidos elementos compreendem pelo menos alguns elementos estruturais e não estruturais de um adenovirus do referido primeiro serotipo diferente do referido segundo serotipo e uma sequência codificando uma proteína E4-orf6 funcional, que é compatível com a referida proteína E1B-55K expressável na referida célula de complementação. De preferência, utiliza-se um kit de partes em que a referida sequência codificando E4-orf6 é seleccionada do grupo que consiste em: uma sequência codificando E4-orf6 derivada de um adenovirus do referido segundo serotipo; uma sequência codificando E4-orf6 derivada de um adenovirus de um terceiro serotipo diferente do primeiro e do segundo serotipos; e uma sequência codificando E4-orf6 compreendendo uma fusão entre uma parte de uma sequência codificando E4-orf6 derivada de um terceiro serotipo e uma parte de uma sequência codificando E4-orf6 derivada de um adenovirus do referido segundo serotipo, em que o referido terceiro serotipo pode ser idêntico ou diferente do referido primeiro serotipo. A invenção é particularmente útil para a replicação de adenovirus quiméricos com deleção de EI que são derivados quase inteiramente de um serotipo diferente do adenovirus 5. Estes vectores só precisam de ser dotados de um ácido nucleico codificando E4-orf6 de adenovirus 5. Uma vez dotado deste, o vector pode ser replicado eficientemente em linhagens de células de empacotamento de complementação de EI de adenovirus 5 normal. A estabilidade dos vectores é aperfeiçoada, e vectores podem ser complementados para deleções tanto de EIA como de E1B. Proporcionando a estes vectores um ácido nucleico codificando adenovirus E4-orf6, é possível obter uma purificação por formação de placas fágicas eficiente e bons rendimentos na ausência de um problema adicional de contaminação pelo tipo selvagem, quando desenvolvidos em células 293 ou 911. Em PER.C6, evidentemente, a contaminação por adenovirus de tipo selvagem também pode ser prevenida de outras maneiras.
Uma vantagem adicional de um vector recombinante da invenção é que não há necessidade de gerar E-orf6 de adenovirus em linhagens de células especiais a partir de um ácido nucleico integrado no genoma. Embora existam estas 20 ΕΡ 1 497 438/ΡΤ linhagens de células, não são facilmente mantidas em boas condições. Isto deve-se pelo menos em parte ao facto de que com mais e mais genes estranhos inseridos no genoma da linhagem de células é difícil manter a estabilidade de todas as sequências estranhas (ou da sua expressão). Verificou-se na presente invenção que pelo menos alguns dos problemas associados a baixos níveis de vectores à base de adenovírus que não de serotipo 5 e estabilidade de vectores de serotipos de adenovírus do subgrupo B, como os serotipos 7, 11 e 35 de adenovírus, em linhagens de células de empacotamento de adenovírus de serotipo 5 podem ser superados com um vector de adenovírus recombinante da invenção.
EXEMPLOS
Exemplo 1. Geração de vírus Ad35 com deleção de El expressando E4-Orf6 de Ad5 numa linhagem de células de complementação de Ad5. A sequenciação do genoma do adenovírus do serotipo 35 e também a construção de um sistema vector à base de plasmídeos e a geração de vírus à base de Ad35 recombinante foram descritos detalhadamente em WO 00/70071. A clonagem da sequência codificante de Ad5-E4-orf6 em pAdApt35IPl (n.2 de depósito ECACC P02041228, para detalhes de clonagem deste plasmídeo ver WO 00/70071) foi realizada como se segue. O plasmídeo foi digerido com Nhel e Avrll e desfosforilado com fosfatase de intestino de bezerro (New England Biolabs). O ADN digerido foi isolado do gel utilizando o kit GeneClean. O plasmídeo ρΔΜΤ.Orf6.Hygro (Figura 1, n.2 de depósito ECACC 02041226) foi digerido com Nhel e subsequentemente parcialmente digerido com Xbal. Após separação das bandas resultantes sobre gel, o fragmento de 1350 pb correspondente ao promotor ΔΜΤ ligado à sequência de E4-orf6 foi purificado do gel. Em seguida, ambos os fragmentos isolados foram ligados e transformados em células DH10B electrocompetentes (Invitrogen/LifeTechnologies) após o que uma colónia com uma inserção na orientação correcta relativamente ao sinal poli(A) de SV40 foi seleccionada para preparação de ADN em grande escala. Isto resultou na construção pAd35.ΔΜΤ.Orf6 (Figura 2), que contém a sequência codificante de E4-orf6 de Ad5 ligada funcionalmente a um 21 ΕΡ 1 497 438/ΡΤ promotor de metalotioneína mutado (ΔΜΤ). O promotor ΔΜΤ foi descrito por Hagmeyer et al. (1996). A sequência de E4-orf6 de AD5 corresponde do nucleótido 33193 até ao nucleótido 34077 na sequência do Ad5 (número de acesso Genbank M73260). Para testar se a expressão de proteínas E4-orf6 de Ad5 poderia tornar possível a produção de vectores de Ad35 com EI totalmente eliminada em células de complementação de Ad5, o pAd35.ΔΜΤ.Orf6 foi co-transfectado com a construção da estrutura principal de Ad35 pWE.Ad35.pIX-rITR em células PER.C6. Aqui, o pAd35.ΔΜΤ.Orf6 foi digerido com PI-Psp-1, e o pWE.Ad35.pIX-rITR foi digerido com Notl para libertar as inserções adenovirais da estrutura principal. Transfectaram-se 2 μρ de pAd35.ΔΜΤ.Orf6 digerido e 6 μg de pWE.Ad35.pIX~rITR digerido utilizando LipofectAmine. A mistura de transfecção foi adicionada a células PER.C6 que foram semeadas no dia anterior a uma densidade de 3,5 x 106 células por balão T25. No dia seguinte o meio foi trocado por meio de cultura de PER.C6 (DMEM com FBS a 10% e MgCl2 10 mM) e as células foram adicionalmente incubadas a 372C/10% de C02. Realizaram-se transfecções de controlo com pAdApt35.Luc co-transfectado com pWE.Ad35.pIX-rITR, e pWE.Ad35.pIX-rITR apenas. Dois dias depois da transfecção, as células foram passadas de balões T25 para T80 e incubadas como descrito. Novamente, três dias mais tarde, a cultura transfectada com pAd35.ΔΜΤ.Orf6 juntamente com a estrutura principal de Ad35 apresentou efeito citopatogénico (CPE: cytopathogenic effect) indicativo de replicação de vírus, e foi colhida (incluindo células e meio) após uma incubação adicional de 2 dias. A suspensão de células foi submetida a 2 etapas de ciclos de congelamento/ descongelamento e o material resultante (lisado bruto) foi mantido a -202C até uso ulterior. Os outros balões não apresentaram CPE e foram passados a 1:3 em balões T80, 6 dias após a transferência para T80. Novamente 5 dias mais tarde o balão transfectado com pAdApt35.Luc + pWE.Ad35.pIX-rITR apresentou alguns poucos eventos semelhantes a CPE, porém isto não progrediu mais. Utilizaram-se 0,2 e 0,5 ml do lisado bruto resultante da transfecção com pAd35.ΔΜΤ.Orf6 para reinfectar células PER.C6 a aproximadamente 85% da confluência em balões T80. Isto resultou em CPE plena após um dia de incubação, indicando que vírus infeccioso estava presente nos lisados brutos. Estas culturas também foram colhidas por meio de dois ciclos de congelamento/descongelamento. Realizaram-se 22 ΕΡ 1 497 438/ΡΤ transfecções de controlo adicionais apenas com a construção pAd35.ΔΜΤ.Orf6 em PER.C6 para confirmar que a expressão de orf6 por si só não resultava em toxicidade celular e morte celular similar a CPE. Em conclusão, apenas as transfecções com pAd35.ΔΜΤ.Orf6 em conjunto com pWE.Ad35.pIX-rITR resultaram em CPE e replicação virai.
Realizou-se uma análise por PCR para confirmar a presença de genomas virais à base de Ad35 em que Ad5-E4-orf6 substitui a região Ei anterior. Aqui, o ADN virai foi isolado das amostras de lisado brutas como se segue. Incubaram-se 275 μΐ de material de lisado bruto com 10 μΐ de ADNasel (10 mg/ml) a 37°C durante 30 min. Subsequentemente, adicionaram-se 6,0 μΐ de EDAT 0,5 M (pH 8,0), 7,5 μΐ de SDS a 20% e 1,5 μΐ de
Proteinase K a 20 mg/ml e isto foi misturado com agitação com vórtice. A mistura foi então incubada a 50 C durante 1 h. Finalmente, o ADN virai foi isolado utilizando o kit GeneClean Spin Kit (Bio 101, Inc.) . Em seguida, 2 μΐ do ADN isolado foram amplificados por PCR utilizando iniciadores 35psi-For e 35R4 (Tabela 1). O programa foi ajustado para 94°C durante 2 min., seguido de 30 ciclos de 94 C durante 30 s, 58 C durante 30 s e 72°C durante 5 min, e terminou com uma incubação a 72°C durante 10 min. Os iniciadores são especificos para sequências de Ad35 e geram um fragmento de 2,9 kb abrangendo da sequência de empacotamento até ao nt 4669 (numeração como na sequência de Ad35 de tipo selvagem) incluindo assim a cassete do transgene de Orf 6 de Ad5. A electroforese dos fragmentos de PCR obtidos mostrou que os fragmentos apresentavam o comprimento esperado equiparado com os fragmentos de PCR de controlo gerados no plasmideo adaptador pAd35.ΔΜΤ.Orf6. Assim, é possivel preparar vectores à base de Ad35 com EI plenamente eliminada em células de complementação de Ad5 se o virus também expressar Ad5-E4orf6.
Exemplo 2. Construção de pWE.Ad35.pIX-rITR5E4
Um primeiro fragmento de PCR foi amplificado utilizando iniciadores DF35-1 e 35FR (Tabela 1) . A amplificação foi realizada com pWE.Ad35.pIX-rITR (ver WO 00/70071) como ADN molde utilizando ADN-polimerase Pwo (Roche) com DMSO adicional (Sigma, concentração final de 3 %) . O programa foi como se
segue: 94 °C durante 2 min. seguido de 30 ciclos de (94°C 23
ΕΡ 1 497 438/ΡΤ durante 30 s, 52°C durante 30 s, 72°C durante 3 min) e uma etapa final de 72 °C durante 8 min. para assegurar fragmentos completos. A amplificação resultou num fragmento de 1,6 kb correspondendo do nt 30224 ao 31805 da sequência de Ad35. Introduziu-se um local BamHI na extremidade 3'. O ADN amplificado foi purificado do gel utilizando o kit GeneClean, e ligado ao kit de vector de clonagem pCRScript/Amp (Stratagene). Após transformação em células DH10B electrocompetentes seleccionaram-se colónias brancas para análise adicional. Isto resultou na construção pCR-fiber35. Devido à clonagem com extremidades lisas, o fragmento de PCR pôde ser inserido em 2 orientações. Seleccionou-se um clone que apresentava a inserção com o local BamHI no poli-ligante do vector pCRScript/Amp na extremidade 5'. A digestão com BamHI resulta, portanto, num fragmento de 1,6 kb. A sequenciação confirmou uma amplificação correcta do fragmento de PCR. Amplificou-se um segundo fragmento de PCR utilizando os iniciadores: 5E4F e 5E4R (Tabela 1). A amplificação foi realizada com pWE.Ad5.Af111-rITRsp, que é um vector cosmidico contendo um local PacI extra em pWE.Ad5.Af111-rITR (n.2 de depósito ECACC P97082116 descrito no pedido internacional de patente da requerente PCT/NL01/00824) . 0 pWE.Ad5.Af111-rITRsp serviu como molde utilizando ADN-polimerase Pwo como descrito acima, embora também fosse possivel usar pWE.Ad5.Af111-rITR para a mesma finalidade. Após purificação do gel, o ADN foi digerido com SstI e BamHI (ambos os locais introduzidos durante a PCR) e o fragmento de 3 kb foi purificado do gel de agarose utilizando o kit GeneClean. A região E4 de Ad5 que é amplificada corresponde do pb 32794 ao pb 35828 da sequência de Ad5. Gerou-se um terceiro fragmento de PCR sobre pWE.Ad35.pIX-rITR utilizando os iniciadores: 355ITR e 353ITR (Tabela 1). A amplificação por PCR foi realizada como descrito acima. O fragmento de 160 pb resultante é flanqueado por um local SstI (extremidade 5') e um local EcoRI (extremidade 3'). Após purificação do gel como acima, o ADN foi digerido com SstI e EcoRI. O fragmento de 160 pb correspondente à ITR da direita de Ad35 foi então separado das extremidades digeridas sobre um gel de agarose com baixo ponto de fusão e recolhido no gel. Em seguida, digeriu-se o pUC119 com BamHI e EcoRI e o fragmento de 3,1 kb foi purificado do gel utilizando o kit GeneClean. Os segundo e terceiro fragmentos de PCR tratados acima foram então ligados a pUC119 digerido com BamHI/EcoRI 24 ΕΡ 1 497 438/ΡΤ resultando ο pUC.Ad5E4-35ITR. As inserções clonadas derivadas de PCR foram sequenciadas para se verificar a amplificação correcta. Em seguida, a inserção de 1,6 kb em pCR-fiber35 foi excisada com BamHI e o fragmento foi purificado do gel como acima. 0 pUC.Ad5E4-35ITR também foi digerido com BamHI e o fragmento linear foi purificado do gel. A ligação de ambos os fragmentos e a selecção dos clones que apresentavam a orientação correcta entre si resultou em pUC.35-5E4 (Figura 3). As etapas que levam à construção de pUC.35-5E4 estão representadas esquematicamente na Figura 4. A inserção de adenovirus em pUC.35-5E4 foi subclonada em pBr.Ad35.PRn (Figura 5; ver WO 00/70071), uma construção com sequências a 3' de Ad35. Aqui, a construção pUC.35-5E4 é digerida com MluI e Notl e o fragmento de 4,7 kb é purificado do gel utilizando o kit GeneClean. Este fragmento é então ligado ao fragmento de vector resultante da digestão com MluI e Notl da construção pBr.Ad35.PRn. Este fragmento de 16,3 kb foi purificado do gel utilizando a enzima agarase (Roche). Em seguida, as ligações foram transformadas em células DH10B competentes. A construção resultante foi denominada pBr.Ad35.PR5E4 (Figura 6, n.2 de depósito ECACC P02041229). A última etapa acarreta a clonagem da extremidade 3' modificada da sequência de Ad35 no clone cosmídico virai pWE.Ad35.pIX-rITR. Aqui, dois fragmentos são combinados numa reacção de empacotamento de fago lambda (Stratagene) de acordo com as instruções do fabricante. O primeiro é a inserção de AD35 modificada com 16,8 kb de pBr.Ad35.PR5E4 obtida por meio de digestão com PacI e Swal, e o segundo é um fragmento de 22,8 kb obtido por meio de digestão de pWE.Ad35.pIX-rITR com PacI e Swal. A combinação correcta dos dois fragmentos proporciona pWE.Ad35.pIX-rITR.5E4 (Figura 7). Assim, nesta construção, a região E4 na estrutura principal de Ad35 é substituída pela região correspondente derivada de Ad5.
Exemplo 3. Construção de pWE.Ad35.pIX-rITR50rf6.
Para obter uma construção de estrutura principal adenoviral que contém sequências de Ad35 do gene pIX (nt 3401 na sequência de Ad35) até ao final da ITR da direita, mas com as sequências para E4-orf6 e -orf6/7 substituídas pelas sequências correspondentes e Ad5, amplificaram-se por PCR sequências Ad35 e Ad5 e combinaram-se como descrito abaixo. Os fragmentos de PCR foram gerados com ADN-polimerase Pwo com 25 ΕΡ 1 497 438/ΡΤ adição de DMSO até 3%. A primeira PCR foi realizada com pBr.Ad35.PRn (Figura 5; ver WO 00/70071) como molde e os iniciadores E4-fl e E4-R2 (Tabela 1) . O programa foi iniciado como se segue: 94°C durante 2 min, 5 ciclos de (94°C durante 30 s, 50°C durante 30 s e 72°C durante 1 min) seguido de 30 ciclos de (94°C durante 30 s, 60°C durante 30 s e 72°C durante 1 min) e terminado com uma etapa final a 68°C durante 8 min. O fragmento resultante de 1,8 kb foi purificado utilizando o kit GeneClean. A segunda PCR foi realizada com pWE.Ad5.AfIII-rlTRsp, que é um vector cosmidico contendo um local PacI em pWE.Ad5.Af111-rITR (n.2 de depósito ECACC: P97082116, descrito no pedido internacional de patente da requerente
PCT/NL01/00824), como molde e os iniciadores E4-f3 e E4-R4 (Tabela 1). O programa foi iniciado como se segue: 94°C durante 2 min. seguido de 30 ciclos de (94°C durante 30 s, 62 °C durante 30 s e 72 2C durante 1 min) e terminado com uma etapa final a 68 °C durante 8 min. O fragmento de 1,1 kb foi purificado como acima. A terceira PCR foi realizada com pBr.Ad35.PRn como molde e os iniciadores E4-F5 e E4-R6 (Tabela 1). O programa foi regulado como se segue: 942C durante 2 min, 5 ciclos de (942C durante 30 s, 48°C durante 30 s e 72°C durante 45 s) seguido de 30 ciclos de (94°C durante 30 s, 56°C durante 30 s e 72°C durante 45 s) e terminado com uma etapa final a 682C durante 8 min. O fragmento de 366 pb foi purificado como acima. Amostras dos fragmentos purificados foram carregadas sobre um gel para estimar a concentração e, depois, os fragmentos foram misturados em conjunto de forma a conter 700 ng de PCR-1, 650 ng de PCR-2 e 430 ng de PCR-3 num total de 30 μΐ. Adicionou-se a esta mistura 3 μΐ de tampão EcoPol (New England Biolabs), 3 μΐ de solução de dNTP 2 mM e 3 μΐ de H20 milliQ. A mistura resultante foi incubada a 94°C durante 3 min. e depois arrefecida a 652C numa máquina de PCR a uma taxa de 0,5°C/s Após incubação a 65°C durante 10 min, a mistura foi adicionalmente arrefecida a 20-C a uma taxa de 0,052C por segundo e incubada durante 10 min. a 20°C. Em seguida adicionou-se 1 μΐ (5 unidades) de enzima de Klenow (New
England Biolabs) seguido de uma incubação de 60 min. a 37°C. Utilizaram-se 5 μΐ desta mistura de Klenow como molde para amplificar separadamente dois fragmentos como se segue. Cenário de Iniciador 1: utilizou-se NF-1 e Nconl-R (Tabela 1) numa reacção empregando ADN-polimerase Pwo (Roche) com adição 26 ΕΡ 1 497 438/ΡΤ de DMSO a uma concentração final de 3% e utilizando os seguintes ajustes da máquina de PCR: 94°C durante 2 min.
seguido de 30 ciclos de (942C durante 30 s, 66°C durante 30 s e 722C durante 3 min.) seguido de uma incubação final a 682C durante 8 min. Cenário de Iniciador 2: utilizou-se Ncol-f e NR-2 (Tabela 1) numa reacção empregando ADN-polimerase Pwo (Roche) com adição de DMSO até uma concentração final de 3% e utilizando os seguintes ajustes da máquina de PCR: 942C durante 2 min. seguido de 30 ciclos de (94°C durante 30 s, 62°C durante 30 s e 722C durante 90 s) seguidos de uma incubação final a 68 °C durante 8 min. Os fragmentos resultantes de 2,7 kb (cenário de iniciador 1) e 1,1 kb
(cenário de iniciador 2) foram purificados do gel utilizando o kit GeneClean e cada um foi ligado ao vector pCRscriptAmp (Stratagene) e transformado em células DH10B electrocompetentes. Isto resultou na construção pCRscriptAmp.NFI-NcoIR (Figura 8) e na construção pCRscriptAmp.NcoIF-NR2 (Figura 9). Como as inserções continham extremidades lisas obtiveram-se duas orientações de cada clonagem. Utilizando digestões com Kpnl seleccionaram-se as construções com a orientação necessária para clonagem adicional (ver Figuras 8 e 9) . As inserções foram então sequenciadas para verificar a amplificação correcta. Em seguida, parte da inserção de pCRscriptAmp-NcoIF-NR2 foi excisada utilizando BamHI e Ncol e purificada do gel como acima. O pCRscriptAmp-NFI-NcoIR foi digerido com as mesmas enzimas e o vector contendo fragmento também foi purificado do gel. A ligação destes fragmentos resultou em pCR.NFl-NR2 (Figura 10) . O pCR.NFl-NR2 contém sequências de Ad35 entre nt 30162 e 33234 da sequência de Ad33 com as sequências de E4-orf6 e E4-orf6/7 entre os nt 31879 e 32974 substituídas por sequências derivadas de Ad5 localizadas entre 32968 e 34077 da sequência de Ad5 publicada no Genbank (número de acesso M73260). Assim, como se pode observar nos alinhamentos de aminoácidos apresentados na Figura 11 e 12, a sequência de aminoácidos da proteína E4-orf6 clonada é idêntica à sequência de E4-orf6 encontrada em Ad5 e a sequência de aminoácidos de E4-orf6/7 é, na sua maior parte, idêntica à sequência de E4-orf6/7 presente em Ad5. Obviamente, é possível projectar diferentes construções híbridas de E4 de Ad35-Ad5 utilizando o método geral delineado acima sem afastamento à invenção. Esta inserção quimérica de pCR.NFl-NR2 foi então clonada em 27 ΕΡ 1 497 438/ΡΤ
pWE.Ad35.pIX-rITR: pCR.NFl-NR-2 foi digerido com MluI e Ndel e o fragmento resultante de 2,8 kb foi purificado do gel utilizando o kit GeneClean. A construção pBr.Ad35.PRn também foi digerida com MluI e Ndel e o fragmento de vector de 18 kb foi isolado do gel utilizando a enzima agarase (Roche). A ligação de ambos os fragmentos resultou na construção pBr.Ad35.PR.50rf6 (Figura 13, n.2 de depósito ECACC P02041227). As sequências de Ad35 entre PacI e SwaI contendo a região E4 quimérica nesta construção são então clonadas na construção pWE.Ad3S.pIX-rITR utilizando empacotamento de fago lambda como descrito acima. 0 resultante pWE.Ad35pIX-rITR.50rf6 (Figura 14) é então usado para gerar vírus à base de AD35 recombinantes por co-transfecção em células de empacotamento PER.C6 com um plasmídeo adaptador de Ad35.
Exemplo 4. Construção de pWE. Ad35 .pIX-rITRAl23, pWE.Ad35.pIX-rITRAE3.5E4 e pWE.Ad35.pIX-rITRÀE350rf6. A estrutura principal de Ad35 foi adicionalmente modificada por meio de uma deleção de sequências de E3. Sabe-se que as proteínas E3 modulam a resposta imunológica do hospedeiro à infecção por adenovírus e, portanto, não são necessárias para a propagação in vitro de vírus recombinantes. Além disso, a deleção de sequências de E3 permite a inserção de sequências heterólogas maiores nos vectores sem comprometer a eficiência do empacotamento. Também, para a aplicação de vectores adenovirais como veículos de vacinação, a expressão de genes imunomoduladores codificados pela região E3 não é preferida. Métodos para deleção de sequências de E3 no plasmídeo pBr.Ad35.PRn (Figura 5) são descritas abaixo.
Primeiro gerou-se um produto de PCR com os iniciadores 35E3for e 35E3rev (Tabela 1) utilizando ADN-polimerase Pwo (Roche) de acordo com instruções dos fabricantes e pBr.Ad35.PRn como ADN molde. 0 programa foi iniciado a 942C durante 2 min. e 30 ciclos de 942C durante 30 s, 582C durante 30 s e 722C durante 1 min, seguido de 682C durante 8 min. O fragmento amplificado contém sequências de Ad35 do nt 26814 até ao 27647 (ver WO 00/70071) e é flanqueado na extremidade 3' por um local MluI. O fragmento resultante de 833 pb foi purificado utilizando o kit de purificação Qiaquick PCR purification kit (Qiagen) e digerido com MluI e StuI. O fragmento de PCR digerido foi então purificado de um 28 ΕΡ 1 497 438/ΡΤ gel de agarose LMP utilizando o kit de extracção de gel Qiaquick (Qiagen). A construção pBr.Ad35.PRn também foi digerida com MluI e StuI e o fragmento contendo o vector de 17,3 kb foi isolado do gel de agarose utilizando a enzima agarase (Roche) e utilizando métodos conhecidos dos peritos na especialidade. Ambos os ADN isolados foram ligados e transformados em bactérias competentes para DH5CC com eficiência Max (Invitrogen/LTI) para originar pBr.Ad35.PRnAE3 (Figura 15). As sequências eliminadas abrangem do nt 27 648 ao 30320 da sequência de Ad35 resultando numa deleção de 2673 pb. A deleção de E3 foi então introduzida na construção pWE.Ad35.pIX-rITR utilizando extractos de empacotamento de fago lambda (Stratagene). Aqui, ambos pWE.Ad35.pIX-rITR e pBr.Ad35.PRnAE3 foram digeridos com PacI e SwaI e os respectivos fragmentos de 22,8 kb e 14 kb foram isolados dos géis de agarose com baixo ponto de fusão utilizando a enzima agarase (Roche). Após ligação e empacotamento utilizando células STBL-2 (Invitrogen/LTI), obteve-se a construção pWE.Ad35.pIX-rITRAE3.
Para construir as versões com deleção de E3 das construções com estrutura principal com E4 modificada descritas acima, as modificações de E4 foram introduzidas na construção pBr.Ad35.PRnÁE3 como se segue. A construção pUC.35-5E4 (Figura 3) foi digerida com MluI e Notl e o fragmento de 4,7 kb foi isolado do gel utilizando o kit GeneClean II. A construção pBr.Ad35.PRnÁE3 também foi digerida com MluI e Notl e o fragmento de vector com 13,6 kb foi isolado do gel utilizando o kit de centrifugação GeneClean spin kit. A ligação destes fragmentos resultou na construção pBr.Ad35.ΔΕ3.PR5E4 (Figura 16). A construção pCR.NFl-NR2 (Figura 10) foi digerida com MluI, Ndel e Bgll (este último para digerir o fragmento de vector em fragmentos menores), e o fragmento de 2,8 kb foi isolado do gel utilizando o kit de centrifugação GeneClean. A construção pBr.Ad35.PRnÀE3 foi digerida com MluI e Ndel, desfosforilada utilizando a enzima CIP (New England Biolabs) e o fragmento de vector de 15,2 kb também foi isolado utilizando o kit de centrifugação GeneClean spin kit. A ligação destes fragmentos originou a construção 29 ΕΡ 1 497 438/ΡΤ pBr.Ad35.ΔΕ3.PR50rf6 (Figura 17). 0 pBr.Ad35.AE3.PR5E4 e o pBr.Ad35.ΔΕ3.PR50rf 6 são então utilizados para trocar o fragmento PacI-SwaI a 3' em pWE.Ad35.pIX-rITR pelas regiões correspondentes de pBr.Ad35.ΔΕ3.PR5E4 e pBr.Ad35.ΔΕ3.PR50rf6 como descrito infra. Isto origina as construções pWE.Ad35.pIX-rITRAE3.5E4 e pWE.Ad35.plX-rITRAE3.50rf6. Um método alternativo para gerar estes grandes cosmideos consiste em utilizar três fragmentos na reacção de ligação para empacotamento: um fragmento NotI-PacI de 14,7 kb de pWE.Ad35.pIX-rITR, a inserção Pacl-Notl de pBr.P.d35.ΔΕ3.PR5E4 ou pBr.Ad35.ΔΕ3.PR50rf6 e o fragmento de vector cosmidico pWE15 digerido com Notl (Stratagene). Este último fragmento também pode ser isolado da digestão de pWE.Ad35.pIX-rITR com Notl/Pacl.
Exemplo 5. Geração de vectores à base de Ad35 com deleções de El e E1/E3 em células PER.C6.
Para permitir a geração de vírus de Ad35 recombinantes nas linhagens de células de complementação PER.C6 utilizando as construções à base de pBr.Ad35.PRn, nós preparamos primeiro uma nova construção contendo seguências de Ad35 do pb 3401 ao pb 24650 da seguência de Ad35 (WO 00/70071) e, assim, sobrepõe-se tanto aos plasmídeos adaptadores como às construções à base de pBr.Ad35.PRn. A transfecção destes três plasmídeos em células PER.C6 e um evento de recombinação homóloga dupla origina um genoma virai completo e a replicação de vírus recombinantes conforme delineado na Figura 18. 0 plasmídeo requerido foi preparado por deleção de uma grande parte das sequências de Ad35 em pWE.Ad35.pIX-rlTR. Assim, o pWE.Ad35.pIX-rITR foi digerido com EcoRV e o fragmento contendo vector de 2 9 kb foi purificado de um gel com baixo ponto de fusão utilizando o kit de centrifugação Geneclean spin kit. 0 ADN purificado foi auto-ligado e usado para transformar bactérias DH10B electrocompetentes
(Invitrogen/LTI) resultando o pWE.Ad35.pIX-EcoRV (Figura 19).
Todos os ADN usados para transfecção foram digeridos como indicado na Tabela 2, inactivados com calor a 65°C durante 15 min. e usados sem tratamento adicional na transfecção. Células PER.C6 foram semeadas no dia anterior à transfecção em balões T25 a uma densidade de 3 x 106 células/balão e 30 ΕΡ 1 497 438/ΡΤ transfectadas como indicado na Tabela 2 utilizando LipofectAmine (Invitrogen/LTI) de acordo com instruções do fabricantes, excepto que a mistura de transfecção em meio DMEM isento de soro (Gibco/BRL) foi substituída por meio de cultura de PER.C6 (DMEM, FBS a 10% e MgCl2 10 mM) após 5 h. No dia seguinte, avaliou-se a eficiência da transfecção como sendo de 50% por microscopia de fluorescência. Dois dias mais tarde, as células foram tratadas com tripsina e re-semeadas em balões T80 e adicionalmente incubadas a 372C/10% de C02. Seis dias após a transfecção todas as culturas apresentaram um efeito citopatogénico pleno (CPE, indicativo da propagação do virus) excepto a cultura de PER.C6 transfectada com Ad35.AdApt.eGFP + pWE. Ad35 .pIX-rITR. Após mais um dia, as células e o meio nos balões com CPE foram recolhidos e submetidos a dois ciclos de congelamento/descongelamento, clarificados por separação dos detritos celulares por centrifugação (10 min. a 1500 rpm) e utilizaram-se 100 μΐ destes lisados brutos para re-infectar células PER.C6 frescas a 85% da confluência em balões T80. A transfecção de Ad35.AdApt.eGFP + pWE.Ad35.pIX-rITR que não apresentou sinais de CPE foi recolhida por tripsinização e foi também tratada como acima. Dois dias após a infecção das células PER.C6 frescas todos os balões apresentaram CPE pleno excepto aquele que não apresentava sinais de CPE no momento da colheita inicial. Isto mostra claramente que os virus à base de Ad35 com deleção plena de EI podem ser preparados sobre células PER.C6 quando o produto génico de E4-orf6 de Ad5 é expresso da estrutura principal de Ad35. 31 ΕΡ 1 497 438/ΡΤ
Tabela 1. Sequências dos iniciadores. 35FR 5' 35R4 5' 35psi-For 5' DF35-1 5' 5E4F 5' 5E4R 5' 355ITR 5' 353ITR 5' E4-F1 5' E4-R2 5' E4-F3 5' E4-R4 5' E4-F5 5' E4-R6 5 ' NF-1 5' NR-2 5' Ncol-R 5' Ncol-F 5' 35E3for 5' 35E3rev 5' Tabela 2 . Lií de Ad35 com ( exemplos . As pWE.Ad35 .pIX-
Tabela 2. Lista de construções usadas para geração de vírus à base leleção de El, sobre células PER.C6, como descrito nos construções de adaptador foram digeridas com PacI, o EcoRV foi digerido com Notl e EcoRV, as construções à base de pBr com E4 modificada foram digeridas com PacI e Notl. N. s Construções CPE 1 pAdApt35.eGFP pWE.Ad35.pIX-EcoRV pBr.Ad35.PR5E4 Sim 2 pAdApt35.eGFP pWE.Ad35.pIX-EcoRV pBr.Ad35.PR50rf 6 Sim 3 pAdApt35.eGFP pWE.Ad35.pIX-EcoRV pBr.Ad35.AE3PR5E4 Sim 4 pAdApt35.eGFP pWE.Ad35.pIX-EcoRV pBr.Ad35.ΔΕ3.PR50rf6 Sim 5 pAdApt35.eGFP pWE.Ad35.pIX-rITRxNotI Não 6 pAdApt5.eGFP pWE.Ad5.Af111-rITRxPacI Sim 32 ΕΡ 1 497 438/ΡΤ
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<223> iniciador 35FR 34 34 ΕΡ 1 497 438/ΡΤ <4 Ο Ο > 1 cgggatccac tttattttag ttgtcgtctt c 31 <210> 2 <211> 37 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> iniciador 35R4 <400> 2 cggaattctt aattaaggga aatgcaaatc tgtgagg 37
<210> 3 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> iniciador 35psi-For <400> 3 gtggtattta tggcagggtg 20
<210> 4 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> iniciador DF35-1 <400> 4 cactcaccac ctccaattcc 20 <210> 5 <211> 30 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> iniciador 5E4F <400> 5 cgggatccgt ttgtgttatg tttcaacgtg <210> 6 <211> 32 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> iniciador 5E4R 35 ΕΡ 1 497 438/ΡΤ <4 Ο Ο > 6 gctggcgagc tcggcggagt aacttgtatg tg 32 <210> <211> <212> <213> 7 31 ADN Sequência Artificial <220> <223> iniciador 355ITR <400> 7 gatccggagc tcacaacgtc attttcccac <210> <211> <212> <213> 8 25 ADN Sequência Artificial <220> <223> iniciador 353ITR <400> 8 aggaattcgc ggccgcattt aaatc 25 <210> <211> <212> <213> 9 18 ADN Sequência Artificial <220> <223> iniciador E4-F1 <400> 9 agaggaacac attccccc 18 <210> <211> <212> <213> 10 32 ADN Sequência Artificial <220> <223> iniciador E4-R2 <400> 10 ggggagaaag gactgtgtat tctgtcaaat <210> <211> <212> <213> 11 35 ADN Sequência Artificial <220> <223> iniciador E4-F3 36 ΕΡ 1 497 438/ΡΤ <4 Ο Ο > 11 tttgacagaa tacacagtcc tttctccccg gctgg 35 <210> 12 <211> 33 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> iniciador E4-R4 <400> 12 acaaaatacg agaatgacta cgtccggcgt <210> 13 <211> 30 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> iniciador E4-F5 <400> 13 ggacgtagtc attctcgtat tttgtatagc <210> 14 <211> 18 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> iniciador E4-R6 <400> 14 tcaccaacac agtggggg 18 <210> 15 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> iniciador NF-1 <400> 15 ccacaacccc cactactccc 20 <210> 16 <211> 21 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> iniciador NR-2 37 37 ΕΡ 1 497 438/ΡΤ <4 Ο Ο > 16 cgtctcttcc ctctcctctc c 21 <210> 17 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Arti ficial <220> <223> iniciador Ncol -R <400> 17 aggatcatcc gctgctgccc 20 <210> 18 <211> 19 <212> ADN <213> Sequência Arti ficial <220> <223> iniciador Ncol -F <400> 18 catcaggata gggcggtgg 19 <210> 19 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Arti ficial <220> <223> iniciador 35E3 for <400> 19 aatgactaat gcaggtgcgc 20 <210> 20 <211> 28 <212> ADN <213> Sequência Arti ficial <220> <223> iniciador 35E3 rev <400> 20 cgacgcgttg tagtcgttga gcttctag 28
<210> 21 <211> 294 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Sequência de aminoácidos da proteína E4-orf6 de Adenovírus de tipo 5 38 ΕΡ 1 497 438/ΡΤ <4 Ο Ο > 21
Met Thr Thr Ser Gly Vai Pro Phe Gly Met Thr Leu Arg Pro Thr Arg 1 5 10 15 Ser Arg Leu Ser Arg Arg Thr Pro Tyr Ser Arg Asp Arg Leu Pro i Pro 20 25 30 Phe Glu Thr Glu Thr Arg Ala Thr Ile Leu Glu Asp His . Pro Leu i Leu 35 40 45 Pro Glu Cys Asn Thr Leu Thr Met His Asn Vai Ser Tyr val Arg Gly 50 55 60 Leu Pro Cys Ser vai Gly Phe Thr Leu Ile Gin Glu Trp Val Val Pro 65 70 75 80 Trp Asp Met Vai Leu Thr Arg Glu Glu Leu Vai Ile Leu Arg Lys Cys 85 90 95 Met His Vai Cys Leu Cys Cys Ala Asn Ile Asp Ile Met Thr Ser Met 100 105 110 Met Ile His Gly Tyr Glu Ser Trp Ala Leu His Cys His Cys Ser Ser 115 120 125 Pro Gly Ser Leu Gin Cys Ile Ala Gly Gly Gin Vai Leu Ala Ser Trp 130 135 140 Phe Arg Met Vai Vai Asp Gly Ala Met Phe Asn Gin Arg Phe Ile Trp 145 150 155 160 Tyr Arg Glu Vai Vai Asn Tyr Asn Met Pro Lys Glu Vai Met Phe Met 165 170 175 Ser Ser Vai Phe Met Arg Gly Arg His Leu Ile Tyr Leu Arg Leu Trp 180 185 190 Tyr Asp Gly His Vai Gly Sèr Vai Vai Pro Ala Met Ser Phe Gly Tyr 195 200 205 Ser Ala Leu His Cys Gly Ile Leu Asn Asn Ile Vai Vai Leu Cys Cys 210 215 22Ò Ser Tyr Cys Ala Asp Leu Ser Glu Ile Arg Vai Arg Cys Cys Ala Arg 225 230 235 240 Arg Thr Arg Arg Leu Met Leú Arg Ala Vai Arg Ile Ile Ala Glu Glu 245 250 255 Thr Thr Ala Met Leu Tyr Ser Cys Arg Thr Glu Arg Arg Arg Gin Gin 260 265 270 Phe Ile Arg Ala Leu Leu Gin His His Arg Pro Ile Leu Met His Asp 275 280 285 Tyr Asp Ser Thr Pro Met 290 <210> 22 <211> 299 39 ΕΡ 1 497 438/ΡΤ
<212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Sequência de aminoácidos da proteína E4-orf6 de Adenovírus de tipo 35 <400> 22
Met Ser Gly Ser Asn Ser Ile Met Thr Arg Leu Arg Ala Arg Ser Thr 1 5 10 15 Ser Cys Ala Arg His His Pro Tyr Thr Arg Ala Gin Leu Pro Arg Cys 20 25 30 Glu Glu Asn Glu Thr Arg Ala Ser Met Thr Glu Asp His Pro Leu Leu 35 40 45 Pro Asp Cys Ásp Thr Met Thr Met His Ser Vai Ser Cys val Arg Gly 50 55 60 Leu Pro Cys Ser Ala Ser Phe Thr Vai Leu Gin Glu Leu Pro Ile Pro 65 70 75 80 Trp Asp Met Phe Leu Asn Pro Glu Glu Leu Lys Ile Met Arg Arg Cys 85 90 95 Met His Leu Cys Leu Cys Cys Ala Thr Ile Asp Ile Phe His Ser Gin 100 105 110 Vai Ile His Gly Arg Glu Asn Trp Vai Leu His Cys His Cys Asn Gin 115 120 125 Gin Gly Ser Leu Gin Cys Met Ala Gly Gly Ala Vai Leu Ala Val Trp 130 135 140 Phe Arg Lys Vai Ile Leu Gly Cys Met Ile Asn Gin Arg Cys Pro Trp 145 150 155 160 Tyr Arg Gin Ile Vai Asn Met His Met Pro Lys Glu Ile Met Tyr Val 165 170 175 Gly Ser Vai Phe Leu Arg Arg Arg His Leu Ile Tyr Ile Lys Leu Trp iao 185 190 Tyr Asp Gly His Ala Gly Ala Ile Ile Ser Asp Met Ser Phe Gly Trp 195 200 205 Ser Ala Phe Asn Tyr Gly Leu Leu Asn Asn Ile Vai Ile Met Cys Cys 210 215 220 Thr Tyr Cys Lys Asp Leu Ser Glu Ile Arg Met Arg Cys Cys Ala His 225 230 235 240 Arg Thr Arg Lys Leu Met Leu Arg Ala Ile Lys Ile Met Leu Gin Glu 245 250 2 55 40 ΕΡ 1 497 438/ΡΤ
Thr val Asp Pro 260 Asp Pro Ile Asn Ser 265 Ser Arg Thr Glu Arg 270 Arg Arg Gin Arg Leu 275 Leu Val Gly Leu Met 280 Arg His Asn Arg Pro 285 Ile Pro Phe Ser Asp Tyr Asp Ser His Arg Ser Ser Ser Arg 290 295
<210> 23 <211> 150 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Sequência de aminoácidos da proteína E4-orf6+7 do Adenovírus de tipo 5 <400> 23
Met Thr Thr Ser Gly Val Pro Phe Gly Met Thr Leu Arg Pro Thr Arg 1 5 10 15 Ser Arg Leu Ser Arg Arg Thr Pro Tyr Ser Arg Asp Arg Leu Pro Pro 20 25 30 Phe Glu Thr Glu Thr Arg Ala Thr Ile Leu Glu Asp His Pro Leu Leu 35 40 45 Pro Glu Cys Asn Thr Leu Thr Met His Asn Ala Trp Thr Ser Pro Ser 50 55 60 Pro Pro Val Lys Gin Pro Gin Val Gly Gin Gin Pro Val Ala Gin Gin 65 70 75 80 Leu Asp Ser Asp Met Asn Leu Ser Glu Leu Pro Gly Glu Phe Ile Asn 85 90 95 Ile Thr Asp Glu Arg Leu Ala Arg Gin Glu Thr Val Trp Asn Ile Thr 100 105 110 Pro Lys Asn Met Ser Val Thr His Asp Met Met Leu Phe Lys Ala Ser 115 120 125 Arg Gly Glu Arg Thr Val Tyr Ser val Cys Trp Glu Gly Gly Gly Arg 130 135 140
Leu Asn Thr Arg Vai Leu 145 150 41 ΕΡ 1 497 438/ΡΤ
<210> 24 <211> 150 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Sequência de aminoácidos da proteína de fusão E4-orf6+7 de Adenovírus de tipo 5 e Adenovírus de tipo 35 <400> 24
Met Thr Thr Ser Gly Vai Pro Phe Gly Met Thr Leu Arg Pro Thr Arg 1 5 10 15 Ser Arg Leu Ser Arg Arg Thr Pro Tyr Ser Arg Asp Arg Leu Pro Pro 20 25 30 Phe Glu Thr Glu Thr Arg Ala Thr Ile Leu Glu Asp His Pro Leu Leu 35 40 45 Pro Glu Cya Asn Thr Leu Thr Met His Asn Ala Trp Thr Ser Pro Ser 50 55 60 Pro Pro Vai Lys Gin Pro Gin Vai Gly Gin Gin Pro Vai Ala Gin Gin 65 70 75 80 Leu Asp Ser Asp Met Asn Leu Ser Glu Leu Pro Gly Glu Phe Ile Asn 85 90 95 Ile Thr Asp Glu Arg Leu Ala Arg Gin Glu Thr Vai Trp Asn Ile Thr 100 105 110 Pro Lys Asn Met Ser Vai Thr HiS ASp Met Met Leu Phe Lys Ala Ser 115 120 125 Arg Gly Glu Arg Thr Vai Tyr Ser Vai Lys Trp Glu Gly Gly Gly Lys 130 135 140 Ile Thr Thr Arg Ile Leu 145 150
<210> 25 <211> 141 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Sequência de aminoácidos da proteína E4-orf6+7 de Adenovírus de tipo 35 <400> 25
Met Ser Gly Ser Asn Ser Ile Met Thr Arg Leu Arg Ala Arg Ser Thr 42 ΕΡ 1 497 438/ΡΤ 1 5
Ser Cys Ala Arg His His Pro Tyr 20 Glu Glu Asn Glu Thr Arg Ala Ser 35 40 Pro Asp Cys Asp Thr Met Thr Met 50 55 Pro Glu Ser Hls Pro Gin Gin Leu 65 70 Tyr Arg Asp Gly Phe Leu Ser Ile 85 Glu Thr Vai Trp Asn Vai Glu Ser 100 Ile Gin Met Phe Lys Ala Vai Arg .115 120 Lys Trp Glu Gly Gly Gly Lys Ile 130 135 10 15 Thr Arg Ala Gin Leu Pro Arg Cys 25 30 Met Thr Glu Asp HiS Pro Leu Leu 45 His Ser Met Thr Vai Ile Gin Thr 60 Asp Cys Glu Ser Ala Leu Lys Asp 75 80 Thr Asp Pro Arg Leu Ala Arg Ser 90 95 Lys Thr Met Ser Ile Ser Asn Gly 105 110 Gly Glu Arg Leu Vai Tyr Ser Vai 125 Thr Thr Arg Ile Leu
Lisboa, 2010-01-28 140

Claims (30)

  1. ΕΡ 1 497 438/ΡΤ 1/5 REIVINDICAÇÕES 1. Vector de adenovírus recombinante compreendendo elementos estruturais e não estruturais de um primeiro serotipo, em que o referido vector compreende adicionalmente uma sequência codificando uma proteína E4-orf6 funcional, em que a referida sequência é seleccionada do grupo que consiste em: a) uma sequência codificando E4-orf6 de um adenovírus de um segundo serotipo diferente do referido primeiro serotipo; b) uma sequência codificando E4-orf6 compreendendo uma fusão entre uma parte de uma sequência que codifica E4-orf6 de um segundo serotipo diferente do referido primeiro serotipo e uma parte de uma sequência que codifica E4-orf6 de um terceiro serotipo, em que o referido terceiro serotipo pode ser idêntico ou diferente do referido primeiro serotipo
  2. 2. Vector de adenovírus recombinante de acordo com a reivindicação 1, em que o referido primeiro serotipo e o referido segundo serotipo são de diferentes subgrupos de adenovírus.
  3. 3. Vector de adenovírus recombinante de acordo com a reivindicação 1, em que o referido primeiro serotipo é de um subgrupo diferente do subgrupo C e em que a referida sequência codificando E4-orf6 é de um serotipo de adenovírus do subgrupo C.
  4. 4. Adenovírus recombinante de acordo com a reivindicação 1, em que o referido primeiro serotipo é do subgrupo B e o referido segundo serotipo é do subgrupo C.
  5. 5. Vector de adenovírus recombinante de acordo com a reivindicação 1, em que a referida sequência codificando E4-orf6 é de adenovírus de serotipo 5.
  6. 6. Vector de adenovírus recombinante de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 5, em que o referido primeiro serotipo é seleccionado do grupo que consiste nos serotipos 11, 14, 16, 21, 34, 35 e 50 de adenovírus.
  7. 7. Vector de adenovírus recombinante de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 6, compreendendo ΕΡ 1 497 438/ΡΤ 2/5 adicionalmente uma sequência que codifica uma proteína, um polipéptido ou um péptido não adenovirais.
  8. 8. Vector de adenovírus recombinante de acordo com a reivindicação 7, em que os referidos proteína, polipéptido ou péptido não adenovirais são seleccionados do grupo que consiste em: um polipéptido indutor de morte celular, um determinante antigénico de um organismo patogénico, um antigénio específico de tumores, uma proteína virai, uma hormona e uma citocina.
  9. 9. Método para produzir um vector de adenovírus recombinante compreendendo elementos estruturais e não estruturais de um adenovírus de um primeiro serotipo, compreendendo o referido método as etapas de: a) proporcionar uma célula de complementação portadora de uma sequência codificando E1B-55K de um adenovírus de um segundo serotipo em forma expressável, com os elementos necessários de um adenovírus de forma a permitir a montagem do referido vector de adenovírus recombinante pela referida célula de complementação, em que os referidos elementos compreendem pelo menos alguns elementos estruturais e não estruturais de um adenovírus do referido primeiro serotipo diferente do referido segundo serotipo, e uma sequência codificando uma proteína E4-orf6 funcional, que é compatível com referida proteína E1B-55K expressável na referida célula de complementação; b) cultivar a referida célula de complementação num meio sob condições que permitem que ocorra a produção e montagem do vector de adenovírus; e c) recolher o vector de adenovírus recombinante assim produzido, a partir do meio e/ou da célula de complementação, em que a sequência que codifica a proteína E4-orf6 compatível está presente no vector de adenovírus recombinante assim produzido.
  10. 10. Método de acordo com a reivindicação 9, em que a referida sequência codificando E4-orf6 é seleccionada do grupo que consiste em: ΕΡ 1 497 438/ΡΤ 3/5 a) uma sequência codificando E4-orf6 de um adenovirus do referido segundo serotipo; b) uma sequência codificando E4-orf6 de um adenovirus de um terceiro serotipo diferente dos referidos primeiro e segundo serotipos; e c) uma sequência codificando E4-orf6 compreendendo uma fusão entre uma parte de uma sequência que codifica E4-orf6 de um terceiro serotipo e uma parte de uma sequência que codifica E4-orf6 de um adenovirus do referido segundo serotipo, em que o referido terceiro serotipo pode ser idêntico ou diferente do referido primeiro serotipo.
  11. 11. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 9 ou 10, em que o referido primeiro e o referido segundo serotipos são de subgrupos diferentes.
  12. 12. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações de 9 a 11, em que o referido segundo serotipo é um serotipo de adenovirus do subgrupo C.
  13. 13. Método de acordo com a reivindicação 12, em que o referido segundo serotipo é o serotipo 5 de adenovirus.
  14. 14. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações de 9 a 13, em que o referido primeiro serotipo é um serotipo de adenovirus do subgrupo B.
  15. 15. Método de acordo com a reivindicação 14, em que o referido primeiro serotipo é seleccionado do grupo que consiste nos serotipos 11, 14, 16, 21, 34, 35 e 50 de de adenovirus.
  16. 16. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações de 9 a 15, em que a referida sequência codificando E1B-55K está integrada no genoma da referida célula de complementação.
  17. 17. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações de 9 a 16, em que a referida célula de complementação é derivada de uma célula primária diplóide humana, ou uma célula sua progenitora.
  18. 18. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações de 9 a 17, em que a referida célula de complementação é ΕΡ 1 497 438/ΡΤ 4/5 derivada de uma célula retinoblasto primária humana, uma célula primária de rim embrionário humana, uma célula primária neuronal humana ou um amniócito primário humano. de
  19. 19. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 9 a 18, em que a referida célula de complementação compreende, integrado no seu genoma, um ácido nucleico codificando pelo menos uma proteina EIA de adenovirus.
  20. 20. Método de acordo com a reivindicação 19, em que o referido ácido nucleico codificando pelo menos uma proteina EIA de adenovirus é de um serotipo de adenovirus de um subgrupo diferente do subgrupo B.
  21. 21. Método de acordo com a reivindicação 19, em que o referido ácido nucleico codificando pelo menos uma proteina EIA de adenovirus é de um serotipo de adenovirus do subgrupo C.
  22. 22. Método de acordo com a reivindicação 20, em que o referido ácido nucleico codificando pelo menos uma proteina EIA de adenovirus é de um adenovirus de serotipo 5.
  23. 23. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações de 9 a 22, em que a referida sequência codificando E4-orf6 e a referida sequência codificando E1B-55K são de diferentes serotipos de adenovirus e em que os referidos diferentes serotipos de adenovirus são membros do mesmo subgrupo de adenovirus.
  24. 24. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações de 9 a 22, em que a referida sequência codificando E4-orf6 e a referida sequência codificando E1B-55K são de diferentes serotipos de adenovirus e em que os referidos diferentes serotipos de adenovirus são ambos membros do subgrupo C.
  25. 25. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações de 9 a 22, em que a referida sequência codificando E4-orf6 e a referida sequência codificando E1B-55K são do mesmo serotipo de adenovirus.
  26. 26. Método de acordo com a reivindicação 25, em que a referida sequência codificando E4-orf6 e a referida sequência codificando E1B-55K são de adenovirus de serotipo 5. ΕΡ 1 497 438/ΡΤ 5/5
  27. 27. Método de acordo com a reivindicação 9, em que a referida célula de complementação é uma célula PER.C6 ou um seu derivado.
  28. 28. Composição farmacêutica compreendendo um vector adenoviral recombinante de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 8, ou obtenível por meio de um método de acordo com qualquer uma das reivindicações de 9 a 27.
  29. 29. Kit de partes compreendendo: a) uma célula de complementação para produzir um vector de adenovírus recombinante compreende elementos estruturais e não estruturais de adenovírus de um primeiro serotipo, sendo a referida célula portadora de uma sequência codificando E1B-55K de um adenovírus de um segundo serotipo em forma expressável; e b) um ou mais vectores de ácido nucleico replicáveis compreendendo todos os elementos adenovirais necessários para permitir a montagem do referido vector de adenovírus recombinante pela referida célula de complementação, em que os referidos elementos compreendem pelo menos alguns elementos estruturais e não estruturais de um adenovírus do referido primeiro serotipo diferente do referido segundo serotipo e uma sequência codificando uma proteína E4-orf6 funcional, que é compatível com a referida proteína E1B-55K expressável na referida célula de complementação.
  30. 30. Kit de partes de acordo com a reivindicação 29, em que a referida sequência codificando E4-orf6 é seleccionada do grupo que consiste em: a) uma sequência codificando E4-orf6 de um adenovírus do referido segundo serotipo; b) uma sequência codificando E4-orf6 de um adenovírus de um terceiro serotipo diferente dos referidos primeiro e segundo serotipos; e c) uma sequência codificando E4-orf6 compreendendo uma fusão entre uma parte de uma sequência codificando E4-orf6 de um terceiro serotipo e uma parte de uma sequência codificando E4-orf6 de um adenovírus do referido segundo serotipo, em que o referido terceiro serotipo pode ser idêntico ou diferente do referido primeiro serotipo. Lisboa, 2010-01-28
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