CN117264902A - 一种腺病毒包装与生产细胞系的构建方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种腺病毒包装与生产的细胞系、其构建方法及应用。与传统HEK293细胞相比，本发明的腺病毒包装与生产细胞系在不降低腺病毒产量的前提下，解决了E1区修饰的腺病毒在包装与生产过程中通过同源重组产生野生型E1区腺病毒的问题。
Description
技术领域
本发明涉及一种腺病毒包装与生产细胞系的构建方法及其应用，尤其涉及一种包含修饰的E1区的腺病毒包装与生产细胞系的构建及其应用。
背景技术
现在被广泛用于腺病毒大规模生产的细胞系为HEK293细胞系。由于其基因组中含有多拷贝数的野生型腺病毒的E1区基因片段，能自发的高水平表达腺病毒复制所必须的E1区基因编码蛋白。E1区基因编码蛋白为E1A和E1B，主要功能有：促进和调节腺病毒基因组后续有关基因的表达；调节细胞周期为溶瘤腺病毒的包装和复制创造条件；抑制细胞凋亡以提高病毒单产。并且HEK293为腺病毒易感型细胞，因此被广泛运用于腺病毒的包装和生产领域。
HEK293细胞虽然有高产、易培养、生长速度快等优点，但由于HEK293基因组中存在多拷贝数的野生型腺病毒E1区基因片段，经E1区修饰的腺病毒在HEK293细胞中包装和生产时，会不可避免地通过同源重组而产生野生型E1区的腺病毒，且随着扩增代次的增加，野生型E1区的腺病毒比例会显著上升，严重影响经E1区修饰的腺病毒的质量，且很难通过现有技术手段将其从目的产物中分离去除。
发明内容
本发明的发明人在研究中意外发现，利用CRISPR/Cas9基因编辑技术，将序列修饰后的腺病毒E1区序列定点整合至对腺病毒易感的细胞系(例如，癌细胞系HeLa S3)的基因组中，由此获得的细胞系能稳定表达腺病毒复制包装所需的E1区蛋白，同时所述修饰后的E1区可避免通过同源重组产生包含野生型E1区腺病毒的可能性。与经典的腺病毒生产细胞HEK293细胞相比，本发明在不降低腺病毒产量的前提下，完全解决了腺病毒在包装与生产过程中通过同源重组产生包含野生型E1区的腺病毒的问题。
为了达到上述目的，本发明提供以下技术方案。
本发明的第一个方面，提供一种腺病毒包装与生产细胞，其中所述细胞的基因组包含改造的腺病毒E1区序列，所述改造的腺病毒E1区序列与野生型E1区序列相比：1)野生型E1区序列的低频密码子被所述细胞中最优的同义密码子替换；2)碱基重复减少；3)避免野生型E1区序列中的一些限制酶识别位点；4)GC含量提高；5)避免转录获得的mRNA具有二级结构；6)避免密码子重复导致的长重复序列；所述改造的腺病毒E1区序列编码的蛋白具有与野生型E1A和E1B蛋白相同的功能，优选地，所述改造的腺病毒E1区序列编码的蛋白具有与野生型E1A和E1B蛋白相同的氨基酸序列。
在本发明的一些实施方案中，所述改造的腺病毒E1区序列还包含启动子，所述启动子位于E1区编码序列上游，能够启动E1区基因的表达。现有技术已知的启动子均可用于本发明，只要能启动E1区基因在宿主细胞的表达即可。优选地，所述启动子选自SV40启动子和mPGK启动子。
在本发明的另一些实施方案中，所述改造的腺病毒E1区序列选自SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:4-7，优选为SEQ ID NO:2。
在本发明的另一些实施方案中，所述细胞为能进行腺病毒包装与生产细胞的人源细胞，例如来源于A549、A375、HeLa、SW620、22RV1、MDA-MB-435S、ES-2或HCC1806细胞，优选为HeLa S3细胞。HeLa S3细胞的基因组中不含有野生型腺病毒的部分基因组，例如E1区，因此不会通过重组产生野生型腺病毒，此外，HeLa S3细胞跟其他病毒易感细胞相比，具有扩增速度快、单细胞产量高的优势。
在本发明的另一些实施方案中，所述改造的腺病毒E1区序列在所述细胞基因组中的插入位点选自AAVS1、CCR5、ROSA26、LMO2、CCDN2、BMI1\MECOM\PRDM1、H11、HBB03、HBB04、FANCF02、RUNX1和ZSCAN2，优选为AAVS1位点。现有技术已知的其它位点也可用于本发明，这些位点可
在本发明的另一些实施方案中，所述细胞能够包装与生产复制缺陷型腺病毒和复制型腺病毒，在复制型腺病毒连续传代时不产生野生型腺病毒。
本发明的第二个方面，提供一种构建如第一个方面所述的腺病毒包装与生产细胞的方法，包括：
对野生型E1区序列进行改造，获得改造的腺病毒E1区序列；
将所述改造的腺病毒E1区序列插入宿主细胞基因组；
其中，所述改造的腺病毒E1区序列与野生型E1区序列相比：1)野生型E1区序列的低频密码子被所述细胞中最优的同义密码子替换；2)碱基重复减少；3)避免野生型E1区序列中的一些限制酶识别位点；4)GC含量提高；5)避免转录获得的mRNA具有二级结构；6)避免密码子重复导致的长重复序列；所述改造的腺病毒E1区序列编码的蛋白具有与野生型E1A和E1B蛋白相同的功能。
本发明还提供第二个方面构建获得的细胞。
本发明的第三个方面，第一个方面所述的腺病毒包装与生产细胞或第二个方面所构建的细胞在制备复制缺陷型腺病毒和复制型腺病毒中的用途。
本发明的第四个方面，提供一种生产/包装腺病毒的方法，包括：
1)将腺病毒导入权利要求1-10任一所述的腺病毒包装与生产细胞；
2)培养步骤1)获得的细胞；和
3)收集病毒。
附图说明
图1示pCRISPR/Cas9-T2质粒构建流程图。
图2示改造后E1-M1与野生型E1的前200个核苷酸的比对示意图。
图3示实施例2中Donor-mPGK转入HeLa S3细胞后第一轮单克隆筛选鉴定。
图4示实施例2中Donor-SV40转入HeLa S3细胞后第一轮单克隆筛选鉴定。
图5示实施例2中鉴定改造细胞系中扩增完整插入基因片段。
图6示实施例2中各单克隆细胞株中E1A蛋白表达检测。
图7示实施例3中各单克隆细胞株与HEK-293细胞的单产比较(注：vp代表病毒颗粒)。
图8示实施例3中HeLa S3-mPGK第二轮单克隆细胞中插入基因片段鉴定。
图9示实施例5中PCR检测单克隆细胞的E1A的mRNA相对表达水平。
图10示各挑选的单克隆细胞敲除Puromycin抗性基因验证。
图11示Puro基因敲除后细胞插入基因验证。
图12示改造细胞E1区特定序列PCR检测结果。
图13示改造细胞插入序列同源臂间的PCR检测图。
图14示改造细胞E1B至同源臂的检测结果图。
图15示10万个病毒中野生型腺病毒含量定量检测。注：293-HeLa S3-SV40-3-1C-2G表示接种至HeLa S3-SV40-3-1C-2G细胞的病毒为在HEK293中连续传代所生产的病毒。
图16示HeLa S3-SV40-3-1C-2G细胞包装病毒过程。
具体实施方式
除非另有定义，本文使用的所有科技术语具有本领域普通技术人员所理解的相同含义。
尽管本发明的广义范围所示的数字范围和参数近似值，但是具体实施例中所示的数值尽可能准确的进行记载。然而，任何数值本来就必然含有一定的误差，其是由它们各自的测量中存在的标准偏差所致。另外，本文公开的所有范围应理解为涵盖其中包含的任何和所有子范围。例如记载的“1至10”的范围应认为包含最小值1和最大值10之间(包含端点)的任何和所有子范围；也就是说，所有以最小值1或更大起始的子范围，例如1至6.1，以及以最大值10或更小终止的子范围，例如5.5至10。另外，任何称为“并入本文”的参考文献应理解为以其整体并入。
另外应注意，如本说明书中所使用的，单数形式包括其所指对象的复数形式，除非清楚且明确的限于一个所指对象。术语“或”可与术语“和/或”互换使用，除非上下文另有清楚指明。
现有技术已知的能够将目的片段整合入基因组的方法均可应用于本发明，只要能将本发明所述改造的腺病毒E1区序列插入基因组即可。例如Cre-lox系统、Zinc FingerNucleases(ZFN)、CRISPR或TALEN，优选为CRISPR。CRISPR/Cas9基因编辑技术是最新一代的基因编辑技术，其特异性强细胞毒性小等特点保证了其安全性。此技术实现基因编辑主要依赖于Cas9酶在sgRNA(T2)的引导下定点剪切基因组中的DNA产生双链断裂，而后依赖于细胞的HDR基因组修复通路进行以Donor质粒为模板的基因组修复，从而将目的基因片段定点整合到靶细胞基因组中实现基因编辑。
术语“低频密码子”是指在Kazusa和基因组数据库中，以低频率出现的密码子，例如Ala(GCG)、Leu(CUC)、Arg(CGG和CGC)和Ser(UGG)。术语“最优的同义密码子”，也称最优密码子(Optimal codon)，是指生物体中倾向于使用的特定一种或几种同义密码子，即密码子偏好性(codon bias)。
AAVS1位点是位于人类PPP1R12C基因第一个内含子中的一段特定序列。在该区域内引入外源核苷酸序列已被证明不会影响PPP1R12C基因或其他内源基因的表达，并且对培养细胞的毒性很小。因此,理论上可以通过在此区段引入各种外源基因及调控序列，以实现可控表达目的基因、治疗相应疾病的目的。现有技术已知的基因组其它安全插入位点也可以被被发明采用，例如AAVS1、CCR5、ROSA26、LMO2、CCDN2、BMI1\MECOM\PRDM1、H11、HBB03、HBB04、FANCF02、RUNX1、ZSCAN2(Safe harbours for the integration of new DNA inthe human genome,Nature Reviews Cancer volume 12,pages51–58(2012)；Highlyefficient CRISPR/Cas9-mediated transgene knockin at the H11 locus in pigs,Scientific Reports volume 5,Article number:14253(2015)；Directed evolution ofCRISPR-Cas9 to increase its specificity,Nature Communications volume 9,Article number:3048(2018))。
本申请中涉及的E1区可包含启动子，所述启动子位于E1区编码序列上游，能够启动E1区基因的表达。例如以mPGK为启动子的E1区序列，用于启动E1A的表达；或以SV40为启动子。现有技术已知的能够启动基因转录和表达的其它启动子也可以运用到本发明中。
mPGK、SV40是真核系统中常用的组成型启动子，但同一启动子在不同的细胞中，往往启动下游基因表达的能力不一样，所以本专利采用了两种不同的启动子进行筛选。E1A不仅具有激活其他早期基因的作用，同时也有促进细胞凋亡的作用，会显著影响病毒产量，而E1B-55K则具有抗凋亡和促进病毒晚期RNA出核的作用，E1B-19K与细胞Bcl-2基因的表达产物同源，可以通过灭活和清除Bax家族成员来防止细胞发生凋亡或坏死。
此外，上述2种设计中E1区的部分核酸序列进行同源密码子及人源化优化，避免改造的溶瘤腺病毒在包装和生产过程中因同源重组产生野生型腺病毒，同时优化后的序列整入细胞基因组后能够稳定表达腺病毒生产和包装所需的E1区蛋白：E1A、E1B-19K和E1B-55K。
本发明采用CRISPR/Cas9基因编辑技术，将腺病毒E1区核苷酸序列通过同源密码子替代、人源化优化以及启动子替换等改造后，插入对腺病毒易感的癌细胞系Hela-S3的基因组中的安全位点，使其能稳定表达腺病毒复制包装所需的E1区蛋白，在不降低腺病毒产量的前提下，完全解决了腺病毒在包装与生产过程中通过同源重组产生包含野生型E1区的腺病毒的问题，以及复制缺陷型腺病毒在本底细胞中的包装盒生产问题。
实施例
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明的一些优选的实施方式和方面，这些实施例不应被解释为限制本发明的范围。
实施例1质粒构建
构建用于基因编辑的pCRISPR/Cas9-T2质粒、携带目的基因的Donor-mPGK和Donor-SV40质粒
1.构建pCRISPR/Cas9-T2质粒
构建流程参见图1。pCRISPR/Cas9-T2质粒是基于CRISPR/Cas9技术的载体质粒，其功能是表达野生型spCas9蛋白和sgRNA(T2)，从而特异性的在人类基因组19号染色体的AAVS1位点处5’-ggggccactagggacagGATTGG-3’(小写和大写碱基之间)产生19号染色体双链断裂(Utilization of the AAVS1 safe harbor locus for hematopoietic specifictransgene expression and gene knockdown in human ES cells.Stem CellRes.2014May；12(3):630-7)。
1.1使用High-Efficiency gRNA-Cas9-GFP Plasmid Assembly Kit(南京金斯瑞生物科技有限公司：L00692-10)依照其说明书合成如表1所示的引物。
表1
变性后梯度退火，形成带粘性末端的双链DNA片段，命名为T2。
1.2 BbsI-HF(NEB：R3539S)酶切pCRISPR/Cas9-GFP载体并插入1.1形成的DNA片段，连接后转化DH5a感受态细胞，挑取单克隆鉴定并扩增携带插入片段的pCRISPR/Cas9-T2质粒。
1.3制备pCRISPR/Cas9-T2质粒用于后续实验。
2.构建目的基因敲入所需的供体模板质粒：Donor-mPGK、Donor-SV40
野生型E1区序列(包括E1A编码区、IRES、E1B编码区)：
atgagacatattatctgccacggaggtgttattaccgaagaaatggccgccagtcttttggaccagctgatcgaagaggtactggctgataatcttccacctcctagccattttgaaccacctacccttcacgaactgtatgatttagacgtgacggcccccgaagatcccaacgaggaggcggtttcgcagatttttcccgactctgtaatgttggcggtgcaggaagggattgacttactcacttttccgccggcgcccggttctccggagccgcctcacctttcccggcagcccgagcagccggagcagagagccttgggtccggtttctatgccaaaccttgtaccggaggtgatcgatcttacctgccacgaggctggctttccacccagtgacgacgaggatgaagagggtgaggagtttgtgttagattatgtggagcaccccgggcacggttgcaggtcttgtcattatcaccggaggaatacgggggacccagatattatgtgttcgctttgctatatgaggacctgtggcatgtttgtctacagtaagtgaaaattatgggcagtgggtgatagagtggtgggtttggtgtggtaattttttttttaatttttacagttttgtggtttaaagaattttgtattgtgatttttttaaaaggtcctgtgtctgaacctgagcctgagcccgagccagaaccggagcctgcaagacctacccgccgtcctaaaatggcgcctgctatcctgagacgcccgacatcacctgtgtctagagaatgcaatagtagtacggatagctgtgactccggtccttctaacacacctcctgagatacacccggtggtcccgctgtgccccattaaaccagttgccgtgagagttggtgggcgtcgccaggctgtggaatgtatcgaggacttgcttaacgagcctgggcaacctttggacttgagctgtaaacgccccaggccataaggtgtaaacctgtgattgcgtgtgtggttaacgcctttgtttgctgaatgagttgatgtaagtttaataaagggtgagataatgtttaacttgcatggcgtgttaaatggggcggggcttaaagggtatataatgcgccgtgggctaatcttggttacatctgacctcatggaggcttgggagtgtttggaagatttttctgctgtgcgtaacttgctggaacagagctctaacagtacctcttggttttggaggtttctgtggggctcatcccaggcaaagttagtctgcagaattaaggaggattacaagtgggaatttgaagagcttttgaaatcctgtggtgagctgtttgattctttgaatctgggtcaccaggcgcttttccaagagaaggtcatcaagactttggatttttccacaccggggcgcgctgcggctgctgttgcttttttgagttttataaaggataaatggagcgaagaaacccatctgagcggggggtacctgctggattttctggccatgcatctgtggagagcggttgtgagacacaagaatcgcctgctactgttgtcttccgtccgcccggcgataataccgacggaggagcagcagcagcagcaggaggaagccaggcggcggcggcaggagcagagcccatggaacccgagagccggcctggaccctcgggaatgaatgttgtacaggtggctgaactgtatccagaactgagacgcattttgacaattacagaggatgggcaggggctaaagggggtaaagagggagcggggggcttgtgaggctacagaggaggctaggaatctagcttttagcttaatgaccagacaccgtcctgagtgtattacttttcaacagatcaaggataattgcgctaatgagcttgatctgctggcgcagaagtattccatagagcagctgaccacttactggctgcagccaggggatgattttgaggaggctattagggtatatgcaaaggtggcacttaggccagattgcaagtacaagatcagcaaacttgtaaatatcaggaattgttgctacatttctgggaacggggccgaggtggagatagatacggaggatagggtggcctttagatgtagcatgataaatatgtggccgggggtgcttggcatggacggggtggttattatgaatgtaaggtttactggccccaattttagcggtacggttttcctggccaataccaaccttatcctacacggtgtaagcttctatgggtttaacaatacctgtgtggaagcctggaccgatgtaagggttcggggctgtgccttttactgctgctggaagggggtggtgtgtcgccccaaaagcagggcttcaattaagaaatgcctctttgaaaggtgtaccttgggtatcctgtctgagggtaactccagggtgcgccacaatgtggcctccgactgtggttgcttcatgctagtgaaaagcgtggctgtgattaagcataacatggtatgtggcaactgcgaggacagggcctctcagatgctgacctgctcggacggcaactgtcacctgctgaagaccattcacgtagccagccactctcgcaaggcctggccagtgtttgagcataacatactgacccgctgttccttgcatttgggtaacaggaggggggtgttcctaccttaccaatgcaatttgagtcacactaagatattgcttgagcccgagagcatgtccaaggtgaacctgaacggggtgtttgacatgaccatgaagatctggaaggtgctgaggtacgatgagacccgcaccaggtgcagaccctgcgagtgtggcggtaaacatattaggaaccagcctgtgatgctggatgtgaccgaggagctgaggcccgatcacttggtgctggcctgcacccgcgctgagtttggctctagcgatgaagatacagattga(SEQ IDNO:1)
发明人经过多次尝试，对野生型E1区序列进行同义密码子改造：
1)野生型E1区序列的低频密码子被所述细胞中最优的同义密码子替换；2)碱基重复减少；3)避免野生型E1区序列中的一些限制酶识别位点；4)GC含量提高；5)避免转录获得的mRNA具有二级结构；6)避免密码子重复导致的长重复序列。此外，考虑翻译动力学、翻译后折叠和代谢水平等因素。
获得的一些改造后E1区序列示例如下：
E1-Modified-1(简称E1-M1)，即实施例中重组质粒Donor-mPGK和Donor-SV40包含的E1区：对E1A和E1B编码区序列进行了改造，与野生型序列比对同源性为96％。
atgcggcacattatttgccacggcggcgtgattacagaggagatggccgcctctctgctggaccagctcattgaggaggtgctcgccgacaacctccctccaccatctcacttcgagccaccaacactgcacgagctgtacgacctggacgtgaccgcccctgaggacccaaacgaggaggccgtgtctcagattttccccgactctgtgatgctcgccgtgcaggagggcattgacctgctgacattcccacccgccccaggctctcctgagcctccacacctgagccgccagcccgagcagccagagcagcgcgccctcggcccagtgtctatgcctaacctggtgccagaggtgatcgaccttacctgccacgaggctggctttccacccagtgacgacgaggatgaagagggtgaggagtttgtgttagattatgtggagcaccccgggcacggttgcaggtcttgtcattatcaccggaggaatacgggggacccagatattatgtgttcgctttgctatatgaggacctgtggcatgtttgtctacagtaagtgaaaattatgggcagtgggtgatagagtggtgggtttggtgtggtaattttttttttaatttttacagttttgtggtttaaagaattttgtattgtgatttttttaaaaggtcctgtgtctgaacctgagcctgagcccgagccagaaccggagcctgcaagacctacccgccgtcctaaaatggcgcctgctatcctgagacgcccgacatcacctgtgtctagagaatgcaatagtagtacggatagctgtgactccggtccttctaacacacctcctgagatacacccggtggtcccgctgtgccccattaaaccagttgccgtgagagttggtgggcgtcgccaggctgtggaatgtatcgaggacttgcttaacgagcctgggcaacctttggacttgagctgtaaacgccccaggccataaggtgtaaacctgtgattgcgtgtgtggttaacgcctttgtttgctgaatgagttgatgtaagtttaataaagggtgagataatgtttaacttgcatggcgtgttaaatggggcggggcttaaagggtatataatgcgccgtgggctaatcttggttacatctgacctcatggaggcttgggagtgtttggaagatttttctgctgtgcgtaacttgctggaacagagctctaacagtacctcttggttttggaggtttctgtggggctcatcccaggcaaagttagtctgcagaattaaggaggattacaagtgggaatttgaagagcttttgaaatcctgtggtgagctgtttgattctttgaatctgggtcaccaggcgcttttccaagagaaggtcatcaagactttggatttttccacaccggggcgcgctgcggctgctgttgcttttttgagttttataaaggataaatggagcgaagaaacccatctgagcggggggtacctgctggattttctggccatgcatctgtggagagcggttgtgagacacaagaatcgcctgctactgttgtcttccgtccgcccggcgataataccgacggaggagcagcagcagcagcaggaggaagccaggcggcggcggcaggagcagagcccatggaacccgagagccggcctggaccctcgggaatgaatgttgtacaggtggctgaactgtatccagaactgagacgcattttgacaattacagaggatgggcaggggctaaagggggtaaagagggagcggggggcttgtgaggctacagaggaggctaggaatctagcttttagcttaatgaccagacaccgtcctgagtgtattacttttcaacagatcaaggataattgcgctaatgagcttgatctgctggcgcagaagtattccatagagcagctgaccacttactggctgcagccaggggatgattttgaggaggctattagggtatatgcaaaggtggcacttaggccagattgcaagtacaagatcagcaaacttgtaaatatcaggaattgttgctacatttctgggaacggggccgaggtggagatagatacggaggatagggtggcctttagatgtagcatgataaatatgtggccgggggtgcttggcatggacggggtggttattatgaatgtaaggtttactggccccaattttagcggtacggttttcctggccaataccaaccttatcctacacggtgtaagcttctatgggtttaacaatacctgtgtggaagcctggaccgatgtaagggttcggggctgtgccttttactgctgctggaagggggtggtgtgtcgccccaaaagcagggcttcaattaagaaatgcctctttgaaaggtgtaccttgggtatcctgtctgagggtaactccagggtgcgccacaatgtggcctccgactgtggttgcttcatgctagtgaaaagcgtggctgtgattaagcataacatggtatgtggcaactgcgaggacagggcctctcagatgctgacctgctcggacggcaactgtcacctgctgaagaccattcacgtagccagccactctcgcaaggcctggccagtgtttgagcataacatactgacccgctgttccttgcatttgggtaacaggaggggggtgttcctaccttaccaatgcaatttgagtcacactaagatattgcttgagcccgagagcatgtccaaggtgaacctgaacggggtgtttgacatgaccatgaagatttggaaggtgctgagatacgacgagacccggacaagatgcaggccatgcgagtgcggcggcaagcacattagaaaccagccagtgatgctcgacgtgacagaggaattacgccctgaccacctcgtgctggcctgcacacgcgccgagttcggctctagcgacgaggacacagactga(SEQ IDNO:2)
作为示例，改造后E1-M1与野生型E1的前200个核苷酸的比对如图3所示。
E1-Modified-2(简称E1-M2)，即实施例中的IRES-Donor E1区：全E1区均经过改造，与野生型序列比对同源性为17.22％。RES-Donor E1区的设计是为了彻底地将E1区改造成与野生型E1区不同，在完成人源同义密码子优化的基础上，还调整了E1区内基因的排列顺序，将野生型E1区中的基因顺序E1A\E1B19K\E1B55K改变为E1B19K\E1B55K\E1A。ccaccatggagagaagaaaccctagcgagcggggcgtgccagccggcttctctggccacgcctctgtggagtctggctgcgagacccaggagtccccagccacagtggtgttcagacccccaggcgacaacaccgacggcggcgccgccgccgccgccggcggctctcaggccgccgccgccggcgccgagcctatggagcccgagagtcggccaggcccatccggcatgaacgtggtgcaggtggccgagctgtaccctgagcttagacgcatactcaccatcaccgaggacggccagggcctcaagggcgtgaagcgggagcggggcgcctgcgaggccacagaggaggcccggaacctcgccttctccctgatgacaaggcaccgccctgagtgcattacattccagcagatcaaggacaactgcgccaacgagttggacctcctcgcccagaagtactctattgagcagctcaccacctactggctccagccaggcgacgacttcgaggaggccattcgggtgtacgccaaggtggccctgagacccgactgcaagtacaagatttccaagctcgtgaacattagaaactgctgctacatttctggcaacggcgccgaggtggagattgacacagaggaccgggtggccttcagatgcagcatgattaacatgtggcccggcgtgctgggcatggacggcgtggtgattatgaacgtgcgcttcacaggccctaacttcagcggcacagtgttcctcgccaacacaaacctcattctccacggcgtgtctttctacggcttcaacaacacatgcgtggaggcctggaccgacgtgagagtgcggggctgcgccttctactgctgctggaagggcgtggtgtgcagaccaaagagccgtgcctctattaagaagtgcctgttcgagagatgcacactgggcatcctgtctgagggcaactctagggtgagacacaacgtggccagcgactgcggctgcttcatgctcgtgaagtctgtggccgtgattaagcacaacatggtgtgcggcaactgcgaggacagagcctctcagatgctgacatgcagcgacggcaactgccacctcctcaagaccatccacgtggcctctcacagccggaaggcctggcccgtgttcgagcacaacattctgacaagatgctccctccacctgggcaaccgcaggggcgtgttcctcccataccagtgcaacctgtcccacacaaagattctcctggagcccgagtctatgtctaaggtgaacctgaacggcgtgttcgacatgacaatgaagatttggaaggtgctccggtacgacgagacccggacacgttgcagaccttgcgagtgcggcggcaagcacattagaaaccagccagtgatgctcgacgtgacagaggagctgagacccgaccacctggtgctcgcctgcacacgcgccgagttcggctcttctgacgaggacaccgactgattaattaattccgcccctctccctcccccccccctaacgttactggccgaagccgcttggaataaggccggtgtgcgtttgtctatatgttattttccaccatattgccgtcttttggcaatgtgagggcccggaaacctggccctgtcttcttgacgagcattcctaggggtctttcccctctcgccaaaggaatgcaaggtctgttgaatgtcgtgaaggaagcagttcctctggaagcttcttgaagacaaacaacgtctgtagcgaccctttgcaggcagcggaaccccccacctggcgacaggtgcctctgcggccaaaagccacgtgtataagatacacctgcaaaggcggcacaaccccagtgccacgttgtgagttggatagttgtggaaagagtcaaatggctctcctcaagcgtattcaacaaggggctgaaggatgcccagaaggtaccccattgtatgggatctgatctggggcctcggtgcacatgctttacatgtgtttagtcgaggttaaaaaacgtctaggccccccgaaccacggggacgtggttttcctttgaaaaacacgatgataatatgagacacgaggtgctcgccgacaacctccctcctccatctcacttcgagcctcctacactgcacgagctgtacgacctcgacgtgaccgccccagaggaccctaacgaggaggccgtgtctcagattttccctgacagcgtgatgctcgccgtgcaggagggcattgacctgctcacattcccacccgcccccggctctccagagcctcctcacctgagcagacagcctgagcagccagagcagcgcgccctcggcccagtgtgccacgaggccggcttccctccatccgacgacgaggacgaggagggcgaggagttcgtgctggactacgtggagcaccctggccacgggtgccgctcctgccactaccacaggcggaacaccggcgaccccgacattatgtgctctctgtgctacatgcgcacatgcggcatgttcgtgtactctccagtgtccgagcctgagcccgagcctgagcctgagcccgagcccgccagaccaacacgcagaccaaagatggcccccgccattctgagacgacctacatctcctgtgtctagggagtgcaactctagcacagactcttgcgactctggcccttctaacacaccaccagagattcacccagtggtgccactctgcccaattaagccagtggccgtgagagtgggcggcaggcggcaggccgtggagtgcattgaggacctgctgaacgagcctggccagccactggacctgtcttgcaagcgcccaaggccttga(SEQ ID NO:3)
E1-Modified-3(简称E1-M3)：对E1A编码区和部分E1B55K编码区进行改造，与野生型序列比对同源性为93.4％。
atgcgccacatcatctgccacggcggcgtgatcaccgaggagatggccgccagcctgctggaccagctgatcgaggaggtgctggctgataacctgccacctccatcgcacttcgagccacccaccctgcacgagctgtacgatctggacgtgacggcccccgaggatcccaacgaggaggcggtgtcgcagatctttcccgacagcgtgatgctggcggtgcaggaggggatcgacctgctcacctttccgccggcgcccggcagcccggagccgcctcacctgtcccggcagcccgagcagccggagcagcgcgccctgggcccggtgagcatgccaaacctggtgccggaggtgatcgatcttacctgccacgcggctggctgtccacccagtaacgccgcggctaacgcgggtaaggcgtgtgtgtgcgcctgtgtggcgccccccgggcccggctgcaggtcctgagcctgagcccggaggagtacgggggcccccgctactacgtgttcgctctgctgtacgaggacctgtggcacgtgtgtctgcagtaagtgaagatcatgggcagcgggtaataaagcggcgggtttggcgtggtgatcttttttctgatctttacagtgctgtggtttaaggagttttgtatcgtgatctttctgaagggccctgtgagcgagcctgagcctgagcccgagccagagccggagcctgcccgccctacccgccgccctaagatggcgcctgctatcctgcgccgcccgacaagccctgtgagccgcgagtgcaacagcagcacggatagctgtgactccggccctagcaacacacctcctgagatccacccggtggtcccgctgtgccccatcaagccagtggccgtgcgcgtgggcgggcgccgccaggctgtggagtgtatcgaggacctgctgaacgagcctgggcagcctctggacctgagctgtaagcgccccaggccataaggtgtaaacctgtgattgcgtgtgtggttaacgcctttgtttgctgaatgagttgatgtaagtttaataaagggtgagataatgtttaacttgcatggcgtgttaaatggggcggggcttaaagggtatataatgcgccgtgggctaatcttggttacatctgacctcatggaggcttgggagtgtttggaagatttttctgctgtgcgtaacttgctggaacagagctctaacagtacctcttggttttggaggtttctgtggggctcatcccaggcaaagttagtctgcagaattaaggaggattacaagtgggaatttgaagagcttttgaaatcctgtggtgagctgtttgattctttgaatctgggtcaccaggcgcttttccaagagaaggtcatcaagactttggatttttccacaccggggcgcgctgcggctgctgttgcttttttgagttttataaaggataaatggagcgaagaaacccatctgagcggggggtacctgctggattttctggccatgcatctgtggagagcggttgtgagacacaagaatcgcctgctactgttgtcttccgtccgcccggcgataataccgacggaggagcagcagcagcagcaggaggaagccaggcggcggcggcaggagcagagcccatggaacccgagagccggcctggaccctcgggaatgaatgttgtacaggtggctgaactgtatccagaactgagacgcattttgacaattacagaggatgggcaggggctaaagggggtaaagagggagcggggggcttgtgaggctacagaggaggctaggaatctagcttttagcttaatgaccagacaccgtcctgagtgtattacttttcaacagatcaaggataattgcgctaatgagcttgatctgctggcgcagaagtattccatagagcagctgaccacttactggctgcagccaggggatgattttgaggaggctattagggtatatgcaaaggtggcacttaggccagattgcaagtacaagatcagcaaacttgtaaatatcaggaattgttgctacatttctgggaacggggccgaggtggagatagatacggaggatagggtggcctttagatgtagcatgataaatatgtggccgggggtgcttggcatggacggggtggttattatgaatgtaaggtttactggccccaattttagcggtacggttttcctggccaataccaaccttatcctacacggtgtaagcttctatgggtttaacaatacctgtgtggaagcctggaccgatgtaagggttcggggctgtgccttttactgctgctggaagggggtggtgtgtcgccccaaaagcagggcttcaattaagaaatgcctctttgaaaggtgtaccttgggtatcctgtctgagggtaactccagggtgcgccacaatgtggcctccgactgtggttgcttcatgctagtgaaaagcgtggctgtgattaagcataacatggtatgtggcaactgcgaggacagggcctctcagatgctgacctgctcggacggcaactgtcacctgctgaagaccattcacgtagccagccactctcgcaaggcctggccagtgtttgagcataacatactgacccgctgttccttgcatttgggtaacaggaggggggtgttcctaccttaccaatgcaatttgagtcacactaagatattgcttgagcccgagagcatgtccaaggtgaacctgaacggggtgtttgacatgaccatgaagatctggagggcgctgaggtgcgctaagacccgcaccaggtgcagaccctgcgcgtgtggcggtaaacatactaagagccagcctgtgatgctggctgtgaccgcggcgctgaggcccgcagcctgggcgctggcctgcacccgcgctaagtgtggctctaacgctaacgctaccgcctga(SEQ IDNO:4)
E1-Modified-4(简称E1-M4)：在整个E1编码区范围进行改造，与野生型序列比对同源性为85.3％。
atgcgccacatcatctgccacggcggcgtgatcaccgaggagatggccgccagcctgctggaccagctgatcgaggaggtgctggctgataacctgccacctccatcgcacttcgagccacccaccctgcacgagctgtacgatctggacgtgacggcccccgaggatcccaacgaggaggcggtgtcgcagatctttcccgacagcgtgatgctggcggtgcaggaggggatcgacctgctcacctttccgccggcgcccggcagcccggagccgcctcacctgtcccggcagcccgagcagccggagcagcgcgccctgggcccggtgagcatgccaaacctggtgccggaggtgatcgatcttacctgccacgaggctggctttccacccagtaacgccgcggctaacgcgggtaaggcgtgtgtgtgcgcctgtgtggcgccccccgggcccggctgcaggtcctgagcctgagcccggaggagtacgggggcccccgctactacgtgttcgctctgctgtacgaggacctgtggcacgtgtgtctgcagtaagtgaagatcatgggcagcgggtaataaagcggcgggtttggcgtggtgatcttttttctgatctttacagtgctgtggtttaaggagttttgtatcgtgatctttctgaagggccctgtgagcgagcctgagcctgagcccgagccagagccggagcctgcccgccctacccgccgccctaagatggcgcctgctatcctgcgccgcccgacaagccctgtgagccgcgagtgcaacagcagcacggatagctgtgactccggccctagcaacacacctcctgagatccacccggtggtcccgctgtgccccatcaagccagtggccgtgcgcgtgggcgggcgccgccaggctgtggagtgtatcgaggacctgctgaacgagcctgggcagcctctggacctgagctgtaagcgccccaggccataaggcgtgaacctgtaactgcgcgtgtggctcactcctctgttcgccgagtaagtggatgtgagcctgatcaagggcgagatcatgtttaacctgcacggcgtgctgaacggggcggggctgaaggggtacatcatgcgccgcgggctgatcctggtgacaagcgacctcatggaggcttgggagtgtctggaggattttagcgctgtgcgcaacctgctggagcagagcagcaacagcacttcgtggttctggaggttcctgtggggcagctcccaggccaagctggtctgccgcatcaaggaggattacaagtgggagtttgaggagctgctgaagtcctgtggcgagctgtttgatagcctgaacctgggccaccaggcgctgttccaggagaaggtcatcaagaccctggatttttccacaccggggcgcgctgcggcggcggttgcgttcctgagcttcataaaggataaatggagcgccgcaacccaagcgagaggggggtgccagctggcttcagcggacacgccagcgtggagagcggctgtgagacacaggagtcgcctgctaccgtggtcttccgcccgcccggcgataacaccgacggcggcgccgccgccgccgccggcggcagccaggcggcggcggccggcgccgagcccatggagcccgagagccggcctggcccctcgggcatgaacgtggtgcaggtggctgagctgtacccagagctgcgccgcatcctgacaatcacagaggatgggcaggggctgaagggggtgaagagggagcggggggcttgtgaggctacagaggaggctaggaatttggctttcagcctcatgacccgccaccgccctgagtgtatcacctttcagcagatcaaggataactgcgctaacgagctggatctgctggcgcagaagtactccatcgagcagctgaccacctactggctgcagccaggcgatgactttgaggaggctataagggtgtacgccaaggtggccctgaggccagattgcaagtacaagatcagcaagctggtgaacatcaggaactgttgctacatcagcgggaacggggccgaggtggagatcgatacggaggatagggtggcctttcgctgtagcatgatcaacatgtggccgggggtgctgggcatggacggggtggtgatcatgaacgtgaggtttaccggccccaactttagcggcacggtgttcctggccaacaccaacctgatcctgcacggcgtgagcttctacgggtttaacaacacctgtgtggaggcctggaccgatgtgagggtgcggggctgtgccttttactgctgctggaagggggtggtgtgtcgccccaagagcagggctagcatcaagaagtgcctctttgagaggtgtaccctgggcatcctgagcgagggcaactccagggtgcgccacaacgtggcctccgactgtggctgcttcatgctggtgaagagcgtggctgtgatcaagcacaacatggtgtgtggcaactgcgaggacagggccagccagatgctgacctgctcggacggcaactgtcacctgctgaagaccatccacgtggccagccacagccgcaaggcctggccagtgtttgagcacaacatcctgacccgctgttccctgcacctgggcaacaggaggggggtgttcctgccttaccagtgcaacctgagccacaccaagatcctgctggagcccgagagcatgtccaaggtgaacctgaacggggtgtttgacatgaccatgaagatctggagggcgctgaggtgcgctaagacccgcaccaggtgcagaccctgcgcgtgtggcggtaaacatactaagagccagcctgtgatgctggctgtgaccgcggcgctgaggcccgcagcctgggcgctggcctgcacccgcgctaagtgtggctctaacgctaacgctaccgcctga(SEQ IDNO:5)
E1-Modified-5(简称E1-M5)：与野生型序列比对同源性为96.3％。
atgagacatattatctgccacggaggtgttattaccgaagaaatggccgccagtcttttggaccagctgatcgaagaggtactggctgataatcttccacctcctagccattttgaaccacctacccttcacgaactgtatgatttagacgtgacggcccccgaagatcccaacgaggaggcggtttcgcagatttttcccgactctgtaatgttggcggtgcaggaagggattgacttactcacttttccgccggcgcccggttctccggagccgcctcacctttcccggcagcccgagcagccggagcagagagccttgggtccggtttctatgccaaaccttgtaccggaggtgatcgatcttacctgccacgcggctggctgtccacccagtaacgccgcggctaacgcgggtaaggcgtgtgtgtgcgcctgtgtggcgccccccgggcccggctgcaggtcctgagcctgagcccggaggagtacgggggcccccgctactacgtgttcgctctgctgtacgaggacctgtggcacgtgtgtctgcagtaagtgaagatcatgggcagcgggtaataaagcggcgggtttggcgtggtgatcttttttctgatctttacagtgctgtggtttaaggagttttgtatcgtgatctttctgaagggccctgtgagcgagcctgagcctgagcccgagccagagccggagcctgcccgccctacccgccgccctaagatggcgcctgctatcctgcgccgcccgacaagccctgtgagccgcgagtgcaacagcagcacggatagctgtgactccggccctagcaacacacctcctgagatccacccggtggtcccgctgtgccccatcaagccagtggccgtgcgcgtgggcgggcgccgccaggctgtggagtgtatcgaggacctgctgaacgagcctgggcagcctctggacctgagctgtaagcgccccaggccataaggtgtaaacctgtgattgcgtgtgtggttaacgcctttgtttgctgaatgagttgatgtaagtttaataaagggtgagataatgtttaacttgcatggcgtgttaaatggggcggggcttaaagggtatataatgcgccgtgggctaatcttggttacatctgacctcatggaggcttgggagtgtttggaagatttttctgctgtgcgtaacttgctggaacagagctctaacagtacctcttggttttggaggtttctgtggggctcatcccaggcaaagttagtctgcagaattaaggaggattacaagtgggaatttgaagagcttttgaaatcctgtggtgagctgtttgattctttgaatctgggtcaccaggcgcttttccaagagaaggtcatcaagactttggatttttccacaccggggcgcgctgcggctgctgttgcttttttgagttttataaaggataaatggagcgaagaaacccatctgagcggggggtacctgctggattttctggccatgcatctgtggagagcggttgtgagacacaagaatcgcctgctactgttgtcttccgtccgcccggcgataataccgacggaggagcagcagcagcagcaggaggaagccaggcggcggcggcaggagcagagcccatggaacccgagagccggcctggaccctcgggaatgaatgttgtacaggtggctgaactgtatccagaactgagacgcattttgacaattacagaggatgggcaggggctaaagggggtaaagagggagcggggggcttgtgaggctacagaggaggctaggaatctagcttttagcttaatgaccagacaccgtcctgagtgtattacttttcaacagatcaaggataattgcgctaatgagcttgatctgctggcgcagaagtattccatagagcagctgaccacttactggctgcagccaggggatgattttgaggaggctattagggtatatgcaaaggtggcacttaggccagattgcaagtacaagatcagcaaacttgtaaatatcaggaattgttgctacatttctgggaacggggccgaggtggagatagatacggaggatagggtggcctttagatgtagcatgataaatatgtggccgggggtgcttggcatggacggggtggttattatgaatgtaaggtttactggccccaattttagcggtacggttttcctggccaataccaaccttatcctacacggtgtaagcttctatgggtttaacaatacctgtgtggaagcctggaccgatgtaagggttcggggctgtgccttttactgctgctggaagggggtggtgtgtcgccccaaaagcagggcttcaattaagaaatgcctctttgaaaggtgtaccttgggtatcctgtctgagggtaactccagggtgcgccacaatgtggcctccgactgtggttgcttcatgctagtgaaaagcgtggctgtgattaagcataacatggtatgtggcaactgcgaggacagggcctctcagatgctgacctgctcggacggcaactgtcacctgctgaagaccattcacgtagccagccactctcgcaaggcctggccagtgtttgagcataacatactgacccgctgttccttgcatttgggtaacaggaggggggtgttcctaccttaccaatgcaatttgagtcacactaagatattgcttgagcccgagagcatgtccaaggtgaacctgaacggggtgtttgacatgaccatgaagatctggaaggtgctgaggtacgatgagacccgcaccaggtgcagaccctgcgagtgtggcggtaaacatattaggaaccagcctgtgatgctggatgtgaccgaggagctgaggcccgatcacttggtgctggcctgcacccgcgctgagtttggctctagcgatgaagatacagattga(SEQ IDNO:6)
E1-Modified-6(简称E1-M6)：与野生型序列比对同源性为93.6％。
atgagacatattatctgccacggaggtgttattaccgaagaaatggccgccagtcttttggaccagctgatcgaagaggtactggctgataatcttccacctcctagccattttgaaccacctacccttcacgaactgtatgatttagacgtgacggcccccgaagatcccaacgaggaggcggtttcgcagatttttcccgactctgtaatgttggcggtgcaggaagggattgacttactcacttttccgccggcgcccggttctccggagccgcctcacctttcccggcagcccgagcagccggagcagagagccttgggtccggtttctatgccaaaccttgtaccggaggtgatcgatcttacctgccacgaggctggctttccacccagtgacgacgaggatgaagagggtgaggagtttgtgttagattatgtggagcaccccgggcacggttgcaggtcttgtcattatcaccggaggaatacgggggacccagatattatgtgttcgctttgctatatgaggacctgtggcatgtttgtctacagtaagtgaaaattatgggcagtgggtgatagagtggtgggtttggtgtggtaattttttttttaatttttacagttttgtggtttaaagaattttgtattgtgatttttttaaaaggtcctgtgtctgaacctgagcctgagcccgagccagaaccggagcctgcaagacctacccgccgtcctaaaatggcgcctgctatcctgagacgcccgacatcacctgtgtctagagaatgcaatagtagtacggatagctgtgactccggtccttctaacacacctcctgagatacacccggtggtcccgctgtgccccattaaaccagttgccgtgagagttggtgggcgtcgccaggctgtggaatgtatcgaggacttgcttaacgagcctgggcaacctttggacttgagctgtaaacgccccaggccataaggtgtaaacctgtgattgcgtgtgtggttaacgcctttgtttgctgaatgagttgatgtaagtttaataaagggtgagataatgtttaacttgcatggcgtgttaaatggggcggggcttaaagggtatataatgcgccgtgggctaatcttggttacatctgacctcatggaggcttgggagtgtttggaagatttttctgctgtgcgtaacttgctggaacagagctctaacagtacctcttggttttggaggtttctgtggggctcatcccaggcaaagttagtctgcagaattaaggaggattacaagtgggaatttgaagagcttttgaaatcctgtggtgagctgtttgattctttgaatctgggtcaccaggcgcttttccaagagaaggtcatcaagactttggatttttccacaccggggcgcgctgcggctgctgttgcttttttgagttttataaaggataaatggagcgccgcaacccaagcgagaggggggtgccagctggcttcagcggacacgccagcgtggagagcggctgtgagacacaggagtcgcctgctaccgtggtcttccgcccgcccggcgataacaccgacggcggcgccgccgccgccgccggcggcagccaggcggcggcggccggcgccgagcccatggagcccgagagccggcctggcccctcgggcatgaacgtggtgcaggtggctgagctgtacccagagctgcgccgcatcctgacaatcacagaggatgggcaggggctgaagggggtgaagagggagcggggggcttgtgaggctacagaggaggctaggaatttggctttcagcctcatgacccgccaccgccctgagtgtatcacctttcagcagatcaaggataactgcgctaacgagctggatctgctggcgcagaagtactccatcgagcagctgaccacctactggctgcagccaggcgatgactttgaggaggctataagggtgtacgccaaggtggccctgaggccagattgcaagtacaagatcagcaagctggtgaacatcaggaactgttgctacatcagcgggaacggggccgaggtggagatcgatacggaggatagggtggcctttcgctgtagcatgatcaacatgtggccgggggtgctgggcatggacggggtggtgatcatgaacgtgaggtttaccggccccaactttagcggcacggtgttcctggccaacaccaacctgatcctgcacggcgtgagcttctacgggtttaacaacacctgtgtggaggcctggaccgatgtgagggtgcggggctgtgccttttactgctgctggaagggggtggtgtgtcgccccaagagcagggctagcatcaagaagtgcctctttgagaggtgtaccctgggcatcctgagcgagggcaactccagggtgcgccacaacgtggcctccgactgtggctgcttcatgctggtgaagagcgtggctgtgatcaagcacaacatggtgtgtggcaactgcgaggacagggccagccagatgctgacctgctcggacggcaactgtcacctgctgaagaccatccacgtggccagccacagccgcaaggcctggccagtgtttgagcacaacatcctgacccgctgttccctgcacctgggcaacaggaggggggtgttcctgccttaccagtgcaacctgagccacaccaagatcctgctggagcccgagagcatgtccaaggtgaacctgaacggggtgtttgacatgaccatgaagatttggaaggtgctgagatacgacgagacccggacaagatgcaggccatgcgagtgcggcggcaagcacattagaaaccagccagtgatgctcgacgtgacagaggaattacgccctgaccacctcgtgctggcctgcacacgcgccgagttcggctctagcgacgaggacacagactga(SEQ IDNO:7)
本文中mPGK启动子的序列为：
gggtaggggaggcgcttttcccaaggcagtctggagcatgcgctttagcagccccgctgggcacttggcgctacacaagtggcctctggcctcgcacacattccacatccaccggtaggcgccaaccggctccgttctttggtggccccttcgcgccaccttctactcctcccctagtcaggaagttcccccccgccccgcagctcgcgtcgtgcaggacgtgacaaatggaagtagcacgtctcactagtctcgtgcagatggacagcaccgctgagcaatggaagcgggtaggcctttggggcagcggccaatagcagctttgctccttcgctttctgggctcagaggctgggaaggggtgggtccgggggcgggctcaggggcgggctcaggggcggggcgggcgcccgaaggtcctccggaggcccggcattctgcacgcttcaaaagcgcacgtctgccgcgctgttctcctcttcctcatctccgggcctttcg(SEQ ID NO:8)
本文中SV40启动子的序列为：
gtgtgtcagttagggtgtggaaagtccccaggctccccagcaggcagaagtatgcaaagcatgcatctcaattagtcagcaaccaggtgtggaaagtccccaggctccccagcaggcagaagtatgcaaagcatgcatctcaattagtcagcaaccatagtcccgcccctaactccgcccatcccgcccctaactccgcccagttccgcccattctccgccccatggctgactaattttttttatttatgcagaggccgaggccgcctcggcctctgagctattccagaagtagtgaggaggcttttttggaggcctaggcttttgcaaa(SEQ ID NO:9)
以上片段均可通过基因合成获得。
Donor质粒的作用是与pCRISPR/Cas9-T2质粒共转染靶细胞，作为DNA双链断裂后同源修复的模板，将序列修饰后的腺病毒E1区序列通过同源修复的方式定点插入到靶细胞基因组中的AAVS1-T2位点，使靶细胞稳定表达插入的E1区基因，为腺病毒的复制创造有利条件，同时避免同源重组产生带有野生型E1区的腺病毒。
2.1从NCBI上查询人类基因组AAVS1-T2位点上游和下游各800bp的基因组序列(参见下文)作为Donor载体上的同源臂，分别置于待敲入基因的上下游，为靶细胞内Cas9切断DNA后的同源修复提供同源片段；根据野生型腺病毒E1区序列设计插入目的序列；再在目的序列下游添加Puromycin抗性筛选标记基因；在Puromycin抗性筛选标记基因的两端添加Cre/LoxP重组酶系统识别位点loxP，用于后期去除重组细胞株基因组中的Puromycin抗性基因。
基因组中AAVS1-T2位点上游序列为：
cattctctcccctgggcctgtgccgctttctgtctgcagcttgtggcctgggtcacctctacggctggcccagatccttccctgccgcctccttcaggttccgtcttcctccactccctcttccccttgctctctgctgtgttgctgcccaaggatgctctttccggagcacttccttctcggcgctgcaccacgtgatgtcctctgagcggatcctccccgtgtctgggtcctctccgggcatctctcctccctcacccaaccccatgccgtcttcactcgctgggttcccttttccttctccttctggggcctgtgccatctctcgtttcttaggatggccttctccgacggatgtctcccttgcgtcccgcctccccttcttgtaggcctgcatcatcaccgtttttctggacaaccccaaagtaccccgtctccctggctttagccacctctccatcctcttgctttctttgcctggacaccccgttctcctgtggattcgggtcacctctcactcctttcatttgggcagctcccctaccccccttacctctctagtctgtgctagctcttccagccccctgtcatggcatcttccaggggtccgagagctcagctagtcttcttcctccaacccgggcccctatgtccacttcaggacagcatgtttgctgcctccagggatcctgtgtccccgagctgggaccaccttatattcccagggccggttaatgtggctctggttctgggtacttttatctgtcccctccaccccacagtggggccactagggacag(SEQ ID NO:10)
基因组中AAVS1-T2位点下游序列为：
gattggtgacagaaaagccccatccttaggcctcctccttcctagtctcctgatattgggtctaacccccacctcctgttaggcagattccttatctggtgacacacccccatttcctggagccatctctctccttgccagaacctctaaggtttgcttacgatggagccagagaggatcctgggagggagagcttggcagggggtgggagggaagggggggatgcgtgacctgcccggttctcagtggccaccctgcgctaccctctcccagaacctgagctgctctgacgcggccgtctggtgcgtttcactgatcctggtgctgcagcttccttacacttcccaagaggagaagcagtttggaaaaacaaaatcagaataagttggtcctgagttctaactttggctcttcacctttctagtccccaatttatattgttcctccgtgcgtcagttttacctgtgagataaggccagtagccagccccgtcctggcagggctgtggtgaggaggggggtgtccgtgtggaaaactccctttgtgagaatggtgcgtcctaggtgttcaccaggtcgtggccgcctctactccctttctctttctccatccttctttccttaaagagtccccagtgctatctgggacatattcctccgcccagagcagggtcccgcttccctaaggccctgctctgggcttctgggtttgagtccttggcaagcccaggagaggcgctcaggcttccctgtcccccttcctcgtccaccatctcatgcccctggctctcctgccccttc(SEQ ID NO:11)
2.2直接合成所需DNA片段(上海捷瑞生物工程有限公司)，然后插入到pMD19-T载体上(Donor-SV40插入位点是SmaI，Donor-mPGK插入位点是MluI/XhoI)，得到重组质粒Donor-mPGK、Donor-SV40。
2.3将上述重组质粒转化DH5a，挑取单克隆，鉴定质粒，制备无内毒素质粒。构建成功的供体模板序列Donor-mPGK(SEQ ID NO:27)和Donor-SV40参见序列表(SEQ ID NO:28)。
实施例2稳定细胞系的第一轮筛选和鉴定
将实施例1获得的质粒转染靶细胞，在靶细胞基因组中插入改造后的E1基因，筛选稳定表达E1A蛋白和E1B蛋白的单克隆细胞株。
现有技术中溶瘤腺病毒易感的细胞系均可作为靶细胞系进行基因编辑，例如A549、A375、HeLa、SW620、22RV1、MDA-MB-435S、ES-2、HCC1806细胞等人源细胞。本实施例使用HeLa S3(ATCC CCL-2.2)细胞系。
1.转染和抗性筛选
使用Effectene转染试剂(QIAGEN：301425)共转1μg pCRISPR/Cas9-T2质粒和4μgDonor质粒至4*105HeLa S3细胞。转染后48h，使用含2.5μg/ml puromycin及10％FBS(Sunrise)的高糖DMEM(Gibco)完全培养基筛选具有puromycin抗性的HeLa S3克隆，持续筛选10天左右后挑选单克隆细胞。
2.筛选单克隆细胞株
使用有限稀释法挑选和培养步骤1抗性筛选后的单克隆细胞株。具体方式如下：消化步骤1筛选后的抗性克隆，将细胞悬液稀释至10cells/ml，向稀释后的细胞悬液中加入终浓度0.25μg/ml的Puromycin以保持选择压力，将细胞悬液以100μl/well接种至6块96孔板中。每48h观察细胞状态，并标记只有单一细胞群落的孔。每96h换液，至标记孔生长至有明显接触抑制时传代，扩大至48孔板并保持每48h观察细胞密度，96h换液。长满后扩大至24孔板、12孔板、6孔板，直至6cm培养皿。
3.鉴定阳性细胞株
3.1PCR鉴定插入片段
提取上述单克隆细胞株基因组，PCR扩增AAVS1-T2位点DNA片段，检测插入基因是否正确存在于细胞基因组中指定插入位点。具体方式如下：
胰酶消化上步6cm培养皿中细胞，计数，取出约106个细胞进行离心，重悬于200μl培养基中，剩余细胞转移至10cm培养皿中扩大培养。
使用磁珠法基因组提取试剂盒提取上述细胞样品的基因组。
使用PCR鉴定样品基因组中是否插入目的基因片段，体系如下：
表2PCR体系
| Taq Mix(翊圣) | 25μl |
| 上下游引物各 | 2.5μl |
| DNA提取物 | 20μl |
| 总体积 | 50μl |
表3引物
PCR反应程序如表4：
PCR实验结果如图3和图4所示。
注：HeLa S3-mPGK-1代表Donor-mPGK稳转入HeLa S3细胞后第一轮单克隆挑选中的1号细胞克隆；HeLa S3-SV40-1代表Donor-SV40稳转入HeLa S3细胞后第一轮单克隆挑选中的1号细胞克隆，依此类推。
结论：由图3和图4可知，在挑选的所有单克隆中，均成功插入了目的基因片段。
使用PCR鉴定样品基因组中是否插入完整目的基因片段
使用提取的基因组作为模板，用50μl Taq酶体系扩增其中插入基因片段，进行琼脂糖凝胶成像，切胶回收目的片段并送测序。引物信息如下：
表5引物
电泳结果如图5所示。
结论：从图5可知，HeLa S3-mPGK-4和HeLa S3-SV40-1、HeLa S3-SV40-2、HeLa S3-SV40-3均能扩增出目的片段。
3.2 WB检测E1A蛋白的表达
取HeLa S3-SV40-1、HeLa S3-SV40-22、HeLa S3-SV40-3、HeLa S3-mPGK-4和HeLaS3细胞，以每孔5*105个细胞铺至6孔板。
24h后使用RIPA裂解液裂解细胞，收取蛋白，BCA法测定各样品总蛋白浓度，使用5×SDS缓冲液处理各样品，100℃煮沸10min。
各样品取15μg进行SDS-PAGE电泳，转膜，WB检测E1A的表达，结果如图6所示。
结论：HeLa S3-SV40-1、HeLa S3-SV40-2、HeLa S3-SV40-3和HeLa S3-mPGK-4均能表达E1A蛋白，HeLa S3本底不表达。说明插入的目的基因均能正常表达。
实施例3细胞株的单细胞病毒产量测试和第二轮筛选
检测实施例2筛选获得的各单克隆细胞株的单细胞病毒产量(单产)
1.单细胞病毒产量(单产)测试
取HeLa S3、HeLa S3-SV40-1、HeLa S3-SV40-2、HeLa S3-mPGK-4和HEK-293A细胞，以每个T175方瓶1.6*107个细胞进行接种。
24h后以500vp/cell的感染比例接种测试病毒YSCH-01。
60h后收获上述病毒样品，反复冻融3次后以2000rpm离心5min，取上清，使用0.22μm针头滤器进行过滤。
HPLC(岛津，LC-2030C)上机检测各样品的病毒颗粒浓度。
使用腺病毒滴度检测试剂盒(Cell Biolabs，VPK-109)检测各样品的病毒滴度。结果如图7所示。
结论：由图7可知，HeLa S3-SV40-1、HeLa S3-SV40-2和HeLa S3-mPGK-4的病毒单产都显著高于HeLa S3对照组，且高于常规腺病毒生产使用的HEK-293A细胞，说明各单克隆细胞株中插入的目的基因均能正常发挥功能，促进腺病毒的复制。
2.HeLa S3-mPGK细胞株第二轮筛选及鉴定
对HeLa S3-mPGK-4细胞株进行第二轮单克隆筛选，参照实施例2进行有限稀释法挑选单克隆细胞株，共5株，待细胞长至6cmdish后对细胞命名HeLa S3-mPGK-1A、HeLa S3-mPGK-1B、HeLa S3-mPGK-1C、HeLa S3-mPGK-1D、HeLa S3-mPGK-1E。HeLa S3-mPGK-1A表示HeLa S3-mPGK-4细胞第二轮单克隆筛选时选择的1号，HeLa S3-mPGK-1B表示HeLa S3-mPGK-4细胞第二轮单克隆筛选时选择的2号，以此类推。提取第二轮单克隆细胞株的基因组进行PCR鉴定，结果如图8所示。
结论：由图8可知，HeLa S3-mPGK第二轮单克隆挑选的5株均扩增出与目的片段大小相符合的片段。
实施例4 HeLa S3-SV40和HeLa S3-mPGK细胞株的单产比较
按照80％密度铺细胞，其中HeLa S3和HEK 293铺3*106细胞/dish；HeLa S3-SV40-1、HeLa S3-SV40-2、HeLa S3-SV40-3铺4*106细胞/dish；HeLa S3-mPGK-1A、HeLa S3-mPGK-1B、HeLa S3-mPGK-1E铺3.8*106细胞/dish。
第二天以600vp/cell转染YSCH-01病毒。
约48h后收获病毒，反复冻融3次后2000rpm离心5min收上清液，使用0.22μm针头滤器进行过滤。
HPLC上机测各病毒样品vp，选择单产结果最好的2株细胞，分别是HeLa S3-SV40-3和HeLa S3-mPGK-1E细胞(详细单产结果见表6)。
表6各细胞株的病毒产量结果
结论：经病毒扩增能力验证，改造后细胞株的病毒扩增能力与出发细胞株HeLa S3在同一数量级。其中，HeLa S3-mPGK-1E和HeLa S3-SV40-3这2株细胞病毒扩增能力较佳，后续选用这2株细胞敲除Puromycin抗性基因。
实施例5 IRES区改造后细胞株的挑选及单产毒比较
按照上述实施例方法，采用IRES-Donor E1区(SEQ ID NO:3)改造细胞株。
筛选获得单克隆后，PCR检测单克隆细胞的E1A的mRNA相对表达水平，结果如图9所示。可以看出，HeLa S3与其他HeLa S3-IRES的单克隆细胞间存在着显著差异。
IRES改造细胞单产毒比较，按照前述实施例进行操作。
数据分析结果如表7所示。
表7IRES改造细胞单产毒比较结果
结论：在A组和B组中HeLa S3-IRES的几株单克隆细胞产毒能力没有另外2种改造细胞好，在之后的验证中不对此种改造的细胞株进行验证
实施例6敲除改造后细胞株中的Puromycin抗性基因
转染Cre/LoxP质粒敲除各单克隆细胞株中的Puromycin抗性基因，Cre/LoxP质粒
在六孔板中，HeLa S3-SV40-3和HeLa S3-mPGK-1E细胞各铺1孔，5.5×105个细胞。使用Effectene转染试剂(QIAGEN：301425)转染0.4μg Cre/LoxP质粒至上述孔中，用于敲除Puromycin抗性基因。
转染48h后，进行有限稀释法挑选单克隆细胞。具体为：消化细胞，将细胞悬液稀释至4cells/ml，然后以100μl/well铺板6块96孔板。每48h观察细胞状态，并标记只有单一细胞群落的孔。每96h换液，至标记孔生长至有明显接触抑制时传代扩大至48孔板，保持每48h观察细胞密度，96h换液，长满后扩大至24孔板。
第一轮Puro抗性筛选：将24孔板中的细胞一分为二，均分至2个孔中，一孔中加入2.5μg/ml的Puro抗性，另一孔不加。观察加入Puro抗性的孔中细胞是否死亡，若死亡则说明Puro抗性基因被成功敲除，待对应不加Puro抗性的孔中的细胞长满，传代至12孔板中，然后传代至6孔板中，再扩大至6cm dish。(经Puro杀伤筛选后得到的细胞命名为HeLa SV40-3-1A等，其中HeLa SV40-3-1表示HeLa SV40-3细胞敲除Puromycin抗性基因后第1轮单克隆，“A”表示细胞扩大到6孔板时的排序，即第1个扩大至6cm dish的为HeLa SV40-3-1A，第2个扩大至6cm dish的为HeLa SV40-3-1B)。
消化上述6cm dish中的细胞，计数，取出约106个细胞进行离心，重悬于200μl培养基中，剩余细胞接种至10cm dish中扩大培养。
使用磁珠法基因组提取试剂盒提取细胞样品基因组。
使用PCR鉴定样品基因组中是否敲除Puromycin抗性基因。
表8 PCR引物
实验结果如图10A、10B所示。
结论：由图10可知，成功敲除Puromycin抗性基因的单克隆细胞有：HeLa S3-SV40-3-1B；HeLa S3-SV40-3-1C；HeLa S3-SV40-3-1E；HeLa S3-SV40-3-1G；HeLa S3-SV40-3-1H；HeLa S3-SV40-3-1I；HeLa S3-SV40-3-1J；HeLa S3-SV40-3-1K；HeLa S3-SV40-3-1M；HeLaS3-SV40-3-1O和HeLa S3-mPGK-1E-1A；HeLa S3-mPGK-1E-1B。
实施例7检测各细胞株的病毒产量
使用敲除Puromycin抗性基因后的单克隆细胞进行病毒扩增测试，选取扩增结果较好的细胞株进行后期实验。
1.检测细胞株对复制型病毒的生产能力
3*106个细胞每10cm dish铺HeLa S3和HEK 293细胞；4*106个细胞每10cm dish 铺HeLa S3-SV40-3-1B、HeLa S3-SV40-3-1C、HeLa S3-SV40-3-1E、HeLa S3-SV40-3-1G、HeLaS3-SV40-3-1H、HeLa S3-SV40-3-1I、HeLa S3-SV40-3-1J、HeLa S3-SV40-3-1K、HeLa S3-SV40-3-1M、HeLa S3-SV40-3-1O细胞；3.8*106个细胞每10cm dish铺HeLa S3-mPGK-1E-1A、HeLa S3-mPGK-1E-1B。其中每个细胞铺2盘。
第二天取其中1盘10cm dish细胞消化计数，向另一盘细胞中以600vp/cell转染YSCH-01病毒。收集病毒进行vp检测，结果见表9。
表9细胞株包装病毒的产量
| 细胞系 | 总产量(VP) | 单产(VP/cell) |
| HEK 293 | 1.21E+11 | 3.71E+04 |
| HeLa S3 | 1.19E+11 | 2.42E+04 |
| HeLa S3-SV40-3-1C | 3.11E+11 | 3.29E+04 |
| HeLa S3-SV40-3-1E | 1.44E+11 | 1.81E+04 |
| HeLa S3-SV40-3-1G | 2.04E+11 | 2.39E+04 |
| HeLa S3-SV40-3-1H | 2.86E+11 | 2.55E+04 |
| HeLa S3-SV40-3-1I | 1.24E+11 | 1.58E+04 |
| HeLa S3-SV40-3-1J | 1.75E+11 | 1.88E+04 |
| HeLa S3-SV40-3-1K | 1.66E+11 | 2.46E+04 |
| HeLa S3-SV40-3-1M | 2.25E+11 | 2.34E+04 |
| HeLa S3-SV40-3-1O | 1.06E+11 | 1.13E+04 |
| HeLa S3-mPGK-1E-1A | 2.53E+11 | 5.05E+04 |
| HeLa S3-mPGK-1E-1B | 3.35E+11 | 7.40E+04 |
结论：经病毒扩增能力验证，改造后细胞株的病毒扩增能力与出发细胞株HeLa S3在同一数量级。其中，HeLa S3-SV40-3-1C和HeLa S3-mPGK-1E-1B的产量最高，因此选用HeLa S3-SV40-3-1C和HeLa S3-mPGK-1E-1B细胞进行puromycin敲除后第二轮单克隆挑选。
2.检测基因组中的插入片段
进行PCR扩增，检测各样品基因组中插入基因片段，结果如图11A-D所示。
表10 PCR引物
结论：HeLa S3-SV40-3-1C细胞成功敲除Puromycin抗性基因，且敲除后插入目的序列的位置和长度均符合预期。HeLa S3-mPGK-1E-1A和HeLa S3-mPGK-1E-1B扩增出目的条带，还存在一些杂带，需进行第二次单克隆挑选。
实施例8对HeLa S3-SV40-3-1C和HeLa S3-mPGK-1E-1B细胞进行第二轮单克隆挑选
第二轮Puromycin抗性基因敲除后单克隆筛选：消化细胞，将细胞悬液稀释至4cells/ml，将细胞悬液100μl/well铺板3块96孔板。每48小时观察细胞状态，并标记只有单一细胞群落的孔。每96小时换液，至标记孔生长至有明显接触抑制时传代扩大至48孔板并保持每48小时观察细胞密度，96小时换液。长满后扩大至24孔板，12孔板中，然后6孔板以此类推扩大至6cm dish。(待细胞扩大至6cm dish后命名为HeLa S3-SV40-3-1C-2A等，表明细胞是从第一轮Purok抗性基因敲除后的HeLa S3-SV40-3-1C单克隆细胞中进行第二轮单克隆筛选的第1个长至6cm dish的细胞)
消化上述步骤中6cm dish中细胞，细胞计数，取出约106个细胞离心，重悬于200μl体积PBS/培养基中，剩余细胞扩大培养至10cm dish中扩大培养。
按照底面积的80％铺细胞，每个细胞铺2个10cm dish，第二天待细胞稳定后取其中一盘进行计数。将计数后的细胞接种病毒，其中HEK 293和HeLa S3细胞按照600vp/cell转染YSCH-01病毒，其余细胞按照300vp/cell转染YSCH-01病毒。
表11第二轮单克隆细胞株单产结果
| 细胞系 | 总产量(VP) | 单产(VP/cell) |
| HEK 293 | 2.03E+10 | 4.07E+04 |
| HeLa S3 | 1.74E+10 | 2.53E+04 |
| HeLa S3-SV40-3-1C-2A | 2.46E+11 | 2.55E+04 |
| HeLa S3-SV40-3-1C-2B | 3.26E+11 | 3.97E+04 |
| HeLa S3-SV40-3-1C-2C | 1.27E+11 | 1.35E+04 |
| HeLa S3-SV40-3-1C-2D | 2.19E+11 | 3.65E+04 |
| HeLa S3-SV40-3-1C-2E | 2.95E+11 | 3.28E+04 |
| HeLa S3-SV40-3-1C-2G | 4.84E+11 | 6.11E+04 |
| HeLa S3-SV40-3-1C-2H | 3.66E+11 | 3.32E+04 |
| HeLa S3-SV40-3-1C-2I | 2.74E+11 | 3.57E+04 |
| HeLa S3-SV40-3-1C-2J | 4.82E+11 | 4.43E+04 |
| HeLa S3-SV40-3-1C-2K | 1.44E+11 | 4.95E+04 |
| HeLa S3-mPGK-1E-1B-2A | 3.63E+10 | 5.38E+04 |
| HeLa S3-mPGK-1E-1B-2B | 3.47E+10 | 5.47E+04 |
| HeLa S3-mPGK-1E-1B-2C | 2.86E+10 | 3.52E+04 |
| HeLa S3-mPGK-1E-1B-2D | 5.10E+10 | 9.51E+04 |
结论：经病毒扩增能力验证，改造后细胞株的病毒扩增能力与出发细胞株HeLa S3在同一数量级。其中，HeLa S3-SV40-3-1C-2G和HeLa S3-mPGK-1E-1B-2D细胞的产毒效果最佳。
使用组织/细胞基因组提取试剂盒提取细胞中的基因组，进行PCR扩增样品基因组中插入基因片段，结果如图12-14所示。
表12 PCR扩增引物
结论：HeLa S3-SV40-3-1C-2G、HeLa S3-SV40-3-1C-2J细胞不仅成功敲除Puromycin抗性基因，且插入序列的位点和长度与预期相符，为纯合子细胞。但是HeLa S3-mPGK-1E-1B-2A、HeLa S3-mPGK-1E-1B-2B、HeLa S3-mPGK-1E-1B-2C、HeLa S3-mPGK-1E-1B-2D细胞虽然成功敲除Puromycin抗性基因且插入序列的位点和长度与预期相符，但是这2个细胞是杂合子细胞。
实施例9检测单克隆细胞系的病毒包装能力
使用LIP3000转染试剂(赛默飞：L3000-015)转染0.5μg经PacI(NEB：R0547L)酶切鉴定成功的pBXYA07-U2-EGFP质粒至10万HeLa S3-SV40-3-1B细胞。(注：由于挑单克隆和包毒时间都比较久，因此使用第一轮单克隆的细胞进行包毒验证。)
经显微镜观察，直到所有细胞发荧光或者细胞出现病变后进行收毒，此时成功包装出OncoMul-V2-EGFP病毒。
验证病毒包装是否成功，3*106个细胞每10cm dish铺HEK 293细胞(ATCC：CRL-1573)、HeLa S3细胞(ATCC CCL-2.2)，4*106个细胞每10cm dish铺HeLa S3-SV40-3-1C-2G细胞，其中每个细胞铺1盘。均加入400μl病变的细胞。待细胞病变后进行收毒。HPLC上机测15.5中的各个样品。
表13改造细胞包装、扩增病毒结果
| 细胞系 | 病毒浓度(VP/mL) | 总产量(VP) |
| HEK 293 | 2.60E+10 | 6.37E+11 |
| HeLa S3 | 1.70E+10 | 4.28E+11 |
| HeLa S3-SV40-3-1C-2G | 1.00E+10 | 2.60E+11 |
结论：由表13可知，经Puromycin抗性基因敲除后的改造细胞能够包装出病毒，再次表明构建成功。
实施例10细胞连续扩增病毒后野生型病毒的鉴定
将实施例9获得的细胞系用于病毒的扩增，扩增不同代数后，检测收获的病毒中野生型病毒的含量。
每个T75方瓶铺3*106个HeLa S3-Mock、HEK 293细胞，每个T75方瓶铺6*106个HeLaS3-SV40-3-1C-2G细胞，其中每个细胞铺2个方瓶，1个用于计数，另1个用于接种病毒。
HEK 293细胞中加入实施例9中使用HEK 293细胞扩增的病毒，其他细胞加入实施例9中使用HeLa S3-SV40-3-1C-2G细胞扩增的病毒，均按照400vp/cell接毒，进行第2代病毒扩增。然后照此连续扩增10代病毒，在第4代产毒时，HeLa S3-SV40-3-1C-2G铺3个T75方瓶，接毒时1个用于细胞计数，1个加HeLa S3-SV40-3-1C-2G细胞第3次扩增的病毒，最后1个加HEK 293细胞第3次扩增的病毒，均按照400vp/cell接毒。收获病毒后进行vp检测。第5代和第10代病毒的扩增结果见表14。实验结果如图15所示。
表14第5代和第10代病毒的扩增结果
注：经HEK 293传代表示在第4代病毒扩增时HeLa S3-SV40-3-1C-2G细胞加入的毒种为HEK 293细胞第3代产生的病毒。
提取第10代病毒的基因组，进行qPCR定量包含野生型E1区序列的病毒，引物见表15，加样体系见表16，扩增程序见表17，标品稀释见表18。
表15包含野生型E1区序列的病毒定量检测引物
表16野生型腺病毒定量检测qPCR加样表
表17qPCR扩增程序
表18野生型腺病毒定量检测标准品稀释表
统计结果如图15所示。由图15可知，以改造细胞包装出的OncoMul-V2-EGFP病毒为毒种，在HEK293细胞中连续扩增10代后会出现明显的野生型腺病毒，显著影响了重组腺病毒的质量；在HEK293细胞中连续扩增3代后再在HeLa S3-SV40-3-1C-2G细胞连续扩增7代，同样会出现明显的野生型腺病毒，甚至高于在HEK293细胞中连续扩增10代的量；相反地，在HeLa S3、HeLa S3-SV40-3-1C-2G细胞中连续扩增10代均检测不到野生型腺病毒，说明在HeLa S3、HeLa S3-SV40-3-1C-2G细胞中不会重组产生野生型腺病毒，表现出更好的安全性。
实施例11复制缺陷型腺病毒的包装、扩增
以Ad-EGFP为例，检测本发明构建的细胞系对复制缺陷型腺病毒的包装及扩增。
HEK 293、HeLa S3、HeLa S3-SV40-3-1C-2G进行铺6孔板，其中HEK 293、HeLa S3每孔铺2*105细胞，HeLa S3-SV40-3-1C-2G每孔铺4*105。
各孔细胞均经PEI转染试剂转染1μg经PacI酶切的非复制型腺病毒包装质粒pAd-EGFP。
转染2天后在荧光显微镜下观察，各孔均有荧光。转染7天后HeLa S3细胞生长过量且没有观察到荧光变多，HeLa S3-SV40-3-1C-2G虽然细胞生长变多，但荧光也在增加。此时HEK 293细胞已经出现病变，收集病毒，其余2个细胞继续培养，直至病变收毒。
转染23天后HeLa S3-SV40-3-1C-2G细胞出现病变，且荧光强度高。而HeLa S3由于细胞生长过多而脱落死亡，没有荧光，说明复制缺陷型病毒不能在HeLa S3中包装。HeLaS3-SV40-3-1C-2G细胞包装病毒过程中细胞形态变化参见图16。
3*106个细胞每个10cm dish铺HeLa S3和HEK 293，6*106个细胞每个10cm dish铺HeLa S3-SV40-3-1C-2G，其中每个细胞铺2个10cm dish，1个用于接毒，1个作为对照。
将上述细胞经过18h培养后进行接毒，接毒量为500μl的由HeLa S3-SV40-3-1C-2G细胞包装的Ad-EGFP病毒。
接毒4天后在镜下观察HEK 293细胞病变，对其进行收毒。接毒6天后在镜下观察HeLa S3-SV40-3-1C-2G细胞病变，收集病毒。但未观察到HeLa S3病变，在荧光显微镜下也未观察到明显荧光，说明HeLa S3细胞不适合用于扩增新包装(低病毒浓度)的复制缺陷型腺病毒。
对上述病毒进行vp检测，结果见表19。
表19复制缺陷型腺病毒第2次扩增结果
| 细胞系 | 病毒浓度(VP/mL) | 总产量(VP) |
| HeLa S3 | 低于检测水平 | - |
| HeLa S3-SV40-3-1C-2G | 1.38E+09 | 2.76E+09 |
| HEK 293 | 1.00E+10 | 2.00E+10 |
结论：改造细胞HeLa S3-SV40-3-1C-2G不仅可以包装复制缺陷型腺病毒，还能在其中快速扩增新包装(低病毒浓度)的复制缺陷型腺病毒，显著强于HeLa S3细胞。
对HEK 293和HeLa S3-SV40-3-1C-2G细胞扩增的Ad-EGFP病毒进行滴度测定，结果见表20。
表20 HEK 293与HeLa S3-SV40-3-1C-2G产毒滴度比较
| 产AD-EGFP的细胞 | 滴度ifu/ml | 病毒浓度Vp/ml | 比滴度 |
| HEK 293 | 2.58E+08 | 1.00E+10 | 2.58 |
| HeLa S3-SV40-3-1C-2G | 3.55E+07 | 1.38E+09 | 2.57 |
结论：由表20可知，HeLa S3-SV40-3-1C-2G与HEK 293细胞扩增的Ad-EGFP的比滴度无明显差异。
以上结果说明，改造后的HeLa S3-SV40-3-1C-2G细胞不仅能够在不引入野生型腺病毒的前提下扩增E1区存在的复制型腺病毒，且扩增能力不弱于HEK293细胞，也能包装和扩增E1区功能缺陷的腺病毒。
本申请中提及的所有公开物和专利通过引用方式并入本文。不脱离本发明的范围和精神，本发明的所描述的方法和组合物的多种修饰和变体对于本领域技术人员是显而易见的。虽然通过具体的优选实施方式描述了本发明，但是应该理解所要求保护的本发明不应该被不适当地局限于这些具体实施方式。事实上，那些对于相关领域技术人员而言显而易见的用于实施本发明的所描述的模式的多种变体意在包括在随附的权利要求的范围内。
序列表
<110> 上海元宋生物技术有限公司
<120> 一种腺病毒包装与生产细胞系的构建方法及应用
<130> MP21018560
<160> 28
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 2950
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 野生型E1区序列
<400> 1
atgagacata ttatctgcca cggaggtgtt attaccgaag aaatggccgc cagtcttttg 60
gaccagctga tcgaagaggt actggctgat aatcttccac ctcctagcca ttttgaacca 120
cctacccttc acgaactgta tgatttagac gtgacggccc ccgaagatcc caacgaggag 180
gcggtttcgc agatttttcc cgactctgta atgttggcgg tgcaggaagg gattgactta 240
ctcacttttc cgccggcgcc cggttctccg gagccgcctc acctttcccg gcagcccgag 300
cagccggagc agagagcctt gggtccggtt tctatgccaa accttgtacc ggaggtgatc 360
gatcttacct gccacgaggc tggctttcca cccagtgacg acgaggatga agagggtgag 420
gagtttgtgt tagattatgt ggagcacccc gggcacggtt gcaggtcttg tcattatcac 480
cggaggaata cgggggaccc agatattatg tgttcgcttt gctatatgag gacctgtggc 540
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gacctacccg ccgtcctaaa atggcgcctg ctatcctgag acgcccgaca tcacctgtgt 780
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agatacaccc ggtggtcccg ctgtgcccca ttaaaccagt tgccgtgaga gttggtgggc 900
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ctttgtttgc tgaatgagtt gatgtaagtt taataaaggg tgagataatg tttaacttgc 1080
atggcgtgtt aaatggggcg gggcttaaag ggtatataat gcgccgtggg ctaatcttgg 1140
ttacatctga cctcatggag gcttgggagt gtttggaaga tttttctgct gtgcgtaact 1200
tgctggaaca gagctctaac agtacctctt ggttttggag gtttctgtgg ggctcatccc 1260
aggcaaagtt agtctgcaga attaaggagg attacaagtg ggaatttgaa gagcttttga 1320
aatcctgtgg tgagctgttt gattctttga atctgggtca ccaggcgctt ttccaagaga 1380
aggtcatcaa gactttggat ttttccacac cggggcgcgc tgcggctgct gttgcttttt 1440
tgagttttat aaaggataaa tggagcgaag aaacccatct gagcgggggg tacctgctgg 1500
attttctggc catgcatctg tggagagcgg ttgtgagaca caagaatcgc ctgctactgt 1560
tgtcttccgt ccgcccggcg ataataccga cggaggagca gcagcagcag caggaggaag 1620
ccaggcggcg gcggcaggag cagagcccat ggaacccgag agccggcctg gaccctcggg 1680
aatgaatgtt gtacaggtgg ctgaactgta tccagaactg agacgcattt tgacaattac 1740
agaggatggg caggggctaa agggggtaaa gagggagcgg ggggcttgtg aggctacaga 1800
ggaggctagg aatctagctt ttagcttaat gaccagacac cgtcctgagt gtattacttt 1860
tcaacagatc aaggataatt gcgctaatga gcttgatctg ctggcgcaga agtattccat 1920
agagcagctg accacttact ggctgcagcc aggggatgat tttgaggagg ctattagggt 1980
atatgcaaag gtggcactta ggccagattg caagtacaag atcagcaaac ttgtaaatat 2040
caggaattgt tgctacattt ctgggaacgg ggccgaggtg gagatagata cggaggatag 2100
ggtggccttt agatgtagca tgataaatat gtggccgggg gtgcttggca tggacggggt 2160
ggttattatg aatgtaaggt ttactggccc caattttagc ggtacggttt tcctggccaa 2220
taccaacctt atcctacacg gtgtaagctt ctatgggttt aacaatacct gtgtggaagc 2280
ctggaccgat gtaagggttc ggggctgtgc cttttactgc tgctggaagg gggtggtgtg 2340
tcgccccaaa agcagggctt caattaagaa atgcctcttt gaaaggtgta ccttgggtat 2400
cctgtctgag ggtaactcca gggtgcgcca caatgtggcc tccgactgtg gttgcttcat 2460
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<210> 2
<211> 2950
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> E1-M1
<400> 2
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tggtaatttt ttttttaatt tttacagttt tgtggtttaa agaattttgt attgtgattt 660
ttttaaaagg tcctgtgtct gaacctgagc ctgagcccga gccagaaccg gagcctgcaa 720
gacctacccg ccgtcctaaa atggcgcctg ctatcctgag acgcccgaca tcacctgtgt 780
ctagagaatg caatagtagt acggatagct gtgactccgg tccttctaac acacctcctg 840
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ctttgtttgc tgaatgagtt gatgtaagtt taataaaggg tgagataatg tttaacttgc 1080
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tgctggaaca gagctctaac agtacctctt ggttttggag gtttctgtgg ggctcatccc 1260
aggcaaagtt agtctgcaga attaaggagg attacaagtg ggaatttgaa gagcttttga 1320
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aggtcatcaa gactttggat ttttccacac cggggcgcgc tgcggctgct gttgcttttt 1440
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ccaggcggcg gcggcaggag cagagcccat ggaacccgag agccggcctg gaccctcggg 1680
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tcaacagatc aaggataatt gcgctaatga gcttgatctg ctggcgcaga agtattccat 1920
agagcagctg accacttact ggctgcagcc aggggatgat tttgaggagg ctattagggt 1980
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ggttattatg aatgtaaggt ttactggccc caattttagc ggtacggttt tcctggccaa 2220
taccaacctt atcctacacg gtgtaagctt ctatgggttt aacaatacct gtgtggaagc 2280
ctggaccgat gtaagggttc ggggctgtgc cttttactgc tgctggaagg gggtggtgtg 2340
tcgccccaaa agcagggctt caattaagaa atgcctcttt gaaaggtgta ccttgggtat 2400
cctgtctgag ggtaactcca gggtgcgcca caatgtggcc tccgactgtg gttgcttcat 2460
gctagtgaaa agcgtggctg tgattaagca taacatggta tgtggcaact gcgaggacag 2520
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agccagccac tctcgcaagg cctggccagt gtttgagcat aacatactga cccgctgttc 2640
cttgcatttg ggtaacagga ggggggtgtt cctaccttac caatgcaatt tgagtcacac 2700
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<211> 2848
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> E1-M2
<400> 3
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gagtgcgggg ctgcgccttc tactgctgct ggaagggcgt ggtgtgcaga ccaaagagcc 900
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ttgaagacaa acaacgtctg tagcgaccct ttgcaggcag cggaaccccc cacctggcga 1800
caggtgcctc tgcggccaaa agccacgtgt ataagataca cctgcaaagg cggcacaacc 1860
ccagtgccac gttgtgagtt ggatagttgt ggaaagagtc aaatggctct cctcaagcgt 1920
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cctcgacgtg accgccccag aggaccctaa cgaggaggcc gtgtctcaga ttttccctga 2220
cagcgtgatg ctcgccgtgc aggagggcat tgacctgctc acattcccac ccgcccccgg 2280
ctctccagag cctcctcacc tgagcagaca gcctgagcag ccagagcagc gcgccctcgg 2340
cccagtgtgc cacgaggccg gcttccctcc atccgacgac gaggacgagg agggcgagga 2400
gttcgtgctg gactacgtgg agcaccctgg ccacgggtgc cgctcctgcc actaccacag 2460
gcggaacacc ggcgaccccg acattatgtg ctctctgtgc tacatgcgca catgcggcat 2520
gttcgtgtac tctccagtgt ccgagcctga gcccgagcct gagcctgagc ccgagcccgc 2580
cagaccaaca cgcagaccaa agatggcccc cgccattctg agacgaccta catctcctgt 2640
gtctagggag tgcaactcta gcacagactc ttgcgactct ggcccttcta acacaccacc 2700
agagattcac ccagtggtgc cactctgccc aattaagcca gtggccgtga gagtgggcgg 2760
caggcggcag gccgtggagt gcattgagga cctgctgaac gagcctggcc agccactgga 2820
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<210> 4
<211> 2950
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> E1-M3
<400> 4
atgcgccaca tcatctgcca cggcggcgtg atcaccgagg agatggccgc cagcctgctg 60
gaccagctga tcgaggaggt gctggctgat aacctgccac ctccatcgca cttcgagcca 120
cccaccctgc acgagctgta cgatctggac gtgacggccc ccgaggatcc caacgaggag 180
gcggtgtcgc agatctttcc cgacagcgtg atgctggcgg tgcaggaggg gatcgacctg 240
ctcacctttc cgccggcgcc cggcagcccg gagccgcctc acctgtcccg gcagcccgag 300
cagccggagc agcgcgccct gggcccggtg agcatgccaa acctggtgcc ggaggtgatc 360
gatcttacct gccacgcggc tggctgtcca cccagtaacg ccgcggctaa cgcgggtaag 420
gcgtgtgtgt gcgcctgtgt ggcgcccccc gggcccggct gcaggtcctg agcctgagcc 480
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agatccaccc ggtggtcccg ctgtgcccca tcaagccagt ggccgtgcgc gtgggcgggc 900
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ctttgtttgc tgaatgagtt gatgtaagtt taataaaggg tgagataatg tttaacttgc 1080
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aggtcatcaa gactttggat ttttccacac cggggcgcgc tgcggctgct gttgcttttt 1440
tgagttttat aaaggataaa tggagcgaag aaacccatct gagcgggggg tacctgctgg 1500
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tgtcttccgt ccgcccggcg ataataccga cggaggagca gcagcagcag caggaggaag 1620
ccaggcggcg gcggcaggag cagagcccat ggaacccgag agccggcctg gaccctcggg 1680
aatgaatgtt gtacaggtgg ctgaactgta tccagaactg agacgcattt tgacaattac 1740
agaggatggg caggggctaa agggggtaaa gagggagcgg ggggcttgtg aggctacaga 1800
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tcaacagatc aaggataatt gcgctaatga gcttgatctg ctggcgcaga agtattccat 1920
agagcagctg accacttact ggctgcagcc aggggatgat tttgaggagg ctattagggt 1980
atatgcaaag gtggcactta ggccagattg caagtacaag atcagcaaac ttgtaaatat 2040
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ggttattatg aatgtaaggt ttactggccc caattttagc ggtacggttt tcctggccaa 2220
taccaacctt atcctacacg gtgtaagctt ctatgggttt aacaatacct gtgtggaagc 2280
ctggaccgat gtaagggttc ggggctgtgc cttttactgc tgctggaagg gggtggtgtg 2340
tcgccccaaa agcagggctt caattaagaa atgcctcttt gaaaggtgta ccttgggtat 2400
cctgtctgag ggtaactcca gggtgcgcca caatgtggcc tccgactgtg gttgcttcat 2460
gctagtgaaa agcgtggctg tgattaagca taacatggta tgtggcaact gcgaggacag 2520
ggcctctcag atgctgacct gctcggacgg caactgtcac ctgctgaaga ccattcacgt 2580
agccagccac tctcgcaagg cctggccagt gtttgagcat aacatactga cccgctgttc 2640
cttgcatttg ggtaacagga ggggggtgtt cctaccttac caatgcaatt tgagtcacac 2700
taagatattg cttgagcccg agagcatgtc caaggtgaac ctgaacgggg tgtttgacat 2760
gaccatgaag atctggaggg cgctgaggtg cgctaagacc cgcaccaggt gcagaccctg 2820
cgcgtgtggc ggtaaacata ctaagagcca gcctgtgatg ctggctgtga ccgcggcgct 2880
gaggcccgca gcctgggcgc tggcctgcac ccgcgctaag tgtggctcta acgctaacgc 2940
taccgcctga 2950
<210> 5
<211> 2950
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> E1-M4
<400> 5
atgcgccaca tcatctgcca cggcggcgtg atcaccgagg agatggccgc cagcctgctg 60
gaccagctga tcgaggaggt gctggctgat aacctgccac ctccatcgca cttcgagcca 120
cccaccctgc acgagctgta cgatctggac gtgacggccc ccgaggatcc caacgaggag 180
gcggtgtcgc agatctttcc cgacagcgtg atgctggcgg tgcaggaggg gatcgacctg 240
ctcacctttc cgccggcgcc cggcagcccg gagccgcctc acctgtcccg gcagcccgag 300
cagccggagc agcgcgccct gggcccggtg agcatgccaa acctggtgcc ggaggtgatc 360
gatcttacct gccacgaggc tggctttcca cccagtaacg ccgcggctaa cgcgggtaag 420
gcgtgtgtgt gcgcctgtgt ggcgcccccc gggcccggct gcaggtcctg agcctgagcc 480
cggaggagta cgggggcccc cgctactacg tgttcgctct gctgtacgag gacctgtggc 540
acgtgtgtct gcagtaagtg aagatcatgg gcagcgggta ataaagcggc gggtttggcg 600
tggtgatctt ttttctgatc tttacagtgc tgtggtttaa ggagttttgt atcgtgatct 660
ttctgaaggg ccctgtgagc gagcctgagc ctgagcccga gccagagccg gagcctgccc 720
gccctacccg ccgccctaag atggcgcctg ctatcctgcg ccgcccgaca agccctgtga 780
gccgcgagtg caacagcagc acggatagct gtgactccgg ccctagcaac acacctcctg 840
agatccaccc ggtggtcccg ctgtgcccca tcaagccagt ggccgtgcgc gtgggcgggc 900
gccgccaggc tgtggagtgt atcgaggacc tgctgaacga gcctgggcag cctctggacc 960
tgagctgtaa gcgccccagg ccataaggcg tgaacctgta actgcgcgtg tggctcactc 1020
ctctgttcgc cgagtaagtg gatgtgagcc tgatcaaggg cgagatcatg tttaacctgc 1080
acggcgtgct gaacggggcg gggctgaagg ggtacatcat gcgccgcggg ctgatcctgg 1140
tgacaagcga cctcatggag gcttgggagt gtctggagga ttttagcgct gtgcgcaacc 1200
tgctggagca gagcagcaac agcacttcgt ggttctggag gttcctgtgg ggcagctccc 1260
aggccaagct ggtctgccgc atcaaggagg attacaagtg ggagtttgag gagctgctga 1320
agtcctgtgg cgagctgttt gatagcctga acctgggcca ccaggcgctg ttccaggaga 1380
aggtcatcaa gaccctggat ttttccacac cggggcgcgc tgcggcggcg gttgcgttcc 1440
tgagcttcat aaaggataaa tggagcgccg caacccaagc gagagggggg tgccagctgg 1500
cttcagcgga cacgccagcg tggagagcgg ctgtgagaca caggagtcgc ctgctaccgt 1560
ggtcttccgc ccgcccggcg ataacaccga cggcggcgcc gccgccgccg ccggcggcag 1620
ccaggcggcg gcggccggcg ccgagcccat ggagcccgag agccggcctg gcccctcggg 1680
catgaacgtg gtgcaggtgg ctgagctgta cccagagctg cgccgcatcc tgacaatcac 1740
agaggatggg caggggctga agggggtgaa gagggagcgg ggggcttgtg aggctacaga 1800
ggaggctagg aatttggctt tcagcctcat gacccgccac cgccctgagt gtatcacctt 1860
tcagcagatc aaggataact gcgctaacga gctggatctg ctggcgcaga agtactccat 1920
cgagcagctg accacctact ggctgcagcc aggcgatgac tttgaggagg ctataagggt 1980
gtacgccaag gtggccctga ggccagattg caagtacaag atcagcaagc tggtgaacat 2040
caggaactgt tgctacatca gcgggaacgg ggccgaggtg gagatcgata cggaggatag 2100
ggtggccttt cgctgtagca tgatcaacat gtggccgggg gtgctgggca tggacggggt 2160
ggtgatcatg aacgtgaggt ttaccggccc caactttagc ggcacggtgt tcctggccaa 2220
caccaacctg atcctgcacg gcgtgagctt ctacgggttt aacaacacct gtgtggaggc 2280
ctggaccgat gtgagggtgc ggggctgtgc cttttactgc tgctggaagg gggtggtgtg 2340
tcgccccaag agcagggcta gcatcaagaa gtgcctcttt gagaggtgta ccctgggcat 2400
cctgagcgag ggcaactcca gggtgcgcca caacgtggcc tccgactgtg gctgcttcat 2460
gctggtgaag agcgtggctg tgatcaagca caacatggtg tgtggcaact gcgaggacag 2520
ggccagccag atgctgacct gctcggacgg caactgtcac ctgctgaaga ccatccacgt 2580
ggccagccac agccgcaagg cctggccagt gtttgagcac aacatcctga cccgctgttc 2640
cctgcacctg ggcaacagga ggggggtgtt cctgccttac cagtgcaacc tgagccacac 2700
caagatcctg ctggagcccg agagcatgtc caaggtgaac ctgaacgggg tgtttgacat 2760
gaccatgaag atctggaggg cgctgaggtg cgctaagacc cgcaccaggt gcagaccctg 2820
cgcgtgtggc ggtaaacata ctaagagcca gcctgtgatg ctggctgtga ccgcggcgct 2880
gaggcccgca gcctgggcgc tggcctgcac ccgcgctaag tgtggctcta acgctaacgc 2940
taccgcctga 2950
<210> 6
<211> 2950
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> E1-M5
<400> 6
atgagacata ttatctgcca cggaggtgtt attaccgaag aaatggccgc cagtcttttg 60
gaccagctga tcgaagaggt actggctgat aatcttccac ctcctagcca ttttgaacca 120
cctacccttc acgaactgta tgatttagac gtgacggccc ccgaagatcc caacgaggag 180
gcggtttcgc agatttttcc cgactctgta atgttggcgg tgcaggaagg gattgactta 240
ctcacttttc cgccggcgcc cggttctccg gagccgcctc acctttcccg gcagcccgag 300
cagccggagc agagagcctt gggtccggtt tctatgccaa accttgtacc ggaggtgatc 360
gatcttacct gccacgcggc tggctgtcca cccagtaacg ccgcggctaa cgcgggtaag 420
gcgtgtgtgt gcgcctgtgt ggcgcccccc gggcccggct gcaggtcctg agcctgagcc 480
cggaggagta cgggggcccc cgctactacg tgttcgctct gctgtacgag gacctgtggc 540
acgtgtgtct gcagtaagtg aagatcatgg gcagcgggta ataaagcggc gggtttggcg 600
tggtgatctt ttttctgatc tttacagtgc tgtggtttaa ggagttttgt atcgtgatct 660
ttctgaaggg ccctgtgagc gagcctgagc ctgagcccga gccagagccg gagcctgccc 720
gccctacccg ccgccctaag atggcgcctg ctatcctgcg ccgcccgaca agccctgtga 780
gccgcgagtg caacagcagc acggatagct gtgactccgg ccctagcaac acacctcctg 840
agatccaccc ggtggtcccg ctgtgcccca tcaagccagt ggccgtgcgc gtgggcgggc 900
gccgccaggc tgtggagtgt atcgaggacc tgctgaacga gcctgggcag cctctggacc 960
tgagctgtaa gcgccccagg ccataaggtg taaacctgtg attgcgtgtg tggttaacgc 1020
ctttgtttgc tgaatgagtt gatgtaagtt taataaaggg tgagataatg tttaacttgc 1080
atggcgtgtt aaatggggcg gggcttaaag ggtatataat gcgccgtggg ctaatcttgg 1140
ttacatctga cctcatggag gcttgggagt gtttggaaga tttttctgct gtgcgtaact 1200
tgctggaaca gagctctaac agtacctctt ggttttggag gtttctgtgg ggctcatccc 1260
aggcaaagtt agtctgcaga attaaggagg attacaagtg ggaatttgaa gagcttttga 1320
aatcctgtgg tgagctgttt gattctttga atctgggtca ccaggcgctt ttccaagaga 1380
aggtcatcaa gactttggat ttttccacac cggggcgcgc tgcggctgct gttgcttttt 1440
tgagttttat aaaggataaa tggagcgaag aaacccatct gagcgggggg tacctgctgg 1500
attttctggc catgcatctg tggagagcgg ttgtgagaca caagaatcgc ctgctactgt 1560
tgtcttccgt ccgcccggcg ataataccga cggaggagca gcagcagcag caggaggaag 1620
ccaggcggcg gcggcaggag cagagcccat ggaacccgag agccggcctg gaccctcggg 1680
aatgaatgtt gtacaggtgg ctgaactgta tccagaactg agacgcattt tgacaattac 1740
agaggatggg caggggctaa agggggtaaa gagggagcgg ggggcttgtg aggctacaga 1800
ggaggctagg aatctagctt ttagcttaat gaccagacac cgtcctgagt gtattacttt 1860
tcaacagatc aaggataatt gcgctaatga gcttgatctg ctggcgcaga agtattccat 1920
agagcagctg accacttact ggctgcagcc aggggatgat tttgaggagg ctattagggt 1980
atatgcaaag gtggcactta ggccagattg caagtacaag atcagcaaac ttgtaaatat 2040
caggaattgt tgctacattt ctgggaacgg ggccgaggtg gagatagata cggaggatag 2100
ggtggccttt agatgtagca tgataaatat gtggccgggg gtgcttggca tggacggggt 2160
ggttattatg aatgtaaggt ttactggccc caattttagc ggtacggttt tcctggccaa 2220
taccaacctt atcctacacg gtgtaagctt ctatgggttt aacaatacct gtgtggaagc 2280
ctggaccgat gtaagggttc ggggctgtgc cttttactgc tgctggaagg gggtggtgtg 2340
tcgccccaaa agcagggctt caattaagaa atgcctcttt gaaaggtgta ccttgggtat 2400
cctgtctgag ggtaactcca gggtgcgcca caatgtggcc tccgactgtg gttgcttcat 2460
gctagtgaaa agcgtggctg tgattaagca taacatggta tgtggcaact gcgaggacag 2520
ggcctctcag atgctgacct gctcggacgg caactgtcac ctgctgaaga ccattcacgt 2580
agccagccac tctcgcaagg cctggccagt gtttgagcat aacatactga cccgctgttc 2640
cttgcatttg ggtaacagga ggggggtgtt cctaccttac caatgcaatt tgagtcacac 2700
taagatattg cttgagcccg agagcatgtc caaggtgaac ctgaacgggg tgtttgacat 2760
gaccatgaag atctggaagg tgctgaggta cgatgagacc cgcaccaggt gcagaccctg 2820
cgagtgtggc ggtaaacata ttaggaacca gcctgtgatg ctggatgtga ccgaggagct 2880
gaggcccgat cacttggtgc tggcctgcac ccgcgctgag tttggctcta gcgatgaaga 2940
tacagattga 2950
<210> 7
<211> 2950
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> E1-M6
<400> 7
atgagacata ttatctgcca cggaggtgtt attaccgaag aaatggccgc cagtcttttg 60
gaccagctga tcgaagaggt actggctgat aatcttccac ctcctagcca ttttgaacca 120
cctacccttc acgaactgta tgatttagac gtgacggccc ccgaagatcc caacgaggag 180
gcggtttcgc agatttttcc cgactctgta atgttggcgg tgcaggaagg gattgactta 240
ctcacttttc cgccggcgcc cggttctccg gagccgcctc acctttcccg gcagcccgag 300
cagccggagc agagagcctt gggtccggtt tctatgccaa accttgtacc ggaggtgatc 360
gatcttacct gccacgaggc tggctttcca cccagtgacg acgaggatga agagggtgag 420
gagtttgtgt tagattatgt ggagcacccc gggcacggtt gcaggtcttg tcattatcac 480
cggaggaata cgggggaccc agatattatg tgttcgcttt gctatatgag gacctgtggc 540
atgtttgtct acagtaagtg aaaattatgg gcagtgggtg atagagtggt gggtttggtg 600
tggtaatttt ttttttaatt tttacagttt tgtggtttaa agaattttgt attgtgattt 660
ttttaaaagg tcctgtgtct gaacctgagc ctgagcccga gccagaaccg gagcctgcaa 720
gacctacccg ccgtcctaaa atggcgcctg ctatcctgag acgcccgaca tcacctgtgt 780
ctagagaatg caatagtagt acggatagct gtgactccgg tccttctaac acacctcctg 840
agatacaccc ggtggtcccg ctgtgcccca ttaaaccagt tgccgtgaga gttggtgggc 900
gtcgccaggc tgtggaatgt atcgaggact tgcttaacga gcctgggcaa cctttggact 960
tgagctgtaa acgccccagg ccataaggtg taaacctgtg attgcgtgtg tggttaacgc 1020
ctttgtttgc tgaatgagtt gatgtaagtt taataaaggg tgagataatg tttaacttgc 1080
atggcgtgtt aaatggggcg gggcttaaag ggtatataat gcgccgtggg ctaatcttgg 1140
ttacatctga cctcatggag gcttgggagt gtttggaaga tttttctgct gtgcgtaact 1200
tgctggaaca gagctctaac agtacctctt ggttttggag gtttctgtgg ggctcatccc 1260
aggcaaagtt agtctgcaga attaaggagg attacaagtg ggaatttgaa gagcttttga 1320
aatcctgtgg tgagctgttt gattctttga atctgggtca ccaggcgctt ttccaagaga 1380
aggtcatcaa gactttggat ttttccacac cggggcgcgc tgcggctgct gttgcttttt 1440
tgagttttat aaaggataaa tggagcgccg caacccaagc gagagggggg tgccagctgg 1500
cttcagcgga cacgccagcg tggagagcgg ctgtgagaca caggagtcgc ctgctaccgt 1560
ggtcttccgc ccgcccggcg ataacaccga cggcggcgcc gccgccgccg ccggcggcag 1620
ccaggcggcg gcggccggcg ccgagcccat ggagcccgag agccggcctg gcccctcggg 1680
catgaacgtg gtgcaggtgg ctgagctgta cccagagctg cgccgcatcc tgacaatcac 1740
agaggatggg caggggctga agggggtgaa gagggagcgg ggggcttgtg aggctacaga 1800
ggaggctagg aatttggctt tcagcctcat gacccgccac cgccctgagt gtatcacctt 1860
tcagcagatc aaggataact gcgctaacga gctggatctg ctggcgcaga agtactccat 1920
cgagcagctg accacctact ggctgcagcc aggcgatgac tttgaggagg ctataagggt 1980
gtacgccaag gtggccctga ggccagattg caagtacaag atcagcaagc tggtgaacat 2040
caggaactgt tgctacatca gcgggaacgg ggccgaggtg gagatcgata cggaggatag 2100
ggtggccttt cgctgtagca tgatcaacat gtggccgggg gtgctgggca tggacggggt 2160
ggtgatcatg aacgtgaggt ttaccggccc caactttagc ggcacggtgt tcctggccaa 2220
caccaacctg atcctgcacg gcgtgagctt ctacgggttt aacaacacct gtgtggaggc 2280
ctggaccgat gtgagggtgc ggggctgtgc cttttactgc tgctggaagg gggtggtgtg 2340
tcgccccaag agcagggcta gcatcaagaa gtgcctcttt gagaggtgta ccctgggcat 2400
cctgagcgag ggcaactcca gggtgcgcca caacgtggcc tccgactgtg gctgcttcat 2460
gctggtgaag agcgtggctg tgatcaagca caacatggtg tgtggcaact gcgaggacag 2520
ggccagccag atgctgacct gctcggacgg caactgtcac ctgctgaaga ccatccacgt 2580
ggccagccac agccgcaagg cctggccagt gtttgagcac aacatcctga cccgctgttc 2640
cctgcacctg ggcaacagga ggggggtgtt cctgccttac cagtgcaacc tgagccacac 2700
caagatcctg ctggagcccg agagcatgtc caaggtgaac ctgaacgggg tgtttgacat 2760
gaccatgaag atttggaagg tgctgagata cgacgagacc cggacaagat gcaggccatg 2820
cgagtgcggc ggcaagcaca ttagaaacca gccagtgatg ctcgacgtga cagaggaatt 2880
acgccctgac cacctcgtgc tggcctgcac acgcgccgag ttcggctcta gcgacgagga 2940
cacagactga 2950
<210> 8
<211> 500
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> mPGK启动子序列
<400> 8
gggtagggga ggcgcttttc ccaaggcagt ctggagcatg cgctttagca gccccgctgg 60
gcacttggcg ctacacaagt ggcctctggc ctcgcacaca ttccacatcc accggtaggc 120
gccaaccggc tccgttcttt ggtggcccct tcgcgccacc ttctactcct cccctagtca 180
ggaagttccc ccccgccccg cagctcgcgt cgtgcaggac gtgacaaatg gaagtagcac 240
gtctcactag tctcgtgcag atggacagca ccgctgagca atggaagcgg gtaggccttt 300
ggggcagcgg ccaatagcag ctttgctcct tcgctttctg ggctcagagg ctgggaaggg 360
gtgggtccgg gggcgggctc aggggcgggc tcaggggcgg ggcgggcgcc cgaaggtcct 420
ccggaggccc ggcattctgc acgcttcaaa agcgcacgtc tgccgcgctg ttctcctctt 480
cctcatctcc gggcctttcg 500
<210> 9
<211> 330
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SV40启动子序列
<400> 9
gtgtgtcagt tagggtgtgg aaagtcccca ggctccccag caggcagaag tatgcaaagc 60
atgcatctca attagtcagc aaccaggtgt ggaaagtccc caggctcccc agcaggcaga 120
agtatgcaaa gcatgcatct caattagtca gcaaccatag tcccgcccct aactccgccc 180
atcccgcccc taactccgcc cagttccgcc cattctccgc cccatggctg actaattttt 240
tttatttatg cagaggccga ggccgcctcg gcctctgagc tattccagaa gtagtgagga 300
ggcttttttg gaggcctagg cttttgcaaa 330
<210> 10
<211> 800
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> AAVS1-T2位点上游序列
<400> 10
cattctctcc cctgggcctg tgccgctttc tgtctgcagc ttgtggcctg ggtcacctct 60
acggctggcc cagatccttc cctgccgcct ccttcaggtt ccgtcttcct ccactccctc 120
ttccccttgc tctctgctgt gttgctgccc aaggatgctc tttccggagc acttccttct 180
cggcgctgca ccacgtgatg tcctctgagc ggatcctccc cgtgtctggg tcctctccgg 240
gcatctctcc tccctcaccc aaccccatgc cgtcttcact cgctgggttc ccttttcctt 300
ctccttctgg ggcctgtgcc atctctcgtt tcttaggatg gccttctccg acggatgtct 360
cccttgcgtc ccgcctcccc ttcttgtagg cctgcatcat caccgttttt ctggacaacc 420
ccaaagtacc ccgtctccct ggctttagcc acctctccat cctcttgctt tctttgcctg 480
gacaccccgt tctcctgtgg attcgggtca cctctcactc ctttcatttg ggcagctccc 540
ctacccccct tacctctcta gtctgtgcta gctcttccag ccccctgtca tggcatcttc 600
caggggtccg agagctcagc tagtcttctt cctccaaccc gggcccctat gtccacttca 660
ggacagcatg tttgctgcct ccagggatcc tgtgtccccg agctgggacc accttatatt 720
cccagggccg gttaatgtgg ctctggttct gggtactttt atctgtcccc tccaccccac 780
agtggggcca ctagggacag 800
<210> 11
<211> 800
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> AAVS1-T2位点下游序列
<400> 11
gattggtgac agaaaagccc catccttagg cctcctcctt cctagtctcc tgatattggg 60
tctaaccccc acctcctgtt aggcagattc cttatctggt gacacacccc catttcctgg 120
agccatctct ctccttgcca gaacctctaa ggtttgctta cgatggagcc agagaggatc 180
ctgggaggga gagcttggca gggggtggga gggaaggggg ggatgcgtga cctgcccggt 240
tctcagtggc caccctgcgc taccctctcc cagaacctga gctgctctga cgcggccgtc 300
tggtgcgttt cactgatcct ggtgctgcag cttccttaca cttcccaaga ggagaagcag 360
tttggaaaaa caaaatcaga ataagttggt cctgagttct aactttggct cttcaccttt 420
ctagtcccca atttatattg ttcctccgtg cgtcagtttt acctgtgaga taaggccagt 480
agccagcccc gtcctggcag ggctgtggtg aggagggggg tgtccgtgtg gaaaactccc 540
tttgtgagaa tggtgcgtcc taggtgttca ccaggtcgtg gccgcctcta ctccctttct 600
ctttctccat ccttctttcc ttaaagagtc cccagtgcta tctgggacat attcctccgc 660
ccagagcagg gtcccgcttc cctaaggccc tgctctgggc ttctgggttt gagtccttgg 720
caagcccagg agaggcgctc aggcttccct gtcccccttc ctcgtccacc atctcatgcc 780
cctggctctc ctgccccttc 800
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PPP In1 F
<400> 12
gaactctgcc ctctaacgct 20
<210> 13
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SV40-seqR1
<400> 13
aaagcctcct cactacttct gg 22
<210> 14
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> mPGK-seqR1
<400> 14
cccagaaagc gaaggagcaa ag 22
<210> 15
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Seq-Puro R1
<400> 15
gaagagttct tgcagctcgg tg 22
<210> 16
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Seq-Puro F1
<400> 16
tgaccgagta caagcccac 19
<210> 17
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TIDE seq R2
<400> 17
aaaactgacg cacggaggaa 20
<210> 18
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> qE1B-55K-F1
<400> 18
aggccagatt gcaagtacaa ga 22
<210> 19
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Seq-E1A-F1
<400> 19
tcacttcgag ccaccaacac 20
<210> 20
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Seq-E1A-R1
<400> 20
ggcaactggt ttaatggggc 20
<210> 21
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> qE1A-promoter-F-5
<400> 21
ctttgaccgt ttacgtggag ac 22
<210> 22
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> qE1A-promoter-R-5
<400> 22
cttgaggaac tcaccgggta taa 23
<210> 23
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Mul11-E1A-Q-F1
<400> 23
caggtcttgt cattatcac 19
<210> 24
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Mul11-E1A-Q-R1
<400> 24
ccacaggtcc tcatatag 18
<210> 25
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> T2 clone F
<400> 25
caccggggcc actagggaca ggat 24
<210> 26
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> T2 clone R
<400> 26
aaacatcctg tccctagtgg cccc 24
<210> 27
<211> 8986
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Donor-mPGK
<400> 27
tcgcgcgttt cggtgatgac ggtgaaaacc tctgacacat gcagctcccg gagacggtca 60
cagcttgtct gtaagcggat gccgggagca gacaagcccg tcagggcgcg tcagcgggtg 120
ttggcgggtg tcggggctgg cttaactatg cggcatcaga gcagattgta ctgagagtgc 180
accatatgcg gtgtgaaata ccgcacagat gcgtaaggag aaaataccgc atcaggcgcc 240
attcgccatt caggctgcgc aactgttggg aagggcgatc ggtgcgggcc tcttcgctat 300
tacgccagct ggcgaaaggg ggatgtgctg caaggcgatt aagttgggta acgccagggt 360
tttcccagtc acgacgttgt aaaacgacgg ccagtgaatt cgagctcggt accccattct 420
ctcccctggg cctgtgccgc tttctgtctg cagcttgtgg cctgggtcac ctctacggct 480
ggcccagatc cttccctgcc gcctccttca ggttccgtct tcctccactc cctcttcccc 540
ttgctctctg ctgtgttgct gcccaaggat gctctttccg gagcacttcc ttctcggcgc 600
tgcaccacgt gatgtcctct gagcggatcc tccccgtgtc tgggtcctct ccgggcatct 660
ctcctccctc acccaacccc atgccgtctt cactcgctgg gttccctttt ccttctcctt 720
ctggggcctg tgccatctct cgtttcttag gatggccttc tccgacggat gtctcccttg 780
cgtcccgcct ccccttcttg taggcctgca tcatcaccgt ttttctggac aaccccaaag 840
taccccgtct ccctggcttt agccacctct ccatcctctt gctttctttg cctggacacc 900
ccgttctcct gtggattcgg gtcacctctc actcctttca tttgggcagc tcccctaccc 960
cccttacctc tctagtctgt gctagctctt ccagccccct gtcatggcat cttccagggg 1020
tccgagagct cagctagtct tcttcctcca acccgggccc ctatgtccac ttcaggacag 1080
catgtttgct gcctccaggg atcctgtgtc cccgagctgg gaccacctta tattcccagg 1140
gccggttaat gtggctctgg ttctgggtac ttttatctgt cccctccacc ccacagtggg 1200
gccactaggg acagacgcgt gggtagggga ggcgcttttc ccaaggcagt ctggagcatg 1260
cgctttagca gccccgctgg gcacttggcg ctacacaagt ggcctctggc ctcgcacaca 1320
ttccacatcc accggtaggc gccaaccggc tccgttcttt ggtggcccct tcgcgccacc 1380
ttctactcct cccctagtca ggaagttccc ccccgccccg cagctcgcgt cgtgcaggac 1440
gtgacaaatg gaagtagcac gtctcactag tctcgtgcag atggacagca ccgctgagca 1500
atggaagcgg gtaggccttt ggggcagcgg ccaatagcag ctttgctcct tcgctttctg 1560
ggctcagagg ctgggaaggg gtgggtccgg gggcgggctc aggggcgggc tcaggggcgg 1620
ggcgggcgcc cgaaggtcct ccggaggccc ggcattctgc acgcttcaaa agcgcacgtc 1680
tgccgcgctg ttctcctctt cctcatctcc gggcctttcg ctcgagccac catgcggcac 1740
attatttgcc acggcggcgt gattacagag gagatggccg cctctctgct ggaccagctc 1800
attgaggagg tgctcgccga caacctccct ccaccatctc acttcgagcc accaacactg 1860
cacgagctgt acgacctgga cgtgaccgcc cctgaggacc caaacgagga ggccgtgtct 1920
cagattttcc ccgactctgt gatgctcgcc gtgcaggagg gcattgacct gctgacattc 1980
ccacccgccc caggctctcc tgagcctcca cacctgagcc gccagcccga gcagccagag 2040
cagcgcgccc tcggcccagt gtctatgcct aacctggtgc cagaggtgat cgaccttacc 2100
tgccacgagg ctggctttcc acccagtgac gacgaggatg aagagggtga ggagtttgtg 2160
ttagattatg tggagcaccc cgggcacggt tgcaggtctt gtcattatca ccggaggaat 2220
acgggggacc cagatattat gtgttcgctt tgctatatga ggacctgtgg catgtttgtc 2280
tacagtaagt gaaaattatg ggcagtgggt gatagagtgg tgggtttggt gtggtaattt 2340
tttttttaat ttttacagtt ttgtggttta aagaattttg tattgtgatt tttttaaaag 2400
gtcctgtgtc tgaacctgag cctgagcccg agccagaacc ggagcctgca agacctaccc 2460
gccgtcctaa aatggcgcct gctatcctga gacgcccgac atcacctgtg tctagagaat 2520
gcaatagtag tacggatagc tgtgactccg gtccttctaa cacacctcct gagatacacc 2580
cggtggtccc gctgtgcccc attaaaccag ttgccgtgag agttggtggg cgtcgccagg 2640
ctgtggaatg tatcgaggac ttgcttaacg agcctgggca acctttggac ttgagctgta 2700
aacgccccag gccataaggt gtaaacctgt gattgcgtgt gtggttaacg cctttgtttg 2760
ctgaatgagt tgatgtaagt ttaataaagg gtgagataat gtttaacttg catggcgtgt 2820
taaatggggc ggggcttaaa gggtatataa tgcgccgtgg gctaatcttg gttacatctg 2880
acctcatgga ggcttgggag tgtttggaag atttttctgc tgtgcgtaac ttgctggaac 2940
agagctctaa cagtacctct tggttttgga ggtttctgtg gggctcatcc caggcaaagt 3000
tagtctgcag aattaaggag gattacaagt gggaatttga agagcttttg aaatcctgtg 3060
gtgagctgtt tgattctttg aatctgggtc accaggcgct tttccaagag aaggtcatca 3120
agactttgga tttttccaca ccggggcgcg ctgcggctgc tgttgctttt ttgagtttta 3180
taaaggataa atggagcgaa gaaacccatc tgagcggggg gtacctgctg gattttctgg 3240
ccatgcatct gtggagagcg gttgtgagac acaagaatcg cctgctactg ttgtcttccg 3300
tccgcccggc gataataccg acggaggagc agcagcagca gcaggaggaa gccaggcggc 3360
ggcggcagga gcagagccca tggaacccga gagccggcct ggaccctcgg gaatgaatgt 3420
tgtacaggtg gctgaactgt atccagaact gagacgcatt ttgacaatta cagaggatgg 3480
gcaggggcta aagggggtaa agagggagcg gggggcttgt gaggctacag aggaggctag 3540
gaatctagct tttagcttaa tgaccagaca ccgtcctgag tgtattactt ttcaacagat 3600
caaggataat tgcgctaatg agcttgatct gctggcgcag aagtattcca tagagcagct 3660
gaccacttac tggctgcagc caggggatga ttttgaggag gctattaggg tatatgcaaa 3720
ggtggcactt aggccagatt gcaagtacaa gatcagcaaa cttgtaaata tcaggaattg 3780
ttgctacatt tctgggaacg gggccgaggt ggagatagat acggaggata gggtggcctt 3840
tagatgtagc atgataaata tgtggccggg ggtgcttggc atggacgggg tggttattat 3900
gaatgtaagg tttactggcc ccaattttag cggtacggtt ttcctggcca ataccaacct 3960
tatcctacac ggtgtaagct tctatgggtt taacaatacc tgtgtggaag cctggaccga 4020
tgtaagggtt cggggctgtg ccttttactg ctgctggaag ggggtggtgt gtcgccccaa 4080
aagcagggct tcaattaaga aatgcctctt tgaaaggtgt accttgggta tcctgtctga 4140
gggtaactcc agggtgcgcc acaatgtggc ctccgactgt ggttgcttca tgctagtgaa 4200
aagcgtggct gtgattaagc ataacatggt atgtggcaac tgcgaggaca gggcctctca 4260
gatgctgacc tgctcggacg gcaactgtca cctgctgaag accattcacg tagccagcca 4320
ctctcgcaag gcctggccag tgtttgagca taacatactg acccgctgtt ccttgcattt 4380
gggtaacagg aggggggtgt tcctacctta ccaatgcaat ttgagtcaca ctaagatatt 4440
gcttgagccc gagagcatgt ccaaggtgaa cctgaacggg gtgtttgaca tgaccatgaa 4500
gatttggaag gtgctgagat acgacgagac ccggacaaga tgcaggccat gcgagtgcgg 4560
cggcaagcac attagaaacc agccagtgat gctcgacgtg acagaggaat tacgccctga 4620
ccacctcgtg ctggcctgca cacgcgccga gttcggctct agcgacgagg acacagactg 4680
attaattaac tgtgccttct agttgccagc catctgttgt ttgcccctcc cccgtgcctt 4740
ccttgaccct ggaaggtgcc actcccactg tcctttccta ataaaatgag gaaattgcat 4800
cgcattgtct gagtaggtgt cattctattc tggggggtgg ggtggggcag gacagcaagg 4860
gggaggattg ggaagacaat agcaggcatg ctggggatgc ggtgggctct atgggtttaa 4920
acataacttc gtatagcata cattatacga agttatgcgg ccgcaatgta gtcttatgca 4980
atactcttgt agtcttgcaa catggtaacg atgagttagc aacatgcctt acaaggagag 5040
aaaaagcacc gtgcatgccg attggtggaa gtaaggtggt acgatcgtgc cttattagga 5100
aggcaacaga cgggtctgac atggattgga cgaaccactg aattccgcat tgcagagata 5160
ttgtatttaa gtgcctagct cgatacaata aacgccattt gaccattcac cacattggtg 5220
tgcaccgcgg ccgcatgacc gagtacaagc ccacggtgcg cctcgccacc cgcgacgacg 5280
tccccagggc cgtacgcacc ctcgccgccg cgttcgccga ctaccccgcc acgcgccaca 5340
ccgtcgatcc ggaccgccac atcgagcggg tcaccgagct gcaagaactc ttcctcacgc 5400
gcgtcgggct cgacatcggc aaggtgtggg tcgcggacga cggcgccgcg gtggcggtct 5460
ggaccacgcc ggagagcgtc gaagcggggg cggtgttcgc cgagatcggc ccgcgcatgg 5520
ccgagttgag cggttcccgg ctggccgcgc agcaacagat ggaaggcctc ctggcgccgc 5580
accggcccaa ggagcccgcg tggttcctgg ccaccgtcgg cgtctcgccc gaccaccagg 5640
gcaagggtct gggcagcgcc gtcgtgctcc ccggagtgga ggcggccgag cgcgccgggg 5700
tgcccgcctt cctggagacc tccgcgcccc gcaacctccc cttctacgag cggctcggct 5760
tcaccgtcac cgccgacgtc gaggtgcccg aaggaccgcg cacctggtgc atgacccgca 5820
agcccggtgc ctgaaataaa ggaaatttat tttcattgca atagtgtgtt ggaatttttt 5880
gtgtctctca ataacttcgt atagcataca ttatacgaag ttatgattgg tgacagaaaa 5940
gccccatcct taggcctcct ccttcctagt ctcctgatat tgggtctaac ccccacctcc 6000
tgttaggcag attccttatc tggtgacaca cccccatttc ctggagccat ctctctcctt 6060
gccagaacct ctaaggtttg cttacgatgg agccagagag gatcctggga gggagagctt 6120
ggcagggggt gggagggaag ggggggatgc gtgacctgcc cggttctcag tggccaccct 6180
gcgctaccct ctcccagaac ctgagctgct ctgacgcggc cgtctggtgc gtttcactga 6240
tcctggtgct gcagcttcct tacacttccc aagaggagaa gcagtttgga aaaacaaaat 6300
cagaataagt tggtcctgag ttctaacttt ggctcttcac ctttctagtc cccaatttat 6360
attgttcctc cgtgcgtcag ttttacctgt gagataaggc cagtagccag ccccgtcctg 6420
gcagggctgt ggtgaggagg ggggtgtccg tgtggaaaac tccctttgtg agaatggtgc 6480
gtcctaggtg ttcaccaggt cgtggccgcc tctactccct ttctctttct ccatccttct 6540
ttccttaaag agtccccagt gctatctggg acatattcct ccgcccagag cagggtcccg 6600
cttccctaag gccctgctct gggcttctgg gtttgagtcc ttggcaagcc caggagaggc 6660
gctcaggctt ccctgtcccc cttcctcgtc caccatctca tgcccctggc tctcctgccc 6720
cttctatcgt cgacctgcag gcatgcaagc ttggcgtaat catggtcata gctgtttcct 6780
gtgtgaaatt gttatccgct cacaattcca cacaacatac gagccggaag cataaagtgt 6840
aaagcctggg gtgcctaatg agtgagctaa ctcacattaa ttgcgttgcg ctcactgccc 6900
gctttccagt cgggaaacct gtcgtgccag ctgcattaat gaatcggcca acgcgcgggg 6960
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gtcgttcggc tgcggcgagc ggtatcagct cactcaaagg cggtaatacg gttatccaca 7080
gaatcagggg ataacgcagg aaagaacatg tgagcaaaag gccagcaaaa ggccaggaac 7140
cgtaaaaagg ccgcgttgct ggcgtttttc cataggctcc gcccccctga cgagcatcac 7200
aaaaatcgac gctcaagtca gaggtggcga aacccgacag gactataaag ataccaggcg 7260
tttccccctg gaagctccct cgtgcgctct cctgttccga ccctgccgct taccggatac 7320
ctgtccgcct ttctcccttc gggaagcgtg gcgctttctc atagctcacg ctgtaggtat 7380
ctcagttcgg tgtaggtcgt tcgctccaag ctgggctgtg tgcacgaacc ccccgttcag 7440
cccgaccgct gcgccttatc cggtaactat cgtcttgagt ccaacccggt aagacacgac 7500
ttatcgccac tggcagcagc cactggtaac aggattagca gagcgaggta tgtaggcggt 7560
gctacagagt tcttgaagtg gtggcctaac tacggctaca ctagaagaac agtatttggt 7620
atctgcgctc tgctgaagcc agttaccttc ggaaaaagag ttggtagctc ttgatccggc 7680
aaacaaacca ccgctggtag cggtggtttt tttgtttgca agcagcagat tacgcgcaga 7740
aaaaaaggat ctcaagaaga tcctttgatc ttttctacgg ggtctgacgc tcagtggaac 7800
gaaaactcac gttaagggat tttggtcatg agattatcaa aaaggatctt cacctagatc 7860
cttttaaatt aaaaatgaag ttttaaatca atctaaagta tatatgagta aacttggtct 7920
gacagttacc aatgcttaat cagtgaggca cctatctcag cgatctgtct atttcgttca 7980
tccatagttg cctgactccc cgtcgtgtag ataactacga tacgggaggg cttaccatct 8040
ggccccagtg ctgcaatgat accgcgagac ccacgctcac cggctccaga tttatcagca 8100
ataaaccagc cagccggaag ggccgagcgc agaagtggtc ctgcaacttt atccgcctcc 8160
atccagtcta ttaattgttg ccgggaagct agagtaagta gttcgccagt taatagtttg 8220
cgcaacgttg ttgccattgc tacaggcatc gtggtgtcac gctcgtcgtt tggtatggct 8280
tcattcagct ccggttccca acgatcaagg cgagttacat gatcccccat gttgtgcaaa 8340
aaagcggtta gctccttcgg tcctccgatc gttgtcagaa gtaagttggc cgcagtgtta 8400
tcactcatgg ttatggcagc actgcataat tctcttactg tcatgccatc cgtaagatgc 8460
ttttctgtga ctggtgagta ctcaaccaag tcattctgag aatagtgtat gcggcgaccg 8520
agttgctctt gcccggcgtc aatacgggat aataccgcgc cacatagcag aactttaaaa 8580
gtgctcatca ttggaaaacg ttcttcgggg cgaaaactct caaggatctt accgctgttg 8640
agatccagtt cgatgtaacc cactcgtgca cccaactgat cttcagcatc ttttactttc 8700
accagcgttt ctgggtgagc aaaaacagga aggcaaaatg ccgcaaaaaa gggaataagg 8760
gcgacacgga aatgttgaat actcatactc ttcctttttc aatattattg aagcatttat 8820
cagggttatt gtctcatgag cggatacata tttgaatgta tttagaaaaa taaacaaata 8880
ggggttccgc gcacatttcc ccgaaaagtg ccacctgacg tctaagaaac cattattatc 8940
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<210> 28
<211> 8844
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Donor-SV40
<400> 28
tcgcgcgttt cggtgatgac ggtgaaaacc tctgacacat gcagctcccg gagacggtca 60
cagcttgtct gtaagcggat gccgggagca gacaagcccg tcagggcgcg tcagcgggtg 120
ttggcgggtg tcggggctgg cttaactatg cggcatcaga gcagattgta ctgagagtgc 180
accatatgcg gtgtgaaata ccgcacagat gcgtaaggag aaaataccgc atcaggcgcc 240
attcgccatt caggctgcgc aactgttggg aagggcgatc ggtgcgggcc tcttcgctat 300
tacgccagct ggcgaaaggg ggatgtgctg caaggcgatt aagttgggta acgccagggt 360
tttcccagtc acgacgttgt aaaacgacgg ccagtgaatt cgagctcggt accccattct 420
ctcccctggg cctgtgccgc tttctgtctg cagcttgtgg cctgggtcac ctctacggct 480
ggcccagatc cttccctgcc gcctccttca ggttccgtct tcctccactc cctcttcccc 540
ttgctctctg ctgtgttgct gcccaaggat gctctttccg gagcacttcc ttctcggcgc 600
tgcaccacgt gatgtcctct gagcggatcc tccccgtgtc tgggtcctct ccgggcatct 660
ctcctccctc acccaacccc atgccgtctt cactcgctgg gttccctttt ccttctcctt 720
ctggggcctg tgccatctct cgtttcttag gatggccttc tccgacggat gtctcccttg 780
cgtcccgcct ccccttcttg taggcctgca tcatcaccgt ttttctggac aaccccaaag 840
taccccgtct ccctggcttt agccacctct ccatcctctt gctttctttg cctggacacc 900
ccgttctcct gtggattcgg gtcacctctc actcctttca tttgggcagc tcccctaccc 960
cccttacctc tctagtctgt gctagctctt ccagccccct gtcatggcat cttccagggg 1020
tccgagagct cagctagtct tcttcctcca acccgggccc ctatgtccac ttcaggacag 1080
catgtttgct gcctccaggg atcctgtgtc cccgagctgg gaccacctta tattcccagg 1140
gccggttaat gtggctctgg ttctgggtac ttttatctgt cccctccacc ccacagtggg 1200
gccactaggg acagacgcgt ctgaggcgga aagaaccagc tgtggaatgt gtgtcagtta 1260
gggtgtggaa agtccccagg ctccccagca ggcagaagta tgcaaagcat gcatctcaat 1320
tagtcagcaa ccaggtgtgg aaagtcccca ggctccccag caggcagaag tatgcaaagc 1380
atgcatctca attagtcagc aaccatagtc ccgcccctaa ctccgcccat cccgccccta 1440
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gaggccgagg ccgcctcggc ctctgagcta ttccagaagt agtgaggagg cttttttgga 1560
ggcctaggct tttgcaaact cgagccacca tgcggcacat tatttgccac ggcggcgtga 1620
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tgctcgccgt gcaggagggc attgacctgc tgacattccc acccgcccca ggctctcctg 1860
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ctatgcctaa cctggtgcca gaggtgatcg accttacctg ccacgaggct ggctttccac 1980
ccagtgacga cgaggatgaa gagggtgagg agtttgtgtt agattatgtg gagcaccccg 2040
ggcacggttg caggtcttgt cattatcacc ggaggaatac gggggaccca gatattatgt 2100
gttcgctttg ctatatgagg acctgtggca tgtttgtcta cagtaagtga aaattatggg 2160
cagtgggtga tagagtggtg ggtttggtgt ggtaattttt tttttaattt ttacagtttt 2220
gtggtttaaa gaattttgta ttgtgatttt tttaaaaggt cctgtgtctg aacctgagcc 2280
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gtatataatg cgccgtgggc taatcttggt tacatctgac ctcatggagg cttgggagtg 2760
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gttttggagg tttctgtggg gctcatccca ggcaaagtta gtctgcagaa ttaaggagga 2880
ttacaagtgg gaatttgaag agcttttgaa atcctgtggt gagctgtttg attctttgaa 2940
tctgggtcac caggcgcttt tccaagagaa ggtcatcaag actttggatt tttccacacc 3000
ggggcgcgct gcggctgctg ttgctttttt gagttttata aaggataaat ggagcgaaga 3060
aacccatctg agcggggggt acctgctgga ttttctggcc atgcatctgt ggagagcggt 3120
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ggaggagcag cagcagcagc aggaggaagc caggcggcgg cggcaggagc agagcccatg 3240
gaacccgaga gccggcctgg accctcggga atgaatgttg tacaggtggc tgaactgtat 3300
ccagaactga gacgcatttt gacaattaca gaggatgggc aggggctaaa gggggtaaag 3360
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accagacacc gtcctgagtg tattactttt caacagatca aggataattg cgctaatgag 3480
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aacatggtat gtggcaactg cgaggacagg gcctctcaga tgctgacctg ctcggacggc 4140
aactgtcacc tgctgaagac cattcacgta gccagccact ctcgcaaggc ctggccagtg 4200
tttgagcata acatactgac ccgctgttcc ttgcatttgg gtaacaggag gggggtgttc 4260
ctaccttacc aatgcaattt gagtcacact aagatattgc ttgagcccga gagcatgtcc 4320
aaggtgaacc tgaacggggt gtttgacatg accatgaaga tttggaaggt gctgagatac 4380
gacgagaccc ggacaagatg caggccatgc gagtgcggcg gcaagcacat tagaaaccag 4440
ccagtgatgc tcgacgtgac agaggaatta cgccctgacc acctcgtgct ggcctgcaca 4500
cgcgccgagt tcggctctag cgacgaggac acagactgat taattaactg tgccttctag 4560
ttgccagcca tctgttgttt gcccctcccc cgtgccttcc ttgaccctgg aaggtgccac 4620
tcccactgtc ctttcctaat aaaatgagga aattgcatcg cattgtctga gtaggtgtca 4680
ttctattctg gggggtgggg tggggcagga cagcaagggg gaggattggg aagacaatag 4740
caggcatgct ggggatgcgg tgggctctat gggtttaaac ataacttcgt atagcataca 4800
ttatacgaag ttatgcggcc gcaatgtagt cttatgcaat actcttgtag tcttgcaaca 4860
tggtaacgat gagttagcaa catgccttac aaggagagaa aaagcaccgt gcatgccgat 4920
tggtggaagt aaggtggtac gatcgtgcct tattaggaag gcaacagacg ggtctgacat 4980
ggattggacg aaccactgaa ttccgcattg cagagatatt gtatttaagt gcctagctcg 5040
atacaataaa cgccatttga ccattcacca cattggtgtg caccgcggcc gcatgaccga 5100
gtacaagccc acggtgcgcc tcgccacccg cgacgacgtc cccagggccg tacgcaccct 5160
cgccgccgcg ttcgccgact accccgccac gcgccacacc gtcgatccgg accgccacat 5220
cgagcgggtc accgagctgc aagaactctt cctcacgcgc gtcgggctcg acatcggcaa 5280
ggtgtgggtc gcggacgacg gcgccgcggt ggcggtctgg accacgccgg agagcgtcga 5340
agcgggggcg gtgttcgccg agatcggccc gcgcatggcc gagttgagcg gttcccggct 5400
ggccgcgcag caacagatgg aaggcctcct ggcgccgcac cggcccaagg agcccgcgtg 5460
gttcctggcc accgtcggcg tctcgcccga ccaccagggc aagggtctgg gcagcgccgt 5520
cgtgctcccc ggagtggagg cggccgagcg cgccggggtg cccgccttcc tggagacctc 5580
cgcgccccgc aacctcccct tctacgagcg gctcggcttc accgtcaccg ccgacgtcga 5640
ggtgcccgaa ggaccgcgca cctggtgcat gacccgcaag cccggtgcct gaaataaagg 5700
aaatttattt tcattgcaat agtgtgttgg aattttttgt gtctctcaat aacttcgtat 5760
agcatacatt atacgaagtt atgattggtg acagaaaagc cccatcctta ggcctcctcc 5820
ttcctagtct cctgatattg ggtctaaccc ccacctcctg ttaggcagat tccttatctg 5880
gtgacacacc cccatttcct ggagccatct ctctccttgc cagaacctct aaggtttgct 5940
tacgatggag ccagagagga tcctgggagg gagagcttgg cagggggtgg gagggaaggg 6000
ggggatgcgt gacctgcccg gttctcagtg gccaccctgc gctaccctct cccagaacct 6060
gagctgctct gacgcggccg tctggtgcgt ttcactgatc ctggtgctgc agcttcctta 6120
cacttcccaa gaggagaagc agtttggaaa aacaaaatca gaataagttg gtcctgagtt 6180
ctaactttgg ctcttcacct ttctagtccc caatttatat tgttcctccg tgcgtcagtt 6240
ttacctgtga gataaggcca gtagccagcc ccgtcctggc agggctgtgg tgaggagggg 6300
ggtgtccgtg tggaaaactc cctttgtgag aatggtgcgt cctaggtgtt caccaggtcg 6360
tggccgcctc tactcccttt ctctttctcc atccttcttt ccttaaagag tccccagtgc 6420
tatctgggac atattcctcc gcccagagca gggtcccgct tccctaaggc cctgctctgg 6480
gcttctgggt ttgagtcctt ggcaagccca ggagaggcgc tcaggcttcc ctgtccccct 6540
tcctcgtcca ccatctcatg cccctggctc tcctgcccct tctatcgtcg acctgcaggc 6600
atgcaagctt ggcgtaatca tggtcatagc tgtttcctgt gtgaaattgt tatccgctca 6660
caattccaca caacatacga gccggaagca taaagtgtaa agcctggggt gcctaatgag 6720
tgagctaact cacattaatt gcgttgcgct cactgcccgc tttccagtcg ggaaacctgt 6780
cgtgccagct gcattaatga atcggccaac gcgcggggag aggcggtttg cgtattgggc 6840
gctcttccgc ttcctcgctc actgactcgc tgcgctcggt cgttcggctg cggcgagcgg 6900
tatcagctca ctcaaaggcg gtaatacggt tatccacaga atcaggggat aacgcaggaa 6960
agaacatgtg agcaaaaggc cagcaaaagg ccaggaaccg taaaaaggcc gcgttgctgg 7020
cgtttttcca taggctccgc ccccctgacg agcatcacaa aaatcgacgc tcaagtcaga 7080
ggtggcgaaa cccgacagga ctataaagat accaggcgtt tccccctgga agctccctcg 7140
tgcgctctcc tgttccgacc ctgccgctta ccggatacct gtccgccttt ctcccttcgg 7200
gaagcgtggc gctttctcat agctcacgct gtaggtatct cagttcggtg taggtcgttc 7260
gctccaagct gggctgtgtg cacgaacccc ccgttcagcc cgaccgctgc gccttatccg 7320
gtaactatcg tcttgagtcc aacccggtaa gacacgactt atcgccactg gcagcagcca 7380
ctggtaacag gattagcaga gcgaggtatg taggcggtgc tacagagttc ttgaagtggt 7440
ggcctaacta cggctacact agaagaacag tatttggtat ctgcgctctg ctgaagccag 7500
ttaccttcgg aaaaagagtt ggtagctctt gatccggcaa acaaaccacc gctggtagcg 7560
gtggtttttt tgtttgcaag cagcagatta cgcgcagaaa aaaaggatct caagaagatc 7620
ctttgatctt ttctacgggg tctgacgctc agtggaacga aaactcacgt taagggattt 7680
tggtcatgag attatcaaaa aggatcttca cctagatcct tttaaattaa aaatgaagtt 7740
ttaaatcaat ctaaagtata tatgagtaaa cttggtctga cagttaccaa tgcttaatca 7800
gtgaggcacc tatctcagcg atctgtctat ttcgttcatc catagttgcc tgactccccg 7860
tcgtgtagat aactacgata cgggagggct taccatctgg ccccagtgct gcaatgatac 7920
cgcgagaccc acgctcaccg gctccagatt tatcagcaat aaaccagcca gccggaaggg 7980
ccgagcgcag aagtggtcct gcaactttat ccgcctccat ccagtctatt aattgttgcc 8040
gggaagctag agtaagtagt tcgccagtta atagtttgcg caacgttgtt gccattgcta 8100
caggcatcgt ggtgtcacgc tcgtcgtttg gtatggcttc attcagctcc ggttcccaac 8160
gatcaaggcg agttacatga tcccccatgt tgtgcaaaaa agcggttagc tccttcggtc 8220
ctccgatcgt tgtcagaagt aagttggccg cagtgttatc actcatggtt atggcagcac 8280
tgcataattc tcttactgtc atgccatccg taagatgctt ttctgtgact ggtgagtact 8340
caaccaagtc attctgagaa tagtgtatgc ggcgaccgag ttgctcttgc ccggcgtcaa 8400
tacgggataa taccgcgcca catagcagaa ctttaaaagt gctcatcatt ggaaaacgtt 8460
cttcggggcg aaaactctca aggatcttac cgctgttgag atccagttcg atgtaaccca 8520
ctcgtgcacc caactgatct tcagcatctt ttactttcac cagcgtttct gggtgagcaa 8580
aaacaggaag gcaaaatgcc gcaaaaaagg gaataagggc gacacggaaa tgttgaatac 8640
tcatactctt cctttttcaa tattattgaa gcatttatca gggttattgt ctcatgagcg 8700
gatacatatt tgaatgtatt tagaaaaata aacaaatagg ggttccgcgc acatttcccc 8760
gaaaagtgcc acctgacgtc taagaaacca ttattatcat gacattaacc tataaaaata 8820
ggcgtatcac gaggcccttt cgtc 8844
Claims (14)
1.一种腺病毒包装与生产细胞，其中所述细胞的基因组包含改造的腺病毒E1区序列，所述改造的腺病毒E1区序列与野生型E1区序列相比：1)野生型E1区序列中的低频密码子被所述细胞中最优的同义密码子替换；2)碱基重复减少；3)避免野生型E1区序列中的一些限制酶识别位点；4)GC含量提高；5)避免转录获得的mRNA具有二级结构；6)避免密码子重复导致的长重复序列；
所述改造的腺病毒E1区序列编码的蛋白具有与野生型E1A和E1B蛋白相同的功能，优选地，所述改造的腺病毒E1区序列编码的蛋白具有与野生型E1A和E1B蛋白相同的氨基酸序列。
2.如权利要求1所述的细胞，其中所述改造的腺病毒E1区序列选自SEQ ID NO:2和SEQID NO:4-7。
3.如权利要求2所述的细胞，其中所述改造的腺病毒E1区序列为SEQ ID NO:2。
4.如权利要求1-3任一所述的细胞，其中所述改造的腺病毒E1区序列还包含启动子，优选地，所述启动子选自SV40启动子和mPGK启动子。
5.如权利要求1-4任一所述的细胞，其中所述细胞是人源细胞。
6.如权利要求5所述的细胞，其中所述细胞选自来源于A549、A375、HeLa、SW620、22RV1、MDA-MB-435S、ES-2和HCC1806细胞。
7.如权利要求6所述的细胞，其中所述细胞为HeLa S3细胞。
8.如权利要求1-7任一所述的细胞，其中所述改造的腺病毒E1区序列在所述细胞基因组中的插入位点选自AAVS1、CCR5、ROSA26、LMO2、CCDN2、BMI1\MECOM\PRDM1、H11、HBB03、HBB04、FANCF02、RUNX1和ZSCAN2。
9.如权利要求8所述的细胞，其中所述改造的腺病毒E1区序列在所述细胞基因组中的插入位点为AAVS1位点。
10.如权利要求1-9任一所述的细胞，其中所述细胞能够包装与生产复制缺陷型腺病毒和复制型腺病毒，在复制型腺病毒连续传代时不产生野生型腺病毒。
11.一种构建如权利要求1-10任一所述的腺病毒包装与生产细胞的方法，包括：
对野生型E1区序列进行改造，获得改造的腺病毒E1区序列；
将所述改造的腺病毒E1区序列插入宿主细胞基因组；
其中，所述改造的腺病毒E1区序列与野生型E1区序列相比：1)野生型E1区序列的低频密码子被所述细胞中最优的同义密码子替换；2)碱基重复减少；3)避免野生型E1区序列中的一些限制酶识别位点；4)GC含量提高；5)避免转录获得的mRNA具有二级结构；6)避免密码子重复导致的长重复序列；
所述改造的腺病毒E1区序列编码的蛋白具有与野生型E1A和E1B蛋白相同的功能。
12.如权利要求11所述的方法构建获得的腺病毒包装与生产细胞。
13.如权利要求1-10任一所述的腺病毒包装与生产细胞和如权利要求11的方法构建的细胞在制备复制缺陷型腺病毒和复制型腺病毒中的用途。
14.一种生产/包装腺病毒的方法，包括：
1)将腺病毒或编码腺病毒蛋白的多核苷酸导入权利要求1-10任一所述的腺病毒包装与生产细胞；
2)培养步骤1)获得的细胞；和
3)收集病毒。
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| PCT/CN2023/100118 WO2023241610A1 (zh) | 2022-06-15 | 2023-06-14 | 一种腺病毒包装与生产细胞系的构建方法及应用 |
Applications Claiming Priority (1)
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|---|---|---|---|
| CN202210674162.8A CN117264902A (zh) | 2022-06-15 | 2022-06-15 | 一种腺病毒包装与生产细胞系的构建方法及应用 |
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