ES2335657T3 - Medios y metodos para la produccion de vectores de adenovirus. - Google Patents
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Abstract
Vector de adenovirus recombinante que comprende elementos estructurales y no estructurales de un adenovirus de un primer serotipo, en el que dicho vector comprende además una secuencia que codifica para una proteína E4-orf6 funcional, en el que dicha secuencia se selecciona del grupo que consiste en: a) una secuencia que codifica para E4-orf6 de un adenovirus de un segundo serotipo diferente de dicho primer serotipo; y b) una secuencia que codifica para E4-orf6 que comprende una fusión entre una parte de una secuencia que codifica para E4-orf6 de un segundo serotipo diferente de dicho primer serotipo y una parte de una secuencia que codifica para E4-orf6 de un tercer serotipo, en el que dicho tercer serotipo puede ser idéntico a o diferente de dicho primer serotipo.
Description
Medios y métodos para la producción de vectores
de adenovirus.
La invención se refiere a vehículos de
suministro de ácido nucleico y al uso de los mismos, más en
particular la invención se refiere a vectores adenovirales
recombinantes y al uso de los mismos.
Hasta la fecha se han identificado 51 serotipos
de adenovirus humanos que se subdividen en 6 subgrupos (A, B, C, D,
E y F) basándose en las propiedades de hemaglutinación y homología
de secuencia (Francki et al., 1991). El ciclo infeccioso de
los adenovirus se divide en una fase temprana y una tardía. En la
fase temprana, el virus no está recubierto y el genoma se
transporta al núcleo tras lo cual las regiones génicas tempranas
(E1, E2, E3 y E4) se vuelven transcripcionalmente activas. La región
E1 contiene dos regiones de transcripción: E1A y E1B. E1A codifica
para proteínas que están implicadas en la modificación del ciclo de
células huésped y la activación de las demás regiones de
transcripción virales (revisado por Rusell. 2000). La región E1B
codifica para dos proteínas principales: E1B-19K y
E1B-55K, que evitan la inducción de apoptosis que
resulta de la actividad de las proteínas E1A (Rao et al.,
1992; Yew y Berk 1992; Shenk 1996). Además, se requiere la proteína
E1B-55K en la fase tardía para el transporte de ARNm
viral selectivo y la inhibición de la expresión de proteínas
huésped (Pilder et al., 1986). E2 se divide también en dos
subdominios: E2A y E2B, que juntos codifican para tres proteínas
(una proteína de unión a ADN, una polimerasa viral y una proteína
pre-terminal), que están todas implicadas en la
replicación del genoma viral (Van der Vliet 1995). E3 no es
necesaria para la replicación in vitro pero codifica para
varias proteínas que debilitan el mecanismo de defensa del huésped
frente a la infección viral (Horwitz 2001). E4 porta al menos 6
marcos de lectura abiertos (orf) que codifican para proteínas
implicadas en varias funciones distintas relacionadas con el corte y
empalme y transporte de ARNm viral, transporte de ARNm de células
huésped, transcripción y transformación viral y celular (revisado
por Leppard 1997). Las proteínas tardías, necesarias para la
formación de las cápsidas virales y el empaquetamiento de los
genomas virales, se generan todas a partir de la unidad de
transcripción tardía principal (MLTU) que se vuelve completamente
activa después del inicio de la replicación. Un proceso complejo de
corte y empalme diferencial y poliadenilación da origen a más de 15
especies de ARNm que comparten una secuencia líder tripartita. Las
proteínas E1B-55K, E4-crf3 y
E4-orf6 desempeñan un papel fundamental en la
regulación del procesamiento y transporte de ARNm viral tardío desde
el núcleo. Para este proceso E1B-55K interactúa con
E4-orf6 para formar un complejo funcional que
estimula el transporte de moléculas de ARNm virales al citoplasma,
mientras que el complejo está también implicado en la inhibición del
transporte de ARNm celulares del núcleo al citoplasma (revisado por
Leppard 1997 y 1998).
La producción de vectores con deleción de E1
basándose en serotipos Ad5 o Ad2 del subgrupo C se logra en líneas
celulares de complementación E1 tales como 293 (Graham et
al., 1970), 911 (Fallaux et al., 1996) y PER.C6^{TM}
(Fallaux et al., 1998; N.º de depósito ECACC 96022940). Tal
como se da a conocer en el documento WO 99/55132 y el documento WO
01/05945, los vectores y las líneas celulares pueden aparearse para
evitar la generación de adenovirus competentes en replicación a
través de recombinación homóloga entre secuencias de adenovirus en
la línea celular y el vector. Para una producción eficiente de
adenovirus incompetentes en replicación derivados del grupo C, se
usa preferiblemente la línea celular PER.C6^{TM}. Usando esta
línea celular pueden aparearse los vectores de adenovirus,
permitiendo de esta manera la producción de vectores adenovirales de
grupo C en ausencia de adenovirus competentes en replicación
(Fallaux et al., 1998; patente de los EE.UU. N.º 6.033.908).
Sin embargo, los vectores del grupo C podrían no siempre ser los
vehículos ideales para aplicaciones in vivo directas puesto
que la eficacia de infección está afectada seriamente por la
presencia de altos títulos de actividad neutralizante en la mayoría
de los seres humanos y la ausencia de cantidades suficientes del
receptor celular (receptor de adenovirus de Coxsackie, CAR) en
células diana primarias específicas (por ejemplo células
endoteliales, células de músculo liso, sinoviocitos, monocitos y
células dendríticas). La administración de cantidades más altas de
virus para aumentar la transducción puede llevar a toxicidad
aumentada y a un resultado clínico impredecible debido a la
variación en los títulos neutralizantes de los sujetos que se
tratan. Estas limitaciones pueden ser superadas por el uso de otros
serotipos de adenovirus. Por ejemplo, la parte de unión a receptor
de una fibra de virus de subgrupo B (en particular del serotipo 16)
cuando se expresa en un vector basado en Ad5, media una infección
significativamente aumentada de células endoteliales y células de
músculo liso humanas (documento WO 00/31285) y de sinoviocitos
humanos (documento WO 00/52186). La fibra de otro adenovirus de
subgrupo B, Ad35, es más eficaz para mediar la infección de
monocitos humanos y células dendríticas (documento WO 00/03029).
Además, se ha identificado Ad35 como un virus para el cual la vasta
mayoría de la población humana no tiene actividad neutralizante
(documento WO 00/70071).
Existe una necesidad generalmente sentida en la
técnica por desarrollar tecnología que tenga una utilidad de
serotipo más amplia. Un problema particular es la falta de líneas
celulares de empaquetamiento adecuadas para estos otros serotipos.
Las líneas celulares de empaquetamiento para vectores Ad5 comprenden
normalmente proteínas codificadas E1 derivadas del serotipo 5 de
adenovirus. Ejemplos de estas líneas celulares de empaquetamiento
"patrón" son 293, 911 y P3R.C6^{TM}. Los intentos por
producir vectores derivados de otros serotipos en estas líneas
celulares de empaquetamiento patrón han demostrado ser difíciles si
no insatisfactorios. Ocasionalmente se observa cierta producción,
dependiendo del serotipo particular usado. Sin embargo, los
rendimientos de vectores de adenovirus recombinantes derivados de
subgrupos de adenovirus que no son de subgrupo C, producidos en
líneas celulares transformadas e inmortalizadas por E1 de Ad5, es
deficiente. En un artículo de Abrahamsen et al., (1997), una
purificación de placa mejorada de un vector de serotipo 7 de
adenovirus con deleción de E1A (subgrupo B) se observó en células
293 que comprendían E4-orf6 derivada del serotipo 5
de adenovirus, en comparación con células 293 que carecían de la
secuencia E4-orf6 de Ad5. Sin embargo, se encontró
un problema con la estabilidad del vector ya que se observaron
recombinaciones inesperadas en grupos purificados en placa. Un
problema adicional se encontró con la contaminación de virus de
adenovirus de tipo natural durante la producción. Además, para la
producción a gran escala de adenovirus no es útil cotransfectar
E4-orf6 para obtener títulos que sean lo
suficientemente altas como para su aplicación. Una opción para el
crecimiento de tales adenovirus es proporcionar células con el gen
E4-orf6 integrado establemente en el genoma de la
línea de células de complementación/empaquetamiento. Se han
descrito tales células en la técnica (por ejemplo, el documento WO
96/22378). Una desventaja de ese sistema es el hecho de que han de
generarse nuevas líneas celulares estables, y han de realizarse
numerosas rondas de selección antes de que células estables y
adecuadas se hayan generado. Este proceso es laborioso y requiere
mucho tiempo. En general, puede decirse que la generación y
propagación de adenovirus de serotipos diferentes del serotipo 5
(subgrupo C), tales como virus del subgrupo B, ha demostrado ser
difícil en células de complementación Ad5. Se ha dado a conocer por
los solicitantes en el documento WO 00/70071, que pueden hacerse
virus recombinantes basándose en el virus de Ad35 del subgrupo B
mediante la cotransfección de una construcción de expresión que
contiene las secuencias de la región 1 temprana de Ad35
(Ad35-E1). Además, los virus basados en Ad35 que
están delecionados solamente para las secuencias E1A y no para E1B
mostraron replicarse eficazmente en células PER.C6, sugiriendo que
las proteínas E1A de Ad5 son capaces de complementar las funciones
de Ad35-E1A (solicitud internacional del solicitante
PCT/NL01/00824). Además, los experimentos muestran que la falta de
Ad35-E1B da como resultado rendimientos deficientes
en células de complementación de Ad5. El documento WO 00/70071
también da a conocer líneas celulares para la producción de vectores
adenovirales que no son de grupo C y con deleción de E1 mediante
modificación adicional de líneas celulares que son capaces de
complementar el serotipo 5 de adenovirus. El documento WO 00/70071
sugiere además que se deben establecer líneas celulares nuevas que
porten secuencias Ad35-E1 para la complementación de
vectores de serotipo 35 de adenovirus recombinantes que carezcan de
la región E1 (véase también la solicitud internacional del
solicitante PCT/NL01/00824). Sin embargo, como también se trató
anteriormente, si se desea aplicar un serotipo específico para una
necesidad específica, tendría que establecerse una nueva línea
celular para cada serotipo específico, o tendrían que modificarse
las líneas celulares disponibles que pudieran complementar el
serotipo 5 de adenovirus para la complementación del serotipo de
interés. Sería claramente ventajoso usar las líneas celulares
establecidas que están disponibles en la técnica, y no modificar
éstas y usarlas para la producción de todos los demás serotipos que
no sean de Ad5, aplicando los métodos establecidos y eficaces
conocidos en la técnica. Se concluye que hasta la presente
invención, ninguna "plataforma de producción" flexible y
adecuada estaba disponible en la técnica que hiciera posible
producir rendimientos útiles de serotipos de adenovirus que fueran
diferentes de los serotipos del subgrupo C.
La figura 1 es una representación esquemática
del plásmido p\DeltaMT.Orf6.Hygro (N.º de depósito ECACC
P02041226). Por motivos de claridad, la D mayúscula indica delta (\Delta).
P02041226). Por motivos de claridad, la D mayúscula indica delta (\Delta).
La figura 2 es una representación esquemática
del plásmido pAd35.\DeltaMT.Orf6. Por motivos de claridad, la D
mayúscula indica delta (\Delta).
La figura 3 es una representación esquemática de
pUC.35-5E4.
La figura 4 es una representación de las etapas
de clonaje que llevan a pUC.35-5E4.
La figura 5 es una representación esquemática de
pBr.Ad35.PRn.
La figura 6 es una representación esquemática de
pBr.Ad35.PR5E4 (N.º de depósito ECACC P02041229).
La figura 7 es una representación esquemática de
pWE.Ad35.pIX-rITR.5E4.
La figura 8 es una representación esquemática de
pCRscriptAmp.NFI-NcoIR.
La figura 9 es una representación esquemática de
pCRscriptAmp.NcoIF-NR2.
La figura 10 es una representación esquemática
de pCR.NF1-NR2.
La figura 11 muestra el alineamiento entre la
secuencia de aminoácidos de E4-orf6 del serotipo 5
de Adenovirus (SEQ ID NO:21; secuencia superior) con la secuencia
de aminoácidos de la proteína E4-orf6 del serotipo 5
de adenovirus clonada en la estructura principal de Ad35 (SEQ ID
NO:21); secuencia intermedia; NB. idéntica a
E4-orf6 de Ad5, secuencia superior) como la obtenida
mediante la determinación del orden de nucleótidos, y la secuencia
de aminoácidos de la proteína E4-orf6 del serotipo
35 de adenovirus (SEQ ID NO:22; secuencia inferior), que muestra
que el fragmento completo que codifica para la proteína
E4-orf6 en la estructura principal del serotipo 35
de adenovirus se ha reemplazado por el fragmento que codifica para
la proteína E4-orf6 del serotipo 5 de
adenovirus.
La figura 12 muestra el alineamiento entre la
secuencia de aminoácidos de la proteína E4-orf6/7
del serotipo 5 de adenovirus (SEQ ID NO:23; secuencia superior) con
la secuencia de aminoácidos de la proteína de fusión
E4-crf6/7 codificada parcialmente por el fragmento
E4-orf6/7 del serotipo 5 de adenovirus que reemplaza
la parte correspondiente del fragmento E4-orf6/7
del serotipo 35 de adenovirus en la estructura principal del
serotipo 35 de adenovirus (SEQ ID NO:24; secuencia intermedia) y la
secuencia de aminoácidos de la proteína E4-orf6/7
del serotipo 35 de adenovirus (SEQ ID NO:25; secuencia inferior),
que muestra que la secuencia orf6/7 es parcialmente quimérica, con
la fusión aproximadamente en el residuo de lisina (K) en la posición
138. Por motivos de claridad, la anotación orf6+7 debe leerse como
el marco de lectura abierto orf6/7, el cual es un marco de lectura
abierto separado dentro de la región E4 de adenovirus aparte de orf6
y orf7, que es una anotación bien conocida por los expertos en la
técnica.
La figura 13 es una representación esquemática
de pBr.Ad35.PR.5Orf6 (N.º de depósito ECACC P02041227).
La figura 14 es una representación esquemática
de pWE.Ad35.pIX-rITR.5Orf6.
La figura 15 es una representación esquemática
de pBr.Ad35.PRn\DeltaE3. Por motivos de claridad, la D mayúscula
indica delta (\Delta).
La figura 16 es una representación esquemática
de pBr.Ad35.\DeltaE3.PR5E4. Por motivos de claridad, la D
mayúscula indica delta (\Delta).
La figura 17 es una representación esquemática
de pBr.Ad35.\DeltaE3.PR5Orf6. Por motivos de claridad, la D
mayúscula indica delta (\Delta).
La figura 18 muestra el sistema para producir
partículas adenovirales recombinantes en células tales como PER.C6
a través de un evento de doble recombinación homóloga.
La figura 19 es una representación esquemática
de pWE.Ad35.pIX-EcoRV.
La presente invención proporciona vectores de
adenovirus recombinantes que comprenden elementos estructurales y
no estructurales de un adenovirus de un primer serotipo, en los que
dicho vector comprende además una secuencia que codifica para una
proteína E4-orf6, en el que dicha secuencia se
selecciona del grupo que consiste en: una secuencia que codifica
para E4-orf6 derivada de un adenovirus de un segundo
serotipo diferente de dicho primer serotipo y una secuencia que
codifica para E4-orf6 que comprende una fusión entre
una parte de una secuencia que codifica para
E4-orf6 derivada de un segundo serotipo diferente de
dicho primer serotipo y una parte de una secuencia que codifica
para E4-orf6 derivada de un tercer serotipo, en la
que dicho tercer serotipo puede ser idéntico a o diferente de dicho
primer serotipo.
La invención proporciona además métodos para la
producción de tales vectores de adenovirus recombinantes que
comprenden elementos estructurales y no estructurales de un
adenovirus de un primer serotipo, comprendiendo dicho método las
etapas de: a) proporcionar una célula de complementación que porte
una secuencia que codifica para E1B-55K, derivada
de un adenovirus de un segundo serotipo en forma expresable, con los
elementos necesarios de un adenovirus tales como para permitir el
ensamblaje de dicho vector de adenovirus recombinante por dicha
célula de complementación, en el que dichos elementos comprenden al
menos algunos elementos estructurales y no estructurales de un
adenovirus de dicho primer serotipo diferente de dicho segundo
serotipo y una secuencia que codifica para una proteína
E4-orf6 funcional que sea compatible con dicha
proteína E1B-55K expresable en dicha célula de
complementación; b) cultivar la célula de complementación en un
medio en condiciones que permitan que tenga lugar la producción y
ensamblaje del vector de adenovirus y c) recoger el vector de
adenovirus recombinante producido de esta manera del medio y/o la
célula de complementación, en el que la secuencia que codifica para
la proteína E4-orf6 compatible está presente en el
vector de adenovirus recombinante producido de esta manera.
La invención se refiere además a composiciones
farmacéuticas que comprenden vectores adenovirales según la
invención y al tratamiento de individuos usando los vectores
adenovirales proporcionados por la presente invención. La invención
se refiere también a un kit de partes que comprende líneas celulares
y vectores adenovirales proporcionados por la invención para
ejecutar los métodos proporcionados por la invención.
La presente invención describe métodos y medios
que resuelven ciertas dificultades relacionadas con una
complementación disminuida de vectores adenovirales que no son del
grupo C en células de empaquetamiento/complemen-
tación de Ad5. Aunque en las líneas de células de complementación de Ad5 la expresión de E1B-55K de Ad5 funcional está presente, se encontró que sólo muy bajos títulos de vectores adenovirales podían producirse cuando la estructura principal adenoviral era de un origen adenoviral que no era de grupo C; este descubrimiento implica una especificidad de serotipo en la interacción de E1B-55K con otra proteína (viral). Se da a conocer aquí que puede superarse esta dependencia de serotipo al proporcionar una proteína E4-orf6 compatible con la proteína E1B-55K proporcionada por la línea celular de complementación. Tal como se trata en el presente documento, E1B-55K y E4-orf6 forman un complejo que está implicado en inhibir el transporte de ARNm celulares del núcleo al citoplasma, mientras que el complejo también está implicado en la estimulación del transporte de ARNm virales del núcleo al citoplasma. Se ha observado por los presentes inventores que la complementación adecuada de vectores virales en células de empaquetamiento requiere la presencia de productos génicos E1B-55K y E4-orf6 que sean compatibles. Las células de empaquetamiento también son referidas como células de complementación, si las células comprenden ciertas secuencias que codifiquen para proteínas que complementen funciones no proporcionadas por el vector que deba ser empaquetado. "Compatible" tal como se usa en el presente documento significa por tanto que un complejo entre el producto génico E1B-55K disponible es capaz de formar un complejo funcional con el producto génico E4-orf6 disponible en un sentido de que este complejo de proteínas soporte la replicación, propagación y/o empaquetamiento viral hasta un nivel que sea comparable con el de la situación de tipo natural o que sea comparable con la situación encontrada cuando un vector de serotipo 5 de adenovirus recombinante se produzca en una línea de células de complementación Ad5 tal como 293 o PER.C6. La replicación de vectores en células de empaquetamiento es eficaz si, durante el periodo de producción en el cual el virus se forma, la célula comprende al menos la proteína E1B-55K y la proteína E4-orf6 que sean compatibles. Preferiblemente, las secuencias de E1B-55K y E4-orf6 son de adenovirus dentro del mismo subgrupo de adenovirus (tal como A, B, C, D, E o F). Más preferiblemente, las secuencias de E1B-55K y E4-orf6 son del mismo serotipo. Ya que están disponibles en la técnica líneas celulares establecidas que son capaces de soportar el crecimiento de adenovirus del subgrupo C, tales como el serotipo 5, se prefiere aún más que los genes E1B-55K y E4-orf6 se deriven del serotipo 5 de adenovirus. Como entenderá el experto en la técnica, la compatibilidad puede determinarse en pruebas o ensayos de complementación como aquellos en el campo de los expertos en la técnica de la producción de vectores adenovirales. El experto en la técnica también entenderá que la presente invención puede usarse también para la producción de cualquier serotipo de adenovirus en cualquier línea de células de complementación, siempre y cuando las proteínas E1B-55K y E4-orf6 sean compatibles.
tación de Ad5. Aunque en las líneas de células de complementación de Ad5 la expresión de E1B-55K de Ad5 funcional está presente, se encontró que sólo muy bajos títulos de vectores adenovirales podían producirse cuando la estructura principal adenoviral era de un origen adenoviral que no era de grupo C; este descubrimiento implica una especificidad de serotipo en la interacción de E1B-55K con otra proteína (viral). Se da a conocer aquí que puede superarse esta dependencia de serotipo al proporcionar una proteína E4-orf6 compatible con la proteína E1B-55K proporcionada por la línea celular de complementación. Tal como se trata en el presente documento, E1B-55K y E4-orf6 forman un complejo que está implicado en inhibir el transporte de ARNm celulares del núcleo al citoplasma, mientras que el complejo también está implicado en la estimulación del transporte de ARNm virales del núcleo al citoplasma. Se ha observado por los presentes inventores que la complementación adecuada de vectores virales en células de empaquetamiento requiere la presencia de productos génicos E1B-55K y E4-orf6 que sean compatibles. Las células de empaquetamiento también son referidas como células de complementación, si las células comprenden ciertas secuencias que codifiquen para proteínas que complementen funciones no proporcionadas por el vector que deba ser empaquetado. "Compatible" tal como se usa en el presente documento significa por tanto que un complejo entre el producto génico E1B-55K disponible es capaz de formar un complejo funcional con el producto génico E4-orf6 disponible en un sentido de que este complejo de proteínas soporte la replicación, propagación y/o empaquetamiento viral hasta un nivel que sea comparable con el de la situación de tipo natural o que sea comparable con la situación encontrada cuando un vector de serotipo 5 de adenovirus recombinante se produzca en una línea de células de complementación Ad5 tal como 293 o PER.C6. La replicación de vectores en células de empaquetamiento es eficaz si, durante el periodo de producción en el cual el virus se forma, la célula comprende al menos la proteína E1B-55K y la proteína E4-orf6 que sean compatibles. Preferiblemente, las secuencias de E1B-55K y E4-orf6 son de adenovirus dentro del mismo subgrupo de adenovirus (tal como A, B, C, D, E o F). Más preferiblemente, las secuencias de E1B-55K y E4-orf6 son del mismo serotipo. Ya que están disponibles en la técnica líneas celulares establecidas que son capaces de soportar el crecimiento de adenovirus del subgrupo C, tales como el serotipo 5, se prefiere aún más que los genes E1B-55K y E4-orf6 se deriven del serotipo 5 de adenovirus. Como entenderá el experto en la técnica, la compatibilidad puede determinarse en pruebas o ensayos de complementación como aquellos en el campo de los expertos en la técnica de la producción de vectores adenovirales. El experto en la técnica también entenderá que la presente invención puede usarse también para la producción de cualquier serotipo de adenovirus en cualquier línea de células de complementación, siempre y cuando las proteínas E1B-55K y E4-orf6 sean compatibles.
Se ha observado además que el producto génico
E4-orf6 que, "coincide" con el E1B en la línea
de células de complementación, puede proporcionarse por el vector
adenoviral, reemplazando el E4-orf6 en el vector
adenoviral de elección con una secuencia que codifica para
E4-orf6 que sea compatible con el gen E1B presente
dentro de la línea celular de empaquetamiento. Se encontró
sorprendentemente que esta modificación no tenía un efecto severo
en estabilidad, replicación, empaquetamiento, ensamblaje y
producción del vector.
Un aspecto específico de la invención es que
ahora puede producirse eficazmente serotipos de adenovirus
diferentes de aquellos del subgrupo C en líneas celulares aplicadas
normalmente para la producción de serotipo 5 de adenovirus u otro
serotipo del subgrupo C, tal como serotipo 1, 2 y 6. La presente
invención proporciona métodos para la producción de adenovirus que
no son del grupo C sin la necesidad de proporcionar por separado la
célula (de empaquetamiento) de complementación con
E4-orf6 debido a que la secuencia de
E4-orf6, que es compatible con la secuencia de
E1B-55K de complementación, se incorpora en la
estructura principal adenoviral.
La presente invención proporciona un vector de
adenovirus recombinante que comprende elementos estructurales y no
estructurales de un adenovirus de un primer serotipo, en el que
dicho vector comprende además una secuencia que codifica para una
proteína E4-orf6 funcional en el que dicha secuencia
se selecciona del grupo que consiste en: una secuencia que codifica
para E4-orf6 derivada de un adenovirus de un segundo
serotipo diferente de dicho primer serotipo y una secuencia que
codifica para E4-orf6 que comprende una fusión entre
una parte de una secuencia que codifica para
E4-orf6 derivada de un segundo serotipo diferente de
dicho primer serotipo y una parte de una secuencia que codifica
para E4-orf6 derivada de un tercer serotipo, en el
que dicho tercer serotipo puede ser idéntico a o diferente de dicho
primer serotipo. En una realización, la presente invención
proporciona un vector de adenovirus recombinante según la invención,
en el que dicho primer serotipo y dicho segundo serotipo son de
diferentes subgrupos de adenovirus. En una realización preferida, se
proporciona un vector de adenovirus recombinante según la
invención, en el que dicho primer serotipo es de un subgrupo que
diferente del subgrupo C y en el que dicha secuencia que codifica
para E4-orf6 se deriva de un serotipo de adenovirus
del subgrupo C. Se prefiere más un adenovirus recombinante según la
invención, en el que dicho primer serotipo es del subgrupo B y
dicho segundo serotipo es del subgrupo C. Aún más preferiblemente,
dicha secuencia que codifica para E4-orf6 se deriva
del serotipo 5 de adenovirus.
Se ha reconocido por los expertos en la técnica
que niveles diferentes de anticuerpos de neutralización circulan en
los seres humanos, los cuales están dirigidos contra diferentes
serotipos. Se ha encontrado que ciertos serotipos adenovirales
encontraron altos títulos de tales anticuerpos neutralizadores y que
muchos individuos en poblaciones diferentes portaban anticuerpos
neutralizadores contra tales serotipos. Se encontró también que
ciertos serotipos sólo se neutralizaban en una minoría de las
muestras (documento WO 00/70071). Aparentemente, ciertos serotipos
del subgrupo B sólo se neutralizaban en un pequeño grupo de
muestras. Por tanto, en una realización preferida de la presente
invención, se proporcionan vectores de adenovirus recombinantes
según la invención, en el que dicho primer serotipo se selecciona
del grupo que consiste en serotipos 11, 14, 16, 21, 34, 35 y 50 de
adenovirus. Se prefieren sumamente los vectores adenovirales
recombinantes, en los que dicho primer serotipo es el serotipo 11 ó
35, mientras que éstos encontraron anticuerpos neutralizadores sólo
en un porcentaje muy pequeño de las muestras sometidas a prueba.
Los vectores de la presente invención pueden
usarse en diferentes escenarios tales como terapia génica, genómica
funcional, vacunación tumoral y/o vacunación antiviral. Para esto,
es necesario que el vector adenoviral funcione como un vehículo de
suministro génico, en el que un gen no nativo se incorpora en el
genoma adenoviral. La partícula adenoviral puede dirigirse
posteriormente específicamente a las células diana de interés; el
adenovirus se une a esa célula específica o bien a través de la
unión cápsida-receptor o bien a través de otros
medios, y suministra el transgén. La dirección de adenovirus puede
realizarse de muchas formas diferentes. Los expertos en la técnica
de dirección de vectores adenovirales estarán conscientes de todas
las posibilidades diferentes que se aplican para suministrar los
vectores adenovirales a las células de interés. Estas posibilidades
incluyen pero no se limitan a alteraciones de cápsida
(modificaciones de fibras, hexones y/o pentones, tales como
deleciones, cambios entre fibras de diferentes serotipos y
adiciones de péptidos y/u otros restos de unión), en la que se
producen fibras quiméricas que reconocen un receptor presente sobre
la célula de interés, o en la que se utiliza la unión de la base de
pentones. Otras posibilidades son el enlace de restos de dirección a
las proteínas de cápsida, en las que por ejemplo péptidos de unión,
proteínas de unión conocidas y fuertes, o anticuerpos o partes de
los mismos se ligan a las proteínas de cápsida para lograr una
dirección específica. Todos estos vectores pueden producirse usando
los métodos y medios proporcionados por la presente invención. Por
tanto, la presente invención también da a conocer vectores de
adenovirus recombinantes según la invención, que comprenden además
una secuencia que codifica para una proteína, polipéptido o péptido
no adenoviral. Tales secuencias pueden estar presentes en
diferentes lugares dentro de la estructura principal adenoviral,
pero preferiblemente se localizan en la región E1, la cual carece
de los vectores adenovirales recombinantes de la invención. La
región E1 se complementa por elementos (la complementación)
presentes en las células de complementación. La dirección del
promotor, transgén y otras secuencias reguladoras puede dirigirse
hacia la repetición terminal invertida a la izquierda, así como la
invertida a la derecha.
La presente invención también puede usarse para
la producción de vectores virales basados en adenovirus y/o en
otros virus tales como el Virus Adeno-Asociado
(AAV), en el que la combinación, tal como un virus quimérico
Ad-AAV, puede integrarse en el genoma de la célula
huésped. Se conocen en la técnica varios métodos para generar
adenovirus de integración. Generalmente, la invención también es
útil para la producción de formas de adenovirus que (específica o
no específicamente) pueden integrarse.
Tal como se mencionó, varios transgenes no
adenovirales pueden clonarse en los vectores adenovirales
recombinantes de la presente invención. Éstos no sólo incluyen
secuencias de ácido nucleico reguladoras tales como potenciadores,
promotores (por ejemplo, promotores no adenovirales fuertes tales
como el promotor de citomegalovirus, el promotor SV40 y el promotor
VSR) y señales de poliadenilación, sino también genes heterólogos
para fines terapéuticos. Por tanto, en un aspecto de la invención
se proporcionan vectores de adenovirus recombinantes según la
invención, en los que dicha proteína, polipéptido o péptido no
adenoviral se selecciona del grupo que consiste en: un polipéptido
inductor de muerte celular, un determinante antigénico de un
organismo patógeno, un antígeno específico de tumor, una proteína
viral, una hormona y una citocina. Ejemplos de organismos patógenos
son, pero no están limitados a, bacterias, virus y hongos. Ejemplos
no limitativos de factores, proteínas, polipéptidos y péptidos no
adenovirales son factores de transcripción, proteínas de
señalización intracelular, fosfatasas, cinasas, factores de
inhibición de apoptosis, antagonistas de receptores, formas solubles
de receptores unidos a membrana, inhibidores de ARN, ARN
antisentido, factores de señuelo, ribozimas y más específicamente,
timidina cinasa, eritropoyetina, proteína estimuladora de
eritropoyesis nueva (NESP), IL3, ceNOS, gama interferón y gp100.
Las proteínas virales no adenovirales pueden clonarse en los
vectores adenovirales recombinantes proporcionados por los métodos
y medios de la presente invención para fines de vacunación. Tales
proteínas virales incluyen, pero no se limitan a, gag, pol, env,
nef, etc., para vacunas contra VIH, proteínas E6 y E7 para vacunas
contra virus de papiloma humano, proteínas de circumsporozoita de
protozoarios de Plasmodium para vacunas contra malaria,
componentes de rotavirus para vacunas contra rotavirus, proteínas de
ébola para vacunas contra el ébola, los productos génicos F y G de
virus sincitial respiratorio (VSR) para vacunas contra VSR, HA y NA
para vacunas contra influenza, etc.
Los adenovirus recombinantes de la presente
invención comprenden elementos estructurales y no estructurales.
Ejemplos de elementos estructurales son los genes que codifican para
las proteínas de cápsida, tales como proteínas de fibra, hexón y
pentón, así como los propios productos génicos. Ejemplos de
elementos no estructurales son los genes tempranos que se expresan
después de la infección en una célula y que se subregulan cuando el
ciclo de infección avanza. Otros ejemplos de elementos no
estructurales son los genes que codifican para las proteínas
activas durante la replicación, tales como pol y pTP. Ha de
entenderse que los vectores adenovirales recombinantes pueden
comprender elementos estructurales y no estructurales derivados de
diferentes serotipos. Ejemplos de tales vectores son por ejemplo
las partículas adenovirales que portan fibras quiméricas (véase la
solicitud de patente del solicitante WO 00/03029). Las técnicas de
biología molecular han hecho posible construir combinaciones
infinitas de secuencias de ácido nucleico. Es claro para el experto
en la técnica de la biología molecular que la combinación de
secuencias diferentes puede realizarse usando diferentes técnicas
moleculares, tales como reacción en cadena de polimerasa (PCR) así
como subclonaje directo. Muchas de las secuencias usadas en la
presente invención, así como las secuencias y construcciones
quiméricas conocidas en la técnica, se derivan de serotipos de
adenovirus diferentes. "Derivar", tal como se usa en el
presente documento, significa por tanto que estas combinaciones de
secuencias pueden obtenerse a través del clonaje directo de
secuencias de tipo natural obtenidas de virus de tipo natural,
aunque pueden obtenerse por ejemplo también a través de PCR usando
diferentes piezas de ADN como molde. Esto significa también que
estas secuencias pueden estar en forma de tipo natural así como en
forma alterada. Otra opción para alcanzar el mismo resultado es a
través de la combinación de ADN sintético. Ha de entenderse que
"derivar" no significa exclusivamente una clonación directa
del ADN de tipo natural. Un experto en la técnica también será
consciente de las posibilidades de la biología molecular para
obtener formas mutantes de cierta pieza de ácido nucleico. Estas
mutaciones pueden hacer una funcionalidad diferente, pero también
pueden ser silenciosas de tal manera que ciertas mutaciones no
alteren la funcionalidad de esa pieza de ADN particular y su
proteína codificada. Por tanto, la expresión "parte funcional,
derivado y/o análogo de la misma" han de entenderse como
equivalentes del ácido nucleico con el que están relacionados. Un
experto en la técnica apreciará el hecho de que ciertas deleciones,
cambios, mutaciones (puntuales), adiciones, etc., pueden aún dar
como resultado un ácido nucleico que tiene una función similar a la
del ácido nucleico original. Ha de entenderse por tanto que tales
alteraciones que no alteran significativamente la funcionalidad de
las proteínas tales como el producto génico E4-orf6
y E1B-55K están dentro del alcance de la presente
invención.
Algunas alteraciones en el ácido nucleico, tales
como una deleción, una mutación, adición y/o sustitución en uno o
más codones también pueden cambiar de forma significativa la
estructura y/o funcionalidad del producto génico codificado. El
codón puede alterarse completamente para cambiar el aminoácido
codificado, pero también puede mutarse parcialmente para cambiar el
aminoácido codificado. Las deleciones de ácidos nucleicos pueden
dar como resultado la pérdida de uno o más aminoácidos codificados;
mientras que esto también puede dar como resultado desplazamientos
de cuadro. La presente invención se refiere también a secuencias de
E4-orf6 presentes en el ácido nucleico adenoviral,
que comprenden partes diferentes derivadas de diferentes serotipos,
en las que los dominios que hacen a la proteína funcional en
compatibilidad pueden usarse de un serotipo, mientras que el resto
de la secuencia de E4-orf6 o una parte de la misma
se deriva de otro serotipo (no) relacionado (por ejemplo del mismo
subgrupo, de diferentes subgrupos o de diferentes especies, o
combinaciones de los mismos). Por tanto, también está dentro del
alcance de la presente invención aplicar proteínas de fusión
E4-orf6 que sean compatibles. Tal proteína de
fusión puede ser el producto de varias piezas de ácido nucleico.
Un experto en la técnica será consciente del
hecho de que aparte de todos los adenovirus humanos, se han
identificado numerosos adenovirus no humanos en la técnica.
Obviamente, también adenovirus no humanos pueden aplicarse para
alcanzar los mismos resultados que los dados a conocer por la
presente invención. Será claro para el experto en la técnica que la
compatibilidad entre E1B-55K y
E4-orf6 podría no estar limitada a adenovirus
humanos sino que también elementos de adenovirus específicos para
diferentes especies pueden ser compatibles. Así, es también otro
aspecto de la invención que pueden producirse adenovirus no humanos
hasta altos títulos en líneas celulares de empaquetamiento
conocidas disponibles en la técnica, siempre y cuando los productos
génicos E1B-55K y E4-orf6 sean
compatibles. Ejemplos no limitativos de adenovirus no humanos que
pueden producirse usando los métodos y medios de la presente
invención son adenovirus caninos, bovinos, ovinos, de rana,
porcinos, equinos, de simios y aviarios. Los serotipos usados en el
presente documento por tanto van más allá de serotipos restringidos
en especie. Por ejemplo, si un producto génico
E4-orf6 de adenovirus de mono es compatible con la
E1B-55K proporcionada por la célula de
empaquetamiento, entonces esta combinación está dentro del alcance
de la presente invención. Igualmente, cuando se aplican fusiones
entre diferentes serotipos, o entre secuencias
E4-orf6 derivadas de por ejemplo un adenovirus
humano y aviario que es compatible con el gen E1B de la célula de
empaquetamiento, entonces esa combinación particular también está
dentro del alcance de la presente invención.
La presente invención proporciona un método para
producir un vector de adenovirus recombinante que comprende
elementos estructurales y no estructurales de un adenovirus de un
primer serotipo, comprendiendo dicho método las etapas de: a)
proporcionar una célula de complementación que porte una secuencia
que codifica para E1B-55K derivada de un adenovirus
de un segundo serotipo en forma expresable, con los elementos
necesarios de un adenovirus tales como para permitir el ensamblaje
de dicho vector de adenovirus recombinante por dicha célula de
complementación, en el que dichos elementos comprenden al menos
algunos elementos estructurales y no estructurales de un adenovirus
de dicho primer serotipo diferente de dicho segundo serotipo y una
secuencia que codifica para una proteína E4-orf6
funcional que sea compatible con dicha proteína
E1B-55K expresable en dicha célula de
complementación; b) cultivar dicha célula de complementación en un
medio en condiciones que permitan que tenga lugar la producción y
ensamblaje del vector de adenovirus y c) recoger el vector de
adenovirus recombinante producido de esta manera del medio y/o la
célula de complementación, en el que la secuencia que codifica para
la proteína E4-orf6 compatible está presente en el
vector de adenovirus recombinante producido de esta manera.
En un aspecto de la invención, se proporciona un
método según la invención, en el que la secuencia que codifica para
E4-orf6 se selecciona del grupo que consiste en: una
secuencia que codifica para E4-orf6 derivada de un
adenovirus de dicho segundo serotipo; una secuencia que codifica
para E4-orf6 derivada de un adenovirus de un tercer
serotipo diferente de dichos primero y segundo serotipos; y una
secuencia que codifica para E4-orf6 que comprende
una fusión entre una parte de una secuencia que codifica para
E4-orf6 derivada de un tercer serotipo y una parte
de una secuencia que codifica para E4-orf6 derivada
de un adenovirus de dicho segundo serotipo, en el que dicho tercer
serotipo puede ser idéntico a o diferente de dicho primer serotipo.
En una realización preferida, dichos primero y segundo serotipos
son de diferentes subgrupos. En una realización más preferida,
dicho segundo serotipo es un serotipo de adenovirus del subgrupo C.
En una realización todavía más preferida, dicho segundo serotipo es
serotipo 5 de adenovirus. En otro aspecto particular de la
invención, dicho primer serotipo es un serotipo de adenovirus del
subgrupo B. Preferiblemente, dicho primer serotipo se selecciona
del grupo que consiste en serotipos 11, 14, 16, 21, 34, 35 y 50
de
adenovirus.
adenovirus.
Existen varias células de empaquetamiento
conocidas en la técnica que se usan para complementar vectores
adenovirales recombinantes y para producir, ensamblar y empaquetar
las partículas adenovirales. Ejemplos no limitativos de tales
líneas celulares son células HEK-293, 911 y
PER.C6^{TM}. Se prefiere usar líneas celulares que ya hayan
demostrado suministrar altos títulos de grupos adenovirales. Estas
líneas celulares expresan proteínas E1 de una manera estable, y es
por tanto un aspecto preferido de la invención usar líneas celulares
y métodos, en los que dicha secuencia que codifica para
E1B-55K está integrada en el genoma de dicha célula
de complementación. Se prefieren más las células de complementación
que se derivan de una célula humana diploide, primaria, o una de
célula progenitora de la misma. De una manera todavía más preferida,
dicha célula de complementación se deriva de una célula de
retinoblasto humano primaria, una célula de riñón embrionario humana
primaria, una célula neuronal humana primaria o un amniocito humano
primario. Se prefiere sumamente el uso de una célula de
complementación en los métodos proporcionados por la presente
invención, en los que dicha célula de complementación es una célula
PER.C6 o un derivado de la misma. Las células PER.C6 se conocen bien
en la técnica porque no dan origen a adenovirus competentes en
replicación cuando se usa ADN adenoviral que no tiene solapamiento
con el ácido nucleico proporcionado por las células. Muchos de los
vectores adenovirales usados en la técnica carecen de la región E1,
y por tanto en un aspecto de la invención, dicha célula de
complementación comprende, integrado en su genoma, un ácido
nucleico que codifica para al menos una proteína E1A de adenovirus.
Preferiblemente, dicho ácido nucleico que codifica para al menos
una proteína E1A de adenovirus se deriva de un serotipo de
adenovirus de un subgrupo diferente que el subgrupo B. Más
preferiblemente, el ácido nucleico que codifica para al menos una
proteína E1A de adenovirus se deriva de un serotipo de adenovirus
del subgrupo C. Se prefieren sumamente las realizaciones en las que
el ácido nucleico que codifica para al menos una proteína E1A de
adenovirus se deriva de un serotipo 5 de adenovirus. En otra
realización de la invención, la invención proporciona un método, en
el que dicha secuencia que codifica para E4-orf6 y
dicha secuencia que codifica para E1B-55K se
derivan de serotipos de adenovirus diferentes y en el que dichos
serotipos de adenovirus diferentes son miembros del mismo subgrupo
de adenovirus. Preferiblemente, dicha secuencia que codifica para
E4-orf6 y dicha secuencia que codifica para
E1B-55K se derivan de diferentes serotipos de
adenovirus y en el que dichos diferentes serotipos de adenovirus
son ambos miembros del subgrupo C. Más preferiblemente, dicha
secuencia que codifica para E4-orf6 y dicha
secuencia que codifica para E1B-55K se derivan del
mismo serotipo de adenovirus. Se prefieren sumamente los métodos en
los que dicha secuencia que codifica para E1B-55K y
dicha secuencia que codifica para E4-orf6 se
derivan del serotipo 5 de adenovirus.
La presente invención se refiere también a una
composición farmacéutica que comprende un vector adenoviral
recombinante según la invención, o que puede obtenerse mediante un
método proporcionado por la invención. La composición farmacéutica
comprende además un vehículo farmacéutico aceptable, aplicado
generalmente por los expertos en la técnica de la preparación de
agentes farmacéuticos. Además, la presente invención se refiere a
un método para tratar un cuerpo humano que comprende administrar a
un cuerpo humano un vector adenoviral recombinante según la
invención, o una composición farmacéutica proporcionada por la
invención. La invención se refiere también a métodos en los cuales
pueden producirse vectores adenovirales usando las células de
complementación/empaquetamiento adecuadas y el vector adenoviral de
interés. Para un proceso de producción eficaz es útil aplicar las
células correctas con el vector adenoviral adecuado. Por tanto, la
invención se refiere también a un kit de partes que comprende: a)
una célula de complementación para producir un vector de adenovirus
recombinante que comprenda elementos estructurales y no
estructurales de un adenovirus de un primer serotipo, portando dicha
célula porta una secuencia que codifica para
E1B-55K derivada de un adenovirus de un segundo
serotipo en forma expresable; y b) en uno o más vectores de ácido
nucleico replicables todos los elementos adenovirales necesarios
tales como para permitir el ensamblaje de dicho vector de
adenovirus recombinante por dicha célula de complementación, en el
que dichos elementos comprenden al menos algunos elementos
estructurales y no estructurales de un adenovirus de dicho primer
serotipo diferente de dicho segundo serotipo y una secuencia que
codifica para una proteína E4-orf6 funcional que es
compatible con la proteína E1B-55K expresable en
dicha célula de complementación. Preferiblemente, se usa un kit de
partes, en el que dicha secuencia que codifica para
E4-orf6 se selecciona del grupo que consiste en:
una secuencia que codifica para E4-orf6 derivada de
un adenovirus de dicho segundo serotipo; una secuencia que codifica
para E4-orf6 derivada de un adenovirus de un tercer
serotipo diferente de dicho primero y segundo serotipos y una
secuencia que codifica para E4-orf6 que comprende
una fusión entre una parte de una secuencia que codifica para
E4-orf6 derivada de un tercer serotipo y una parte
de una secuencia que codifica para E4-orf6 derivada
de un adenovirus de dicho segundo serotipo, en la que el tercer
serotipo puede ser idéntico o diferente al primer serotipo.
La invención es particularmente útil para la
replicación de adenovirus quiméricos con deleción de E1 que se
derivan casi completamente de un serotipo diferente del adenovirus
5. Esos vectores sólo tienen que proporcionarse con un ácido
nucleico que codifica para E4orf6 de adenovirus 5. Una vez que está
proporcionado con el mismo, el vector puede replicarse eficazmente
en líneas de células de empaquetamiento de complementación E1 de
adenovirus 5 normales. Se mejora la estabilidad de los vectores, y
los vectores pueden complementarse para deleciones tanto en E1A
como en E1B. Proporcionando tales vectores con un ácido nucleico que
codifica para E4orf6 de adenovirus, es posible lograr una
purificación en placa eficaz y buenos rendimientos en ausencia de un
problema de contaminación de tipo natural adicional, cuando se
hacen crecer sobre células 293 ó 911. En PER.C6, por supuesto, la
contaminación de adenovirus de tipo natural también puede evitarse
de otras maneras.
Una ventaja adicional de un vector recombinante
de la invención es que no existe la necesidad de generar
E4-orf6 de adenovirus de líneas celulares
especiales a partir de un ácido nucleico integrado en el genoma.
Aunque tales líneas celulares existen, no se mantienen fácilmente
en un orden adecuado. Esto es al menos en parte debido al hecho de
que con más y más genes extraños insertados en el genoma de la línea
celular es difícil mantener la estabilidad de todas las secuencias
extrañas (o la expresión de las mismas). En la presente invención
se encontró que al menos algunos de los problemas asociados con
bajos rendimientos de vectores a base de serotipo 5 que no es de
adenovirus y la estabilidad de los vectores del serotipo de
adenovirus del subgrupo B, tales como serotipo 7, 11 y 35 de
adenovirus en líneas celulares de empaquetamiento del serotipo 5 de
adenovirus pueden superarse con un vector de adenovirus
recombinante de la invención.
\newpage
La secuenciación del genoma del serotipo 35 de
adenovirus así como la construcción de un sistema de vectores
basados en plásmidos y la generación de virus recombinantes basados
en Ad35 se han descrito en detalle en el documento WO 00/70071.
Se realizó el clonaje de la secuencia que
codifica para Ad5-E4-orf6 en
pAdApt35IP1 (N.º de depósito ECACC P02041228, para detalles del
clonaje de ese plásmido véase el documento WO 00/70071) tal como
sigue. Se digirió el plásmido con NheI y AvrII y se desfosforiló
con fosfatasa de intestino de ternera (New England Biolabs). El ADN
digerido del gel se aisló usando el kit GeneClean. Se digirió el
plásmido p\DeltaMT.Orf6.Hygro (figura 1, N.º de depósito ECACC
P02041226) con NheI y posteriormente se digirió parcialmente con
XbaI. Tras la separación de las bandas resultantes en gel, se
purificó del gel el fragmento de 1350 pb que correspondía al
promotor \DeltaMT unido a la secuencia E4-orf6.
Después, se ligaron ambos fragmentos aislados y se transformaron en
células DH10B electrocompetentes (Invitrogen/LifeTechnologies) tras
lo cual se seleccionó una colonia con el inserto en la orientación
correcta con respecto a la señal poli(A) de SV40 para la
preparación de ADN a gran escala. Esto dio como resultado la
construcción pAd35.\DeltaMT.Orf6 (figura 2), que contiene la
secuencia que codifica para E4-orf6 de Ad5 unida
funcionalmente a un promotor de metalotioneína mutado (\DeltaMT).
Se ha descrito el promotor \DeltaMT por Hagmeyer et al.,
(1996). La secuencia E4-orf6 de Ad5 corresponde al
nucleótido 33193 al nucleótido 34077 en la secuencia de Ad5 (número
de registro Genbank M73260). Para someter a prueba si la expresión
de las proteínas E4-orf6 de Ad5 podría hacer posible
la producción de vectores Ad35 con deleción de E1 completa en
células de complementación de Ad5, se co-transfectó
pAd35.\DeltaMT.Orf6 con la construcción de estructura principal
de Ad35 pWE.Ad35.pIX-rITR sobre células PER.C6.
Después, se digirió pAd35.\DeltaMT.Orf6 con
PI-Psp-1 y se digirió
pWE.Ad35.pIX-rITR con NotI para liberar los insertos
adenovirales de la estructura principal. Se transfectaron 2 \mug
de pAd35.\DeltaMT.Orf6 digerido y 6 \mug de
pWE.Ad35.pIX-rITR usando lipofectamina. Se añadió
la mezcla de transfección a células PER.C6 que se sembraron el día
anterior a una densidad de 3,5 x 10^{6} células por matraz T25.
Al día siguiente se cambió el medio por medio de cultivo de PER.C6
(DMEM con FBS al 10% y MgCl_{2} 10 mM) y se incubaron
adicionalmente las células a 37ºC/10% de CO_{2}. Se realizaron
transfecciones de control con pAdApt35.Luc
co-transfectado con
pWE.Ad35.pIX-rITR y
pWE.Ad35.pIX-rITR solo. Dos días después de la
transfección, se pasaron las células de matraces T25 a T80 y se
incubaron tal como se describe. De nuevo tres días después el
cultivo transfectado con pAd35.\DeltaMT.Orf6 junto con la
estructura principal de Ad35 mostró un efecto citopatogénico (CPE)
indicador de la replicación de virus, y se recogió (incluyendo
células y medio) tras una incubación adicional de dos días. Se
sometió la suspensión de células a dos rondas de ciclos de
congelación/descongelación y se mantuvo el material resultante
(lisado bruto) a -20ºC hasta su uso adicional. Los otros matraces no
mostraron CPE y se pasaron 1:3 en matraces T80 seis días después de
la transferencia a T80. De nuevo cinco días después el matraz
transfectado con pAdApt35.Luc + pWE.Ad35.pIX-rITR
mostró pocos eventos tipo CPE pero esto no progresó más. Se usaron
0,2 y 0,5 ml del lisado bruto que resultó de la transfección con
pAd35.\DeltaMT.Orf6 para reinfectar células PER.C6 a
aproximadamente el 85% de confluencia en matraces T80. Esto dio
como resultado un CPE completo después de un día de incubación
indicando que el virus infeccioso estaba presente en los lisados
brutos. También se recogieron estos cultivos por dos ciclos de
congelación/descongelación. Se realizaron transfecciones de control
adicionales con la construcción pAd35.\DeltaMT.Orf6 solo en
PER.C6 para confirmar que la propia expresión de orf6 no dio como
resultado la toxicidad celular y muerte celular tipo CPE. En
conclusión, sólo las transfecciones con pAd35.\DeltaMT.Orf6 junto
con pWE.Ad35.pIX-rITR dieron como resultado la
replicación de virus
y CPE.
y CPE.
Se realizó análisis por PCR para confirmar la
presencia de genomas virales basados en Ad35 con
Ad5-E4-orf6 reemplazando la región
E1 anterior. Más tarde, se aisló ADN viral de las muestras de lisado
bruto tal como sigue. Se incubaron 275 \mul de material lisado
bruto con 10 \mul de ADNasaI (10 mg/ml) a 37ºC durante 30
minutos. Posteriormente se añadieron 6,0 \mul de EDTA 0,5 M (pH
8,0), 7,5 \mul de SDS al 20% y 1,5 \mul de proteinasa K 20
mg/ml y se mezclaron mediante vórtex. Luego se incubó la mezcla a
50ºC durante 1 hora. Finalmente, se aisló el ADN viral usando el
kit GeneClean Spin (Bio 101, Inc.). Luego se amplificaron 2 \mul
del ADN aislado mediante PCR usando los cebadores
35psi-For y 35R4 (tabla 1). Se ajustó el programa a
94ºC durante 2 min. seguido por 30 ciclos de 94ºC durante 30 s, 58ºC
durante 30 s y 72ºC durante 5 min., y concluyó mediante una
incubación a 72ºC durante 10 min. Los cebadores son específicos para
secuencias Ad35 y generan un fragmento de 2,9 kb que varía desde la
secuencia de empaquetamiento hasta el nucleótido 4669 (numeración
como en la secuencia de Ad35 wt) incluyendo de esta manera el casete
de transgén orf6 de Ad5. La electroforesis de los fragmentos de PCR
obtenidos mostró que los fragmentos tuvieron la longitud esperada
que coincidía con la de los fragmentos de PCR de control generados
en el plásmido adaptador pAd35.\DeltaMT.Orf6. De esta manera,
pueden hacerse vectores basados en Ad35 con deleción de E1 completa
sobre células de complementación de Ad5 si el virus expresa también
Ad5-E4orf6.
\newpage
Se amplificó un primer fragmento de PCR usando
los cebadores DF35-1 y 35FR (tabla 1). Se hizo la
amplificación con pWE.Ad35.pIX-rITR (véase el
documento WO 00/70071) como ADN molde usando Pwo ADN polimerasa
(Roche) con DMSO adicional (Sigma, concentración final del 3%). El
programa fue tal como sigue: 94ºC durante 2 min., seguido por 30
ciclos de (94ºC durante 30 s, 52ºC durante 30 s, 72ºC durante 3
min.) y una etapa final de 72ºC durante 8 min. para asegurar
fragmentos completos. La amplificación dio como resultado un
fragmento de 1,6 kb que correspondía desde el nucleótido 30224 al
31805 de la secuencia de Ad35. Se introdujo un sitio BamHI en el
extremo 3'. Se purificó del gel el ADN amplificado usando el kit
Geneclean y se ligó al vector usando el kit de clonaje
pCRScript/Amp (Stratagene). Después de la transformación en células
DH10B electrocompetentes se seleccionaron colonias blancas para
análisis adicional. Esto dio como resultado la construcción
pCR-fiber35. Debido al clonaje en extremos romos
pudo insertarse el fragmento de PCR en 2 orientaciones. Se
seleccionó un clon que tenía el inserto con el sitio BamHI en el
polienlazador en el extremo 5' del vector pCRScript/Amp. La
digestión con BamHI da como resultado de esta manera un fragmento de
1,6 kb. La secuenciación confirmó una amplificación correcta del
fragmento de PCR. Se amplificó un segundo fragmento de PCR usando
los cebadores: 5E4F y 5E4R (tabla 1). Se hizo la amplificación con
pWE.Ad5.AflII-rITRsp, el cual es un vector cósmido
que contiene un sitio PacI adicional en
pWE.Ad5.AflII-rITR (N.º de depósito ECACC P97082116
descrito en la solicitud de patente internacional del solicitante
PCT/NL01/00824). pWE.Ad5.AflII-rITRsp sirvió como
molde usando Pwo ADN polimerasa tal como se describió
anteriormente, aunque pWE.Ad5.AflII-rITR también
podría usarse para el mismo fin. Tras la purificación del gel, se
digirió el ADN con SstI y BamHI (ambos sitios introducidos durante
la PCR) y se purificó el fragmento de 3 kb del gel de agarosa usando
el kit GeneClean. La región E4 de Ad5 que se amplifica corresponde
del pb 32794 al pb 35828 de la secuencia de Ad5. Se generó un tercer
fragmento de PCR en pWE.Ad35.pIX-rITR usando los
cebadores: 355ITR y 353ITR (tabla 1). Se realizó la amplificación
por PCR tal como se describió anteriormente. El fragmento de 160
pb resultante está flanqueado por un sitio SstI (extremo 5') y un
sitio EcoRI (extremo 3'). Después de la purificación del gel como
arriba, se digirió el ADN con SstI y EcoRI. Luego el fragmento de
160 pb que correspondía al ITR derecho de Ad35 se separó de los
extremos digeridos en un gel de agarosa de bajo punto de fusión y se
recogió en gel. Después, se digirió pUC119 con BamHI y EcoRI y se
purificó el fragmento de 3,1 kb del gel usando el kit GeneClean.
Luego se ligaron los segundo y tercer fragmentos de PCR tratados
anteriormente con pUC119 digerido con BamHI/EcoRI dando como
resultado pUC.Ad5E4-35ITR. Se secuenciaron los
insertos derivados de PCR clonados para verificar una amplificación
correcta. Después, se cortó el inserto de 1,6 kb en
pCR-fiber35 con BamHI y se purificó el fragmento del
gel tal como anteriormente. También se digirió
pUC.Ad5E4-35ITR con BamHI y se purificó el fragmento
lineal del gel. La ligación de ambos fragmentos y la selección de
los clones que tenían la orientación correcta entre sí dieron como
resultado pUC.35-5E4 (figura 3). Las etapas que
conducen a la construcción de pUC.35-5E4 se
representan esquemáticamente en la figura 4. Se
sub-clonó el inserto de adenovirus en
pUC.35-5E4 en pBr.Ad35.PRn (figura 5; véase el
documento WO 00/70071), una construcción con secuencias 3' de Ad35.
Después, se digiere la construcción pUC.35-5E4 con
MluI y NotI y se purifica el fragmento de 4,7 kb del gel usando el
kit GeneClean. Luego se liga este fragmento con el fragmento de
vector que resulta de la digestión con MluI y NotI de la
construcción pBr.Ad35.PRn. Se purificó este fragmento de 16,3 kb del
gel usando enzima agarasa (Roche). Luego se transformaron las
ligaciones en células DH10B competentes. Se denominó la construcción
resultante pBr.Ad35.PR5E4 (figura 6, N.º de depósito ECACC
P02041229). La última etapa implica clonar el extremo 3' modificado
de la secuencia de Ad35 en el clon cósmido viral
pWE.Ad35.pIX-rITR. Después, se combinan dos
fragmentos en una reacción de empaquetamiento de fagos lambda
(Stratagene) según las instrucciones del fabricante. El primero es
el inserto Ad35 modificado de 16,8 kb de pBr.Ad35.PR5E4 obtenido
mediante digestión con PacI y SwaI y el segundo es un fragmento de
22,8 kb obtenido mediante digestión de
pWE.Ad35.pIX-rITR con PacI y SwaI. La combinación
correcta de los dos fragmentos produce
pWE.Ad35.pIX-rITR.5E4 (figura 7). De esta manera, en
esta construcción se reemplaza la región E4 en la estructura
principal de Ad35 con la región correspondiente derivada de Ad5.
Para obtener una construcción de estructura
principal adenoviral que contiene las secuencias Ad35 del gen pIX
(nucleótido 3401 en la secuencia Ad35) hasta el extremo del ITR
derecho pero con las secuencias para E4-orf6 y
-orf6/7 intercambiadas por las secuencias correspondientes de Ad5,
se amplificaron las secuencias Ad35 y Ad5 mediante PCR y se
combinaron tal como se describe a continuación. Se generaron los
fragmentos de PCR con Pwo ADN polimerasa con la adición de DMSO
hasta el 3%. Se hizo la primera PCR con pBr.Ad35.PRn (figura 5;
véase el documento WO 00/70071) como molde y los cebadores
E4-F1 y E4-R2 (tabla 1). Se ajustó
el programa tal como sigue: 94ºC durante 2 min., 5 ciclos de (94ºC
durante 30 s, 50ºC durante 30 s y 72ºC durante 1 min.) seguido por
30 ciclos de (94ºC durante 30 s, 60ºC durante 30 s y 72ºC durante 1
min.) y concluyó con una etapa final a 68ºC durante 8 min. Se
purificó el fragmento de 1,8 kb resultante usando el kit GeneClean.
Se hizo la segunda PCR con pWE.Ad5.AflII-rITRsp,
que es un vector cósmido que contiene un sitio PacI en
pWE.Ad5.AflII-rITR (N.º de depósito ECACC
P97082116, descrito en la solicitud de patente internacional del
solicitante PCT/NL01/00824), como molde, y los cebadores
E4-F3 y E4-R4 (tabla 1). Se ajustó
el programa tal como sigue: 94ºC durante 2 min. seguido por 30
ciclos de (94ºC durante 30 s, 62ºC durante 30 s y 72ºC durante 1
min.) y concluyó con una etapa final a 68ºC durante 8 min. Se
purificó el fragmento de 1,1 kb tal como anteriormente. Se hizo la
tercera PCR con pBr.Ad35.PRn como molde y los cebadores
E4-F5 y E4-R6 (tabla 1). Se ajustó
el programa tal como sigue: 94ºC durante 2 min., 5 ciclos de (94ºC
durante 30 s, 48ºC durante 30 s y 72ºC durante 45 s) seguido por 30
ciclos de (94ºC durante 30 s, 56ºC durante 30 s y 72ºC durante 45 s)
y concluyó con una etapa final a 68ºC durante 8 min. Se purificó el
fragmento de 366 pb tal como anteriormente. Se cargaron muestras de
los fragmentos purificados en un gel para calcular la concentración
y luego se mezclaron los fragmentos juntos para contener 700 ng de
PCR-1, 650 ng de PCR-2 y 430 ng de
PCR-3 en un total de 30 \mul. A esta mezcla se le
añadieron 3 \mul de tampón EcoPol (New England Biolabs), 3 \mul
de una disolución de dNTP 2 mM y 3 \mul de H_{2}O milliQ. Se
incubó la mezcla resultante a 94ºC durante 3 min. y luego se enfrió
hasta 65ºC en una máquina de PCR a una velocidad de 0,5ºC/s.
Después de la incubación a 65ºC durante 10 min., se enfrió
adicionalmente la mezcla hasta 20ºC a una velocidad de 0,05ºC por s
y se incubó durante 10 min. a 20ºC. Luego se añadió 1 \mul (5
unidades) de enzima Klenow (New England Biolabs) seguida por una
incubación de 60 min. a 37ºC. Se usaron 5 \mul de esta mezcla de
Klenow como molde para amplificar por separado dos fragmentos tal
como sigue. Se usó el conjunto de cebadores 1: NR-1
y NcoI-R (tabla 1) en una reacción usando Pwo ADN
polimerasa (Roche) con la adición de DMSO hasta una concentración
final del 3% y usando los siguientes ajustes de la máquina de PCR:
94ºC durante 2 min. seguido por 30 ciclos de (94ºC durante 30 s,
66ºC durante 30 s y 72ºC durante 3 min.) seguido por una incubación
final a 68ºC durante 8 min. Se usó el conjunto de cebadores 2:
NcoI-F y NR-2 (tabla 1) en una
reacción usando Pwo ADN polimerasa (Roche) con adición de DMSO hasta
una concentración final del 3% y usando los siguientes ajustes de
la máquina de PCR: 94ºC durante 2 min. seguido por 30 ciclos de
(94ºC durante 30 s, 62ºC durante 30 s y 72ºC durante 90 s) seguido
por una incubación final a 68ºC durante 8 min. Se purificaron los
fragmentos resultantes de 2,7 kb (conjunto de cebadores 1) y 1,1 kb
(conjunto de cebadores 2) del gel usando el kit GeneClean y se ligó
cada uno al vector pCRscriptAmp (Stratagene) y se transformaron en
células electrocompetentes DH10B. Esto dio como resultado la
construcción pCRscriptAmp.NFI-NcoIR (figura 8) y la
construcción pCRscriptAmp.NcoIF-NR2 (figura 9). Ya
que los insertos contenían extremos romos se obtuvieron dos
orientaciones de cada clonaje. Usando digestiones con KpnI se
seleccionaron las construcciones con la orientación requerida para
un clonaje adicional (véase figuras 8 y 9). Luego se secuenciaron
los insertos para verificar una amplificación correcta. Después, se
cortó parte del inserto de
pCRscriptAmp-NcoIF-NR2 usando BamHI
y NcoI y se purificó del gel tal como anteriormente. Se digirió
pCRscriptAmp-NFI-NcoIR con las
mismas enzimas y también se purificó del gel el fragmento que
contenía el vector. La ligación de estos fragmentos dio como
resultado pCR.NF1-NR2 (figura 10).
pCR.NF1-NR2 contiene secuencias Ad35 entre nt 30162
y 33234 de la secuencia Ad35 con secuencias E4-orf6
y E4-orf6/7 entre nt 31879 y 32974 reemplazadas por
secuencias derivadas de Ad5 localizadas entre 32968 y 34077 de la
secuencia Ad5 publicada en Genbank (Número de registro M73260). De
esta manera, como se puede observar en las alineaciones de
aminoácidos presentadas en las figuras 11 y 12, la secuencia de
aminoácidos de la proteína E4-orf6 clonada es
idéntica a la secuencia E4-orf6 encontrada en Ad5 y
la secuencia de aminoácidos E4-orf6/7 es en gran
parte idéntica a la secuencia E4-orf6/7 presente en
Ad5. Obviamente, pueden diseñarse diferentes construcciones E4
híbridas Ad35-Ad5 usando el método general
descrito anteriormente sin alejarse de la invención. Luego se clonó
este inserto quimérico de pCR.NF1-NR2 en
pWE.Ad35.pIX-rITR: se digirió
pCR.NF1-NR-2 con MluI y NdeI y se
purificó del gel el fragmento de 2,8 kb resultante usando el kit
GeneClean. Se digirió también la construcción pBr.Ad35.PRn con MluI
y NdeI y se aisló del gel el fragmento del vector de 18 kb usando
enzima agarasa (Roche). La ligación de ambos fragmentos dio como
resultado la construcción pBr.Ad35.PR.5Orf6 (figura 13, N.º de
depósito ECACC P02041227). Luego las secuencias Ad35 entre PacI y
SwaI que contenían la región E4 quimérica en esta construcción se
clonan en la construcción pWE.Ad35.pIX-rITR usando
empaquetamiento de fagos lambda tal como se describió anteriormente.
Luego se usa pWE.Ad35pIX-rITR.5Orf6 resultante
(figura 14) para generar virus recombinantes basados en Ad35
mediante co-transfección en células de
empaquetamiento PER.C6 con un plásmido adaptador
Ad35.
Ad35.
Se modificó adicionalmente la estructura
principal de Ad35 mediante una deleción de las secuencias E3. Se
sabe que las proteínas E3 modulan la respuesta inmune del huésped a
infección por adenovirus y por tanto no son necesarias para la
propagación in vitro de virus recombinantes. Además, la
deleción de las secuencias E3 permite la inserción de secuencias
heterólogas más grandes en los vectores sin comprometer la eficacia
de empaquetamiento. Asimismo, para la aplicación de vectores
adenovirales como vehículos de vacunación, no se prefiere la
expresión de genes inmunomoduladores codificados por la región E3.
Los métodos para delecionar las secuencias E3 en el plásmido
pBr.Ad35.PRn (figura 5) se describen a continuación.
En primer lugar, se generó un producto de PCR
con los cebadores 35E3for y 35E3rev (tabla 1) usando Pwo ADN
polimerasa (Roche) según las instrucciones del fabricante y
pBr.Ad35.PRn como ADN de molde. Se ajustó el programa a 94ºC
durante 2 min. y 30 ciclos de 94ºC durante 30 s, 58ºC durante 30 s y
72ºC durante 1 min., seguidos por 68ºC durante 8 min. El fragmento
amplificado contiene secuencias Ad35 desde el nt 26814 hasta el
27647 (véase el documento WO 00/70071) y se flanquea en el extremo
3' por un sitio MluI. Se purificó el fragmento de 833 pb resultante
usando el kit de purificación de PCR Qiaquick (Qiagen) y se digirió
con MluI y StuI. Luego se purificó el fragmento de PCR digerido de
un gel de agarosa LMP usando el kit de extracción en gel Qiaquick
(Qiagen). También se digirió la construcción pBr.Ad35.PRn con MluI y
StuI y se aisló el fragmento que contenía un vector de 17,3 kb del
gel de agarosa usando enzima agarasa (Roche) mediante el uso de
métodos conocidos por los expertos en la técnica. Se ligaron ambas
moléculas de ADN aisladas y se transformaron en bacterias
competentes DH5\alpha de máxima eficacia (Invitrogen/LTI) para dar
pBr.Ad35.PRn\DeltaE3 (figura 15). Las secuencias suprimidas
abarcan de nt 27648 a 30320 de la secuencia Ad35 dando como
resultado una deleción de 2673 pb. Luego se introdujo la supresión
en E3 en la construcción pWE.Ad35.pIX-rITR usando
extractos de empaquetamiento de fagos lambda (Stratagene). Después,
se digirieron tanto pWE.Ad35.pIX-rITR como
pBr.Ad35.PRn\DeltaE3 con PacI y SwaI y se aislaron los fragmentos
de 22,8 kb y 14 kb respectivos de los geles de agarosa de bajo
punto de fusión usando enzima agarasa (Roche). Tras la ligación y el
empaquetamiento usando células STBL-2
(Invitrogen/LTI), se obtuvo la construcción
pWE.Ad35.pIX-rITR\DeltaE3.
Para construir las versiones con deleción de E3
de las construcciones de estructura principal modificados en E4
descritos anteriormente, se introdujeron las modificaciones en E4 en
la construcción pBr.Ad35.PRn\DeltaE3 tal como sigue. Se digirió
la construcción pUC.35-5E4 (figura 3) con MluI y
NotI y se aisló el fragmento de 4,7 kb del gel usando el kit
GeneClean II. También se digirió la construcción
pBr.Ad35.PRn\DeltaE3 con MluI y NotI y se aisló el fragmento de
vector de 13,6 kb del gel usando el kit de centrifugación GeneClean.
La ligación de estos fragmentos dio como resultado la construcción
pBr.Ad35.\DeltaE3.PR5E4 (figura 16). Se digirió la construcción
pCR.NF1-NR2 (figura 10) con MluI, NdeI y BglI (esto
último para digerir el fragmento del vector en fragmentos más
pequeños), y se aisló el fragmento de 2,8 kb del gel usando el kit
de centrifugación GeneClean. Se digirió la construcción
pBr.Ad35.PRn\DeltaE3 con MluI y NdeI, se desfosforiló usando
enzima CIP (New England Biolabs) y también se aisló el fragmento de
vector de 15,2 kb usando el kit de centrifugación GeneClean. La
ligación de estos fragmentos dio la construcción
pBr.Ad35.\DeltaE3.PR5Orf6 (figura 17). Luego se usan
pBr.Ad35.\DeltaE3.PR5E4 y pBr.Ad35.\DeltaE3.PR5Orf6 para cambiar
el fragmento en 3' PacI-SwaI en
pWE.Ad35.pIX-rITR por las regiones correspondientes
de pBr.Ad35.\DeltaE3.PR5E4 y pBr.Ad35.\DeltaE3.PR5Orf6 tal como
se describió anteriormente. Esto conduce a las construcciones
pWE.Ad35.pIX-rITR\DeltaE3.5E4 y
pwE.Ad35.pIX-rITR\DeltaE3.5Orf6. Un método
alternativo para generar estos cósmidos grandes es el de usar tres
fragmentos en la reacción de ligación para el empaquetamiento: un
fragmento NotI-PacI de 14,7 kb de
pWE.Ad35.pIX-rITR, el inserto
PacI-NotI de pBr.Ad35. \DeltaE3.PR5E4 o
pBr.Ad35.\DeltaE3.PR5Orf6 y el fragmento de vector cósmido pWE15
digerido con NotI (Stratagene). Este último fragmento también puede
aislarse de la digestión con NotI/PacI de
pWE.Ad35.pIX-rITR.
Para hacer posible la generación de virus Ad35
recombinantes en la línea de células de complementación PER.C6
usando las construcciones a base de pBr.Ad35.PRn, se hizo en primer
lugar una construcción nueva que contenía secuencias Ad35 desde el
pb 3401 hasta el pb 24650 de la secuencia Ad35 (documento WO
00/70071) y de esta manera solapamientos tanto con los plásmidos
adaptadores como con las construcciones basadas en pBr.Ad35.PRn.
La transfección de estos tres plásmidos en células PER.C6 y un
evento de doble recombinación homóloga conducen a un genoma viral
completo y a la replicación de virus recombinantes tal como se
describe en la figura 18. Se hizo el plásmido requerido mediante la
deleción de una gran parte de las secuencias Ad35 en
pWE.Ad35.pIX-rITR. Después, se digirió
pWE.Ad35.pIX-rITR con EcoRV y se purificó el
fragmento que contenía vectores de 29 kb de un gel de bajo punto de
fusión usando el kit de centrifugación GeneClean. Se autoligó el ADN
purificado y se usó para transformar bacterias electrocompetentes
DH10B (Invitrogen/LTI) dando como resultado
pWE.Ad35.pIX-EcoRV
(figura 19).
(figura 19).
Se digirieron todos los ADN usados para la
transfección tal como se indica en la tabla 2, se inactivaron con
calor a 65ºC durante 15 minutos y se usaron sin tratamiento
adicional en la transfección. Se sembraron las células PER.C6 el
día anterior a la transfección en matraces T25 a una densidad de
3x10^{6} células/matraz y se transfectaron tal como se indica en
la tabla 2 usando lipofectamina (Invitrogen/LT1) según las
instrucciones del fabricante, excepto que se reemplazó la mezcla de
transfección en medio DMEM libre de suero (Gibco/BRL) por medio de
cultivo de PER.C6 (DMEM, FBS al 10% y MgCl_{2} 10 mM) tras cinco
horas. Al día siguiente, se estimó la eficacia de transfección al
50% por microscopia de fluorescencia. Dos días después, se
tripsinizaron las células y se volvieron a sembrar en matraces T80
y se incubaron adicionalmente a 37ºC/10% de CO_{2}. Seis días
después de la transfección todos los cultivos mostraron un efecto
citopatogénico completo (CPE, indicador de la propagación de virus)
excepto por el cultivo de PER.C6 transfectado con Ad35.AdApt.eGFP +
pWE.Ad35.pIX-rITR. Un día después, se recogieron
células y medio en los matraces con CPE y se sometieron a dos
ciclos de congelación/descongelación, se aclaró de residuos
celulares mediante centrifugación (10 min. a 1.500 rpm) y se usaron
100 \mul de estos lisados brutos para reinfectar células PER.C6
recientes al 85% de confluencia en matraces T80. La transfección de
Ad35.AdApt.eGFP + pWE.Ad35.pIX-rITR que no mostró
señales de CPE se recogió mediante tripsinización y también se
trató tal como anteriormente. Dos días después de la infección de
células PER.C6 frescas todos los matraces mostraron CPE completo
excepto por el que no mostró señales de CPE en el momento de la
recogida inicial. Esto muestra claramente que pueden hacerse virus
basados en Ad35 con deleción de E1 completa sobre células PER.C6
cuando se expresa el producto génico E4-Orf6 de Ad5
de la estructura principal de Ad35.
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<210> 1
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<211> 31
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> cebador 35FR
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<213> Secuencia Artificial
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35psi-For
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proteína E4-orf6 de Adenovirus tipo 35
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proteína E4-orf6+7 de Adenovirus tipo 5
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<210> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 150
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia de aminoácidos de la
proteína de fusión E4-orf6+7 de Adenovirus tipo 5 y
Adenovirus tipo 35
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 141
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia de aminoácidos de la
proteína E4-orf6+7 de Adenovirus tipo 35
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 25
Claims (30)
1. Vector de adenovirus recombinante que
comprende elementos estructurales y no estructurales de un
adenovirus de un primer serotipo, en el que dicho vector comprende
además una secuencia que codifica para una proteína
E4-orf6 funcional, en el que dicha secuencia se
selecciona del grupo que consiste en:
- a)
- una secuencia que codifica para E4-orf6 de un adenovirus de un segundo serotipo diferente de dicho primer serotipo; y
- b)
- una secuencia que codifica para E4-orf6 que comprende una fusión entre una parte de una secuencia que codifica para E4-orf6 de un segundo serotipo diferente de dicho primer serotipo y una parte de una secuencia que codifica para E4-orf6 de un tercer serotipo, en el que dicho tercer serotipo puede ser idéntico a o diferente de dicho primer serotipo.
\vskip1.000000\baselineskip
2. Vector de adenovirus recombinante según la
reivindicación 1, en el que dicho primer serotipo y dicho segundo
serotipo son de diferentes subgrupos de adenovirus.
3. Vector de adenovirus recombinante según la
reivindicación 1, en el que dicho primer serotipo es de un subgrupo
diferente del subgrupo C, y en el que dicha secuencia que codifica
para E4-orf6 es de un serotipo de adenovirus del
subgrupo C.
4. Vector de adenovirus recombinante según la
reivindicación 1, en el que dicho primer serotipo es del subgrupo B
y dicho segundo serotipo es del subgrupo C.
5. Vector de adenovirus recombinante según la
reivindicación 1, en el que dicha secuencia que codifica para
E4-orf6 es del serotipo 5 de adenovirus.
6. Vector de adenovirus recombinante según una
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que dicho primer
serotipo se selecciona del grupo que consiste en serotipos 11, 14,
16, 21, 34, 35 y 50 de adenovirus.
7. Vector de adenovirus recombinante según una
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, que comprende además una
secuencia que codifica para una proteína, polipéptido o péptido no
adenoviral.
8. Vector de adenovirus recombinante según la
reivindicación 7, en el que dicha proteína, dicho polipéptido o
dicho péptido no adenoviral se selecciona del grupo que consiste en:
un polipéptido inductor de muerte celular, un determinante
antigénico de un organismo patógeno, un antígeno específico de
tumor, una proteína viral, una hormona y una citocina.
9. Método para la producción de un vector de
adenovirus recombinante que comprende elementos estructurales y no
estructurales de un adenovirus de un primer serotipo, comprendiendo
dicho método las etapas de:
- a)
- proporcionar una célula de complementación que porte una secuencia que codifica para E1B-55K de un adenovirus de un segundo serotipo en forma expresable, con los elementos necesarios de un adenovirus tales como para permitir el ensamblaje de dicho vector de adenovirus recombinante por dicha célula de complementación, en el que dichos elementos comprenden al menos algunos elementos estructurales y no estructurales de un adenovirus de dicho primer serotipo diferente de dicho segundo serotipo y una secuencia que codifica para una proteína E4-orf6 funcional que es compatible con dicha proteína E1B-55K expresable en dicha célula de complementación;
- b)
- cultivar dicha célula de complementación en un medio en condiciones que permiten que tenga lugar la producción y el ensamblaje del vector de adenovirus; y
- c)
- recoger el vector de adenovirus recombinante producido de esta manera del medio y/o la célula de complementación,
en el que la secuencia que codifica para la
proteína E4-orf6 compatible está presente en el
vector de adenovirus recombinante producido de esta manera.
\vskip1.000000\baselineskip
10. Método según la reivindicación 9, en el que
dicha secuencia que codifica para E4-orf6 se
selecciona del grupo que consiste en:
- a)
- una secuencia que codifica para E4-orf6 de un adenovirus de dicho segundo serotipo;
- b)
- una secuencia que codifica para E4-orf6 de un adenovirus de un tercer serotipo diferente de dichos primero y segundo serotipos; y
- c)
- una secuencia que codifica para E4-orf6 que comprende una fusión entre una parte de una secuencia que codifica para E4-orf6 de un tercer serotipo y una parte de una secuencia que codifica para E4-orf6 de un adenovirus de dicho segundo serotipo, en el que dicho tercer serotipo puede ser idéntico a o diferente de dicho primer serotipo.
\vskip1.000000\baselineskip
11. Método según una cualquiera de las
reivindicaciones 9 ó 10, en el que dicho primero y dicho segundo
serotipos son de diferentes subgrupos.
12. Método según una cualquiera de las
reivindicaciones 9 a 11, en el que dicho segundo serotipo es un
serotipo de adenovirus del subgrupo C.
13. Método según la reivindicación 12, en el que
dicho segundo serotipo es serotipo 5 de adenovirus.
14. Método según una cualquiera de las
reivindicaciones 9 a 13, en el que dicho primer serotipo es un
serotipo de adenovirus del subgrupo B.
15. Método según la reivindicación 14, en el que
dicho primer serotipo se selecciona del grupo que consiste en
serotipos 11, 14, 16, 21, 34, 35 y 50 de adenovirus.
16. Método según una cualquiera de las
reivindicaciones 9 a 15, en el que dicha secuencia que codifica para
E1B-55K está integrada en el genoma de dicha célula
de complementación.
17. Método según una cualquiera de las
reivindicaciones 9 a 16, en el que dicha célula de complementación
se deriva de una célula humana diploide, primaria, o una célula
progenitora de la misma.
18. Método según una cualquiera de las
reivindicaciones 9 a 17, en el que dicha célula de complementación
se deriva de una célula de retinoblasto humano primaria, una célula
de riñón embrionario humana primaria, una célula neuronal humana
primaria o un amniocito humano primario.
19. Método según una cualquiera de las
reivindicaciones 9 a 18, en el que dicha célula de complementación
comprende, integrado en su genoma, un ácido nucleico que codifica
para al menos una proteína E1A de adenovirus.
20. Método según la reivindicación 19, en el que
dicho ácido nucleico que codifica para al menos una proteína E1A de
adenovirus es de un serotipo de adenovirus de un subgrupo diferente
que el subgrupo B.
21. Método según la reivindicación 19, en el que
dicho ácido nucleico que codifica para al menos una proteína E1A de
adenovirus es de un serotipo de adenovirus del subgrupo C.
22. Método según la reivindicación 20, en el que
dicho ácido nucleico que codifica para al menos una proteína E1A de
adenovirus es de un serotipo 5 de adenovirus.
23. Método según una cualquiera de las
reivindicaciones 9 a 22, en el que dicha secuencia que codifica para
E4-orf6 y dicha secuencia que codifica para
E1B-55K son de serotipos de adenovirus diferentes y
en el que dichos serotipos de adenovirus diferentes son miembros
del mismo subgrupo de adenovirus.
24. Método según una cualquiera de las
reivindicaciones 9 a 22, en el que dicha secuencia que codifica para
E4-orf6 y dicha secuencia que codifica para
E1B-55K son de serotipos de adenovirus diferentes, y
en el que dichos serotipos de adenovirus diferentes son ambos
miembros del subgrupo C.
25. Método según una cualquiera de las
reivindicaciones 9 a 22, en el que dicha secuencia que codifica para
E4-orf6 y dicha secuencia que codifica para
E1B-55K son del mismo serotipo de adenovirus.
26. Método según la reivindicación 25, en el que
dicha secuencia que codifica para E4-orf6 y dicha
secuencia que codifica para E1B-55K son del
serotipo 5 de adenovirus.
27. Método según la reivindicación 9, en el que
dicha célula de complementación es una célula PER.C6 o un derivado
de la misma.
28. Composición farmacéutica que comprende un
vector adenoviral recombinante según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 8, u obtenible mediante un método según una
cualquiera de las reivindicaciones 9 a 27.
29. Kit de partes que comprende:
- a)
- una célula de complementación para producir un vector de adenovirus recombinante que comprende elementos estructurales y no estructurales de un adenovirus de un primer serotipo, portando dicha célula una secuencia que codifica para E1B-55K de un adenovirus de un segundo serotipo en forma expresable; y
- b)
- uno o más vectores de ácido nucleico replicables que comprenden todos los elementos adenovirales necesarios para permitir el ensamblaje de dicho vector de adenovirus recombinante por dicha célula de complementación, en el que dichos elementos comprenden al menos algunos elementos estructurales y no estructurales de un adenovirus de dicho primer serotipo diferentes de dicho segundo serotipo y una secuencia que codifica para una proteína E4-orf6 funcional que es compatible con dicha proteína E1B-55K expresable en dicha célula de complementación.
\vskip1.000000\baselineskip
30. Kit de partes según la reivindicación 30, en
el que dicha secuencia que codifica para E4-orf6 se
selecciona del grupo que consiste en:
- a)
- una secuencia que codifica para E4-orf6 de un adenovirus de dicho segundo serotipo;
- b)
- una secuencia que codifica para E4-orf6 de un adenovirus de un tercer serotipo diferente del primero y segundo serotipos; y
- c)
- una secuencia que codifica para E4-orf6 que comprende una fusión entre una parte de una secuencia que codifica para E4-orf6 de un tercer serotipo y una parte de una secuencia que codifica para E4-orf6 de un adenovirus de dicho segundo serotipo, en la que dicho tercer serotipo puede ser idéntico a o diferente de dicho primer serotipo.
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