JP2002513290A

JP2002513290A - 修飾されたファイバー蛋白質を有するアデノウイルスによる遺伝子移入

Info

Publication number: JP2002513290A
Application number: JP54817398A
Authority: JP
Inventors: マックレランド・アラン; スティーブンソン・スーザン・シー; ゴルジグリア・マリオ; バニン・エリオ・エフ
Original assignee: ジェネティック・セラピー・インコーポレテッド
Priority date: 1997-05-08
Filing date: 1998-04-30
Publication date: 2002-05-08
Also published as: US20020192187A1; US20020123147A1; CA2289215A1; AU7263298A; NZ500791A; WO1998050053A1; IL132673A0; EP1015005A4; US20040175364A1; EP1015005A1; AU743051B2

Abstract

(57)【要約】修飾アデノウイルスを細胞にインビボ又はエキソビボで形質導入する。該アデノウイルスは、修飾される前は第一の血清型である。該修飾アデノウイルスにおいて、ファイバーの少なくとも一部分、特にヘッド部分が第一の血清型のアデノウイルスから除去され、第二の血清型アデノウイルスのファイバーの少なくとも一部分、特にヘッド部分と置換されている。このような方法は、該第一の血清型のアデノウイルスに抵抗性であるが、第二の血清型アデノウイルスのファイバーのヘッド部分に結合する受容体を有する細胞に形質導入するのに有用である。

Description

【発明の詳細な説明】修飾されたファイバー蛋白質を有するアデノウイルスによる遺伝子移入技術分野本発明は、１９９７年５月８日に出願された出願番号０８／８５２，９２４の一部継続出願であり、その全ての内容は本明細書の一部である。本発明は、遺伝子運搬ビークル（vehicle）として使用され、それによって遺伝子が細胞内に転移されるようなアデノウイルスに関する。特に、本発明は、修飾アデノウイルスを使用することによる細胞内への遺伝子の転移（移入）(trans fer)に関する。修飾される前のアデノウイルスは、第一の血清型であり、第−の血清型アデノウイルスのファイバーの少なくとも一部分、好ましくはヘッド部分が除去され、第二の血清型アデノウイルスのファイバーの少なくとも一部分、好ましくはヘッド部分と置換されている。本発明は、又、所望の血清型のアデノウイルスのファイバー、好ましくはヘッド部分の少なくとも一部分を含むように修飾されており、遺伝子運搬又は遺伝子転移ビークルが該所望の血清型のアデノウイルスのファイバーの当該部分、好ましくは当該ヘッド部分に対する受容体に結合するようになっている、該遺伝子運搬又は遺伝子転移ビークルに関する。このような遺伝子運搬又は遺伝子転移ビークルは、例えば、所望の血清型のアデノウイルスのファイバーの少なくとも一部分、好まし〈はヘッド部分を含むように修飾されている、ウイルス表面蛋白質を有する、レトロウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルスである。別の態様として、上記遺伝子運搬又は遺伝子転移ビークルは、所望の血清型のアデノウイルスのファイバーの少なくとも一部分、好ましくはヘッド部分が結合されているプラスミドのような、非ウイルス性遺伝子運搬又は遺伝子転移ビークルであり得る。一具体例として、遺伝子運搬又は遺伝子転移ビークルは発現ビークルを包摂したプロテオリポソームであり、該プロテオリポソームは所望の血清型のアデノウイルスのファイバーの少なくとも一部分、好ましくはヘッド部分を有する。本発明は、更に、少なくとも一つの外来性ＤＮＡ配列を含む血清型３のアデノウイルスに関し、又、血清型３のアデノウイルスのファイバーのヘッド部分に結合する受容体を有する細胞を血清型３のアデノウイルスのファイバーのヘッド部分を有する遺伝子転移ビークルと接触させることによって、該細胞内にポリヌクレオチドを移入させることに関する。本明細書中で使用される「遺伝子転移ビークル」という用語は、細胞にポリヌクレオチド（ＤＮＡ又はＲＮＡ）配列を運搬することの出来るいかなる構築物をも意味する。このような遺伝子転移ビークルには、非限定的に、アデノウイルス、レトロウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルスのようなウイルス、プラスミド、細胞内に転移されるポリヌクレオチド配列を包摂したプロテオリポソーム、並びに、付着融合性性(fusogenic)ポリマー層内、又は内部付着融合性性ポリマー層と外部親水性ポリマー層の間に含まれるポリヌクレオチドを有する「合成ウイルス」及び「合成ベクター」等が含まれる。本明細書中で使用される「ポリヌクレオチド」という用語は、リボヌクレオチド及びデオキシリボヌクレオチドを含むヌクレオチドの任意の長さのポリマー形態を意味する。このような用語には、一本鎖又は二重鎖ＲＮＡを含み、更に、メチル化又はキャップ化ポリヌクレオチドのような修飾ポリヌクレオチドも含まれる。背景技術アデノウイルスゲノムは、約３６キロベース塩基対の直鎖状、二重鎖のＤＮＡ分子である。ウイルスゲノムの各末端には、ウイルス複製に必要な、逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）として知られている短い配列が存在する。アデノウイルスは分子遺伝学的に充分特徴付けがなされているので、遺伝子導入の為に有利なベクターである。アデノウイルスの遺伝子構成に関する知識がある為に、ウイルスＤＮＡの大きな断片を外来性配列と置換することが可能である。更に、組換えアデノウイルスは構造的に安定していて、大量に複製した後でも再構成した(rearran ged)ウイルスは観察されない。従って、アデノウイルスは所望の遺伝子を真核細胞内に導入する為の運搬ビークルとして使用することが出来る。アデノウイルスによる運搬は細胞受容体と結合することによってこのような遺伝子を真核細胞に運搬する。アデノウイルスファイバー蛋白質はこのような付着に係わる(Philipson，et al.，J.Virol.，Vol ．2，pgs．1064-1075(1968))。ファイバー蛋白質には、テール部分(tail portio n)、シャフト部分(shaft portion)、及び、推定受容体結合領域を含む球状ヘッド部分(globular head portion)を有する。ファイバースパイクはホモトリマーであり、一つのビリオン当り１２個のスパイクがある。感受性細胞においては、アデノウイルスによる細胞侵入経路は、二つの別個の細胞表面現象から成る効率的な過程である(Wickham，et al.，Cell，Vol.73，pg s．309-319(1993))。第一に、アデノウイルスキャプシドファイバー蛋白質と未同定細胞表面受容体との間の高親和性相互作用によって、アデノウイルス粒子が細胞表面に付着する。引き続いて、ペントンが共受容体として機能する細胞表面インテグリン、αｖβ３及びαｖβ５と会合してウイルスの内部侵入(internalization)を可能にする(Wickham，(1993))。天然のアデノウイルス粒子及び発現されたファイバー蛋白質とを使用した競合試験によって、少なくとも二つの異なるアデノウイルスファイバー受容体が存在することが証明され、これらの受容体は亜属Ｂアデノウイルス（アデノウイルス３）及び亜属Ｃアデノウイルス(アデノウイルス５)と反応する(Defer,et al.,J.Virol.,Vol.6 4,pgs.3661-3673(1990);Mathias,et al.,J.Virol.,Vol.68,pgs.6811-6814(1994) ;Stevenson,et al.,J.Virol.,Vol.69,pgs.2850-2857(1995))。アデノウイルス３とアデノウイルス５は異なるファイバー結合受容体を利用しているが、αｖインテグリンはこれら両血清型の細胞内への侵入を強化する(Marthias，1994)。このことは、結合及び侵入の段階は関連していない事象であり、様々な細胞表面分子へのファイバー付着によって生産的な侵入が可能になるということを示唆している。その他のアデノウイルス血清型に対する別の受容体も存在すると思われるが、未だ証明されていない。ヒト亜属Ｃアデノウイルス（アデノウイルス血清型５）は、多くの非分裂細胞に容易に形質導入できる効率的な運搬ビークルである。アデノウイルスは広範囲な細胞、並びに、肺、肝臓、内皮細胞、及び筋肉等の組織に感染する(Trapnell ，et al.，Curr ．Opinion Biotech.，Vol．5，pgs．617-625(1994))。高い力価の精製アデノウイルスベクターストックを調製することが出来、これによってインビボでの投与をすることが出来る。肝臓形質導入の為の静注運搬及び肺に対する遺伝子移入のための気管内点滴を含むインビボ投与の様々な経路が研究されてきた。アデノウイルスベクター系がより広範囲に使用されるに従って、ある細胞型は組換えアデノウイルス感染に対して抵抗性があることが明らかになってきた。ファイバー結合受容体、及びαｖβ３又はαｖβ５インテグリンの両者は、標的細胞への高効率な感染にとって重要である。遺伝子移入を阻止することにおける組換え可溶性ファイバーの効率によって示されるように、ファイバーが介在する付着が効率的な形質導入に必要である(Goldman et al，J ．Virol．Vol．69，pgs．5951-5958(1995))。ファイバー受容体を欠いた細胞の形質導入はかなり低い効率で起こり、投入するベクターの量を多くする必要がある(Freimuth ert al.，J ．Virol．Vol.70，pgs．40 81-4085(1996);Haung，etal.，J ．Virol.，Vol．70，pgs．4502-4508(1996))。ファイバーに関係ない形質導入はペントン基アルギニン−グリシン−アスパラギン酸、即ち、ＲＧＤ配列が細胞表面のインテグリンに直接結合することによって起こるものと考えられる。ＲＧＤ：インテグリン経路を阻害することによって、遺伝子移入効率が数分の一に低下するが(Freimuth，1996;Haung，1996)、ファイバー受容体相互作用を阻害した場合に較べて不完全であり、ファイバー受容体相互作用の方がより重要であることが示唆される。低レベルの遺伝子移入は、標的細胞における侵入過程の成分の一つが欠けていることが原因と考えられる。例えば、ヒト肺上皮細胞への不充分な遺伝子移入はａｖｂ５インテグリンが欠失していることによる(Goldman，1995)。血管内皮細胞及び平滑筋細胞のようなその他の細胞型は、アデノウイルス５受容体が低レベルであるためにファイバー依存性形質導入が欠如していることが確認されている (Wickham，et al.，J ．Virol.，Vol．70，pgs．6831-6838(1996))。アデノウイルスベクターの標的細胞への効率的な形質導入を増強する又は可能にする為に、幾つかの試みが成されてきた。これらの戦略には、ペントン基を変更して、特異的細胞表面インテグリンを選択的に標的とすること(Wickman，et al.，Gene Ther.，Vol．2，pg s．750-756(1995);Wickman，et al.，J ．Virol.，Vol.70，pgs．6831-838(1996) )及びファイバー蛋白質を適当なリガンドで修飾して結合を変えること(Michael ，et al.，Gene Ther.，Vol.2，pgs.660-668(1995);Stevenson，1995)がある。発明の開示本発明は、アデノウイルスのファイバーの少なくとも一部分、特にヘッド部分が除去され、新規な受容体特異性を有するファイバー部分、特にヘッド部分と置換されているアデノウイルスによる細胞への形質導入に係る。細胞受容体に対する組換えアデノウイルス３とアデノウイルス５のファイバー蛋白質の結合は以前に研究され、ファイバー蛋白質の受容体特異性はこれら二つのファイバー蛋白質間のヘッド領域を交換することによって変更出来ることが示された(Stevenson ，1995)。即ち、本発明は、修飾される前のアデノウイルスは第一の血清型であり、該アデノウイルスのファイバーの少なくとも一部分、好ましくはヘッド部分が除去され、第二の血清型アデノウイルスのファイバーの少なくとも一部分と置換されているキメラファイバーを有する修飾アデノウイルスによる細胞への形質導入に係る。本発明者は、このようなアデノウイルスは、異なるファイバー結合受容体を利用しているが、第二の血清型アデノウイルスに対する受容体を有する細胞に結合し、しかも、修飾アデノウイルスのファイバーのヘッド領域の第二の血清型アデノウイルスに対する受容体への結合を介して修飾アデノウイルスにより結合していることを見出した。本発明は、又、所望の血清型のアデノウイルスのファイバーの少なくとも一部分、好ましくはヘッド部分を含む、アデノウイルス以外の遺伝子運搬又は遺伝子転移ビークルに係る。このような遺伝子転移ビークルは所望の血清型のアデノウイルスのファイバーに結合する受容体を有する細胞にポリヌクレオチドを運搬するのに有用である。本発明の遺伝子転移ビークルには、非限定的に、レトロウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、所望の血清型のアデノウイルスのファイバーの少なくとも一部分、好ましくはヘッド部分が化学的に結合されているプラスミド、及び細胞内に運搬されるポリヌクレオチドを包摂する(encap sulating)プロテオリポソームが含まれる。更に、もう一つの別の態様として、本発明は、少なくとも一つの外来性ＤＮＡ配列を有するアデノウイルス血清型３のアデノウイルスに係る。更に別の態様として、本発明は、アデノウイルス３に対する受容体を有する細胞にアデノウイルス３のファイバーの少な〈とも一部分、好ましくはヘッド部分を有する遺伝子運搬ビークルを接触させることにより、このような細胞内へポリヌクレオチドを移入させることに係る。図面の簡単な説明本発明を以下の図面に関して記載する。図１は、野生型ファイバーＡｖ１ＬａｃＺ４、及びキメラファイバーＡｖ９ＬａｃＺ４アデノウイルスベクターのゲノム分析を示す。図１Ａは、各ベクターの構成図上での、ＳｃａＩ(Ｓ)，ＤｒａＩ(Ｄ)，ＥｃｏＲＩ(Ｅ)，及びＢａｍＨＩ（Ｂ）制限エンドヌクレアーゼ部位を示す。予想されるＤｒａＩ及びＳｃａＩ制限断片、及びＡｖ１ＬａｃＺ４及びＡｖ９ＬａｃＺ４の予想サイズが強調されている。各ベクターよりＤＮＡを単離し、示されている制限エンドヌクレアーゼで消化し、そして標準操作によるサザンブロット分析を実施した。図１Ｂは、０．８％アガロースゲルに適用し、エチジウムブロマイドで染色して各ＤＮＡ断片を視覚化した、消化ＤＮＡ試料（０．４μｇ）を示している。λＤＮＡ／ＨｉｎｄIII及びφＸ１７４ＲＦＤＮＡ／ＨａｅIIIのＤＮＡサイズマーカーの組み合わせ（Ｍ）が示されている。野生型ファイバーＡｖ１ＬａｃＺ４ベクターは、レーン１，ＳｃａＩ(Ｓ)；レーン２，ＤｒａＩ(Ｄ)；及びレーン３，ＥｃｏＲＩ（Ｅ）及びＢａｍＨＩ（Ｂ）で消化されている。キメラファイバーＡｖ９ＬａｃＺ４アデノウイルスベクターは、レーン４，ＳｃａＩ(Ｓ) ；レーン５，ＤｒａＩ(Ｄ)；及びレーン６，ＥｃｏＲＩ（Ｅ）及びＢａｍＨＩ（Ｂ）で消化されている。図１Ｃは、ゼータプローブ(Zetaprobe)膜に写し取り、約１ｘ１０⁶ｃｐｍ／ｍｌの［³²Ｐ］標識化５００ｂｐアデノウイルス３ファイバーヘッドドメインプローブとハイブリダイズさせ、１２時間感光してフィルムとした、図１Ｂに示された消化ＤＮＡ断片である。アデノウイルス３ファイバーヘッドプローブとハイブリダイズしたＡｖ９ＬａｃＺ４由来と予想される断片が示されている。図２は、アデノウイルスキャプシド蛋白質のウエスタンイムノブロット分析を示す。Ａｖ１ＬａｃＺ４（レーン１及び４）及びＡｖ９ＬａｃＺ４ベクター（レーン２及び５）に対する等しい数のアデノウイルス粒子、又は完全長のアデノウイルス３ファイバー蛋白質を有するコントロールウイルス（レーン３及び６）を４／１５％ＳＤＳＰＡＧＥ及び変性条件下でのウエスタンブロット分析にかけた。(Ａ)１レーン当り２ｘ１０¹⁰のアデノウイルス粒子を適用し、膜を抗ファイバーモノクローナル抗体、４Ｄ２−５及び抗マウスＩｇＧ−ＨＲＰＯ結合二次抗体を用いて化学発光により発色させた。（Ｂ）１レーン当り６ｘ１０¹⁰のアデノウイルス粒子を適用し、膜をウサギ抗アデノウイルス３ファイバー特異的ポリクローナル抗体及びロバ抗ウサギＩｇＧ−ＨＲＰＯ結合二次抗体を用いて化学発光により発色させた。分子量マーカーの位置を示した。図３Ａ及び図３Ｂは、競合ウイルス形質導入アッセイの結果を示すグラフである。Ｈｅｌａ細胞の単層を、漸増する濃度の精製アデノウイルス５ファイバートリマー蛋白質(５Ｆ，図３Ａ)、又は、アデノウイルス３ファイバー蛋白質を有する昆虫細胞溶解物（３Ｆ／ＣＬ，図３Ｂ）と共にインキュベートし、その後、各細胞一個当り全１００粒子の各Ａｖ１ＬａｃＺ４(白丸)、又はＡｖ９ＬａｃＺ４（黒丸）アデノウイルスベクターで形質導入した。実施例１に記載されているように、２４時間後、細胞をβ−ガラクトシダーゼ発現に関して分析した。各競合濃度におけるアデノウイルスによる形質導入のパーセンテージをプロットした。各プロットは、代表的な実験に対して独立した３回の測定の平均±標準偏差である。図４（Ａ，Ｂ）は、ヒト細胞系のアデノウイルスによる形質導入特性の差異を示す。Ｈｅｌａ(図４Ａ及び４Ｂ)、ＭＲＣ−５(図４Ｃ及び４Ｄ)、及びＦａＤｕ（図４Ｅ及び４Ｆ）細胞を、各細胞一個当り全１，０００粒子の各Ａｖ１ＬａｃＺ４(図４Ａ，４Ｃ，４Ｅ)、又はＡｖ９ＬａｃＺ４（図４Ｂ，４Ｄ，４Ｆ）ベクターで形質導入した。実施例１に記載されているように、２４時間後、細胞をβ−ガラクトシダーゼ発現に関して分析した。各競合濃度におけるアデノウイルスによる形質導入のパーセンテージをプロットした。代表的な光学顕微鏡写真を示す。図５Ａ、図５Ｂ、及び図５Ｃは、Ｈｅｌａ、ＭＲＣ−５、及びＦａＤｕヒト細胞系へのアデノウイルス媒介形質導入を示すグラフである。示された細胞は各細胞一個当り全０、１０、１００、及び１０００粒子の各Ａｖ１ＬａｃＺ４(白丸) 、又はＡｖ９ＬａｃＺ４（黒丸）ベクターを用いて、全０．２ｍｌの培養液中で３７℃にて１時間で形質導入した。２４時間後に細胞を固定し、Ｘ−ガルで実施例１のように染色した。高倍率視野(high power field)当たりの形質導入細胞のパーセンテージを各ベクター投与につき求めた。各値は独立した３回の測定の平均パーセント形質導入±標準偏差であり、各ベクター投与は三重に実施した。各ベクター投与におけるＨｅｌａ(図５Ａ)、ＭＲＣ−５(図５Ｂ)、及びＦａＤｕ（図５Ｃ）細胞のパーセント形質導入が表示されている。図６Ａ及び図６Ｂは、各Ａｖ１ＬａｃＺ４(白丸)、又はＡｖ９ＬａｃＺ４（黒丸）ベクターで感染させた各細胞系に対するパーセント形質導入効率が、細胞当たり１００（図６Ａ）粒子、及び１０００（図６Ｂ）粒子の各ベクター投与につき表示されている。各値は独立した３回の測定の平均±標準偏差である。細胞系は、Ｈｅｌａ：ヒト子宮腫瘍細胞、ＨＤＦ：ヒト二倍体繊維芽細胞、ＴＨＰ−１：ヒト単球、ＭＲＣ−５：ヒト胎児性肺二倍体繊維芽細胞、ＦａＤｕ：ヒト扁平上皮腫瘍細胞、ＨＵＶＥＣ：ヒト臍帯静脈内皮細胞、及びＨＣＡＥＣ：ヒト冠状動脈内皮細胞である。図７は、細胞当たり１０，０００粒子までの量の各Ａｖ１ＬａｃＺ４又はＡｖ９ＬａｃＺ４で形質導入した初代ヒト大動脈平滑筋細胞のパーセンテージを示すグラフである。図８は、細胞当たり１，０００粒子までの量の各Ａｖ１ＬａｃＺ４又はＡｖ９ＬａｃＺ４で形質導入したヒト大動脈平滑筋細胞（ＨＡＳＭＣ）パーセンテージ、細胞当たり１，０００又は５，０００粒子までの量の各Ａｖ１ＬａｃＺ４又はＡｖ９ＬａｃＺ４で形質導入したブタ大動脈平滑筋細胞（ＰＡＳＭＣ）パーセンテージ、及び、細胞当たり１，０００粒子までの量の各Ａｖ１ＬａｃＺ４又はＡｖ９ＬａｃＺ４で形質導入したラット大動脈平滑筋細胞（ＲＡＳＭＣ）パーセンテージを示すグラフである。図９は、ヒト扁平上皮腫瘍細胞系のアデノウイルスによる形質導入特性の差異を示す。ＪＳＱ−３(パネルＡ及びパネルＢ)、Ｈｅｐ−２(パネルＣ及びパネルＤ)、及びＳＣＣ９（パネルＥ及びパネルＦ）細胞を、各細胞一個当り全１，０００粒子の各Ａｖ１ＬａｃＺ４(パネルＡ，Ｃ，及びＥ)、又はＡｖ９ＬａｃＺ４（パネルＢ，Ｄ，及びＦ）ベクターで形質導入した。実施例８に記載されているように、２４時間後、細胞をβ−ガラクトシダーゼ発現に関して分析した。代表的な光学顕微鏡写真を示す。図１０は、形質導入に対する投与量の影響を示す。ＪＳＱ−３(パネルＡ)、Ｈｅｐ−２(パネルＢ)、及びＳＣＣ９（パネルＣ）ヒト細胞系を漸増する投与量の各Ａｖ１ＬａｃＺ４(白丸)、又はＡｖ９ＬａｃＺ４（黒丸）に、全０．２ｍｌの培養液中で３７℃にて１時間暴露した。２４時間後に細胞を固定し、Ｘ−ガルで実施例８のように染色した。高倍率視野(high power field)当たりの形質導入細胞のパーセンテージを各ベクター投与につき求めた。各値は独立した３回の測定の平均パーセント形質導入± 標準偏差であり、各ベクター投与は三重に実施した。図１１は、ヒト扁平上皮腫瘍細胞系のアデノウイルスによる形質導入特性の差異を示す。各Ａｖ１ＬａｃＺ４（白四角）又はＡｖ９ＬａｃＺ４（黒四角）で感染した各細胞系に対する形質導入効率のパーセンテージが、細胞当たり１，０００粒子について示されている。各値は独立した３回ないし６回の測定の平均パーセント形質導入±標準偏差（ｓｄ）である。発明の詳細な説明本発明の一態様によれば、少なくとも一種のＤＮＡ配列を細胞内に導入する (transferring)方法が提供される。該方法は、細胞を少なくとも一種のＤＮＡ配列を有する修飾アデノウイルスで形質導入することから成る。修飾される前のアデノウイルスは、第一の血清型である。修飾アデノウイルスにおいては、該アデノウイルスのファイバーの少なくとも一部分が除去され、第二の血清型のアデノウイルスのファイバーの少なくとも一部分で置換されている。細胞は、第二の血清型のアデノウイルスのファイバーの少なくとも一部分に結合する受容体を有している。少なくとも一種のＤＮＡ配列の細胞内への導入は、修飾アデノウイルスが細胞に結合することを介して達成される。上記のように、アデノウイルスファイバー蛋白質は、ヘッド部分、シャフト部分及びテール部分を有する。本発明の一具体例では、第一の血清型のアデノウイルスのファイバーのヘッド部分の少なくとも一部分が除去され、第二の血清型アデノウイルスのヘッド部分の少なくとも一部分と置換されている。好適な具体例によれば、第一の血清型のアデノウイルスのファイバーのヘッド部分の全体が除去され、第二の血清型アデノウイルスのファイバーのヘッド部分と置換されている。一具体例においては、第一血清型と第二血清型とは、異なる亜属からのものである。一般的に、ヒトアデノウイルス血清型は亜属Ａから亜属Ｆに分類される。このような亜属については、Bailey,et al.，Virology,Vol.205,pgs.438-452(19 94)に詳しく記載されており、その内容は本明細書に参照として含まれている。亜属Ａには、アデノウイルス１２、アデノウイルス１８、及びアデノウイルス３１が含まれる。亜属Ｂには、アデノウイルス３、アデノウイルス７、アデノウイルス３４、及びアデノウイルス３５が含まれる。亜属Ｃには、アデノウイルス１、アデノウイルス２、アデノウイルス５、及びアデノウイルス６が含まれる。亜属Ｄには、アデノウイルス９、アデノウイルス１０、アデノウイルス１５、及びアデノウイルス１９が含まれる。亜属Ｅには、アデノウイルス４が含まれる。亜属Ｆには、アデノウイルス４０及びアデノウイルス４１が含まれる。一具体例として、第一の血清型のアデノウイルスは亜属Ｃ内の血清型のアデノウイルスであり、第二の血清型のアデノウイルスは亜属Ａ，Ｂ，Ｄ，Ｅ及びＦ内の一つに属するものである。別の具体例では、第二の血清型のアデノウイルスは亜属Ｂに属するものである。更に別の具体例では、第一の血清型のアデノウイルスはアデノウイルス５であり、第二の血清型のアデノウイルスはアデノウイルス３である。即ち、このような具体例においては、アデノウイルス５のファイバーのアミノ酸残基４０４から５８１（即ち、ファイバーヘッド部分）が除去され、アデノウイルス３のファイバーのアミノ酸残基１３６から３１９（即ち、ファイバーヘッド部分）と置換されている。アデノウイルス５のファイバー蛋白質をコードするＤＮＡはＧｅｎｂａｎｋ受託番号Ｎｏ．Ｍ１８３６９（参照として本明細書の一部を成す）として、アデノウイルス３のファイバー蛋白質をコードするＤＮＡはＧｅｎｂａｎｋ受託番号Ｎｏ．Ｍ１２４１１（参照として本明細書の一部を成す）として登録されている。修飾アデノウイルスによって形質導入される細胞は、第二の血清型アデノウイルスのファイバー蛋白質の一部分、特に、ファイバー蛋白質のヘッド部分と結合する受容体を有する細胞である。修飾アデノウイルスがアデノウイルス３のファイバーヘッド部分を有するアデノウイルス５血清型のアデノウイルスである場合には、このような修飾アデノウイルスによって形質導入される細胞には、非限定的に、例えば、肺上皮細胞及び肺癌細胞のような肺細胞；単球、マクロファージのような造血細胞を含む血液細胞；リンパ腫細胞；急性骨髄白血病細胞及び急性リンパ球白血病細胞を含む白血病細胞；例えば、血管及び消化系の平滑筋細胞を含む平滑筋細胞；及び、例えば、頭部及び首癌細胞、並びに神経芽細胞腫のような癌細胞がある。このようなアデノウイルスは、ファイバーの少なくとも一部分をコードするＤＮＡが除去され、第二の血清型アデノウイルスのファイバーの少なくとも一部分をコードするＤＮＡと置換されているような第一の血清型のアデノウイルスベクターから構築することが出来る。一般的に、かかるアデノウイルスは更に、細胞内に移入すべき少なくとも一種のＤＮＡ配列を含む。この少なくとも一種のＤＮＡ配列は外来性ＤＮＡ配列であり得、特に、治療剤をコードする外来性ＤＮＡ配列であり得る。この「治療剤」という用語は、包括的な意味で使用され、狭義の治療剤、予防剤及び置換剤を包含するものである。治療剤をコードするＤＮＡ配列としては、非限定的に、ＴＮＦ−αのような腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）遺伝子、インターフェロン−α、−β及び−γのようなインターフェロン類をコードする遺伝子、ＩＬ−１，ＩＬ−１β、ＩＬ−２からＩＬ−１４までのようなインターロイキン類をコードする遺伝子、Ｇ−ＣＳＦ，ＧＭ−ＣＳＦ，ＴＧＦ−α，ＴＧＦ−β及び繊維芽増殖因子をコードする遺伝子、オルニチントランスカルバミアーゼ（ＯＴＣ）をコードする遺伝子、アデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡ）をコードする遺伝子、リンパ球に対する増殖因子であるリンホカイン類のような細胞増殖因子をコードする遺伝子、上皮細胞増殖因子( ＥＧＦ)、血管内皮増殖因子(ＶＥＧＦ)、及びケラチン細胞増殖因子（ＫＧＦ）をコードする遺伝子、可溶性ＣＤ４をコードする遺伝子、ファクターVIIIをコードする遺伝子、ファクターIXをコードする遺伝子、チトクロムｂをコードする遺伝子、グルコセレブロシダーゼをコードする遺伝子、Ｔ細胞受容体をコードする遺伝子、ＬＤＬ受容体、ＡｐｏＥ，ＡｐｏＣ，ＡｐｏＡＩ及びコレステロール輸送及び代謝に関するその他の遺伝子、α−１アンチトリプシン（α１ＡＴ）遺伝子、Ｂ７．１のような共刺激抗原(co-stimulatory antigen)をコードする遺伝子、リンフォタクチンのような走化性物質をコードする遺伝子、嚢胞性繊維症性膜貫通調節（ＣＦＴＲ）遺伝子、インシュリン遺伝子、ヒポキサチンフォスフォリボシルトランスフェラーゼ遺伝子、例えば、ヘルペス単純ウイルスチミジンキナーゼ遺伝子、サイトメガロウイルスチミジンキナーゼ遺伝子、及び水痘ウイルスチミジンキナーゼ遺伝子のようなウイルスチミジンキナーゼ遺伝子のような「自殺」遺伝子又は負選択マーカー、抗体の抗原結合ドメインに対するＦｃ受容体をコードする遺伝子、肝炎Ｂ，又は非Ａ非Ｂ肝炎ウイルスの複製を阻害するアンチセンス配列のようなウイルス複製を阻害するアンチセンス配列、アンチセンスＣ−ｍｙｂオリゴヌクレオチド、例えば、マンガンスーパーオキシドジスムターゼ(Ｍｎ−ＳＯＤ)、カタラーゼ、銅亜鉛スーパーオキシドジスムターゼ (ＣｕＺｎ−ＳＯＤ)、細胞外スーパーオキシドジスムターゼ（ＥＣ−ＳＯＤ）及びグルタチオンレダクターゼのような抗酸化剤遺伝子、組織プラスミノーゲンアクチベーター(ｔｐＡ)、尿プラスミノーゲンアクチベーター(ウロキナーゼ)、ヒルディン、及びフェニルアラニンヒドロキシラーゼ遺伝子、酸化窒素合成酵素、血管作用性ペプチド、血管形成性(Angiogenic peptides)、ドーパミン遺伝子、ジストロフィン遺伝子、βグロビン遺伝子、αグロビン遺伝子、ＨｂＡ遺伝子、ｒａｓ，ｓｒｃ及びｂｃ１遺伝子のようなガン遺伝子(protooncogenes)、ｐ５３及びＲｂのようなガン抑制遺伝子、例えば、内皮単球活性化ポリペプチド−２（ＥＭＡＰ−２）のような抗血管形成性因子をコードする遺伝子、乳ガン、卵巣ガン、消化器ガン、及び子宮ガンを治療する為のヘレグリン−α蛋白質遺伝子、例えば、ｐ２１遺伝子のような細胞周期調節因子遺伝子、サイクリンＧ１及びＤ１遺伝子に対するアンチセンスポリヌクレオチド、内皮酸化窒素合成酵素（ＥＮＯＳ）遺伝子、Ｔ細胞抗原受容体のβ鎖内に含まれるエピトープに特異的なモノクローナル抗体、多剤耐性（ＭＤＲ）遺伝子、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）遺伝子、リボザイムをコードするＤＮＡ配列、アンチセンスポリヌクレオチド、血管平滑筋カルシウムチャンネル又はアドレナリン受容体又はアンジオテンシン変換酵素に対する拮抗阻害剤として機能する分泌ペプチドをコードする遺伝子、並びに、中枢神経系のアミロイドプラークを破壊する酵素等をコードするＤＮＡ配列を挙げることが出来る。しかしながら、本発明の範囲は、如何なる特定の治療剤に限定されるものではないことを理解されたい。治療剤をコードするＤＮＡ配列は、ゲノムＤＮＡ又はｃＤＮＡ配列であり得る。更に、該ＤＮＡ配列は天然のＤＮＡ配列、又はその対立変異体であっても良い。「対立変異体」という用語は、本明細書中において、一つ以上のヌクレオチドの置換、欠失、又は付加が天然ＤＮＡ配列にあり、それによってコードされるポリペプチド又はその断片又は誘導体の機能が実質的に変化しないような、該天然ＤＮＡ配列の変異形態を意昧する。一具体例では、ＤＮＡ配列は更に、リーダー配列又はその一部分、分泌シグナル又はその一部分、及び／又はトレーラー(tra iler)配列又はその一部分を含むことが出来る。少なくとも一つの治療剤をコードするＤＮＡ配列は適当なプロモーターの調節下にある。適当なプロモーターとしては、非限定的に、アデノウイルス主要後期プロモーターのようなアデノウイルスプロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターのような外来性プロモーター、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター、ＭＭＴプロモーター及びメタロチオネインプロモーターのような誘導性プロモーター、熱ショックプロモーター、アルブミンプロモーター、及びＡｐｏＡＩプロモーターを挙げることが出来る。しかしながら、本発明の範囲は、如何なる特定の外来性遺伝子又はプロモーターに限定されるものではないことを理解されたい。本発明で使用するアデノウイルスベクターの一具体例としては、本質的に完全なアデノウイルスゲノムを含むアデノウイルスベクターを挙げることができる(S henk et al.，Curr ．Top．Microbiol．Immunol.，111(3):1-39(1984))。別の態様として、アデノウイルスゲノムの少なくとも一部分を決失した修飾アデノウイルスベクターを使用することができる。好適な具体例として、アデノウイルスベクターには、アデノウイルス５’ＩＴＲ，アデノウイルス３’ＩＴＲ，アデノウイルスキャプシド化シグナル、治療剤をコードするＤＮＡ配列、及び該治療剤をコードするＤＮＡ配列を調節するプロモーターが含まれる。該ベクターでは、アデノウイルスＥ１及びＥ３ＤＮＡ配列の少なくとも主要部が欠如しているが、アデノウイルスＥ２及びＥ４ＤＮＡ配列の全部、及びアデノウイルス主要後期プロモーターに制御されるアデノウイルス蛋白質をコードするＤＮＡ配列が欠如しているわけではない。別の態様のベクターでは、Ｅ２及びＥ４ＤＮＡ配列から成る群から選択される少なくとも１つのＤＮＡ配列の少なくとも一部も欠如している。別の態様では、アデノウイルスＥ１及びＥ３ＤＮＡ配列の少なくとも主要部が欠如しており、且つ、Ｅ２及びＥ４ＤＮＡ配列の少なくとも一部も欠如している。更に別の態様のベクターでは、７２キロダルトンの結合蛋白質をコードするＥ２ａ領域の遺伝子が変異を受け、ウイルス粒子が形成される温度である３２℃で活性化されるような温度感受性蛋白質を生産するようになっている。この温度感受性変異はEnsinger et al.，J ．Virology，10:328-339(1972)，Van der Vliet et al.，J ．Virology，15:348-354 (1975)，Friefeld et al.，J ．Virology，124:380-389（1983）に記載されている。好適具体例におけるこのようなベクターは、標準的な技術によって、最初に、５’側から、アデノウイルス５’ＩＴＲ、アデノウイルスキャプシド化シグナル、及びＥ１ａエンハンサー配列を含む「必須左末端要素」、プロモーター(アデノウイルスプロモーター又は外来性プロモーター)、複数クローニング部位(本明細書に記載されたようなもの)、ポリＡシグナル、及びアデノウイルスゲノムのセグメントに対応するＤＮＡセグメントを含有するシャトルベクターを構築することにより作成される。このベクターには、更に、三つの部分から成る(tripartit e)リーダー配列が含まれていてもよい。アデノウイルスゲノムのセグメントに対応するＤＮＡセグメントは修飾又は突然変異アデノウイルスとの相同的組換えにおける基質として機能し、このような配列は、例えば、ゲノムの３３２９番目の塩基から６２４６番目の塩基より長くない、アデノウイルス５ゲノムのセグメントである。該ベクターには、更に、選択マーカー及び複製基点が含まれることがある。複製基点は細菌由来の複製基点で有り得る。このようなシャトルベクターの代表例としては、ＰＣＴ出願(ＷＯ９４／２３５８２(１９９４年１０月２７日公開)、及びＷＯ９５／０９６５４（１９９５年４月１３日公開）)並びに米国特許第５，５４３，３２８号（１９９６年８月６日付与）に記載されているｐＡｖＳ６を挙げることが出来る。治療剤をコードするＤＮＡ配列を複数クローニング部位に挿入し、プラスミドベクターを調製することが出来る。こうして得られる構築物は、アデノウイルスベクターを製造するのに使用される。相同的組換えは、Ｅ１及びＥ３アデノウイルスＤＮＡ配列の少なくとも主要部が除去された、修飾又は変異アデノウイルスを用いて行われる。このような相同的組換えは、上記プラスミドベクター及び修飾又は変異アデノウイルスを、例えば、２９３細胞のようなヘルパー細胞系にリン酸カルシウム沈殿によってコトランスフェクションすることで実施することが出来る。このような相同的組換えによって、ＮｏｔＩ部位と相同的組換え断片との間にシャトルベクター由来のＤＮＡ配列を含み、相同的組換え断片と３’ＩＴＲとの間にＥ１及びＥ３が除去されたアデノウイルス由来のＤＮＡ配列を含む、組換えベクターが形成される。一具体例において、相同的組換え断片は、アデノウイルス５(ＡＴＣＣＶＲ− ５)ゲノムの３３２９番目から６２４６番目のヌクレオチドと重複している。このような相同的組換えによって、アデノウイルス５’ＩＴＲ，アデノウイルスキャプシド化シグナル、Ｅ１ａエンハンサー配列、プロモーター、治療剤をコードするＤＮＡ配列、ポリＡシグナル、Ｅ１及びＥ３ＤＮＡ配列の少なくとも主要部が欠如しているアデノウイルスＤＮＡ、及びアデノウイルス３’ＩＴＲを含むベクターが作成される。更に、三つの部分から成るリーダー配列が含まれていてもよい。このベクターは、２９３ヘルパー細胞系（ＡＴＣＣＮｏ．ＣＲＬ１５７３）のような、ウイルス複製にとって必須のＥ１ａ及びＥ１ｂＤＮＡ配列を有するヘルパー細胞系（セルライン）内にトランスフェクションされ、アデノウイルス粒子を生産する。トランスフェクションは、エレクトロポラレーション、リン酸カルシウム沈殿、微小注射又はプロテオリポソームによって行うことが出来る。別の態様のベクターでは、アデノウイルスＥ１及びＥ４の各ＤＮＡ配列の全部又は少なくとも一部が欠如しているか、又は、アデノウイルスＥ１及びＥ２の各ＤＮＡ配列の全部又は少なくとも一部が欠如しているか、又は、アデノウイルスＥ１、Ｅ２及びＥ４の各ＤＮＡ配列の全部又は少なくとも一部が欠如している。このようなベクターは修飾又は非修飾ウイルスゲノム又はプラスミドと、アデノウイルス５（ＡＴＣＣＮｏ．ＶＲ−５）又は変異若しくは欠失を含むアデノウイルス５由来ウイルスのような直鎖状ウイルスゲノムから直接得られる断片との組み合わせからの直接のインビトロ結合によっても組み立てることが出来る。別の態様では、ベクターは、所望の修飾がなされたアデノウイルスゲノム（例えば、アデノウイルス５ゲノム又はアデノウイルス５Ｅ３突然変異Ａｄｄ１３２７(Thimmpaya，et al.，Cell，Vol.31,pg.543(1983))）の部分を含むプラスミドクローンと、左アデノウイルスＩＴＲ、Ｅ１領域欠如、及び所望のトランス遺伝子を含む第二のプラスミド（例えば、ｐＡｖＳ６）との間での真核細胞内における相同的組換えによって組み立てることが出来る。別の相同的組換えの方法によれば、プラスミドクローンと直鎖状アデノウイルス（例えば、アデノウイルス５、Ａｄｄ１３２７又は変異若しくは欠失を含むアデノウイルス５由来ウイルス）ゲノムとの間で行われる。次いで、ベクターは、このウイルスベクターから除去されている必須の遺伝子の機能を補完することのできるセルライン内にトランスフェクションされ、感染性ウイルス粒子を生成する。このセルラインは、一般的に、感染可能でアデノウイルス又はアデノウイルスベクターの増殖を助け、グルココルチコイドホルモンの存在下で連続的なウイルス生産が可能であり、グルココルチコイドホルモンに対して応答可能（即ち、グルココルチコイドホルモン受容体を発現することのできるセルライン）であるようなセルラインである。必須アデノウイルス遺伝子でトランスフェクションすることが可能で、感染性アデノウイルス粒子を生成する為に用いることのできるセルラインとしては、非制限的ではあるが、Ａ５４９，ＫＢ，Ｈｅｐ−２が挙げられる。或種のウイルス遺伝子が発現すると細胞毒となり得るので、Ｅ２ａ，Ｅ２ｂ及び／又はＥ４領域、並びにＥ１領域が誘導性プロモーターの調節下に入れることができる。このような誘導性プロモーターとしては、非限定的ではあるが、マウス乳腫瘍ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーター(Archer，et al.，Science，Vol.25 5，pgs.1573-1576（March 20，1992）、合成最小グルココルチコイド応答要素プロモーターＧＲＥ５(Mader，et al.，Proc ．Natl．Acad．Sci.，Vol.90，pgs.56 03-5607（June 1993）,又はテトラサイクリン応答性プロモーター(Gossen,et al .,Proc.Natl ．Acad．Sci.，Vol.89，pgs.5547-5551（June 1992）を挙げることができる。もう一つの態様では、Ｅ１領域は誘導性プロモーターの調節下にあり、Ｅ２ａ，Ｅ２ｂ及び／又はＥ４領域は天然プロモーターの調節下にある。このような場合には、天然プロモーターはＥ１領域の発現によってトランス活性化される。一具体例では、セルラインは、アデノウイルスＥ４全領域をその天然プロモーターとともに含み、かつ、転写調節の為に、例えば、ホルモン誘導性プロモーターであるマウス乳腫瘍ウイルス（ＭＭＶ）プロモーター又はグルココルチコイド応答要素（ＧＲＥ）を含むプロモーターのような、制御可能な又は誘導性のプロモーターの調節下のＥ１ａ領域又は全Ｅ１領域（Ｅ１ａ及びＥ１ｂ領域を含む）を含む。また別の態様では、Ｅ４ＤＮＡ配列もＭＭＶプロモーターのような制御可能プロモーターから発現される。Ｅ１及びＥ４ＤＮＡ配列は一つの発現ビークルに含まれるか、又は、別個の発現ビークルに含まれている。好ましくは、発現ビークルはプラスミドベクターであって、セルラインのゲノムに組み込まれている。アデノウイルスのＥ１及びＥ４の各ＤＮＡ配列の全て又は一部が欠如しているベクター、アデノウイルスのＥ１及びＥ２の各ＤＮＡ配列の全て又は一部が欠如しているベクター、又はアデノウイルスのＥ１、Ｅ２及びＥ４の各ＤＮＡ配列の全て又は一部が欠如しているベクター、並びに補完細胞系(complementing cell lines)は、ＰＣＴ出願（ＷＯ９６／１８４１８、１９９６年６月２０日公開）に記載されており、その内容は本明細書に参照として含まれる。上記のようなアデノウイルスベクターが作成された後に、ファイバー蛋白質の少なくとも一部分をコードするＤＮＡが除去され、修飾されるアデノウイルスの血清型とは異なる血清型を有するアデノウイルスのファイバー蛋白質の少なくとも一部分をコードするＤＮＡと置換されているように、このようなベクターのゲノムが修飾される。このような修飾は、当業者には公知の遺伝子工学的手法によって実施することができる。アデノウイルスベクターのゲノムの修飾後に、該ベクターは適当な細胞系内にトランスフェクションされて、ファイバー蛋白質の少なくとも一部分、特にヘッド部分が変更され、修飾されるアデノウイルスの血清型とは異なる血清型を有するアデノウイルスのファイバー蛋白質の少なくとも一部分を特にヘッド部分有するようになった感染性のアデノウイルス粒子が生成される。別の態様としては、修飾されたファイバー蛋白質をコードするＤＮＡ配列は、上記のようなアデノウイルスシャトルプラスミド内に置かれる。このシャトルプラスミドには治療剤をコードする少なくとも一種のＤＮＡ配列も含まれる。シャトルプラスミドは、ファイバー蛋白質をコードするＤＮＡ配列が欠如したアデノウイルスゲノムと共に適当な細胞系内にトランスフェクションされ、感染性ウイルス粒子を生成する。もう一つの別の態様では、第一のシャトルプラスミドには治療剤をコードする少なくとも一種のＤＮＡ配列が含まれる。第二のシャトルプラスミドには修飾されたファイバー蛋白質をコードするＤＮＡ配列が含まれる。第一のシャトルプラスミドは適当な細胞系内にコトランスフェクションされ、少なくとも一種のＤＮＡ配列を有する感染性ウイルス粒子が生産される。修飾されたファイバー蛋白質をコードするＤＮＡ配列が含まれる第二のシャトルプラスミドは、少なくとも一種のＤＮＡ配列を有するアデノウイルスと共に適当な細胞系内にコトランスフェクションされ、相同組換えによって、修飾されたファイバー及び治療剤をコードする少なくとも一種のＤＮＡ配列を有する感染性ウイルス粒子が生産される。更にもう一つの別の態様では、治療剤をコードする少なくとも一種のＤＮＡ配列を有する第一の血清型のアデノウイルスベクターと修飾ファイバーをコードするＤＮＡ配列を有するシャトルプラスミドとの間の相同組換えによって修飾アデノウイルスを構築する。本発明の修飾アデノウイルスは、インビボ、エキソビボ、又はインビトロで細胞を形質導入する為に使用される。インビボで投与される際には、本発明のアデノウイルスは宿主における治療効果を奏する上に有効な量で投与される。一具体例では、修飾アデノウイルスベクターは、１プラーク形成単位(Plaque forming unit)から１０¹⁴プラーク形成単位、好ましくは、１０⁶プラーク形成単位から１０¹³プラーク形成単位の量を投与する。宿主はヒト又はヒト以外の霊長類を含む哺乳動物であり得る。修飾アデノウイルスは、患者に投与するのに適当な、例えば、生理溶液のような液体、硫酸プロタミン(Elkins-Sinn，Inc.，Cherry Hill，N.J.)、又はポリブレン(Sigma Chemical)のような薬学的に許容し得るキャリアと組合わせて投与することが出来る。修飾アデノウイルスによって形質導入される細胞は、第二の血清型アデノウイルスに対する受容体を有する細胞であり、第二の血清型アデノウイルスのファイバー部分、特に、修飾アデノウイルスに含まれるヘッド部分と第二の血清型アデノウイルスに対する該受容体が結合する。一具体例として、第一の血清型アデノウイルスがアデノウイルス５であり、このアデノウイルスが、そのアデノウイルス５のファイバーの少な＜とも一部分、特にヘッド部分が除去され、アデノウイルス３のファイバーの少なくとも一部分、特にヘッド部分で置換されているように修飾されている場合には、形質導入される細胞には、非限定的に、例えば、肺上皮細胞のような正常肺細胞、肺繊維芽細胞、及び肺癌細胞のような肺細胞；単球、マクロファージのような造血細胞を含む血液細胞；リンパ腫細胞；急性骨髄白血病細胞及び急性リンパ球白血病細胞を含む白血病細胞；例えば、血管及び消化系の平滑筋細胞を含む平滑筋細胞；及び、例えば、頭部及び首癌細胞、肺癌細胞、並びに神経芽細胞腫のような癌細胞がある。このように、アデノウイルス３のファイバーのヘッド部分を有するアデノウイルス５血清型の修飾アデノウイルスは、肺の病気又は疾患（例えば、嚢胞性繊維症、肺サーファクタント蛋白質欠損状態、又は肺気腫）の治療に使用することが出来る。修飾アデノウイルスは、例えば、エアゾル吸引、又は気管支点滴、又は経鼻又は経気管点滴で投与が行われる。例えば、修飾アデノウイルスベクターは肺細胞を感染させるのに使用され、このような修飾アデノウイルスには嚢胞性線維症の治療に有効なＣＦＴＲ遺伝子が含まれている。別の態様では、修飾アデノウイルスには、ＳＰ−Ａ，ＳＰ−Ｂ，又はＳＰ−Ｃのような肺サーファクタント蛋白質をコードする遺伝子を含み、それによって該修飾アデノウイルスベクターは肺サーファクタント蛋白質欠損症の治療に使用される。更に別の態様として、修飾アデノウイルスには、α−１−アンチトリプシンをコードする遺伝子が含まれており、それによって該修飾アデノウイルスベクターはα−１−アンチトリプシン欠損症の結果引き起こされる肺気腫の治療に使用される。別の態様では、修飾アデノウイルスは、化学治療を受けている癌患者の造血幹細胞に感染させる為に使用され、このような細胞を化学治療剤の副作用から保護する。このような細胞は、インビボで修飾アデノウイルスにより形質導入されるか、又は、患者から取られ、エキソビボで修飾アデノウイルスにより形質導入され、その後戻される血液試料又は骨髄試料から得られる。例えば、多剤耐性（ＭＤＲ）遺伝子、又はジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）遺伝子を含有する本発明の修飾アデノウイルスをインビボ又はエキソビボで造血幹細胞に形質導入することが出来る。このような形質追導入された造血幹細胞は化学治療剤に対して耐性となり、形質導入された造血幹細胞はこのような化学治療剤による治療を受けている癌患者の中で生存することが出来る。更に別の具体例では、本発明の修飾アデノウイルスは、頭部又は首の癌、神経芽細胞腫、肺癌、及びリンパ腫のような腫瘍の治療に使用される。例えば、修飾アデノウイルスは単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＴＫ）のような負の選択マーカー又は「自殺」遺伝子と呼ばれるものを含む。このようなベクターは、例えば、腫瘍又はリンパ腫に修飾アデノウイルスを直接注射し、該腫瘍又はリンパ腫にアデノウイルスベクターが形質導入されることによって、患者に投与することから成る、頭部又は首の癌、神経芽細胞腫、肺癌、及びリンパ腫のような腫瘍の治療に使用される。別の方法として、頭部及び首の癌、又は神経腫瘍の治療に使用される場合、修飾アデノウイルスを頭部及び首の癌、又は神経芽細胞腫に近隣部位に位置する血管に投与し、それによって、修飾アデノウイルスが該頭部及び首の癌、又は神経芽細胞腫まで移動し、それらに形質導入される。該腫瘍細胞又はリンパ腫に修飾アデノウイルスが形質導入された後、例えば、ガンシクロビルのような相互作用薬剤又はプロドラッグを患者に投与し、これによって形質導入された細胞を殺す。更に別の具体例では、本発明の修飾アデノウイルスは、急性骨髄白血病細胞及び急性リンパ球白血病細胞を含む白血病細胞の治療に使用される。例えば、修飾アデノウイルスは上記のような負の選択マーカー又は「自殺」遺伝子と呼ばれるものを含む。このような修飾アデノウイルスは、例えば、静脈経由、又は、骨髄に投与され、白血病細胞にアデノウイルスベクターが形質導入される。該白血病細胞に修飾アデノウイルスが形質導入された後、例えば、上記相互作用薬剤又はプロドラッグを患者に投与し、これによって形質導入された細胞を殺す。別の具体例として、急性骨髄白血病細胞及び急性リンパ球白血病細胞を含む白血病細胞、又は神経芽細胞腫は、白血病細胞、又は神経芽細胞腫に対する免疫応答を惹起するポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を含む修飾アデノウイルスによって治療することも出来る。このようなポリペプチドには、非限定的に、インターロイキン−２のような免疫刺激性サイトカイニン、Ｂ７．１のような共刺激性抗原(co-stimulatory antigen)及びリンフォタクチンのような化学走化性薬剤が含まれる。神経芽細胞腫の治療に使用された場合に、修飾アデノウイルスは直接に該神経芽細胞腫に投与されるか、及び／又は血管経由で投与され、それによって修飾アデノウイルスが神経芽細胞腫に形質導入される。形質導入された白血病細胞又は神経芽細胞腫は、該白血病細胞又は神経芽細胞腫に対する免疫応答を惹起するポリペプチドを発現し、それによって、該白血病細胞又は神経芽細胞腫の増殖を阻止し、予防し、破壊する。更に別の具体例では、修飾アデノウイルスは、再発狭窄症(restenosis)を予防するか又は治療し、若しくは、侵入性(invasive)血管操作後の血管障害の予防又は治療に使用すること出来る。本明細書中で使用する「侵入性(invasive)血管操作」という用語は、非限定的に動脈及び静脈を含む血管系の一部分の修復、除去、置換、及び／又は再構成（例えば、バイパス又はシャント）を意味する。このような操作には、非限定的に、血管形成(angioplasty)、動脈移植のような血管移植、血栓の除去、動脈又は静脈の除去、及び冠状動脈バイパス手術が含まれる。例えば、修飾アデノウイルスには、ｐ２１遺伝子のような細胞周期調節因子、ヒルディン、内皮酸化窒素合成酵素(ＥＮＯＳ)、例えば、サクリンＧ１及びＤ１のエピトープを認識する抗体のような、サクリンＧ１及びＤ１に対するアンタゴニストをコードするＤＮＡ配列が含まれる。又は、修飾アデノウイルスには、サイクリンＧ１及びＤ１に対する遺伝子に対するアンチセンスポリヌクレオチドが含まれるか、又は、上記のような負の選択マーカー又は「自殺」遺伝子と呼ばれるものを含まれる。修飾アデノウイルスは血管障害又は侵入性(invasive)血管操作の近隣部位に血管内経由で投与され、それによって、修飾アデノウイルスが血管の平滑筋細胞に形質導入される。形質導入された細胞は治療剤を発現し、再発狭窄症又は血管障害を予防するか又は治療する。このような血管障害の再発狭窄症には、非限定的に、冠状動脈、頚動脈、股動脈、又は腎動脈の血管障害又は再発狭窄症、及び腎臓透析ろう管(f istulas)が含まれる。一具体例として、血管障害又は再発狭窄症が平滑筋細胞の増殖と関連する場合には、修飾アデノウイルスには、上記のような負の選択マーカーをコードする遺伝子又は「自殺」遺伝子と呼ばれるものが含まれる。該平滑筋細胞に修飾アデノウイルスが形質導入された後、上記のような相互作用薬剤又はプロドラッグを患者に投与し、これによって血管障害又は再発狭窄症の部位で形質導入された平滑筋細胞を殺し、血管障害又は再発狭窄症を治療する。別の具体例では、治療剤をコードする少なくとも一つのＤＮＡ配列を有する修飾アデノウイルスは動物に投与され、こうして得られる動物を病気、又は疾患及びそれらの治療について研究の為のモデルとして使用する。例えば、治療剤をコードするＤＮＡ配列を有する本発明の修飾アデノウイルスは、このような薬剤が欠如した動物に与えることが出来る。このような治療剤をコードするＤＮＡ配列を有する修飾アデノウイルスの投与後に、この治療剤の発現に関して該動物は評価される。このような研究の結果から、治療剤の欠如に関連する病気又は疾患の治療に、こうしたアデノウイルスをヒト患者にどのように投与したら良いかについて決定することが出来る。本発明の範囲としては更に、所望の血清型のアデノウイルスのファイバーの少なくとも一部分、好ましくはヘッド部分の少なくとも一部分、より好ましくは全ヘッド部分がアデノウイルス以外の遺伝子運搬又は遺伝子転移ビークルに含まれることである。このような遺伝子運搬又は遺伝子転移ビークルには、非限定的に、レトロウイルス、アデノ随伴ウイルス、及びヘルペス単純ウイルス等のヘルペスウイルス等のウイルスベクター；並びに、プラスミドベクター、遺伝性物質を包摂したプロテオリポソーム、「合成ウイルス」及び「合成ベクター」等が含まれる。ウイルスベクターを使用する場合には、レトロウイルスのエンベロープ、アデノ随伴ウイルスのネークド(naked)蛋白質被覆、又はヘルペスウイルスのエンベロープのようなウイルス表面蛋白質が、所望の血清型のアデノウイルスの少なくとも一部分、好ましくはヘッド部分の少なくとも一部分、より好ましくは全ヘッド部分を含むように修飾されていて、該ウイルスベクターを用いて該所望の血清型のアデノウイルスのファイバーのヘッド部分に結合する受容体を有する細胞を形質導入することが出来る。例えば、細胞内に転移すべきポリヌクレオチド（ＤＮＡ又はＲＮＡ）配列を含むウイルスベクターは、アデノウイルス３のファイバーのヘッド部分を含むように修飾されたウイルス表面蛋白質を有している。このようなウイルスベクターは、当業者に公知の遺伝子工学的手法に従って構築することが出来る。次いで、該ウイルスベクターを、上記のようなアデノウイルス３のファイバーのヘッド部分に結合する受容体を有する細胞に形質導入し、上記のような病気又は疾患を治療することが出来る。別の具体例として、遺伝子運搬ビークルは、所望の血清型のアデノウイルスのファイバーの少なくとも一部分、好ましくはヘッド部分の少なくとも一部分、より好ましくは全ヘッド部分が結合しているプラスミドである。この所望の血清型のアデノウイルスのファイバーの少なくとも一部分は細胞内に転移すべきポリヌクレオチド配列を含むプラスミドベクターに直接結合することが出来、又は、この所望の血清型のアデノウイルスのファイバーの少なくとも一部分は、例えば、ポリエチレンイミン、ポリリジン複合体、又はデンドリマーポリマーのような直鎖又は分岐状陽イオン性ポリマーのようなリンカー部分によってプラスミドベクターに結合することも出来る。該プラスミドベクターは該所望の血清型のアデノウイルスのファイバーのヘッド部分に結合する受容体を有する細胞を形質導入することが出来る。例えば、プラスミドベクターは直接、又はリンカー部分を介してアデノウイルス３のファイバーのヘッド部分に付着することが出来る。該プラスミドベクターは、アデノウイルス３のファイバーのヘッド部分と結合する受容体を有する細胞に形質導入することが出来る。別の具体例として、細胞内に転移すべきポリヌクレオチドを、所望の血清型のアデノウイルスのファイバーの少なくとも一部分、好ましくはヘッド部分の少なくとも一部分、より好ましくは全ヘッド部分を有するプロテオリポソーム内に包摂することが出来る。該細胞内に転移すべきポリヌクレオチドは裸の(単独の)ポリヌクレオチド配列か、又は、プラスミドベクターのような適当な発現ビークル内に含有されていてもよい。プロテオリポソームは当業者には公知の方法で調製することが出来る。細胞内に転移すべきポリヌクレオチドを包摂するプロテオリポソームを使用して、該所望の血清型のアデノウイルスのファイバーのヘッド部分に結合する受容体を有する細胞に該細胞内に転移すべきポリヌクレオチドを運搬することが出来る。例えば、プロテオリポソームはその壁の中にアデノウイルス３のファイバーのヘッド部分を有し、このようなプロテオリポソームは、上記のようなアデノウイルス３のファイバーのヘッド部分と結合する受容体を有する細胞と接触させることが出来る。該プロテオリポソームが細胞に結合した後に、リポソームに含まれるポリヌクレオチドが該細胞内に移入される。更に別の具体例として、細胞内に転移すべきポリヌクレオチドを「合成ウイルス」の一部とすることも出来る。このような合成ウイルスにおいて、該ポリヌクレオチドはｐＨ感受性膜不安定化ポリマーの内部付着融合性(fusogenic)層内に含まれる。この合成ウイルスには切断可能な親水性ポリマーの外部層も含まれる。所望の血清型のアデノウイルスのファイバーの少なくとも一部分、好ましくはヘッド部分の少なくとも一部分、より好ましくは全ヘッド部分を切断可能な親水性ポリマーの外部層に結合する。細胞内に転移すべきポリヌクレオチドは裸の( 単独の)ポリヌクレオチド配列か、又は、プラスミドベクターのような適当な発現ビークル内に含有されていてもよい。合成ウイルスを使用して、該所望の血清型のアデノウイルスのファイバーのヘッド部分に結合する受容体を有する細胞に該細胞内に転移すべきポリヌクレオチドを運搬することが出来る。例えば、合成ウイルスは切断可能な親水性ポリマーの外部層に結合するアデノウイルス３のファイバーのヘッド部分を有する。このような合成ウイルスは、上記のようなアデノウイルス３のファイバーのヘッド部分と結合する受容体を有する細胞と接触させることが出来る。該合成ウイルスが細胞に結合した後に、合成ウイルスに含まれるポリヌクレオチドが該細胞内に移入される。更に別の具体例として、細胞内に転移すべきポリヌクレオチドを「合成ベクター」の一部とすることも出来る。このような合成ベクターにおいて、該ポリヌクレオチドはｐＨ感受性膜不安定化ポリマーの付着融合性層内に含まれる。所望の血清型のアデノウイルスのファイバーの少なくとも一部分、好ましくはヘッド部分の少なくとも一部分、より好ましくは全ヘッド部分をｐＨ感受性膜不安定化ポリマーの付着融合性層に結合する。このような合成ベクターは、特にエキソビボ又はインビトロでポリヌクレオチドを細胞に運搬することに有用である。例えば、合成ベクターはｐＨ感受性膜不安定化ポリマーの付着融合性層に結合するアデノウイルス３のファイバーのヘッド部分を有する。このような合成ベクターは、上記のようなアデノウイルス３のファイバーのヘッド部分と結合する受容体を有する細胞と接触させることが出来る。該合成ベクターが細胞に結合した後に、合成ベクターに含まれるポリヌクレオチドが該細胞内に移入される。本発明の更に態様によれば、少なくとも一種の外来性ＤＮＡ配列を有するアデノウイルス３血清型のアデノウイルスベクターが提供される。この少なくとも一種の外来性ＤＮＡ配列は上記したものの中から選択することが出来る。このようなアデノウイルスベクターは、インビボ、エキソビボ、又はインビトロで、例えば、アデノウイルス３のファイバーのヘッド部分と結合する受容体を有する、上記のような細胞に形質導入する際に使用することが出来る。該ベクターは上記のような投与量で投与することが出来る。該ベクターは、上記のような薬学的に許容し得るキャリアと組み合わせて投与することが出来る。このようにしてベクターは上記したような病気又は疾患の治療に使用することが出来る。しかしながら、本態様の範囲は、如何なる特定の細胞型、又は特定の病気若しくは疾患の治療に限定されるものではないものと理解されたい。又、本発明の別の態様によれば、アデノウイルス３のファイバーの少なくとも一部分、好ましくはヘッド部分の少なくとも一部分、より好ましくは全ヘッド部分を含む遺伝子運搬ビークルを細胞と接触させることによって、少なくとも一種のポリヌクレオチドを該細胞内に移入する方法が提供される。このような細胞はアデノウイルス３のファイバーの少なくとも一部分と結合する受容体を有する。少なくとも一種のポリヌクレオチドの該細胞内への移入は、該遺伝子運搬ビークルが細胞と結合することによって行われる。このような遺伝子運搬ビークルには、非限定的に、アデノウイルス、レトロウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペス単純ウイルスのようなヘルペスウイルス、及び、細胞内に移入すべき少なくとも一種のポリヌクレオチドを包摂したプロテオリポソームがある。この少なくとも一種のポリヌクレオチドは、少なくとも一種の上記のよな治療剤をコードする。実施例本発明を以下の実施例に関して説明する。しかしながら、かかる実施例によって本発明の範囲は制限されるものではない。実施例１材料及び方法組換えファイバープラスミドアデノウイルス５に基づくアデノウイルスベクターの右側末端(right hand en d)における相同組換え用にシャトルベクターを構築した。このシャトルベクタープラスミド（「プレパック(prepac)」と呼ぶ）は、pBluescript ＳＫＩＩ（＋）(S tragene)にクローニングされているＡｄｄ１３２７(Thimmapaya，Cell，Vol．31 ，pg.543(1983))の２５１７１ｂｐから３４０５７ｂｐまでの最後の８８８６ｂｐゲノムを含み、Dr． Soumitra Roy，Genetic Therapy，Inc.，Gaithersberg，Marylandの好意により提供された。プレパック内に含まれる野生型アデノウイルス５ファイバーｃＤＮＡを、Horton，et al.，Biotechniues，Vol．8，pgs．528-535（1990）に記載されているように、ＰＣＲ遺伝子オーバーラップ伸長を用いて５ＴＳ３ＨａｃＤＮＡと置換した。Stevenson，et al.，J ．Virol.，Vol.69，pgs．2850-2857（1995 ）に記載されているように、５ＴＳ３Ｈａはアデノウイルス５ファイバーのテール及びシャフトドメイン（５ＴＳ；アミノ酸１から４０３）とアデノウイルス３ファイバーのヘッド領域（３Ｈ；アミノ酸１３６から３１９）が融合して含まれるものである。５ＴＳ３Ｈａは野生型５ＦｃＤＮＡの天然３’下流配列を有するように修飾された。更に、アデノウイルス３ファイバーのヘッド領域の最後の二つのコドンである「ＧＡＣＴＧＡ」を野生型５Ｆコドン配列である「ＧＡＡＴＡＡ」に相当するように変異させてアデノウイルス５ファイバーの停止コドン及びポリアデニル化シグナルを維持するようにした。アデノウイルス５ファイバー３’下流配列を、鋳型としてｐｇｅｍ５ＴＳ３Ｈプラスミド(Stevenson，1995 )を、そして以下のプライマー：及び、を使用して、５ＴＳ３ＨａｃＤＮＡに付加した。オーバーラッピング相同配列は、以下のプライマー：及び、を使用して、プレパックに付加した。予想したサイズの増幅産物が得られ、ゲル精製した。エンドプライマーＰ１及びＰ４を使用して第二のＰＣＲ反応を実施し、これら二つの断片を結合した。第二のＰＣＲ反応によって得られた断片は、野生型５Ｆコドン配列に変異された最後の二つのコドン及び適当な３’下流プレパック配列を有する５ＴＳ３ＨａｃＤＮＡを含んでいる。５ＴＳ３ＨａＰＣＲ断片をＮｄｅＩ及びＳｓｅ８３８７で消化し、直接プレパック内にクローニングしてファイバーシャトルプラスミドである、ｐｒｅｐ５ＴＳ３Ｈａを作成した。組換えアデノウイルスの作成修飾５ＴＳ３ＨａファイバーｃＤＮＡを、Ｅ１及びＥ３を欠如しβ−ガラクトシダーゼをコードするアデノウイルスベクターＡｖ１ＬａｃＺ４（ＰＣＴ出願No ．WO95/09654、１９９５年４月１３日公開）のゲノム内に、Ａｖ１ＬａｃＺ４と５ＴＳ３Ｈａファイバーシヤトルプラスミドとの間の相同組換えによって導入し、キメラファイバーアデノウイルスベクターである、Ａｖ９ＬａｃＺ４を作成した。ヒト胎児性腎臓細胞２９３(ATCC CCL-1573)をアメリカンタイプカルチャーコレクション（Rockville.MD）から入手して、１０％熱不活性化ＦＢＳ（ＨＩＦＢＳ）を含むＩＭＥＭ培地で培養した。１０μｇのＮｏｔＩ消化ｐｒｅｐ５ＴＳ３Ｈａ及び１．５μｇのＳｒｆＩ消化Ａｖ１ＬａｃＺ４ゲノムＤＮＡをリン酸カルシウム哺乳動物トランスフェクション系(Promega Corporation， Madison，WI)を使用して２９３細胞にトランスフェクションした。２９３細胞はリン酸カルシウムＤＮＡ沈殿とともに、３７℃で２４時間インキュベートした。沈殿を除去し、単層を生理的リン酸塩緩衝液（ＰＢＳ）で一回洗浄した。トランスフェクトされた２９３細胞単層の上を、７．５％ＨＩＦＢＳ、２ｍＭグルタミン、５０ユニット／ｍｌペニシリン、５０μｇ／ｍｌ硫酸ストレプトマイシン、及び１％アンフオテリシンＢを含むＭＥＭの１％シープラークアガロース溶液で覆った。アデノウイルスプラークを約１４日後に単離した。各プラークを展開し、ゲノムＤＮＡを単離し、キメラファイバー５ＴＳ３ＨａｃＤＮＡの存在に関してＳｃａＩ制限酵素消化を用いてスクリーニングし、プローブとしてＡｄ３ファイバーヘッド部分を使用したサザンブロット分析により確認した。陽性プラークは二回のプラーク精製にかけ、元のＡｖ１ＬａｃＺ４挟雑物を除去した。この二回のプラーク精製の後、Ａｖ９ＬａｃＺ４ベクターを展開し、ＣｓＣｌ超遠心を用いる従来技術により精製した。アデノウイルスカ価（粒子／ｍｌ）を分光学的に測定し（Halbert，et al.，J ．Virol.，Vol．56，pgs．250-257(1985);Weiden ，et al.，Proc ．Natl．Acd．Sci.，Vol．91，pgs．153-157(1994)）、Mitterde r，et al.，J ．Virol.，Vol.70，pgs．7498-7509(1996)に記載されているように２９３細胞単層を使用して測定した生物学的力価（ｐｆｕ／ｍｌ）と比較した。感染粒子に対する全粒子の割合（粒子／ｐｆｕ）を計算した。各ベクターからＤＮＡを単離してＤｒａＩ，ＳｃａＩ，又はＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩで消化し各ベクターを同定し確認した。Ａｖ９ＬａｃＺ４及び元のＡｖ１ＬａｃＺ４ベクターの模式図を図１に示した。バキュロウイルス内でのファイバー構築物の発現既に記載されているように(Stevenson，1995)、バキュロウイルス発現系(Clon tech，Palo Alto，CA)を使用して受容体結合の研究のためのファイバー蛋白質を製造した。Ａｄ３又はＡｄ５ファイバー蛋白質を発現する組換えバキュロウイルスベクターを使用した。Spodoptera frugiperda細胞（Ｓｆ２１）を単層で、２７℃において、１０％ＨＩＦＢＳ、１００ユニット／ｍｌペニシリン、１００μ ｇ／ｍｌ硫酸ストレプトマイシン、及び２．５μｇ／ｍｌアンフォテリシンＢを含むグレース(Grace)添加昆虫細胞培地で培養した。各組換えファイバーバキュロウイルスによるＳｆ２１細胞の大規模な感染を実施し、ファイバー保有細胞溶解物を調製した(Stevenson，1995)。Ｓｆ２１細胞溶解物からアデノウイルス５ファイバーを精製した(Stevenson， 1995)。簡潔に述べると、ＤＥＡＥ−セファロースカラム、及びＦＰＬＣシステム(Pharmacia)を用いるＰＢＳで平衡化したスーパーロース６ゲルろ過カラムを使用した二段階の精製操作により、アデノウイルス５ファイバートリマーを均一物まで精製した。精製したアデノウイルス５ファイバートリマー、及びアデノウイルス３ファイバー（３Ｆ／ＣＬ）を有する細胞溶解物の蛋白質濃度は、牛血清アルブミン（ＢＳＡ）をアッセイ標準として用いるビシンコニン酸(bicinchonin ic acid)蛋白質アッセイ(Pierce，Rockford，IL)によって測定した。ファイバー蛋白質の発現は変性条件下のドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）− ４／１５％ポリアクリルアミドゲル電気泳動(ＰＡＧＥ)、及びウエスタンブロットにより確認した。小型のトランスブロット装置（Biorad，Hercles，CA）により、１００ボルト３０分間で蛋白質をポリビニリデンジフルオリド（ＰＶＤＦ）膜に移動させた。この移動が完了した後、ＰＶＤＦ膜をポンシーレッド(Ponceau red)で一時的に染色し、分子量標準を直接膜上に記した。使用した分子量標準は２００から１４ｋＤａ(Biorad)であった。ＰＶＤＦ膜上の非特異的蛋白質結合部位は、１５０ｍＭＮａＣｌ，２ｍＭＥＤＴＡ，０．０４％Ｔｗｅｅｎ−２０を含有する１０ｍＭＴｒｉｓ，ｐＨ７．４の５％乾燥ミルク溶液を使用して室温下１時間、又は４℃下一晩でブロックした。次いでこの膜を、一次抗アデノウイルス２ファイバーモノクローナル抗体、４Ｄ２−５(Dr．J．Engler，University of Alabamaの好意により提供された腹水)の１：10,000の希釈溶液、又は、アデノウイルス３ファイバーヘッドドメインを発現するバキュロウイルスに対して作成された、部分精製の抗アデノウイルス３ファイバー特異的ウサギポリクローナル抗体(Stevenson，1995)２０μｇ／ｍｌと共に、室温で１時間インキュベートした。増感化学発光系(Amersham Li fesciences，Arlington，IL)を使用して、二次ヒツジ抗マウスＩｇＧ西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰＯ）結合抗体(Amersham Lifesciences，Arlington，I L)の１：10,000の希釈溶液、又は、二次ロバ抗ウサギＩｇＧ−ＨＲＰＯ結合抗体の１:2,000の希釈溶液により膜を発色させた。膜を約３から６０秒間フィルムに感光させた。抗アデノウイルス３ファイバー特異抗血清の生産既に記載されたバキュロウイルス発現系(Stevenson，1995)を使用して、アデノウイルス３ファイバーのヘッド領域を発現させた。標準プロトコール(Lofstra nd Labs Ltd.，Gaithersberg，MD)に従って、ファイバーのヘッド領域を含む昆虫細胞溶解物を用いてニュージーランド白ウサギを免疫した。ＩｇＧ画分を単離し、昆虫細胞溶解蛋白質を共有結合させたアフィニティカラムにかけた。このフィニティカラムに未結合の画分を集め、アデノウイルス５、アデノウイルス３、及びキメラ５ＴＳ３Ｈファイバー蛋白質に対する免疫反応性をウェスタンブロット分析によりテストした。競合的ウイルス形質導入アッセイ組換えアデノウイルスの受容体指向性をファイバー蛋白質競合物の存在下でのウイルス形質導入アッセイで評価した。１０％ＨＩＦＢＳ、１００ユニット／ｍｌペニシリン、及び１００μｇ／ｍｌ硫酸ストレプトマイシン添加のＤＭＥＭを含む１２ウェル内で培養したＨｅｌａ細胞（ATCC CCL2）の単層を、精製アデノウイルス５ファイバートリマー蛋白質(０．０５μｇ／ｍｌから１００μｇ／ｍｌ)、又は、アデノウイルス３ファイバーを含む昆虫細胞溶解物（１００μｇ／ｍｌから２０００μｇ／ｍｌ）の各種希釈物とともに、２％ＨＩＦＢＳ含有０．２ｍｌＤＭＥＭ（全量）で３７℃１時間インキュベートした。全量５μｌのＡｖ９ＬａｃＺ４及び元のＡｖ１ＬａｃＺ４アデノウイルスベクターを添加し、細胞一個あたりの全粒子の割合が１００となるようにウイルスを２％ＨＩＦＢＳ含有ＤＭＥＭで希釈した。ウイルスによる形質導入を３７℃で１時間実施した。該単層をＰＢＳで一度洗浄し、１０％ＨＩＦＢＳ含有ＤＭＥＭ１ｍｌを各ウエルに添加し、細胞を更に２４時間インキュベートし、β−ガラクトシダーゼを発現させた。細胞の単層をＰＢＳ中の０．５％グルタルアルデヒドで固定し、１ｍｇ／ｍｌの５−ブロモ−４−クロロ−３−インドイル−β−Ｄ−ガラクトシド(Ｘ−ガル)、５ｍＭフェロシアナイドナトリウム、２ｍＭＭｇＣｌ₂を含むＰＢＳ０．５ｍｌ中でインキュベートした。細胞は、３７℃で約２４時間染色した。単層をＰＢＳで洗浄して、高倍率視野当りの青色細胞の平均数をＺｅｉｓｓＩＤ０３顕微鏡を使用する光学顕微鏡でで計測し、１ウェル当り３から５個の視野を計数した。高倍率視野当りの青色細胞の平均数を競合的ファイバー蛋白質を含まないコントロールに対するパーセンテージで示した。競合物の各濃度を３重に行い、平均パーセンテージ±標準偏差を、添加した競合物ファイバー蛋白質の関数として表した。各実験は３回から４回行われ、代表的な実験からのデータを示した。細胞培養Ａｖ９ＬａｃＺ４及びＡｖ１ＬａｃＺ４による形質導入効率をヒト細胞系パネルで調査した。Ｈｅｌａ，ＭＲＣ−５(ＡＴＣＣＣＣＬ−１７１)，ＦａＤｕ( ＡＴＣＣＨＴＢ４３)及びＴＨＰ−１(ＡＴＣＣＴＩＢ−２０２)をＡＴＣＣから入手し、推奨培地で培養した。ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ，ＣＣ− ２５１７）及び冠状動脈内皮細胞(ＨＣＡＥＣ，ＣＣ−２５８５)はClonetics Co rporation(San Diego，CA)から入手し、推奨培地で培養した。細胞１個あたりキメラファイバーＡｖ９ＬａｃＺ４又は野生型Ａｖ１ＬａｃＺ４アデノウイルスベクターの全０，１０，１００，及び１０００粒子を、２％ＨＩＦＢＳ含有の全量０．２ｍｌの培地中で３７℃で１時間、各細胞系に形質導入した。細胞単層をＰＢＳで一度洗浄し、１０％ＨＩＦＢＳ含有の適当な培地１ｍｌ中を添加した。ＴＨＰ−１は２％ＨＩＦＢＳ含有の全量０．２ｍｌの培地中で３７℃で１時間上記の各濃度のベクターとインキュベートし、その後、１０％ＨＩＦＢＳ含有の完全培地１ｍｌを添加した。これらの細胞を２４時間インキュベートしてβ−ガラクトシダーゼを発現させた。細胞の単層を上記のように固定して染色した。Ｘ−ガル溶液中での各細胞系のインキュベーションは、偽感染ウェルに見られたバックグランド染色の量に応じて１．５乃至２４時間の間で変化させた。パーセンテージ形質導入は、高倍率視野における全細胞一個当りの形質導入された青色細胞数をＺｅｉｓｓＩＤ０３顕微鏡による光学顕微鏡で１ウェル当り３から５の視野を計測することによって測定した。各ベクター投与は三重に行い、高倍率視野当りの平均パーセンテージ形質導入（平均±標準偏差，ｎ＝３）を求め、添加ベクターの関数として表示した。各細胞系を少なくとも３回形質導入し、データは３回の独立した各試験から得られた平均パーセンテージ形質導入±標準偏差を表している。結果キメラファイバー遺伝子を含有するアデノウイルスベクターの構築インビトロで発現されるキメラファイバー蛋白質及び昆虫細胞を使用して、ヘッドドメインを別の受容体を認識する別の血清型と交換することによってアデノウイルスファイバー蛋白質に特異的な受容体を変更することが以前から示されていた(Stevenson，1995)。変更された受容体特異性を有するアデノウイルスベクター粒子を製造するために、アデノウイルス５ファイバーのテール及びシャフトにアデノウイルス３ファイバーのヘッドドメインが融合したキメラファイバー遺伝子である、５ＴＳ３Ｈ、をアデノウイルスゲノムであるＡｖ１ＬａｃＺ４内に組み込んだ。野生型アデノウイルス５ファイバー遺伝子の正確な置換の為に、アデノウイルス５ファイバー遺伝子、Ｅ４及び右端ＩＴＲを含有する７３．９から１００マップユニットまでのＡｄｄ１３２７ゲノムの最後の８８８６ｂｐを含むシャトルプラスミドが構築された。このシャトルプラスミドは、Ｅ１及びＥ３を欠如するアデノウイルスベクターＡｖ１ＬａｃＺ４のバックボーンに修飾ファイバー遺伝子を相同組換えによって導入するために使用された。この戦略は、天然アデノウイルス５のファイバーをプレップ５ＴＳ３Ｈａシャトルプラスミド内にクローニングされたキメラ５ＴＳ３Ｈファイバー配列と置換することである。得られたベクターであるＡｖ９ＬａｃＺ４は核標的β−ガラクトシダーゼｃＤＮＡ及びアデノウイルス３ファイバーのヘッドドメインを有する。この方法はアデノウイルスゲノムに組み込ませる天然ファイバー配列に対するいかなる修飾をも可能にするものである。元の（親）Ａｖ１ＬａｃＺ４及びキメラファイバーＡｖ９ＬａｃＺ４ベクターは図１に模式的に示されている。アデノウイルス３ファイバーのヘッド領域によってＤｒａＩ及びＳｃａＩ制限酵素部位がＡｖ１ＬａｃＺ４ゲノム内に追加され、これら部位が組換えウイルスの特定に使用される。図１Ａに示されたような、予想されるＤｒａＩ及びＳｃａＩ診断断片を生じたプラークを選択し、展開した。精製したキメラファイバーＡｖ９ＬａｃＺ４及び元の（親）Ａｖ１ＬａｃＺ４からゲノムＤＮＡを制限酵素及びアガロースゲル電気泳動で分析した(図１Ｂ)。予想されたＤＮＡ断片はＡｖ９ＬａｃＺ４及び野生型Ａｖ１ＬａｃＺ４の両方から得られた。Ａｖ９ＬａｃＺ４ゲノムＤＮＡのＳｃａＩ消化によって１８．４及び３．２ｋｂの診断断片が得られ(図１Ｂ、レーン４)、これはアデノウイルス３ファイバーのヘッド領域の存在を示している。Ａｖ９ＬａｃＺ４のＤｒａＩ消化によって８．０及び２．８ｋｂの診断断片が得られ、これによってもアデノウイルス３ファイバーのヘッド領域の存在が示された(図１Ｂ、レーン５)。ＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩ消化によって、予想されたような同一の制限酵素パターンが両方のベクターから得られた (図１Ｂ、レーン３及び６)。アデノウイルス３ファイバーのヘッドプローブを用いたサザンブロット分析によって、両ベクターに関して、全ての制限エンドヌクレアーゼ消化に対して予想されたハイブリダイゼーションパターンが示された( 図１Ｃ)。Ａｖ９ＬａｃＺ４のＳｃａＩ消化による１８．４及び３．２ｋｂの診断断片及びＤｒａＩ消化による８．０及び２．８ｋｂの診断断片はアデノウイルス３ファイバーのヘッドプローブとハイブリダイズした(図１Ｃ、レーン４及び５)。完全長５ＴＳ３Ｈファイバーヘッド遺伝子が含まれるＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩ断片も同様に検出された(図１Ｃ、レーン６)。アデノウイルス５ファイバーのヘッドプローブを用いたサザンブロット分析（デ−タは示さず）によって、Ａｖ１ＬａｃＺ４に対する予想されたハイブリダイゼーションパターンが示され、キメラファイバーＡｖ９ＬａｃＺ４ウイルス調製物は元のＡｖ１ＬａｃＺ４を欠いていることが確認された。キメラファイバー含有アデノウイルス粒子の特徴付けキメラ５ＴＳ３Ｈファイバー蛋白質のアデノウイルス内への組み込み及び発現に関して、ＣｓＣｌ精製ウイルスストックのウエスタンブロット分析により検討した。等数のキメラ（Ａｖ９ＬａｃＺ４）及び親(Ａｖ１ＬａｃＺ４)粒子を変性下での４/１５％ＳＤＳＰＡＧＥにかけた。完全長Ａｄ３ファイバーを含むコントロールウイルスも同様に分析した。ウエスタンブロット分析は、モノクローナル抗体、４Ｄ２−５（図２Ａ）及び抗アデノウイルス３ファイバーヘッドドメインに特異的なウサギポリクローナル抗体（図２Ｂ）を使用して実施した。４Ｄ２−５モノクローナル抗体は、ファイバー蛋白質内のＮ−末端テールドメイン内に位置する保存(conservative)エピトープを認識し(Hong，et al.，Embo ．J.，V ol.14，pgs.4714-4727(1995))、アデノウイルス３ファイバー蛋白質（３Ｆ）及びアデノウイルス５ファイバー蛋白質（５Ｆ）の両方に反応する(Stevenson，19 95)。図２Ａに示されているように、Ａｖ１ＬａｃＺ４（レーン１）及びＡｖ９ＬａｃＺ４（レーン２）ウイルスは４Ｄ２−５と反応する約６２から６３ｋＤａのファイバー蛋白質を有しており、一方で、アデノウイルス３ファイバーウイルスは約３５ｋＤａのファイバー蛋白質を有していた(図２Ａ、レーン３)。キメラ５ＴＳ３Ｈファイバー蛋白質のアデノウイルス内でのアデノウイルス３ファイバーヘッド（３ＦＨ）ドメインの存在はアデノウイルス３ファイバーの特異的なウサギポリクローナル抗体を使用したウエスタンブロット分析により確認された。ウサギ抗３ＦＨポリクローナル抗体はＡｖ１ＬａｃＺ４のアデノウイルス５ファイバー蛋白質とは反応せず、コントロールウイルス（図２Ａ、レーン６）及びＡｖ９ＬａｃＺ４のキメラ５ＴＳ３Ｈファイバー蛋白質（図２Ｂ、レーン５）内に含まれるアデノウイルス３ファイバー蛋白質である３５ｋＤａに特異的であった。キメラファイバー（Ａｖ９ＬａｃＺ４）及び親ファイバー（Ａｖ１ＬａｃＺ４）アデノウイルスの生物学的力価及び粒子数を比較した。２９３細胞単層を使用して測定した生物学的力価は、Ａｖ１ＬａｃＺ４及びＡｖ９ＬａｃＺ４ウイルス調製物に対して、夫々、２．６及び４．５ｘ１０¹⁰プラーク形成ユニット（ｐｆｕ）／ｍｌであった。全粒子数は分光学的に測定し、Ａｖ１ＬａｃＺ４及びＡｖ９ＬａｃＺ４ウイルス調製物に対して、夫々、１．４５及び１．２５ｘ１０¹²粒子／ｍｌであった。即ち、ｐｆｕ力価に対する粒子数の割合はどちらのウイルスも類似しており、夫々、５５．８対２７．８全粒子数／ｐｆｕであった。アデノウイルス２に較べてアデノウイルス３でこの割合が増加することは報告されている(Defer．et al.，J ．Virol.，Vol.64，pgs.3661-3673(1990))。しかしながら、アデノウイルス５ファイバーヘッドドメインをアデノウイルス３ファイバーヘッドドメインと置換することによっては、キメラファイバー蛋白質を有するアデノウイルスの細胞生産を悪影響を及ぼしたり、全物理的粒子数の感染粒子に対する割合に顕著な変化を及ぼしたりはしないことが判明した。修飾ファイバーアデノウイルスの受容体結合特異性天然のアデノウィルス５ファィバーベクターと比較してキメラフィバーベクターの受容体結合特異性を評価するために、組換えファイバー蛋白質競合体の存在下で形質導入試験を実施した。キメラファイバー又は天然のアデノウイルス５ファイバーベクターで形質導入する前に、精製アデノウイルス５ファイバー蛋白質又はアデノウイルス３ファイバー蛋白質を含有する昆虫細胞溶解物と共に細胞をプレインキュベートした。図３は、Ａｖ１ＬａｃＺ４又はＡｖ９ＬａｃＺ４Ｈｅｌａベクターによる形質導入の前に、Ｈｅｌａ細胞をアデノウイルス５ファイバー蛋白質（図３Ａ）又はアデノウイルス３ファイバー競合体（図３Ｂ）の量を増加させてインキュベートした形質導入試験の結果を示したものである。Ａｖ１ＬａｃＺ４によるＨｅｌａ細胞への形質導入は、アデノウイルス５ファイバートリマー蛋白質量の増加に従い減少し、最大競合は０．１及び１．０μｇ／ｍｌの間で起こった。対照的に、精製したアデノウイルス５ファイバートリマーはＡｖ９ＬａｃＺ４キメラファイバーアデノウイルスによるＨｅｌａ細胞への形質導入を阻害しなかった。これらの結果から、野生型Ａｖ１ＬａｃＺ４とＡｖ９ＬａｃＺ４キメラファイバーベクターは異なる細胞表面蛋白質に結合することが確認された。この結論は、図３Ｂに示した逆の実験によっても支持された。アデノウイルス３ファイバー競合体の濃度を増加させると、Ａｖ９ＬａｃＺ４によるＨｅｌａ細胞への形質導入は減少したが、野生型であるＡｖ１ＬａｃＺ４ベクターによるＨｅｌａ細胞への形質導入は影響を受けなかった。アデノウイルス３ファイバー蛋白質を含まない昆虫細胞溶解物を用いたコントロール実験では競合は示されなかったので(結果は示さず)、アデノウイルス３ファイバー競合体とＡｖ９ＬａｃＺ４との間の競合は特異的である。これらの結果から、Ａｖ９ＬａｃＺ４ベクターによるＨｅｌａ細胞への形質導入はアデノウイルス３受容体と反応するキメラファイバー蛋白質を介するものであることを示している。即ち、アデノウイルス５ファイバーヘッドドメインを修飾することによって、アデノウイルスベクターの受容体指向性を変化させる結果となったのである。キメラファイバーベクターによるヒト細胞系の形質導入アデノウイルス５及びアデノウイルス３受容体は未だ同定されていないので、細胞分布に関して利用できる情報は比較的少ない。様々なヒト細胞におけるアデノウイルス５及びアデノウイルス３受容体の異なる発現は、親Ａｖ１ＬａｃＺ４とＡｖ９ＬａｃＺ４キメラファイバーベクターによる形質導入における差異に反映されているのかも知れない。この二つのベクターによる多数のヒト細胞系の形質導入特性が調査された。幾つかの細胞系はアデノウイルス５ファイバーアデノウイルス受容体結合に関して陰性であるか(Haung，et al.，J ．Virol.，Vol.70 ，pgs.4502-4508(1996);Stevenson，1995)、又は、Ａｖ１ＬａｃＺ４感染に抵抗性(refractory)である（未発）ことが確認された。細胞は、キメラファイバーであるＡｖ９ＬａｃＺ４、又は野生型であるＡｖ１ＬａｃＺ４アデノウイルスにより、０，１０，１００，及び１０００の細胞一個当り粒子割合で、全量０．２ｍｌの培地中で感染させ、２４時間後に上記のように細胞をＸ−ガルで染色した。図４は、Ｈｅｌａ細胞(図４Ａ及び４Ｂ)、ヒト胎児性肺繊維芽細胞系であるＭＲＣ−５(図４Ｃ及び４Ｄ)、及びヒト扁平上皮細胞がんであるＦａＤｕ（図４Ｅ及び４Ｆ）の単層を、細胞一個当り１００ウイルス粒子のＡｖ１ＬａｃＺ４及びＡｖ９ＬａｃＺ４で形質導入した代表的な写真である。Ｈｅｌａ細胞はどちらのベクターによっても似たような効率で形質導入された。対照的に、ＭＲＣ −５及びＦａＤｕでは異なる形質導入が観察された。これらの両細胞ともＡｖ１ＬａｃＺ４形質導入に対して比較的抵抗性があるが、Ａｖ９ＬａｃＺ４によって容易に形質導入された。各細胞系のパーセント形質導入を定量し、形質導入したＨｅｌａ細胞、ＭＲＣ −５及びＦａＤｕ細胞の割合を投与量の関数として示した(図５)。Ｈｅｌａ細胞（図５Ａ）にベクターによる形質導入に対して同程度に感受性があり、アデノウイルス５及びアデノウイルス３受容体が細胞表面に存在していることを示している。ヒト胎児性肺繊維芽細胞系であるＭＲＣ−５（図５Ｂ）はキメラファイバーＡｖ９ＬａｃＺ４により効率的に形質導入された。Ａｖ９ＬａｃＺ４によるパーセント形質導入は用量依存的であり、ベクター投与が１０００のときに約８０％の形質導入であった。Ａｖ１ＬａｃＺ４によるＭＲＣ−５の形質導入効率は低いことが観察され、これらから、この細胞はアデノウイルス５ファイバー受容体の発現レベルが低いか又は欠いていることが示唆された。対照的に、この型の細胞にはアデノウイルス３ファイバー受容体は豊富に存在するようである。ＦａＤｕ細胞単層（図５Ｃ）も又、Ａｖ９ＬａｃＺ４でより効率的に形質導入され、ベクター投与が１０００のときに７５％の形質導入であるのに対しＡｖ１ＬａｃＺ４では同じベクター投与量でわずか７％の形質導入しか達成されなかった。更に、Ａｖ９ＬａｃＺ４及びＡｖ１ＬａｃＺ４を用いて多くのヒト細胞系の形質導入が比較された。図６は、細胞一個当り１００個（図６Ａ）及び１０００個（図６Ｂ）のウイルス粒子の割合での各細胞系のデータをまとめたものである。上記のＨｅｌａ細胞、ＭＲＣ−５及びＦａＤｕ細胞以外に検討した細胞は、ＨＤＦ(ヒト二倍体繊維芽細胞)、ＴＨＰ−１(ヒト単球)、ＨＵＶＥＣ(ヒト臍帯静脈内皮細胞)、及びＨＣＡＥＣ（ヒト冠状動脈内皮細胞）である。これらの細胞は細胞一個当り１００個及び１０００個のウイルス粒子の割合でＡｖ９ＬａｃＺ４又はＡｖ１ＬａｃＺ４を用いて２４時間感染し、その後に上記のようにＸ−ガルで染色した。それぞれのベクター投与量における各細胞系の形質導入細胞の割合を測定した。既に示したように、Ｈｅｌａ細胞はこれらの両ベクターによって同等のレベルで形質導入され、一方で、ＨＤＦ細胞はＡｖ１ＬａｃＺ４およびＡｖ９ＬａｃＺ４による形質導入に抵抗性があった。ＨＤＦ細胞はアデノウイルス５ファイバー結合に陰性であり、この細胞はアデノウイルス５ファイバー受容体の発現レベルが低いか又は欠いていることが示されている(Stevenson，1995)。ＨＤＦ細胞に関して図６に示された形質導入のデータは、この細胞がアデノウイルス３ファイバー受容体についても、その発現レベルが低いか又は欠いていることを示している。この分析によって、親Ａｖ１ＬａｃＺ４及びキメラファイバーＡｖ９ＬａｃＺ４ベクターによる形質導入に差異のある幾つかのヒト細胞系が同定された。ＭＲＣ−５、ＦａＤｕ及びＴＨＰ−１細胞はアデノウイルス３ファイバーヘッドを有する組換えベクターにより用量依存的に感染され(図６Ａ及び６Ｂ)、これら細胞型にはアデノウイルス３受容体がアデノウイルス５受容体よりも豊富に存在していることを示唆している。細胞一個当り１０００個のウイルス粒子の割合で野生型Ａｖ１ＬａｃＺ４により約４５％のＨＣＡＥＣが形質導入され、一方、キメラファイバーＡｖ９ＬａｃＺ４ベクターでは僅か７．３％しか形質導入されなかった。ＨＵＶＥＣ（ヒト臍帯静脈内皮細胞）は両方のベクターにより同程度に形質導入された。Ａｖ１ＬａｃＺ４及びＡｖ９ＬａｃＺ４による形質導入における動脈内皮及び静脈内皮細胞の差異は、血管細胞の異なる領域由来の細胞上のアデノウイルス３及びアデノウイルス５受容体の発現の差異を明らかにした。これらの全てデータによって、潜在的な臨床上の関連性のある標的組織由来のヒト細胞系上のアデノウイルス３及びアデノウイルス５受容体の発現の違いが示された。議論遺伝子治療研究における主な目的は、インビボにおける効率的なターゲット遺伝子移入及び発現を達成することが可能であるベクター及び運搬システムの開発である。治療遺伝子発現の為に適当な型の細胞への遺伝子移入の効率性及び特異性を最大にし、且つ、毒性又は望ましくない副作用を生じる可能性のある体内の他の細胞又は部位への遺伝子の移入を最小にするベクターが必要とされている。インビボ遺伝子移入への応用に関して現在研究されているウイルスベクターの中で、アデノウイルス系はかなり有望であり、動物モデル及び肺疾患及び癌における初期臨床において多数の評価を受けてきた。アデノウイルスベクターの重要な特徴は、形質導入の効率性とその結果インビボで達成される高レベルの遺伝子発現である。これは、精製ウイルスベクターの高力価ストックを調製することが可能であること、及び、遺伝子発現に至るアデノウイルス侵入プロセスにおける各段階における顕著な効率性に由来するものである(Greber，et al.，Cell，Vol.7 5，pgs．477-486(1993))。アデノウイルス粒子の細胞への付着は、ファイバー蛋白質と細胞受容体との間の高アフィニティ相互作用によって媒介される(Phillip son，et al.，J ．Virol.，Vol.2，pgs.1064-1075(1968))。結合に続いて、多数の細胞型へのビリオンの侵入は、ペプトン基のＲＧＤペプチド配列と共受容体として機能するαｖｂ３及びαｖｂ５インテグリンとの間の相互作用によって促進される(Wickman，et al.，Cell，Vol.73，pgs．303-319(1993))。ファイバー蛋白質とその受容体との間の高アフィニティ相互作用がないと、ウイルス結合及び形質導入は起こるが、その効率は低いものになる。このファイバーに関係しない結合及び形質導入は、ペプトン基と細胞インテグリンとの直接の会合によるものと考えられている(Haung，1996)。細胞への形質導入の最初の段階での、ファイバー蛋白質と細胞との間の相互作用は、アデノウイルスベクターによる形質導入の細胞特異性を調節する為に、魅力的なそして論理的に当然の目標である。ファイバー蛋白質の受容体結合ドメインは三量体である球状ヘッドドメイン内に存在することが示されている(Henry，et al.，J ．Virol.，Vol.68，pgs.5239-5246(1 994);Louis，et al.，J.Virol.，Vol．68，pgs.4104-4106(1994);Stevenson，19 95)。従って、ファイバーヘッドドメインとその受容体との相互作用は、アデノウイルスの結合特異性を決定するものである。その結果、ファイバーヘッドドメインを操作することは、アデノウイルスベクターによる形質導入の細胞特異性を調節することの可能性を示している。この考え方を実験によって確かめるために、グループＢとグループＣ血清型のアデノウイルスは異なった細胞受容体に結合するという事実を利用した(Defer， 1990;Mathias，et al.，J ．Virol.，Vol．68，pgs.6811-6814(1994);Stevenson ，1995)。アデノウイルス３及びアデノウイルス５ファイバー蛋白質のヘッドドメインを交換したキメラファイバー蛋白質を調製した。この組換えキメラファイバー蛋白質を用いた細胞結合及び競合に関する研究によって、受容体結合におけるファイバーヘッドドメインの役割が確認され、ヘッドドメインを交換することによってアデノウイルス３及びアデノウイルス５受容体の間で対応する受容体特異性の変化が見られた(Stevenson，1995)。本発明において、アデノウイルス３のファイバーヘッドドメインを含む、アデノウイルス５に基づくアデノウイルスベクターＡｖ９ＬａｃＺ４を構築した。このファイバー修飾ベクターは、β−ガラクトシダーゼ発現ベクターであるＡｖ１ＬａｃＺ４から出発して、遺伝子置換方法で得られた。アデノウイルス５／アデノウイルス３キメラファイバー遺伝子、５ＴＳ３Ｈ、を含むプラスミドカセットをＡｖ１ＬａｃＺ４ゲノムとの相同組換えに使用し、アデノウイルス５ファイバー遺伝子をアデノウイルス３のファイバーヘッドを有するキメラファイバー遺伝子と正確に置換してＡｖ９ＬａｃＺ４を作成した。プラーク精製に続いて、組換えベクターゲノムの分子分析により、該ベクター中のファイバー遺伝子の置換が確認された。アデノウイルス３ファイバーに特異的な抗血清を使用した、精製ベクター粒子のウェスタンブロット分析により、キメラ５ＴＳ３Ｈファイバー蛋白質の発現及び機能的ウイルス粒子への集合が確認された。Ａｖ９ＬａｃＺ４キメラファイバーベクターの受容体特異性の変化は、組換えファイバー蛋白質との競合反応によって確認され、２９３細胞の形質導入は可溶性アデノウイルス３ファイバーによって効率良くブロックされるが、アデノウイルス５では起こらなかった。このデータは、組換えファイバー蛋白質との結合試験から得られた以前の結果を確認し、元のアデノウイルス粒子に対する分析を発展させるものである。更に、Ａｖ９ＬａｃＺ４ベクターの変化した受容体特異性から、アデノウイルスベクターの指向性がヘッドドメインの操作によって変化させることが出来る、ということを実験的に確立した。キメラファイバーキメラベクターＡｖ９ＬａｃＺ４及び親アデノウイルス５のＡｖ１ＬａｃＺ４ベクターの力価、収率、及び感染粒子に対する物理的量の割合は類似しており、ファイバーヘッドの変更は２９３細胞に対するベクターの増殖特性を顕著に変えるものでなかったことを示している。アデノウイルス３の感染性はアデノウイルス５の感染性よりも著しく弱く、アデノウイルス３の粒子対ＰＦＵの割合はアデノウイルス５の約２０倍であることが報告されている(Defer， 1990)。Ａｖ９ＬａｃＺ４ベクターが親Ａｖ１ＬａｃＺ４ベクターと同様の感染性を有していることは、アデノウイルス５受容体又はアデノウイルス３受容体を介するアデノウイルス５に基づくベクターの侵入効率が類似していることを示している。このことは、アデノウイルス５及びアデノウイルス３の間に見られる感染性の差異は結合に異なる受容体を使用しているためではなく、これら二つの血清型におけるその他の差異を反映したものであることを示唆している。２９３細胞に対してＡｖ９ＬａｃＺ４ベクターとＡｖ１ＬａｃＺ４ベクターと同程度の感染性を有している事実から、核への遺伝子運搬及び発現に至るベクター粒子の侵入及び解離におけるその後の段階に悪影響を及ぼすことなく、アデノウイルスベクターの結合特異性を完全に変化させることが可能であるという重要な結論が導きだされる。この結果は、ファイバー受容体の機能は第一に効率的な細胞付着を促進すること、及び細胞への侵入はこの付着に使用される分子には必ずしも依存しない独立の事象であることを意味する。従って、ファイバー蛋白質を修飾して、異なる細胞へベクターが侵入する能力と妥協することなく、該細胞表面分子へのベクターの付着を促進させることが可能である。この結論は、偏在的に発現される細胞表面プロテオグリカンに結合するファイバー修飾アデノウイルスに関する最近の報告によって支持される(Wickman，et al.，Nature Biotechnology，Vol．14，pgs .1570-1573(1996))。従って、細胞特異的に発現された細胞受容体に対するリガンドを含むように修飾されたファイバー蛋白質を含むその他のアデノウイルスベクターを構築し、その結果、細胞選択的な形質導入をすることが可能である。ファイバー蛋白質と細胞ファイバー受容体との相互作用のアデノウイルス感染性に対する重要性は、可溶性ファイバー蛋白質によるこの感染の阻害が形質導入を有効に阻止するという事実（図３）によって強調される。更に、細胞ファイバー受容体の発現レベルが低いか又は欠いている細胞は充分に形質導入されず、遺伝子移入を達成するには高レベルのベクターを投入する必要がある(Haung，1996 )。嚢胞性肺繊維症の治療における最近のアデノウイルスベクターの臨床経験によって、アデノウイルス５に基づくベクターによる形質導入に対する、以前には予想されなかったようなヒト気道細胞(airway cells)の抵抗性が明らかにされてきた(Grub，et al.，Nature，Vol．371，pgs．802-806(1994)；Zabner，et al. ，J ．Virol.，Voo.70，pgs.6994-7003(1996))。αｖインテグリン及びファイバー付着受容体の両者の発現パターンがインビボでのヒト気道細胞の形質導入を制限しているものと言われている(Goldman，et al.，J ．V irol. ，Vol．69，pgs．5951-5958(1995):Zabner，1996)。ヒト肺上皮細胞上のα ｖインテグリンの発現とアデノウイルスベクターによる形質導入効率との関連の証拠がこの仮説を支持している(Goldman，1995)。初代ヒト細胞上のアデノウイルス５ファイバー付着受容体の分布は充分に解明されていない。これは主に、その同定が未だなされていないことに因る。しかしながら、多くのヒト細胞系及び多数の初代細胞は、アデノウイルス５ファイバー受容体の低レベル又は不存在により、アデノウイルス５に基づくベクターによる形質導入に抵抗性であることが益々明らかとなってきた。既に述べたように、アデノウイルス３ファイバー受容体も未だ同定されていないが、これは明らかにアデノウイルス５ファイバー受容体とは異なる。その結果、これら二つの受容体の発現パターンに差異があれば、これは、アデノウイルス３ファイバー受容体又はアデノウイルス５ファイバー受容体のいずれかに付着するベクターによる形質導入効率の差異に反映されるであろう。この仮説を支持すべく、アデノウイルス５ベクターであるＡｖ１ＬａｃＺ４によっては充分に形質導入されず、キメラファイバーであるＡｖ９ＬａｃＺ４によってより効率的に形質導入されるような、幾種類かのヒト細胞系が同定された。このような細胞としては、ヒト頭部及び首腫瘍系であるＦａＤｕ、ヒト肺上皮細胞系であるＭＲＣ−５、及びヒト単球細胞系であるＴＨＰ−１がある。Ｈｅｌａ細胞及びヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）の形質導入ではこれらの両ベクターは同程度の効率を有していた。対照的に、ヒト冠状動脈内皮細胞（ＨＣＡＥＣ）はＡｖ９ＬａｃＺ４よりもＡｖ１ＬａｃＺ４によってより効率的に形質導入された。これら二つのベクターの差異はファイバーヘッドドメインの特性のみにあるので、形質導入で観察された差異はファイバーに依存するものであり、二つのファイバー受容体の発現の差異の結果に違いない。以上の結果によって明らかにされた、アデノウイルス５及びアデノウイルス３に対する、ファイバー受容体の重複はするが異なっている細胞分布は、特異的なヒト標的細胞の形質導入のためのベクターを設計する為におそらくとりわけ価値のあるものとなるであろう。例えば、ＴＨＰ−１細胞系に関して得られた結果は、単球／マクロファージ系列に対する遺伝子移入はアデノウイルス５よりはアデノウイルス３受容体の指向性を有するベクターを用いる方がより効率的であることを示唆している。以前の研究によれば、ヒト造血細胞、単球、Ｔ−リンパ球、及びＴＨＰ−１細胞系は、アデノウイルス５ファイバー受容体の明らかな欠如の為にアデノウイルスベクターによる形質導入に対して抵抗性であり、非常に高投与量のアデノウイルス５投入によってのみ形質導入されるものとされていた(Haung，et a.，J ．Virol.，Vol.64，pgs.2257-2263(1995))。Ａｖ９ＬａｃＺ４ベクターによって単球が効率的に形質導入されることにより、血管壁病巣のマクロファージ細胞を標的とすることによる心臓血管疾患及びアテローム性動脈硬化症の治療の為の戦略を立てる際に、これが有用であることが示唆される。同様に、ＦａＤｕ細胞系に関するデータは、ある種の腫瘍細胞系はＡｖ１ＬａｃＺ４よりもＡｖ９ＬａｃＺ４によってより効率的に形質導入されることを示している。アデノウイルスベクターを修飾して形質導入を可能にしたり促進したりする可能性があるので、アデノウイルス介在遺伝子移入の効率を増加させることが出来る。本明細書に記載されたヘッド置換戦略のようなアデノウイルスファイバー蛋白質の修飾は、標的細胞の高度な選択的形質導入を可能成らしめるものである。他のファイバー蛋白質からのヘッドドメインは、異なるアデノウイルス血清型の指向性における天然の差異を利用して別のアデノウイルス受容体にベクターを向かわせるキメラファイバーを構築する為に使用することができる。新規なファイバー蛋白質は又、ファイバーヘッドドメインの他のトリマー蛋白質との置換、ペプチド配列のアデノウイルス５ファイバーＣ −末端への融合(Michael，et al.，Gene Ther.，Vol.2，pgs.660-668(1995))、又は、ファイバーヘッドドメインの露出したループ領域へのペプチドリガンドの付加(Xia，et l.，Structure，Vol.2，pgs．1259-1270(1994))によっても構築することが出来る。これらの戦略は、特異的細胞型に選択的にターゲットする、カスタマイズされたアデノウイルスベクターの開発に繋がるであろう。実施例２肺腫瘍細胞系の形質導入Ａ５４９肺腫瘍(ＡＴＣＣＮｏ.ＣＣＬ−１８５)、Ｈ２３肺腺癌(ＡＴＣＣＮｏ.ＣＲＬ−５８００)、Ｈ３５８肺胞細気管支腺癌(ＡＴＣＣＮｏ．ＣＲＬ −５８０７)、Ｈ４４１肺乳頭性腺癌(ＡＴＣＣＮｏ．ＨＴＢ−１７４)、及び，Ｈ４６０肺大細胞癌細胞系（ＡＴＣＣＮｏ．ＨＴＢ−１７７）を、実施例１に記載のように，細胞当たり１００又は１，０００個の粒子のＡｖ１ＬａｃＺ４又はＡｖ９ＬａｃＺ４で形質導入した。形質導入に関するデータは以下の表Ｉにまとめた。上記のデータは、アデノウイルス３ファイバーからのヘッド部分を有するアデノウイルスベクターが肺腫瘍細胞の形質導入、及び肺癌の治療に使用することが出来ることを示唆している。実施例３リンパ腫及び白血病細胞系の形質導入Ｕ９３７ヒト大食細胞リンパ腫細胞（ＡＴＣＣＮｏ．ＣＲＬ−１５９３）を、実施例１に記載のように，細胞当たり１００又は１，０００個の粒子のＡｖ１ＬａｃＺ４又はＡｖ９ＬａｃＺ４で形質導入した。各実験は三重に行い、形質導入細胞の平均パーセンテージを決定した。細胞当たり１００個のＡｖ１ＬａｃＺ４と接触させたＵ９３７では形質導入された細胞は観察されず、細胞当たり１，０００個の粒子のＡｖ１ＬａｃＺ４と接触させたＵ９３７では僅か０．１％の形質導入された細胞が観察された。対照的に、細胞当たり１００個の粒子のＡｖ９ＬａｃＺ４ではＵ９３７細胞に３．４％±１．０％の形質導入が見られ、又、１，０００個の粒子のＡｖ９ＬａｃＺ４ではＵ９３７細胞に９．２％±０．４％の形質導入が見られた。別の実験では、Ｋ５６２ヒト慢性骨髄性(chronic myelogenous)白血病細胞（ＡＴＣＣＣＣＬ２４３）を、実施例１に記載の方法に従い、感染多重度（Mult iplicity of infection:ＭＯＩ）１０，５０、又は１００のＡｖ１ＬａｃＺ４又はＡｖ９ＬａｃＺ４で形質導入した。形質導入したに関するデータは以下の表ＩＩにまとめた。別の実験では、ＫＧ１ヒト骨髄急性骨髄原発性白血病細胞（ＡＴＣＣＣＣＬ２４６）を、実施例１に記載の方法に従い、感染多重度（ＭＯＩ）１０，５０、１００、５００又は１，０００のＡｖ１ＬａｃＺ４又はＡｖ９ＬａｃＺ４で形質導入した。形質導入したに関するデータは以下の表ＩＩＩにまとめた。この実施例における各実験結果によると、アデノウイルス３ファイバーのヘッド部分を有するアデノウイルスベクターがリンパ腫又は白血病の治療に使用することが出来ることが示唆されている。実施例４ヒト平滑筋細胞系の形質導入ＨＩＳＭヒト空腸(intestinal jejunum)平滑筋細胞（ＡＴＣＣＮｏ．ＣＲＬ −１６９２）を、実施例１に記載のように，細胞当たり１０、１００又は１，０００個の粒子のＡｖ１ＬａｃＺ４又はＡｖ９ＬａｃＺ４で形質導入した。各実験は三重に行い、形質導入細胞のパーセンテージ（平均±標準偏差）を決定した。その結果を以下の表ＩＶに示した。この実施例における実験結果は、アデノウイルス３ファイバーのヘッド部分を有するアデノウイルスベクターが消化系又は血管の平滑筋のような平滑筋細胞の形質導入に使用することが出来、このようなアデノウイルスが例えば、血管病巣の再発狭窄症(restenosis)の治療のような各種疾患の治療に使用できることを示唆している。実施例５ヒト大動脈平滑筋細胞系の形質導入ヒト大動脈平滑筋細胞（Clonetics）を、実施例１に記載のように，細胞当たり１０、１００又は１，０００個の粒子のＡｖ１ＬａｃＺ４又はＡｖ９ＬａｃＺ４で形質導入した。各実験は三重に行い、形質導入細胞のパーセンテージ（平均 ±標準偏差）を決定した。その結果を以下の表Ｖに示した。この実施例における実験結果は、アデノウイルス３ファイバーのヘッド部分を有するアデノウイルスベクターが、血管形成(angioplasty)後の再発狭窄症(rest enosis)の治療において、治療用導入遺伝子を血管平滑筋細胞に運搬し平滑筋細胞の増殖を阻止する為に使用することができることを示唆している。実施例６ヒト大動脈平滑筋細胞を細胞当たり１０，０００個までの粒子のＡｖ１ＬａｃＺ４又はＡｖ９ＬａｃＺ４で形質導入する点以外は、実施例５の操作を繰り返した。形質導入細胞のパーセンテージ（平均±標準偏差）を決定した。その結果を以下の図７に示した。図７に示された実験結果は、細胞当たり１０，０００個までの粒子を使用することによって、Ａｖ１ＬａｃＺ４と比較してＡｖ９ＬａｃＺ４によるヒト大動脈平滑筋細胞の形質導入が顕著に改善されたことを示してる。実施例７ヒト、ブタ、及びラットの大動脈平滑筋細胞ヒト大動脈平滑筋細胞（ＨＡＳＭＣ）を細胞当たり１，０００個の粒子のＡｖ１ＬａｃＺ４又はＡｖ９ＬａｃＺ４で形質導入し、ブタ大動脈平滑筋細胞（ＰＡＳＭＣ）を細胞当たり１，０００個又は５，０００個の粒子のＡｖ１ＬａｃＺ４又はＡｖ９ＬａｃＺ４で形質導入し、そしてラット大動脈平滑筋細胞（ＲＡＳＭＣ）を細胞当たり１，０００個の粒子のＡｖ１ＬａｃＺ４又はＡｖ９ＬａｃＺ４で形質導入する点以外は、実施例５の操作を繰り返した。形質導入細胞のパーセンテージを決定した。その結果を以下の図８に示した。図８に示された実験結果は、ブタ大動脈平滑筋細胞はＡｖ１ＬａｃＺ４及びＡｖ９ＬａｃＺ４により同程度のパーセンテージが得られたので、ブタは、アデノウイルス３ファイバーのヘッド部分及び治療移入遺伝子を有するアデノウイルスベクターの投与による、再発狭窄症のような血管疾患の治療の研究用の動物モデルとして使用できることを示している。実施例８Ａｖ１ＬａｃＺ４及びＡｖ９ＬａｃＺ４アデノウイルスベクターを上記実施例１のようにして調製した。生物学的及び分光学的力価は、Mittereder，1996中に記載されているようにして測定した。２９３細胞の単層について求めた生物学的力価は、Ａｖ１ＬａｃＺ４及びＡｖ９ＬａｃＺ４につき、夫々プラーク形成ユニット２．６ｘ１０¹⁰及び４．５ｘ１０¹⁰ｐｆｕ／ｍｌであった。全粒子濃度は分光学的に求め、Ａｖ１ＬａｃＺ４及びＡｖ９ＬａｃＺ４につき、夫々１．４５ｘ１０¹²及び１．２５ｘ１０¹²粒子／ｍｌであり、全粒子数のｐｆｕに対する割合は、夫々、５５．８及び２７．８であった。細胞培養Ａｖ１ＬａｃＺ４及びＡｖ９ＬａｃＺ４の形質導入効率をヒト頭部及び首扁平上皮細胞腫瘍細胞系を用いて調査した。ＦａＤｕ(ヒト咽頭扁平癌：ＡＴＣＣＨＴＧ４３)、Ｈｅｐ−２(ヒト類表皮喉頭癌：ＡＴＣＣＣＣＬ−２３)、ＳＣＣ４(ヒト舌扁平細胞癌：ＡＴＣＣＣＲＬ−１６２４)，ＳＣＣ９(ヒト舌扁平細胞癌：ＡＴＣＣＣＲＬ−１６２９)、ＳＣＣ１５(ヒト舌扁平細胞癌：ＡＴＣＣＣＲＬ−１６２３)、及びＳＣＣ２５（ヒト舌扁平細胞癌：ＡＴＣＣＣＲＬ−１６２８）をＡＴＣＣから購入して、推薦培地中で培養した。ＪＳＱ−３細胞は、ヒト鼻前庭癌であり、Dr．Esther C hang，Georgetown University Medical Centerから頂いた。ＪＳＱ−３細胞も推薦培地中で培養した。アデノウイルスによる形質導入１２ウェル組織培養皿を使用して、細胞一個当たりの全粒子が０、１０、１０、１００、１，０００、２，０００、５，０００、又は１０，０００個のＡｖ１ＬａｃＺ４又はキメラファイバーＡｖ９ＬａｃＺ４アデノウイルスベクターにより、２％熱不活性化牛胎児血清（ＨＩＦＢＳ）を含む培地の全量０．２ｍｌ中で３７℃で１時間で各細胞系を形質導入した。ウイルス溶液を除去し、単層をＰＢＳで洗浄し、そして、１０％ＨＩＦＢＳを含む０．１ｍｌの完全培地を添加した。細胞を２４時間インキュベートして、β−ガラクトシダーゼを発現させた。細胞を固定し、染色し、パーセンテージ形質導入を既に記載したように光学顕微鏡で測定した(Stevenson，et al.，J ．Virology，Vol．71，pgs.4782-4790(1997)) 。簡潔に述べると、細胞の単層をＰＢＳ中の０．５％グルタルアルデヒドで固定し、１ｍｇ／ｍｌの５−ブロモ−４−クロロ−３−インドイル−β−Ｄ−ガラクトシド(Ｘ−ガル)、５ｍＭフェロシアナイドナトリウム、２ｍＭＭｇＣｌ₂を含むＰＢＳ０．５ｍｌ中でインキュベートした。細胞は、３７℃で約２４時間染色した。単層をＰＢＳで洗浄して、高倍率視野当りの青色細胞の平均数をＺｅｉｓｓＩＤ０３顕微鏡を使用する光学顕微鏡で計測し、１ウェル当り３から５の高倍率視野を計数した。各ウイルス濃度を３重に行った。各細胞系に対して、少なくとも３回の独立した実験を行った。結果以前に、ヒト細胞系ＦａＤｕ（ヒト咽頭扁平細胞癌）が、Ａｄ３受容体に対するキメラファイバー蛋白質を含有するＡｖ９ＬａｃＺ４ベクターにより効率的に形質導入されることが示されている(Stevenson，1997)。この初期の観察を拡大して、頭部及び首の腫瘍の治療に対するＡｖ９の利用可能性を探索すべく、キメラファイバーＡｖ９ＬａｃＺ４及び親Ａｖ１ＬａｃＺ４ベクターによる多数のヒトの頭部及び首腫瘍細胞系の形質導入特性が調査された。細胞はキメラファイバーＡｖ９ＬａｃＺ４又はＡｖ１ＬａｃＺ４アデノウイルスにより、全量０．２ｍｌの培地中で細胞一個当たり０から１０，０００個迄の粒子の割合で感染させた。感染２４時間後に、上記のようにＸ− ガルで細胞を染色した。図９は、細胞一個当たり１，０００個のウイルス粒子の投与量での、ヒト鼻前庭由来の頭部及び首系であるＪＳＱ−３単層のＡｖ１ＬａｃＺ４及びＡｖ９ＬａｃＺ４ベクターによる形質導入の代表的な写真(図９Ａ及び９Ｂ)、ヒト類表皮喉頭癌であるＨｅｐ−２単層のＡｖ１ＬａｃＺ４及びＡｖ９ＬａｃＺ４ベクターによる形質導入の代表的な写真(図９Ｃ及び９Ｄ)、及びヒト舌扁平細胞癌であるＳＣＣ９単層のＡｖ１ＬａｃＺ４及びＡｖ９ＬａｃＺ４ベクターによる形質導入の代表的な写真（図９Ｅ及び９Ｆ）である。これら全ての細胞系において、形質導入に差異が見られた。ＪＳＱ−３、Ｈｅｐ−２及びＳＣＣ９はこのウイルス投与量のＡｖ１ＬａｃＺ４による形質導入に対して比較的抵抗性であるが、Ａｖ９ＬａｃＺ４では効率的に形質導入された。これら三種類の各細胞系のパーセンテージ形質導入を、細胞一個当たり０から１０，０００個迄の各ウイルス粒子の投与について定量した。ウイルス投与の関数として、ＪＳＱ−３、Ｈｅｐ−２及びＳＣＣ９の形質導入細胞の割合をウイルス投与の関数として図１０に示した。ヒト鼻前庭由来の癌細胞であるＪＳＱ−３（図１０Ａ）はキメラファイバーＡｖ９ＬａｃＺ４ベクターにより用量依存的に効率的に形質導入され、細胞一個当たり１，０００個の粒子のベクター投与量で６２．４±２５．３パーセンテージ形質導入（平均±標準偏差(ｓｄ)）を達成した。対照的に、Ａｖ１ＬａｃＺ４では形質導入の効率は低く、同じ細胞一個当たり１，０００個の粒子のベクター投与量でわずか１４．６±６．５パーセンテージ形質導入しか観察されなかった。より高いベクター投与量である細胞一個当たり１０，０００個の粒子では細胞の数が減少するという注目すべき細胞毒性が観察された。ヒト類表皮喉頭癌細胞系であるＨｅｐ−２（図１０Ｂ）はキメラファイバーＡｖ９ＬａｃＺ４ベクターにより効率的に形質導入され、細胞一個当たり１，０００個の粒子のベクター投与量で９３±２．３パーセンテージ形質導入（平均±標準偏差(ｓｄ)）を達成した。Ａｖ１ＬａｃＺ４では形質導入の効率は低く、同じ細胞一個当たり１，０００個の粒子のベクター投与量でわずか２０．４±２．３パーセンテージ形質導入しか観察されなかった。ヒト舌扁平細胞癌細胞系であるＳＣＣ９でもＡｖ９ＬａｃＺ４ベクターにより効率的に形質導入され、細胞一個当たり１，０００個の粒子のベクター投与量で８０．７±６．９パーセンテージ形質導入であり、対照的に、Ａｖ１ＬａｃＺ４では同じ細胞一個当たり１，０００個の粒子のベクター投与量でわずか１３．９±２．１パーセンテージ形質導入しか観察されなかった。これらのデータは、以上の扁平細胞癌系はアデノウイルス５受容体を低レベルでしか発現しておらず、これと対照的に、アデノウイルス３受容体はこれら扁平細胞癌系において豊富に発現されていることを示唆するものである。以上の研究から、例えば、咽頭、喉頭、鼻前庭及び舌等の頭部及び首の異なる部位に由来する細胞は、アデノウイルス５受容体を介するよりも、アデノウイルス３受容体を介してより効率的に形質導入されることを示している。Ａｖ９ＬａｃＺ４はＡｖ１ＬａｃＺ４に較べてこのような細胞系を約４から６倍の効率で形質導入する。その他の多くのヒト頭部及び首扁平癌細胞系の形質導入能力をＡｖ９ＬａｃＺ４及びＡｖ１ＬａｃＺ４を用いて調査した。図１１には、細胞一個当たり１，０００個の粒子で検討した各細胞系に関するデータをまとめてある。使用したこれら追加の細胞系には、その他の舌由来であるヒト扁平癌細胞系であるＳＣＣ４、ＳＣＣ１５及びＳＣＣ２５も含まれていた。細胞は細胞一個当たり１，０００個の粒子のＡｖ９ＬａｃＺ４又はＡｖ１ＬａｃＺ４アデノウイルスベクターで感染させ、２４時間後に上記のようにＸ−ガルで染色した。このベクター投与量で形質導入された細胞の割合を測定した。この分析によって、検討した全ての細胞系はＡｖ９ＬａｃＺ４キメラファイバー及び野生型ファイバーを有するＡｖ１ＬａｃＺ４ベクターによる形質導入に差異が見られることが示された。ＦａＤｕ，ＪＳＱ−３，Ｈｅｐ−２，ＳＣＣ４，ＳＣＣ９，ＳＣＣ１５，及びＳＣＣ２５細胞系はＡｖ９ＬａｃＺ４キメラファイバーにより効率的に形質導入され、これは、アデノウイルス５受容体に較べてアデノウイルス３受容体がより多くこれら細胞型の上に存在することを意味している。議論以上の結果は、アデノウイルス３受容体にターゲットされたアデノウイルスベクターであるＡｖ９ＬａｃＺ４は、ヒト扁平細胞癌細胞系内に遺伝子を移入する際に、アデノウイルス５受容体と相互作用する親ベクターであるＡｖ１ＬａｃＺ４よりも、より効率的であることを示している。Ａｖ９ＬａｃＺ４により形質導入された細胞のパーセンテージは用量依存的であり、Ａｖ１ＬａｃＺ４に較べて約４乃至６倍高かった。更に、Ａｖ９は頭部及び首の様々な異なる起源を有する細胞を効率的に形質導入することが出来、頭部及び首の扁平細胞癌の治療のための新規な遺伝子治療の開発の為に、頭部及び首内の異なる部位内に遺伝子を移入するために、このベクターは有用であることを示唆するものである。本明細書において引用された、特許、刊行物(公開された特許出願を含む)、データベースアクセッション番号、及び寄託番号は全て、これらの各特許、刊行物(公開された特許出願を含む)、データベースアクセッション番号、及び寄託番号が具体的にかつ個別的に参照として含まれるのと同程度に、それらの内容全体が本明細書の中に参照として含まれる。しかしながら、本発明の範囲は上記の具体例に限定されるものではない。本発明は、上記に特定した以外の方法で実施することが出来、それらも以下に記載する特許請求の範囲である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者スティーブンソン・スーザン・シーアメリカ合衆国 21701 メリーランド州, フレデリック，ホースシュー・ドライブ, 10974番 (72)発明者ゴルジグリア・マリオアメリカ合衆国 20879 メリーランド州, ガイザースバーグ，ライオンズ・クレスト・ウェイ，8027番 (72)発明者バニン・エリオ・エフアメリカ合衆国 38118 テネシー州，メンフィス，セッションズ・コート，1258番

Claims

【特許請求の範囲】１．少なくとも一つのＤＮＡ配列を有する修飾アデノウイルスを細胞に形質導入することから成る、該少なくとも一つのＤＮＡ配列を該細胞内に移入する方法であって、該アデノウイルスは、修飾される前は第一の血清型であり、該修飾アデノウイルスにおいて、第一の血清型の該アデノウイルスのファイバーの少なくとも一部分が除去され、第二の血清型アデノウイルスのファイバーの少なくとも一部分と置換されており、該細胞は該第二の血清型アデノウイルスのファイバーの少なくとも一部分と結合する受容体を有しており、該少なくとも一つのＤＮＡ配列の該細胞内への移入が該修飾アデノウイルスの該細胞への結合を介して行われる、前記方法。２．アデノウイルスのファイバーがヘッド部分、シャフト部分、及びテール部分を有し、該第一の血清型の該アデノウイルスのファイバーのヘッド部分の少なくとも一部分が除去され、第二の血清型アデノウイルスのファイバーのヘッド部分の少なくとも一部分と置換されている、請求項１に記載の方法。３．該第一の血清型のアデノウイルスが亜属Ｃ内の血清型のアデノウイルスであり、該第二の血清型のアデノウイルスが亜属Ａ，Ｂ，Ｄ，Ｅ，及びＦから成る群から選択される亜属内の血清型のアデノウイルスである、請求項１に記載の方法。４．該第二の血清型のアデノウイルスが亜属Ｂ内の血清型のアデノウイルスである、請求項３に記載の方法。５．該第一の血清型のアデノウイルスがアデノウイルス５であり、該第二の血清型のアデノウイルスがアデノウイルス３である、請求項４に記載の方法。６．該細胞が肺細胞、造血細胞、リンパ腫細胞、白血病細胞、平滑筋細胞、及び腫瘍細胞から成る群から選択される、請求項１に記載の方法。７．該細胞にインビボで該修飾アデノウイルスが形質導入される、請求項１に記載の方法。８．該細胞が肺細胞である、請求項６に記載の方法。９．該細胞が造血細胞である、請求項６に記載の方法。１０．該細胞が腫瘍細胞である、請求項６に記載の方法。１１．該腫瘍細胞が頭部及び首の癌細胞である、請求項１０に記載の方法。１２．該腫瘍細胞が神経芽細胞腫である、請求項１０に記載の方法。１３．該細胞がリンパ腫細胞である、請求項６に記載の方法。１４．該細胞が白血病細胞である、請求項６に記載の方法。１５．該細胞が平滑筋細胞である、請求項６に記載の方法。１６．少なくとも一つのＤＮＡ配列を有する修飾アデノウイルスを細胞に形質導入することから成る、該少なくとも一つのＤＮＡ配列を該細胞内に移入する方法であって、該アデノウイルスは、修飾される前はアデノウイルス５血清型であり、該修飾アデノウイルスにおいて、アデノウイルス５のファイバーのヘッド部分が除去され、アデノウイルス３のファイバーのヘッド部分と置換されており、該細胞は該アデノウイルス３のファイバーのヘッド部分と結合する受容体を有しており、該少なくとも一つのＤＮＡ配列の該細胞内への移入が該修飾アデノウイルスの該細胞への結合を介して行われる、前記方法。１７．細胞に形質導入される少なくとも一つのＤＮＡ配列を有する修飾アデノウイルスであって、該アデノウイルスは、修飾される前はアデノウイルス５血清型であり、該修飾アデノウイルスにおいて、アデノウイルス５のファイバーのヘッド部分が除去され、アデノウイルス３のファイバーのヘッド部分と置換されている、前記修飾アデノウイルス。１８．請求項１７に記載の修飾アデノウイルス、及び薬学的に許容し得るキャリアを含む組成物。１９．細胞をアデノウイルス以外の遺伝子運搬ビークルと接触させることから成る、該細胞内へ少なくとも一つのポリヌクレオチドを移入させる方法であって、該遺伝子運搬ビークルは該少なくとも一つのポリヌクレオチドを含有し、該遺伝子運搬ビークルは所望の血清型のアデノウイルスのファイバーの少なくとも一部分を含み、該細胞は該所望の血清型のアデノウイルスのファイバーの少なくとも一部分に結合する受容体を有し、該少なくとも一つのポリヌクレオチドの該細胞内への移入が該遺伝子運搬ビークルの該細胞への結合を介して行われる、前記方法。２０．該遺伝子運搬ビークルは所望の血清型のアデノウイルスのファイバーのヘッド部分の少なくとも一部分を含む、請求項１９に記載の方法。２１．該遺伝子運搬ビークルはアデノウイルス３のファイバーのヘッド部分を含む、請求項２０に記載の方法。２２．所望の血清型のアデノウイルスのファイバーの少なくとも一部分を含むアデノウイルス以外の遺伝子運搬ビークル。２３．アデノウイルス３のファイバーのヘッド部分を含む、請求項２２に記載の遺伝子運搬ビークル。２４少なくとも一つの外来性ＤＮＡ配列を含む、アデノウイルス３血清型のアデノウイルス。２５．請求項２４に記載のアデノウイルス、及び薬学的に許容し得るキャリアを含む組成物。２６．請求項２４に記載のアデノウイルスを細胞に形質導入することから成る、少なくとも一つの外来性ＤＮＡ配列を該細胞内に移入する方法であって、該細胞はアデノウイルス３のファイバーと結合する受容体を有しており、該少なくとも一つの外来性ＤＮＡ配列の該細胞内への移入が該アデノウイルスの該細胞への結合を介して行われる、前記方法。２７．細胞を少なくとも一つのポリヌクレオチドを含有する遺伝子運搬ビークルと接触させることから成る、該細胞内へ少なくとも一つのポリヌクレオチドを移入させる方法であって、該遺伝子運搬ビークルはアデノウイルス３のファイバーの少なくとも一部分を含み、該細胞はアデノウイルス３のファイバーの少なくとも一部分に結合する受容体を有し、該少なくとも一つのポリヌクレオチドの該細胞内への移入が該遺伝子運搬ビークルの該細胞への結合を介して行われる、前記方法。