JP2001503250A - 束縛ペプチドモチーフを用いたターゲッティングアデノウイルス - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、立体配座的に拘束された様式で非天然アミノ酸配列を導入することによって、野生型コート蛋白質とは異なるキメラアデノウイルスファイバー蛋白質を提供する。そのような本発明のキメラアデノウイルスファイバー蛋白質は、該キメラアデノウイルスファイバー蛋白質ではなく野生型のアデノウイルスファイバー蛋白質を含んでいること以外は等しいベクターの細胞内への侵入よりもより効率的な、キメラファイバー蛋白質を含むベクターの細胞内への侵入を指示することができる。該非天然アミノ酸配列は、細胞ターゲッティングに使用することができる、抗体に対するエピトープあるいは細胞表面受容体に対するリガンドを含むペプチドモチーフをコードしている。本発明はまた、そのようなキメラアデノウイルスファイバー蛋白質を含むベクター、ならびに当該ベクターを用いた方法に関する。

Description

【発明の詳細な説明】 束縛ペプチドモチーフを用いたターゲッティングアデノウイルス 発明の技術分野 本発明は、束縛(constrained)非天然アミノ酸配列を含むキメラアデノウイル スファイバー蛋白質に関する。該非天然アミノ酸配列は、細胞ターゲッティング に使用することができる、抗体に対するエピトープあるいは細胞表面受容体に対 するリガンドを含むペプチドモチーフをコードする。本発明はまた、そのような キメラアデノウイルスファイバー蛋白質を含むベクターならびにそのようなベク ターの使用方法に関する。 発明の背景 多くの感染性疾患を引き起こす主要な病原性作用剤として以前は評判がよくな かったが、アデノウイルス（特に、複製欠損アデノウイルス）は、遺伝子治療に 極めて有効なウイルスベクターとして、ごく最近かなり認知されるようになって きている。アデノウイルスベクターは、それらの高い遺伝子導入効率、実質的な 運搬能力、および広範囲な細胞種への感染能力(Crystal，Science，270，404-41 0(1995)；Curielら，Human Gene Therapy，3，147-154(1992)；国際特許出願WO 95/21259)に基づき、この治療の新領域において非常に面白い可能性を提供する 。このようなアデノウイルスの望ましい特性のおかげで、組換えアデノウイルス ベクターは、治療を必要とする罹病細胞や組織への、１またはそれ以上の組換え 遺伝子の、細胞をターゲッティングした導入に使用されてきた。アデノウイルス の一般的構造に関しては、電子顕微鏡下では、アデノウイルス粒子は突出してい る触角を有する宇宙カプセルに似ている(Xiaら，Structure，2，1259-1270(1994 ))。ウイルスキャプシドは、２４０コピーの三量体ヘキソン（すなわちポリペプ チド1II）、およびそれぞれ１２コピーの５量体ペントン（ポリペプチドIII）ベ ースと三量体ファイバーを含め、少なくとも６つの異なるポリペプチドを含んで いる(Xiaら，上述)。 アデノウイルスは２つの別個の細胞受容体を使用するが、細胞に接着して感染 するためには、両方とも存在していなければならない(Wickhamら，Cell，73，30 9-319(1993))。まずアデノウイルスファイバー蛋白質が現在のところ同定されて いない受容体へ結合することによって、ウイルスを細胞に接着させる。次いでペ ントンベースが、細胞外マトリックス分子およびその他の分子への細胞の接着を 仲介するヘテロ二量体細胞表面受容体のファミリーであるα_Vインテグリンに結 合する(Hynes，Cell，69，11-25(1992))。一旦細胞に接着すると、アデノウイル スはクラスリン被覆エンドサイトーシス小胞への、受容体を介したインターナリ ゼーションを受け、段階的にウイルスの二本鎖ゲノムにまではがされ、そして該 ゲノム（および幾つかの付随のウイルス構成成分）が続いて細胞核へ輸送され、 そうして感染を開始する(Svennsonら，J ．Virol.，51，687-694(1984)；Chardon netら，Virology，40，462-477(1970)；Greberら，Cell，75，477-486(1993)；F itzgeraldら，Cell，32，607-617(1983))。 ファイバー単量体は、アミノ末端のテール（ペントンベースと非共有結合的に 接着する）、シャフト（その長さは異なるウイルスの血清型間で変化する）、お よびカルボキシ末端の球状ノブドメイン（宿主細胞結合に必要且つ十分）からな る(Devauxら，J ．Molec．Biol.，215，567-588(1990)；Xiaら，上述；Greenら，EMBO J. ，2，1357-1365(1983)；Henryら，J ．Virology，68(8)，5239-5246(1994 ))。また、ペントンベースとの結合に必要とされるファイバーの三量体化に必要 な領域は該蛋白質のノブ領域に位置している(Henryら(1994),上述;Novelliら，V irology ，185，365-376(1991))。該ファイバーはヘキソンとともにウイルスの血 清型特異性を決定し、またウイルスの主要な抗原決定基を有する(Watsonら，J ． Gen．Virol. ，69，525-535(1988))。 この、宿主の免疫応答のターゲットとして作用するアデノウイルスファイバー やヘキソン蛋白質の能力は、当初はアデノウイルスを介した遺伝子治療の試みを 妨げるものであった。すなわち、該ベクターが安定に維持されないが故に、アデ ノウイルスに仲介される遺伝子発現における変化は永久的なものではなかった。 しかしながら、治療上の応答を長続きさせるべくアデノウイルスベクターを反復 投与すると、結果としてアデノウイルスファイバーおよび／またはヘキソン蛋白 質に対して中和抗体が生 じ、そうして蛋白質生産を阻害し得る(Wohlfart，J ．Virology，62，2321-2328( 1988)；Wohlfartら，J ．Virology，56，896-903(1985))。幸いにもそのような免 疫応答は使用する全てのアデノウイルスベクターについて生じるわけではない。 同様に、そのような中和抗体の存在が、アデノウイルスが介在する細胞内送達を 妨げる場合には、例えば別の血清型のアデノウイルスベクター等の他のアデノウ イルスベクターをあるいは指向される抗体に対するエピトープを欠いた他のアデ ノウイルスベクターを代わりに使用できることが現在では知られている(Crompto nら，J.Gen ．Virol.，75，133-139(1994))。さらに、ウイルスに対する抗体応答 によって効果的なアデノウイルスベクターの反復投与が阻まれることのないよう に、絶えずより新しく、また効果的な技術が出現してくる(例えば国際特許出願W O 96/12406;Mastrangeliら，Human Gene Therapy，7，79-87(1996)参照)。 従って、アデノウイルスを介する遺伝子治療は依然前途多望であり、特にアデ ノウイルス指向性の方向換え（redirecting）に有望である。すなわち、例え非 常に多様な細胞種にアデノウイルスが侵入することができたとしても(例えばRos enfeldら，Cell，68，143-155(1992)；Quantinら，Proc ．Natl．Acad．Sci.，89 ，2581-2584(1992))；Lemarchandら，Proc ．Natl．Acad．Sci.，89，6482-6486( 1992)；Antonら，J ．Virol.，69，4600-4606(1995)；LaSalleら，Science，259 ，988-990(1993)参照)、まだ容易にはアデノウイルスが介する遺伝子送達に従順 でない細胞（例えばリンパ球）もあるようである(例えばGrubbら，Nature，371 ，802-806(1994)；Dupuitら，Human Gene Therapy，6，1185-1193(1995)；Silve rら，Virology 165，377-387(1988)；Horvathら，J ．Virol.，62(1)，341-345(1 988)参照)。同様にアデノウイルスによって容易に感染する細胞へターゲッティ ングする場合でさえ、多くの場合、形質導入を成功させるためには、極めて高レ ベルのアデノウイルス粒子が用いられている。そのような高レベルではアデノウ イルス感染に伴ういかなる免疫応答も悪化を余儀なくされるだろうから、このこ とは欠点である。 従って、研究者らは、アデノウイルスに感染させることができない細胞へアデ ノウイルスを選択的に導入するための、そしてアデノウイルスに感染する細胞へ のアデノ ウイルス送達の有効性を増大するための新しい方法を探索している。アデノウイ ルス指向性の方向換えの一般原則は直接的であるということである。一般的なア プローチでは、ペプチド結合モチーフをファイバー蛋白質のようなアデノウイル スコート蛋白質に組み込むことによって、通常では結合することのない細胞表面 結合部位に結合するようにウイルスの指向性を変えることができる(例えばMicha elら，Gene Therapy，2，660-668(1995)；国際特許出願WO 95/26412;国際特許出 願WO 94/10323;国際特許出願WO 95/05201参照)。ペプチド結合モチーフは、細胞 ターゲッティングに使用することができる、抗体（例えば二重特異性抗体）に対 するエピトープあるいは細胞表面結合部位（例えば受容体）に対するリガンド等 の短いアミノ酸配列である。例えば、該ペプチドモチーフが対応する細胞表面結 合部位（通常アデノウイルスが結合しないかあるいは低い親和性でしか結合しな い）に結合すると、該ペプチドモチーフを担持しているアデノウイルスは、この 結合部位を有する細胞に特異的および／またはより効率的に遺伝子を選択的に送 達することができる。 しかしながらアデノウイルスのファイバー蛋白質へ既知のペプチドモチーフを 単に組み込んだだけでは、ウイルスが標的細胞へ結合し、効果的に形質導入する には十分でないこともある。新たな細胞表面結合部位へのウイルス結合の方向換 えにおける該ペプチドモチーフの有効性は、細胞表面受容体へ結合するペプチド モチーフの入手可能性、該細胞表面結合部位に対する該ペプチドモチーフの親和 性、および遺伝子送達の標的となった細胞上に存在する標的結合部位（例えば受 容体）の数、を含む、多くの要因に依る。最後の要因は、今のところインビボの 適用の際は操作することはできないが、前者２つについては、広く行なわれてい るアデノウイルスが介在する遺伝子治療の改良の余地があるように思われる。例 えば、初期の研究者らは、ペプチドモチーフがファイバー蛋白質の構造内に埋没 および／または該蛋白質の周囲の構造によって覆われている場合、該ペプチドモ チーフはその標的と相互作用し、結合することができないであろうということを 考慮していなかった。同様に、以前の研究者らは、結果として細胞感染／形質導 入をもたらす標的受容体との接触結合をどのくらいの効率でウイルスが開始し、 且つ維持することができるかを決定するのがペプチドモ チーフの細胞表面結合部位（例えば受容体）との親和性であるということに取り 組んでこなかった。 従って、細胞ターゲッティングの改良法およびそれを遂行し得るアデノウイル スベクターが依然必要である。本発明は、組換えアデノウイルス遺伝子治療にお ける上述の問題点の少なくともいくつかを克服することを目的とする。特に、本 発明の目的は、束縛ペプチドモチーフを含むキメラアデノウイルスファイバー蛋 白質の提供によって、細胞ターゲッティングの為の改良ベクターおよび改良方法 を提供することである。本発明のこれらのおよび他の目的および利点、ならびに さらなる本発明の特徴は以下の詳細な説明から明らかになるであろう。 発明の簡単な要約 本発明は、立体配座的に拘束される（conformationally-restrained）（すな わち束縛される（constrained））様にして非天然アミノ酸配列を導入すること によって、野生型（すなわち天然）ファイバー蛋白質とは異なるキメラアデノウ イルスファイバー蛋白質を提供する。該導入により、束縛ペプチドモチーフが結 果的に挿入あるいは作出される。当該束縛ペプチドモチーフは、キメラファイバ ー蛋白質を含むベクターの細胞への侵入を指示する能力（該侵入は、野生型アデ ノウイルスファイバー蛋白質を含んでいるという点を除いては等しいベクターの 細胞への侵入よりもより能率的である）および／または野生型ファイバー蛋白質 を含むアデノウイルスが通常感染／形質導入しない細胞内への侵入を指示する能 力を、結果的に得られるキメラアデノウイルスファイバー蛋白質に付与する。本 発明はまた、該キメラアデノウイルスファイバー蛋白質を含むベクター、および そのようなベクターを構築する方法ならびに使用する方法に関する。 図面の簡単な説明 図１は、ペプチド結合モチーフを含むべくファイバーノブの露出ループ内に非 天然アミノ酸配列を立体配座的に拘束させることにより、アデノウイルスをター ゲッティングする本発明の方法を示す模式図である。 図２は、ペプチド結合モチーフを含むべくファイバー蛋白質のＣ末端に立体配 座的に拘束された非天然アミノ酸配列（すなわち元来存在しないループを含む配 列）を組み入れることにより、アデノウイルスをターゲッティングする本発明の 方法を示す模式図である。 図３は、アデノウイルスファイバーキメラを構築するために使用されるプラス ミドｐ１９３（Ｆ５*）を描写する模式図である。 図４は、キメラファイバー蛋白質をコードするプラスミドｐ１９３ Ｆ５Ｆ２ Ｋを描写する模式図である。 図５は、Ａｄ２ファイバーノブの露出ＨＩループ内にヘパリン結合ドメイン（ すなわちＲＫＫＫＲＫＫＫ、つまりArg Lys Lys Lys Arg Lys Lys Lys［配列番 号１］）を含むキメラアデノウイルスファイバー蛋白質をコードするプラスミド ｐ１９３ Ｆ５Ｆ２Ｋ（ＲＫＫＫ２）を描写する模式図である。 図６は、Ａｄ２ファイバーノブの露出ＨＩループ内にＦＬＡＧエピトープ（す なわちＤＹＫＤＤＤＤＫ、つまりAsp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys［配列番号 ２］）を含むキメラアデノウイルスファイバー蛋白質をコードするプラスミドｐ １９３ Ｆ５Ｆ２Ｋ（ＦＬＡＧ）を描写する模式図である。 図７は、可溶性ファイバー蛋白質非存在下（コントロール）または存在下（フ ァイバー）で、ＡｄＺ．Ｆ５Ｆ２Ｋ（ＲＫＫＫ２）（塗りつぶした棒）あるいは ＡｄＺ（塗りつぶしていない棒）のどちらか一方で形質導入した２９３細胞にお ける、β−ガラクトシダーゼ発現（コントロールに対する％）を描写する棒グラ フである。 図８は、アデノウイルスベクターＡｄＺ．ＲＧＤを創製するために使用した導 入プラスミドｐ１９３（Ｆ５）ＲＧＤを描写している。 図９は、アデノウイルスベクターＡｄＺ．ｐＬＤＶを創製するために使用した 導入プラスミドｐ１９３（Ｆ５）ｐＬＤＶを描写している。 図１０は、アデノウイルスベクターＡｄＺ．ｐＹＩＧＳＲを創製するために使 用した導入プラスミドｐ１９３（Ｆ５）ｐＹＩＧＳＲを描写している。 図１１は、ＡｄＺ（白丸）あるいはＡｄＺ．ＲＧＤ（黒四角）で感染させた２ ９３細胞の、ＦＦＵ／細胞対感染後の日数のグラフである。 図１２は、ＡｄＺ（黒丸）あるいはＡｄＺ．ＲＧＤ（黒三角）で感染させたＡ ５４９細胞の、β−ガラクトシダーゼ発現（ＲＬＵ／０．３μｌ／７分）対添加 したウイルス粒子（６ｃｍプレートあたり）のグラフである。 図１３は、ＡｄＺ（黒丸）あるいはＡｄＺ．ＲＧＤ（黒三角）で感染させたＣ ＰＡＥ細胞の、β−ガラクトシダーゼ発現（ＲＬＵ／０．３μｌ／７分）対添加 したウイルス粒子（６ｃｍプレートあたり）のグラフである。 図１４は、ＡｄＺ（黒丸）あるいはＡｄＺ．ＲＧＤ（黒三角）で感染させたＨ ＩＳＭ細胞の、β−ガラクトシダーゼ発現（ＲＬＵ／０．３μｌ／７分）対添加 したウイルス粒子（６ｃｍプレートあたり）のグラフである。 図１５は、８３５腎細胞における、競合するファイバー蛋白質の存在下（Ｆ５ ）、ペントンベース蛋白質の存在下（ＰＢ）、あるいは非存在下（コントロール ）、あるいはファイバーおよびペントンベース蛋白質の両方の存在下（Ｆ５／Ｐ Ｂ）での、ＡｄＺ．ＲＧＤ（塗りつぶした棒）およびＡｄＺ（塗りつぶしていな い捧）の結合を描写する棒グラフである。該結合は細胞に結合したベクターの、 投入量に対する％で表した。 図１６は、Ａ１０平滑筋細胞における、競合するファイバー蛋白質の存在下（ Ｆ５）、ペントンベース蛋白質の存在下（ＰＢ）、あるいは非存在下（コントロ ール）、あるいはファイバーおよびペントンベース蛋白質の両方の存在下（Ｆ５ ／ＰＢ）での、ＡｄＺ．ＲＧＤ（塗りつぶした棒）およびＡｄＺ（塗りつぶして いない棒）の結合を描写する棒グラフである。該結合は細胞に結合したベクター の、投入量に対する％で表した。 図１７は、ＣＰＡＥ内皮細胞における、競合するファイバー蛋白質の存在下（ Ｆ５）、ペントンベース蛋白質の存在下（ＰＢ）、あるいは非存在下（コントロ ール）、あるいはファイバーおよびペントンベース蛋白質の両方の存在下（Ｆ５ ／ＰＢ）での、ＡｄＺ．ＲＧＤ（塗りつぶした棒）およびＡｄＺ（塗りつぶして いない棒）の結合を 描写する棒グラフである。該結合は細胞に結合したベクターの、投入量に対する ％で表した。 図１８は、可溶性ファイバー蛋白質の非存在下（コントロール）または存在下 （ファイバー）での、ＡｄＺ．ｐＹＩＧＳＲ（塗ってある棒）あるいはＡｄＺ（ 塗っていない棒）で形質導入したＡ５４９細胞におけるβ−ガラクトシダーゼ発 現（コントロールに対する％）を描写する棒グラフである。 図１９は、可溶性ファイバー蛋白質の非存在下（コントロール）または存在下 （ファイバー）、あるいはファイバー蛋白質とＥＤＴＡの存在下（ファイバー＋ ＥＤＴＡ）での、ＡｄＺ．ｐＬＤＶ（塗りつぶした棒）あるいはＡｄＺ（塗りつ ぶしていない棒）で形質導入したラモス細胞におけるβ−ガラクトシダーゼ発現 （コントロールに対する％）を描写する棒グラフである。 図２０は、可溶性ファイバー蛋白質の非存在下（コントロール）または存在下 （ファイバー）での、ＡｄＺ．ＲＧＤ（塗りつぶした棒）、ＡｄＺ．ｐＲＧＤ（ 点刻された(stippled)棒）、あるいはＡｄＺ（塗りつぶしていない棒）で形質導 入した２９３細胞におけるβ−ガラクトシダーゼ発現（コントロールに対する％ ）を描写する棒グラフである。 発明の詳細な説明 本発明は、特に、キメラファイバー蛋白質を含む組換えアデノウイルスを提供 する。該キメラファイバー蛋白質は天然アミノ酸配列に加え、あるいはそれに代 えて束縛非天然アミノ酸配列を含む。この非天然アミノ酸配列が、キメラファイ バー（あるいは該キメラファイバーを含むベクター）がより能率良く細胞に結合 し、侵入することを可能にする。キメラアデノウイルスファイバー蛋白質 本発明の「ファイバー蛋白質」は、好ましくはアデノウイルスファイバー蛋白 質を含む。いかなる血清型のヒトあるいは非ヒトアデノウイルス（キメラファイ バー蛋白 質を含むベクターに関連して後述されている）もファイバー蛋白質あるいはファ イバー遺伝子の供給源として使用し得る。しかしながら、最適には、該アデノウ イルスはＡｄ２またはＡｄ５アデノウイルスである。 該ファイバー蛋白質は、野生型アデノウイルスから単離されるような蛋白質（ すなわち天然蛋白質、つまり野生型蛋白質を含む）内には通常見られないアミノ 酸残基を含むという点で「キメラ」である。つまり該ファイバー蛋白質は「非天 然アミノ酸配列」を含む。「非天然アミノ酸配列」とは、任意の適当な長さ、好 ましくは約３ないし約２００のアミノ酸、最適には約３ないし約３０のアミノ酸 の配列を意味する。該非天然アミノ酸配列は遺伝子発現のレベルでファイバー蛋 白質に導入されている（すなわち「非天然アミノ酸配列をコードする核酸配列」 の導入によって）ことが望ましい。そのような非天然アミノ酸配列は、アデノウ イルス配列に代えて、あるいはアデノウイルス配列に加えて導入される。導入の 種類にかかわらず、ＤＮＡあるいは蛋白質レベルでの非天然アミノ酸配列のアデ ノウイルスファイバー蛋白質への組み込みにより、結果として得られるキメラフ ァイバー蛋白質内にペプチドモチーフ（すなわちペプチド結合モチーフ）が生じ る。 例えば、抗体に対するエピトープあるいは細胞表面結合部位に対するリガンド を含むことで、該ペプチドモチーフは細胞ターゲッティングを可能とする。該ペ プチドモチーフは、任意に細胞ターゲッティングに使用される他の要素（例えば 一本鎖抗体配列）を含み得る。該ペプチド結合モチーフは挿入によって調製され てもよく、また例えば天然配列と非天然配列を含んでいても良いし、あるいは全 て非天然配列から作り上げられていてもよい。非天然アミノ酸配列をキメラファ イバー蛋白質内に挿入することにより得られるペプチドモチーフは、高親和性ペ プチド（すなわち比較的低濃度で供された場合にそのコグネイト結合部位に結合 するもの）であり得るか、あるいは低親和性ペプチド（すなわち比較的高濃度で 供された場合にそのコグネイト結合部位に結合するもの）であり得る。しかしな がら、結果として得られるペプチドモチーフは高親和性モチーフであることが好 ましく、アデノウイルスファイバー蛋白質内でそ れが束縛されることによりそのコグネイト結合部位と高親和性を有するようにな ったものが特に好ましい。 「抗体」としては、イムノグロブリン分子およびパラトープ（すなわち抗原結 合部位）を含有する部分のようなイムノグロブリン分子の免疫学的に活性のある 部分が挙げられるが、それに限定されない。特に、抗体は、好ましくは二重特異 性抗体（すなわちキメラファイバー蛋白質のエピトープに指向されるひとつのパ ラトープと、細胞表面結合部位のエピトープに指向される別のパラトープを有し ている）であり得る。 「細胞結合部位」は、受容体（好ましくは蛋白質、炭水化物、糖蛋白質あるい はプロテオグリカン）および任意の反対に荷電した分子（すなわちキメラコート 蛋白質に対して反対に荷電している）あるいはキメラコート蛋白質が細胞へ結合 するために相互作用することができ、それによって細胞への侵入を促進するよう な他種の分子を包含する。可能性のある細胞表面結合部位として、グリコサミノ グリカン類に見られるヘパリンおよびコンドロイチン硫酸部分；ムチン類、糖蛋 白質、およびガングリオシド類に見られるシアル酸部分、主要組織適合遺伝子複 合体Ｉ（ＭＨＣ Ｉ）糖蛋白質類；マンノース、Ｎ−アセチル−ガラクトサミン 、Ｎ−アセチル−グルコサミン、フコース、ガラクトースを含む、膜糖蛋白質類 に共通して見られる炭水化物構成成分等が例示されるが、それらに限定されない 。しかしながら本発明のキメラファイバー蛋白質およびその使用方法はいかなる 特定の細胞相互作用（すなわち特定の細胞表面結合部位との相互作用）の機構に も限定されるものでなく、またそのように解釈されるものでもない。 本発明のキメラアデノウイルスファイバー蛋白質を含むベクターに比べると野 生型アデノウイルスファイバー蛋白質を含有するベクターの侵入効率が減じられ るのに反映されるように、本発明の細胞表面結合部位は、好ましくは以前には野 生型アデノウイルスファイバー蛋白質と相互作用すべく接近できないか、あるい は極めて低レベルでしか接近できなかったものである。つまり、非天然アミノ酸 配列のキメラファイバー蛋白質への挿入は、望ましくは野生型ファイバー蛋白質 が結合しないかあるいは極めて低い親和性で結合する、細胞表面上に存在する結 合部位に結合する能力を該 キメラファイバー蛋白質に付与するものである。このことが、キメラアデノウイ ルスファイバー蛋白質が非天然アミノ酸配列とファイバー受容体以外の細胞受容 体との相互作用（直接的あるいは間接的のどちらでも）を介したベクターの細胞 内への侵入を指示し得る状況を結果として生じることが好ましい。 また、このことが、キメラアデノウイルスファイバー蛋白質が、キメラアデノ ウイルスファイバーを含むベクターの、キメラアデノウイルス蛋白質ではなく野 生型アデノウイルスファイバー蛋白質を含むこと以外は等しいベクターの細胞内 への侵入よりもより能率的な細胞内への侵入を指示することができる状況を結果 として生じることが好ましい。また好ましくは、該キメラアデノウイルスファイ バー蛋白質は、例えばファイバー蛋白質の特異性の変更によってターゲッティン グの特異性を増大させるように作用してもよい。 「侵入効率」はいくつかの手段で定量し得る。特に、侵入効率は、キメラファ イバー蛋白質をベクター、好ましくはウイルスベクター内に導入し、感染多重度 （ＭＯＩ）の関数として細胞侵入をモニタリング（例えば、リポーター遺伝子の ような遺伝子の細胞へのベクター介在性の送達によって）することにより定量し 得る。この場合、当該キメラアデノウイルスファイバー蛋白質ではなく野生型ア デノウイルスファイバー蛋白質を含んでいること以外は等しいベクターに比べ、 キメラアデノウイルスファイバー蛋白質を含むベクターの細胞への侵入に必要と されるＭＯＩが低減していることが「より効率的な」侵入であることを示してい る。 同様に、キメラあるいは野生型ファイバー蛋白質を含むベクター、あるいは可 溶性キメラあるいは野生型ファイバー蛋白質それら自身の細胞への結合能力に換 算して侵入効率を定量することもできる。この場合、かわりに野生型ファイバー 蛋白質を含有する等しいベクターあるいは野生型ファイバーそれ自身と比べ、キ メラアデノウイルスファイバー蛋白質を含むベクターあるいはキメラアデノウイ ルスファイバー蛋白質そのものでは結合が増加しているということが、侵入効率 の増大あるいは「より効率的な」侵入を示している。 本発明によれば、非天然アミノ酸配列は立体配座的に拘束され、すなわち「束 縛され」ている。非天然アミノ酸配列は、キメラファイバー蛋白質内に存在し、 細胞へ結合する、および／または細胞への侵入を仲介する能力が増大する（例え ば野生型蛋白質と比べて）ような様式で細胞に呈示されている時、束縛されてい る。本発明のそのような束縛は、キメラファイバー蛋白質の露出ループ内に非天 然アミノ酸配列を設けることによって、あるいは別の部位に該配列を設け、その 部位に非天然アミノ酸配列を含むループ様構造を作り出すことによって達成され 得る。 アデノウイルスが介在する特定の組織への遺伝子送達（すなわち細胞ターゲッ ティング）は、概して、標的受容体へのアデノウイルスの結合を介在する際に、 より低親和性の束縛されていないペプチドが束縛されたペプチドに比べて有効で ないことが多いという事実によって阻まれてきた。例えば、ファージディスプレ イによって同定される、または一般に同定されるペプチドモチーフは束縛された 環境で提示されている。従って、本出願はアデノウイルスをターゲッティングす る手段を提供する。その一態様では、該ペプチドモチーフはアデノウイルスファ イバー蛋白質のノブのループドメインの束縛された環境内で提示されている。 露出したファイバーノブループの全ての残基が、ファイバー蛋白質の構築ある いは機能化に重要なわけではなく、従ってペプチドモチーフを挿入し得る都合の よい部位を提供するので、本方法は有利である。本方法はさらに、蛋白質構造の ループ内へ付加することにより、蛋白質の末端に付加するよりも加水分解的蛋白 質分解に対してより耐性になるであろうという点で有利である。さらに、特に低 親和性のペプチドモチーフにとって、本方法は、ペプチドモチーフがファイバー のノブのＣ末端で束縛されていない線状構造として呈示される方法よりもより効 果的である。多分、本発明の「束縛」は、該分子をその受容体と協調関係に有る 位相構造内に置くので親和性を増大させ、このようにして結合を容易にする。し かしながら、本明細書はいかなる特定の作用機作に限定されるものではなく、ま たそのように解釈されるものでもない。 本発明において使用することができるファイバーノブのループドメインに関し ては、ファイバーノブの結晶構造が記載されている(例えばXiaら，上述，特に図 ４、 参照)。ノブ単量体は８本鎖のアンチパラレルなβ−サンドイッチ折り畳み構造 を有する。ファイバーノブ三量体の全体構造は、翼面を含む３つの単量体の各々 に一定のβ鎖を有する３翼のプロペラに似ている。特に、以下のＡｄ５ファイバ ーノブ残基がβサンドイッチモチーフにおける水素結合に重要であると思われる :４００−４０２、４１９−４２８、４３１−４４０、４５４−４６１、４７９ −４８２、４８５−４８６、５１６−５２１、５２９−５３６、５５０−５５７ 、および５７３−５７８。該蛋白質の残りの残基（ファイバー蛋白質の二次構造 の形成に重要であるとは思われない）が蛋白質ノブドメインの露出ループを定義 している。特に４０３−４１８を含めた残基はＡＢループを構成し、４４１−４ ５３を含めた残基はＣＤループを構成し、４８７−５１４を含めた残基はＤＧル ープを構成し、５２２−５２８を含めた残基はＧＨループを構成し、５３７−５ ４９を含めた残基はＨＩループを構成し、５５８−５７２を含めた残基はＩＪル ープを構成する。 本発明によれば「ループ」とは、包括的な定義では、細胞ターゲッティングを 可能にするペプチドモチーフを含むべく非天然アミノ酸配列で置換し得るアミノ 酸残基の範囲（すなわち２以上、好ましくは２００未満、より好ましくは３０未 満）を意味する。Ａｄ５配列に関してはそのようなループは本明細書中に定義さ れるが、他のファイバー種の配列のアラインメント(alignment)は記載されてい る（例えばXiaら，上述参照）。これらの他種（特にXiaら,上述に記載されてい るＡｄ２、Ａｄ３、Ａｄ７、Ａｄ４０およびＡｄ４１）について、ノブドメイン の対応ループ領域は同等と思われる。 さらに、蛋白質結合／フォールディングに重要なファイバーノブ内の対応残基 は、異なるアデノウイルス血清型のファイバー蛋白質間で保存されていると思わ れる（Xiaら，上述）。このことは、ファイバー蛋白質の結晶構造が未知のアデ ノウイルス種についてさえ、これらの保存された残基の外部に、非保存領域、す なわち蛋白質の機能性に重要な残基に観察される高レベルな保存性を示さない領 域が存在するであろうことを示唆している。該蛋白質のこの領域では重要な分子 内相互作用が存在しないので、これら非保存領域におけるファイバーノブ蛋白質 の配列も恐らくループと して存在するであろう。細胞ターゲッティングを可能にするペプチドモチーフを 組み込むことによって、これらの非保存領域を含むループ配列を、本明細書に記 載されているのと同様に変異させることができる。これらのいわゆる非保存配列 は、恐らく、該保存領域の外部に存在する任意のアミノ酸を含む（すなわち、Ａ ｄ５残基４００−４０２、４１９−４２８、４３１−４４０、４５４−４６１、 ４７９−４８２、４８５−４８６、５１６−５２１、５２９−５３６、５５０− ５５７および５７３−５７８に対応する残基を含まない残基）。 より一般的には、該非保存領域は、通常蛋白質内部に観察される疎水性残基を 含むであろう。そのような疎水性残基としては、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｔｒ ｐ、ＣｙｓおよびＰｈｅが挙げられるが、それらに限定されない。対照的に、該 保存領域は、通常、荷電した残基（例えばＡｒｇ、Ｌｙｓ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ等） あるいは極性のある残基または水酸基を含む残基（例えばＴｈｒ、Ｓｅｒ、Ａｓ ｎ、Ｇｌｎ等）のような親水性残基を含むであろう。このことは、ファイバー蛋 白質の露出されたアミノ酸と埋没されたアミノ酸のおおざっぱな概算がその疎水 性／親水性プロットに基づいて導き出し得ることを意味している。 すなわち本発明は、好ましくは束縛非天然アミノ酸配列を含むキメラアデノウ イルスファイバー蛋白質を提供する。好ましくは、該非天然アミノ酸配列は該キ メラファイバー蛋白質のノブのループ内に存在することによって束縛されている 。特に望ましくは、該非天然アミノ酸配列が該キメラアデノウイルスファイバー 蛋白質のノブのループ内で、蛋白質配列内にあるいはそれに代えて挿入されてい る。最適には、該ファイバー蛋白質ループはＡＢ、ＣＤ、ＤＧ、ＧＨおよびＩＪ ループからなる群より選択されるものであって、望ましくはＨＩループである。 また、該ループは、Ａｄ５残基４００−４０２、４１９−４２８、４３１−４４ ０、４５４−４６１、４７９−４８２、４８５−４８６、５１６−５２１、５２ ９−５３６、５５０−５５７および５７３−５７８以外のファイバーノブ内のア ミノ酸残基を含んでいることが好ましい。望ましくは、該ループは、残基４０３ −４１８、４４１−４５３、４８７−５１４、５ ２２−５２８、５３７−５４９および５５８−５７２からなる群より選択される アミノ酸残基を含む。 特に好ましくは、ループ内に存在する非天然アミノ酸配列は、配列番号１、配 列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号１７、配列番号１９ 、配列番号２３、配列番号３１、配列番号３５、配列番号３９、配列番号４３、 配列番号４９、配列番号５３、配列番号５６、配列番号５９、および配列番号６ ３、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８、配列番号７９からなる群より 選択される配列（ここで該配列はＣ−あるいはＮ−末端のどちらか一方で１，２ または３残基が欠失していてもよい）を含む。また、望ましくは、該非天然アミ ノ酸配列は、さらに本明細書に記載されるように、これらの配列の保存的アミノ 酸置換を含み得る。最適には、これらの配列は、例えば図４、図５、図６、図８ 、図９および図１０に記載されているようにキメラ蛋白質内に存在し得る。 本発明はまた、該ペプチドモチーフがファイバーノブ領域内でファイバー蛋白 質のＣ末端で束縛された環境で提示されている、アデノウイルスをターゲッティ ングする手段を提供する。この方法は、システイン残基間での結合によって、あ るいはループ（例えばβ−シート）を形成することが可能な他の配列を用いるこ とによって、ループ（すなわち「元来存在しないループ」）を生み出し、それに よって該ペプチドモチーフが挿入された蛋白質ドメイン内にループ様の二次構造 を作り上げる。本発明によれば、通常、付加された該非天然アミノ酸配列自身が ループ様構造を形成するであろう（例えば、インビボで生じるシステイン残基間 のジスルフィド結合によって）。しかしながら、該ループは、例えば非天然アミ ノ酸配列内に存在しているシステイン残基と、野生型ファイバー蛋白質内に存在 しているシステイン残基との間の結合によって形成されるかもしれない。この点 で、該配列がループ構造をとることは、生来のものではなく潜在的なものである 。 特に、本発明のキメラアデノウイルスファイバー蛋白質は、束縛された、好ま しくはＲＧＤペプチド（あるいは本明細書に記載されるＬＤＶのような他の同様 のペプチド）および１またはそれ以上のシステイン対を保有することにより束縛 された非天然 アミノ酸配列を含む。本発明において、「対」とは少なくとも１つの介在アミノ 酸によって隔てられた２つのシステインを包含する。該配列が１対のみを含む場 合には、それらのシステインは、元来存在しないループが作り上げられる様に（ すなわちジスルフィド結合によって）、ＲＧＤ配列（あるいは細胞ターゲッティ ングを行なうのに使用し得る他の同様の配列、好ましくは３０アミノ酸未満）に よって隔てられていることが望ましい。この場合、これらのシステイン残基は、 例えば［配列番号７２］にみられるようにグリシンとセリン残基の混合物といっ た３０未満のアミノ酸によって隔てられていることが好ましい。使用する非天然 アミノ酸配列にかかわらず、該非天然アミノ酸配列はループ様二次構造を有して いなければならない。 この元来存在していなかったループについては、可能なペプチドモチーフおよ びそのバリエーションを本明細書中に述べている。しかしながら、他のＲＧＤ含 有環状ペプチドが文献に記載されており、本発明において非天然アミノ酸配列と して使用することができる(例えばKoivunenら，Bio/Technology，13，265-270(1 995)参照)。特に、本発明の別の非天然アミノ酸配列としては、配列ＣＤＣＲＧ ＤＣＦＣ（すなわちCys Asp Cys Arg Gly Asp Cys Phe Cys［配列番号３］）を 含むことができる。しかしながら、該非天然アミノ酸配列は、好ましくはCys Xa a Cys Arg Gly Asp Cys Xaa Cys［配列番号４］（ここで「Xaa」は任意の核酸で ある）あるいはCys(Xaa)_ACys Arg Gly Asp Cys(Xaa)_BCys［配列番号５］（ここ で「Ａ」および「Ｂ」は、ＡあるいはＢのどちらか一方が１である限り、個々に 変更することができ、０〜８の任意の数字で有り得る）。特に、該非天然アミノ 酸は好ましくは配列Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Cys Arg Gly Asp Cy s Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Cys［配列番号５］を含み、ここでは欠失 が、ＲＧＤ（すなわちArg Gly Asp）配列の片側、あるいは両側で、１、２、３ 、４、５、６、７または８残基のシステイン以外のアミノ酸残基によって構成さ れ得る。 つまり、元来存在しないループを含む非天然アミノ酸配列はキメラアデノウイ ルスファイバー蛋白質のＣ末端で、蛋白質配列内にあるいはそれに代えて挿入さ れることが望ましい。好ましくは、元来存在しないループを含む非天然アミノ酸 配列はキメラ アデノウイルスファイバー蛋白質のノブのループ内に挿入されている。最適には 、非天然アミノ酸配列は配列番号３、配列番号４および配列番号５からなる群よ り選択される配列を含み、ここで該配列はＣまたはＮ末端のどちらか一方で１、 ２または３残基を欠失していてもよい。さらに本明細書に記載するように、該ア ミノ酸配列はまた、これらの配列の保存的アミノ酸置換基を含むことが望ましい 。 元来存在しないループは最適にはファイバー蛋白質のＣ末端に、あるいはファ イバーノブループ内に、いわゆる「スペーサー」配列を用いて接着させる。該ス ペーサー配列は非天然アミノ酸配列の一部を適当に含んでいてもよく、また全く 別の配列であってもよい。特にスペーサー配列は、天然蛋白質配列と非天然配列 との間、非天然配列と別の非天然配列との間、あるいは天然配列と別の天然配列 の間に介在する配列であることが好ましい。そのような配列は、抗体または細胞 表面結合部位に対するエピトープを含む非天然アミノ酸配列が、細胞と相互作用 し結合し得るような様式でキメラファイバーの三次元構造から突出することを確 実にするために、該蛋白質に組み込まれていることが望ましい。スペーサー配列 は任意の適当な長さ、好ましくは約３ないし約３０のアミノ酸をとり得、例えば ［配列番号７２］にみられるようなグリシンとセリンの混合物といった任意のア ミノ酸を含み得る。最適には、該スペーサー配列はファイバー蛋白質が機能する のを妨げない。キメラアデノウイルスファイバー蛋白質をコードする核酸 先に示したように、非天然アミノ酸配列はＤＮＡのレベルで導入されることが 好ましい。従って、本発明は、本発明の束縛非天然アミノ酸配列を含むキメラア デノウイルスファイバー蛋白質をコードする単離精製された核酸を提供する。望 ましくは、非天然アミノ酸配列をコードする核酸配列は、配列番号１６、配列番 号１８、配列番号２２、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号 ３４、配列番号３８、配列番号４２、配列番号４８、配列番号５２、配列番号５ ６、配列番号５７、配列番号５８および配列番号６２、ならびにこれらの核酸配 列の保存的に修飾された変異体からなる群より選択される配列を含む。 「保存的に修飾された変異体」とは、結果的に保存的アミノ酸置換をもたらす 核酸配列における変化である。「保存的アミノ酸置換」とは、類似の荷電密度、 親水性／疎水性、サイズ、および／または立体配置の代替アミノ酸（例えばＩｌ ｅに対してＶａｌ）によって置換されたアミノ酸である。対照的に「非保存的に 修飾された変異体」とは、結果的に非保存的アミノ酸置換をもたらす核酸配列に おける変化である。「非保存的アミノ酸置換」とは、異なる荷電密度、親水性／ 疎水性、サイズ、および／または立体配置の代替アミノ酸（例えばＰｈｅに対し てＶａｌ）によって置換されたアミノ酸である。そのような修飾を行う手段は当 分野では公知であり、以下の実施例に記載され、また、商業的に入手可能なキッ トおよびベクター(例えば、New England Biolabs，Tnc.，Beverly，MA;Clontech ，Palo Alto，CA)を用いることによって遂行し得る。さらにそのような置換を評 価する手段（例えば、細胞への結合および侵入能力に及ぼす効果に関して）は本 明細書で実施例に記載されている。当分野で開示されている他のアプローチもま た、細胞表面受容体に対するリガンドとして作用することができるペプチド配列 の同定に利用することができ、よって本発明において使用することができる（例 えばRussell，Nature Medicine，2，276-277(1996)参照）。 そのようなキメラファイバー蛋白質を作成する手段、特に該配列をＤＮＡレベ ルで導入する手段については、当分野において十分に公知であり、また以下の実 施例に記載される。簡単に言えば、該方法は、野生型ファイバー蛋白質のＣ末端 あるいは野生型ファイバー蛋白質のノブのループ内の蛋白質配列内にあるいはそ れに代えて新しいペプチドモチーフを挿入すべく、ファイバー蛋白質をコードす る配列内に、ある配列を導入することを含む。そのような導入は、結果として新 しいペプチド結合モチーフの挿入、あるいはペプチドモチーフの創製をもたらす （例えば、ここでは、該モチーフを含むいくつかの配列は天然ファイバー蛋白質 に既に存在している）。該方法はまた、ファイバー配列を本発明の非天然アミノ 酸配列で置きかえるために行い得る。 一般に、当該方法はプラスミドまたは配列の操作を容易にするため他のいくつ かのベクターにキメラファイバー蛋白質をコードする核酸配列をクローニングす ることによって遂行し得る。次いでさらなる配列をファイバー蛋白質内に付加す ることがで きるユニークな制限部位を同定するか、該ファイバー配列内に挿入する。二本鎖 合成オリゴヌクレオチドは通常、該二本鎖オリゴヌクレオチドが標的配列に隣り 合う制限部位を組み込むように、オーバーラップする合成一本鎖センスおよびア ンチセンスオリゴヌクレオチドから調製され、例えば置換ＤＮＡを組み込むため に使用することができる。該プラスミドまたは他のベクターを制限酵素を用いて 切断し、該野生型ＤＮＡと置きかえるべく、適合する付着末端を有するオリゴヌ クレオチド配列を該プラスミドあるいは他のベクターに連結する。（当業者には 公知であり、例えば商業的に入手可能なキットを用いて行うことができる（特に ＰＣＲを用いて））インビトロ位置指定突然変異誘発の他の手段もまた、該ファ イバー蛋白質コード配列に変異配列を導入するために用いることもできる。 いったん変異配列がキメラコート蛋白質に導入されると、該配列をコードする 核酸フラグメントを、例えば５’および３’プライマー、好ましくは付加的なユ ニークな制限部位で終結する５’および３’プライマーを用いたＰＣＲ増幅によ って単離し得る。このようなプライマーの使用は、結果として、ユニークな制限 部位が両側にある増幅されたキメラファイバー含有フラグメントを生じさせる。 このユニークな制限部位はさらに該フラグメントの都合のよいサブクローニング に使用することができる。キメラファイバー蛋白質を作製する他の手段もまた使 用することができる。これらの方法は当業者には十分に知られている。キメラアデノウイルスファイバー蛋白質を含むベクター 本発明において「ベクター」とは、その語が当業者によって理解されているよ うに遺伝子導入の為の乗り物である。本発明では、プラスミド、ファージおよび ウイルスの３つのタイプのベクターが包含される。プラスミド、ファージおよび ウイルスは核酸の形で細胞へ導入され得る（例えば形質導入を介して）。対照的 に、ファージおよびウイルスはまた、核酸とともに「カプセル」の形でトランス フェクションされ得る。ゆえに遺伝子導入に使用し得るベクター（例えばカプセ ル型）をここでは一般的に「ベ クター」と呼び、核酸型のものをより特別に「導入ベクター」と呼ぶ。しかしな がら導入ベクターもまた本発明に包含されるベクターである。 好ましくは、本発明のベクターはウイルス、特に非エンベロープウイルス類（ すなわち非エンベロープＲＮΛあるいはＤＮＡウイルス類）からなる群より選択 されるウイルスである。また、エンベロープウイルス類（すなわちエンベロープ ＲＮＡあるいはＤＮＡウイルス類）からなる群より選択されてもよい。そのよう なウイルスは好ましくは、ファイバー蛋白質あるいは細胞への侵入に使用される 類縁のコート蛋白質を含む。該ウイルスコート蛋白質は、細胞と相互作用可能な ようにキャプシドから外側へ突出しているものであることが望ましい。エンベロ ープＲＮＡあるいはＤＮＡウイルスの場合には、該コート蛋白質は脂質エンベロ ープ糖蛋白質（すなわちいわゆるスパイクあるいはペプロマー）である。 特に、ヘパドナウイルス科、パルボウイルス科、パポーバウイルス科、アデノ ウイルス科あるいはピコルナウイルス科由来の、非エンベロープウイルス（すな わちＲＮＡウイルスあるいはＤＮＡウイルスのどちらか一方）であるベクターが 好ましい。本発明において好ましい非エンベロープウイルスはヘパドナウイルス 科、特にヘパドナウイルス属のウイルスである。パルボウイルス科のウイルスは 、望ましくはパルボウイルス属（例えば哺乳類および鳥類のパルボウイルス）あ るいはデペンドウイルス属（例えばアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶｓ））である。 パポーバウイルス科のウイルスは、好ましくはパピローマウイルス亜科（例えば 、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）１〜４８が挙げられるが、それらに限定は されないパピローマウイルス類）あるいはポリオーマウイルス亜科（例えば、Ｊ Ｃ、ＳＶ４０およびＢＫウイルスが挙げられるが、それらに限定はされないポリ オーマウイルス類）である。アデノウイルス科のウイルスは、望ましくはマスト アデノウイルス属（例えば哺乳動物のアデノウイルス）あるいはアビアデノウイ ルス属（例えば鳥類のアデノウイルス）である。ピコルナウイルス科のウイルス は、好ましくはＡ型肝炎ウイルス（ＨＡＶ）、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）ある いは非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルスである。 同様に、ヘルペスウイルス科またはレトロウイルス科由来のエンベロープウイ ルス、あるいはシンドビスウイルスのベクターであってもよい。本発明において 好ましいエンベロープウイルスはヘルペスウイルス科、特にアルファヘルペスウ イルス亜科（例えば、ヘルペス単純様ウイルス）、シンプレックスウイルス属（ 例えば、ヘルペス単純様ウイルス）、ワリセラウイルス属（例えば、水痘および 仮性狂犬病様ウイルス）、ベータヘルペスウイルス亜科（例えばサイトメガロウ イルス）、サイトメガロウイルス属（例えばヒトサイトメガロウイルス）、ガン マヘルペスウイルス亜科（例えばリンパ球関連ウイルス）およびリンホクリプト ウイルス属（例えばＥＢ様ウイルス）といった亜科あるいは属のウイルスである 。 別の好ましいエンベロープウイルスはレトロウイルス科のＲＮＡウイルス（す なわちレトロウイルス）、特にオンコウイルス亜科、スプーマウイルス亜科、ス プーマウイルス属、レンチウイルス亜科あるいはレンチウイルス属といった属あ るいは亜科のウイルスである。オンコウイルス亜科のＲＮＡウイルスは、望まし くはヒトＴリンパ球向性ウイルス１または２型（すなわちＨＴＬＶ−１またはＨ ＴＬＶ−2）あるいはウシ白血病ウイルス（ＢＬＶ）、トリ白血病−肉腫ウイル ス（例えばラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）、トリ骨髄芽球症ウイルス（ＡＭＶ） 、トリ赤芽球症ウイルス（ＡＥＶ）、ラウス随伴ウイルス（ＲＡＶ）１〜５０、 ＲＡＶ−０）、哺乳類Ｃ型ウイルス（例えばモロニーマウス白血病ウイルス（Ｍ ｕＬＶ）、ハーベイマウス肉腫ウイルス（ＨａＭＳＶ）、エイブルソンマウス白 血病ウイルス（Ａ−ＭｕＬＶ）、ＡＫＲ−ＭｕＬＶ、ネコ白血病ウイルス（Ｆｅ ＬＶ）、サル肉腫ウイルス、細網内皮症ウイルス（ＲＥＶ）、脾臓壊死ウイルス （ＳＮＶ））、Ｂ型ウイルス（例えば、マウス乳がんウイルス（ＭＭＴＶ））あ るいはＤ型ウイルス(例えば、メーソン・ファイザーサルウイルス（ＭＰＭＶ） 、「ＳＡＩＤＳ」ウイルス）。レンチウイルス亜科のＲＮＡウイルスは、望まし くはヒト免疫不全ウイルス１または２型（すなわち、ＨＩＶ−１またはＨＩＶ− ２、ここでＨＩＶ−１は以前はリンパ節症関連ウイルス３（ＨＴＬＶ−III）お よび後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）関連ウイルス（ＡＲＶ）と呼ばれていた ）、あるいはＨＩＶ−１またはＨＩＶ−２に関連した別のウイルス（同定さ れており、ＡＩＤＳまたはＡＩＤＳ様疾患に随伴している）である。「ＨＩＶ」 なる頭字語、または「ＡＩＤＳウイルス」あるいは「ヒト免疫不全ウイルス」な る語は、本明細書では、一般にこれらのＨＩＶウイルス、およびＨＩＶ関連およ び随伴ウイルスに言及するために使用される。さらにレンチウイルス亜科のＲＮ Ａウイルスは、好ましくはビスナ／マエディウイルス（例えばヒツジを感染させ るような）、ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）、ウシレンチウイルス、サル免疫 不全ウイルス（ＳＩＶ）、ウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）あるいはヤギ関 節炎−脳炎ウイルス（ＣＡＥＶ）である。 特に好ましい本発明のベクターはアデノウイルスベクターである（すなわちア デノウイルス科、最適にはマストアデノウイルス属のウイルスベクター）。その ようなベクターとしては、他の血清型のアデノウイルスベクターも使用し得るが 、望ましくはＡｄ２またはＡｄ５ベクターであるが、。本発明において使用し得 るアデノウイルスのストックとしては、現在、アメリカンタイプカルチャーコレ クション(ＡＴＣＣ、ロックヴィレ、メリーランド）から入手可能な任意のアデ ノウイルス血清型１〜４７、または他のいずれかの供給源から入手可能な他のい ずれかのアデノウイルス血清型が挙げられる。例えば、アデノウイルスはＡ亜群 （例えば血清型１２、１８、３１）、Ｂ亜群（例えば血清型３、７、１１、１４ 、１６、２１、３４、３５）、Ｃ亜群（例えば血清型１、２、５、６）、Ｄ亜群 （例えば血清型８、９、１０、１３、１５、１７、１９、２０、２２〜３０、３ ２、３３、３６〜３９、４２〜４７）、Ｅ亜群（血清型４）、Ｆ亜群（血清型４ ０、４１）または他のいかなるアデノウイルス血清型であってもよい。 遺伝子導入に使用されるアデノウイルスベクターは野生型（すなわち複製コン ピテントである）であってもよい。もしくは、該アデノウイルスベクターはウイ ルスを複製欠損にし得る少なくとも１つの修飾をその中に有する遺伝的材料を含 んでもよい。アデノウイルスゲノムに対する該修飾としては、ＤＮＡセグメント の付加、ＤＮＡセグメントの再配置、ＤＮＡセグメントの欠失、ＤＮＡセグメン トの置換、あるいはＤＮＡ損傷の導入が挙げられるが、それらに限定されない。 ＤＮＡセグメントは、小さ なもので１ヌクレオチド、大きいもので３６キロ塩基対（すなわちおおよそアデ ノウイルスゲノムのサイズ）、あるいはまた、アデノウイルスウイルス粒子中に パッケージングできる最大量（すなわち約３８ｋｂ）と同等であればよい。アデ ノウイルスゲノムに対する好適な修飾としては、Ｅ１、Ｅ２、Ｅ３および／また はＥ４領域における修飾が挙げられる。アデノウイルスベクターまた、好適にコ インテグレートされ得る（すなわちアデノウイルスゲノム配列と、他のウイルス 、ファージあるいはプラスミド配列のような他の配列との連結）。 ウイルスベクター（例えば特に複製欠損アデノウイルスベクター）に関しては 、そのようなベクターは、完全なキャプシド（すなわちアデノウイルスゲノムの ようなウイルスゲノムを含んでいる）もしくは空のキャプシド（すなわち例えば 物理的あるいは化学的な手段によってウイルスゲノムが欠落しているか分解して いる）を含む。好ましくは該ウイルスベクターは完全なキャプシドを含んでいる 。方法はウイルス、プラスミドおよびファージをそれらの核酸配列（すなわちＲ ＮＡまたはＤＮＡ）の形で導入するのに利用できるので、キャプシド蛋白質のよ うな任意の関連蛋白質の非存在下、およびエンベロープ脂質の非存在下でも、同 じ手法で、同様にベクター（すなわち導入ベクター）はＲＮＡまたはＤＮＡを含 むことができる。つまり本発明によれば、ベクターがキメラアデノウイルスファ イバー蛋白質を「含む」のに対し、導入ベクターは、キメラアデノウイルスファ イバー蛋白質を「コードする」という意味でキメラアデノウイルスファイバー蛋 白質を含んでいる。 本発明のベクターは追加の配列および変異を含み得る（例えばいくつかは該フ ァイバー蛋白質それ自身の中に）。例えば、好ましくは本発明のベクターはさら にパッセンジャー遺伝子を含む核酸を含む。 「核酸」とはポリヌクレオチド（ＤＮＡあるいはＲＮＡ）である。「遺伝子」 とは、蛋白質あるいは初期ＲＮＡ分子をコードするあらゆる核酸配列である。「 パッセンジャー遺伝子」とは、通常はベクター中に存在せず、本発明によりベク ター（例えば導入ベクター）中にサブクローニングされ、且つ宿主細胞へ導入す ると、細胞内環境において識別できる変化（例えばデオキシリボ核酸（ＤＮＡ） 、リボ核酸（ＲＮＡ）、 ペプチドまたは蛋白質のレベルの増加、あるいはそれらの生産または分解速度の 変化）を伴うあらゆる遺伝子である。「遺伝子産物」とは、所定の遺伝子または コード配列から転写された、まだ翻訳されていないＲＮＡ分子（例えばｍＲＮＡ またはアンチセンスＲＮＡ）、あるいは所定の遺伝子またはコード配列より転写 された、ｍＲＮＡ分子から翻訳されたボリペプチド鎖（すなわち蛋白質またはペ プチド）のいずれかである。遺伝子はコード配列に加え任意の非コード配列を含 むが、「コード配列」はいかなる非コード（例えば調節）ＤＮＡをも含まない。 遺伝子あるいはコード配列は、もし該分子に沿う塩基配列が天然に通常見出され る遺伝子あるいはコード配列を有する配列から変化していれば、すなわち該塩基 配列が天然に通常見出されないものであれば、「組換え体」である。本発明によ れば、遺伝子またはコード配列は全体または部分的に合成で作ることができ、ゲ ノムＤＮＡあるいは相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）配列を含むことができ、ＤＮＡある いはＲＮＡのどちらか一方の形態で提供され得る。 非コード配列あるいは調節配列にはプロモーター配列が包含される。「プロモ ーター」はＲＮＡポリメラーゼの結合を指示し、それによってＲＮＡ合成を促進 するＤＮＡ配列である。「エンハンサー」は近傍の遺伝子の転写を刺激または阻 害するＤＮＡのシス作動性エレメントである。転写を阻害するエンハンサーはま た、「サイレンサー」とも呼ばれる。エンハンサーは、それがいずれの配向にお いても、数キロ塩基対までならその距離を越えて、転写される領域の下流の位置 からでさえも機能し得るという点で、プロモーター中にのみ見出される配列特異 的ＤＮＡ結合蛋白質のためのＤＮＡ結合部位（「プロモーターエレメント」とも 呼ばれる）とは異なる。本発明によれば、プロモーターがコード配列の転写を指 示することが可能な場合には、該コード配列は該プロモーターに「機能的に連結 している」（例えばコード配列およびプロモーターの両方がパッセンジャー遺伝 子を構成している場合）。 従って、「パッセンジャー遺伝子」はいかなる遺伝子であってもよく、望まし くは治療遺伝子もしくはリポーター遺伝子のどちらかである。好ましくは、パッ センジャー遺伝子はベクターがインターナリゼーションされた細胞内で発現し得 る。例えば、該パッセンジャー遺伝子はリポーター遺伝子、すなわち何らかのや り方で細胞内で検 出することができる蛋白質をコードする核酸配列を包含し得る。該パッセンジャ ー遺伝子はまた、治療遺伝子、例えばＲＮＡまたは蛋白質のレベルでその効果を 発揮する治療遺伝子を包含し得る。例えば嚢胞性繊維症の治療のための嚢胞性繊 維症膜貫通コンダクタンス調節因子ｃＤＮＡのように、導入される治療遺伝子に よってコードされる蛋白質を遺伝病の治療に使用することができる。治療遺伝子 によってコードされる蛋白質は結果的に細胞を殺すことによってその治療効果を 発揮するかもしれない。例えば、ジフテリア毒素Ａ遺伝子の発現のように、遺伝 子発現そのものが殺細胞に導くか、あるいは遺伝子発現により、細胞をある特定 の薬物の殺作用に選択的に感受性となるようにすることができる（例えばＨＳＶ チミジンキナーゼ遺伝子の発現により、細胞はアシクロビル、ガンシクロビルお よびＦＩＡＵ（１−（２−デオキシ−２−フルオロ−β−Ｄ−アラビノフラノシ ル）−５−ヨードウラシル）を含めた抗ウイルス性化合物に感受性となる）。 さらに、治療遺伝子は、例えばアンチセンスメッセージもしくはリボザイム、 スプライシングや３’プロセッシング（例えばポリアデニル化）に影響する蛋白 質をコードすることによってＲＮＡレベルでその効果を発揮させることができ、 あるいは、おそらくはとりわけｍＲＮＡ蓄積速度の変化、ｍＲＮＡ輸送の変化、 および／または転写後調節の変化を仲介することによって、細胞内での別の遺伝 子発現レベルに影響することで作用する蛋白質をコードすることができる（すな わち、ここでは遺伝子発現は、転写開始からプロセスされた蛋白質の生産までの 全ての工程を含めるものと広く解釈されている）。従って、「治療遺伝子」なる 語の使用はこれらの、ならびに当業者には公知の遺伝子治療としてより普通に言 及される他のいかなる態様をも包含すべく意図されるものである。同様に、該組 換えアデノウイルスは、遺伝子治療に、または所定の細胞あるいは組織における インビトロまたはインビボでの遺伝子の発現の効果を調べるために使用すること ができる。 従って、本発明は束縛非天然アミノ酸配列を含むキメラアデノウイルスファイ バー蛋白質（すなわち、ペントンベース、ファイバーまたはヘキソン蛋白質）を 含むベクターを提供する。好ましくは、そのようなベクターは、任意にアデノウ イルスゲノム に挿入されるか、あるいは蛋白質／ＤＮＡ相互作用によってアデノウイルスのコ ート蛋白質に接着しているかしているパッセンジャー遺伝子を含む。もしくは、 該アデノウイルスベクターは、好ましくは、連結していないＤＮＡあるいは蛋白 質分子、もしくは他の小部分を、これらの分子のアデノウイルスバイスタンダー に仲介される取り込みによって、細胞内へと運搬する（国際特許出願ＷＯ ９５ ／２１２５９）。 同じ手法でアデノウイルスゲノムの一部として移送される（すなわちアデノウ イルスによってコードされている）核酸配列の導入、アデノウイルスキャプシド の外側に付着している核酸配列の導入(Curielら.,上述）、およびアデノウイル スバイスタンダーによって仲介される取り込みによって同様に移送される接着し ていないＤＮＡ、蛋白質または他の小分子の導入（国際特許出願ＷＯ ９５／２ １２５９）のために本発明の方法を使用することができる。該方法は本明細書に 記載されるようにエクスビボあるいはインビボのどちらかで遺伝子および／また は蛋白質の送達を仲介するために使用することができる。 望ましくは、ベクターは非エンベロープウイルス類からなる群より選択される ウイルスベクターである。そのようなベクターは望ましくは本発明の非天然アミ ノ酸配列および／またはそのような非天然アミノ酸配列をコードする核酸配列を 含む。最適には、該ベクターは、アデノウイルスベクター、特にＡｄＺ．ＦＬＡ Ｇ、ＡｄＺ．ＲＫＫＫ２、ＡｄＺ．ｐＧＳ、ＡｄＺ．ＲＧＤ、ＡｄＺ．ｐＲＧＤ 、ＡｄＺ．ｐＬＤＶおよびＡｄＺ．ｐＹＩＧＳＲからなる群より選択されるアデ ノウイルスベクターである。 本発明の組換えアデノウイルスを作成する方法は、当業者には公知である。例 えば、本発明に従って、導入ベクター、好ましくはウイルスまたはプラスミド導 入ベクターを用いることによりキメラファイバー蛋白質を含む組換えアデノウイ ルスならびにパッセンジャー遺伝子または特定の細胞内で発現し得る遺伝子をさ らに含む該組換えアデノウイルスを作製することができる。そのような導入ベク ターは、好ましくは先に述べたキメラアデノウイルスファイバー配列を含む。該 キメラファイバー蛋白質 遺伝子配列は、欠失した天然配列の代わりに、あるいは該天然配列に付加して、 非天然（すなわち野生型ではない）配列を含む。 発現ならびに受容体または蛋白質の特異性およびアビディティー、三量体化能 、ペントンベース結合、および他の生化学的特徴の評価のために、バキュロウイ ルスあるいは適当な原核生物または真核生物の発現ベクターからアデノウイルス ベクターに、あるいはアデノウイルスベクターからバキュロウイルスあるいは適 当な原核生物または真核生物の発現ベクターにと組換えキメラファイバー蛋白質 遺伝子配列を移すことができる。特に、以下の実施例で述べられ、またWickham ら(1995)、上述、に記載されているバキュロウイルスでの蛋白質の生産方法を用 いることができる。 従って、本発明はまた、キメラアデノウイルスファイバー蛋白質遺伝子配列を 含む組換えバキュロウイルスならびに原核生物および真核生物の発現ベクター（ これらはまた導入ベクターであり得る）を提供する。本発明は、通常使用される 導入ベクターの定義に該当するベクター（例えば新しいアデノウイルスベクター を作り上げるために使用されるアデノウイルス配列を含有するプラスミドである ベクター）をもまた提供する。該キメラファイバー蛋白質遺伝子配列は、天然ア ミノ酸配列に加え、あるいはそれに代えて非天然配列を含む。このことにより、 結果的に得られるキメラファイバー蛋白質が天然配列によって結合する結合部位 以外の結合部位に結合することが可能となる。アデノウイルス導入ベクターから バキュロウイルスまたは原核生物あるいは真核生物の発現ベクターへ、キメラ遺 伝子を移すことによって、高い蛋白質発現を達成することができる（全蛋白質の およそ５〜５０％はキメラファイバーである）。本発明の好ましい導入ベクター は、ｐ１９３（Ｆ５＊）、ｐ１９３ Ｆ５Ｆ２Ｋ（ＦＬＡＧ）、ｐ１９３ Ｆ５Ｆ ２Ｋ、ｐ１９３ Ｆ５Ｆ２Ｋ（ＲＫＫＫ２）、ｐ１９３（Ｆ５）ｐＧＳ（ＲＧＤ ）、ｐ１９３（Ｆ５）ｐＬＤＶ、ｐ１９３（Ｆ５）ｐＹＩＧＳＲおよびｐ１９３ （Ｆ５＊）ＲＧＤからなる群より選択される。 本発明によれば、ベクターはさらにファイバー蛋白質内に、代わりに、あるい は外側に、ファイバー蛋白質の三量体化能力に強い影響を与える、あるいはプロ テアーゼ認識配列を含むさらなる配列を含むことができる。三量体化する能力に 強い影響を与 える配列は、ファイバーの三量体化を可能にする１またはそれ以上の配列である 。プロテアーゼ認識配列を含む配列は、プロテアーゼによって切断することがで き、それによってキメラコート蛋白質（あるいはその部分）の除去、ならびに該 組換えアデノウイルスの細胞への別のコート蛋白質を利用した接着をもたらす。 ファイバー蛋白質と使用する場合には、該プロテアーゼ認識部位は、ファイバー の三量体化あるいは該ファイバー蛋白質の受容体特異性に影響を及ぼさないこと が好ましい。例えば、本発明の一態様では、好ましくは該ファイバー蛋白質また はその一部は、プロテアーゼ認識配列によって削除され、そしてペントンベース 蛋白質もしくは別の蛋白質が細胞結合/細胞侵入を命令する。 本発明によれば、ベクターおよび導入ベクターの製造については、導入ベクタ ーは当業者には公知の標準的な分子的および遺伝学的技術を用いて構築される。 ビリオンすなわちウイルス粒子を含むベクターはウイルスベクターを用いて適当 な細胞系で生産される。同様に、該アデノウイルスファイバーキメラ含有粒子が 、現在アデノウイルスベクター用に使用されている標準的な細胞系内で産生され る。産生ならびに精製に続いて、ファイバーに削除されるべき該粒子を適当な配 列特異的なプロテアーゼ（該ファイバー蛋白質を切断し、該ウイルス粒子からそ れらを遊離させ、ファイバーのない粒子を作成する）で消化することによって、 該粒子をファイバーがないようにする。使用例 本発明は、高効率で、細胞に結合し、細胞内への侵入を仲介し得るキメラファ イバー蛋白質、ならびにそれを含むベクターおよび導入ベクターを提供する。該 キメラ蛋白質それ自身、複数の用途、例えば細胞へのアデノウイルス結合のイン ビトロでの研究の道具としての用途（例えば、Wickhamら(1993)，上述,によって 先に示されたようにスキャッチャード解析によって）、アデノウイルスがインビ トロで受容体に結合するのを阻害する用途（例えば、本明細書の実施例に記載な らびに当分野で知られているように抗体、ペプチド、および酵素を使用すること によって）、そして特定のペ プチドモチーフを含むキメラファイバー蛋白質をいくらか使用して、結合部位へ の結合（それによってアデノウイルスが細胞侵入を達成する）について競合する ことによってインビボでのアデノウイルス感染を防ぐ用途を有する。 また、キメラファイバー蛋白質を含むベクターを、株の調製ならびに新しいベ クターを作成する手段として使用することもできる。例えば、非天然アミノ酸配 列を組換えによる新しいベクターを調製する手段として細胞内に導入することが できる。同様に、ベクターを遺伝子治療に使用することができる。例えば、本発 明のベクターは、矯正ＤＮＡ、すなわち、欠損するか損なわれた機能をコードす るＤＮＡ、または、例えば細胞内でのみ活性のある細胞毒素をコードするＤＮＡ のような慎重な殺傷剤を標的細胞に送達することにより数多くの疾患のいずれか を治療するのに用いることができる。このような治療の対象となり得る疾患とし ては、例えば、癌（例えば黒色腫、膠腫または肺癌）、遺伝病（例えば嚢胞性線 維症、血友病または筋ジストロフィー）、病原性の感染（例えばヒト免疫不全ウ イルス、結核または肝炎）、心臓病（例えば壊死組織に再灌流させるための血管 形成術または血管新生促進の後の妨害的再狭窄）および自己免疫障害（例えばク ローン病、大腸炎または関節リウマチ）が挙げられる。 特に、本発明以前には、アデノウイルスが結合し侵入することのできなかった 、あるいは低親和性および／または低特異性でのみしか結合、侵入できなかった 種々の組織に関しての疾患、障害または病態を治療するのに遺伝子治療を行うこ とができる。例えば、該方法は、種々の組織への遺伝子送達の能率を増大させる ターゲッティング配列を組み込むために使用することができる。そのようなター ゲッティング配列としては、ヘパリン結合ドメイン（例えば、ｐｏｌｙＫ、ｐｏ ｌｙＲまたはそれらを組み合わせたもの）、インテグリン結合ドメイン（例えば ＲＧＤ、ＬＤＶ等）、ラミニン受容体ドメイン（例えばＹＩＧＳＲ［配列番号６ ６］）、ＤＮＡ結合ドメイン（例えばｐｏｌｙＫ、ｐｏｌｙＲまたはそれらを組 み合わせたもの）、抗体エピトープ（例えばＦＬＡＧペプチドＤＹＫＤＤＤＤＫ ［配列番号２］または他のエピトープ）、脳特異的ターゲッティングドメイン（ 例えばＳＬＲ）、および受容体に結合する任意 の他のペプチドドメイン（例えば、特に、約２ないし２００のアミノ酸の範囲の ペプチドドメイン）が挙げられるが、それらに限定されない。 同じ手法で、該方法を、例えば骨髄細胞、内皮細胞、肺、肝、脾臓、腎、脳、 眼、心臓、筋肉等の器官、造血細胞、腫瘍血管系および腫瘍細胞へのアデノウイ ルスが介する送達能率を増大させるために使用することができる。これらの組織 に関連した疾病、障害、あるいは病態として、血管新生、再狭窄、炎症、癌、ア ルツハイマー病、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２）感染および 貧血が挙げられるが、これらに限定されない。 上述の使用例は決して包括的なものではなく、本発明が、本明細書の開示には 明白には言及されていないが、そこから生み出されてくるようなさらなる用途を も包含することを意図するものである。同様に本発明の種々の局面についての用 途に関連しての無数の利点がある。 例えば、該ファイバー蛋白質内に抗体エピトープを組み入れることによって、 もし該抗体エピトープがループ内でファイバー受容体結合ドメインに近接して存 在している場合、二重特異性抗体の結合は通常の受容体結合を阻害し、それによ って該抗体エピトープを用いた細胞ターゲッティングの特異性が増大するであろ う。もし、該ファイバー受容体結合ドメインがもはやその受容体に結合しないよ うに変異していれば、特異的受容体結合ドメインをループ内に組み込むことによ って、野生型ファイバー受容体結合ドメインによって仲介されるいかなる競合結 合もなく、相補的な受容体を発現している組織へターゲッティングできるであろ う。 同様にして、通常の受容体結合に対するファイバーの不活性化をもたらすドメ インもまた、ファイバー蛋白質のループドメイン内に組み込まれ得る。その通常 の受容体へのファイバーの結合の不活性化は、アデノウイルスの別個の蛋白質あ るいはドメインを介する特異的ターゲッティングを可能にするであろう。例えば 、天然ペントンベースを用いたα_Vインテグリンターゲッティングはこの様式で 行うことができる。同じ手法で、エンテロキナーゼ切断部位（例えばＤＹＫＤＤ ＤＤＫ［配列番号２］）またはトリプシン切断部位（例えばＲＫＫＫＲＫＫＫ［ 配列番号１］）をファイバー ループ内に組み入れた後、アデノウイルス粒子をエンテロキナーゼまたはトリプ シンで処理することができる。天然アデノウイルス粒子はそのようなエンテロキ ナーゼまたはトリプシン処理を免れる。 さらに本発明のベクター、特にアデノウイルスベクターは通常の手段で単離、 精製し得るという点で有利である。該ベクターの改変はゲノムレベルでなされる ので、他のベクターにつきものの、煩わしく且つ経費のかかる生産後の改変を必 要としない（例えばCottenら，Proc ．Natl．Acad．Sci.，89，6094-6098(1992) ；Wagnerら，Proc ．Natl．Acad．Sci.，89，6099-6103(1992)参照）。同様に、 特別なアデノウイルス受容体発現細胞系を必要とすることもない。キメラファイ バー蛋白質を含むアデノウイルスベクターは、ファイバー改変を行なっていない 野生型ベクターと同様の力価で増殖し得る。投与手段 本発明のベクターおよび導入ベクターは、インビトロあるいはインビボのどち らにおいても細胞と接触すべく使用することができる。本発明によれば、「接触 させること」は、それによってベクターが細胞内に導入される任意の手段を包含 する；該方法はいかなる特定の導入手段にも依存するものではなく、またそのよ うに解釈されるものでもない。導入手段は当業者にはよく知られたものであり、 また本明細書に例示されるものである。 従って、例えば、インビトロ（例えばエクスビボ型の遺伝子治療方法、または 組織培養研究において）、あるいはインビボ（エレクトロポレーション、形質転 換、形質導入、接合あるいはまたは三親交配(triparental mating)、（共）トラ ンスフェクション、（共）感染、カチオン性脂質との膜融合、ＤＮＡをコーティ ングしたマイクロプロジェクタイルの高速射撃、リン酸カルシウムとのインキュ ベーション−ＤＮＡ沈澱、単細胞への直接マイクロインジェクション等による） において導入することができる。同様に、該ベクターをカチオン性脂質（例えば リポソーム）を用いて導入することができる。そのようなリポソームは商業的に 入手可能である（例えばリポフェク より供給される）。さらに、インビボでの導入能力が増大した、および／または 毒性が減ぜられたリポソーム（例えば国際特許出願ＷＯ ９５／２１２５９を参 照）を、本発明に使用することができる。他の方法もまた利用でき、当業者には 公知である。 本発明によれば「宿主」（およびすなわち宿主由来の「細胞」）は本発明のベ クターが導入し得る任意の宿主を包含するものであり、すなわち両生類、鳥類、 魚類、昆虫類、爬虫類、または哺乳類を含む（これらに限定はされない）動物を 包含するものである。最適には宿主は哺乳類であり、例えばげっ歯類、チンパン ジー、尾のあるサル、尾なしサル、ゴリラ、オラウータンまたはテナガザルのよ うな霊長類、ネコ科動物、イヌ科動物、反芻動物あるいはブタのような有蹄類お よび特にヒトである。望ましくは、そのような宿主細胞は、アデノウイルスが細 胞へ侵入した後、一定期間存在できるものである（すなわち通常は少しの時間か ら約２ヶ月まで、もしかするとその後も）。 細胞は、単一で存在することも、またはたくさんの細胞の一部として存在する こともできる。そのような「たくさんの細胞」には例えば、細胞培養（混合ある いは純粋）、組織（例えば上皮または他の組織）、器官（例えば心臓、肺、肝、 胆嚢、膀胱、眼および他の器官）、器官系（例えば循環器系、呼吸器系、消化器 系、泌尿器系、神経系、外皮系および他の器官系）、または生体（例えば鳥類、 哺乳類等）が包含される。細胞ターゲッティングに使用される該ペプチドモチー フは、標的となる器官／組織／細胞が循環器系（例えば心臓、血管および血液が 挙げられるがこれらに限定されない）、呼吸器系（例えば鼻、咽頭、喉頭、気管 、気管支、細気管支、肺等）、消化器系（口、咽頭、食道、胃、腸、唾液腺、膵 臓、肝、胆嚢および他が挙げられる）、泌尿器系（例えば腎、尿管、膀胱、尿道 等）、神経系（例えば脳および脊髄、ならびに眼のような特殊感覚器官が挙げら れるが、それらに限定されない）および外皮系（例えば皮膚）であることが好ま しい。標的となる細胞は、心細胞、造血細胞、肺細胞、肝細胞、脾細胞、腎細胞 、脳細胞、眼細胞、骨髄細胞、内皮細胞、筋肉細胞、腫瘍血管細胞、および腫瘍 細胞からなる群より選択されるものであることがよりいっそう好ましい。 当業者には本発明のベクター（特にアデノウイルスベクター）を遺伝子治療（ 例えばRosenfeldら，Science，252，431-434(1991)；Jaffeら，Clin ．Res.，39( 2) ，302A(1991)；Rosenfeldら，Clin ．Res.，39(2)，311A(1991)；Berkner，Bio Techniques ，6，616-629(1988)；Crystalら，Human Gene Ther.，6，643-666(19 95)；Crystalら，Human Gene Ther.，6，667-703(1995)を参照）、化学療法およ びワクチン接種の目的で動物に投与するのに適当な方法を利用することができ、 また、２つ以上の経路が投与に使用できるが、ある特定の経路が他の経路よりも 迅速でより効果的な反応を提供し得ることがわかるであろう。医薬上許容され得 る賦形剤もまた当業者によく知られており、容易に入手可能である。賦形剤の選 択は組換えベクターの投与に使用される特定の方法によって部分的に決定される であろう。したがって、本発明における使用には非常に多様な好適な製剤がある 。以下の方法および賦形剤は単なる例示であって何ら限定するものではない。 さらに、本発明の方法によって該アデノウイルスが細胞へ侵入するための能力 をできるだけ能率的に利用するためには、好ましくは該方法は、細胞内に導入さ れる特定のアデノウイルスに対する中和抗体の非存在下で行なう。そのような抗 体がなければ、抗体によってアデノウイルスが結合する可能性がなく、つまり細 胞へ結合および／または挿入が妨害される可能性がない。そのような中和抗体の 存在を確認することは、当分野の通常の技術内である。当分野で公知の技術を用 いて、中和抗体の存在が、効果的な蛋白質産生を妨害するのを防ぐことができる (例えばCromptonら,上述，国際特許出願ＷＯ ９６／１２４０６参照)。 経口投与に好適な製剤は、（ａ）液剤、例えば水、食塩水、オレンジジュース のような希釈剤に溶解された有効量の化合物；ｂ）それぞれ予め決められた量の 有効成分を固形剤または顆粒剤として含むカプセル剤、サッシェ剤または錠剤、 （ｃ）適当な液体中の懸濁液剤、および（ｄ）適当な乳液剤からなり得る。錠剤 型は、ラクトース、マンニトール、コーンスターチ、馬鈴薯デンプン、微晶質セ ルロース、アカシア、ゼラチン、コロイド性二酸化ケイ素、クロスカルメロース ナトリウム、タルク、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸および他の賦形 剤、着色剤、希釈剤、緩衝剤、湿 潤剤、保存剤、着香剤、並びに薬理学的に適合する賦形剤のうちの１つまたはそ れ以上を含み得る。ロゼンジ型は、有効成分を香味成分、通常はシュクロースお よびアカシアまたはトラガカントゴム中に含み得るし、また、香錠剤は有効成分 をゼラチンおよびグリセリン、またはシュクロースおよびアカシアのような不活 性な基剤中に含み、乳化剤、ゲル剤等は有効成分に加えて、当技術分野において 知られているような賦形剤を含有する。 本発明のベクターあるいは導入ベクターは単独で、あるいは他の適当な成分と 組み合わせて、吸入によって投与されるエアロゾル製剤にすることができる。こ のようなエアロゾル製剤は、ジクロロジフルオロメタン、プロパン、窒素等の加 圧された許容され得る推進ガス中におくことができる。それらはまた、ネブライ ザー噴霧器やアトマイザー噴霧器のような非加圧製剤用の医薬として製剤化され 得る。 非経口投与に適した製剤としては、抗酸化剤、緩衝剤、静菌剤、および意図す る受容者の血液と製剤とを等張にする溶質を含み得る水性および非水性の等張滅 菌注射溶液剤、並びに懸濁化剤、溶解補助剤、増粘剤、安定化剤および保存剤を 含み得る水性および非水性の滅菌懸濁化剤が挙げられる。当該製剤はアンプルや バイアルのような単位用量または複数回用量を封入した容器で提供され、注射用 に、使用直前に滅菌した液状賦形剤、例えば水を添加すればよいだけのフリーズ ドライ（凍結乾燥）された状態で保存することができる。即席の注射溶液剤およ び懸濁液剤は、以前に記載された種類の滅菌した散剤、顆粒剤および錠剤から調 製することができる。 さらに、本発明のベクターまたは導入ベクターは、乳化用基剤や水溶性基剤の ような種々の基剤と混合することにより坐薬としてもよい。 膣投与に適した製剤は、有効成分に加えて当技術分野において適当であると知 られているような担体を含むペッサリー、タンポン、クリーム、ゲル、ペースト 、泡またはスプレー剤として提供され得る。 本発明によれば、動物、特にヒトに投与される用量は目的の遺伝子、使用され る組成物、投与方法および治療される特定部位および生物によって変化する。し かしながら、その投与量は治療的応答をもたらすに十分であるべきである。 先に示したように、本発明のベクターまたは導入ベクターはインビトロでの有 用性も有する。そのようなベクターは、アデノウイルスの細胞接着および細胞感 染の研究における研究用の道具として、また、結合部位−リガンド相互作用の測 定方法に使用することができる。同様に、天然アミノ酸配列に加えて、あるいは それに代えて束縛非天然アミノ酸配列を含むキメラファイバー蛋白質を、例えば 、受容体−リガンドアッセイに、また、接着蛋白質としてインビトロまたはイン ビボで使用することができる。実施例 以下の実施例により本発明をさらに説明するが、もちろん、これらは決して本 発明の範囲を限定するように解釈されるべきものではない。 実施例１ 本実施例において、アデノウイルスファイバー蛋白質のノブ領域の露出ループ に種々のペプチドモチーフの挿入部を有するファイバー配列をコードする導入ベ クターの構築について述べる。 Ａｄ２およびＡｄ５のファイバー蛋白質はともに同一の受容体を認識する。フ ァイバーノブの蛋白質構造およびそのＤＮＡ制限地図の並行評価（parallel eva luation）は、Ａｄ２ファイバーノブが、その蛋白質中の露出ループをコードす る領域にユニークなSpeＩ制限部位を含有することを表わしている。このループ 中の該アミノ酸は、蛋白質のフォールディングに関するいかなる相互作用にも関 与していない。従って、このループへの付加が、ファイバー蛋白質のフォールデ ィングの為の能力に影響することはほとんどありそうもない。露出ループ（特に ＨＩループ）の修飾を含むキメラアデノウイルスファイバー蛋白質を本明細書に 記載するようにして構築した。 ベクター構築および特徴付けについては、標準的な分子および遺伝学的技術( 例えば、株、プラスミドおよびウイルスの調製、ゲル電気泳動、プラスミドの単 離、ＤＮＡクローニングおよびシークエンシングを含むＤＮＡ操作、ウエスタン ブロットアッ セイ等）は、当業者に公知のように、および標準的な実験マニュアル(例えば、M aniatisら、モレキュラー クローニング：ア ラボラトリー マニュアル、第 ２版（Cold Spring Harbor，NY，1992）；Ausubelら、カレント プロトコール イン モレキュラー バイオロジー （1987）)に詳細に記載されているように 実施した。分子操作に使用される制限酵素および他の酵素は、販売元（例えば、 Boehringer Mannheim，Inc.，Indianapolis，Indiana;New England Biolabs，Be verly，Massachusetts;Bethesda Research Laboratories，Bethesda，Maryland ）から購入し、そして製造業者の推奨に従って使用した。実験に用いた細胞(例 えば、形質転換したヒト胎児腎細胞系２９３（すなわち、ＣＲＬ １５７３細胞 ）および他の細胞は、アメリカン タイプ カルチャーコレクションにより供給 された)は、以前に記載された(Erzerumら、Ｎucleic Acids Research，21，1607 -1612（1993）)ように標準的な無菌培養試薬、培地および技術を使用して培養お よび維持した。 制限消化断片の連結反応によりターゲッティング配列を含有する組換えアデノ ウイルスベクターを作製するために、まず導入ベクターに存在するＡｄ５のノブ 領域をＡｄ２由来のノブコード領域と交換することが必要であった。なぜなら、 Ａｄ２のＨＩループは、この部位への特定のターゲッティング配列のクローニン グを可能にするユニークなSpeＩ制限部位を含むからである。このベクター操作 の正味の結果は、図１に示すように、ファイバーのテールおよびシャフトをコー ドするＤＮＡがＡｄ５由来であり、ノブをコードするＤＮＡがＡｄ２由来であり 、そしてノブがＨＩループにおいて非天然アミノ酸配列をさらに含むファイバー キメラを作り出すことであった。もしくは、標準的なオリゴヌクレオチド仲介型 の位置指定突然変異誘発を製造業者（Stratagene，La Jolla，CA）の指示に従っ て使用した。位置指定突然変異誘発については、ユニークな制限部位を必要とし ないのでファイバーノブを交換する必要はなかった。後の実施例に記載する本発 明のさらに別の代替方法においても、ターゲッティング配列は、図２に示すよう に、ファイバーノブ蛋白質の末端に配置される。 ループ内にファイバーノブの挿入を行うプロセスの第１工程において、図３に 示す導入ベクターｐ１９３（Ｆ５^*）を構築した。このプラスミドは、ファイバ ーコード 配列の最終アミノ酸コドンおよび終止コドンの間に８ヌクレオチドの挿入部を有 する。該８ヌクレオチドの挿入部は、Ａｄ５ファイバードメインと他のアデノウ イルス血清型由来の他のファイバードメインとの直接的な置換を可能にするユニ ークなBamHI制限部位を含有する。すなわち、野生型Ａｄ５ファイバー遺伝子の 配列は以下の通りである。 ここで^*は終止コドンを示す。これに比べてｐ１９３（Ｆ５^*）に存在する変異フ ァイバー遺伝子のＣ末端は以下の通りである。 ここで下線を引いた該配列はファイバー蛋白質に導入されたBamHI部位を示す。 このBamHI部位はまた、アミノ酸グリシンおよびセリンをコードするのに役立つ 。 導入プラスミドｐ１９３（Ｆ５^*）は、ｐ１９３ＮＳ（ΔＦ）から構築した。 変異ファイバー遺伝子（すなわち、終止コドンの前にBamHI部位を含むファイバ ー遺伝子）を合成センスおよびアンチセンスオリゴヌクレオチドプライマーを使 用してファイバーのないプラスミドｐ１９３ＮＳ（ΔＦ）に組み込み、ポリメラ ーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によってファイバー遺伝子を増幅した。その一方、同時 にファイバー遺伝子の最終コドンに続く修飾したBamHI部位を組み込んで、変異 ファイバー遺伝子を創製した。Ａｄ５ゲノムＤＮＡ由来のファイバー遺伝子のNd eI部位からＣ末端までのコード領域を増幅するために使用されるプライマーは以 下の通りであった：アンチセンスプライマー、T CCC CCC GGG TCT AGA TTA GGA TCC TTC TTG GGC AAT GTA TGA(BamHI部位には下線を施した)[配列番号１０]；セ ンスプライマー、CGT GTA TCC ATA TGA CAC AGA(NdeI部位には下線を施した)[配 列番号１１]。次いで、ＰＣＲ産物をNdeIお よびBamHIで切断し、そしてｐ１９３ＮＳ（ΔＦ）のNdeI/BamHI部位にクローニ ングした。 該プラスミドｐ１９３ＮＳ（ΔＦ）自身を、中間段階の一連のベクターを用い て構築した。すなわち、まず、導入プラスミドｐ１９３ＮＳ８３−１００を、フ ァイバー遺伝子を含有するＡｄ５ゲノムの８３−１００地図単位領域にわたるＡ ｄ５NdeI-SalI断片を、プラスミドｐＮＥＢ１９３（New England Biolabs，Beve rly，MA）にクローニングすることにより構築した。NDeI-MunI断片を、５'NdeI 部位および３'MunI部位にとなりあってBamHI部位を含む合成オリゴヌクレオチド で置換して、クローニングを容易にした。二本鎖合成オリゴヌクレオチド断片を オーバーラップする合成一本鎖センス（すなわち、配列TAT GGA GGA TCC AAT AA A GAA TCG TTT GTG TTA TGT TTC AAC GTG TTT ATT TTT C[配列番号１２]を含む ）およびアンチセンス（すなわち、配列AAT TGA AAA ATA AAC ACG TTG AAA CAT AAC ACA AAC GAT TCT TTA TTG GAT CCT CCA[配列番号１３]を含む）オリゴヌク レオチドから創製した。オーバーラップオリゴマーの末端はNdeIおよびMunI部位 への直接クローニングに適合する突出を有するようにした。得られたベクターｐ １９３ＮＳ（ΔＦ）は、ファイバー遺伝子に関する全てのコード配列を欠損して いるが、完全長アデノウイルスＥ４コード配列を含有する。該プラスミドは合成 NdeI/MunIオリゴヌクレオチドに含まれるAATAAAポリアデニル化シグナルを保有 し、そしてまた、新しいBamHI制限部位を組み込んでいる。 従って、一連の連続的クローニング工程におけるその構築に続いて、該導入ベ クターｐ１９３（Ｆ５^*）をその後のベクター構築に用いた。すなわち、センス オリゴヌクレオチドＦ５Ｆ２Ｋ（ｓ）Ｎ（すなわち、NcoI制限部位を含有する配 列GGC CAT GGC CTA GAA TTT GAT TCA AAC GGT GCC ATG ATT ACT AAA CTT GGA GC G[配列番号１４]を含む）およびアンチセンスオリゴヌクレオチドプライマーＦ ５Ｆ２Ｋ（ａ）Ｂ（すなわち、BamHI制限部位を含有する配列GC GGA TCC TTA TT C CTG GGC AAT GTA GGA[配列番号１５]を含む）を使用して、精製したＡｄ２Ｄ ＮＡ由来のノブコード領域をＰＣＲによって増幅した。ＰＣＲ産物の両端にこれ らの部位を組み込むことにより、NcoIおよびBamHIでそれを切断し、次いで基本( base)プラスミドｐ１９３（Ｆ５^*）にク ローニングして、図４に示す導入ベクターｐ１９３Ｆ５Ｆ２Ｋを創製することを 可能にした。ｐ１９３（Ｆ５^*）とは異なり、ｐ１９３Ｆ５Ｆ２Ｋは、該蛋白質 内の露出ループをコードするＡｄ２ファイバー遺伝子の範囲内にユニークなSpeI 制限部位を含有する。すなわち、ｐ１９３Ｆ５Ｆ２Ｋに存在するファイバー遺伝 子は以下の変異ファイバー配列を含有している。 ここで下線を引いた配列は該ファイバー遺伝子に導入された新規なSpeI部位を示 す。 次いで、このベクターを使用して、ターゲッティング配列をSpeI部位にクロー ニングした。特に、ＦＬＡＧペプチドモチーフＤＹＫＤＤＤＤＫ（すなわち、As p Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys[配列番号２]）をコードする核酸配列およびヘ パリン結合ドメインを含む８個の塩基性アミノ酸ＲＫＫＫＲＫＫＫ（Arg Lys Ly s Lys Arg Lys Lys Lys [配列番号１]）の範囲をコードする核酸配列をオーバー ラップするセンスおよびアンチセンスオリゴヌクレオチドを使用してｐ１９３ Ｆ５Ｆ２ＫのSpeI部位にクローニングした。 すなわち、ＰｏｌｙＧＳ(ＲＫＫＫ)₂配列は以下を含む。 ２７ｍｅｒのセンスオリゴヌクレオチドＰｏｌｙＧＳ（ＲＫＫＫ）₂（ｓ）（ すなわち、配列CT AGA AAG AAG AAA CGC AAA AAG AAG A[配列番号２０]を含む） および２ ７ｍｅｒのアンチセンスオリゴヌクレオチドＰｏｌｙＧＳ(ＲＫＫＫ)₂（ａ）（ すなわち、配列CT AGT CTT CTT TTT GCG TTT CTT CTT T[配列番号２１]を含む） を、ＲＫＫＫＲＫＫＫ[配列番号１７]ペプチドモチーフを含むＰｏｌｙＧＳ(Ｒ ＫＫＫ)₂配列をクローニングするために用いた。このプラスミドを、結合ドメイ ンをコードするＤＮＡ配列をｐ１９３ Ｆ５ＦＫ２のSpeI部位にクローニングす ることにより構築した。まず、結合ドメインをコードするオーバーラップするセ ンスおよびアンチセンスオリゴヌクレオチドをアニーリングさせ、次いでSpeI制 限部位に直接連結させて図５に示すプラスミドｐ１９３ Ｆ５Ｆ２Ｋ（ＲＫＫＫ ２）を得た。 同様に、ＦＬＡＧ配列は以下を含む。 ３０ｍｅｒのセンスオリゴヌクレオチドＦＬＡＧ（ｓ）（すなわち、配列CT AGA GAC TAC AAG GAC GAC GAT GAT AAG A[配列番号２４]を含む）および３０ｍｅｒ のアンチセンスオリゴヌクレオチドＦＬＡＧ（ａ）（すなわち、配列CT AGT CTT ATC ATC GTC GTC CTT GTA GTC T[配列番号２５]を含む）を用いて、ｐ１９３ Ｆ５Ｆ２Ｋ（ＲＫＫＫ２）についてと同様の様式でＦＬＡＧペプチド配列をクロ ーニングし図６に示すプラスミドｐ１９３ Ｆ５Ｆ２Ｋ（ＦＬＡＧ）を得た。 該ＦＬＡＧ配列は抗ＦＬＡＧ Ｍ２抗体（Kodak，New Haven，CT）により認識 され、そして二重特異的抗体（Wickhamら、「二重特異的抗体を用いた内皮およ び平滑筋細胞へのターゲットアデノウイルス遺伝子導入」，J ．Virol.，70(10) ，6831-6838（1996））によるアデノウイルスのターゲッティングに使用される 。該ＲＫＫＫＲＫＫＫ[配列番号１７]ペプチド配列は、細胞のヘパリン硫酸を認 識し、アデノウイルスを細胞上のヘパリン硫酸含有受容体にターゲッティングす るために使用される。ヘパリン硫酸部分は、ほとんど全ての哺乳類細胞上に発現 しているので、非修飾（すな わち、野生型）アデノウイルスベクターと比較すると、該ヘパリン結合モチーフ によりＡｄＦ２Ｋ（ＲＫＫＫ２）は広範な細胞に結合し、形質導入することが可 能となる。 該プラスミドｐ１９３ Ｆ５Ｆ２Ｋ（ＲＫＫＫ２）およびｐ１９３ Ｆ５Ｆ２Ｋ （ＦＬＡＧ）が正しい挿入部を含有することをプラスミドの制限消化により生じ るＤＮＡ断片について行われるＰＣＲ分析および移動度シフトアッセイを使用し て確認した。すなわち、ｐ１９３ Ｆ５Ｆ２Ｋ（ＲＫＫＫ２）に存在するファイ バーノブの修飾ループの関連部分は以下の通りである。 ｐ１９３ Ｆ５Ｆ２Ｋ（ＦＬＡＧ）に存在するファイバーノブの修飾ループの関 連部分は以下の通りである。 本発明の別の実施態様において、さらなる変異ファイバー蛋白質を位置指定突 然変異誘発により創製した。プライマーを合成し、Ａｄ５ファイバーノブのＣＤ 、ＦＧ、およびＩＪループのアミノ酸をコードするＤＮＡ配列を置換した。より 詳細には、アミノ酸配列ＳＧＴＶＱ[配列番号８１]（天然Ａｄ５ファイバーノブ のＣＤループのアミノ酸４４９−４５３）をコードする配列を、プラスミドｐＡ ｃＳＧ２ Ｆ５ＫＮの位置指定突然変異誘発（Roelvinkら、以下のプライマーを 使用する ）を実施することによりアミノ酸配列Gly Ser Gly Ser Gly[配列番号８２]をコ ードするＤＮＡに置換した。同様に、位置指定突然変異誘発のための適当なプラ イマーを使用して、ＦＧループのアミノ酸配列Ser His Gly Lys Thr Ala [配列 番号８６]（アミノ酸５０７−５１２）およびＩＪループのSer Gly His Asn[配 列番号８７]（アミノ酸５５９−５６２）を、Gly Ser Gly Ser Gly Ser[配列番 号８８]およびGly Ser Gly Ser[配列番号８９]でそれぞれ置換した。得られた変 異ファイバーノブ遺伝子を含有するバキュロウイルス導入ベクターを使用して、 組換えバキュロウイルスを作製した。該組換えバキュロウイルスを使用して、変 異を含有する組換えファイバーノブ蛋白質を作製した。得られた蛋白質は完全に 可溶性であることが見出され、このことは、当該蛋白質が正確に三量体へとフォ ールディングされていることを示している。さらに、該可溶性蛋白質を使用して 、アデノウイルスの細胞への結合を阻害した。これは、ファイバー遺伝子におけ る置換がファイバー受容体への結合を邪魔しなかったことを示している。 従って、これらの結果は、本明細書に記載する方法がアデノウイルスファイバ ー蛋白質のノブ領域の露出ループにおいて種々のペプチドモチーフの挿入部を有 するファイバー配列をコードする導入ベクターを構築するために用いられ得るこ とを立証する。 実施例２ 本実施例において、アデノウイルスファイバー蛋白質のノブ領域のループ内に 種々のペプチドモチーフの挿入部を有するファイバー配列をコードするアデノウ イルスベクターの構築について述べる。 導入プラスミドｐ１９３ Ｆ５Ｆ２Ｋ（ＲＫＫＫ２）およびｐ１９３ Ｆ５Ｆ２ Ｋ（ＦＬＡＧ）を用いて、ＦＬＡＧおよびＲＫＫＫ２ペプチドモチーフを含む対 応するアデ ノウイルスベクターを得た。これは、これらのプラスミド（これらはアデノウイ ルスの必須のＥ４領域を含有する）をSalIで消化して、次いで１時間前にすでに アデノウイルスベクターＡｄＺ.Ｅ４Ｇｕｓに感染させておいた２９３細胞にそ れらをトランスフェクトすることによって行った。このアデノウイルスベクター は、Ｅ４領域を欠損しており、そしてＥ４遺伝子なしでは２９３細胞において複 製できない。ＡｄＺ.Ｅ４Ｇｕｓ ＤＮＡが、ｐ１９３ Ｆ５Ｆ２Ｋ、ｐ１９３ Ｆ ５Ｆ２Ｋ（ＦＬＡＧ）、およびｐ１９３ Ｆ５Ｆ２Ｋ（ＲＫＫＫ２）のようなプ ラスミドＤＮＡと組換えをおこしてＥ４遺伝子を得る場合にのみ、該ベクターは ２９３細胞内で複製し得る。アデノウイルスベクターを救済するためのこの組換 えの間に、新たに形成したベクターもまた該プラスミドによってコードされてい る変異ファイバー配列を獲得する。 Ｆ２Ｋ（ＲＫＫＫ２）およびＦ２Ｋ（ＦＬＡＧ）ＤＮＡ配列（すなわち、Ａｄ Ｚ.ＦＬＡＧおよびＡｄＺ.ＲＫＫＫ２）を含有する生育可能な組換えＥ４⁺アデ ノウイルスを、トランスフェクションの５日後に該トランスフェクトされた細胞 の溶菌物をプラーク形成させることにより単離した。次いで、該組換えアデノウ イルスを２９３細胞で２回プラーク精製した。該精製したプラークを２９３細胞 で増殖させた。感染から２日後、３回の凍結−融解のサイクル、次いでＣｓＣｌ 勾配で２回連続してバンドを形成させる（banding）ことにより感染細胞から全 てのウイルスを精製した。精製ウイルスを１０ｍＭ ＭｇＣｌ₂、３％ショ糖を含 有する１０ｍＭトリス、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．８に対して透析し、そ して使用時まで−８０°で凍結した。該精製ウイルスがＲＫＫＫ２挿入部または ＦＬＡＧ挿入部のどちらかを含有することをＰＣＲにより確認した。 これらのアデノウイルスベクターならびにそれらが修飾ファイバーノブを所有 することによって特異的に標的とする配列を表１に示す。 表１ 束縛ペプチドモチーフを含むアデノウイルスベクター 従って、これらの結果は、本明細書に記載の方法がアデノウイルスファイバー 蛋白質のノブ領域の露出ループ内に種々のペプチドモチーフの挿入部を有するフ ァイバー配列をコードするアデノウイルスベクターを構築するために用いられ得 ることを立証する。 実施例３ 本実施例において、アデノウイルスファイバー蛋白質のノブ領域のループにお いて種々のペプチドモチーフの挿入部を有するファイバー配列をコードするアデ ノウイルスベクターの特徴付けについて述べる。 ＡｄＺ.ＦＬＡＧベクターに存在するＦＬＡＧ挿入部は、以前に記載されてい るように（Wickhamら、1993）、免疫蛍光法により評価されるが如く機能的に接 近可能であり、且つ抗ＦＬＡＧＭ２ｍＡｂに結合可能であることがわかった。簡 単に言えば、２９３細胞をＡｄＺ.ＲＫＫＫ２またはＡｄＺ.ＦＬＡＧ単離物を用 いて低感染多重度（すなわち、約０.０２ＭＯＩ）で感染させた。該細胞を感染 の２日後に固定し、次いでウサギ抗ペントンベースポリクローナル抗体またはマ ウス抗ＦＬＡＧ ｍＡｂのどちらか一方と共にインキュベートし、続いて抗ウサ ギまたは抗マウスＦＩＴＣ抗体と共にインキュベートした。抗ペントンベース抗 体は、いずれのウイルスにより感 染した細胞も認識した。対照的に、該ＦＬＡＧ ｍＡｂは、ＡｄＺ.ＦＬＡＧウイ ルスで感染した細胞のみを認識し、ＡｄＺ.ＲＫＫＫ２ウイルスで感染した細胞 は認識しなかった。 これらの結果は、本発明の方法に従って作り出されたアデノウイルスは生育可 能であり、そしてファイバー蛋白質の露出ループに存在する挿入部（例えば、Ｆ ＬＡＧエピトープ）はその対応する結合物（例えば、細胞表面結合部位または抗 ＦＬＡＧ抗体のような抗体）に接近可能であり、そして結合可能であることを立 証する。これらの結果は、本発明の方法がアデノウイルス介した細胞ターゲッテ ィングに用いられ得ることを立証する。 実施例４ 本実施例において、アデノウイルスファイバー蛋白質のノブ領域の露出ループ 内に種々のペプチドモチーフの挿入部を有するファイバー配列をコードするアデ ノウイルスベクターにより仲介される遺伝子送達について述べる。 細胞ターゲッティングをもたらすＲＫＫＫ２モチーフの能力を試験するために 、２９３細胞（かなり高レベルの受容体（それによって野生型アデノウイルスフ ァイバー蛋白質の細胞侵入がもたらされる）を発現している様に思われる）を競 合する野生型ファイバー蛋白質の存在下および非存在下で３０分間予備インキュ ベートした。次いで、精製したＡｄＺまたはＡｄＺ.ＲＫＫＫ２ベクターを該細 胞と共にさらに６０分間３７℃でインキュベートした。該細胞をＰＢＳで３回洗 浄し、そして培養培地で終夜インキュベートした。次いで、溶菌した細胞由来の β−ガラクトシダーゼ活性をβ−ガラクトシダーゼ蛍光アッセイキット（Tropix ，Bedford，MA）を使用して測定した。活性はルミノメーターを用いて相対光単 位(relative light unit)（ＲＬＵ）で測定した。 図７に示すデータは、ＡｄＺ.ＲＫＫＫ２ベクターによりもたらされる２９３ 細胞への遺伝子送達を示す。この図から分かるように、組換え野生型ファイバー 蛋白質はＡｄＺによる遺伝子送達は阻害したが、ＡｄＺ.ＲＫＫＫ２によるもの は阻害しなか った。該ＡｄＺ.ＲＫＫＫ２ベクターはアデノウイルスが仲介する遺伝子送達に 対するファイバー介在性の阻害を克服することが可能であった。 これらの結果は、ファイバーループに存在するこの束縛ペプチドモチーフが細 胞結合／侵入を効率的に仲介し得ることを立証する。さらに、該結果は、アデノ ウイルスファイバー蛋白質のノブの露出ループ内に種々のペプチドモチーフの挿 入部を有するファイバー配列をコードするアデノウイルスベクターが、細胞への 送達（例えば、ＤＮＡおよび／または蛋白質の送達）に用いられ得ることを立証 する。 実施例５ 本実施例においては、非天然アミノ酸配列をキメラアデノウイルスファイバー 蛋白質、好ましくは該アデノウイルスファイバーノブの露出ループ内に、それだ けでなく該蛋白質のＣ末端に挿入するためにも使用され得る他のオリゴヌクレオ チドについて述べる。 先の実施例に記載したクローニング技術を、ファイバーノブの露出ループに、 例えば、α_vインテグリン、α₅β₁インテグリン、ＦＬＡＧ ｍＡｂ、または他の 細胞表面結合部位をターゲッティングするであろうペプチドモチーフを含む挿入 部を組み込むために使用することができる。 特に、ＨＡαｖ配列が挿入され得る。この配列は以下を含む。該配列は、３９ｍｅｒのセンスオリゴヌクレオチドＨＡｃｔｖ（ｓ）（すなわち 、配列CT AGA GCC TGC GAC TGT CGC GGC GAT TGT TTT TGC GGT A[配列番号３２] を含む）および３０ｍｅｒのアンチセンスオリゴヌクレオチドＨＡαｖ（ａ）（ すなわち、配列CT AGT ACC GCA AAA ACA ATC GCC GCG ACA GTC GCA GGC T[配列 番号３３]を含む） を使用して挿入され得る。これらのオリゴヌクレオチドを使用して、ＡｄＺ.Ｒ ＧＤを作製するために使用するｐ１９３（Ｆ５^*）ｐＧＳ（ＲＧＤ）を作製した 。 同様に、インテグリンα₅β₁に対するターゲッティングを可能にするＨＡα₅ β₁配列を挿入することができる。この代表的な配列は以下を含む。 該配列は、３９ｍｅｒのセンスオリゴヌクレオチドＨＡα₅β₁（ｓ）（すなわち 、配列CT AGA TGC CGC CGC GAA ACC GCT TGG GCC TGT A[配列番号３６]を含む） および３９ｍｅｒのアンチセンスオリゴヌクレオチドＨＡα₅β₁(ａ)（すなわち 、配列CT AGT ACA GGC CCA AGC GGT TTC GCG GCG GCA T[配列番号３７]を含む） を使用して挿入することができる。 α_vインテグリンに対するターゲッティングを可能にするこれらの配列(および 本明細書に記載する他の配列)は、この標的受容体が内皮細胞および平滑筋細胞 への分布を含めて広範な分布を示すので有用である。該接着受容体は、負傷（す なわち、その治療および悪化の両方）、ならびに血管新生、再狭窄および転移に おいて重要であるように思われる。一般に、該受容体は内皮細胞および平滑筋細 胞の増殖において上向きに制御され、そして黒色腫および膠腫において高度の発 現を示す。α_vインテグリン受容体に対する通常のリガンドとしては、ビトロネ クチン、コラーゲン、フィブロネクチン、ラミニン、およびオステオポンチンが 挙げられる。 また、Ｅ−セレクチンターゲッティング配列も挿入され得る。代表的な配列は 以下を含む。 エラスチンに結合するさらなるリガンドは、当該分野において記載されており、 そして本明細書に記載するようにペプチドモチーフ調製用の非天然アミノ酸配列 として同様に用いられ得る（例えば、MartensらJ ．Biolog．Chem.，270，21129- 21136(1995)を参照）。該Ｅ−セレクチン配列は、４２ｍｅｒのセンスオリゴヌ クレオチドＥ−セレクチン（ｓ）（すなわち、配列CT AGA GAC ATT ACC TGG GAC CAG CTT TGG GAC CTT ATG AAG A[配列番号４０]を含む）および４２ｍｅｒのア ンチセンスオリゴヌクレオチドＥ−セレクチン（ａ）（すなわち、配列CT AGT C TT CAT AAG GTC CCA AAG CTG GTC CCA GGT AAT GTC T[配列番号４１]を含む）を 使用して挿入され得る。 さらに、ＰｏｌｙＧＳ(ＲＫＫＫ)₃配列、またはこの配列の他のバリエーショ ンが挿入され得る。この配列は以下を含む。 該配列は、３９ｍｅｒのセンスオリゴヌクレオチドＰｏｌｙＧＳ（ＲＫＫＫ）₃ （ｓ）（すなわち、配列CT AGA AAG AAG AAG CGC AAA AAA AAA AGA AAG AAG AAG A[配列番号４４]を含む）および３９ｍｅｒのアンチセンスオリゴヌクレオチド ＰｏｌｙＧＳ（ＲＫＫＫ）₃（ａ）（すなわち、配列CT AGT CTT CTT CTT TCT TT T TTT TTT GCG CTT CTT CTT T[配列番号４５]を含む）を使用して挿入され得る 。 従って、本実施例は、非天然アミノ酸配列をファイバー蛋白質に挿入するため に他のオリゴヌクレオチドを使用できることを立証する。そのような挿入は、ア デノウイルスファイバーノブの露出ループ内か、または以下に記載するようにフ ァイバー蛋白質のＣ末端でなされ得る。さらに、該非天然アミノ酸配列は、単な る配列への挿入としてだけではなく、アデノウイルス配列の置換としてもキメラ ファイバー蛋白質に組 み込まれ得る。これは、当業者にとって公知であるように、本明細書に記載する クローニング手順の改変を通じて行われ得る。 実施例６ アデノウイルスファイバー蛋白質の露出ループにペプチドモチーフを配置する こにより得られる束縛に類似した様式で、束縛はファイバー蛋白質のＣ末端でペ プチドモチーフを適当に修飾することによって得ることができ、この部位に本質 的には元来存在しないループを作り出すことができる。従って、本実施例におい ては、アデノウイルスファイバー蛋白質のＣ末端において種々の束縛ペプチドモ チーフの挿入部を有するファイバー配列をコードする導入ベクターの構築につい て述べる。この方法を図２に示す。 実施例１に記載した導入ベクターｐ１９３（Ｆ５^*）を基本プラスミドとして 使用して、ファイバー遺伝子のＣ末端への付加物を含有するキメラアデノウイル ス粒子を作製した。特に、ターゲッティング配列に続くリンカー配列をコードす るＤＮＡ配列および終止コドンをBamHI部位にクローニングして、さらなる導入 ベクターを作製した。続いて、これを使用して（すなわち、さらなる導入ベクタ ーｐ１９３（Ｆ５）ｐＧＳ（ＲＧＤ）およびｐ１９３（Ｆ５）ｐＧＳの構築を介 して）、キメラアデノウイルス粒子を作製した。 アミノ酸グリシン／セリン繰り返しリンカー、ターゲッティング配列および終 止コドンをコードする配列を含有する変異導入プラスミドを、合成オリゴヌクレ オチドをｐ１９３（Ｆ５^*）のBamHI部位にクローニングすることによって作製し た。該クローニング反応を実質的に実施例１に記載したようにして実施した。特 に、図８に示す導入プラスミドｐ１９３（Ｆ５）ｐＧＳ（ＲＧＤ）を作製するた めに使用したオーバーラップ合成オリゴヌクレオチドは以下の通りであった：セ ンス、GA TCA GGA TCA GGT TCA GGG AGT GGC TCT GCC TGC GAC TGT CGC GGC GAT TGT TTT TGC GGT TAA G[配列番号４６]；アンチセンス、GA TCC TTA ACC GCA A AA ACA ATC GCC GCG ACA GTC GCA GGC AGA GCC ACT CCC TGA ACC TGA TCC T[配 列番号４７]。このプラスミドは、アミノ酸 配列Ala Gln Glu Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Ala Cys Asp Cys Arg Gly Asp Cys Phe Cys Gly ***[配列番号４９]（ここで***は終止コドンを意 味する）をコードする核酸配列GCC CAA GAA GGA TCA GGA TCA GGT TCA GGG AGT GGC TCT GCC TGC GAC TGT CGC GGC GAT TGT TTT TGC GGT TAA GGA TCC AAT AA[ 配列番号４８]を含む。ＲＧＤペプチドは、このより長い配列の範囲内に存在す る。従って、該プラスミドｐ１９３（Ｆ５）ｐＧＳ（ＲＧＤ）は、より長い配列 Ser Ala Cys Asp Cys Arg Gly Asp Cys Phe Cys Gly[配列番号７９]に存在する ターゲッティング配列ＣＤＣＲＧＤＣＦＣ（すなわち、Cys Asp Cys Arg Gly As p Cys Phe Cys[配列番号３]）を含む。この配列は、先に記載したトリペプチド モチーフＲＧＤを含有する他の配列のように、標的受容体α₅インテグリンに対 するリガンドとして作用する。しかしながら、ＲＧＤの高度に束縛された形態は 、直線状形態よりもより高い親和性でインテグリンに結合する（例えば、Aumail leyら、FEBS，291，50-54（1991）;CardarelliらJ ．Biolog．Chem.，269.，1866 8-18673（1994）；KoivunenらBio/Technology，13，265-270（1995）を参照）。 同じ様にして、ｐ１９３（Ｆ５）ｐＧＳ（ＲＧＤ）に存在する束縛されたＲＧＤ ターゲッティングモチーフは、類似の直線状ＲＧＤモチーフよりも約１００倍高 い親和性でα_vインテグリンに結合する。ＲＧＤの両側でジスルフィドを形成す るシステインの各対は、反対側のシステインの対と結合して、高度に束縛された ＲＧＤループを形成する。 さらに、ＣＲＣＲＧＤＣＦＣ[配列番号３]ターゲッティング配列のバリエーシ ョンを本発明において使用することができる。例えば、ＲＧＤトリペプチド配列 の両側の２個のシステイン残基ではなく、１個の残基のみが代わりに使用され得 る。ループ様構造がＲＧＤ配列を含んで作り出される限り、そして該配列が１つ またはそれ以上のシステインの対を含む限り、いかなる配列も使用可能である。 さらに、該ＲＧＤ配列は、別の配列（例えば、ＬＤＶ）により代用され得る。 関連する導入プラスミドｐ１９３（Ｆ５）ｐＧＳの構築に関して、該導入プラ スミドを作製するために使用されるオーバーラップ合成オリゴヌクレオチドは以 下の通りであった：センス、ＰｏｌｙＧＳ（s）、GA TCC GGT TCA GGA TCT GGC AGT GGC TCG ACT AGT TAA A[配列番号５０]；アンチセンス、ＰｏｌｙＧＳ（a）、GA TCT TTA ACT AGT CGA GCC ACT GCC AGA TCC TGA ACC G[配列番号５１]。該センスおよび アンチセンスオリゴヌクレオチドを等モル比で混合し、次いでｐ１９３（Ｆ５^* ）のBamHI部位にクローニングして、ｐ１９３（Ｆ５）ｐＧＳを創製した。次い で、該導入ベクターｐ１９３（Ｆ５）ｐＧＳを使用して、以下の実施例に記載す るようにさらなる導入ベクターを構築した。 従って、本実施例は、アデノウイルスファイバー蛋白質のＣ末端において種々 の束縛ペプチドモチーフの挿入部を有するファイバー配列をコードする導入ベク ターが本発明に従って構築され得ることを立証する。また、他の導入ベクター（ すなわち、異なるターゲッティング配列を有する）もこのアプローチを使用して 構築され得る。 実施例７ 本実施例において、アデノウイルスファイバー蛋白質のＣ末端において種々の 束縛されたペプチドモチーフ挿入部を有するファイバー配列をコードするアデノ ウイルスベクターの構築について述べる。 これらの実験に用いるＥ１−およびＥ３−欠損アデノウイルスＡｄＺは、サイ トメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターの制御下にあって、かつアデノウイル スゲノムに組み込まれたβ-ガラクトシダーゼ遺伝子を含有する。ＡｄＺをヒト 胎児腎２９３細胞（ウイルス増殖のための相補的Ｅ１領域を含有する）中で増殖 させた。ＡｄＺ.ＲＧＤ（および本明細書に記載する他の接着受容体を標的とし た他のベクター）をＡｄＺから直接誘導した。同様に、これらのウイルスはＥ１ −およびＥ３−欠損であって、かつファイバー蛋白質のＣ末端において付加アミ ノ酸が存在することを除いてはＡｄＺと一致する。 アデノウイルスの必須のＥ４領域を含有する導入プラスミドｐ１９３（Ｆ５ ）ｐＧＳおよびｐ１９３（Ｆ５）ｐＧＳ（ＲＧＤ）をアデノウイルスベクターの 構築に用いた。これらの導入プラスミドをSalIで切断し、次いで１時間前にアデ ノウイルスベクター（ＡｄＺ.Ｅ４Ｇｕｓ）で感染させておいた２９３細胞にト ランスフェクト した。該アデノウイルスベクターＡｄＺ.Ｅ４Ｇｕｓは、Ｅ４領域を欠損してお り、Ｅ４遺伝子なしでは２９３細胞中で複製できない。ＡｄＺ.Ｅ４ＧｕｓＤＮ Ａが、ｐ１９３（Ｆ５）ｐＧＳまたはｐ１９３（Ｆ５）ｐＧＳ（ＲＧＤ）プラス ミドＤＮＡと組換えを行いＥ４遺伝子を得る場合のみ、該ベクターは２９３細胞 中で複製し得る。この組換えの間、新たに形成したベクターもまた該プラスミド にコードされるファイバー変異を獲得する。次いで、ｐＧＳおよびｐＧＳ（ＲＧ Ｄ）変異を含有する生育可能な組換えＥ４⁺アデノウイルスを、トランスフェク ションの５日後、トランスフェクトされた細胞の溶菌物をプラーク形成を行うこ とにより単離した。それらの得られたベクター（ＡｄＺ.ｐＧＳおよびＡｄＺ.Ｒ ＧＤ）を単離し、次いで２９３細胞内で２ラウンドの連続的なプラーク形成を行 って精製した。各ベクターが正しい挿入部を含有することを挿入ＤＮＡの領域に わたるウイルスＤＮＡ由来のＰＣＲ産物をシークエンシングすることにより確認 した。 本実施例は、アデノウイルスファイバー蛋白質のＣ末端において種々の束縛ペ プチドモチーフの挿入部を有するファイバー配列をコードするアデノウイルスベ クターが本発明に従って構築され得ることを立証する。 実施例８ 本実施例において、キメラアデノウイルスファイバー蛋白質、好ましくはアデ ノウイルスファイバーノブの露出ループ内に、また該蛋白質のＣ末端に、非天然 アミノ酸配列を挿入するのに使用し得る他のオリゴヌクレオチドを用いた導入ベ クターおよびアデノウイルスベクターの構築について述べる。 実施例６に記載したクローニング技術を用いて、Ｃ末端における付加物を創製 した。基本的には、本実施例に記載する導入ベクター（特に、導入ベクターｐ１ ９３（Ｆ５）ｐＧＳ）を、該ベクターに存在するユニークなクローニング部位Sp eIにおいて直線状にし、次いで新しい配列をこの部位に挿入した。他の手段（例 えば、ＰＣＲ反応）もまたこのユニークな部位への挿入に使用することができる 。同様に、実施例５に記載したクローニング技術を、ファイバーノブの露出ルー プ内に、他の細胞表面結 合部位または抗体に対するエピトープをターゲッティングするペプチドモチーフ を含む挿入部を組み込むために用いることができる。 特に、ＲＧＤ配列の多コピー（multiple copies）（すなわち、ｐｏｌｙ．Ｒ ＧＤまたはｐＲＧＤ配列）を挿入した。この配列は以下を含む。 該配列は、センスオリゴヌクレオチドｐ.ＲＧＤs（すなわち、配列CT AGT GGA A GA GGA GAT ACT TTT GGC CGC GGC GAC ACG TTC GGA AGG GGG GAT ACA TTT T[配 列番号５４]を含む）およびアンチセンスオリゴヌクレオチドｐ.ＲＧＤａ（すな わち、配列CT AGA AAA TGT ATC CCC CCT TCC GAA CGT GTC GCC GCG GCC AAA AGT ATC TCC TCT TCC A[配列番号５５]を含む）を使用して挿入され得る。 得られたプラスミドｐ１９３（Ｆ５^*）ＲＧＤを用いてアデノウイルスＡｄＺ. ｐＲＧＤを創製した。ＡｄＺ.ＲＧＤおよびＡｄＺ.ｐＲＧＤ（これらは太字で示 すＲＧＤペプチドを有する）に存在する挿入部の比較を表２に示す。 表２ アデノウイルスベクター ＡｄＺ.ＲＧＤおよびＡｄＺ.ｐＲＧＤの比較 同様に、ＬＤＶターゲッティング配列の１つまたはそれ以上のコピーが挿入さ れ得る。該ＬＤＶ標的受容体は、造血細胞、リンパ球、および単球／マクロファ ージに分 布する。該接着受容体は、細胞−マトリックスおよび細胞−細胞相互作用（例え ば、造血滲出、ならびに炎症、およびリンパ球の移動（trafficking）の間）に 関与する休止状態のリンパ球上に高度に発現する。α₄インテグリン標的受容体 に対するリガンドとしては、フィブロネクチン（細胞外マトリックス蛋白質）、 ＶＣＡＭ−１（内皮組織を標的にする）、およびＭＡｄＣＡＭ（α₄β₇）（これ は腸特異的である）が挙げられるが、それらに限定されない。特に、α₄インテ グリンターゲッティング配列は、配列ＥＩＬＤＶＰＳＴ（すなわち、上記配列に 含まれるGlu Ile Leu Asp Val Pro Ser Thr[配列番号５６]、および配列(ＥＩＬ ＤＶＰＳ)₃（すなわち縦に一列になった３コピーのペプチドモチーフＥＩＬＤＶ ＰＳ[配列番号８０]、つまりGlu Ile Leu Asp Val Pro Ser Glu Ile Leu Asp Va l Pro Ser Glu Ile Leu Asp Val Pro Ser）[配列番号５７]を含む。 特に、多コピーのＬＤＶ配列（すなわち、ｐｏｌｙＬＤＶまたはｐＬＤＶ配列 ）が挿入され得、以下の配列を含み得る。 この配列を、センスオリゴヌクレオチドｐＬＤＶｓ（すなわち、配列CT AGT GAA ATT CTT GAC GTC GGA GAG ATC CTC GAC GTC GGG GAA ATA CTG GAC GTC T[配列 番号６０]を含む）およびアンチセンスオリゴヌクレオチドｐＬＤＶａ（すなわ ち、配列CT AGA GAC GTC CAG TAT TTC CCC GAC GTC GAG GAT CTC TCC GAC GTC A AG AAT TTC A[配列番号６１]を含む）を使用して挿入した。 このような挿入は、図９に示すベクターｐ１９３（Ｆ５）ｐＬＤＶを生み出し た。このベクターに存在するＬＤＶターゲッティングモチーフ（すなわち、配列 番号５９の配列を含む）は、ミリモーラーより低い親和性でα₄インテグリンに 結合する。該ＬＤＶモチーフは、各ファイバー単量体において、ファイバー分子 当たり合計９モチー フになるように３回繰り返されている。このベクターを、対応するアデノウイル スベクターの調製にさらに用いた。 さらに、ｐＹＩＧＳＲターゲッティング配列をファイバー蛋白質のＣ末端に挿 入して、図１０に示すプラスミドｐ１９３（Ｆ５）ｐＹＩＧＳＲを誘導した。こ のプラスミドにおいてファイバー蛋白質は以下のアミノ酸配列を含む。 該配列をセンスオリゴヌクレオチドｐＹＩＧＳＲｓ（すなわち、配列CT AGT GGA TAC ATC GGC AGT CGC GGT TAC ATT GGG TCC CGA GGA TAT ATA GGC TCA AGA T[ 配列番号６４]を含む）およびアンチセンスオリゴヌクレオチドｐＹＩＧＳＲａ （すなわち、配列CT AGA TCT TGA GCC TAT ATA TCC TCG GGA CCC AAT GTA ACC G CG ACT GCC GAT GTA TCC A[配列番号６５]を含む）を使用して挿入した。 得られたプラスミドは、ミリモーラーより低い親和性で、高親和性ラミニン受 容体に結合するＹＩＧＳＲ[配列番号６６]（すなわち、配列Tyr Ile Gly Ser Ar g[配列番号６６]を含む）ターゲッティングモチーフを含有する。ＹＩＧＳＲＧ （すなわち、配列Tyr Ile Gly Ser Arg Gly[配列番号６７]を含む）として存在 するＹＩＧＳＲ[配列番号６６]モチーフは、各ファイバー単量体において、ファ イバー分子当たり合計９モチーフになるように３回繰り返されている。特に、Ｙ ＩＧＳＲ[配列番号６６]モチーフは、６７キロダルトンのラミニン／エラスチン 受容体へのターゲッティングを提供する。この受容体は、単球／好中球、血管平 滑筋、線維芽細胞、および軟骨細胞に存在し、そして多発性腫瘍において上向き に制御されている。さらに、該受容体は、腫瘍転移および血管新生に関与するよ うに思われる。ラミニン／エラスチン受容体に対する通常のリガンドとしては、 ラミニン、エラスチン、およびガラクトースが 挙げられる。本明細書で誘導したｐ１９３（Ｆ５）ｐＹＩＧＳＲプラスミドをさ らに用いてアデノウイルスベクターＡｄＺ.ｐＹＩＧＳＲを創製した。 従って、本実施例は、他のオリゴヌクレオチドが、ファイバー蛋白質に非天然 アミノ酸配列を挿入するために使用できることを立証する。このような挿入は、 アデノウイルスファイバーノブの露出ループ内か、または以下に記載するように 、ファイバー蛋白質のＣ末端かのいずれかでなされ得る。さらに、該非天然アミ ノ酸配列は、単に該配列への挿入としてだけでなく、アデノウイルス配列の置換 としてキメラファイバー蛋白質に組み込まれ得る。これは、当業者に公知のよう な本明細書に記載したクローニング手順の単なる改変を通じてなされ得る。 実施例９ 本実施例において、アデノウイルスファイバー蛋白質のＣ末端において束縛さ れたＲＧＤペプチドモチーフの挿入部を有するファイバー配列をコードするアデ ノウイルスベクターの特徴付けについて述べる。特に、異なる細胞におけるこれ らのベクターの活性ウイルス粒子を産生する能力について調べた。 ウイルス粒子のウエスタン分析については、容積１０μｌの精製したウイルス 粒子（２×１０¹⁰）をレムリ泳動用緩衝液で１：１に希釈し、そして９％アクリ ルアミド、０．１％ＳＤＳゲルに付した。該ゲルを１５０ｍＶで泳動し、次いで ニトロセルロースに転写した。該ニトロセルロースを５％ドライミルクでブロッ キングし、そして変性させたＡｄ５ビリオンに対するウサギポリクローナル抗体 （１：１０００）ならびにファイバー蛋白質に対するウサギポリクローナル抗体 （１：５０００）を組み合わせて用い調べた。該蛋白質を抗ウサギ−ペルオキシ ダーゼ（１：５０００）および市販のケミルミネッセント検出キットを用いて検 出した。 ウエスタンにおいて組換えアデノウイルス（ＡｄＺ.ｐＧＳおよびＡＤＺ.ＲＧ Ｄ）のファイバー蛋白質は、ＡｄＺベクターにより含有されるファイバー蛋白質 に対して、上方にシフトした。ニトロセルロースに転写し、そしてファイバー蛋 白質に対するポリクローナル抗体のみを使用して調べた、同時に流したゲルから 、ウエスタン分 析においてシフトしたバンドが、事実、ファイバー蛋白質であることが実証され た。これらの結果は、ＡｄＺ.ｐＧＳおよびＡｄＺ.ＲＧＤファイバー蛋白質が適 当なアミノ酸挿入部を含有することを立証する。 ウイルス産生速度を測定することにより、生育可能なアデノウイルスが本発明 の種々のアデノウイルスベクターで感染させた２９３細胞中で産生されているこ とを確かめた。これらの研究を実施するために、放射標識したアデノウイルスを 、５ＭＯＩで細胞を感染させて２０時間後、感染細胞の培地に５０μＣｉ／ｍｌ の[³Ｈ]チミジン（Amersham，Arlington Heights，IL）を添加することにより作 製した。次いで、該感染細胞を感染の６０時間後に収穫し、次いで該ウイルスを 先に記載したように精製した。標識ウイルスの活性は、およそ１０⁴ウイルス粒 子／ｃｐｍであった。感染性粒子を２９３細胞での蛍光フォーカスアッセイを使 用して蛍光フォーカス単位（ｆｆｕ）で力価を測定した。 感染２９３細胞での活性ウイルス粒子産生速度を、０日目に１時間、６ｃｍの プレート中で１０ＭＯＩでＡｄＺまたはＡｄＺ.ＲＧＤのいずれかを０．２ｍｌ 用いて１０⁶個の２９３細胞を感染させることにより測定した。該細胞を感染後 １、２、および３日目に収穫した。該細胞を遠沈し、次いで１ｍｌのＰＢＳ中に ＡｄＺおよびＡｄＺ.ＲＧＤについて再懸濁した。該細胞を３回凍結および融解 させて、ウイルス粒子を放出させた。次いで、該ライセートを、標準的技術を使 用して細胞当たりの産生した活性粒子の数について調べた。これらの実験の結果 （図１１に示す）は、ＡｄＺ.ＲＧＤにおけるファイバー蛋白質に対する修飾は 、非修飾ベクターＡｄＺと比較して、活性ウイルス粒子の産生には有意に影響し ないことを立証する。 Ａ５４９上皮細胞、ＣＰＡＥ内皮細胞、およびヒト腸管平滑筋細胞（ＨＩＳＭ ）におけるベクターＡｄＺおよびＡｄＺ.ＲＧＤの粒子用量−反応を同様にして 調べた。ＨＩＳＭＣ細胞、ＣＰＡＥ細胞、またはＡ５４９細胞（５×１０⁵細胞 ／ウェル）を実験の１〜２日前に６ｃｍのプレートに蒔いた。ファイバー受容体 を発現している細胞における該ベクター用量−反応を評価するアッセイにおいて 、ＡｄＺまたはＡｄＺ.ＲＧＤ粒子の濃度を徐々に増やしたものを該細胞と共に ６０分間３７℃にて、０． ２ｍｌ ＤＭＥＭ＋２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ中でインキュベートした。該プレートを このインキュベーションの間１０分毎に振盪させた。次いで、該細胞を２回ＤＭ ＥＭで洗浄し、ついでＤＭＥＭ＋５％仔ウシ血清中で２〜３日間３７℃にて培養 した。次いで、該培地を吸引し、そして該細胞を１ｍｌの１Ｘレポーターライシ ス緩衝液＋１０ｍＭ ＥＤＴＡ（Promega，Madison，WI）中で溶かした。次いで 、細胞ライセート中のβ−ガラクトシダーゼ活性を先に記載したように測定した 。結果は二回の測定の平均である。 これらの実験結果を図１２−１４に示す。これらの実験は、ＡｄＺおよびＡｄ Ｚ.ＲＧＤベクターが、アデノウイルスファイバー受容体を高レベルで発現する ことが知られている細胞（Ａ５４９）（すなわち、図１２に表わすようなＡ５４ ９細胞）に侵入し、そして生育可能なウイルス粒子を産生するそれらの能力に関 して、同等であることを立証する。しかしながら、有意なレベルでのアデノウイ ルスファイバー受容体は欠損しているが、α_vインテグリンを発現するＣＰＡＥ 細胞およびＨＩＳＭ細胞については（すなわち、それぞれ図１３および図１４に 表わす）、ＡｄＺ.ＲＧＤベクターは、形質導入において、非修飾（ＡｄＺベク ター）よりもはるかに効率的である。ＡｄＺ.ＲＧＤによるＣＰＡＥ細胞および ＨＩＳＭ細胞の形質導入は、広範囲のベクター濃度にわたって、ＡｄＺよりもそ れぞれ、おおよそ１００倍および３０倍高い。 これらの結果は、本発明のアデノウイルスベクターに存在するアミノ酸挿入部 が、キメラアデノウイルスファイバー蛋白質において適切に翻訳され、且つ得ら れるキメラファイバー蛋白質が、この蛋白質を含有する生育可能なアデノウイル スの産生により評価されるように、機能的であることを確認する。さらに、該結 果は、キメラファイバー蛋白質に存在する該ペプチドモチーフが、アデノウイル ス結合の方向変えを行い得ること、且つ高効率で選択的なアデノウイルスの細胞 結合／侵入をもたらし得ることを立証する。実施例１０ 本実施例において、アデノウイルスファイバー蛋白質のＣ末端において種々の 束縛ペプチドモチーフの挿入部を有するファイバー配列をコードするアデノウイ ルスベクターの結合様式について述べる。 腎細胞（８３５）、平滑筋細胞（Ａ１０）、および内皮細胞（ＣＰＡＥ）への 結合におけるＡｄＺおよびＡｄＺ.ＲＧＤベクターの特異性を調べた。これらの 実験に関して、２４ウェルの組織培養プレートで８３５細胞、Ａ１０細胞、また はＣＰＡＥ細胞の単層を、可溶性組換えファイバー（Ｆ５；３ｕｇ／ｍｌ）、ペ ントンベース（ＰＢ；５０μｇ／ｍｌ）、ファイバー＋ペントンベースを含有す るか、あるいはいずれのコート蛋白質も含有しない、０．３ｍｌの培地で４５分 間予備インキュベートした。次いで、放射標識したＡｄＺまたはＡｄＺ.ＲＧＤ をウェルに添加し、室温で振動させつつ９０分間インキュベートした。該ウェル をＰＢＳで３回洗浄し、そして該残存する細胞による放射活性をシンチレーショ ンカウンターで測定した。これらの実験の結果をグラフとして図１５〜１７に、 そして定量的に表３に示す。 表３ ３種の細胞系^*に対するＡｄＺおよびＡｄＺ.ＲＧＤの結合の比較 ^*値は、結合アッセイにおけるベクターの投入量に対する百分率を表わす。^** 全ての値についての誤差は１０％未満。 これらの結果は、８３５細胞（図１５）およびＡ１０細胞（図１６）ともに、フ ァイバー蛋白質が、ＡｄＺ形質導入を有意に阻害するが、ＡｄＺ.ＲＧＤ形質導 入を阻害しないことを立証する。ファイバー＋ペントンベース(これは共同して ファイバー受容体およびα_vインテグリンの両方を阻害する)のみが、これらの細 胞に対するＡｄＺ.ＲＧＤの結合を有意に阻害し得る。検出可能なレベルのファ イバー受容体を欠損するＣＰＡＥ細胞（図１７）では、ペントンベースは単独で ＡｄＺ.ＲＧＤへの結合を有意に阻害することができる。 これらの結果は、ＡｄＺ.ＲＧＤが細胞上でα_vインテグリンと相互作用するこ とを示す。さらに、該結果は、ＡｄＺ.ＲＧＤのファイバー蛋白質に存在するよ うな該ペプチドモチーフを、特定の細胞をアデノウイルスの標的にするために効 率的に使用できることをことを示している。 実施例１１ 本実施例において、アデノウイルスファイバー蛋白質のＣ末端において種々の 配列の挿入部をコードするアデノウイルスベクターにより仲介される遺伝子送達 について述べる。 ＹＩＧＳＲ[配列番号６６]ペプチドモチーフの細胞ターゲッティングをもたら す能力を調べるために、Ａ５４９細胞を競合する野生型ファイバー蛋白質の存在 下および非存在下で30分間予備インキュベートした。次いで、精製したＡｄＺま たはＡｄＺ.ｐＹＩＧＳＲベクターを該細胞と共にさらに６０分間３７℃でイン キュベートした。次いで、該細胞をＰＢＳで３回洗浄し、そして培養培地中で終 夜インキュベートした。溶菌した細胞由来のβ-ガラクトシダーゼ活性を測定し た。 図１８に示すように、組換え野生型ファイバー蛋白質は完全に両ベクターによ る遺伝子送達を阻害した。ファイバー蛋白質の存在下ではＡｄＺ.ｐＹＩＧＳＲ ベクターによる遺伝子送達の増加は観察されなかった。これは、ｐＹＩＧＳＲタ ーゲッティングモチーフが、可溶性ファイバー蛋白質の添加によって達成される アデノウイルス結合の阻害を克服するには親和性が十分に高くないことを示す。 ｐＬＤＶモチーフの細胞ターゲッティングをもたらす能力を調べるするために 、ラモス細胞（これは高レベルでα₄インテグリン標的受容体を発現する）を競 合する野生型ファイバー蛋白質の存在下および非存在下で30分間予備インキュベ ートした。次いで、精製したＡｄＺまたはＡｄＺ.ｐＬＤＶベクターを該細胞と 共にさらに６０分間３７℃でインキュベートした。該細胞をＰＢＳで３回洗浄し 、そして培養培地中で終夜インキュベートした。次いで、溶菌した細胞由来のβ −ガラクトシダーゼ活性を測定した。 図１９は、ラモス細胞に対するＡｄＺ.ｐＬＤＶベクターによりもたらされる 遺伝子送達を示す。この図から分かるように、組換え野生型ファイバー蛋白質は ＡｄＺならびにＡｄＺ.ｐＬＤＶの遺伝子送達を両方とも阻害した。ＡｄＺ.ｐＹ ＩＧＳＲの場合と同様に、ファイバー蛋白質の存在下でＡｄＺ.ｐＬＤＶベクタ ーによる遺伝子送達が増加したという証拠はない。これは、ｐＬＤＶターゲッテ ィングモチーフが、ＹＩＧＳＲ[配列番号６６]ターゲッティングモチーフと同様 に、蛋白質結合に対するファイバー介在性の阻害を克服するには親和性が十分に 高くないことを示す。可溶性ファイバー蛋白質を添加しても阻害されない残存す るＡｄＺ.ｐＬＤＶの遺伝子送達能力は、ＥＤＴＡと共にさらにインキュベーシ ョンを行っても阻害されない。対照的に、フィブロネクチンに通常存在するＬＤ Ｖモチーフとα₄インテグリンとの相互作用はＥＤＴＡにより阻害される。さら に、この結果は、ｐＬＤＶターゲッティングモチーフが、ラモス細胞に対するベ クター結合および遺伝子送達を増加させるに十分な高い親和性でもってα₄イン テグリンと相互作用しないことを示している。しかしながら、ＹＩＧＳＲモチー フ（すなわち、[配列番号６６]の配列）およびＬＤＶモチーフの両方を含むこと で、高親和性ペプチドモチーフを、ファイバー蛋白質の露出ループ内にこれらの ペプチドが立体配座的に拘束することにより誘導し得る可能性がある。 同様に、ＲＧＤモチーフの細胞ターゲッティングをもたらす能力を、αｖ−イ ンテグリンを発現している２９３細胞について研究した。他のペプチドモチーフ ／細胞系に対して行ったと同様にしてこれらの研究を実施した。しかしながら、 比較のために、該ベクターＡｄＺおよびＡｄＺ.ｐＲＧＤ（すなわち、システイ ン残基を有しないＲ ＧＤモチーフの多コピーを含有するベクター）もまた含めた。これらの研究の結 果を図２０に示す。この図から分かるように、ＡｄＺ.ｐＲＧＤではなく、Ａｄ Ｚ.ＲＧＤが、明らかにアデノウイルスが介する遺伝子送達に対するファイバー 介在性の阻害を克服することができた。 従って、これらの結果は、アデノウイルスファイバー蛋白質のループ内に存在 するＲＫＫＫ２モチーフ（実施例４に記載する）のように、ＲＧＤペプチドモチ ーフ（すなわち、ファイバー蛋白質のＣ末端でループとして存在する）が、アデ ノウイルスが仲介する遺伝子送達に対するファイバー介在性の阻害を克服するこ とが可能な、十分に高い親和性を有していることを示している。そして野生型フ ァイバー蛋白質とその細胞受容体との通常の相互作用を効率的に「排除（swamp out）」することができ、新たな受容体をアデノウイルスの標的とし得たことを 立証する。 さらに、該結果は非天然アミノ酸配列の束縛（すなわち、ファイバーループに おける挿入か、またはファイバー末端におけるループ様構造の創製かのいずれか を通じて）が高い親和性のペプチドモチーフを作り出し得ることを立証する。こ のような高い親和性のペプチドモチーフがアデノウイルス細胞ターゲッティング に使用される。 ここに述べられた特許、特許出願、および刊行物を含めた全ての引例は、引用 により、各引例がここに完全に明らかにされたと同程度に、そっくりそのまま組 み入れられるものである。 本発明を、好ましい実施態様を強調して説明してきたが、好ましい実施態様が 変更され、且つ使用され得ること、および本発明がここで詳細に記載された以外 の方法で実行され得ることが当業者には明白であろう。本発明はそのような変更 や代替の実施の包含を意図するものである。したがって、本発明は添付の請求の 範囲に定義される該発明の精神と範囲に包含されるすべての変更を含むものであ る。

【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項 【提出日】平成１０年１１月２日（１９９８．１１．２） 【補正内容】 請求の範囲 １．元来存在していないループによって、あるいはキメラアデノウイルスファイ バー蛋白質の元来存在しているループの天然アミノ酸配列内に、またはその代わ りに導入されることによって束縛されている、束縛非天然アミノ酸配列を含むキ メラアデノウイルスファイバー蛋白質。 ２．当該キメラアデノウイルスファイバー蛋白質が、当該キメラアデノウイルス 蛋白質ではなく野生型のアデノウイルスファイバー蛋白質を含んでいること以外 は等しいベクターよりも、当該キメラアデノウイルスファイバー蛋白質を含むベ クターの細胞への侵入をより効率的に容易にするものである、請求の範囲１に記 載のキメラアデノウイルスファイバー蛋白質。 ３．当該キメラアデノウイルスファイバー蛋白質が、野生型ファイバー蛋白質は 結合しない細胞表面上に存在する結合部位に結合するものである、請求の範囲１ 〜２のいずれかに記載のキメラアデノウイルスファイバー蛋白質。 ４．当該非天然アミノ酸配列が抗体に対するエピトープまたは細胞表面結合部位 に対するリガンドを含むものである、請求の範囲１〜３のいずれかに記載のキメ ラアデノウイルスファイバー蛋白質。 ５．当該非天然アミノ酸配列が約３ないし約２００のアミノ酸を含むものである 、請求の範囲１〜４のいずれかに記載のキメラアデノウイルスファイバー蛋白質 。 ６．当該非天然アミノ酸配列が約３ないし約３０のアミノ酸を含むものである、 請求の範囲１〜４のいずれかに記載のキメラアデノウイルスファイバー蛋白質。 ７．当該非天然アミノ酸配列が、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番 号４、配列番号５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２３、配列番号３１ 、配列番号３５、配列番号３９、配列番号４３、配列番号４９、配列番号５３、 配列番号５６、配列番号５９および配列番号６３、配列番号６６、配列番号６７ 、配列番号６８、配列番号７９、それらの保存的アミノ酸置換体、およびそれら のＣあるいはＮ末端欠失体（当該欠失は１、２または３残基を除去するものであ る）からなる群より選択される配列を含むものである、請求の範囲１〜４のいず れかに記載のキメラアデノウイルスファイバー蛋白質。 ８．当該非天然アミノ酸配列が、配列番号３、配列番号４および配列番号５、そ れらの保存的アミノ酸置換体およびそれらのＣあるいはＮ末端欠失体（当該欠失 は１、２または３残基を除去するものである）からなる群より選択される配列を 含むものである請求の範囲１〜７のいずれかに記載のキメラアデノウイルスファ イバー蛋白質。 ９．当該非天然アミノ酸配列が、ＲＧＤ配列ならびに当該元来存在しないループ を形成すべく一緒になって連結している１またはそれ以上のシステイン対を保有 することによって束縛されているものである、請求の範囲１〜８のいずれかに記 載のキメラアデノウイルスファイバー蛋白質。 １０．当該非天然アミノ酸配列が、キメラアデノウイルスファイバー蛋白質のＣ 末端で該蛋白質配列に加えて、あるいはその代わりに挿入されるものである請求 の範囲１〜９のいずれかに記載のキメラアデノウイルスファイバー蛋白質。 １１.請求の範囲１〜１０のいずれかに記載のキメラアデノウイルスファイバー 蛋白質をコードする、単離または精製した核酸。 １２．請求の範囲１１に記載の該単離または精製した核酸を含む導入ベクター。 １３．当該導入ベクターがｐ１９３（Ｆ５^*）、ｐ１９３Ｆ５２Ｋ（ＲＫＫＫ２ ）、ｐ１９３Ｆ５Ｆ２Ｋ、ｐ１９３（Ｆ５）ｐＧＳ（ＲＧＤ）、ｐ１９３（Ｆ５ ）ｐＬＤＶ、ｐ１９３（Ｆ５）ｐＹＩＧＳＲ、ｐ１９３（Ｆ５^*）ＲＧＤ、およ びｐ１９３Ｆ５５２Ｋ(ＦＬＡＧ)からなる群より選択されるものである、請求の 範囲１２に記載の導入ベクター。 １４.請求の範囲１〜１０のいずれかに記載のキメラアデノウイルスファイバー 蛋白質を含むベクター。 １５.当該ベクターが非エンベロープウイルス類からなる群より選択されるウイ ルスベクターである、請求の範囲１４に記載のベクター。 １６．当該ベクターがアデノウイルスベクターである請求の範囲１４または１５ に記載のベクター。 １７．当該ベクターがＡｄＺ．ＦＬＡＧ、ＡｄＺ．ＲＫＫＫ２、ＡｄＺ．ｐＲＧ Ｄ、ＡｄＺ．ＲＧＤ、ＡｄＺ．ｐＬＤＶおよびＡｄＺ．ＹＩＧＳＲからなる群よ り選択されるものである、請求の範囲１６に記載のベクター。 １８.当該ベクターがさらに、パッセンジャー遺伝子（ウイルスゲノムに挿入さ れているか、または蛋白質／ＤＮＡ相互作用によって当該アデノウイルスのコー ト蛋白質に接着している）を含んでいる請求の範囲１４〜１７のいずれかに記載 のベクター。 １９.請求の範囲１〜１０のいずれかに記載のキメラアデノウイルスファイバー 蛋白質で、ベクターのファイバー蛋白質を置換することを含む、ベクターの細胞 内への侵入効率を増大させる方法。 ２０.請求の範囲１２〜１８のいずれかに記載のベクターに細胞を接触させるこ とを含む、細胞を遺伝的に改変する方法。 ２１.請求の範囲１２〜１８のいずれかに記載のベクターを含む宿主細胞。 ２２.(a)野生型アデノウイルスファイバー蛋白質を取得し、 (b)キメラアデノウイルスファイバー蛋白質が結果としてできるように、当 該野生型アデノウイルスファイバー蛋白質の当該ノブのループ内で蛋白質配列に 、あるいはその代わりに非天然アミノ酸配列を挿入する、 ことを含む細胞表面結合部位へのペプチドの親和性を増大させる方法。 ２３.(a)野生型アデノウイルスファイバー蛋白質を取得し、 (b)１またはそれ以上のシステイン対によって側面を固め、該システイン間 での相互作用によってループを形成することが可能なように、当該野生型アデノ ウイルスファイバー蛋白質の蛋白質配列内に、あるいはその代わりにＲＧＤ配列 を挿入する、ことを含む細胞表面結合部位へのＲＧＤ配列の親和性を増大させる 方法。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，Ｓ Ｄ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ， ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，Ｆ Ｉ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ， ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，Ｍ Ｘ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ， ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者 コウベスディ、イムリ アメリカ合衆国、メリーランド州 20852、 ロックヴィル、ウォーブラー レイン 7713

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．束縛非天然アミノ酸配列を含むキメラアデノウイルスファイバー蛋白質。 ２．当該キメラアデノウイルスファイバー蛋白質が、当該アデノウイルスファイ バー蛋白質を含むベクターの細胞への侵入を、当該キメラアデノウイルス蛋白質 ではなく野生型のアデノウイルスファイバー蛋白質を含んでいること以外は等し いベクターよりも、より効率的に容易にするものである、請求の範囲１に記載の キメラアデノウイルスファイバー蛋白質。 ３．当該キメラアデノウイルスファイバー蛋白質が、野生型ファイバー蛋白質は 結合しない、細胞表面上に存在する結合部位に結合するものである、請求の範囲 １または２に記載のキメラアデノウイルスファイバー蛋白質。 ４．当該非天然アミノ酸配列が抗体に対するエピトープまたは細胞表面結合部位 に対するリガンドを含むものである、請求の範囲１〜３のいずれかに記載のキメ ラアデノウイルスファイバー蛋白質。 ５．当該非天然アミノ酸配列が約３ないし約２００のアミノ酸を含むものである 、請求の範囲１〜４のいずれかに記載のキメラアデノウイルスファイバー蛋白質 。 ６．当該非天然アミノ酸配列が約３ないし約３０のアミノ酸を含むものである、 請求の範囲１〜４のいずれかに記載のキメラアデノウイルスファイバー蛋白質。 ７．当該非天然アミノ酸配列が、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番 号４、配列番号５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２３、配列番号３１ 、配列番号３５、配列番号３９、配列番号４３、配列番号４９、配列番号５３、 配列番号５６、 配列番号５９および配列番号６３、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８ 、配列番号７９、それらの保存的アミノ酸置換、およびそれらのＣあるいはＮ末 端欠失(ここで当該欠失は１、２または３残基を除去するものである)からなる群 より選択される配列を含むものである、請求の範囲１〜４のいずれかに記載のキ メラアデノウイルスファイバー蛋白質。 ８．当該ファイバー蛋白質がノブを有し、該ノブが１またはそれ以上のループを 有し、且つ当該非天然アミノ酸配列が当該ノブのＡＢ、ＣＤ、ＤＧ、ＧＨ、ＩＪ およびＨＩループからなる群より選択されるループの天然アミノ酸配列中に、あ るいはそれに代えて挿入されるものである請求の範囲１〜７のいずれかに記載の キメラアデノウイルスファイバー蛋白質。 ９．当該非天然アミノ酸配列が、配列番号３、配列番号４および配列番号５、そ れらの保存的アミノ酸置換およびそれらのＣあるいはＮ末端欠失（当該欠失は１ 、２または３残基を除去するものである）からなる群より選択される配列を含む ものである請求の範囲１〜８のいずれかに記載のキメラアデノウイルスファイバ ー蛋白質。 １０．当該非天然アミノ酸配列が、ＲＧＤ配列ならびに１またはそれ以上のシス テイン対を保有することによって束縛されているものである、請求の範囲１〜９ のいずれかに記載のキメラアデノウイルスファイバー蛋白質。 １１．当該非天然アミノ酸配列が、キメラアデノウイルスファイバー蛋白質のＣ 末端の蛋白質配列中に、あるいはそれに代えて挿入されるものである請求の範囲 １〜１０のいずれかに記載のキメラアデノウイルスファイバー蛋白質。 １２．請求の範囲１〜１１のいずれかに記載のキメラアデノウイルスファイバー 蛋白質をコードする、単離または精製した核酸。 １３．請求の範囲１２に記載の該単離または精製した核酸を含む導入ベクター。 １４．当該導入ベクターがｐ１９３（Ｆ５^*）、ｐ１９３ Ｆ５２Ｋ（ＲＫＫＫ２ ）、ｐ１９３ Ｆ５Ｆ２Ｋ、ｐ１９３（Ｆ５）ｐＧＳ（ＲＧＤ）、ｐ１９３（Ｆ ５）ｐＬＤＶ、ｐ１９３（Ｆ５）ｐＹＩＧＳＲ、ｐ１９３（Ｆ５^*）ＲＧＤ、お よびｐ１９３ Ｆ５５２Ｋ（ＦＬＡＧ）からなる群より選択されるものである、 請求の範囲１３に記載の導入ベクター。 １５．請求の範囲１〜１１のいずれかに記載のキメラアデノウイルスファイバー 蛋白質を含むベクター。 １６．当該ベクターが非エンベロープウイルス類からなる群より選択されるウイ ルスベクターである、請求の範囲１５に記載のベクター。 １７．当該ベクターがアデノウイルスベクターである請求の範囲１５または１６ に記載のベクター。 １８．当該ベクターがＡｄＺ．ＦＬＡＧ、ＡｄＺ．ＲＫＫＫ２、ＡｄＺ．ｐＲＧ Ｄ、ＡｄＺ．ＲＧＤ、ＡｄＺ．ｐＬＤＶおよびＡｄＺ．ＹＩＧＳＲからなる群よ り選択されるものである、請求の範囲１７に記載のベクター。 １９．当該ベクターがさらに、パッセンジャー遺伝子（ウイルスゲノムに挿入さ れているか、または蛋白質／ＤＮＡ相互作用によって当該アデノウイルスのコー ト蛋白質に接着している）を含んでいる請求の範囲１５〜１８のいずれかに記載 のベクター。 ２０．請求の範囲１〜１１のいずれかに記載のキメラアデノウイルスファイバー 蛋白質で、ベクターのファイバー蛋白質を置換することを含む、当該ファイバー 蛋白質を含むベクターの細胞内への侵入効率を増加させる方法。 ２１．請求の範囲１３〜１９のいずれかに記載のベクターに細胞を接触させるこ とを含む、当該細胞を遺伝的に修飾する方法。 ２２．請求の範囲１３〜１９のいずれかに記載のベクターを含む宿主細胞。 ２３．(a)野生型アデノウイルスファイバー蛋白質を取得し、 (b)キメラアデノウイルスファイバー蛋白質が結果としてできるように、 当該野生型アデノウイルスファイバー蛋白質の当該ノブのループ内の蛋白質配列 中に、あるいはそれに代えて非天然アミノ酸配列を挿入する、ことを含む細胞表 面結合部位へのペプチドの親和性を増大させる方法。 ２４．(a)野生型アデノウイルスファイバー蛋白質を取得し、 (b)１またはそれ以上のシステイン対によって側面を固めて、該システイ ン間の相互作用によってループを形成することが可能なように、当該野生型アデ ノウイルスファイバー蛋白質の蛋白質配列内に、あるいはそれに代えてＲＧＤ配 列を挿入する、ことを含む細胞表面結合部位へのＲＧＤ配列の親和性を増大させ る方法。