EA023816B1 - СПОСОБ ПРОДУЦИРОВАНИЯ ВИРУСНЫХ ЧАСТИЦ Ad26 - Google Patents

СПОСОБ ПРОДУЦИРОВАНИЯ ВИРУСНЫХ ЧАСТИЦ Ad26 Download PDF

Info

Publication number
EA023816B1
EA023816B1 EA201290797A EA201290797A EA023816B1 EA 023816 B1 EA023816 B1 EA 023816B1 EA 201290797 A EA201290797 A EA 201290797A EA 201290797 A EA201290797 A EA 201290797A EA 023816 B1 EA023816 B1 EA 023816B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
cells
bioreactor
cell
infection
cell density
Prior art date
Application number
EA201290797A
Other languages
English (en)
Other versions
EA201290797A1 (ru
Inventor
Альфред Лейтьенс
Херман Ван Херк
Original Assignee
Круселл Холланд Б.В.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Круселл Холланд Б.В. filed Critical Круселл Холланд Б.В.
Publication of EA201290797A1 publication Critical patent/EA201290797A1/ru
Publication of EA023816B1 publication Critical patent/EA023816B1/ru

Links

Classifications

    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86Viral vectors
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12MAPPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M3/00Tissue, human, animal or plant cell, or virus culture apparatus
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86Viral vectors
    • C12N15/861Adenoviral vectors
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • C12N7/02Recovery or purification
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011Details
    • C12N2710/10011Adenoviridae
    • C12N2710/10311Mastadenovirus, e.g. human or simian adenoviruses
    • C12N2710/10321Viruses as such, e.g. new isolates, mutants or their genomic sequences
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011Details
    • C12N2710/10011Adenoviridae
    • C12N2710/10311Mastadenovirus, e.g. human or simian adenoviruses
    • C12N2710/10341Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2710/10343Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011Details
    • C12N2710/10011Adenoviridae
    • C12N2710/10311Mastadenovirus, e.g. human or simian adenoviruses
    • C12N2710/10351Methods of production or purification of viral material

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Sustainable Development (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

Изобретение относится к способу продуцирования по меньшей мере 1×10вирусных частиц (VP)/мл E1-дефицитного аденовируса серотипа 26 (rAd26), причем отношение абсолютного количества вирусных частиц к инфекционным частицам VP/IU составляет менее 20:1, причем способ включает а) культивирование клеток PER.C6 в суспензии с помощью перфузионной системы; b) инфицирование указанных клеток посредством rAd26 при плотности от 10×10до 16×10жизнеспособных клеток/мл; с) дальнейшее культивирование инфицированных клеток с помощью перфузионной системы для размножения указанного rAd.26 до достижения концентрации по меньшей мере 1×10вирусных частиц VP/мл и d) сбор вирусных частиц указанного rAd26. Изобретение также относится к применению биореактора в указанном способе, где указанный биореактор имеет рабочий объем от 2 до 1000 л и содержит культуральную среду, клетки PER.C6 и вирусные частицы rAd26 в концентрации по меньшей мере 1×10VP/мл.

Description

Изобретение относится к области клеточных культур и получения аденовирусов. Более конкретно, оно относится к усовершенствованным способам культивирования клеток млекопитающих, инфицирования этих клеток аденовирусом и продуцирования из них аденовирусных частиц.
Предпосылки изобретения
Недавние разработки в области ДНК-вакцинации с использованием рекомбинантных вирусных векторов вызвали необходимость в крупномасштабном производстве материала клинической категории. Необходимы способы, позволяющие предоставить менее и наименее развитые общества достаточными количествами рекомбинантных вакцин на основе аденовирусов для борьбы с проблемами туберкулеза и малярии в мире. Оценка когорт рождения демонстрирует, что в менее и наименее развитых обществах в 2010-2015 годах родится более 150000000 человек. Исходя из этой когорты рождения предполагаемая ежегодная потребность в вакцине может достигнуть приблизительно 1,5х1019 вирусных частиц (УР) в год (Ь!1р://е8а.ип.огд/цпрр/шбех.а8р?рапе1=2).
Описано несколько способов продуцирования аденовирусов. В этих способах используются прикрепляющиеся клеточные культуры во вращающихся флаконах, клеточных фабриках (Νυηοίοη от Νιιηο или Се118!аек от Сотшпд) или клеточных кубах (Сотшпд). Способы продуцирования на прикрепляющихся клеточных культурах не могут удовлетворить мировую потребность в вакцинах на основе аденовируса. Таким образом, клетки, используемые в способе на прикрепляющихся культурах, адаптированы к суспензионным культурам (например, клеточные линии НЕК293 и РЕК.С6®). С использованием суспензионных культур можно масштабировать процессы продуцирования для крупномасштабных биореакторов. Суспензионные клеточные культуры для продуцирования аденовируса обычно достигают масштаба от 3 до 20 л и было описано успешное увеличение масштаба вплоть до 100 л (Катеп е1 а1., 2004) и 250 л (Х1е е1 а1., 2003). Описаны эксперименты, которые предусматривают увеличение масштаба вплоть до 10000 л (Хе е! а1., 2003).
Однако, главным недостатком увеличения масштаба до 10000 л является высокое вложение капитала (САРЕХ), которое требуется для моделирования и конструирования биореакторной установки объемом 10000 л. Более того, вложение САРЕХ в конструирование установки объемом 10000 л, согласно условиям В§Ь 2, должно быть осуществлено в отсутствие даже информации о том, что продуцирование будет успешным (фаза IV и далее). Сообщается, что общие капитальные затраты на биореакторную установку объемом 10000 л составляют от €225000000 до €320000000 (Ез!аре е! а1., 2006). Таким образом, является желательным получение в меньшем масштабе, например в биореакторах объемом 1000 л или менее.
При использовании существующих в настоящее время способов для достижения заданного уровня 1,5х1019 УР/год необходимо продуцировать более 150 партий в масштабе 1000 л. Таким образом, существует потребность в усовершенствовании систем для продуцирования аденовирусов в целях увеличения выхода аденовирусных частиц, чтобы удовлетворить мировую потребность в аденовирусных вакцинах, предпочтительно без чрезмерных затрат.
Одной из проблем, встречаемых при оптимизации продуцирования аденовирусов, является так называемый эффект клеточной плотности. В случае периодического процесса в нескольких ссылках указывается на существование оптимальной клеточной плотности при инфицировании для продуцирования аденовируса. Оптимум составляет 0,5-1х106 клеток/мл (Матапда е! а1., 2005; Катеп е! а1., 2004). Для продуцировании аденовируса (А65) в биореакторе с механическим перемешиванием для периодического производства было показано, что выход вируса на клетку остается постоянным при уровне приблизительно 0,9х106 клеток/мл, но резко падает при уровне приблизительно 1х106 клеток/мл (АЬатак е! а1., 2005). При уровне свыше 2х106 клеток/мл инфекционные частицы не выявлялись. Переходная точка, связанная с падением удельного продуцирования в зависимости от клеточной плотности при инфицировании, зависит от среды. До настоящего времени ни одна из доступных коммерческих сред не продемонстрировала потенциал в отношении поддержания высоких выходов вирусных частиц при сохранении оптимального удельного продуцирования при клеточной плотности свыше 1х106 клеток/мл (Катеп е! а1., 2004). Причины этого падения в настоящее время неизвестны, однако оно может быть следствием ограниченной доступности питательных веществ для продуцирования вируса или следствием высоких концентраций метаболитов, которые являются ингибиторными для продуцирования вируса.
Процессы с подпиткой, такие как добавление глюкозы, глутамина и аминокислот, позволили инфицирование при клеточной плотности вплоть до 2х106 клеток/мл. Однако, выход, достигаемый при высокой плотности клеток, был ниже, чем выход, достигаемый при инфицировании при плотности клеток 1х 106 клеток/мл (Катеп е! а1., 2004).
В перфузионных процессах клетки удерживают в биореакторе полыми волокнами, центробежными фильтрами или акустическими сепараторами, в то время как культуральную среду перфузируют через биореактор. В этих процессах иногда можно достигать плотности клеток >100 х106 клеток/мл (например, Уа11ор е! а1., 2005).
Инфицированные клетки перфузионной культуры продемонстрировали преждевременную потерю клеток в ходе перфузии в системе с полыми волокнами. Это может быть связано с их более высокой чув- 1 023816 ствительностью к сдвиговым усилиям вследствие вирусной инфекции (Сотйп е! а1., 2004). Наиболее вероятной причиной этого явления были гидродинамические нагрузки, индуцируемые в трубах, полых волокнах или в перистальтическом насосе на более уязвимые инфицированные клетки. Поскольку инфицированные клетки являются более уязвимыми, было предположено, что, если на протяжении фазы инфицирования необходимо поддерживать перфузию, является желательным, в частности, акустический сепаратор (Непгу е! а1., 2004).
Однако, инфекции, осуществленные в перфузионном режиме, могли поддерживаться только для плотностей клеток вплоть до 3х106 клеток/мл со скоростью перфузии 2 об/сутки. Инфицирование при клеточной плотности 6х106 клеток/мл приводило к пятикратному снижению удельной продуктивности (Непгу е! а1., 2004).
Несмотря на описанный в других источниках эффект клеточной плотности, в одном сообщении (Уик е! а1., 2004) описаны успешные перфузионные культуры на опухолевых клетках человека в качестве платформы для продуцирования онколитических аденовирусных векторов. В этом сообщении описан перфузионный процесс с высокой плотностью клеток с использованием технологии переменного тангенциального потока (АТР). При средней плотности жизнеспособных клеток при инфицировании 9х106 клеток НеЬа83/мл наблюдали средний титр вируса приблизительно 4х10п ΥΡ/мл. Опухолевые клетки, использованные в этом сообщении, не являются предпочтительными в качестве продуцирующих клеток, поскольку использование опухолевых клеток может представлять угрозу безопасности, когда продуцированные аденовирусные частицы подлежат введению человеку. Рекомбинантный аденовирус в этом сообщении был основан на Ай5. Возможности применения таких аденовирусов в качестве вакцин ограничены, поскольку основная часть человеческой популяции имеет предсуществующие нейтрализующие антитела против Ай5, и, таким образом, в качестве вакцин более пригодны рекомбинантные аденовирусы других серотипов (см. например νθ 00/70071). Рекомбинантные аденовирусы, особенно преимущественные для применения в качестве вакцин, включают АЙ26 (νθ 00/70071).
Для крупномасштабного продуцирования рекомбинантных аденовирусов, отличных от АЙ5. в частности для преимущественного серотипа 26, доступна ограниченная информация, если вообще доступна. Некоторые отличия между крупномасштабным продуцированием АЙ35 и АЙ5 были описаны ранее, например в РСТ/ЕР2009/064265. В некоторой степени отличающиеся физические свойства рекомбинантных аденовирусов различных серотипов могут привести к различиям в способах продуцирования. Такие потенциальные отличия могут быть особенно важными при промышленном масштабе, где даже вроде бы небольшие отличия при мелком масштабе могут иметь большие экономические последствия в масштабе, предусматриваемом для продуцирования согласно ежегодной мировой потребности. Например, заявителем было показано, что описанный эффект плотности клеток для Ай5 был отличным для АЙ35 (РСТ/ЕР2009/064265). Таким образом, тАй35 размножается иным образом в продуцирующих клетках, чем гАй5, в ходе процессов крупномасштабного продуцирования. Очевидно, размножение аденовирусов из различных серотипов очень непредсказуемо.
Чтобы удовлетворить мировую потребность в вакцинах на основе рекомбинантного аденовируса серотипа 26 (гАй26), существует необходимость в усовершенствовании систем продуцирования гАй26.
Настоящее изобретение относится к усовершенствованным способам промышленного продуцирования гАй26.
Сущность изобретения
В рамках настоящего изобретения авторы изобретения открыли, что еще один серотип, т.е. АЙ26, имеет поведение, отличное от других серотипов Ай5 и АЙ35. Действительно, АЙ26 имеет тенденцию к демонстрации небольшого эффекта клеточной плотности, но не настолько выраженного, как эффект плотности, наблюдаемый для Ай5. Кроме того, клетки, инфицированные АЙ26, имеют тенденцию к дальнейшему росту после инфицирования, в то время как клетки, инфицированные АЙ35, демонстрируют сниженный рост после инфицирования.
Эти результаты вновь указывают на то, что, возможно, процессы для конкретных серотипов аденовируса необходимо точно отрегулировать для каждого серотипа в целях получения оптимальных результатов. Настоящее изобретение относится к оптимизированной системе для продуцирования тАй26 с точки зрения выхода, качества полученного тАй26 и простоты манипулирования собранным материалом для последующей переработки.
Изобретение относится к способу продуцирования по меньшей мере 1х1012 вирусных частиц (УР)/мл Е1-дефицитного аденовируса серотипа 26 (тАй26), причем отношение абсолютного количества вирусных частиц к инфекционным частицам ΥΡ/ΐυ составляет менее 20:1, причем способ включает:
a) культивирование клеток РЕК.С6 в суспензии с помощью перфузионной системы;
b) инфицирование указанных клеток посредством тАй26 при плотности от 10х106 до 16х106 жизнеспособных клеток/мл посредством тАй26;
c) дальнейшее культивирование инфицированных клеток с помощью перфузионной системы для размножения указанного тАй26 до достижения концентрации по меньшей мере 1х 1012 вирусных частиц ΥΡ/мл и
- 2 023816
б) сбор вирусных частиц указанного гЛб26.
В определенных вариантах осуществления указанные клетки на стадии Ь) инфицируют гАб26 при плотности приблизительно от 10х 106 до 14х 106 жизнеспособных клеток/мл.
В определенных предпочтительных вариантах осуществления указанная перфузионная система на стадии с) представляет собой перфузионную систему переменного тангенциального потока (АТР).
В других предпочтительных вариантах осуществления способ дополнительно включает е) очистку вирусных частиц гАб26.
В определенных вариантах осуществления указанный рекомбинантный аденовирус лишен по меньшей мере части Е1А или Е1В области Е1.
В других предпочтительных вариантах осуществления указанная перфузионная система на стадии а) представляет собой перфузионную систему переменного тангенциального потока (АТР).
Также аспектом изобретения является способ, в котором стадию а) проводят в биореакторе для предварительного культивирования, и стадии Ь) и с) проводят в биореакторе для продуцирования.
Также изобретение относится к применению биореактора в указанном способе, где указанный биореактор имеет рабочий объем от 2 до 1000 л, и содержит культуральную среду, клетки РЕК.С6 и вирусные частицы гАб26 в концентрации по меньшей мере 1 х 1012 УР/мл.
В определенных вариантах осуществления указанный биореактор соединен с перфузионной системой АТР.
Краткое описание фигур
Фиг. 1 - инфицирование при высокой плотности клеток посредством гАб5 во вращающихся флаконах.
Фиг. 2 - инфицирование при высокой плотности клеток во вращающихся флаконах и 2 л биореакторе посредством гАб35.ТВ-§.
Фиг. 3 - инфицирование при высокой плотности клеток во вращающихся флаконах посредством гАб26.
Фиг. 4 - рост клеток после инфицирования посредством гАб26.
Фиг. 5 - рост клеток после инфицирования посредством гАб35.
Подробное описание изобретения
Настоящее изобретение относится к новому способу продуцирования больших количеств рекомбинантного аденовируса гАб26. Этот оптимизированный способ основан на возможности инфицирования культуры при высокой плотности клеток с сохранением высокого выхода вируса на клетку. Посредством этого обеспечивается способ получения раствора с собранным вирусом с высокой концентрацией вируса в одном биореакторе. Типичный выход данных процессов для гАб26 составляет приблизительно 2-ЗхЮ11 УР/мл. Действительно, полагают, что с использованием способов по настоящему изобретению можно получать очень большие количества частиц гАб26, например количества по меньшей мере приблизительно 5х10п УР/мл, предпочтительно по меньшей мере приблизительно 6, 7, 8 или 9х 1011 УР/мл. Предпочтительно продуцируют по меньшей мере 1х1012 УР/мл гАб26, более предпочтительно по меньшей мере 1,5х1012 УР/мл, еще более предпочтительно по меньшей мере 2х1012 УР/мл, например приблизительно от 1х 1012 до 5х 1012 УР/мл. Как правило, этот способ обеспечивает более чем приблизительно 1х 1013 УР/мл гАб26.
Выходы, которые могут быть достигнуты с помощью способов в соответствии с настоящим изобретением, вероятно, являются достаточными для получения желаемого в мире количества определенных вакцин на основе гАб26 без потребности в биореакторных установках с рабочими объемами более 1000 л.
Изобретение относится к способу продуцирования рекомбинантного аденовируса серотипа 2 6 (гАб26), причем способ включает: а) культивирование клеток-продуцентов в суспензии с помощью перфузионной системы; Ь) инфицирование указанных клеток при плотности по меньшей мере 10х106 жизнеспособных клеток/мл посредством гАб26; с) дальнейшее культивирование инфицированных клеток с помощью перфузионной системы для размножения указанного гАб26 и б) сбор указанного гАб26.
В определенных вариантах осуществления указанные клетки на стадии Ь) инфицируют гАб26 при плотности приблизительно между 10х106 и 50х106 жизнеспособных клеток/мл. В следующих вариантах осуществления указанные клетки на стадии Ь) инфицируют гАб26 при плотности приблизительно между 10х106 и 20х106 жизнеспособных клеток/мл. В других преимущественных вариантах осуществления указанные клетки на стадии Ь) инфицируют гАб26 при плотности приблизительно между 10х106 и 16х106 жизнеспособных клеток/мл, например при приблизительно 10, 11, 12, 13, 14 или 15х106 жизнеспособных клеток/мл.
Клетки-продуценты и рекомбинантный аденовирус.
Клетка-продуцент (иногда также называемая в данной области и в настоящем описании упаковывающей клеткой, или комплементирующей клеткой, или клеткой-хозяином) в соответствии с настоящим изобретением может представлять собой любую клетку-продуцента, в которой может размножаться желаемый аденовирус. Например, размножение рекомбинантных аденовирусных векторов прово- 3 023816 дят в клетках-продуцентах, которые комплементируют дефекты аденовирусов. Такие клетки-продуценты предпочтительно имеют в их геноме по меньшей мере последовательность Е1 аденовируса, и, тем самым, способны комплементировать рекомбинантные аденовирусы с делецией области Е1. Кроме того, аденовирус может иметь делецию в области Е3, которая является необязательной для генома АД, и, таким образом, такая делеция не должна быть комплементирована. Можно использовать любую комплементирующую Е1 клетку-продуцент, такую как клетки сетчатки человека, иммортализованные с помощью Е1, например клетки 911 или РЕК.Сб (см. патент США 5994128), трансформированные Е1 амниоциты (см. патент ЕР 1230354), трансформированные Е1 клетки А549 (см., например, \УО 98/39411, патент США 5891690), СН329:НеЬа (Сао е! а1., 2000, Нитап Сепе ТЬегару 11: 213-219), 293, и т.п. В определенных вариантах осуществления клетки-продуценты представляют собой, например, клетки НЕК293, или клетки РЕК.Сб, или клетки 911, или клетки ГТ2938Р и т.п. Предпочтительно в качестве клетокпродуцентов используют клетки РЕК.Сб (депонированные 29 февраля 1996 г. под номером депозита ЕСАСС 96022940 в Еигореап С'оПесОоп оГ Се11 СиИитек, САМК, ЗаПкЪиту, ХУПЫйге. Великобритания; см. патент США 5994128), или клетки, происходящие из них.
В настоящем описании показано, что рекомбинантный аденовирус серотипа 35 (гАД35) обладает прежде неизвестными преимущественными свойствами по сравнению с гАД5 в способах с использованием инфицирования при высокой плотности клеток. Также авторы настоящего изобретения открыли, что другой серотип (гАД26) также ведет себя иначе в сходных процессах по сравнению с упомянутыми выше серотипами, указывая на то, что для различных серотипов необходимо устанавливать оптимальные условия для крупномасштабного продуцирования рекомбинантного аденовируса. Аденовирус по настоящему изобретению представляет собой гАД26.
Предпочтительно аденовирусный вектор имеет дефект по меньшей мере одной необходимой функции гена области Е1, например области Е1а и/или области Е1Ъ, аденовирусного генома, которая необходима для вирусной репликации. В определенных вариантах осуществления вектор имеет дефицит по меньшей мере одной необходимой функции гена области Е1 и по меньшей мере части необязательной области Е3. Аденовирусный вектор может иметь множественный дефицит, что означает, что аденовирусный вектор является дефицитным по одной или нескольких необходимым функциям генов в каждой из двух или более областей аденовирусного генома. Например, указанные выше Е1-дефицитные или Е1-, Е3-дефицитные аденовирусные векторы могут быть далее дефицитными по меньшей мере по одному необходимому гену области Е4 и/или по меньшей мере одному необходимому гену области Е2 (например, области Е2А и/или области Е2В). Аденовирусные векторы с делецией всей области Е4 могут индуцировать более низкий иммунный ответ у хозяина. Примеры пригодных аденовирусных векторов включают аденовирусные векторы, которые лишены (а) всей области Е1 или ее части и всей области Е2 или ее части, (Ъ) всей области Е1 или ее части, всей области Е2 или ее части и всей области Е3 или ее части, (с) всей области Е1 или ее части, всей области Е2 или ее части, всей области Е3 или ее части и всей области Е4 или ее части, (Д) по меньшей мере части области Е1а, по меньшей мере части области Е1Ъ, по меньшей мере части области Е2а и по меньшей мере части области Е3, (е) по меньшей мере части области Е1, по меньшей мере части области Е3 и по меньшей мере части области Е4, и (Т) всех необходимых аденовирусных продуктов генов (например, аденовирусные ампликоны, содержащие только ГТК и сигнал для упаковывания). Как известно специалисту в данной области, в случае делеций необходимых областей из генома аденовируса, функции, кодируемые этими областями, должны быть предоставлены после переноса предпочтительно продуцирующей клеткой, т.е., когда из аденовируса удалены части или целые области Е1, Е2 и/или Е4, они должны присутствовать в продуцирующей клетке, например встроены в ее геном или в форме так называемого аденовируса-помощника или плазмид-помощников.
В следующих вариантах осуществления аденовирус по изобретению лишен по меньшей мере части области Е1, например кодирующих последовательностей Е1А и/или Е1В, и, кроме того, содержит гетерологичную нуклеиновую кислоту. Пригодная гетерологичная нуклеиновая кислота хорошо известна специалисту в данной области и, например, может включать открытые рамки считывания трансгенов, например открытые рамки считывания, кодирующие полипептиды, против которых является желательным иммунный ответ, когда вектор гАД используют для вакцинации, например трансгены, пригодные для индукции иммунного ответа против малярии (см. например \УО 2004/055187), ВИЧ, туберкулеза (см., например, \УО 2006/053871), определенных вирусов и т.д., все из которых хорошо известны специалисту в данной области. В действительности, природа гетерологичной нуклеиновой кислоты не является критичной для настоящего изобретения, она может представлять собой любую гетерологичную нуклеиновую кислоту и, таким образом, не нуждается в дальнейшем уточнении в настоящем описании.
Специалисту в данной области известно о возможности размножения аденовирусных векторов различных серотипов в конкретных клетках-хозяевах с использованием способов, например, таких как описаны в патенте США 6492169 или в \УО 03/104467 и ссылках в них. Например, для размножения гАД26 с дефицитом Е1 можно конструировать конкретные продуцирующие клетки, которые экспрессируют Е1В55К АД26, например, на основе существующих продуцирующих клеток, которые экспрессируют Е1А и Е1В АД5, таких как клетки РЕК.С6 или НЕК293 (см., например, И8 6492169), как известно специалисту в данной области. Альтернативно и предпочтительно, можно использовать существующие (АД5-) компле- 4 023816 ментирующие клеточные линии, например, такие как РЕК.С6 или НЕК293 без модификации клеток для размножения гАб26 с дефицитом Е1, путем включения кодирующей последовательности Е4-огТ6 из Аб5 в вектор гАб26, как подробно описано, например, в \УО 03/104467, включенной в настоящее описание в качестве ссылки в полном объеме. Таким образом, размножение аденовирусных векторов любого серотипа можно проводить на продуцирующих клетках с использованием средств и способов, хорошо известных специалисту в данной области. Аденовирусные векторы, способы их конструирования и способы их размножения хорошо известны в данной области и описаны, например, в патентах США №№ 5559099, 5837511, 5846782, 5851806, 5994106, 5994128, 5965541, 5981225, 6040174, 6020191 и 6113913,и Тйотак 8йеик, Абсиоушбас аиб 1Нс1г КсрБса!юи, М. 8. Ног\\Ц/. Абсиоуиикск, главы 67 и 68 соответственно, νποίοβγ. В. N. РШбк с! а1., ебк., 3б еб., Кауси Ргскк, Нб., №\ν Уогк (1996) и других ссылках, упомянутых в настоящем описании.
Конструирование аденовирусных векторов хорошо понятно в данной области и вовлекает применение стандартных методик молекулярной биологии, таких как методики, описанные, например, в 8атЬгоок с! а1., Мо1сси1аг С1отид, а ЬаЬога!огу Маииа1, 2б еб., Со1б 8ргшд НагЬог Ргскк, Со1б 8ргшд НагЬог, Ν.Υ. (1989), \Уа15оп с! а1., КссотЫиаи! ΌΝΆ, 2б еб., 8с1сиййс Лтспсап Воокк (1992), и АикиЬс1 с! а1., Сиггеи! Рго!осо1к ш Мо1сси1аг Вю1оду, \УПсу 1и!сгкс1еисс РиЬйкйсгк, ΝΥ (1995) и других ссылках, упомянутых в настоящем описании.
Клетки-продуценты согласно изобретению культивируют для увеличения количеств клеток и вирусов и/или титров вирусов. Культивирование клетки проводят для обеспечения метаболизма и/или роста, и/или деления, и/или продуцирования представляющего интерес вируса согласно изобретению. Это можно осуществлять способами, по существу, известными в данной области, и они включают, но не ограничивается этим, предоставление питательных веществ для клетки, например, в подходящей культуральной среде. Можно использовать различные культуральные среды, и выбор оптимальной клеточной культуральной среды для клеток и используемых условий является частью повседневных задач специалиста в данной области. Таким образом, пригодные культуральные среды для целей настоящего изобретения хорошо известны специалисту в данной области и их, главным образом, можно получить из коммерческих источников в больших количествах или они могут быть выполненными на заказ в соответствии со стандартными протоколами. Культивирование можно проводить, например, в чашках, вращающихся флаконах или в биореакторах с использованием периодических, периодических с подпиткой, непрерывных систем и т.п. Для достижения крупномасштабного (непрерывного) продуцирования вируса с помощью клеточной культуры в данной области предпочтительно иметь клетки, способные расти в суспензии, и предпочтительно иметь клетки, способные к культивированию в отсутствие происходящей из животного или человека сыворотки или компонентов происходящей из животного или человека сыворотки. Пригодные условия для культивирования клеток известны (см., например, Нккис Си1!игс, Асабетю Ргскк, Кгикс аиб Ра!сгкои, сбйогк (1973), и К.1. РгскЬису, Си1!игс о£ атта1 сс11к: А таииа1 о£ Ьакю (ссИшсцт ГоигШ сбйюи (^Ьсу-Ыкк 1ис., 2000, Ι8ΒΝ 0-471-34889-9).
Клеточная культуральная система и перфузионная система.
Биореакторы широко используют для крупномасштабного продуцирования биологических продуктов из суспензионных культур клеток животных. Согласно изобретению биореакторы, используемые для размножения аденовируса, могут представлять собой, например, смесительные емкости, одноразовые биореакторы, аэролифтные реакторы и т.п. Согласно определенным вариантам осуществления настоящего изобретения биореактор представляет собой смесительную емкость.
Согласно определенным вариантам осуществления изобретения биореактор имеет рабочий объем приблизительно между 2 и 2000 л, причем значение этого диапазона включает указанные верхнюю и нижнюю предельные величины, т.е. 2 л является наименьшим рабочим объемом и 2000 л является наибольшим рабочим объемом. Термин приблизительно для числовых величин, как используют в настоящем описании, означает эту величину ±10%. В определенных предпочтительных вариантах осуществления рабочий объем составляет между 10 и 1000 л, предпочтительно между 20 и 800 л, например между 30 и 600 л, например между 50 и 500 л, например приблизительно 250 л или приблизительно 500 л. Преимущество использования биореакторов с рабочим объемом согласно изобретению состоит в том, что избегают использования биореакторов с очень большим объемом, т.е. биореакторов с рабочим объемом, значительно превышающим 2000 л, предпочтительно 1000 л, и, таким образом, не требуется очень больших вложений капитала и времени для конструирования такого очень большого биореактора. Кроме того, продукт, т.е. гАб, является значительно более концентрированным, когда используют способы по настоящему изобретению, которые экономят время и расходы на сбор и/или дальнейшую переработку гАб из биореакторов. Рабочий объем представляет собой эффективный объем культуры в биореакторе. Смесительные емкости, как правило, имеют отношение высоты к диаметру от 1:1 до 3:1. Культуру обычно смешивают с помощью одного или нескольких смесителей на основе дисков с лезвиями или паттернов гребного винта. Описаны смесительные системы, обеспечивающие меньшие сдвиговые усилия, чем лезвия. Смешение может запускаться либо прямо, либо непрямо с помощью соединенных магнитом приводов. Непрямые приводы снижают риск микробной контаминации посредством изоляции на валах мешалки. Оборудование и управление указанных биореакторов включают (но не ограничиваются ими): управ- 5 023816 ление перемешиванием, температурой, растворенным кислородом, рН и бимассой. Перемешивание, рН, температура, концентрация растворенного кислорода клеточной культуральной среды, в принципе, не являются критичными и зависят от типа выбранной клетки. Предпочтительно перемешивание, рН, температуру, концентрацию растворенного кислорода выбирают так, чтобы они были оптимальными для роста клеток. Специалисту в данной области известно, как найти оптимальные перемешивание, рН, температуру, концентрацию растворенного кислорода для культивирования. Как правило, оптимальное перемешивание проводят при 50 и 300 об/мин, например 100-250 об/мин, оптимальное значение рН составляет от 6,7 до 7,7, оптимальная температура составляет от 30 до 39°С, например 34, 35, 36, 37 или 38°С.
Большинство крупномасштабных суспензионных культур работают в качестве периодических процессов или периодических процессов с подпиткой, поскольку они наиболее просты для управления и масштабирования. Однако, непрерывные процессы на основе перфузионных принципов становятся более распространенными. В соответствии с настоящим изобретением продуцирующие клетки культивируют в перфузионной системе. Перфузионное культивирование клеток имеет его общепринятое значение в данной области, т.е. оно означает, что в процессе культивирования клетки удерживаются в устройстве для разделения, в котором имеется выход жидкости, имеющей более низкую плотность клеток, чем перед разделением, и в котором имеется приток клеточной культуральной среды. Использование перфузионной культуры является решением задачи выращивания клеток с высокой плотностью (например 10-50х106 жизнеспособных клеток/мл). Для увеличения плотности выше 2-4х106 жизнеспособных клеток/мл, среду постоянно, или периодически, заменяют свежей подаваемой средой для компенсации дефицита питательных веществ и для удаления токсических продуктов. Перфузия также позволяет лучший контроль условий культивирования (рН, άθ2, уровни питательных веществ, и т.д.). Перфузии свежей среды через культуру можно достигать путем удержания клеток в различных устройствах для разделения (например, центробежный фильтр с мелкой сеткой, мембранные фильтры с полыми волокнами или мембранные фильтры в виде плоских пластин, трубки для осаждения). В предпочтительных вариантах осуществления способа по настоящему изобретению устройство для разделения представляет собой фильтрующий модуль, содержащий полые волокна.
Под термином полое волокно понимают трубчатую мембрану. Внутренний диаметр трубки предпочтительно составляет между 0,3 и 6,0 мм, более предпочтительно между 0,5 и 3,0 мм, наиболее предпочтительно между 0,5 и 2,0 мм. В определенных вариантах осуществления размер сита (размер пор) в мембране выбирают так, чтобы размер пор в сите был близок к диаметру клеток, обеспечивая высокое удержание клеток, в то время как клеточный дебрис может проходить через фильтр. В других вариантах осуществления размер сита является существенно меньшим, чем диаметр клеток. Предпочтительно размер сита составляет приблизительно 0,1-30 мкм, например от 0,1 до 3 мкм, например приблизительно 0,2 мкм. Фильтрующие модули, содержащие полые волокна, коммерчески доступны, например, от Оеиега1 Е1ес1пс (ранее Атегкйат). В ходе процесса по настоящему изобретению не наблюдали значительных количеств аденовирусных частиц в выходящей культуральной среде, несмотря на то что вирусные частицы имеют меньшие размеры, чем используемый размер сита.
Перфузию используют для поддержания желаемых уровней определенных метаболитов и для удаления и, тем самым, снижения примесей в культуральной среде. Скорость перфузии можно измерять различными путями, например, в значениях объемов на замену/единица времени или в значениях уровней определенных метаболитов, которые должны поддерживаться, в процессе периодов перфузии. Обычно, перфузию не проводят все время в процессе культивирования и, как правило, ее проводят только время от времени в процессе культивирования, как желательно. Например, перфузию обычно не начинают до тех пор, пока определенные компоненты среды, такие как глюкоза, не начинают истощаться и не становится необходимым их заменить.
В данной области известно несколько перфузионных систем, и они, в принципе, пригодны для способов по настоящему изобретению. Под термином перфузионная система подразумевают комбинацию биореактора, соединенного с устройством для разделения. Устройство для разделения может либо быть включено в биореактор (например, центробежный фильтр с мелкой сеткой), либо оставаться вне биореактора (например полые волокна). В обоих случаях, как объяснено выше, устройство для разделения препятствует вымыванию клеточной массы из реактора и обеспечивает обновление среды.
Авторы настоящего изобретения провели предварительные эксперименты с несколькими перфузионными системами, среди которых перфузионная система переменного тангенциального потока (АТР) дала наилучшие результаты. Таким образом, в предпочтительном варианте осуществления изобретения биореакторы работают (соединены) с перфузионной системой АТР (например, АТР §ук!ет, Кейпе Тесйпо1оду, Со., Еак! Напоуег, N1). Эта система состоит из диафрагменного насоса, вмонтированного в один конец корпуса с полыми фибрами. Другой конец корпуса соединен с узлом сочленения, который, в свою очередь, соединен с биореактором через доступное отверстие. Диафрагменный насос и контролирующая система служат для создания переменного тангенциального потока через полые волокна. Это означает, что существует один поток в том же направлении (т.е. тангенциальный), что и поверхности мембран полых волокон, который течет вперед и назад, и что существует поток в направлении, по существу, пер- 6 023816 пендикулярном указанной поверхности фильтра. Тангенциальный поток может быть достигнут согласно способам, известным специалисту в данной области, и как описано, например, в И8 6544424.
Работа перфузионной системы ΑΤΡ была описана (Ригеу, 2002). Системы ΑΤΡ позволяют культивирование клеток в течение более длительного периода времени и достижение высокой плотности клеток без наличия блокированного фильтра. Действительно, с использованием перфузионной системы ΑΤΡ можно достигать чрезвычайно высокой плотности клеток свыше 100х106 жизнеспособных клеток/мл, например в случае клеток РЕК.С6 (см. например Уа11ор е1 а1.). Однако, в более ранних сообщениях клетки РЕК.С6 в перфузионных системах использовали для совершенно другой цели и не инфицировали аденовирусом.
Дополнительное преимущество системы ΑΤΡ состоит в том, что эта система создает низкое напряжение сдвига. Энергия подается к поверхности жидкости, создавая ламинарный поток с низким сдвигом. Это может быть преимуществом особенно для настоящего изобретения, где клетки инфицированы аденовирусом. В процессе перфузии, после инфекции, с помощью системы ΆΤΡ не было выявлено снижения клеточной плотности и не наблюдали преждевременной утраты клеток, но скорее наблюдали даже клеточный рост. Поскольку клетки остаются неизмененными, создаются оптимальные условия для размножения вируса.
Таким образом, перфузия с помощью системы ΆΤΡ является преимущественной в фазу предварительного культивирования (стадия в соответствии с настоящим изобретением), поскольку она позволяет достигнуть очень высокой клеточной плотности, и клетки находятся в хорошем состоянии для последующего инфицирования аденовирусом, что, возможно, вносит вклад в высокие достигнутые выходы. Для достижения указанной высокой плотности клеток культуральную среду в определенных вариантах осуществления по меньшей мере частично подвергают перфузии в течение периода времени в процессе клеточного роста продуцирующих клеток (стадия а). В определенных вариантах осуществления перфузию начинают после достижения клеточной плотности от 2х106 жизнеспособных клеток/мл до 8х106 жизнеспособных клеток/мл.
Кроме того, перфузия с помощью системы ΆΤΡ является преимущественной после стадии инфицирования (стадия с в соответствии с настоящим изобретением), поскольку она позволяет получить очень высокие выходы аденовируса из инфицированных клеток. Таким образом, в предпочтительных вариантах осуществления как на стадии предварительного культивирования, так и на стадии после инфицирования в способах по изобретению используется перфузионная система ΆΤΡ. Объем культуральной среды, используемый в процессе ΆΤΡ, может варьировать в соответствии с потребностями клеток, как может легко установить и скорректировать квалифицированный специалист, и, как правило, он варьирует в диапазоне 0,5-5 об./сутки, например между 1 и 3 об./сутки, например приблизительно 2 об./сутки. В определенных преимущественных вариантах осуществления скорость обновления составляет приблизительно между 1 и 2 об./сутки, поскольку авторы изобретения продемонстрировали в настоящем описании, что это обеспечивает очень хорошие результаты с точки зрения выхода и качества полученного гАб26, и в то же время расход среды в единицу времени и, таким образом, затраты, связанные с ним, тем не менее, являются умеренными.
Наконец, перфузионная система ΑΤΡ является масштабируемой системой. Доступны элементы ΑΤΡ разного размера. Поскольку для пропускания культуры через мембрану с полыми волокнами используется поток воздуха, можно создать очень высокие скорости тангенциального потока с низким сдвигом, обеспечивающие использование этой технологии от Κ&Ό до масштаба продуцирования вплоть до 1000 л (Ригеу, 2002). Возможно, дальнейшая разработка позволит еще больше увеличение масштаба перфузионной системы ΑΤΡ.
В Уик е1 а1. гАб5 продуцируют с использованием опухолевой клеточной линии и весь процесс проводят в одном биореакторе, что отнимает приблизительно 8-10 суток в биореакторе для продуцирования. В определенных вариантах осуществления настоящего изобретения используют два различных биореактора: один для предварительного культивирования (стадия а; биореактор для предварительного культивирования), и один для инфицирования (стадия Ь) и культивирования после инфицирования (стадия с; биореактор для продуцирования) клеток. Преимущество использование двух отдельных биореакторов для этих стадий состоит в том, что требуется только приблизительно 1,5-6, как правило, приблизительно 4-5 суток культивирования в биореакторе для продуцирования, и, таким образом, в год можно проводить значительно больше циклов. Добавление большого количества свежей культуральной среды в процессе инфицирования, кроме того, является преимущественным для уменьшения объема культуральной среды, требуемого в ходе перфузии в биореакторе для продуцирования. В альтернативных вариантах осуществления также возможно проводить все стадии а-с по изобретению в одном биореакторе.
Инфицирование.
В способах по изобретению продуцирующие клетки инфицируют рекомбинантным аденовирусом. Как правило, вирус предоставляют соответствующей продуцирующей клетке в оптимальных условиях, позволяющих захват вируса. Оптимальные условия зависят от типа клетки и от типа выбранного аденовируса. Специалисту в данной области известно, как определить оптимальные условия, а именно для
- 7 023816 перемешивания, рН, температуры, растворенного кислорода (άΟ2 или ИО) , множественности инфекции (ΜΟΙ). Как правило, оптимальное перемешивание проводят при приблизительно между 50 и 300 об/мин, как правило, при приблизительно 100-200, например приблизительно 150, обычно ИО составляет 2060%, например 40%, оптимальное значение рН составляет между 6,7 и 7,7, оптимальная температура составляет между 30 и 39°С, например 34-37°С, и оптимальная ΜΟΙ составляет между 5 и 1000, например приблизительно 50-300. Как правило, аденовирус инфицирует продуцирующие клетки самопроизвольно, и приведение продуцирующих клеток в контакт с частицами гЛб является достаточным для инфицирования клеток. Как правило, исходный раствор с исходным аденовирусом добавляют в культуру для инфицирования, а затем аденовирус размножается в продуцирующих клетках. Все это является стандартным действием для специалиста в данной области.
В определенном варианте осуществления настоящего изобретения перфузию останавливают перед инфицированием и возобновляют через приблизительно 1-20 ч, например 3-15 ч, например 5 ч после инфицирования. Эта задержка должна позволить вирусным частицам проникнуть в клетки и предотвратить вымывание вирусных частиц из системы. Скорости перфузии после инфицирования определяются по уровню глюкозы, который поддерживается с помощью перфузии. Например, в настоящем изобретении концентрацию глюкозы в среде обычно поддерживают на уровне приблизительно между 2 и 20 ммоль/л, как правило, приблизительно между 5 и 10 ммоль/л.
Было возможно преимущественно инфицировать биореактор гЛб26 при высокой плотности, т.е. выше 10х106 жизнеспособных клеток/мл, при сохранении высокого выхода вируса на клетку. В определенных вариантах осуществления удельная продуктивность сохраняется на уровне приблизительно между 0,5х105 и 1,5х105 УР/клетка.
Более того, в настоящем изобретении жизнеспособность клеточной культуры до инфицирования сохраняется на уровне выше 75%. Это означает, что по меньшей мере 75% всего количества клеток в культуре являются жизнеспособными в момент инифицирования. В определенных вариантах осуществления жизнеспособность клеточной культуры в момент инфицирования составляет по меньшей мере 80%, в следующих вариантах осуществления по меньшей мере 85%. Жизнеспособность можно определять с использованием общепринятых способов, доступных специалисту в данной области, например, исключения трипанового синего, подсчета клеток Саку, и т.п.
В определенном варианте осуществления плотность клеток в момент инфицирования составляет приблизительно между 10х106 и 50х106 жизнеспособных клеток/мл, например приблизительно между 10х106 и 20х106 жизнеспособных клеток/мл, например приблизительно между 10х106 и 15х106 жизнеспособных клеток/мл, например приблизительно между 10х106 и 14х106 жизнеспособных клеток/мл. Эта клеточная плотность обеспечивает высокий выход вируса при ограниченном накоплении клеточного дебриса и ДНК клеток-хозяев, что обеспечивает преимущество этих вариантов осуществления при последующей переработке собранного аденовируса. Таким образом, настоящее изобретение относится к оптимизированному способу продуцирования гАб26. обеспечивающему высокие количества частиц гЛб26 высокого качества, и в то же время обеспечивающему собранный материал, который, тем не менее, пригоден для целей последующей переработки.
Инфицирование при этих плотностях клеток может обеспечивать еще более высокие концентрации рекомбинантного аденовируса, в частности гЛб26, и превосходит выходы для гЛб26, описанные до настоящего времени. Как показано впервые в рамках настоящего изобретения, в противоположность инфицированию гЛб5 при высокой плотности (свыше 10х106 жизнеспособных клеток/мл), инфицирование гЛб26 при плотностях свыше 10х106 жизнеспособных клеток/мл, тем не менее, увеличивало объемный выход гЛб26 при увеличении клеточных плотностей вплоть до по меньшей мере 16х 106 жизнеспособных клеток/мл при инфицировании, с использованием продуцирующих клеток в суспензии с перфузионной системой. В предпочтительном варианте осуществления изобретения предусмотрен способ продуцирования по меньшей мере 1х 1012 вирусных частиц гЛб26 (УР)/мл.
Способы по настоящему изобретению позволяют выделение гЛб26 с отношением физических частиц к инфекционным частицам менее 30:1, которое является важным параметром для аденовируса, который подлежит введению человеку. Его можно измерять в качестве отношения вирусная частица (УР)/инфекционная единица (Ιυ), например, с использованием анализа ОРЛ (\Уапд с1 а1., 2005). Более низкое отношение является преимущественным, поскольку в таком случае меньше вирусных частиц необходимо вводить для инфицирования того же количества клеток. Текущие нормы РИЛ требуют, чтобы отношение УР/Ιυ составляло менее 30:1, и, таким образом, способы по изобретению, описанные в настоящем описании, пригодны для получения больших количеств гЛб26, которые удовлетворяют этому конкретному требованию. Авторы Уик с1 а1. (2004) описали более низкие абсолютные количества вирусных частиц, чем количества, описанные в настоящем описании, и, кроме того, отношение УР/Ιυ для образцов, описанных Уик с1 а1. (2004), составляет приблизительно 100 (фиг. 2А/2В в Уик с1 а1., 2004). Напротив, авторы настоящего изобретения описывают более высокие абсолютные выходы и, более того, значительно лучшие отношения УР/Ιυ, составляющие менее 20:1. Таким образом, в определенных предпочтительных вариантах осуществления способы по изобретению обеспечивают партии гЛб26, которые
- 8 023816 имеют отношение УР/Ш менее чем 20:1, например от приблизительно 20:1 до приблизительно 5:1.
Способы сбора и лизиса клеток.
После инфицирования аденовирусом вирус реплицируется внутри клетки и, тем самым, амплифицируется. Аденовирусная инфекция в конечном итоге приводит к лизису инфицированных клеток. Литические характеристики аденовируса, таким образом, позволяют два различных пути продуцирования вируса. Первый путь состоит в сборе вируса до лизиса клеток с использованием внешних факторов для лизиса клеток. Второй путь состоит в сборе супернатанта с вирусом после (практически) полного лизиса клеток продуцированным вирусом (см. например патент США 6485958, в котором описан сбор аденовируса без лизиса клеток-хозяев с помощью внешнего фактора). Для последнего пути требуется более длительное время инкубации для достижения полного лизиса клеток и, таким образом, высоких выходов вируса. Более того, постепенный выход содержимого клеток-хозяев в среду может быть вредоносным для целостности и выхода полученных вирусов. Таким образом, согласно изобретению предпочтительно использовать внешние факторы для активного лизиса клеток для сбора аденовируса.
Способы, которые можно использовать для активного лизиса клеток, известны специалисту в данной области, и рассмотрены, например, в \УО 98/22588, с. 28-35. Пригодными способами в этом отношении являются, например, замораживание-размораживание, сдвиговое напряжение в твердом состоянии, гипертонический и/или гипотонический лизис, сдвиговое напряжение в жидком состоянии, обработка ультразвуком, экструзия высокого давления, лизис детергентом, комбинации вышесказанных способов и т.п. В одном варианте осуществления изобретения клетки подвергают лизису с использованием по меньшей мере одного детергента. Использование детергента для лизиса имеет преимущество в том, что оно представляет собой простой способ, который легко масштабируется.
Детергенты, которые можно использовать, и способ их использования, главным образом, известны специалисту в данной области. Несколько примеров, например, рассмотрены в \УО 98/22588, с. 29-33. Детергенты, как используют в рамках изобретения, могут включать анионные, катионные, цвиттерионные и неионные детергенты. Специалисту в данной области очевидно, что концентрация детергента может варьировать, например, в диапазоне приблизительно 0,1-5% мас./мас. В одном варианте осуществления используемым детергентом является ТгНоп Х-100.
Для удаления контаминирующих нуклеиновых кислот, т.е., главным образом, нуклеиновых кислот продуцирующих клеток можно использовать нуклеазу. Иллюстративные нуклеазы, пригодные для применения в настоящем изобретении, включают Веп/опахе®, Ри1то/утс® или любую другую ДНКазу и/или РНКазу, обычно используемую в данной области. В предпочтительных вариантах осуществления нуклеаза представляет собой Всп/опахс®, которая быстро гидролизует нуклеиновые кислоты путем гидролиза внутренних фосфодиэфирных связей между конкретными нуклеотидами, тем самым снижая вязкость клеточного лизата. Веп/опахе®® можно коммерчески приобретать от Мегск КСаА (код ^214950). Концентрация, в которой используют нуклеазу, предпочтительно находится в диапазоне 1-100 единиц/мл.
Способы сбора аденовируса из культур продуцирующих клеток подробно описаны в \УО 2005/080556.
В соответствии с настоящим изобретением время сбора составляет приблизительно между 24 и 120 ч после инфицирования, например приблизительно между 48 и 96 ч после инфицирования, например 72 ч после инфицирования.
Способы очистки.
В определенных вариантах осуществления собранный аденовирус далее очищают.
Очистку аденовируса можно проводить на нескольких стадиях, включающих процеживание, ультрафильтрацию, диафильтрацию или разделение с помощью хроматографии, как описано, например, в \УО 05/080556, включенной в настоящее описание в качестве ссылки.
Процеживание проводят с помощью стадии фильтрации, удаляющей клеточный дебрис и другие примеси из клеточного лизата. Ультрафильтрацию используют для концентрации раствора вируса. Диафильтрация или замена буфер с использованием ультрафильтров является способом удаления и замены солей, сахаров и т.п. Специалисту в данной области известно, как найти оптимальные условия для каждой стадии очистки. Также в \УО 98/22588, включенной в настоящее описание в качестве ссылки, описаны способы продуцирования и очистки аденовирусных векторов. Способы включают выращивание клеток-хозяев, инфицирование клеток-хозяев аденовирусом, сбор и лизис клеток-хозяев, концентрирование неочищенного лизата, замену буфера неочищенного лизата, обработку лизата нуклеазой и дальнейшую очистку вируса с использованием хроматографии.
Очистку, например, можно проводить центрифугированием в градиенте плотности, как описано, например, в \УО 98/22588, с. 59-61.
Однако, предпочтительно в очистке используется по меньшей мере одна стадия хроматографии, например, как описано в \УО 98/22588, с. 61-70. Для дальнейшей очистки аденовирусов описано множество способов, где в способ включены стадии хроматографии. Специалисту в данной области известны эти способы, и он может варьировать точный способ использования стадий хроматографии для оптимизации
- 9 023816 способа.
Например, можно очищать аденовирусы с помощью стадий анионообменной хроматографии, см. например νθ 05/080556. Для очистки аденовируса предпочтительно использовать по меньшей мере одну стадию анионообменной хроматографии. После стадии анионообменной хроматографии вирус может быть достаточно чистым. Однако, в определенных вариантах осуществления далее проводят стадию эксклюзионной хроматографии для увеличения надежности способа. Эта стадия может быть до или после стадии анионообменной хроматографии. Очевидно, со стадией анионообменной хроматографии также можно пригодным образом комбинировать другие стадии очистки.
Использование анионообменной хроматографии для очистки аденовируса подробно описано, и, таким образом, этот аспект находится в пределах досягаемости специалиста в данной области. Для очистки используют и пригодны множество различных хроматографических матриц, и специалист в данной области может легко найти оптимальный анионообменный материал для очистки вируса, например, руководствуясь перечисленными документами уровня техники.
В патенте США 5837520 (также см. НиудЬе е! а1., 1995, Нитап Оеие ТЬегару 6: 1403-1416) описан способ очистки аденовируса, где лизат клетки-хозяина обрабатывают нуклеазой с последующей анионообменной хроматографией и аффинной хроматографией с ионами металлов.
В патенте США 6485958 описано применение сильной анионообменной хроматографии для очистки рекомбинантного аденовируса.
Анионообменную хроматографию для очистки аденовирусных частиц используют на колонках с псевдоожиженным слоем, см. νθ 00/50573.
Кроме того, анионообменная хроматография с восходящим движением жидкости и определенные хроматографические смолы для анионообменной хроматографии для очистки аденовирусных частиц описаны в патенте США 6586226.
В дополнение к анионообменным колонкам, пригодны продукты анионообменной мембранной хроматографии, такие как продукты, производимые Ра11 (например, серии Мик1аид™) и §атЮгшк (например серии §ат!оЫпД). Для применения этих фильтров и их преимуществ для очистки аденовируса см., например, νθ 03/078592 и νθ 2005/080556.
В патенте США 6537793 описана очистка аденовирусных частиц из клеток-хозяев с использованием ионообменной хроматографии, в частности описана предпочтительность хроматографической подложки типов С ЗерЬатоке ХЬ для этой цели. В одном варианте осуществления настоящего изобретения аденовирус далее очищают с использованием колонки С ЗерЬатоке ХЬ.
В способе очистки может быть пригодным образом использована стадия эксклюзионной хроматографии.
В международной заявке νθ 97/08298 описана очистка аденовирусов с использованием определенных хроматографических матриц для предупреждения повреждения вирусов, включая анионообменную и эксклюзионную стадии. В патенте США 6261823 описан способ очистки аденовируса, где препарат аденовируса подвергают анионообменной хроматографии, а затем эксклюзионной хроматографии. На эксклюзионной стадии достигают группового отделения вирусных частиц от примесей с низкой молекулярной массой.
Также можно использовать гидроксиапатитный носитель для очистки аденовируса, см. νθ 02/44348.
Также можно использовать стадию обращенно-фазовой адсорбции, как описано, например, в νθ 03/097797, с. 26.
В международной заявке νθ 97/08298 описана очистка аденовирусов с использованием определенных хроматографических матриц для предупреждения повреждения вирусов, включая анионообменную и эксклюзионную стадии.
Определенные способы ультрафильтрации также в высокой степени пригодны для очистки аденовируса, как описано в νθ 2006/108707. Такие стадии можно проводить в дополнение к определенным стадиям хроматографической очистки или вместо них.
Следующие преимущественные способы очистки аденовирусов из культур с высокой плотностью клеток описаны заявителем в заявках ЕР 09173090.3 и ЕР 09173119.0, поданных 15 октября 2009 г., обе из которых включены в настоящее описание в качестве ссылок в полном объеме.
Получение фармацевтического препарата.
В определенных вариантах осуществления очищенный аденовирус включают в состав фармацевтической композиции. Это можно осуществлять различными способами и с использованием различных буферов, все из них согласно общепринятым способам, хорошо известным специалисту в данной области. Как правило, это охватывает включение аденовирусных частиц в фармацевтически приемлемую композицию, содержащую аденовирус и по меньшей мере один фармацевтически приемлемый эксципиент. Такую композицию можно получать в условиях, известных специалисту в данной области, и в определенных вариантах осуществления она пригодна для введения человеку.
Например, аденовирус можно подвергать замене буфера в ходе группового разделения на буфер, который также используется для мирового стандарта для аденовируса (Нодаикои е! а1., Эеуе1ортеп1 о£ а
- 10 023816
81аЪ1е абепоу1га1 усс1ог Ιοπηιιίαΐίοη. Вюргосеззшд МагсЬ 2002, р. 43-48): 20 мМ Ττίδ рН 8, 25 мМ ЫаС1, 2,5% глицерин, и в итоге хранить в нем.
Очевидно, можно использовать множество других буферов, и несколько примеров подходящих составов для хранения и фармацевтического введения очищенных (адено)вирусных препаратов могут быть найдены, например, в патенте Европы № 0853660 и в международных патентных заявках ШО 99/41416, ШО 99/12568, ШО 00/29024, ШО 01/66137, ШО 03/049763.
В определенных вариантах осуществления аденовирусные векторы используют в качестве вакцин, и они, как правило, содержатся в фармацевтически приемлемых носителях или эксципиентах и/или разбавителях. Фармацевтически приемлемые носители или эксципиенты и разбавители хорошо известны в данной области и их широко используют в широком диапазоне терапевтических продуктов.
Предпочтительно используют носители, которые хорошо работают в вакцинах. Более предпочтительно вакцины, кроме того, содержат адъювант. Адъюванты известны в данной области для дальнейшего увеличения иммунного ответа на применяемую антигенную детерминанту, и фармацевтические композиции, содержащие аденовирус и адъювант на основе фосфата алюминия, описаны, например, в ШО 2007/110409.
Для введения человеку могут использоваться фармацевтические композиции по изобретению, содержащие τΑά и фармацевтически приемлемый носитель или эксципиент. В данном контексте термин фармацевтически приемлемый означает, что носитель или эксципиент в используемых дозировках и концентрациях не вызовет каких-либо нежелательных или вредоносных эффектов у индивидуумов, которым их вводят. Такие фармацевтически приемлемые носители и эксципиенты хорошо известны в данной области (см. РетшдЮп'з РЬагтасеийса1 Баепсез, 181П ебйоп, Α. К. Оеппато, Εά., Маск РиЪЬзЬшд Сотрапу [1990]; РЬагтасеийса1 Ротти1айоп Оеуе1ортеп1 о! Рерййек апб Рто1еш8, 8. Ргок)аег апб Ь. Ноудаатй, Εάδ., Тау1ог & Ртапс18 [2000]; и НапбЪоок о! РЬаттасеиЬса1 Ехс1р1еп18, 3гб ебйоп, Α. КтЪЪе, Εά., РЬаттасеиЬса1 Рте88 [2000]). Очищенный τΑά предпочтительно изготавливают и вводят в качестве стерильного раствора, хотя в объем этого изобретения входит использование лиофилизированных препаратов. Стерильные растворы получают стерильной фильтрацией или с помощью других способов, по существу, известных в данной области. Затем растворы лиофилизируют и помещают в контейнеры с фармацевтическими дозами. рН раствора, как правило, находится в диапазоне между рН 3,0 и 9,5, например между рН 5,0 и 7,5. τΑά, как правило, находится в растворе, имеющем пригодный фармацевтически приемлемый буфер, и раствор τΑά также может содержать соль. Необязательно может присутствовать стабилизатор, такой как альбумин. В определенных вариантах осуществления добавляют детергент. В определенных вариантах осуществления τΑά может быть изготовлен в виде инъецируемого препарата. Эти составы содержат эффективные количества τΑά, представляют собой стерильные жидкие растворы, жидкие суспензии или лиофилизированные версии и необязательно содержат стабилизаторы или эксципиенты.
Настоящее изобретение относится к способам продуцирования аденовирусных векторов, в частности τΑά26, с очень высокими выходами, и, насколько известно авторам настоящего изобретения, полученные и описанные в настоящем описании выходы ранее не были описаны. В способах по изобретению используют биореакторы и биореактор с очень высоким количеством аденовирусных частиц на объем является непосредственным (промежуточным) продуктом по изобретению.
Культуральная среда может представлять собой любую культуральную среду, пригодную для размножения клеток и инфицирования аденовирусом, как описано выше. Аспекты объема биореактора, продуцирующих клеток и количества частиц τΑά26 и отношения УР/Щ являются такими, как описано выше для способов по изобретению. В предпочтительных вариантах осуществления биореактор соединен с перфузионной системой ΑΤΡ.
В другом аспекте изобретение относится к способу продуцирования по меньшей мере 1 х 1012 вирусных частиц τΑά26 (УР)/мл, причем способ включает: а) культивирование продуцирующих клеток в суспензии с помощью перфузионной системы; Ъ) инфицирование указанных клеток при плотности от 10х106 жизнеспособных клеток/мл до 15х106 жизнеспособных клеток/мл посредством τΑά26; с) дальнейшее культивирование инфицированных клеток с помощью перфузионной системы для размножения указанного τΑά26, где концентрация вирусных частиц τΑά26 достигает по меньшей мере 1х1012 УР/мл; и ά) сбор указанного τΑά26. До настоящего изобретения было неизвестно, являются ли такие высокие выходы τΑά26 вообще осуществимыми, не говоря о том, как достигнуть таких высоких выходов. Настоящее изобретение показывает, что такие выходы возможны в соответствии со способами, описанными в настоящем описании. Предпочтительно отношение физических частиц к инфекционным частицам в собранном τΑά26 составляет менее 30:1. Другие преимущественные варианты осуществления являются такими, как описано для способов в соответствии с изобретением, описанных выше.
Кроме того, изобретение поясняется в следующих примерах. Примеры не ограничивают изобретение никоим образом. Они служат только для пояснения изобретения.
- 11 023816
Примеры
Пример 1. Инфицирование при высокой плотности клеток вектором Л65.
Из рабочего банка клеток РЕК.С6® клетки размораживали и размножали в бессывороточной культуральной среде в инкубаторе с увлажнением при 37°С и 10% СО2. Субкультивирование проводили каждые от 3 до 4 суток, пока не достигали достаточной клеточной плотности для инокуляции 2-л биореактора при объеме 1,5 л и плотности клеток от 0,2 до 0,5х 106 жизнеспособных клеток/мл. Клетки размножали в биореакторе при 37°С, ИО 40%, и рН 7,3. Процесс перфузии АТР начинали при клеточной плотности 4,7х106 всех клеток/мл. АТР была от Кейпе Теейио1о§у, Со., Еак! Напоуег, N1. Через 89 ч клеточная плотность достигала 12,4х106 всех клеток/мл. В этот момент часть клеток собирали и клетки центрифугировали в течение 5 мин при 300д. Клеточный осадок ресуспендировали до следующих концентраций в свежей бессывороточной среде:
1,3х106 жизнеспособных клеток/мл, 30 мл/вращающийся флакон, два 250-мл вращающихся флакона
10х106 жизнеспособных клеток/мл, 30 мл/вращающийся флакон, два 250-мл вращающихся флакона
20х106 жизнеспособных клеток/мл, 30 мл/вращающийся флакон, два 250-мл вращающихся флакона
30х106 жизнеспособных клеток/мл, 30 мл/вращающийся флакон, два 250-мл вращающихся флакона
Вращающиеся флаконы инфицировали А65.С8 (вектор гАб5; §йой е1 а1., 2008) при МО1 90 УР/клетка и инкубировали при 36°С, 10% СО2 и 100 об./мин. На 1 и 2 сутки после инфицирования проводили обновление среды для вращающихся флаконов, инкубированных при 10, 20 и 30х106 жизнеспособных клеток/мл. Это обновление среды проводили с помощью стадии центрифугирования в течение 5 мин при 300д и ресуспендирования клеточного осадка в 30 мл свежей среды на вращающийся флакон. На 3 сутки после инфицирования вращающиеся флаконы собирали и отбирали образцы для анализа АЕХ-ВЭЖХ. Лизис собранных клеток проводили путем смешения образца объемом 1 мл из каждого вращающегося флакона с 100 мкл 10% Тгйои Х-100 и инкубации при 37°С в течение 30 мин. После инкубации образцы смешивали с 2,42 Веп/опахе/МдСР с последующей стадией инкубации в течение 30 мин при 37°С. Наконец к образцам добавляли 100 мкл 50% сахарозы. После стадии центрифугирования в течение 5 минут при 2500д образцы хранили при температуре ниже -65°С до проведения анализа АЕХВЭЖХ для определения количества продуцированных вирусных частиц (УР/мл). Результаты представлены на фиг. 1.
Объемный выход инфицирования при клеточной плотности 10х106 жизнеспособных клеток/мл был в 10 раз выше, чем при 1х106 жизнеспособных клеток/мл. Это было в некоторой степени неожиданным, учитывая эффект клеточной плотности, описанный в более ранних сообщениях при значительно более низких плотностях (т.е. при приблизительно 0,5-3х 106 клеток/мл, например Магапда е1 а1., 2005; Катей е1 а1., 2004; АИагак е1 а1., 2005). Однако при плотности более 10х106 клеток/мл наблюдали эффект клеточной плотности и объемный выход снижался. Таким образом, в случае рекомбинантного А65 в перфузионной системе наблюдают эффект клеточной плотности.
Пример 2. Инфицирование гАб35 при низкой плотности клеток (1-1,6х106 жизнеспособных клеток/мл).
В примере 1 использовали гАб5. Однако, известны и были описаны для различных целей различные серотипы аденовирусов. Эти серотипы могут иметь различные свойства, и, таким образом, способы, пригодные для одного серотипа, не всегда обязательно пригодны для другого серотипа. Это может иметь особое значение в процессах промышленного масштаба, где вроде бы небольшие отличия иметь могут иметь большое экономическое значение. Одним из особенно преимущественных серотипов для применения, например в вакцинах, является А635, и в следующих примерах авторы настоящего изобретения протестировали возможность улучшения выходов гАб35 для получения больших его количеств. В этом примере продемонстрировано инфицирование вектором гАб35 при низкой плотности клеток по сравнению со следующими примерами, где клетки инфицируют при более высокой плотности клеток.
Из рабочего банка клеток РЕК.С6® клетки размораживали и размножали в бессывороточной культуральной среде в инкубаторе с увлажнением при 37°С и 10% СО2. Субкультивирование проводили каждые от 3 до 4 суток, пока не достигали достаточной клеточной плотности для инокуляции 10-л биореактора при объеме 5 л и плотности клеток от 0,2 до 0,35х 106 жизнеспособных клеток/мл. Клетки размножали в биореакторе при 37°С, ИО 40%, и рН 7,3. Через четверо суток после инокуляции (когда плотность клеток достигала от 2 до 3,5х106 жизнеспособных клеток/мл) клеточную суспензию разбавляли 5 л свежей среды, а затем инфицировали гАб35.ТВ-§ (вектор гАб35; Кабо8еу1е е1 а1., 2007) при МО1 70 УР/клетка. Размножение вируса проводили при 36°С, рН 7,3 и ИО 40%. Через трое суток после инфицирования проводили взятие образцов для подсчета клеток и определения продуцирования вируса. Для высвобождения вируса 1 мл образца из каждого биореактора смешивали со 100 мкл 10% Тгйои Х-100 и инкубировали при 37°С в течение 30 мин. После инкубации образцы смешивали с 2,42 мкл Веп/опахе/МдСТ с последующей стадией инкубации в течение 30 мин при 37°С. Наконец, к образцам добавляли 100 мкл, 50% сахарозы. После стадии центрифугирования в течение 5 мин при 2500д образцы хранили при температуре ниже -65°С до анализа посредством АЕХ-ВЭЖХ. Проводили всего десять циклов в биореакторе и проводили анализ согласно описанному выше способу, и эти циклы дали согласую- 12 023816 щиеся результаты (не представлено). Средний выход вирусных частиц составлял 2,3χ 1011 УР/мл.
Для ежегодной потребности, составляющей приблизительно 1,5х1019 УР, при таком выходе потребуется приблизительно 65000 л. Это потребовало бы больших установок и, таким образом, больших предварительных капиталовложений в ходе разработки вакцины.
Пример 3. Исследование выполнимости процесса инфицирования гАб35 при высокой клеточной плотности (>10χ 106 жизнеспособных клеток/мл).
Из рабочего банка клеток РЕКС6® клетки размораживали и размножали в бессывороточной культуральной среде в инкубаторе с увлажнением при 37°С и 10% СО2. Субкультивирование проводили каждые от 3 до 4 суток, пока не достигали достаточной клеточной плотности для инокуляции 2 л биореактора при объеме 1,5 л и плотности клеток от 0,2 до 0,5х 106 жизнеспособных клеток/мл. Клетки размножали в биореакторе при 37°С, ΌΟ 40% и рН 7,3. Перфузию среды начинали при клеточной плотности 6,8х106 всех клеток/мл с использованием системы АТР. Через 70 ч клеточная плотность достигала 36,8х106 всех клеток/мл. В этот момент проводили следующее инфицирование.
Инфицирование во вращающихся флаконах при клеточной плотности:
1,3 χ 106 жизнеспособных клеток/мл, 30 мл/вращающийся флакон, два 250-мл вращающихся флакона
10х106 жизнеспособных клеток/мл, 30 мл/вращающийся флакон, два 250-мл вращающихся флакона
20χ106 жизнеспособных клеток/мл, 30 мл/вращающийся флакон, два 250-мл вращающихся флакона
30χ106 жизнеспособных клеток/мл, 30 мл/вращающийся флакон, два 250-мл вращающихся флакона
Инфицирование в масштабе биореактора 2л при 8,7 всех клеток/мл (жизнеспособность 84%) - через 1 ч после инфицирования биореактора образец отбирали из биореактора и переносили в два вращающихся флакона объемом 250 мл, по 30 мл/вращающийся флакон.
Для процесса инфицирования в 250-мл вращающихся флаконах клеточную суспензию из биореактора объемом 2 собирали, и эту суспензию центрифугировали в течение 5 мин при 300д. Клеточный осадок ресуспендировали до упомянутых выше концентраций в свежей бессывороточной среде. Вращающиеся флаконы инфицировали А635.ТВ-Б при ΜΟΙ 70 УР/клетка и инкубировали при 36°С, 10% СО2 и 100 об./мин. На 1 и 2 сутки после инфицирования проводили обновление среды для вращающихся флаконов, инфицированных при 10, 20 и 30χ106 жизнеспособных клеток/мл. Это обновление среды проводили с помощью стадии центрифугирования в течение 5 мин при 300§ и ресуспендирования клеточного осадка в 30 мл свежей среды на вращающийся флакон. На 3 сутки после инфицирования вращающиеся флаконы собирали и проводили взятие образцов для анализа АЕХ-ВЭЖХ. Лизис собранных клеток проводили путем смешения образца объемом 1 мл из каждого вращающегося флакона с 100 мкл 10% Тгйоп Х-100 и инкубации при 37°С в течение 30 мин. После инкубации образцы смешивали с 2,42 Всп/опахс/МдСЕ с последующей стадией инкубации в течение 30 мин при 37°С. Наконец к образцам добавляли 100 мкл 50% сахарозы. После стадии центрифугирования в течение 5 мин при 2500д образцы хранили при температуре ниже -65°С до проведения анализа АЕХ-ВЭЖХ.
Оставшиеся клетки в биореакторе объемом 2 л разбавляли свежей бессывороточной средой до концентрации клеток 8,7χ106 всех клеток/мл (жизнеспособность 84%). Биореактор инфицировали АЙ35.ТВ-Б при ΜΟΙ 70 УР/клетка и инкубировали при 36°С, рН 7,3 и ΌΟ 40%. Систему АТР запускали через 15 ч после инфицирования при скорости обновления среды 1 объем биореактора в сутки. На 1, 2, 3 и 4 сутки после инфицирования из биореактора проводили взятие образцов для подсчета клеток (цитометр САБУ) и определения выхода вируса с помощью АЕХ-ВЭЖХ. Приготовление образцов проводили, как описано выше. Образцы хранили при температуре ниже -65°С до проведения анализа АЕХ-ВЭЖХ.
Приблизительно через 1 ч после инфицирования биореактора из 2 л биореактора отбирали образец объемом по меньшей мере 60 мл и начинали два процесса инфицирования (в 250-мл вращающихся флаконах) в объеме 30 мл на вращающийся флакон. На 1 и 2 сутки после инфицирования проводили обновление среды для имитации перфузионной системы. Это обновление среды проводили посредством стадии центрифугирования в течение 5 мин при 300§ и ресуспендирования клеточного осадка в 30 мл свежей среды на вращающийся флакон. На 3 сутки после инфицирования проводили сбор из вращающихся флаконов и взятие образцов для анализа АЕХ-ВЭЖХ. Приготовление образцов проводили, как описано выше. Образцы хранили при температуре ниже -65°С до проведения анализа АЕХ-ВЭЖХ.
Результаты представлены на фиг. 2. Результаты демонстрируют, что является возможным инфицирование от 1,3χ 106 жизнеспособных клеток/мл до 30χ106 жизнеспособных клеток/мл. В противоположность результатам для гАб5 общие выходы гАб35 возрастали при увеличении плотности клеток при инфицировании даже образцов с более 10χ106 жизнеспособных клеток/мл. При 30χ106 жизнеспособных клеток/мл достигали объемного выхода 1,4χ 1012 УР/мл. Результаты отчетливо указывают на то, что является возможным инфицирование А035.ТВ-Б при высоких плотностях клеток, т.е. 10χ106 жизнеспособных клеток/мл или более. Даже при 30χ106 жизнеспособных клеток/мл, инфекции дали высокие объемные выходы.
Следует отметить, что наблюдают снижение продуктивности на единицу от 120000 УР/клетка при 1,3χ106 клеток до 47000 УР/клетка при 30χ106 жизнеспособных клеток/мл. Вращающиеся флаконы,
- 13 023816 культивирование в которых начинали с суспензии клеток, которые были инфицированы в биореакторе, демонстрируют выход при сборе 8,0х10п УР/мл и удельную продуктивность 92000 УР/клетка. Результаты в биореакторе объемом 2 л являются несколько более низкими: был получен выход при сборе 5х10п УР/мл, что соответствует продуктивности на единицу, составляющей 57000 УР/клетка.
Пример 4. Эксперименты в биореакторе по инфицированию при высокой клеточной плотности вектором гАб35.
1) Из рабочего банка клеток РЕК.С6® клетки размораживали и размножали в бессывороточной культуральной среде в инкубаторе с увлажнением при 37°С и 10% СО2. Субкультивирование проводили каждые от 3 до 4 суток, пока не достигали достаточной клеточной плотности для инокуляции 2 л биореактора при плотности клеток от 0,59х106 жизнеспособных клеток/мл. Клетки размножали в биореакторе при 37°С, IX) 40% и рН 7,3. Когда достигали плотности клеток приблизительно 2,9х106 всех клеток/мл (на 4 сутки после инокуляции) запускали систему АТР. После перфузии в течение 118 ч достигали клеточной плотности 29х106 всех клеток/мл. В этот момент времени часть клеточной суспензии собирали и остальные клетки разбавляли свежей среде в биореакторе объемом 2 до клеточной плотности 16,4х106 всех клеток/мл (жизнеспособность 82%, следовательно 13,4х106 жизнеспособных клеток/мл). Затем биореактор объемом 2 л инфицировали Аб35.ТВ-8 при ΜΟΙ 70 УР/клетка и инкубировали при 36°С, рН 7,3 и Ι)Ο 40%. Систему АТР запускали через 15 ч после инфицирования при средней скорости обновления 2 объема емкости в сутки. На 1, 2 и 3 сутки после инфицирования проводили взятие образцов из 2 л биореактора для подсчета клеток и определения выхода вируса с помощью АЕХ-ВЭЖХ. Для высвобождения вируса образец объемом 1 мл смешивали с 100 мкл 10% ТгИоп Х-100 и инкубировали при 37°С в течение 30 мин. После инкубации образец смешивали с 2,42 Веп/опазе/МдСР с последующей стадией инкубации в течение 30 мин при 37°С. Наконец, к образцам добавляли 100 мкл 50% сахарозы. После стадии центрифугирования в течение 5 мин при 2500д образцы хранили при температуре ниже -65°С до анализа способом АЕХ-ВЭЖХ. Результаты представлены в табл. 2.
Результаты продемонстрировали, что инфицирование при клеточной плотности более 10х106 жизнеспособных клеток/мл осуществимы в биореакторах, соединенных с перфузионной системой, и что возможно увеличить объемный выход практически в 10 раз по сравнению с периодическим процессом (пример 2). Не наблюдали преждевременной утраты клеток в инфицированной культуре, что указывает на то, что процесс АТР является пригодной системой для культивирования инфицированных клеток.
Таблица 2
Результаты для примера 4 (1)
Сутки после инфицирования Количество клеток (х106 всех клеток/мл) АЕХ-НРЬС (УР/мл) ζ)ΡΑ МЕ /мл ΑΕΧ/ΟΡΑ νΡ/ΜΕ
0 16,4 ΝΑ ΝΑ ΝΑ
1 21,4 Ниже ЬОО Ниже ЬОО ΝΑ
2 29,18 1,34х1012 2,23x1ο11 6,0
3 31,50 2,26х1012 3,16x1ο11 7,2
Требованием Р1)А для партий гАб является отношение УР/ΐυ <30. Анализ рРА (анализ эффективности на основе ^-ПЦР; А'апд е! а1., 2005) продемонстрировал, что все образцы удовлетворяют этому требованию. Напротив, образцы, описанные в Уик е! а1. (2004), имеют отношение УР/ΐυ приблизительно 100 (фиг. 2А-2В в ней). Отношение физических частиц к инфекционным частицам является значимым параметром для аденовирусов и более низкое отношение является предпочтительным для партий гАб. Партии, полученные согласно этому примеру, соответственно имеют такое низкое отношение, составляющее менее 10:1.
Для ежегодной потребности приблизительно 1,5х 1019 УР и с выходом приблизительно 2х1012 УР/мл необходимо переработать менее 7500 л собранной культуры. Эти объемы можно обрабатывать на установках объемом 1000 л или менее, и, таким образом, это снизило бы предварительные затраты на разработку вакцины.
2) Дополнительные эксперименты в биореакторе объемом 2 л.
Из рабочего банка клеток РЕК.С6® клетки размораживали и размножали в бессывороточной культуральной среде в инкубаторе с увлажнением при 37°С и 10% СО2. Субкультивирование проводили каждые от 3 до 4 суток, пока не достигали достаточной клеточной плотности для инокуляции 2 л биореактора при плотности клеток 0,44х106 жизнеспособных клеток/мл. Клетки размножали в биореакторе при 37°С, Ι)Ο 40% и рН 7,3. Систему АТР запускали через 4 суток после инокуляции при плотности клеток приблизительно 2,72х106 всех клеток/мл. После перфузии в течение 144 ч достигали плотности клеток 30,5х106 всех клеток/мл. В этот момент часть клеточной суспензии собирали и остальные клетки разбавляли свежей средой в биореакторе объемом 2 л до клеточной плотности 16,2х106 всех клеток/мл (жизнеспособность 81%, следовательно, 13,1х106 жизнеспособных клеток/мл). Затем биореактор объемом 2 л инфицировали Аб.35.ТВ-8 при ΜΟΙ 70 УР/клетка и инкубировали при 36°С, рН 7,3 и Ι)Ο 40%. Систему АТР запускали через 5 ч после инфицирования при скорости обновления среды 2 объема емкости в су- 14 023816 тки. На 2, 3 и 4 сутки после инфицирования проводили взятие образца из 2 л биореактора для подсчета клеток и продуцирования вируса с помощью АЕХ-ВЭЖХ. Для высвобождения вируса 1 мл образца смешивали с 100 мкл 10% Ττίΐοη Х-100 и инкубировали при 37°С в течение 30 мин. После инкубации образец смешивали с 2,42 мкл Всп/опавс/МдСЕ с последующей стадией инкубации в течение 30 мин при 37°С. Наконец, к образцам добавляли 100 мкл 50% сахарозы. После стадии центрифугирования в течение 5 мин при 2500д образцы хранили при температуре ниже -65°С до анализа посредством АЕХ-ВЭЖХ. Результаты представлены в табл. 3.
Таблица 3
Результаты для примера 4 (2)
Сутки после инфицирования Количество клеток (х10* всех клеток/мл) АЕХ-НРЬС (УР/мл) дрА. МЕ /мл АЕХ/дРА УР/МЕ
0 16,19 ΝΑ ΝΑ ΝΑ
1 20,40 ΝΑ ΝΑ ΝΑ
2 24,14 1,42х1012 1,77x1ο11 8,0
3 24,60 2,20х101! 1.82Х1011 12,1
4 16,26 1, 90х1012 1,51x10й 12,5
Результаты вновь продемонстрировали, что инфекции при плотности клеток более 10х106 жизнеспособных клеток/мл являются выполнимыми в биореакторах, соединенных с перфузионной системой, и что возможно увеличить объемный выход практически в 10 раз по сравнению с периодическим процессом (пример 2). Более того, этот пример демонстрирует, что скорость перфузии после инфицирования может быть ограничена до двух 2 объемов емкости в сутки без снижения выхода вируса.
Для ежегодной потребности приблизительно 1,5х 1019 УР и с выходом приблизительно 2х 1012 УР/мл необходимо переработать менее 7500 л собранной культуры. Эти объемы можно обрабатывать на установках объемом 1000 л или менее, и, таким образом, это снизило бы предварительные затраты на разработку вакцины.
3) Дальнейшие эксперименты в биореакторе ЗОЕ
Из рабочего банка клеток РЕК.С6® клетки размораживали и размножали в бессывороточной культуральной среде в инкубаторе с увлажнением при 37°С и 10% СО2. Субкультивирование проводили каждые от 3 до 4 суток, пока не достигали достаточной клеточной плотности для инокуляции 10 л биореактора при плотности клеток 0,52х106 жизнеспособных клеток/мл. Клетки размножали в 10-л биореакторе при 37°С, ΌΟ 40% и рН 7,3. Систему ΆΤΡ запускали, когда достигали плотности клеток приблизительно 5,3 х 106 всех клеток/мл (4 суток после инокуляции). После перфузии в течение 169 ч достигали плотности клеток 77х106 всех клеток/мл. В этот момент суспензию клеток объемом 1 л разбавляли свежей средой в биореакторе объемом 50 л до клеточной плотности 15,5х106 всех клеток/мл (жизнеспособность 81%, следовательно, 12,6х106 жизнеспособных клеток/мл). Затем биореактор объемом 50 л инфицировали Άά35.ΤΒ-3 при ΜΟΙ 70 УР/клетка и инкубировали при 36°С, рН 7,3 и ΌΟ 40%. Систему ΆΤΡ запускали через 5 ч после инфицирования при скорости обновления среды 2 объема емкости в сутки. На 2 и 3 сутки после инфицирования из 50-л биореактора проводили взятие образца для подсчета клеток и определения выхода вируса с помощью АЕХ-ВЭЖХ. Для высвобождения вируса 1 мл образца смешивали с 100 мкл 10% Τήΐοη Х-100 и инкубировали при 37°С в течение 30 мин. После инкубации образец смешивали с 2,42 мкл Всп/опа5с/МдС12 с последующей стадией инкубации в течение 30 мин при 37°С. Наконец, к образцам добавляли 100 мкл 50% сахарозы. После стадии центрифугирования в течение 5 мин при 2500д образцы хранили при температуре ниже -65°С до анализа посредством АЕХ-ВЭЖХ. Результаты представлены в табл. 4.
Таблица 4
Результаты для примера 4 (3)
Сутки после инфицирования Количество клеток (х10* всех клеток/мл) АЕХ-НРЬС (УР/мл) βΡΑ. МЕ/мл АЕХ/йРА УР/МЕ
0 15,5 ΝΑ ΝΑ ΝΑ
2 21,4 1,67х1012 1, 15Х1011 14,6
3 23,5 1, 84х1012 1,99x1ο11 9,2
Результаты продемонстрировали, что инфицирование при плотности клеток более 10х106 жизнеспособных клеток/мл было осуществимо в биореакторах объемом 50 л, соединенных с перфузионной системой, и что было возможным в масштабе 50 л увеличить объемный выход практически в 10 раз по сравнению с периодическим процессом (пример 2). В данном случае было показано, что разработанный способ можно увеличивать в масштабе. С помощью данного процесса можно продуцировать собираемые объемы, которые должны быть переработаны в год для удовлетворения ежегодной потребности в вирусе. Для ежегодной потребности приблизительно 1,5х1019 УР и с выходом приблизительно 2х1012 УР/мл необходимо переработать менее 7500 л собранной культуры. Эти объемы можно обрабатывать на установках объемом 1000 л или менее, и, таким образом, это снизило бы предварительные затраты на разработку
- 15 023816 вакцины.
Пример 5. Инфицирование гАД26 при низкой плотности клеток (1-1,6х106 жизнеспособных клеток/мл).
В этом примере продемонстрировано инфицирование вектором гАД26, содержащим трансген С8 малярии (гАД26.С8), при низкой клеточной плотности по сравнению с последними примерами, где клетки инфицированы при более высокой плотности клеток.
Из рабочего банка клеток РЕК.С6® клетки размораживали и размножали в бессывороточной культуральной среде в инкубаторе с увлажнением при 37°С и 10% СО2. Субкультивирование проводили каждые от 3 до 4 суток, пока не достигали достаточной клеточной плотности для инокуляции 10 л биореактора при объеме 5 л и плотности клеток от 0,25 до 0,35х106 жизнеспособных клеток/мл. Клетки размножали в биореакторе при 37°С, ИО 40% и рН 7,3. Через трое суток после инокуляции (когда плотность клеток достигала от 1 до 2,1х106 жизнеспособных клеток/мл) клеточную суспензию разбавляли 5 л свежей среды, а затем инфицировали вектором гАД26.С8 при МОГ 70 УР/клетка. Размножение вируса проводили при 36°С, рН 7,3 и ИО 40%. Через трое суток после инфицирования проводили взятие образцов для подсчета клеток и определения продуцирования вируса. Для высвобождения вируса 1 мл образца из каждого биореактора смешивали со 100 мкл 10% ТгПоп Х-100 и инкубировали при 37°С в течение 30 мин. После инкубации образцы смешивали с 2,42 мкл Веп/опа^е/МдСР с последующей стадией инкубации в течение 30 мин при 37°С. Наконец, к образцам добавляли 100 мкл, 50% сахарозы. После стадии центрифугирования в течение 5 мин при 2500д образцы хранили при температуре ниже -65°С до анализа посредством АЕХ-ВЭЖХ. Проводили всего 5 циклов в биореакторе и проводили анализ согласно описанному выше способу, и эти циклы дали согласующиеся результаты (не представлено). Средний выход вирусных частиц составлял 7,6х 1011 УР/мл.
Для ежегодной потребности приблизительно 1,5х1019 УР при таком выходе ежегодно необходимо было бы перерабатывать приблизительно 197000 л. Это потребовало бы больших установок и, таким образом, большого предварительного инвестирования в ходе разработки вакцины.
Пример 6. Осуществимость инфицирования при высокой клеточной плотности вектором гАД26.
Осуществимость инфицирования АД35 при высокой клеточной плотности ранее оценивали, и было показано, что продуцирование АД35 можно увеличивать в масштабе. Поскольку существуют существенные отличия между серотипами аденовирусов, в рамках настоящего изобретения было протестировано, является ли осуществимым продуцирование АД26 путем инфицирования культур с высокой клеточной плотностью.
Из рабочего банка клеток РЕК.С6® клетки размораживали и размножали в бессывороточной культуральной среде в инкубаторе с увлажнением при 37°С и 10% СО2. Субкультивирование проводили каждые от 3 до 4 суток, пока не достигали достаточной клеточной плотности для инокуляции 2 л биореактора при объеме 1,5 л и плотности клеток 0,5х106 жизнеспособных клеток/мл. Клетки размножали в биореакторе при 37°С, ИО 40% и рН 7,3. Процесс перфузии АТР начинали при клеточной плотности 3,6х106 всех клеток/мл. Через 120 ч клеточная плотность достигала 21,6 х106 всех клеток/мл. В этот момент часть клеток собирали. Клетки центрифугировали в течение 5 мин при 300д и клеточный осадок ресуспендировали до следующих концентраций в свежей бессывороточной среде:
1,3х 106 жизнеспособных клеток/мл, 30 мл/вращающийся флакон, два 250-мл вращающихся флакона
10х106 жизнеспособных клеток/мл, 30 мл/вращающийся флакон, два 250-мл вращающихся флакона
20х106 жизнеспособных клеток/мл, 30 мл/вращающийся флакон, два 250-мл вращающихся флакона
30х106 жизнеспособных клеток/мл, 30 мл/вращающийся флакон, два 250-мл вращающихся флакона
Вращающиеся флаконы инфицировали гАД26.С8 при МОГ 70 УР/клетка и инкубировали при 36°С, 10% СО2 и 100 об./мин. На 1 и 2 сутки после инфицирования проводили обновление среды для вращающихся флаконов, инкубированных при 10, 20 и 30х106 жизнеспособных клеток/мл. Это обновление среды проводили с помощью стадии центрифугирования в течение 5 мин при 300д и ресуспендирования клеточного осадка в 30 мл свежей среды на вращающийся флакон. На 3 сутки после инфицирования вращающиеся флаконы собирали и отбирали образцы для анализа АЕХ-ВЭЖХ. Лизис собранных клеток проводили путем смешения образца объемом 1 мл из каждого вращающегося флакона с 100 мкл 10% ТгПоп Х-100 и инкубации при 37°С в течение 30 мин. После инкубации образцы смешивали с 2,42 Вепхопа^е/МдСР с последующей стадией инкубации в течение 30 мин при 37°С. Наконец к образцам добавляли 100 мкл 50% сахарозы. После стадии центрифугирования в течение 5 мин при 2500д образцы хранили при температуре ниже -65°С до проведения анализа АЕХ-ВЭЖХ.
Результаты представлены на фиг. 3 и демонстрируют, что инфицирование с помощью АД26 при клеточной плотности вплоть до 30х106 жизнеспособных клеток/мл является осуществимым. Объемные выходы гАД26 были более высокими, чем выходы, достигнутые в случае, например, АД5.
В противоположность результатам для гАД35, эффект клеточной плотности наблюдали при плотности клеток выше 10х106 жизнеспособных клеток/мл. Действительно, выход гАД26 возрастал при увеличении клеточных плотностей при инфицировании свыше 10х 106 жизнеспособных клеток/мл и выходы
- 16 023816 снижались в диапазоне 20х106-30х106 жизнеспособных клеток/мл.
Исходя из наблюдаемого эффекта клеточной плотности для Аб26 может быть определена оптимальная клеточная плотность при инфицировании. Указанное оптимальное значение находится в диапазоне 10-16х 106 жизнеспособных клеток/мл. Объемные выходы гАб26, полученные путем инфицирования клеток, были существенно более высокими по сравнению с объемными выходами, полученными путем инфицирования клеток при низкой плотности клеток (например, в периодическом процессе). Действительно, выход, полученный при низкой плотности клеток согласно примеру 5, был равен 7,6х1010 УР/мл, в то время как при более высокой клеточной плотности при инфицировании выходы достигали вплоть до 1-2х 1012 УР/мл (см. пример 7). Инфицирование в указанном диапазоне позволяет наличие высоко продуктивного процесса, который можно использовать при продуцировании в крупном масштабе.
Пример 7. Инфицирование при высокой клеточной плотности вектором гАб26 в биореакторе.
Из рабочего банка клеток РЕК.С6® клетки размораживали и размножали в бессывороточной культуральной среде в инкубаторе с увлажнением при 37°С и 10% СО2. Субкультивирование проводили каждые от 3 до 4 суток, пока не достигали достаточной клеточной плотности для инокуляции 2 л биореактора при плотности клеток 0,6х106 жизнеспособных клеток/мл. Клетки размножали в биореакторе при 37°С, ΏΟ 40% и рН 7,3. Систему АТЕ запускали через 2 суток после инокуляции при плотности клеток приблизительно 2х106 всех клеток/мл. После перфузии в течение 7 суток достигали плотности клеток 19,1 х106 всех клеток/мл. В этот момент часть клеточной суспензии собирали и остальные клетки разбавляли свежей средой в биореакторе объемом 2 л до клеточной плотности 16,5х106 всех клеток/мл (жизнеспособность 80%, следовательно, 13,1 х106 жизнеспособных клеток/мл). Затем биореактор объемом 2 л инфицировали гАб26.С8 при ΜΟΙ 70 УР/клетка и инкубировали при 36°С, рН 7,3 и ΏΟ 40%. Систему АТЕ начинали через 5 ч после инфицирования при скорости обновления среды 2 объема емкости в сутки. На 3, 4, 5 и 6 сутки после инфицирования проводили взятие образца из 2 л биореактора для подсчета клеток и продуцирования вируса с помощью АЕХ-ВЭЖХ и ^РА. Для высвобождения вируса 1 мл образца смешивали с 100 мкл 10% Ттйоп Х-100 и инкубировали при 37°С в течение 30 мин. После инкубации образец смешивали с 2,42 мкл Вепхопазе/МдС^ с последующей стадией инкубации в течение 30 мин при 37°С. Наконец, к образцам добавляли 100 мкл 50% сахарозы. После стадии центрифугирования в течение 5 мин при 2500д образцы хранили при температуре ниже -65°С до анализа посредством АЕХ-ВЭЖХ и ^РА. Результаты представлены в табл. 5.
Т аблица 5
Результаты для примера 7
Сутки после инфицирования Количество клеток (х106 всех клеток/мл) АЕХ-НРЬС (УР/мл) ОРА МЕ/мл ΑΕΧ/βΡΑ νρ/мв
0 16,5 ΝΑ ΝΑ ΝΑ
3 31,2 4,4х10п 5,37х1О10 8,2
4 33,8 1, ЗхЮ12 1,38x1ο11 9,4
5 28,1 1,42х1012 1,54x1ο11 9,2
6 20,3 1,64х1012 9,94x1ο11 16,5
Эти результаты впервые продемонстрировали, что инфицирование гАб26 при клеточной плотности свыше от 10х 106 до 16х 106 жизнеспособных клеток/мл являются осуществимыми в биореакторах, соединенных с перфузионной системой и что возможно увеличить объемных выход более чем в 20 раз по сравнению с периодическим процессом (как показано в примере 5).
Для ежегодной потребности приблизительно 1,5х 1019 УР и с выходом приблизительно 2х1012 УР/мл необходимо переработать менее 7500 л собранной культуры. Эти объемы можно обрабатывать на установках объемом 1000 л или менее, и, таким образом, это снизило бы предварительные затраты на разработку вакцины.
При сравнении роста клеток после инфицирования было выявлено, что после инфицирования посредством Аб26 клетки имеют тендецию к дальнейшему росту, хотя после инфицирования Аб35 клетки прекращали расти. Действительно, было показано (фиг. 4), что клетки, которые были инфицированы Аб26 при плотности 12х 106 УР/мл, росли далее до максимума 22х106 УР/мл через 3 суток. После инфицирования Аб35, клетки, которые были инфицированы при плотности 12х 106 УР/мл, росли далее до максимума через 2 суток и через 3 суток их плотность снижалась до 14х 106 УР/мл (фиг. 5). Таким образом, Аб26 размножается иначе, чем Аб35. Вместе с эффектом клеточной плотности, описанным выше, это демонстрирует, что существуют явные отличия между размножением рекомбинантных аденовирусов различных серотипов (Аб5, Аб35 и Аб26) в клетках, которые влияют на способы получения фармацевтических материалов из этих серотипов в промышленных масштабах.
Ссылки
АЙатаз НЕ., Аишпз Ю., Еуапз К.К., Катеп А., Копх Ι.Ο., \\'о1!' Ы. Ргобисйоп апб Югти1айоп оР абепоуйиз уес!огз. Абу. ВюсЬет. Епдт/Вю1есЬпо1. Уо1. 99, 2005
Согйп У., ТЫЪаиЙ I., 1асоЪ Ώ., Оагшег А. ИдЬ-Тйег абепоУ1гиз уес!от ргобисйоп т 2938 Се11 РегРи- 17 023816 δΐοη си1!иге. Бю1есЬпо1. Ргод. Υο1. 20, 2004
Ек!аре Ό., йййе Р. Сотрапкоп оГ сатршдп ν§ сопсиггеп! 1агде-кса1е се11 си1!иге ГасШйек. РЬагтасеийса1 Епдшеейпд. Υο1. 26, Ыо. 5, 8ер!етЬег/Ос!оЬег 2006.
Ригеу ί. 8са1е-ир оГ а се11 сиЪиге регГиккп ргосекк - А 1оте-кЬеаг йЬгайоп кук!ет 1На1 тЫЬЬк й1!егтетЬгапе Гоийпд. Оепейс Епдшеейпд Ыетек. Υο1. 22, Ыо. 7, АргП 2002.
Непгу О., Эогтопй Е., Ретег М., Катеп А. ЬМдШк ш!о айепо\ага1 νес!ο^ ргойисйоп ктейск т асоикйс й1!ег-Ьакей регГиккп си1!игек. Вк!есЬпо1оду апй Ькепдшеейпд, Υο1. 86, Ыо. 7, .Типе 2004.
Нойде О. ИкрокаЫе Ыоргосеккшд: 81а1е оГ 1Не 1пйикйу, Есопоткк апй а пονе1 тапиГас!ийпд р1айогт саке к!ийу (РгекеШайоп). ЫС Вк. С1г. ВРИ СопГегепсе, 18 Ыо\'етЬег 2004.
Катеп А., Непгу О. ^еνе1οртеπ! апй орйт1/айоп оГ ап айепо\агик ргойисйоп ргосекк. ТНе _)оита1 оГ депе тейкт Υο1. 6, 2004
Магапда Ь., Аитпк Ю., 2Ьои V. СЬагас1еп/аЬоп оГ сНапдек ш РЕК.С6 се11и1аг те!аЬойкт йийпд дгоМЬ апй ргорадайоп оГ а герйсайоп-йейскп! айепо\агик νес!ο^. Вк!есЬпо1оду апй Вюепдшеейпд, Υο1. 90, Ыо. 5, .Типе 2005.
Кайоке\к К., С.й., Койпдие/ А., Vеνе^1^пд ОЛ, е! а1. Рго!есМе 1ттипе гекропкек Ю а гесотЫпап! айепо\агик 1уре 35 !иЬегси1ок1к \'ассте ш !тео тоике к!га1пк: СИ4 апй СИ8 Т-се11 ерйоре тарршд апй го1е оГ датта ш!егГегоп. 1пГес!. 1ттип. 75: 4105-4115 (2007).
8Но!! !Р., МсОга!Н 8.М., Раи М.О., Сик!егк ЕН., е! а1. Айепо\агик 5 апй 35 νес!ο^к ехргеккшд Р1актойшт ГаЮрагит сйситкрого/оЬе кшГасе рго!еш ейсй ро!еп! апйдеп-кресШс се11и1аг 1РЫ-датта апй апйЬойу гекропкек т тке. Уассте 26: 2818-2823 (2008).
ипкей Ыайоп тееЬ кйе: Ьйр://ека.ип.огд/ипрр/тйех.акр?рапе1=2 (МагсЬ 2008)
Vаид Р., Риййу А.С., Ма!Ык В.С., МоШайо А.О., е! а1. икшд ОРСК !о акыдп 1и£есйоик ро!епскк !о айепо\агик Ьакей \'асстек апй νес!ο^к Гог депе !Ьегару: Ютеагй а ипЫегка1 те!Ьой Гог !Ье Гасйе сршпЫаЬоп оГ \агик апй νес!ο^ ро!епсу. Уассте 23: 4500-4508 (2005).
Хк Ь., Ме!а11о С., йаггеп 1., РйЬгоидЬ V., РеЬкг ί., 2Ьопд Т., Р1кик Ь., Уайсу А., Ьеипд ί., Аитпк ЕО., 2Ьои V. Ьагде-8са1е ргорадайоп оГ а ^ер1^сайοπ-йеГесйνе айепо νес!ο^ т кйггей-!апк Ькгеас!ог РЕК.С6 се11 сиЪиге ипйег крагдтд сопйЫопк. Вк!есЬпо1оду апй Ыоепд1пеег1пд, Υο1. 83, Ыо. 1, Му 5, 2003
Уа11ор С., Сготеку ί., Со!е ί., Недтапк-Вгоитеег К., ЬадегтеегГ Р., Оадпе К., Магйп ЕС., Оок!егЬшк Ы., Орк!е1!еп Ό.Ε, Вой! А. Рег.С6 се11к Гог !Ье тапиГасЫге оГ ЬкрЬагтасеийса1 рго!етк. Мойет ВкрЬагтасеийса1к - Оейдп, ^еνе1οртеπ! апй ОрЬпи/айоп. Υο1. 3, 2005
Уик 1.Н.У., О1кеп М.М., Оеуег 8., Рогек!е11 8.Р. РегГиккп СиЬигек оГ Нитап Титог Се11к: А 8са1аЬ1е Ргойисйоп Р1а!Гогт Гог Опсо1уйс Айепо\ага1 Уес1огк. Вю!есЬпо1. Вюепдт. 86: 637-641 (2004).

Claims (9)

  1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
    1. Способ продуцирования по меньшей мере 1 х 1012 вирусных частиц (ΥΡ)/мл Е1-дефицитного аденовируса серотипа 26 (гАй26), причем отношение абсолютного количества вирусных частиц к инфекционным частицам ΥΓ/Щ составляет менее 20:1, причем способ включает:
    a) культивирование клеток РЕК.С6 в суспензии с помощью перфузионной системы;
    b) инфицирование указанных клеток посредством гАй26 при плотности от 10х106 до 16х106 жизнеспособных клеток/мл;
    c) дальнейшее культивирование инфицированных клеток с помощью перфузионной системы для размножения указанного гАй26 до достижения концентрации по меньшей мере 1х1012 вирусных частиц ΥΡ/мл и
    й) сбор вирусных частиц указанного гАй26.
  2. 2. Способ по п.1, где указанные клетки на стадии Ь) инфицируют посредством гАй26 при плотности приблизительно от 10х 106 до 14х 106 жизнеспособных клеток/мл.
  3. 3. Способ согласно любому из предшествующих пунктов, где указанная перфузионная система на стадии с) представляет собой перфузионную систему переменного тангенциального потока (АТР).
  4. 4. Способ по любому из предшествующих пунктов, дополнительно включающий стадию е) очистки вирусных частиц гАй26.
  5. 5. Способ по любому из предшествующих пунктов, где указанный рекомбинантный аденовирус лишен, по меньшей мере, части Е1А или Е1В области Е1.
  6. 6. Способ по любому из предшествующих пунктов, где указанная перфузионная система на стадии а) представляет собой перфузионную систему переменного тангенциального потока (АТР).
  7. 7. Способ по любому из предшествующих пунктов, где стадию а) проводят в биореакторе для предварительного культивирования, и стадии Ь) и с) проводят в биореакторе для продуцирования.
  8. 8. Применение биореактора в способе по любому из пп.1-7, где указанный биореактор имеет рабочий объем от 2 до 1000 л и содержит культуральную среду, клетки РЕК.С6 и вирусные частицы гАй26 в концентрации по меньшей мере 1х 1012 ΥΡ/мл.
  9. 9. Применение по п.8, где указанный биореактор соединен с перфузионной системой АТР.
EA201290797A 2010-02-15 2011-02-14 СПОСОБ ПРОДУЦИРОВАНИЯ ВИРУСНЫХ ЧАСТИЦ Ad26 EA023816B1 (ru)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US30455310P 2010-02-15 2010-02-15
EP10153581 2010-02-15
PCT/EP2011/052109 WO2011098592A1 (en) 2010-02-15 2011-02-14 Method for the production of ad26 adenoviral vectors

Publications (2)

Publication Number Publication Date
EA201290797A1 EA201290797A1 (ru) 2013-01-30
EA023816B1 true EA023816B1 (ru) 2016-07-29

Family

ID=42227128

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA201290797A EA023816B1 (ru) 2010-02-15 2011-02-14 СПОСОБ ПРОДУЦИРОВАНИЯ ВИРУСНЫХ ЧАСТИЦ Ad26

Country Status (14)

Country Link
EP (1) EP2536829B1 (ru)
JP (1) JP5250155B2 (ru)
KR (1) KR101820980B1 (ru)
CN (1) CN102762721B (ru)
AU (1) AU2011214262B2 (ru)
BR (1) BR112012019023B1 (ru)
CA (1) CA2786835C (ru)
DK (1) DK2536829T3 (ru)
EA (1) EA023816B1 (ru)
ES (1) ES2578514T3 (ru)
MX (1) MX2012007936A (ru)
NZ (1) NZ601424A (ru)
PL (1) PL2536829T3 (ru)
WO (1) WO2011098592A1 (ru)

Families Citing this family (41)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
MX2011004292A (es) 2008-11-03 2011-05-31 Crucell Holland Bv Metodo para la produccion de vectores adenovirales.
BR112013004582A2 (pt) 2010-09-27 2016-09-06 Crucell Holland Bv método para induzir uma resposta imune em um sujeito contra um antígeno de um parasita que causa a malária
EP2780034A1 (en) 2011-11-14 2014-09-24 Crucell Holland B.V. Heterologous prime-boost immunization using measles virus-based vaccines
CN103305417A (zh) * 2012-03-07 2013-09-18 无锡药明康德生物技术有限公司 进行蛋白生产的高产量反应器及其生产方法和应用
US8932607B2 (en) 2012-03-12 2015-01-13 Crucell Holland B.V. Batches of recombinant adenovirus with altered terminal ends
AU2013231423B2 (en) 2012-03-12 2018-10-04 Janssen Vaccines & Prevention B.V. Batches of recombinant adenovirus with altered terminal ends
CN104334188B (zh) 2012-03-22 2016-08-24 克鲁塞尔荷兰公司 抗rsv疫苗
US9119813B2 (en) 2012-03-22 2015-09-01 Crucell Holland B.V. Vaccine against RSV
EA039803B1 (ru) 2013-04-25 2022-03-15 Янссен Вэксинс Энд Превеншн Б.В. Стабилизированные растворимые f-полипептиды rsv до слияния
PE20160045A1 (es) 2013-06-17 2016-02-18 Crucell Holland Bv Polipeptidos f de prefusion del virus sincicial respiratorio (rsv) solubles y estabilizados
EP3613841B1 (en) 2014-03-25 2022-04-20 Terumo BCT, Inc. Passive replacement of media
HUE053585T2 (hu) * 2014-09-26 2021-07-28 Beth Israel Deaconess Medical Ct Inc Eljárások és készítmények humán immundeficiencia vírus fertõzés elleni védõ immunválasz indukálására
SG11201702997YA (en) 2014-11-04 2017-05-30 Janssen Vaccines & Prevention Bv Therapeutic hpv16 vaccines
WO2017004592A1 (en) 2015-07-02 2017-01-05 Terumo Bct, Inc. Cell growth with mechanical stimuli
EA035909B1 (ru) 2015-07-07 2020-08-31 Янссен Вэксинс Энд Превеншн Б.В. Стабилизированные растворимые f-полипептиды rsv до слияния
PL3319633T3 (pl) 2015-07-07 2021-04-19 Janssen Vaccines & Prevention B.V. Szczepionka przeciwko rsv
AU2016309743B2 (en) 2015-08-20 2019-02-07 Janssen Vaccines & Prevention B.V. Therapeutic HPV18 vaccines
EA201892250A1 (ru) 2016-04-05 2019-03-29 Янссен Вэксинс Энд Превеншн Б.В. Вакцина против rsv
JP7088841B2 (ja) 2016-04-05 2022-06-21 ヤンセン ファッシンズ アンド プリベンション ベーフェー 安定化された可溶性融合前rsv fタンパク質
SG11201808809PA (en) 2016-05-02 2018-11-29 Janssen Vaccine & Prevention B V Therapeutic hpv vaccine combinations
EP3464565A4 (en) 2016-05-25 2020-01-01 Terumo BCT, Inc. CELL EXPANSION
EP3464331B1 (en) 2016-05-30 2020-10-28 Janssen Vaccines & Prevention B.V. Stabilized pre-fusion rsv f proteins
US11685883B2 (en) 2016-06-07 2023-06-27 Terumo Bct, Inc. Methods and systems for coating a cell growth surface
US11104874B2 (en) 2016-06-07 2021-08-31 Terumo Bct, Inc. Coating a bioreactor
EP3484506A1 (en) 2016-07-14 2019-05-22 Janssen Vaccines & Prevention B.V. Hpv vaccines
JP7393945B2 (ja) 2017-03-31 2023-12-07 テルモ ビーシーティー、インコーポレーテッド 細胞増殖
EP3624844A1 (en) 2017-05-17 2020-03-25 Janssen Vaccines & Prevention B.V. Methods and compositions for inducing protective immunity against rsv infection
WO2018229711A1 (en) 2017-06-15 2018-12-20 Janssen Vaccines & Prevention B.V. Poxvirus vectors encoding hiv antigens, and methods of use thereof
SG11202001458SA (en) 2017-09-15 2020-03-30 Janssen Vaccines & Prevention Bv Method for the safe induction of immunity against rsv
BR112020007695A2 (pt) 2017-10-31 2020-10-20 Janssen Vaccines & Prevention B.V. adenovírus e seus usos
BR112020008435A2 (pt) 2017-10-31 2020-11-17 Janssen Vaccines & Prevention B.V. vetores de adenovírus e seus usos
SG11202003290RA (en) 2017-10-31 2020-05-28 Janssen Vaccines & Prevention Bv Adenovirus and uses thereof
SG11202003200VA (en) 2017-10-31 2020-05-28 Janssen Vaccines & Prevention Bv Adenovirus and uses thereof
BR112022014808A2 (pt) 2020-01-31 2022-09-20 Beth Israel Deaconess Medical Ct Inc Composições e métodos para vacinas para prevenir e tratar infecção pelo coronavírus-sars-cov-2
EP4314019A2 (en) 2021-04-01 2024-02-07 Janssen Vaccines & Prevention B.V. Stabilized pre-fusion piv3 f proteins
WO2023020939A1 (en) 2021-08-17 2023-02-23 Janssen Pharmaceuticals, Inc. Sars-cov-2 vaccines
WO2023111725A1 (en) 2021-12-14 2023-06-22 Janssen Pharmaceuticals, Inc. Sars-cov-2 vaccines
WO2023110618A1 (en) 2021-12-16 2023-06-22 Janssen Vaccines & Prevention B.V. Stabilized pre-fusion hmpv fusion proteins
WO2024061757A1 (en) 2022-09-23 2024-03-28 Janssen Vaccines & Prevention B.V. Pre-fusion human piv1 f proteins
WO2024061753A1 (en) 2022-09-23 2024-03-28 Janssen Vaccines & Prevention B.V. Stabilized trimeric class i fusion proteins
WO2024074584A1 (en) 2022-10-06 2024-04-11 Janssen Vaccines & Prevention B.V. Stabilized pre-fusion piv3 f proteins

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2000070071A1 (en) * 1999-05-17 2000-11-23 Crucell Holland B.V. Adenovirus derived gene delivery vehicles comprising at least one element of adenovirus type 35
WO2004055187A1 (en) * 2002-12-17 2004-07-01 Crucell Holland B.V. Recombinant viral-based malaria vaccines
WO2007104792A2 (en) * 2006-03-16 2007-09-20 Crucell Holland B.V. Recombinant adenoviruses based on serotype 26 and 48, and use thereof
WO2010060719A1 (en) * 2008-11-03 2010-06-03 Crucell Holland B.V. Method for the production of adenoviral vectors

Family Cites Families (41)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2705686B1 (fr) 1993-05-28 1995-08-18 Transgene Sa Nouveaux adénovirus défectifs et lignées de complémentation correspondantes.
US6686200B1 (en) * 1993-08-31 2004-02-03 Uab Research Foundation Methods and compositions for the large scale production of recombinant adeno-associated virus
US5851806A (en) 1994-06-10 1998-12-22 Genvec, Inc. Complementary adenoviral systems and cell lines
DE69535178T2 (de) 1994-06-10 2006-12-14 Genvec, Inc. Adenoviren-vektor systeme und zelllinien
US5965541A (en) 1995-11-28 1999-10-12 Genvec, Inc. Vectors and methods for gene transfer to cells
US5559099A (en) 1994-09-08 1996-09-24 Genvec, Inc. Penton base protein and methods of using same
US5846782A (en) 1995-11-28 1998-12-08 Genvec, Inc. Targeting adenovirus with use of constrained peptide motifs
US5837520A (en) 1995-03-07 1998-11-17 Canji, Inc. Method of purification of viral vectors
JP4051416B2 (ja) 1995-06-15 2008-02-27 クルーセル ホランド ベスローテン フェンノートシャップ 遺伝子治療に使用されるヒト組換えアデノウイルス用のパッケージングシステム
US6143548A (en) 1995-08-30 2000-11-07 Genzyme Corporation Chromatographic purification of adeno-associated virus (AAV)
US5837511A (en) 1995-10-02 1998-11-17 Cornell Research Foundation, Inc. Non-group C adenoviral vectors
US5891690A (en) 1996-04-26 1999-04-06 Massie; Bernard Adenovirus E1-complementing cell lines
IL127692A0 (en) 1996-07-01 1999-10-28 Rhone Poulenc Rorer Sa Method for producing recombinant adenovirus
FR2751343B1 (fr) 1996-07-16 1998-12-18 Transgene Sa Procede de conservation de virus recombinants infectieux, suspension aqueuse virale et utilisation comme medicament
ATE550429T1 (de) 1996-11-20 2012-04-15 Crucell Holland Bv Adenovirus-zusammensetzungen erhältlich durch ein verbessertes produktions- und reinigungsverfahren
US6261823B1 (en) 1996-12-13 2001-07-17 Schering Corporation Methods for purifying viruses
JP2000509614A (ja) 1997-03-04 2000-08-02 バクスター インターナショナル インコーポレイテッド アデノウイルスe1−相補性細胞系
US6020191A (en) 1997-04-14 2000-02-01 Genzyme Corporation Adenoviral vectors capable of facilitating increased persistence of transgene expression
US6210683B1 (en) 1997-09-05 2001-04-03 Merck & Co., Inc. Stabilizers containing recombinant human serum albumin for live virus vaccines
KR100912362B1 (ko) 1998-02-17 2009-08-19 쉐링 코포레이션 바이러스 제제의 정제방법
US5981225A (en) 1998-04-16 1999-11-09 Baylor College Of Medicine Gene transfer vector, recombinant adenovirus particles containing the same, method for producing the same and method of use of the same
SK15682000A3 (sk) 1998-04-22 2001-05-10 Genvec, Inc. Účinné čistenie adenovírusu
US6113913A (en) 1998-06-26 2000-09-05 Genvec, Inc. Recombinant adenovirus
EP1977764A1 (en) 1998-11-16 2008-10-08 Introgen Therapeutics, Inc. Formulation of adenovirus for gene therapy
NZ512504A (en) 1998-12-31 2004-01-30 Aventis Pharma Sa Method for separating viral particles
CA2364934C (fr) 1999-02-22 2011-10-18 Transgene S.A. Procede d'obtention d'une preparation virale purifiee
US6492169B1 (en) 1999-05-18 2002-12-10 Crucell Holland, B.V. Complementing cell lines
DE19955558C2 (de) 1999-11-18 2003-03-20 Stefan Kochanek Permanente Amniozyten-Zelllinie, ihre Herstellung und Verwendung zur Herstellung von Gentransfervektoren
US6544424B1 (en) 1999-12-03 2003-04-08 Refined Technology Company Fluid filtration system
JP5118798B2 (ja) 2000-03-07 2013-01-16 メルク・シャープ・エンド・ドーム・コーポレイション アデノウイルス製剤
US20020064860A1 (en) 2000-11-29 2002-05-30 Schering Corporation Method for purifying adenoviruses
CA2469623C (en) 2001-12-12 2012-05-29 F H Faulding & Co Limited Composition for the preservation of viruses
US20030180936A1 (en) 2002-03-15 2003-09-25 Memarzadeh Bahram Eric Method for the purification, production and formulation of oncolytic adenoviruses
ES2335657T3 (es) 2002-04-25 2010-03-31 Crucell Holland B.V. Medios y metodos para la produccion de vectores de adenovirus.
US20050196854A1 (en) 2002-05-14 2005-09-08 Konz John O.Jr. Methods of adenovirus purification
US20070207461A1 (en) * 2004-02-23 2007-09-06 Crucell Holland B.V. Virus Purification Methods
DK1720972T3 (da) * 2004-03-05 2014-04-14 Dsm Ip Assets Bv Fremgangsmåde til celledyrkning ved hjælp af fortløbende perfusion og vekslende tangentialt flow
CA2586620C (en) 2004-11-16 2014-06-03 Crucell Holland B.V. Multivalent vaccines comprising recombinant viral vectors
WO2006086284A2 (en) * 2005-02-11 2006-08-17 Merck & Co., Inc. Adenovirus serotype 26 vectors, nucleic acid and viruses produced thereby
US8574595B2 (en) 2005-04-11 2013-11-05 Crucell Holland B.V. Virus purification using ultrafiltration
WO2007110409A1 (en) 2006-03-27 2007-10-04 Crucell Holland B.V. Compositions comprising a recombinant adenovirus and an adjuvant

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2000070071A1 (en) * 1999-05-17 2000-11-23 Crucell Holland B.V. Adenovirus derived gene delivery vehicles comprising at least one element of adenovirus type 35
WO2004055187A1 (en) * 2002-12-17 2004-07-01 Crucell Holland B.V. Recombinant viral-based malaria vaccines
WO2007104792A2 (en) * 2006-03-16 2007-09-20 Crucell Holland B.V. Recombinant adenoviruses based on serotype 26 and 48, and use thereof
WO2010060719A1 (en) * 2008-11-03 2010-06-03 Crucell Holland B.V. Method for the production of adenoviral vectors

Non-Patent Citations (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
1 January 2004 (2004-01-01), HUMAN GENE THERAPY, MARY ANN LIEBERT, NEW YORK ,NY, US, PAGE(S) S184-S192, XP002486824, ISSN: 1043-0342 the whole document *
ABBINK PETER ET AL.: "Comparative seroprevalence and immunogenicity of six rare serotype recombinant adenovirus vaccine vectors from subgroups B and D", 1 May 2007 (2007-05-01), JOURNAL OF VIROLOGY, THE AMERICAN SOCIETY FOR MICROBIOLOGY, US, PAGE(S) 4654-4663, XP002451979, ISSN: 0022-538X the whole document *
ALTARAS N E ET AL.: "Production and Formulation of Adenovirus Vectors", 1 November 2005 (2005-11-01), ADVANCES IN BIOCHEMICAL ENGINEERING, BIOTECHNOLOGY, SPRINGER, BERLIN, DE LNKD- DOI:10.1007/10_008, PAGE(S) 193-260, XP009105897, ISSN: 0724-6145 the whole document *
HENRY OLIVIER ET AL.: "Insights into adenoviral vector production kinetics in acoustic filter-based perfusion cultures", 30 June 2004 (2004-06-30), BIOTECHNOLOGY AND BIOENGINEERING, WILEY & SONS, HOBOKEN, NJ, US LNKD- DOI:10.1002/BIT.20074, PAGE(S) 765-774, XP008102488, ISSN: 0006-3592 [retrieved on 2004-05-10] the whole document *
KAMEN A ET AL.: "Development and optimization of an adenovirus production proces", *
SUBRAMANIAN S ET AL.: "Pilot-scale adenovirus seed production through concurrent virus release and concentration by hollow fiber filtration", BIOTECHNOLOGY PROGRESS, AMERICAN INSTITUTE OF CHEMICAL ENGINEERS, US LNKD-DOI:10.1021/BP049561A, vol. 21, no. 3, 1 May 2005 (2005-05-01), pages 851-859, XP002516027, ISSN: 8756-7938 [retrieved on 2005-03-30] page 852-page 853; figure 1 *
XIE LIANGZHI ET AL.: "Large-scale propagation of a replication-defective adenovirus vector in stirred-tank bioreactor PER.C6TM cell culture under sparging conditions", 5 July 2003 (2003-07-05), BIOTECHNOLOGY AND BIOENGINEERING, WILEY & SONS, HOBOKEN, NJ, US LNKD- DOI:10.1002/BIT.10644, PAGE(S) 45-.52, XP002296365, ISSN: 0006-3592 the whole document *
YALLOP C ET AL.: "Per.C6 cells for the manufacture of biopharmaceutical proteins", MODERN BIOPHARMACEUTICALS : DESIGN, DEVELOPMENT AND OPTIMIZATION, WILEY-VCH, WEINHEIM, vol. 3, 1 January 2005 (2005-01-01), pages 779-807, XP008102484, ISBN: 978-3-527-31184-2 the whole document *
YUK INN HY ET AL.: "Perfusion cultures of human tumor cells: A scalable production platform for oncolytic adenoviral vectors", 20 June 2004 (2004-06-20), BIOTECHNOLOGY AND BIOENGINEERING, WILEY & SONS, HOBOKEN, NJ, US LNKD- DOI:10.1002/BIT.20158, PAGE(S) 637-642, XP002496481, ISSN: 0006-3592 the whole document *

Also Published As

Publication number Publication date
CN102762721B (zh) 2015-03-11
EA201290797A1 (ru) 2013-01-30
KR20130026518A (ko) 2013-03-13
EP2536829B1 (en) 2016-04-06
JP2013519366A (ja) 2013-05-30
KR101820980B1 (ko) 2018-01-22
JP5250155B2 (ja) 2013-07-31
CA2786835A1 (en) 2011-08-18
AU2011214262B2 (en) 2015-05-21
ES2578514T3 (es) 2016-07-27
BR112012019023A2 (pt) 2015-09-15
BR112012019023B1 (pt) 2021-12-21
AU2011214262A1 (en) 2012-08-30
CA2786835C (en) 2021-08-31
WO2011098592A1 (en) 2011-08-18
DK2536829T3 (en) 2016-07-04
EP2536829A1 (en) 2012-12-26
CN102762721A (zh) 2012-10-31
PL2536829T3 (pl) 2016-09-30
MX2012007936A (es) 2012-11-22
NZ601424A (en) 2014-07-25

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EA023816B1 (ru) СПОСОБ ПРОДУЦИРОВАНИЯ ВИРУСНЫХ ЧАСТИЦ Ad26
KR101504392B1 (ko) 아데노바이러스 벡터의 제조방법
US20180080010A1 (en) Method for the production of ad26 adenoviral vectors
CN102575233B (zh) 从高细胞密度培养物纯化腺病毒的方法
CN1922308A (zh) 病毒纯化方法
CN102791852A (zh) 纯化腺病毒颗粒的方法
Carina Silva et al. Adenovirus vector production and purification
JP2008067720A (ja) 細胞培養およびウイルス増殖のための方法
US6168944B1 (en) Methods for cultivating cells and propagating viruses
AU2003220531B2 (en) Large scale methods of producing adenovirus and adenovirus seed stocks
JP2023552472A (ja) アデノウイルスの産生方法

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): AM AZ KZ KG MD TJ TM