CZ438398A3 - Způsob přípravy rekombinantních adenovirů - Google Patents

Description

Oblast techniky

Předložený vynález se týká nového postupu pro přípravu rekombinantních adenovirů. Týká se také purifikovaných virových přípravků vytvořených podle této metody.

Dosavadní stav techniky

Adenoviry mají jisté vlastnosti výhodné zejména pro použití jako vektory přenosu genů v genové terapii. Mají dosti široké hostitelské spektrum, jsou schopné infikovat příbuzné buňky, nejsou zahrnuty do genomu infikované buňky a nejsou spojovány s významnými patologiemi u lidí. Byly použity adenoviry pro přenos genů zájmu do svalu (Ragot et al., Nátuře 361 (1993) 647), do jater (Jaffe et al., Nátuře genetics 1 (1992) 372), nervového systému (Akli et al.,

Nátuře genetics 3 (1993) 224), atd.

Adenoviry jsou viry lineární dvouvláknové DNA o velikosti okolo 36 (kilobasí) kb. Jejich genom obsahuje zejména sekvenci obrácené repetice (ITR) na každém konci, sekvenci enkapsidace (Psi), rané a pozdní geny. Zásadní rané geny jsou známé v oblastech El, E2, E3 a E4. Mezi těmito známými geny v oblasti El jsou zejména geny nezbytné pro virovou propagaci. Zásadní pozdní geny jsou známé v oblastech LI až L5. Genom adenovirů Ad5 byl úplně sekvenován a je dostupný na základě údajů (viz zejména Genebank M73260). Byly také sekvenovány i jiné adenovirové genomy (Ad2, Ad7, Adl2 atd.).

Pro jejich použití v genové terapii byly připraveny různé vektory odvozené od adenovirů, začleňující různé ϊ

•··· ·· · 4 4 • · · · · · 4

4 4 4 4

4 · 4 4 4

4 4 4 4 4 β· 4444444 • 4 4 4 · · 4

4 4 4

4 4 4 4

4 4

4 44 terapeutické geny. V každé z těchto konstrukcí byly adenoviry modifikovány tak, aby ztratily neschopnost replikace v infikované buňce. Konstrukce popsané ve vedlejších oborech jsou adenoviry deletované v oblasti El, zejména pro virovou replikaci, na úrovni, ve které jsou vloženy sekvence heterologní DNA (Levrero et al., Gene 101 (1991); Gosh-Choudhury et al., Gene 50 (1986) 161). Pro zlepšení vlastností vektoru bylo navrženo vytvořit další delece nebo modifikace v genomu adenoviru. Bodová termosenzitivní mutace byla vložena do mutantu tsl25 umožňující inaktivovat vazebný protein 72 kDa s DNA (DBP) (Van der Vliet et al., 1985). Jiné vektory obsahují deleci jiné oblasti zejména oblasti pro replikaci nebo/a virovou propagaci, oblasti E4. Oblast E4 je zahrnuta do regulace exprese pozdních genů, do stability pozdní nukleové RNA, do ukončení exprese proteinů hostitelské buňky a do účinku replikace virové DNA. Adenovirové vektory, ve kterých jsou oblasti El a E4 deletovány mají tedy schopnost transkripce a exprese virových genů velmi sníženou. Takovéto vektory byly popsány například v přihláškách vynálezů WO94/28152, WO95/02697, PCT/FR96/00088). Mimoto byly popsány vektory, které nesou modifikaci na úrovni genu IVa2 (WO96/10088).

Rekombinantní adenoviry popsané v literatuře jsou produkty od různých adenovirových serotypů. Existují různé serotypy adenovirů, jejichž struktura a vlastnosti se poněkud mění, ale které mají srovnatelnou genetickou organizaci. Rekombinantní adenoviry mohou být původu lidského nebo zvířecího. Co se týče adenoviru lidského původu, mohou se zejména uvést ty, které jsou zařazeny do skupiny C, zejména adenoviry typu 2 (Ad2), 5 (Ad5), 7 (Ad7) nebo 12 (Adl2). Mezi adenoviry zvířecího původu se mohou zejména uvést adenoviry psího původu a zejména kmeny adenoviru CAV2 (například: souche manhatan nebo A26/61 (ATCC VR-800). Jiné typy adenovirů zvířecího původu jsou zejména uvedeny v přihlášce • · · ··· · · · · 4

4 44444 • · · · · 4 4 4444 4 • · · 44 444

4444444 44 44 vynálezu WO94/26914, které jsou zahrnuty v odkazech.

V upřednostňovaném způsobu provedení vynálezu je rekombinantní adenovirus lidského původu skupiny C. Zejména se jedná o Ad2 nebo Ad5.

Rekombinantní adenoviry jsou produkovány v enkapsidační linii, totiž v linii buněk schopných doplnit v trans jednu nebo více deficientních funkcí v rekombinantním adenovirovém genomu. Jedna z těchto linií je například linie 293, ve které část genomu adenoviru byla zahrnuta. Linie 293 je buněčnou lidskou ledvinovou embryonální linií, která obsahuje levý konec (okolo 11-12%) genomu adenoviru serotypu 5 (Ad5), obsahující levou ITR, oblast enkapsidace, oblast El, zahrnující Ela a Elb, oblast kódující protein pIX a část oblasti kódující protein pIVa2. Tato linie je schopná transkomplementovat oblast El defektního rekombinantního adenoviru, totiž adenovirus bez celeku nebo části oblasti El a je schopná produkovat virovou zásobu, která má zvýšenou schopnost. Tato linie je také schopná produkovat při teplotě okolo 32°C zásobu viru obsahujícího mimo jiné termosenzitivní mutaci E2. Byly popsány jiné buněčné linie schopné doplnit oblast El, založené zejména na rakovinových buňkách lidskkých plic A549 (WO94/28152) nebo na lidských retinoblastech (Hum. Gen. Ther. (1996) 215). Byly také popsány linie schopné transkomplementovat více funkcí adenoviru. Mohou se také uvést linie komplementující oblasti El a E4 (Yeh et al., J. Virol. 70 (1996) 559; Cancer Gen. Ther.2 (1995) 322; Krougliak et al., Hum. Gen. Ther. 6 (1995) 1575) a linie komplementující oblasti El a E2 (WO94/28152, WO95/02697, WO95/2701).

Rekombinantní adenoviry jsou obvykle tvořeny vložením virové DNA do enkapsidační linie, následujícím lyzou buněk po dvou nebo třech dnech (kinetika adenovirového cyklu je od 24 do 36 hodin). Po lyže buněk rekombinantní virové částice jsou • · • · · · · ···· « · ·· · · · ···· · ···· · · ··· ·· ·· ··· ···· ·· ·· izolovány odstřeďováním v gradientu chloridu česného.

Pro uvedení postupu může být virová DNA úplný rekombinantní virový genom, případně konstruován v bakterii (WO96/25506) nebo v kvasince (W095/03400), transfektovaný v buňkách. Může se jednat o rekombinantní virus použitý pro infikování enkapsidační linie. Virová DNA může být vložena ve formě fragmentů nesoucích každou část virového rekombinantního genomu a oblast homologie umožňující po vložení do enkapsidační buňky znovu tvořit rekombinantní virový genom obecnou rekombinací mezi různými fragmenty. Klasický postup tvorby adenoviru zahrnuje následující etapy: Buňky (například buňky 293) jsou infikovány v kultivační misce virovou zásobou v množství 3 až 5 virových částic na buňku (Multiplicity of Infection (MOI) = 3 až 5), nebo transfektovány virovou DNA. Délka inkubace se pohybuje mezi 40 a 72 hodinami. Virus je pak uvolněn z jádra lyzou buněk, několika postupnými cykly rozmrazování. Získaný buněčný lyzát je potom odstředěn při rychlosti 2000 až 4000 rpm a supernatant (čistý buněčný lyzat) je potom purifikován odstřeďováním v přítomnosti chloridu česného ve dvou etapách:

-první odstřeďování po dobu 1,5 hodiny ve dvou vrstvách chloridu česného o hustotě 1,25 a 1,40 ohraničující denzitu viru (1,34) tak, aby oddělil virové proteiny prostředí;

-druhé odstřeďování v delším gradientu (od 10 do 40 hodin podle použitého rotoru), které tvoří skutečnou a jedinou etapu purifikace viru.

Po druhé etapě odstřeďování je pruh viru majoritní. Nicméně jsou pozorovatelné dva pruhy méně tmavé, tenké, jejichž pozorování v elektronickém mikroskopu ukázalo, že se jedná o prázdné virové částice nebo rozbité virové částice pro pruh tmavší a o virové podjednotky (pentony, hexony) pro pruh méně tmavý. Po této etapě virus byl sklizen punkcí pomocí jehly z kyvety centrifugy a cesium bylo vyloučeno • · · · ·* *· • · · • · · • · · · • · ··

dialysou nebo vysolením.

Ačkoliv získaná úrověň purifikace byla uspokojivá, má tento postup určité nevýhody. Zejména to, že je založen na použití chloridu česného, který je nepřijatelný pro terapeutické použití pro člověka. Je nutné vyloučit chlorid česný pocházející z purifikace. Tato metoda vyjadřuje mimoto ještě další nevýhody, které jsou zmíněné dále, a které omezují použití metody v průmyslovém měřítku.

Pro vyloučení těchto problémů byla navržena purifikace viru získaného po lyže ne v gradientu chloridu česného, ale chromatograficky. Článek autorů Huyghe et al., (Hum. Gen. Ther. 6 (1996) 1403) popisuje různé typy chromatografií přizpůsobených pro purifikaci rekombinantních adenovirů. Tento článek popisuje zejména studii purifikace rekombinantních adenovirů, která používá chromatografii založenou na slabé výměně aniontů (DEAE). Byly publikovány práce odborníků popisující použití tohoto typu chromatografie s tímto cílem (Klemperer et al., Virology 9 (1959) 536; Philipson L., Virology 10 (1960) 459; Haruna et al., Virology 13 (1961) 264). Výsledky uveřejněné v článku autorů Huyghe et al., ukazují dosti podprůměrný účinek doporučované iontoměničové chromatografie. Získaný výsledek je podprůměrný, autoři naznačují, že virové částice jsou přítomny ve více chromatografických signálech; výtěžek je nízký (výtěžek virových částic: 67%; výtěžek infikovaných částic: 49%); a získaný virový preparát po těchto chromatografických etapách není čistý. Je nezbytné předem zpracovat virus různými enzymy / proteiny. Stejný článek popisuje studii použití chromatografie gelovou filtrací, která ukazuje velmi špatné dělení a velmi nízké výtěžky (15 20%) .

·· · ·

Podstata vynálezu

Předložený vynález popisuje nový postup přípravy rekombinantních adenovirů. Postup podle vynálezu spočívá v modifikaci postupu odborníků na úrovni fáze přípravy nebo/a na úrovni fáze purifikace. Postup podle vynálezu umožňuje nyní získat velmi rychle a v průmyslovém měřítku virus ve větším množství a vyšší kvalitě.

Jedno z prvních hledisek vynálezu se týká zejména postupu přípravy rekombinantních adenovirů, ve kterém jsou viry získávány ze supernatantu kultury. Jiné hledisko vynálezu se týká postupu přípravy zahrnující etapu ultrafiltrace. Podle dalšího hlediska vynález se týká také postupu purifikace rekombinantních adenovirů, který zahrnuje etapu aniotoměničové chromatotografie. Předložený vynález také popisuje postup zlepšení purifikace používající chromatografií gelovou filtrací, případně spojenou s aniontoměničovou chromatografií. Postup podle vynálezu umožňuje získat virus lepší kvality, co se týče čistoty, stability, morfologie a infekčnosti s vyšším výtěžkem a za podmínek přípravy úplně vyhovujícími průmyslovým požadavkům a s ohledem na nařízení, které se týká produkce terapeutických molekul.

V rámci industrializace postup podle vynálezu používá metody zpracování supernatantu kultury osvědčené v široké škále pro rekombinantní proteiny takové, jako jsou mikrofiltrace nebo hloubková filtrace a tangenciální ultrafiltrace. Z důvodu stability viru při teplotě 37°C tato metoda umožňuje lepší použití v průmyslovém měřítku, kde na rozdíl od metody intracelulární čas sklizně nemusí být přesný na půlden. To zajišťuje získání maximálního množství viru, což je velmi významné v případě virů defektních ve více oblastech. Na druhé straně metoda podle vynálezu umožňuje jednodušší a přesnější sledování kinetiky tvorby viru přímo v • 9 9 9 9 9 · · · 9 9 e 9 9 9 9 9999

99 · 9 9 9999 9

9999 99 999

94 999 9999 99 99 homogenním vzorku supernatantu bez předběžné úpravy, což umožňuje lepší reprodukovatelnost přípravy. Postup podle vynálezu umožňuje také se vyloučit etapu lyzy buněk. Lyza buněk představuje několik nevýhod. Na průmyslové úrovni může být obtížné pozorovat rozbití buněk zmrazovacími a rozmrazovacími cykly. Alternativní metoda lyzy (Dounce, X-press, sonifikace, mechanické stříhání atd.) vyjadřuje určité nevýhody: potenciálně tvoří aerosol těžko konfinovaný pro virus L2 nebo L3 (úroveň konfinace viru závisí na jejich patogenicitě nebo jejich způsobu roznášení), tyto viry mají sklon způsobovat infekci vzdušně; vyvolávají střihovou sílu nebo/a uvolnění tepla těžko kontrolovaného a snížení aktivity preparátu. Použitý roztok detergentů pro lyzu buněk bude vyžadovat být validovaný a bude vyžadovat mimo jiné potvrzení vyloučení detergentů. Buněčná lyza vede k počtu zlomků buněk v prostředí, které pak vyžaduje jemnější purifikaci. Co se týče kvality viru, postup podle vynálezu umožňuje případně zlepšit dozrávání viru, a to vede k homogenní populaci. V mezích, kde zabalení virové DNA je poslední etapou virového cyklu, lyza po maturaci buněk uvolňuje prázdné částice, které jsou nereplikativní a jsou choroboplodné a mají toxický účinek viru a umožňují zvýšení poměru specifické aktivity získaného preparátu. Specifická infekční schopnost preparátu je definována jako poměr úplného počtu virových částic, který je měřen biochemickými metodami (DO260nm, HPLC, PCR, imunoenzymová metoda atd.) k počtu virových částic, které vyvolávají biologický efekt (tvorba plaků lyzy při kultivaci buněk na pevné půdě, buněčná translace.). Prakticky pro purifikovaný preparát tato hodnota je určena poměrem koncentrace částic měřenou DO při 260 nm ke koncentraci jednotek tvořících plak preparátu. Tato hodnota musí být nižší než 100.

Získané výsledky ukazují, že postup podle vynálezu umožňuje získat virus čistoty alespoň takové jako se získá čistota viru pomocí odstřeďování v gradientu chloridu česného

v jedné etapě a bez předběžného zpracování, který pochází z virového koncentrovaného supernatantu.

První předmět vynálezu se tedy týká postupu přípravy rekombinantních adenovirů vyznačeného, tím, že virová DNA je vložena do buněčné enkapsidační buňky a produkovaný virus se sklízí po vyloučení do supernatantu kultury. Na rozdíl od vedlejších postupů, ve kterých se virus získává po lyže narostlých buněk, která je provedena mechanicky nebo chemicky, v postupu podle vynálezu nejsou buňky lyžovány působením vnějšího působení. Kultura je sledována po delší dobu a viry jsou získávány přímo ze supernatantu po samovolném uvolnění enkapsidačními buňkami. Virus podle vynálezu je pak získán z buněčného supernatantu tak, jako ve vedlejších postupech; jedná se o virus intracelulární, zejména intranukleární.

Předkladatel nyní ukázal, že navzdory prodloužení doby kultivace a navzdory použití větších objemů postup podle vynálezu umožňuje vytvořit virové částice množství a zlepšit jejich kvalitu. Mimoto, naznačeno, tento postup umožňuje vyhnout se které jsou obtížné v průmyslovém měřítku a vytvářejí počet nečistot.

ve zvýsenem jak je již etapám lyzy,

Princip postupu se tedy týká získání volných virů ze supernatantu. Tento postup může zahrnovat dobu kultivace nižší než je doba kultivace vedlejších technik založených na buněčné lyže. Jak je již naznačeno, čas sklizně není přesný na půlden. Je určen kinetikou uvolňování viru do supernatantu kultury.

Kinetika uvolňování viru může být sledována různými způsoby. Může být zejména použita metoda analýzy, jako je RP-HPLC, IE-HPLC, semikvantitativní PCR (příklad 4.3), barvení mrtvých buněk barvivém blue trypan, měření uvolněného intracelulárního enzymu typu LDH, měření částic v • ••••9 Φ · · ·· * · • · · 9 9 9 9 · « · 9 • 99 9 999 99

99 · · 9 ··· · 9

9999 99 999 • 9 9« 999 9999 99 99 supernatantu přístroji typu Coulter nebo difrakcí světla, imunologické metody (ELISA, RIA atd.) nebo nefelometrie, titrace agregátů v přítomnosti protilátky atd.

Upřednostňovaný způsob získávání je, že je sklizeň provedena, když alespoň 50% viru bylo uvolněno do supernatantu. Doba, kdy 50% viru bylo uvolněno může být určena pomocí měření kinetiky podle metod dále popsaných. Ještě výhodněji je sklizeň provedena, když alespoň 70% viru bylo uvolněno do supernatantu. Ještě výhodněji je sklizeň provedena, když alespoň 90% viru bylo uvolněno do supernatantu tedy, když kinetika dosahuje maxima. Kinetika uvolňování viru závisí zejména na cyklu replikace adenoviru a může být ovlivněna určitými faktory. Zejména se může měnit podle typu použitého viru a podle typu delece provedené na rekombinantním virovém genomu. Zejména delece v oblasti E3 se zdá, že brzdí uvolňování viru. V přítomnosti oblasti E3 virus může být získán 24 - 48 hodin po infekci. Naopak v nepřítomnosti oblasti E3 je nezbytně nutné dobu kultivace prodloužit. V tomto ohledu předkladatel provedl kinetické pokusy uvolňování adenoviru se sníženou schopností v oblastech El a E3 do buněčného supernatantu a ukázal, že uvolnění začíná 4 až 5 dní po infekci, a že délka kultivace se pohybuje až okolo 14 dní. Uvolnění dosahuje všeobecně maxima mezi 8 a 14 dny a titr zůstává stabilní alespoň 20 dnů po infekci.

V postupu podle vynálezu buňky jsou přednostně kultivovány během periody zahrnující 2 a 14 dní. Uvolňování viru může být indukováno expresí v enkapsidační buňce proteinu, například virového, zahrnutého do uvolňování viru. V případě adenoviru uvolňování může být modulováno expresí proteinu Death kódovaného oblastí E3 adenoviru (protein E3-11,6K), případně exprimovaného pod řízením indukovatelného promotoru. Je možné snížit dobu uvolňování viru a získat ze supernatantu kultury víc než 50% viru 24-48 hodin po infekci.

Pro získání virových částic je výhodné supernatant kultury předem zfiltrovat. Pro adenovirus, který má velikost okolo 0,1 pm (12 nm) , filtrace je provedena pomocí membrán, které mají velikost pórů dostatečně významnou pro průchod viru, ale dostatečně jemnou pro zachycení kontaminantů. Filtrace je přednostně provedena pomocí membrán, které mají velikost pórů vyšší než 0,2 pm. Podle způsobu provedení zejména výhodného filtrace je vhodně provedena přes membrány se snižující se pórovitostí. Zejména dobré výsledky byly získány za použití filtrace přes hloubkové filtry se snižující se velikostí pórů 10 pm, 1,0 pm potom 0,8-0,2 pm. Podle jiné upřednostňované varianty filtrace je provedena tangenciální mikrofiltrací přes rovinné a vláknité hloubkové membrány. Mohou se zejména použít rovinné membrány firmy Millipore nebo vláknité hloubkové filtry, které mají velikost pórů mezi 0,2 pm a 0,6 pm. Výsledky uvedené v příkladech ukazují, že tato etapa filtrace má výtěžek 100% (nebyly pozorovány žádné ztráty virů zadržením na filtru majícího nejjemnější póry).

Podle jiného hlediska vynálezu předkladatel ukázal postup umožňující sklízet a purifikovat virus ze supernatantu. V tomto ohledu je takto filtrovaný (nebo čištěný) supernatant připraven k ultrafiltraci. Ultrafiltrace umožňuje (i) koncentrovat supernatant, předpokládané objemy jsou značné, (ii) zlepšení první purifikace viru a (iii) upravit pufr přípravy v pozdějších etapách přípravy. Podle upřednostňovaného způsobu provedení supernatant je podroben tangenciální ultrafiltraci. Tangenciální ultrafiltrace spočívá v koncentraci a frakcionaci roztoku na dva podíly, peletu a filtrát, které jsou separovány membránami určité velikosti za provedení průtoku přes podíl pelety a za aplikace transmembránového tlaku mezi tímto podílem a podílem filtrátu. Průtok je všeobecně proveden pomocí pumpy do podílu pelety a transmembránový tlak je řízen prostřednictvím šoupátka na kapalinovém přítoku oběhu filtrátu nebo pumpou s

proměnlivým průtokem na kapalinovém přítoku oběhu filtrátu. Rychlost průtoku a transmembránový tlak jsou zvoleny tak, aby se vytvořily malé střihové síly (počet jednotek reynold nižší než 5000 s¹, přednostně nižší než 3000 s^_1, tlak nižší než 1,0 bar) pro vyhnutí se vyprazdňování membrán. Pro provedení ultrafiltrace mohou být použity různé systémy, jako například spirálové membrány (Millipore, Amicon), rovinné membrány nebo hloubkové vláknité membrány (Amicon, Millipore, Sartorius, Pall, GF, Sepracor). Pro adenoviry, které mají velikost okolo 1000 kDa se používají výhodně v rámci vynálezu membrány, které mají velikost pórů menší než 1000 kDa přednostně mezi 100 kDa a 1000 kDa. Použití membrán, které mají velikost 1000 kDa nebo vyšší, ztrácí význam pro virus v této etapě. Přednostně se používají membrány, které mají velikost mezi 200 a 600 kDa, zejména 300 a 500 kDa. Uvedené zkušenosti v příkladech ukazují, že použití membrány, která má velikost 300 kDa umožňuje zadržení větší než 90% virových částic, přičemž eliminuje kontaminanty kultivační půdy (DNA, proteiny kultivační půdy, buněčné proteiny atd.). Použití velikost 500 kDa nabízí stejné výhody.

Výsledky uvedené v příkladech ukazují, že tato etapa umožňuje významně koncentrovat objemy supernatantu bez ztráty viru (výtěžek je 90%), a že se získá virus lepší kvality. Může být snadno dosaženo 20 - 100 násobné koncentrace.

Tato etapa ultrafiltrace spočívá tedy v doplňkové purifikaci na rozdíl od klasického schématu, kde kontaminanty velikosti nižší než velikost membrány (300 nebo 500 kDa) jsou eliminovány alespoň zčásti. Zvýšení kvality virového preparátu je evidentní, když se porovná hledisko separace po první etapě ultracentrifugace podle těchto dvou postupů. V klasickém postupu, který zahrnuje lyzu, zkumavka virového prostředku má poněkud problémy se sraženinou (lipidy, proteiny), která někdy dosahuje pruhu viru, zatímco v postupu podle vynálezu přípravek po uvolnění a ultrafiltraci » « • 4 představuje pruh dobře oddělený od kontaminantů média, které zůstávají ve vyšší fázi. Zvýšení kvality je také ukázáno, když se porovnají profily na iontoměničové koloně získaného viru buněčnou lyzou oproti viru, který byl získán ultrafiltrací jak je popsáno v předloženém vynálezu. Je také možné zvýšit kvalitu při následování ultrafiltrace diafiltrací koncentrátu. Tato diafiltrace se provádí na stejném principu jako tangenciální ultrafiltrace a umožňuje vyloučit kontaminanty vyšší velikosti než je velikost membrány za provedení ekvilibrace koncentrátu v purifikačním pufru.

Předkladatel také ukázal, že tato ultrafiltrace umožňuje potom purifikaci viru přímo chromatograficky na iontoměničové koloně nebo gelovou filtrací, která umožňuje získat dobré rozdělení signálů virových částic bez potřeby předběžné chromatografie přípravku. Zejména toto je neočekávané a výhodné. Jak je naznačeno ve výše uvedeném článku autorů Hyughe et al., purifikace chromatografií virového preparátu poskytuje nevalné výsledky a ukazuje na nutnost předem podrobit virovou suspenzi Bensonase a cyklodextrinům.

Postup podle vynálezu se tedy vyznačuje tím, že virus je získán pomocí ultrafiltrace.

Jak je již naznačeno, výsledný koncentrát je použitelný přímo pro purifikaci'viru. Tato purifikace může být provedena klasickými technikami, takovými jako jsou odstřeďování v gradientu chloridu česného nebo v jiném prostředí ultracentrifugace, která umožňuje oddělit částice podle jejich velikosti, denzity nebo sedimentačního koeficientu. Výsledky uvedené v příkladu 4 ukazují, že virus takto získaný má významné vlastnosti. Zejména podle vynálezu je možné nahradit chlorid česný roztokem jodixanol,5,5'-[(2-hydroxy-1,3propandiyl)-bis(acetylamino)]bis(acetylamono)bis[N,N'

-bis(2,3dihydroxypropyl-2,4,6-triodo-l,3-benzenkarboxamid],

ve kterém virus sedimentuje v rovnováze s denzitou mezi 1,16 a 1,24. Použití tohoto roztoku je výhodné, protože na rozdíl od chloridu česného není toxický. Předkladatel také prokázal, že takto výhodně získaný koncentrát umožňuje také purifikovat virus přímo mechanizmem měniče iontů nebo gelovou filtrací získat velmi dobrý výsledek dělení chromatografických signálů virových částic bez potřeby předběžného zpracování.

Podle upřednostňovaného způsobu provedení virus je tedy získán a purifikován aniontomeničovou chromatografií.

Pro aniontoměničovou chromatografií byly použity různé druhy nosiče, takové jako je celulosa, agarosa (gely Sepharosa), dextran (gely Sephadex), akrylamid (gely Sephacryl, gely Trisacryl) silice (gely TSK-gel SW) , póly[styren/divinylbenzen] (gely Source nebo gely Poros), kopolymer ethylenglycolmethakrylat (gely Toyopearl HW a TSK-gel PW) nebo směsi (agarosa-dextran: gel Superdex). Pro zvýšení chromatografického dělení je výhodnější v rámci předloženého vynálezu použití nosičů ve formě kuliček, které mají následující vlastnosti:

-co možná nejvíce kulový tvar,

-kalibrovaný rozměr (všechny kuličky by měly být identické nebo co možná nejvíce homogenní), bez nedokonalosti a bez rozbití,

-co možná nejmenší rozměr: byly popsány kuličky 10 pm (například MonoBeads Pharmacia nebo TSK-gel TosoHaas). Tato velikost se zdá, že je dolní limitou pro rozměr kuliček, jejichž pórovitost musí být velmi vysoká pro to, aby umožnila penetraci předmětu chromatografie do vnitřku kuliček (viz dále).

-zachovat rigiditu pro rezistenci k tlaku.

Pro chromatografie adenovirů obsahujících předmět velmi významné velikosti (rozměr > lOOnm) je důležité použít gely ·· 00 09

9 · 0 0 0 0 0 0* 0

0 0 · 0 0009

9· 0 0 0 «000 0 • 000 ·· 000 ·· *00 0009 0· 00 mající horní limitu pórovitosti zvýšenou, dokonce co možná nejvíce, pro umožnění přístupu virových částic k funkčním skupinám, s kterými by měly interagovat.

Výhodně je nosič vybrán mezi agarosou, dextranem, akrylamidem, silicí, póly[styren-divinylbenzenem], kopolymerem ethylenglykolmethylaktrylátem, samotnými nebo ve směsi.

Pro aniontoměničové chromatografie použitý nosič musí být funkcionalizován roubováním skupin schopných interagovat s anionickými molekulami. Skupina je tvořena zejména aminem, který může být terciální nebo kvarterní. Za použití tercinálního aminu takového, jako je například DEAE se získá slabý měnič aniontů. Za použití kvarterního aminu se získá silný měnič aniontů.

V rámci předloženého vynálezu je zejména výhodné použití silného měniče aniontů. Podle vynálezu se přednostně používá nosič chromatografie takový, jaký je naznačen dále, funkcionalizovaný kvarterními aminy. Mezi nosiči, které jsou funkcionalizované kvarterními aminy se mohou uvést jako příklady pryskyřice Source Q, Mono Q, Q Sepharosa, Poros HQ a Poros QE, pryskyřice typu Fractogel TMAE a pryskyřice Toyopearl SuperQ.

Upřednostňované příklady pryskyřic použitelných v rámci vynálezu jsou Source zejména Source Q takové, jako 15 Q (Pharmacia), MonoBeads, takový jako Q (Pharmacia) pryskyřice typu Poros HQ a Poros QE. Nosič MonoBeads (rozměr kuliček 10 ±0,5 μηι) je komerčně dostupný již 10 let a pryskyřice typu Source (15 μιη) nebo Poros (10 μτη nebo 20 μτη) již okolo 5 let. Tyto dvě náplně mají výhodu, že mají vnitřní rozdělení pórů velmi široké (od 20 nm po 1 pm) umožňující tak přechod velmi velkého objektu skrz kuličky. Poskytují velmi malou rezistenci k cirkulaci kapaliny skrz gel (tedy velmi málý tlak) a jsou velmi rigidní. Transport roztoků skrz funkční ··· · ·· • · · · ·· ·· skupiny, se kterými budou vstupovat do interakce, je velmi rychlý. Předkladatel ukázal, že tyto parametry jsou zejména důležité v případě adenoviru, jehož difúze je pomalá vzhledem k jeho velikosti.

Výsledky uvedené v příkladech ukazují, že adenovirus může být purifikován z koncentrátu v jedné etapě aniontoměničové chromatografie, že výtěžek purifikace je velmi dobrý (140% tdu, při porovnání s hodnotou 49% publikovanou autory Huyghes et al.), a že rozdělení je také velmi dobré. Uvedené výsledky mimoto ukazují, že získaný adenovirus má zvýšenou infekční schopnost a má tedy vlastnosti, které jsou vyžadované pro terapeutické použití. Tyto přednostně výhodné výsledky byly získány se silným měničem aniontů, totiž s funkcionalizovaným měničem aniontů, zejména pryskyřicí Source Q. Zejména je upřednostňovaná pryskyřice Source Q15.

V tomto ohledu se předmět vynálezu týká purifikace rekombinantních adenoviru z biologického prostředí vyznačenou tím, že zahrnuje etapu purifikace silnou aniontoměničovou chromatografií.

Podle této varianty biologické prostředí může být supernatant enkapsidačních buněk, které produkují uvedený virus, lyzat enkapsidačních buněk, které produkují uvedený virus nebo roztok prepurifikovaného uvedeného viru.

Chromatografie je přednostně provedena na nosiči, který je funkcionalizován upřednostňovaného způsobu agarosou, dextranem, póly[styrendivinylbenzenem], methakrylatem, samotnými nebo ve směsi, kvarterním aminem. Podle nosič je vždy vybírán mezi akrylamidem, silicí, kopolymerem ethylenglykolZejména výhodný je způsob provedení, který se vyznačuje tím, že chromatografie je provedena na pryskyřici Source Q • ·β · «4 • · · · • · · • · · · • · · · ·· ·· · • ···· zejména Q15.

Postup dále popsaný je výhodně proveden na supernatantu buněk, které produkují virus ultrafiltrace. Tato etapa je popsaných podmínek, zejména a zahrnuje etapu předběžné výhodně provedena za dříve se jedná o tangenciální ultrafiltraci na membráně, která má velikost mezi 300 a 500 kDa.

Podle jiného způsobu provedení vynálezu jsou viry získány a purifikovány chromatografií gelovou filtrací.

Gelová filtrace může být provedena přímo na supernatantu, na koncentrátu, nebo na viru pocházejícím z aniontoměničové chromatografie. V této etapě mohou být být použity zmíněné nosiče pro aniontoměničovou chromatografii, ale bez funkcionalizace.

V tomto ohledu upřednostňované nosiče jsou agarosa (gely Sepharosa), dextran (gely Sephacryl, gely Trisacryl), silice (gely TSK-gel SW) , kopolymer ethylenglykolmethakrylat (gely Toypearl HW a TSK-gel PW, nebo směsi (agarosa-dextran: gel Superdex). Nosiče zejména upřednostňované jsou:

-Superdex 200HR (Pharmacia)

-Suphacryl S-500HR, S-1000HR nebo S-2000 (Pharmacia)

-TSK G6000 PW (TosoHaas).

Upřednostňovaný postup podle vynálezu zahrnuje tedy ultrafiltraci následovanou aniontoměničovou chromatografii.

Jiný uřednostňovaný postup podle vynálezu zahrnuje tedy ultrafiltraci následovanou aniontoměničovou chromatografii následovanou chromatografii gelovou filtraci.

Jiná varianta vynálezu se týká postupu purifikace adenovirů z biologického prostředí, který zahrnuje první etapu ultracentrifugace, druhou etapu diluce nebo dialýzy a

9 9 9

99

99 99 99

999 9 9 99 9

9 9999 · 9 9999 9

9 9 9 9

999 9999 >9 99 třetí etapu aniontoměničové chromatografie. Podle této varianty je přednostně první etapa provedena rychlou ultracentrifugací v gradientu chloridu česného. Termín rychlá znamená ultracentrifugací ne delší než 0,5 až 4 hodiny. V průběhu druhé etapy virus je diluován nebo dialysován proti pufru, aby se usnadnila jeho injektace na chromatografický gel, a aby se vyloučila ultracentrifugace. Třetí etapa je provedena za použití aniontoměničové chromatografie tak, jak je již popsáno přednostně, silných aniontů. V typickém pokuse od viru získaného ze supernatantu (nebo případně intracelulární) první rychlá ultracentrifugace je provedena s chloridem cesnatým (jako v příkladě 3). Po jednoduché diluci vzorku (například deseti objemy pufru) nebo po jednoduché dialýze v pufru je vzorek chromatografován iontoměničovou chromatografií (jako v příkladě 5.1). Výhoda této varianty postupu podle vynálezu spočívá v tom, že uvádí dvě úplně rozdílné separace viru (denzita a povrchový náboj), které mohou upravit případně virus na úroveň kvality, která doplňuje technické údaje těchto dvou metod. Etapa chromatografie mimoto umožňuje současně vyloučit prostředí použité pro ultracentrifugací (například chlorid česný nebo každé jiné prostředí odpovídající prostředí, která jsou citovaná výše).

Jiný předmět vynálezu se týká použití jodixanol,5,5'-[(2-hydroxy-l,3propandiyl)-bis(acetylamino)] -bis(acetylamono)bis[N,N'-bis(2,3dihydroxypropyl-2,4,6-triodo -1,3-benzenkarboxamid] pro purifikaci adenoviru.

Pro uvedení postupu podle vynálezu mohou být použity různé enkapsidační buňky adenoviru. Enkapsidační buňky mohou být zejména připraveny od různých farmaceuticky použitelných buněk, totiž buněk kultivovatelných za přijatelných průmyslových podmínek, které nemají patogenní charakter. Může se jednat o divoké nebo primární kulturní buněčné linie, zejména lidské retinoblasty, buňky lidského karcinomu plic ·««· ·· • * A • A A

A A · • · · A • A ··

A

A·· A • A AA

A · A A

A A A A

A AAA A A

A A · • A A A nebo embryonální buňky ledvin. Může se výhodně jednat o buňky lidského původu, které jsou infikovatelné adenovirem. V tomto ohledu se mohou uvést buňky KB, Hela, 293, Věro, gmDBP6, HER, A54 9, HER atd.

Buňky linie KB pocházejí z karcinomu lidského epidermu. Jsou přístupné k ATCC (ref. CCL17) stejně jako k podmínkám, které umožňují jejich kultivaci. Linie lidských buněk Hela pochází z karcinomu lidského epitelu. Je také přístupná k ATCC (ref. CCL2) stejně jako k podmínkám, které umožňují jejich kultivaci. Buňky linie 293 jsou buňky ledvin lidského embrya (Graham et al., J. Gen. Virol. 36 (1977) 59). Tato linie obsahuje zejména zahrnutou ve svém genomu levou část genomu lidského adenovirů Ad5 (12%) . Buněčná linie gm DBP6 (Brough et al., Virology 190 (1992) 624) je tvořena buňkami Hela, které nesou gen E2 adenovirů pod řízením LTR MMTV.

Může se také jednat o buňky psího původu (BHK, MDCK atd). V tomto ohledu jsou upřednostňovány psí buňky linie MDCK. Podmínky kultivace buněk MDCK jsou popsány zejména autory Macatney et al., v Science 44 (1988) 9.

V literatuře byly popsány různé linie enkapsidačních buněk a jsou zmíněny v příkladech. Jedná se zejména o buňky, které transkomplementují funkce El a E4 nebo El a E2 adenovirů. Tyto buňky jsou přednostně odvozeny od lidských embryonálních buněk ledvin nebo sítnice nebo lidských karcinomů plic.

Vynález se také týká zejména výhodného postupu přípravy rekombinantního adenovirů. Tento postup je přizpůsoben produkci defektního rekombinantního viru v jedné nebo více oblastech a zejména viru, který je defektní v oblasti El nebo v oblasti El a E4. Jinak je tento postup aplikovatelný pro přípravu adenovirů různých serotypů takových, jaké jsou již naznačeny.

Podle zejména výhodného způsobu provedení postup

vynálezu je použitý pro přípravu rekombinantního adenovirů, ve kterém oblast El je neaktivní delecí fragmentu PvuII-BglII, který se rozprostírá od nukleotidu 454 po nukleotid 3328, na sekvenci adenovirů Ad5. Tato sekvence je uvedena v literatuře a také na základě dat (viz zejména Genebank n°M73260). V jiném upřednostňovaném způsobu provedení je oblast El neaktivní delecí fragmentu HinfII-Sau3A, který se rozprostírá od nukleotidu 382 po nukleotid 3446. Ve zvláštním způsobu postup umožňuje přípravu vektorů, které obsahují úplnou deleci oblasti E4. Toto může být provedeno odstraněním fragmentu Maell-MscI, který odpovídá nukleotidům 35835-32720. V jiném zvláštním způsobu postupu je deletována samotná funkční část E4. Tato část obsahuje alespoň fáze ORF3 a ORF6. Tyto kódované fáze genomu například mohou být deletovány ve formě fragmentů PvuII-AluI a BglII-PvuII, které odpovídají nukleotidům 34801-34329 a 34115-33126. V rámci předloženého vynálezu mohou být také použity delece oblasti E4 viru Ad2 dl808 nebo viru Ad5 dll004, Ad5 dll007, Ad5 dllOll nebo Ad5 dll014. V tomto ohledu jsou zejména výhodné buňky pro přípravu viru, který obsahuje neaktivní oblast El a deleci v oblasti E4 tohoto typu přítomného v genomu Ad5 dll014, totiž viru E4-, který zachovává čtecí fázi ORF4.

Jak je již naznačeno, delece v oblasti El zahrnuje výhodně celek nebo část oblastí ElA a E1B. Tato delece musí být dostatečná proto, aby učinila virus neschopný se autonomně replikovat v buňce. Část oblasti El deletovaná v adenovirů podle vynálezu pokrývá výhodně nukleotidy 454-3328 nebo 382-3446.

Dále uvedené pozice odkazují na sekvenci divokého adenovirů Ad5 takového, jaký je publikovaný a přijatý na daném základě. Ačkoliv menší varianty musí existovat mezi různými serotypy adenovirů, tyto polohy jsou všeobecně aplikovatelné pro konstrukci rekombinantních adenovirů podle vynálezu od každého serotypu a zejména adenovirů Ad2 a Ad7.

Vytvořené adenoviry mohou mít další alternativy na úrovni jejich genomu. Mohou být další oblasti deletovány pro zvýšení schopnosti viru a snížení vedlejších účinků spojených s expresí virových genů. Může být zejména deletován celek nebo část oblasti E3 nebo IVa2. Co se týče oblasti E3, může být zejména výhodné zachovat oblast kódující protein gpl9K. Tento protein umožňuje vyhnout se tomu aby adenovirový vektor byl předmětem imunitní reakce, která (i) omezuje jeho účinek a (ii) by mohla mít nežádoucí sekundární účinek. Podle způsobu provedení oblast E3 je deletovaná a sekvence kódující protein gpl9k je znovu vložena pod řízení heterologního promotoru.

Jak je již naznačeno, adenoviry obsahují vektory přenosu genů velmi účinných pro aplikace v genové a buněčné terapii. Proto heterologní sekvence nukleových kyselin, jejichž přenos nebo/a exprese v buňce, orgánu nebo organizmu je zkoumána může být vložena do jejich genomu. Tato sekvence může zahrnovat jednu nebo více terapeutických genů takových, jako je gen, jehož transkripce a případně translace v cílové buňce vytvářejí produkty, které mají terapeutický účinek. Mezi terapeutickými produkty se mohou uvést zejména enzymy, krevní deriváty, hormony, lymfokiny: interleukiny, interferony, TNF, atd. (FR 9203120), růstové faktory nebo jeji prekurzory nebo enzymy syntézy, trofické faktory: BDNF, CNTF, NGF, IGF, GMF, aFGF, bFGF, NT3, NT5 atd., apolipoproteiny: ApoAI, ApoAIV, ApoE atd. (FR 93 05125), dystrofin nebo minidistrofin (FR 91 11947) geny supresorů tumorů: p53, Rb, RaplA, DCC, k-rev atd. (WO94/24297), geny kódující faktory zahrnuté do koagulace: Faktor VII, VIII, IX atd. sebevražedné geny: thymidin-kinasa, cytosin-deaminasa atd. nebo také celek nebo část přírodního nebo umělého imunoglobinu (Fab, ScFv atd. WO94/29446), atd. Terapeutický gen může být gen nebo antisensovou sekvencí, jejichž exprese • · • · · • · · · • · · · • · · · v cílové buňce umožňuje řídit expresi genů nebo transkripci buněčné mRNA. Tyto sekvence mohou být například transkripovány v cílové buňce v RNA komplementární mRNA buněčné a blokovat tak jejich translaci v proteinu podle technik popsaných v EP 140 308. Terapeutický gen může také být gen kódující antigenní peptid schopný tvořit u lidí imunitní odpověď z pohledu vakcinové realizace. Může se zejména jednat o specifické antigenní peptidy viru Epstein-Baarové, viru HIV, viru hepatitidy B (EP 185 573) , virus pseudovztekliny nebo také specifický nádorový virus (EP 259 212).

Heterologní sekvence nukleových kyselin obsahuje zejména oblast promotoru transkripce funkční v infikované buňce, stejně jako oblast umístěnou na 3'konci genu zájmu, který specifikuje signál terminace transkripce a místo polyadenylace. Tyto elementy dohromady tvoří kazetu exprese.

se jednat

Co se týče oblasti promotoru, může promotoru přirozeně odpovědného za expresi požadovaného genu, když tento je schopný fungovat v infikované buňce. Může se jednat o oblasti různého původu (odpovědné za expresi jiných proteinů nebo stejných syntetických. Zejména se může jednat o sekvence promotorů eukaryontních nebo virových genů nebo o každou sekvenci promotoru nebo odvozenou, která stimuluje nebo potlačuje transkripci genu specificky nebo nespecificky, indukovatelně nebo neindukovatelně. Například se může jednat o sekvence promotorů vzešlých z genomu buňky, která se požaduje infikovat nebo genomu viru, zejména se jedná o promotory genů EAl, MLP adenoviru, promotor CMV, LTR-RSV atd. Mezi promotory eukaryontů se mohou použít zejména ubikvitinové promotory (HPRT, vimentin, α-aktin, tubulin atd.), promotory středních filament (GFAP, desmin, neurofilament, keratin atd.), promotory terapeutických genů (typ MDR, CFTR, faktor VIII, ApoAI atd.) promotory specifických tkání (pyruvát-kinasa, vilin, vazebný střevní protein mastných kyselin, α-aktin hladkého svalstna, oblast • ·

specifický promotor pro játra; Apo AI, Apo AII, lidský albumin atd.) nebo také promotory odpovídající na stimuly (receptor steroidních hormonů, receptor kyseliny retinové atd.). Mimoto tyto sekvence exprese mohou být modifikovány adicí aktivačních sekvencí, regulačních nebo sekvencí umožňujících expresi tkáňově specifickou nebo majoritní. Jinak, jestliže vložená nukleová kyselina neobsahuje sekvence exprese, může být vložena do genomu defektního viru po směru takovéto sekvence.

Heterologní sekvence nukleových kyselin může také zahrnovat zejména proti směru terapeutického genu signální sekvenci řídící terapeutický produkt syntetizovaný v sekrečních cestách cílové buňky. Tato signální sekvence může být přírodní signální sekvencí terapeutického produktu, ale může se také jednat o každou jinou funkční signální sekvenci nebo o umělou signální sekvenci.

Kazeta exprese terapeutického genu může být vložena do různých míst genomu rekombinantního adenoviru podle technik popsaných ve vedlejších oborech. Může být především vložena na úrovni delece El. Může být také vložena na úrovni oblasti E3 za přidání nebo substituce sekvencí. Může být také umístěna na úrovni deletované oblasti E4.

Předložený vynález se také týká virových preparátů purifikovaných a získaných podle postupu vynálezu, stejně jako každé farmaceutické kompozice obsahující alespoň jeden nebo více defektních rekombinantních adenovirů připravených podle tohoto postupu. Farmaceutické kompozice podle vynálezu mohou být formulovány z pohledu podávání a to orálně, parenterálně, intranasálně, intravenózně, intramuskulárně, podkožně, intaokulárně atd.

Farmaceutická kompozice podle vynálezu obsahuje vhodné farmaceutické vehikulum pro injektovatelnou formu. Může se jednat zejména o roztoky solí (dihydrogenfosforečnan sodný, • · · · sodný, draselný, vápenatý těchto solí), sterilní.

hydrogenfosforečnan sodný, chlorid nebo horečnatý atd. nebo směs izotonické nebo kompozice suché zejména lyofilizované, které po přídavku, podle případu, sterilované vody nebo fyziologického séra umožňují injektovatelnou formu kompozice. Mohou být použity další vehikula jako například hydrogel. Tento hydrogel může být připraven od každého polymeru (homo nebo heteropolymeru) biokompatibilního a necytotoxického. Tyto polymery byly například popsány v přihlášce vynálezu WO93/08845. Některé mezi nimi jako například ty, které jsou získány od ethylen oxidu nebo/a propylen oxidu jsou komerční. Dávka vektoru použitá pro injekci může být přizpůsobena různým parametrům, zejména použitému způsobu podávání, patologii, genu určeného k exprimování nebo také délce léčení. Všeobecně rekombinantní adenoviry podle vynálezu jsou formulovány a podávány ve formě dávek, které obsahují mezi 10⁴ a 10¹⁴ pfu/ml, zejména 10⁶ až 1O¹⁰ pfu/ml. Termín pfu (plaque forming units) odpovídá infekční schopnosti roztoku adenovirů a je určen infekcí určité buněčné kultury a následným měřením po 15 dnech počtu plaků infikovaných buněk. Techniky určení velikosti pfu virového roztoku jsou dobře popsány v odborné literatuře.

Podle terapeutického genu viry takto produkované mohou být použity pro léčení nebo prevenci počtu patologií, které zahrnují genetická onemocnění (distrophie, cystická fibrosa atd.), neurodegenerativní onemocnění (Alzheimer, Parkinson, ALS, atd.), rakoviny, patologie spojené s desorganizací koagulace nebo s dyslipoproteinémií, patologie spojené s virovou infekcí (hepatitida, AIDS atd.) atd.

Následující obrázky a příklady blíže ilustrují vynález, aniž by však v jakémkoliv směru omezovaly jeho rozsah.

• ·

Legenda k obrázkům

Obrázek 1: Studie stability adenovirů purifikovaného podle příkladu 4.

Obrázek 2; HPLC analýza (reverzní fáze) adenovirů purifikovaného podle příkladu 4. Porovnání s adenovirem podle příkladu 3.

Obrázek 3: Kinetika uvolňování adenovirů Ad-pGal do supernatantu buněk 293, měřeno semikvantitativní PCR a Plague Assay.

Obrázek 4: Profil eluce na Source Q15 supernatantu ultrafiltrovaného adenovirů (příklad 5.1).

Obrázek 5: HPLC analýza na Resource Q signálu získaného viru chromatografií na pryskyřici Source Q15 supernatantu ultrafiltrovaného adenovirů (příklad 5.1).

Obrázek 6: (A) Profil eluce na pryskyřici Source Q15 supernatantu adenovirů Ad-APOAl ultrafiltrovaného (příklad

5.3) ; a (B) HPLC analýza (Resource Q) signálu získaného viru.

Obrázek 7: (A) Profil eluce na pryskyřici Source Q15 supernatantu adenovirů Ad-TK ultrafiltrovaného (příklad 5.3). HPLC analýza (Resource Q) různých frakcí (začátek a konec signálu) získaných virů: (B) Frakce F2, střed signálu; (C) Frakce F3, okraj signálu; (D) frakce F4 konec signálu.

Obrázek 8: Profil eluce na pryskyřici Mono Q koncentrátu supernatantu buněčné kultury produkující adenovirus (příklad 5.4). BG25F1: Infikovaný a koncentrovaný supernatant.

Obrázek 9: Profil eluce na gelu POROS HQ koncentrátu supernatantu buněčné kultury produkující adenovirus (příklad

5.4) . BG25F1: virový koncentrovaný supernatant a purifikovaný na cesiu. BG25C: Infikovaný a koncentrovaný supernatant

Obrázek 10: Profil purifikace gelovou filtrací na Sephacryl SlOOOHR/Superdex 200HR supernatantu ultrafiltrovaného adenoviru (příklad 6).

Obrázek 11: Analýza elektronickým mikroskopem adenoviru purifikovaného podle vynálezu.

Obrázek 12: Analýza elektronickým mikroskopem virového pásu denzity 1,27.

Všeobecné techniky molekulární biologie

Klasické metody používané v molekulární biologii takové, jako jsou preparativní extrakce plazmidové DNA, odstřeďování plazmidové DNA v gradientu chloridu česného, elektroforéza na agarosových gelech nebo akrylamidu, purifikace fragmentů DNA elektroelucí, extrakce proteinů fenolem nebo směsí fenol-chloroform, srážení DNA v prostředí šalinu ethanolem nebo isopropanolem, transformace v E. coli atd. jsou dobře známé odborníky a jsou popsány v odborné literatuře (Maniatis et al., Molecular Cloning, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbar,

N.Y., 1982; Ausubel et al., (eds.) Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley&Sons, New York, 1987) .

Plazmidy typu pBR322, pUC a fágy série M13 jsou komerčního původu (Bethesda Research Laboratories). Pro ligaci mohou být fragmenty DNA rozděleny na základě velikosti elektroforézou na agarosových nebo akrylamidových gelech, extrahovány fenolem nebo směsí fenol/chloroform, sráženy ethanolem a inkubovány v přítomnosti DNA-ligasy fágu T4 (Biolabs) podle doporučení dodavatele. Doplnění vyčnívajících konců 5' může být provedeno Klenowým fragmentem DNA Polymerasy I E. coli (Biolabs) podle doporučení výrobce.

φ φ φφ · · > · φ · φ φ • · · Φ· • « 0 · · · · • φφφ

ΦΦ·Φ φ* ··

Destrukce přečnívajících konců 3' je provedeno za přítomnosti DNA Polymerasy fágu (Biolabs) použité podle doporučení výrobce. Destrukce přečnívajících konců 5' je provedeno zpracováním směsi nukleasou Sl.

Řízená mutageneze in vitro syntetickými oligodeoxynukleotidy může být provedena podle metody vyvinuté Taylorem et al., (Nucleic Acids Res. 13 (1985) 8749-8764) za použití soupravy firmy Amersham. Enzymatická amplifikace fragmentů DNA technikou nazvanou PCR (Polymerase-catalyzed Chain Reaction, Saiki R. K. et al., Science 230 (1985) 1350-1354; Mullis K. B. a Faaloona F. A., Meth. Enzym. 155 (1987) 335-350) může být provedena za použití DNA thermal cycler (Perkin Elmer Cetus) podle doporučení výrobce. Ověření nukleotiotidových sekvencí může být provedeno metodou vyvinutou Sangerem et al., (Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 74 (1977) 5463-5467) za použití soupravy firmy Amersham.

Příklady

Příklad 1: Buněčná enkapsidační linie

Enkapsidační buňky použité v rámci vynálezu mohou pocházet z každé buněčné linie infikovatelné adenovirem slučitelným s použitím v terapeutické oblasti. Jedná se zejména o buňky vybrané mezi následujícími liniemi:

-buněčná linie 293:

Linie 293 je linie embryonálních buněk lidských ledvin, obsahující levý konec (okolo 11-12%) genomu adenoviru serotypu 5 Ad5, obsahující levou ITR, oblast enkapsidace, oblast El, obsahující E1A, E1B, oblast kódující protein pIX a část oblasti kódující protein pIVa2 (Graham et al., J. Gen. Virol. 36 (1977) 59) . Tato linie je schopná

transkomplementovat defektní rekombinantní adenovirus v oblasti El, totiž ztracený celek nebo část této oblasti El, a produkovat množství viru, který má zvýšené hodnoty.

-buněčná linie A54 9:

Buňky doplňující oblast El adenoviru byly konstruovány od buněk A549 (Imler et al., Gene Ther. (1996) 75). Tyto buňky obsahují fragment zasahující oblast El, která je zbavena levé ITR umístěné pod řízením indukovatelného promotoru.

-buněčná linie HER

Embryonální buňky lidských ledvin (HER) mohou být infikovány adenovirem (Byrd et al., Oncogene 2 (1988) 477). Enkapsidační buňky adenoviru připravené od těchto buněk byly popsány například v přihlášce vynálezu WO94/28153 nebo v článku autorů Fallaux et al. (Hum. Gene Ther. (1996) 215) . Mohou se uvést zejména linie 911 obsahující oblast El genomu adenoviru Ad5, od nukleotidu 70 po nukleotid 5789 obsažený v genomu buněk HER. Tato buněčná linie umožňuje produkci viru defektního v oblasti El.

-buňky IGRP2

Buňky IGRP2 jsou buňky získané od buněk 293 vložením funkční jednotky oblasti E4 pod řízení indukovatelného promotoru. Tyto buňky umožňují tvorbu defektních virů v oblasti El a E4 (Yeh et al., J. Virol (1996) 70).

-buňky VK

Buňky VK (VK2-20 a VK10-9) jsou buňky získané od buněk 293 vložením celistvé oblasti E4 pod řízení indukovatelného promotoru a oblasti kódující protein pIX. Tyto buňky umožňují tvorbu defektních virů v oblasti El a E4 (Krougliak et al., Hum. Gene Ther. 6 (1995) 1575).

• · » « ·· · · · 4 • 4 ·

4· 44

-buňky 293Ε4

Buňky 293E4 jsou buňky získané od buněk 293 včleněním celistvé oblasti E4. Tyto buňky umožňují tvorbu defektních virů v oblasti El a E4 (WO95/02697; Cancer Gene Ther. (1995) 322) .

Příklad 2: Použité viry

Produkované viry v rámci příkladů, které následují jsou adenoviry obsahující značený gen LacZ E.coli (Ad-PGal), adenovirus obsahující gen kódující thymidin-kinasu viru herpes typu I (Ad-TK), adenovirus kódující supresorový protein lidského tumoru p53 a virus kódující apolipoprotein Al (Ad-apoAI). Tyto viry jsou odvozeny od serotypu Ad5 a mají následující strukturu:

-deleci v oblasti El, která zahrnuje nukleotidy 382 (místo Hinfl) až 3446 (místo Sau3a).

-kazetu exprese genu pod řízením promotoru RSV nebo CMV vloženou na úrovni výše uvedené delece,

-deleci oblasti E3.

Konstrukce těchto virů byla popsána v literatuře (WO94/25073, WO95/14102, FR 95.01632, Stratford-Perricaudet et al. J. Clin. Invest (1992) p626). Očekává se, že může být připravena každá jiná konstrukce podle postupu vynálezu zejména virus nesoucí další heterologní geny nebo/a další delece (například E1/E4 nebo E1/E2).

Příklad 3: Produkce viru lyzou buněk

Tento příklad popisuje dřívější techniku přípravy viru spočívající v lyže enkapsidačních buněk pro získání • · · · • « « · • « ♦ • · · • « · · « · « · • » · » · « ·· • · * « · « « ·· · · · • 9 9 9

9 999 99 99 produkovaného viru.

Buňky 293 jsou infikované z 80-90% v kultivační misce se zásobou viru Ad-pGal nebo Ad-TK (příklad 2) v poměru 3 až 5 virů na buňku (Multiplicity of Infection MOI = 3 až 5) . Délka inkubace se pohybuje od 40 do 72 hodin a čas sklizně je určen pozorováním buněk v mikroskopu, buňky které se zakulatily stanou se lámavější a přiléhají slaběji a slaběji k nosiči kultury. V literatuře kinatika virového cyklu trvá od 24 do 36 hodin.

Na laboratorní úrovni přípravy je důležité sklízet buňky dříve než se oddělí, aby se vyloučila infekce kultivačního prostředí v době sklizně bez ztráty buněk a potom je navrátit do minimálního objemu (koncentrační faktor se řídí podle velikosti kultury, tj. mezi 10 a 100 násobkem).

Virus je tedy uvolněn z jádra třemi až šesti cykly postupného rozmrazování (ethanol - suchý led až -70°C, teplota lázně 37°C).

Získaný buněčný lyzát je potom odstředěn při rychlosti 2000 až 4000 rpm a supernatant (čistý buněčný lyzát) je potom purifikován ultracentrifugací v gradientu chloridu česného ve dvou etapách:

-První rychlá ultracentrifugace po dobu 1,5 hodiny při 35000 rpm rotor sw 41, ve dvou vrstvách cesia 1,25 a 1,40 zajišťující denzitu viru (1,34) tak, aby došlo k separaci proteinů viru z prostředí; rotory mohou být rotory swinging (Sw28,Sw41Beckman) nebo fixní úhel (Ti 45, Ti 70, Ti 70.1 Beckman) podle účinného objemu;

-Druhá ultracentrifugace v delším gradientu (od 10 po 40 hodin podle použitého rotoru) například 18 hodin při 35000 rpm v rotoru sw 41, která spočívá v pravé a jedinečné purifikaci viru. Virus se nalézá v lineárním gradientu s rovnováhou k denzitě 1.34.

• 44 · 4* ·· 44 44

4 · * · 4 • · 4 44

444 4444

V této etapě je pruh viru majoritní. Nicméně byly pozorovány dva tenké pruhy menší denzity, jejichž pozorování v elektronovém mikroskopu prokázalo, že se jedná o prázdný nebo rozbitý virus a pruh menší denzity je tvořen virovými podjednotkami (pentony, hexony). Po této etapě je virus získán z nádobky punkcí pomocí jehly a cesium je vyloučeno dialyzou nebo odstraněním soli na gelu.

Příklad 4; Příprava viru ze supernatantu

Tento příklad popisuje pokus přípravy viru získáním po spontánním uvolnění. Virus je potom získán ultracentrifugací potom je purifikován chloridem česným.

4.1 Protokol

V této metodě, na rozdíl od příkladu 3, buňky nejsou sklízeny po 40 až 72 hodinách, ale inkubace je prodloužena na 8 až 12 dni, aby se získala úplná lyza buněk, a aby se vyloučily cykly zmražování a rozmražování. Virus se získá ze supernatantu.

Supernatant je tedy čištěn filtrací na filtrech se snižující se velikostí pórů (10 μιη/1,0 pm/0,8-0,2 pm) .

Virus má velikost 0,1 pm a v této etapě není pozorována žádná ztráta tohoto viru zadržením na filtru s nejmenší pórovitostí (0,22 pm) . Supernatant, který je jednou čištěn se potom koncentruje tangenciální ultrafiltrací na spirálové membráně Millipore, která má velikost 300 kDa.

V příkladech uvedených v předloženém vynálezu koncentrační faktor je dán mrtvým objemem systému, který je 100 ml. Objemy supernatantu od 4 do 20 litrů byly koncentrovány tímto systémem, který umožňuje získat objemy koncentrátu od 100 po 200 ml bez velkých obtíží, což odpovídá • 0 · · 0 · >0 «

0 4

9 « • 0 9 I ♦ 0 ··

0· ·9 0

0«0 • 0 0 9 0

0 «

0· 0« koncentračnímu faktoru od 20 do 100 násobku.

Koncentrát je potom purifikován odstřeďováním v chloridu česném, jak je popsáno v příkladu 3, podroben následující etapou dialyzy.

4.2 Výsledky

Čistota

Zatímco zkumavka s intracelulárním virem (příklad 3) představuje problém se sraženinou (lipidy, proteiny), která někdy dosahuje pruhu viru, virový přípravek získaný po první etapě centrifugace v chloridu česném, postupem podle vynálezu, představuje pruh viru již dobře izolovaný od kontaminantů kultivační půdy, které setrvávají v horní fázi. HPLC analýza na koloně Resource Q (příklad 5) ukazuje také tento stupeň čistoty produktu na začátku získaného ultrafiltrací infikovaného supernatantu se sníženým množstvím kontaminantů nukleových kyselin (poměr DO 260/280 vyšší nebo rovný 1,8) a proteiny (poměr DO 260/280 nižší než 1).

Stabilita viru v supernatantu při teplotě 37°C:

Stabilita viru byla určena titrací metodou plaque assay supernatantu buněčné kultury, jehož část byla odebírána v různých časových intervalech inkubace při 37°C po infekci. Výsledky jsou uvedeny dále:

Virus Ad-TK:

-titr 10 dní po infekci = 3,5 x 10⁸ pfu/ml

-titr 20 dní po infekci = 3,3 x 10⁸ pfu/ml

Virus Ad-pGal:

-titr 8 dní po infekci = 5,8 x 10⁸ pfu/ml «4 • 4 4 · • · 44 • 4>4 · • 4 4

4 4 4

-titr 9 dní po infekci = 3, 6 x 10® pfu/ml

-titr 10 dní po infekci = 3,5 x 10⁸ pfu/ml

-titr 13 dní po infekci = 4,1 x 10⁸ pfu/ml

-titr 16 dní po infekci = 5,5 x 10⁸ pfu/ml

Získané výsledky ukazují, že dokonce až 20 dní po infekci titr supernatantu je stabilní v přesných mezích dávky. Obrázek 1 ukazuje, že v elučním pufru je virus stabilní alespoň 8 měsíců při -80°C stejně jako při -20°C.

Specifická infekce preparátů

Parametr odpovídající poměru počtu virových částí, měřených pomocí HPLC, k počtu pfu dává infekční schopnost virového přípravku. Podle doporučení FDA musí být tato hodnota nižší než 100. Tento parametr byl měřen následovně: Dvě série nádobek, které obsahují kulturu buněk 293 byly infikovány současně ve stejné době stejným množstvím viru za stejných podmínek. Tento pokus byl proveden pro rekombinantní adenovirus Ad-Pgal, pak byl opakovaný pro adenovirus Ad-TK. Pro kažký adenovirus byla serie získána po 48 hodinách po infekci a byla pózována jako produkt intracelulárního viru purifikovaného v gradientu cesia po pozmrazení a rozmražení. Druhá serie byla inkubována 10 dní po infekci a virus byl získán ze supernatantu. Získané purifikované přípravky byly titrovány plaque assay a kvantifikace úplného počtu virových částic byla určena měřením koncentrace proteinu PVII HPLC analýzou na přímé fázi na koloně C4 Vydac 4.6 x 50 mm po denaturaci vzorků v guanidinu 6.4 M. Množství proteinů PVII bylo korelováno s počtem virových částic zkoumaných 720 kopií PVII na virus (Horwitz, Virology, second edition (1990)). Tato metoda je korelovaná s počtem virových částic k přípravku, který byl purifikován densitometricky při 260 nm pro keofifient specifické extinkce 1.0 jednotky absorbance =

A A A A ··

A · · ·

AAA A A A A • A A A • A A A A

AA ·· AA * A A · A A

A A · AA • A A A A A A

A AAA ·»«· A· AA

1.1 10¹² částic na ml.

Získané výsledky ukazují, že pro virus Ad-PGal je tento poměr 16 pro virus supernatantu a 45 pro intracelulární virus. Pro virus Ad-TK je poměr 78 v případě sklizně metodou supernatantovou a 80 pro virus získaný metodou intracelulární.

Analýza elektronickým mikroskopem

Tato metoda umožňuje odhalit přítomnost prázdných částic nebo volných virových podjednotek společně purifikovaných a také umožňuje posoudit proteinovou kontaminaci purifikovaných virových přípravků nebo přítomnost nedisociovatelných agregátů virových částic.

Protokol: 20 μΐ vzorku bylo uloženo na uhlíkovou misku, potom pro pozorování negativního zbarvení byl přidán uranylacetát v koncentraci 1,5%. Pro pozorování se používá elektronický mikroskop Jeol 1010 od 50 kV až 100.

Výsledek: Analýza provedená na viru sklizeném ze supernatantu ukazuje čistý preparát bez kontaminantů, bez agregátů a bez prázdných virových částic. Je možné rozlišit vlákna virů, stejně jako jejich správnou geometrickou strukturu. Tyto výsledky potvrzují vysokou kvalitu virových částic získaných podle vynálezu.

Analýza proteinového profilu metodou HPLC a SDS PAGE:

Analýza SDS PAGE μΐ vzorku bylo ředěno pufrem Laemmli (Nátuře 227 (1970) 680-685), redukováno 5 minut při teplotě 95°C, potom umístěno na gely Novex 1 mm x 10 jamek s gradientem 4 - 20%. Po migraci gely byly barveny Coomasie Blue a analyzovány na • · · · · · • * · • » · • ♦ · * ♦ · · ·« ·♦

9 ♦ • · ·

Image Master VDS Pharmacia. Analýza dává elektroforetický profil pro virus sklizený ze supernatantu, který je v souhlase s údaji z literatury (Lennart Philipson, 1984 H. S. Ginsberg editors, Plenům press, 310-338).

Analýza HPLC reverzní fáze

Obrázek 2 ukazuje superpozici 3 chromatogramů získaných ze dvou vzorků viru sklizeného intracelulárně a jednoho z vzorku viru purifikovaného metodou supernatantu. Podmínky pokusu jsou následující: kolona Vydac ref 254 Tp 5405, RPC4 4,ž x 50 mm, roztok A: H₂O + TFA 0,07%; roztok B: CH₃CN + TFA 0,07%, lineární gradient: T = 0 min %B = 25; T = 25 min %B = 50; průtok 1 ml/min, detektor 215 nm. Chromatogramy ukazují úplnou identicitu mezi vzorky bez rozdílu v relativní intenzitě každého signálu. Povaha každého signálu byla určena sekvenováním a prokázáním, že přítomné proteiny jsou všechny virového původu (viz následující tabulka).

peak (min)	identifikace
19-20	prekurzor PVII
21-22	prekurzor PVII; prekurzor XI a 12
27-28	prekurzor PVI; prekurzor PX
32-33	prekurzor PX
34
35-36	zralý PVII
37	zralý PVII; prekurzor PVIII
39-41	zralý PVI
45	pX
46	pX

Analýza in vitro účinku translace a cytotoxicity

Byla provedena analýza cytotoxicity, když byly infikovány buňky HCT116 na plaku s 24 jamkami pro rostoucí MOI a byla určena procenta živých buněk vzhledem k neinfikované kontrole 2 a 5 dní po infekci pomocí technik barvení krystalovou violetí.

Výsledky jsou uvedeny v následující tabulce:

adenovirus	M0I=3,0	MOI=10,0	MOI=30,0	MOI=100,0
supernatant, J2	97%	96%	87%	89%
supernatant, J5	97%	90%	10%	<5%

Analýza účinku translace

Pro adenovirus AD-^Gal účinek transdukce přípravku byl určen při infekci buněk W162 neumožňujících replikaci, kultivovaných na plaku s 24 jamkami s rostoucí koncentrací virových částic. Pro stejné množství kontrolních virových částic se počítají 48 hodin po infekci buňky vykazující betagalaktosidasovou aktivitu po inkubaci s X-gal jako substrátem. Každá modrá buňka je počítána jako jednotka transdukce (TDU), výsledek je násoben ředěním vzorku, aby se získala koncentrace v jednotkách transdukce vzorku. Účinek transdukce je potom vyjádřen, když se provede poměr koncentrace virových částic ke koncentraci v TDU. Získané výsledky ukazují, že purifikovaný virus má dobrý účinek transdukce in vitro.

Analýza exprese intracerebrálně in vivo

Za cílem zvýšit účinnost adenoviru podle vynálezu pro přenos a expresi genů in vivo byly adenoviry injektovány stereotaxicky do části mozku imunokompetitivních myší OF1.

36	···· » • · * • · · • · · · • 9 9 9 99 99	9 99 99 99 9 9 9 9 9 9 • 9 9 99 9 9
Proto objemy 1 μΐ po 107 pfu	viru byly	inj ikovány

stereotaxickým označením následovně (pro řezný pruh 0 mm) : předozadní +0,5; středopostranní: 2; hloubka: -3,5.

Mozky byly analyzovány 7 dní po injekci. Získané výsledky ukazují, že účinek transdukce je vysoký: tisíce transdukovaných buněk, exprese v jádře velmi intenzivní, častá a intenzivní difúze do cytoplazmy.

4.3 Kinetika uvolňování viru

Tento příklad popisuje studii kinetiky uvolnění adenovirů do supernatantu kultury enkapsidačních buněk.

Tato studie byly provedena semikvantitativní metodou PCR prostřednictvím oligonukleotidů komplementujících oblasti genomu adenovirů. V tomto ohledu lineární virová DNA (1-10 ng) byla inkubována v přítomnosti dXTP (2 μΐ, 10 mM), dvojice specifických oligonukleotidů a Taq Polymerasy (Cetus) v pufru 10XPCR a podrobena 30 cyklům amplifikace za následujících podmínek: 2 min při 91°C 30 cyklů (1 min při 91°C, 2 min při okolní teplotě, 3 min při 72°C), 5 min při 72°C a 4°C. Pokusy PCR byly provedeny s následujícími dvojicemi oligonukleotidů:

-dvojice 1:

TAATTACCTGGGCGGCGAGCACGAT	(6368) ·	- SEQ	ID	n'	S1
ACCTTGGATGGGACCGCTGGGAACA	(6369)	- SEQ	ID	n‘	’2
-dvojice 2:
TTTTTGATGCGTTTCTTACCTCTGG	(6362)	- SEQ	ID	n'	’3
CAGACAGCGATGCGGAAGAGAGTGA	(6363)	- SEQ	ID	n*	’4
-dvojice 3:
TGTTCCCAGCGGTCCCATCCAAGGT	(6364) ·	- SEQ	ID	n‘	’5
AAGGACAAGCAGCCGAAGTAGAAGA	(6365)	- SEQ	ID	n*	’6
-dvojice 4:
GGATGATATGGTTGGACGCTGGAAG	(6366)	- SEQ	ID	n‘	’7
AGGGCGGATGCGACGACACTGACTT	(6367) -	- SEQ	ID	n‘	’8

Množství uvolněného adenovirů do supernatantu bylo určeno v supernatantu buněk 293 infikovaných Ad-pGal v ··· · ·· • · • · různých časových intervalech po infekci. Získané výsledky jsou uvedeny na obrázku 3. Ukazují, že uvolňování buněk začíná od 5. nebo 6. dne po infekci.

Očekává se, že každá jiná technika určení množství viru může být použita za stejným cílem na každé jiné enkapsidační linii a pro všechny typy adenovirů.

Příklad 5: Purifikace viru ultrafiltrací a měniči iontů

Tento příklad popisuje, jak adenovirus získaný z koncentrátu může být purifikovaný přímo a v jedné etapě iontoměničové chromatografie s velmi dobrým výtěžkem.

5.1 Protokol

V tomto příkladě výchozí materiál je tvořen koncentrátem (nebo peletou ultrafiltrace) a je popsaný v příkladu 4. Peleta má úplný obsah proteinů mezi 5 a 50 mg/ml, zejména mezi 10 a 30 mg/ml v pufru PBS (10 mM fosfátový pufr, pH 7,2, který obsahuje 150 mM NaCl).

Supernatant ultrafiltrace získaný od virového přípravku je injikován na kolonu obsahující Source Q 15 (Pharmacia) ekvilibrovanou v pufru Tris/HCl 50 mM, pH 8,0 obsahující 250 mM NaCl, 1.0 mM MgCl₂ a 10% glycerolu (pufr A). Po propláchnutí 10 objemy kolony pufru A byly adsorbované vzorky eluovány v lineárním gradientu NaCl (250 mM do 1 M) 25 objemy kolony při lineárním průtoku 60 až 300 ml/h, zejména při 12 ml/h. Profil typické eluce získaný při 260 nm je uveden na obrázku 4. Frakce, které obsahují virové částice jsou shromážděny. Odpovídají konci symetrického signálu, jehož retenční čas souhlasí s retenčním časem získaným s preparátem virových částic purifikovaných ultracentrifugací. Je možné injektovat za podmínek popsaných dále minimálně 30 mg úplných proteinů na ml pryskyřice Source Q 15 při zachování dobrého ·· ·· » · · 4

I · ·· ··· · 4 • · 4 ·· ·· dělení signálů virových částic.

V reprezentativním příkladu provedeném s přípravkem adenovoru β-gal (Příklad 2) bylo 12,6 mg úplných proteinů injektováno na kolonu Resource Q (1 ml) , dejme tomu 5 x 1O¹⁰ PFU a 1,6 x 1O¹⁰ TDU. Signál virových částic shromážděných po chromatografii (3,2 ml; Obrázek 5) obsahuje 173 μg proteinů a

3,2 x 10

PFU

2,3

1O¹⁰ TDU. Virové částice byly tedy purifikovány 70 krát (v množství proteinů) a výtěžek purifikace je 64% v PFU a 142% v TDU (viz následující tabulka).

etapy	koncentrace vzorku	objemy	získané objemy	výtěžky	faktor purifikace
supernatant		5000 ml	5000 ml	100%	—
ultrafiltrace 300 kd	proteiny: 6,3 mg/ml PFU: 2,5 x 1010/ml TDU: 8,1 x 109/ml částice 3,8 x 10n/ml podíl/pfu:16,0 podíl/tdu:47,0	5000 ml	200 ml	100%	5

9999 99

9 9

9 9

9 9 9 • 9 9 9 ·· «9

9 9 9

9 99

9*9 9 9

9 9 • 9 99

purifikace iontoměničová (jedna etapa)	PFU:1, lxl010/ml TDU:7,2 x 109/ml částice 2,0x 10u/ml podíl/pfu:20 podíl/tdu:27	2,0 ml koncentrátu	3,0 ml eluátu	proteiny =85% PFU=64% TDU=140% částice= 84% HPLC čistota= 98,4%	70
gradient CsCl	PFU: 1,0 x 10u/ml TDU: 7,5 x 1010/ml částice 2,2 x 1012/ml podíl/pfu:22 podíl/tdu:29	28,3 ml koncentrátu	QSP 4,1 ml	PFU=66% TDU=130% částice= 84% HPLC čistota= 98,4%	70

5.2 Čistota

Po této etapě purifikace sebrané frakce mají čistotu >98% virových částic (detekce UV při 260 nm) při analýze vysokotlakou kapalinovou chromatografií (HPLC) na koloně Resource Q (lml) v následujícím chromatografickém systému: 10 μΐ purifikované frakce chromatografický jak je popsáno v Příkladu 5.1 je injikováno na kolonu Resource Q15 (1 ml gelu; Pharmacia) ekvilibrovanou v pufru Tris/HCl 50 mM pH 8,0 (pufr B) . Po propláchnutí 5 ml pufru B adsorbované vzorky byly eluovány lineárním gradientem 30 ml NaCl (0 až 1 M) v pufru B při průtoku 1 ml/min. Eluované vzorky byly detekovány při vlnové délce 260 nm. HPLC analýza (Obrázek 5) ukazuje také, že zbytkový albumin hovězího séra residuelle přítomný v peletě ultrafiltrace je úplně vyloučen v průběhu preparativní chromatografie. Jeho obsah v purifikované frakci je stanoven jako < 0,1 %. Analysa Western blot s polyklonální protilátkou

444« 44 • 4 · • · ·

4 · • 4 · · ·4

4444 ·· • 4 4 4 » 4 44

444 4 4

4 4

44 anti-BSA (s poměrem ECL; Amersham) naznačuje, že obsah BSA po chromatografické preparaci je vyšší než 100 ng na mg viru.

adenovirové frakce je provedena na podmínek denaturačních

Elektroforetická analýza purifikované chromatograficky polyakryamidovém gelu (4-20%) za (SDS). Pruhy proteinů jsou potom detekovány nitrátem stříbrným. Tato analýza ukazuje, že adenovirový prostředek získaný chromatograficky má úroveň čistoty alespoň takovou, jako je čistota preparátu získaného klasicky ultracentrifugací, protože nemá pruh doplňovacích proteinů, který naznačuje kontaminaci preparátu neadenovirovými proteiny.

Adenovirový preparát získaný chromatograficky má poměr absorbance Α_260ηιη/Α_2θ0ηιη rovný 1,30 ± 0,05. Tato hodnota, která je identická hodnotě získané pro nejlepší preparáty získané ultracentrifugací, naznačuje, že preparát je bez kontaminujících proteinů nebo kontaminujících nukleových kyselin.

Analýza v elektronickém mikroskopu provedená za podmínek popsaných v příkladu 4.2 na viru Ad-PGal purifikovaném chromatograficky ukazuje čistý přípravek bez kontaminantů bez agregátů a bez prázdných virových částic. Ultracentrifugace v gradientu chloridu česného tohoto přípravku zjevuje samotný pruh denzity 1,30, což potvrzuje nepřítomnost kontaminace v chromatografickém přípravku možnými prázdnými částicemi nebo kapsidovými fragmenty. Během purifikace chromatografický signál viru je následován inflexem (nebo sekundárním signálem) v jeho opožděné části, který není sebrán se základním signálem. Ultracentrifugace této frakce v gradientu chloridu česného odhaluje pruh denzity 1,27 a analýza přípravku této frakce ukazuje, že neobsahuje nukleové kyseliny. Analýza elektronovým mikroskopem ukazuje, že tato frakce obsahuje částice nepravidelné, které mají na povrchu perforaci (Obrázek 12) . Jedná se tedy o prázdné (bez DNA) a nekompletní částice. To • ·

tedy ukazuje, že purifikace adenovirů chromatografií vyloučí prázdné částice přítomné v malém množství z preparátů před purifikací.

5.3 Purifikace adenovirů, který obsahuje terapeutický gen takový, jako jsou geny kódující proteiny ApoAl nebo thimidinkinasu

Tento příklad ukazuje, jak adenoviry obsahující ve svých genomech sekvence heterologních nukleových kyselin, které kódují terapetické proteiny mohou být purifikovány přímo a v jedné samotné etapě iotoměničové chromatografie. Ukazuje také, že chromatografické vlastnosti adenovirů jsou nezávislé na sekvenci heterologních nukleových kyselin, které adenovirus nese, což umožňuje použít stejný postup purifikace pro různé adenoviry nesoucí sekvence různých heterologních nukleových kyselin.

V typickém experimentu purifikace adenovirus obsahující ve svém genomu sekvenci heterologních nukleových kyselin kódujících protein ApoAl (Příklad 2, WO94/25073) je purifikován chromatografíčky v systému popsaném v příkladu 5.1; 18 ml (72 mg proteinů; 1,08 x 10¹³ částic) koncentrovaného supernatantu buněčné kultury získaného 10 dní po infekci (Obrázek 6A). Signál virových částic získaných po chromatografií (14 ml; 1,4 mg proteinů) obsahuje 9,98 x 10¹² částic, což naznačuje výtěžek v částicích 92% a faktor purifikace 51. Po této etapě purifikace získané frakce ukazují (Obrázek 6B) čistotu vyšší než 98% virových částic během chromatografické analýzy za podmínek popsaných v příkladu 5.2. Elektroforetická analýza adenovirových frakcí purifikovaných chromatografií provedenou za podmínek popsaných v příkladu 5.2 ukázala, že preparát má úroveň čistoty alespoň stejný jako je čistota preparátu získaného klasicky ultracentrifugací, a že je bez kontaminujících • · · ·

• · · · · · · • · ·· proteinů nebo bez kontaminujících nukleových kyselin.

V jiném typickém experimentu purifikace adenovirus obsahující ve svém genomu sekvenci heterologních nukleových kyselin kódujících protein thimidin-kinasu herpes simplex typu 1 (Příklad 2, WO95/14102) je purifikován chromatograficky v systému popsaném v příkladu 5.1; 36 ml (180 mg proteinů; 4,69 x 10¹³ částic) koncentrovaného supernatantu buněčné kultury (Obrázek 7A) . Signál virových částic získaných po chromatografii (20 ml; 5,6 mg proteinů) obsahuje 4,28 x 10¹² částic, což naznačuje výtěžek částic 99% a faktor purifikace 32. Po této etapě purifikace získané frakce vykazují (Obrázek 7B-D) čistotu vyšší než 99% virových částic během chromatografické analýzy za podmínek popsaných v příkladu 5.2 a poměr absorbance 1,29. Analýza elektroforetická adenovirových frakcí purifikovaných chromatografii provedenou za podmínek popsaných v příkladu

5.2 ukázala, že preparát má úroveň čistoty alespoň stejný jako je čistota preparátu získaného klasicky ultracentrifugací, a že je bez kontaminujících proteinů nebo kontaminujících nukleových kyselin.

5.4 Purifikace intracelulárního adenoviru silnou výměnou aniontů

Tento příklad ukazuje, jak adenovirus obsahující ve svém genomu sekvenci heterologní nukleové kyseliny může být purifikován přímo a v jedné samotné etapě iontoměničové chromatografie z lyzatu enkapsidačních buněk produkujících uvedený virus.

V typickém experimentu purifikace adenovirus obsahující ve svém genomu sekvenci heterologních nukleových kyselin kódujících protein β-GAl je purifikován chromatograficky v systému popsaném v příkladu 5.1 (kolona FineLine Pilot 35, Pharmacia, 100 ml praskyřice Source 15Q); 450 ml (dejme tomu

9

2,5 x 10¹⁴ částic) koncentrovaného lyzatu buněčné kultury získaného 3 dny po infekci chemickou lyzou (1% Tween-20). Signál virových částic získaných po chromatografii (110 ml) obsahuje 2,15 x 10¹⁴ částic, což naznačuje výtěžek 86% částic. Po této etapě purifikace získané frakce vykazují čistotu vyšší než 98% virových částic během chromatografické analýzy za podmínek popsaných v příkladu 5.2. Elektroforetická analýza adenovirových frakcí purifikovaných chromatografii provedenou za podmínek popsaných v příkladu

5.2 ukázala, že preparát má úroveň čistoty alespoň stejný jako je čistota preparátu získaného klasicky ultracentrifugací, a že je bez kontaminujících proteinů nebo bez kontaminujících nukleových kyselin.

5.5 Purifikace viru ultrafiltrací a iontoměničovou chromatografii na různých kolonách

Tento příklad ukazuje, jak adenovirus obsahující ve svém genomu sekvenci heterologní nukleové kyseliny může být purifikován přímo a v jedné samotné etapě iontoměničové chromatografie za použití různých gelů nosiče Source 15Q založené na stejném principu separace - výměna aniontů interakcí s kvarterními aminovými skupinami matrice.

V typickém experimentu purifikace adenovirů byly různé rekombinantní adenoviry (kódující PGal, apolipoprotein AI a TK) purifikovány chromatograficky na koloně gelu Source Q30 v popsaném protokolu v příkladu 5.1. Získané výsledky ukazují, že gel Source Q30 umožňuje získat virový preparát čistoty 85% s výtěžkem mezi 70 a 100%. Získané výsledky ukazují, že Q30 má pro purifikaci adenovirů účinek (vyjádřený počtem teoretických pater) 1000 a 0,5 až 1 x 10¹² pv na ml (maximální množství viru, které může být chromatografováno bez toho, aby se signály měnily). Tyto výsledky ukazují, že gel Source Q30 může tedy vyhovovat purifikaci rekombinantních adenovirů, i kdyby jeho vlastnosti byly horší než vlastnosti

Source Q15 (čistota 99%, účinek 8000 a schopnost 2,5 až 5 10¹² pv na ml) .

V jiném typickém experimentu purifikace adenoviru je adenovirus je β-Gal purifikován chromatograficky na koloně MonoQ HR 5/5 v popsaném protokolu příkladu 5.1. Chromatografický obraz odpovídající peletě ultrafiltrace a virovému preparátu purifikovanému takto získanému je naznačen na Obrázku 8.

V jiném typickém experimentu purifikace adenoviru je adenovirus β-Gal purifikován chromatograficky na koloně Poros HQ/M v popsaném protokolu příkladu 5.1. Chromatografický obraz odpovídající peletě ultrafiltrace a virovému preparátu purifikovanému takto získanému je naznačen na Obrázku 9.

Příklad 6: Purifikace viru ultrafiltraci a gelovou filtrací

Tento příklad naznačuje, jak adenovirus získaný v koncentrátu (peleta ultrafiltrace) může být purifikován přímo chromatograficky gelovou filtrací s velmi dobrým výtěžkem.

6.1 Protokol

200 μΐ pelety ultrafiltrace získaných v příkladu 4 (dejme tomu 1,3 mg proteinů) je injikováno na kolonu HR 10/30 (Pharmacia) založenou na Sephacryl S-1000SF (Pharmacia) ekvilibrovanou například v pufru PBS, pH 7,2 obsahujícím 150 mM NaCl (Pufr C). Vzorky jsou frakcionovány a eluovány pufrem C o průtoku 0,5 ml/min a detekovány na konci kolony pomocí UV při 260 nm. Případně se mohou použít stejné podmínky pro kolonu založenou na Sephacryl S-1000HR pro částice mezi 100 nm a 1000 nm.

Dělení dvou chromatografických systémů gelové filtrace dále popsané může být výhodně zvýšeno při chromatografii • · · · • · • 4 * · · • · · * » · · 4 « · · « supernatantu ultrafiltrace (200 μΐ) na systému 2 kolon HR 10/30 (Pharmacia) spojených do série (kolona Sephacryl S-1000HR nebo S-2000 následovaná kolonou Superdex 200 HR) ekvilibrovaných v pufru C. Vzorky jsou eluovány pufrem C s průtokem 0,5 ml/min a detekovány pomocí UV při 260 nm. V tomto systému signál virových částic je velmi zřetelně separovaný od vzorku slabší molekulové hmotnosti než v systému zahrnujícím kolonu Sephacryl S-1000 HR nebo Sephacryl S-2000.

V reprezentativním příkladu peleta ultrafiltrace (200 μΐ, 1,3 mg proteinů) byla chromatografována na systému dvou kolon Sephacryl S-1000HR - Superdex 200 HR 10/30 (Obrázek

10) . Chromatografický signál obsahující virové částice byl shromážděn. Jeho retenční čas je v souhlase s retenčním časem získaným s preparátem virových částic purifikovaných ultracentrifugací. Signál virových částic shromážděn po chromatografii (7 ml) obsahuje 28 μg proteinů a 3,5 10⁹ PFU. Jeho analýza analytickou iontoměničovou chromatografii za podmínek popsaných v příkladu 5.2 ukazuje na přítomnost silnějšího signálu kontaminantů pelety na analytické koloně, jehož povrch je okolo 25% povrchu virového signálu. Poměr absorbance 260 nm/280 nm, která má hodnotu 1,86 naznačuje, že signál kontaminantů odpovídá nukleovým kyselinám. Virové částice byly tedy purifikovány 50 krát (v množství proteinů) a výtěžek purifikace je 85% PFU.

Případně je možné chromatografovat preparáty virových částic (ultrafiltrát nebo frakce na konci kolony aniontoměničové chromatografie) na koloně TSK G6000 PW (7,5 x 300 mm; TosoHaas) ekvilibrované v pufru C. Vzorky byly eluovány pufrem C s průtokem 0,5 ml/min a detekovány pomocí UV při 260 nm. Stejně může být výhodné zvýšit rozlišení chromatografického systému, zejména zvýšit separaci signálů virových částic vzorku s menší molekulovou hmotností při chromatografii supernatantu ultrafiltrace (50 až 200 μΐ) na • · · · • · · · · • · · · · · • · · « · · «· · · ·······

systému dvou spojených kolon v sérii (kolona TSK G6000 PW (7,5 x 300 mm) následovaná kolonou Superdex 200 HR] ekvilibrovaných v pufru C. Vzorky jsou eluovány pufrem C při průtoku 0,5 ml/min a detekovány pomocí UV při 260 nm.

Příklad 7: Purifikace viru ultrafiltrací, měničem iontů a gelovou filtrací

Frakce virových částic pocházející z aniontoměničové chromatografie (Příklad 5) může být výhodně chromatografována v již popsaném chromatografickém systému gelové filtrace například s cílem zvýšit úroveň čistoty virových částic, ale také hlavně s cílem upravit virové částice do prostředí kompatibilního nebo přizpůsobeného dalšímu použití virového preparátu (injekce, ...).

Seznam sekvencí (1)Informace pro sekvenci SEQ ID NO: 1:

(i) charakteristika sekvence:

(A) délka: 25 párů basí (B) typ: nukleotid (C) počet vláken: jedno (D) konfigurace: lineární (ii) typ molekuly: DNA (ix) popis sekvence SEQ ID NO: 1:

TAATTACCTG GGCGGCGAGC ACGAT 25 (1)Informace pro sekvenci SEQ ID NO: 2:

(i) charakteristika sekvence:

(A) délka: 25 párů basí (B) typ: nukleotid (C) počet vláken: jedno (D) konfigurace: lineární (ii) typ molekuly: DNA (ix) popis sekvence SEQ ID NO: 2:

ACCTTGGATG GGACCGCTGG GAACA 25 (1)Informace pro sekvenci SEQ ID NO: 3:

(i) charakteristika sekvence:

(A) délka: 25 párů basí (B) typ: nukleotid (C) počet vláken: jedno (D) konfigurace: lineární (ii) typ molekuly: DNA (ix) popis sekvence SEQ ID NO: 3:

TTTTTGATGC GTTTCTTACC TCTGG 25 (1)Informace pro sekvenci SEQ ID NO: 4:

(i) charakteristika sekvence:

(A) délka: 25 párů basí (B) typ: nukleotid (C) počet vláken: jedno (D) konfigurace: lineární (ii) typ molekuly: DNA (ix) popis sekvence SEQ ID NO: 4:

CAGACAGCGA TGCGGAAGAG AGTGA 25 (1)Informace pro sekvenci SEQ ID NO: 5:

(i) charakteristika sekvence:

(A) délka: 25 párů basí (B) typ: nukleotid (C) počet vláken: jedno (D) konfigurace: lineární (ii) typ molekuly: DNA (ix) popis sekvence SEQ ID NO: 5:

TGTTCCCAGC GGTCCCATCC AAGGT (1)Informace pro sekvenci SEQ ID NO: 6:

(i) charakteristika sekvence:

(A) délka: 25 párů basí (B) typ: nukleotid (C) počet vláken: jedno (D) konfigurace: lineární (ii) typ molekuly: DNA (ix) popis sekvence SEQ ID NO: 6:

AAGGACAAGC AGCCGAAGTA GAAGA (1)Informace pro sekvenci SEQ ID NO: 7:

(i) charakteristika sekvence:

(A) délka: 25 párů basí (B) typ: nukleotid (C) počet vláken: jedno (D) konfigurace: lineární (ii) typ molekuly: DNA (ix) popis sekvence SEQ ID NO: 7:

GGATGATATG GTTGGACGCT GGAAG (1)Informace pro sekvenci SEQ ID NO: 8:

• · (i) charakteristika sekvence:

(A) délka: 25 párů basí (B) typ: nukleotid (C) počet vláken: jedno (D) konfigurace: lineární (ii) typ molekuly: DNA (ix) popis sekvence SEQ ID NO: 8:

AGGGCGGATG CGACGACACT GACTT ·

• · · ·· jiti

Claims (4)

Patentové nároky
1. 01--- získaný intracelulárně získaný intracelulárně získaný ze supernatantu čas

   Obr. 2

   PFU

   PFU/částice/ml

   IOOOOOO

   Obr. 3 • · · · · · • · · · · · · · • · · · · ······· *· · ·

   1/17

   Ví

   4444 44 44 ΐ^ΐ titr

   Obr. 1

   4444 • 4 ·· • 4 4 4 <

   4 « • 4 44

   1. Postup přípravy rekombinantního adenovirů v yznačený tím, že virová DNA je vložena do enkapsidační buněčné kultury a produkované viry jsou získány po uvolnění do supernatantu.
2. 2/17

   2. Postup podle nároku 1 vyznačený tím, že sklizeň je provedena, když alespoň 50 % viru bylo uvolněno do supernatantu.
3. 3. Postup podle nároku 1 vyznačený tím, že sklizeň je provedena, když alespoň 70 % viru bylo uvolněno do supernatantu.

   4. Postup podle nároku 1 vyznačený tím, že sklizeň je provedena, když alespoň 90 % viru bylo uvolněno do supernatantu.

   5. Postup podle nároku 1 vyznačený tím, že virus je získán ultrafiltraci.

   6. Postup podle nároku 5 vyznačený tím, že ultrafiltrace je tangenciální ultrafiltrace.

   7. Postup podle nároku 5 nebo 6 vyznačený t í m, že ultrafiltrace je provedena na membráně, která má velikost menší než 1000 kDa.

   8. Postup podle nároku 1 vyznačený tím, že ·· ·· • » * « • · · · • · · ·· virus je získán aniontoměničovou chromatografií.

   9. Postup podle nároku 8 vyznač e n ý anion tím, že toměničová aniontoměničová chromatografie. chromatografie je silná 10. Postup podle nároku 9 v y z nač e n ý tím, že

   silná aniontoměničová chromatografie je provedena na nosiči vybraném mezi pryskyřicemi Source Q, Mono Q, Q Sepharose, Poros HQ a Poros QE, pryskyřicemi typu TMAE a Toyopearl Super

   Q.

   11. Postup podle nároku 1 vyznačený tím, že virus je získán chromatografíčky gelovou filtrací.

   12. Postup podle nároku 11 vyznačený tím, že chromatografie gelovou filtrací je provedena na nosiči vybraném mezi gely Sephacryl S-500 HR, Sephacryl S-1000 SF, Sephacryl S-1000 HR, Sephacryl S-2000, Superdex 200 HR, Sepharose 2B, 4B nebo 6B a TSK G6000 PW.

   13. Postup podle nároku 1 vyznačený tím, že virus je získán ultrafiltrací následovanou aniontoměničovou chromatografií.

   14. Postup podle nároku 13 vyznačený tím, že virus je získán ultrafiltrací následovanou aniontoměničovou chromatografií a potom chromatografií gelovou filtrací.

   ···· ·» · ·· ·· ··

   9 · ··· · · 9 9 9

   9 9 · · · · ·9

   9 9 9 9 9 · 9999 9

   9 9 9 9 9 9 9 9

   99 999 9999 99 99

   15. Postup podle jednoho z předchozích nároků v yznačený tím, že enkapsidační buňka je buňka transkomplementující oblast El adenoviru.

   16. Postup podle nároku 15 vyznačený tím, že enkapsidační buňka je buňka transkomplementující oblast El a E4 adenoviru.

   17. Postup podle nároku 15 vyznačený tím, že enkapsidační buňka je buňka transkomplementující oblast El a E2a adenoviru.

   18. Postup podle jednoho z nároků 15 až 17 vyznačený t i m, že buňka je lidská embryonální ledvinová buňka, lidský retinoblast nebo buňka lidského karcinomu.

   19. Postup purifikace rekombinantních adenovirů z biologického prostředí vyznačený tím, že zahrnuje etapu purifikace silnou aniontoměničovou chromatografií.

   20. Postup podle nároku 19 vyznačený tím, že biologické prostředí je supernatant enkapsidačních buněk produkujících uvedený virus.

   21. Postup podle nároku 19 vyznačený tím, že biologické prostředí je lyzat enkapsidačních buněk produkujících uvedený virus.

   22. Postup podle nároku 19 vyznačený tím, že biologické prostředí je prepurifikovaný roztok uvedeného viru.

   23. Postup podle nároku 19 vyznačený tím, že chromatografie je provedena na nosiči, který je funkcionalyzován kvarterním aminem.

   24. Postup podle nároku 23 vyznačený tím, že nosič je vybrán mezi agarosou, dextranem, akrylamidem, silicí póly[styrendivinylbenzen], kopolymerem ethylenglykolmethakrylat, samotnými nebo jejich směsemi.

   25. Postup podle nároku 24 vyznačený tím, že chromatografie je provedena na pryskyřici Source Q, Mono

   Q, Q Sepharose, Poros Toyopearl Super Q. HQ a Poros QE, Fractogel TMAE nebo 26. Postup podle nároku 25 v y z n a č e n ý t i m, že chromatografie je provedena na pryskyřici Source Q, zejména Source Q15. 27. Postup podle nároku 19 v y z n a č e n ý t i m,

   že zahrnuje etapu předběžné ultrafiltrace.

   28. Postup podle nároku 27 vyznačený tím, že ultrafiltrace je tangenciální ultrafiltrací na membráně, která má velikost mezi 300 a 500 kDa.

   4444 44 * 44 ·· ·· • 44 · · · · 4 4 4 4 • 4« 4 444 44

   4 4 4 4 4 · 44 4 « 4

   4444 44 · 4 4

   44 444 4444 44 44

   29. Purifikovaný virový prostředek získaný podle postupu nároku 1 nebo 19.

   30. Farmaceutická kompozice obsahující virový prostředek podle nároku 29 a vhodné farmaceutické vehikulum.

   31. Použití jodixanol,5,5'-[(2-hydroxy-l,3propandiyl)bis(acetylamino)]bis[N,N'-bis(2,3dihydroxypropyl-2,4-triodo1,3-benzenkarboxamid] pro purifikaci adenoviru.

   32. Postup purifikace adenoviru z biologického prostředí zahrnující první etapu ultracentrifugace, druhou etapu diluce nebo dialyzy a třetí etapu aniontoměničové chromatografie.
4. 4/17