KR101416600B1

KR101416600B1 - 친수성 분리막을 이용하여 아데노바이러스 ｄｎａ-말단 단백질 복합체를 분리하는 방법

Info

Publication number: KR101416600B1
Application number: KR1020120090102A
Authority: KR
Inventors: 이원종; 최은욱; 김형기
Original assignee: (주)프로스테믹스
Priority date: 2012-08-17
Filing date: 2012-08-17
Publication date: 2014-07-08
Also published as: KR20140023737A

Abstract

본 발명은 친수성 분리막을 이용하여 진공 감압으로 아데노바이러스 DNA-말단 단백질 복합체를 분리하는 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 아데노바이러스 DNA-말단 단백질 복합체의 분리방법을 이용하면 기존의 방법에 비하여 간단한 절차로 더 많은 아데노바이러스 DNA-말단 단백질 복합체를 분리할 수 있어 유용하다.

Description

친수성 분리막을 이용하여 아데노바이러스 ＤＮＡ-말단 단백질 복합체를 분리하는 방법{Method for isolation of Adenovirus DNA-terminal protein complex using hydrophilic membrane}

본 발명은 친수성 분리막을 이용하여 진공 감압으로 아데노바이러스 DNA-말단 단백질 복합체를 분리하는 방법에 관한 것이다.

재조합 바이러스 벡터는 백신의 제조, 유전자 또는 유전자 군의 기능분석, 특정 유전자 도메인의 기능분석, 유전자 치료, 라이브러리의 제조, 단백질의 생산 등의 목적을 위해 목적 외래 유전물질을 삽입하여 제조된 인위적으로 재조합된 바이러스를 말한다. 바이러스 벡터에 삽입되는 목적 유전물질은 발현시키고자 하는 모든 유전물질 예를 들어, 유전자, cDNA, 게놈 DNA, 펩타이드를 발현할 수 있는 DNA 서열, 특정 단백질의 전체 또는 일부를 발현하는 서열, RNA, 안티센스 RNA, siRNA를 발현할 수 있는 DNA, 프로모터, 인핸서 등을 포함하며, 이와 같은 재조합 바이러스 벡터의 제조에 이용되는 바이러스로는 아데노바이러스, 아데노-관련 바이러스 (AAV), 레트로바이러스, 허프스바이러스 (Herpes virus) 또는 박시니아 바이러스 등이 있다.

재조합 아데노바이러스는 매우 높은 수준의 외래도입유전자 전달을 제공할 수 있다. 치료 목적의 외래도입유전자를 생체 내에 전달하여 유전적 불균형을 보완하는 이런 시스템의 효능은 다양한 질환의 동물 모델에서 입증되었다(Watanabe, 1986; Tanzawa et al., 1980; Golasten et al., 1983; Ishibashi et al., 1993; and Ishibashi et al., 1994). 또한, 임상 시험이 진행됨에 따라, 임상 등급 아데노바이러스 벡터에 대한 수요가 급증하고 있다.

전통적으로, 아데노바이러스는 시판되는 조직 배양 플라스크 또는 “세포공장(cell factory)”에서 생산된다. 일반적으로, 아데노바이러스 벡터 생산은 HEK293 세포의 부착을 위한 배양 표면을 제공하는 배양 장치, 예를 들면, T-플라스크에서 수행된다. 바이러스에 감염된 세포는 수득 후 반복적인 냉동-해동을 거쳐, 정제되지 않은 세포 용해물 형태로 세포로부터 바이러스를 방출시킨다. 이후, 생산된 정제되지 않은 세포 용해물(CCL)은 이중 CsCl 농도 구배 초원심분리 (CsCl gradient ultra-centrifucation) 를 이용하여 정제한다. 100 단일트레이 세포공장(cell factory)에서 전형적으로 수득되는 바이러스는 대략 6 ×10¹² PFU이다. 분명한 점은 이와 같은 통상적인 공정을 이용하면 필요한 양의 바이러스를 만들 수 없다는 것이다. 증가하는 수요를 충족시키기 위해서는 생산 규모를 늘리고, 효과적인 새로운 생산 및 정제 공정이 개발될 필요가 있다.

CsCl 구배 원심분리를 통한 정제는 지극히 제한적이어서, 유전자 치료에 필요한 아데노바이러스 벡터의 요구량을 충족시킬 수 없다. 따라서, 아데노바이러스 벡터를 대규모로 생산하기 위해서는 CsCl 구배 원심분리 방법 이외의 다른 정제 방법을 개발해야 한다. 재조합 단백질을 정제하는데 크로마토그래피가 광범위하게 이용되고는 있지만, 바이러스를 크로마토그래피로 정제하는 것은 지극히 제한적이다. 레트로바이러스, 진드기-유래의 뇌염 바이러스, 식물 바이러스를 정제하는데 크기 배제, 이온 교환, 친화성 크로마토그래피가 이용된다는 보고가 있긴 하지만, 그 성공 여부는 각기 다르다(Crooks, et al., 1990; Aboud, et al., 1982; McGrath et al., 1978; Smith and Lee, 1978; O'Neil and Balkovic, 1993). 또한, 크로마토그래피를 이용한 아데노바이러스의 정제에 대한 연구는 극히 적다.

최근에, Huyghe 등(1996)은 금속 킬레이트 친화성 크로마토그래피와 이온 교환 크로마토그래피를 병용하여 아데노바이러스 벡터를 정제하였다고 보고하였다. CsCl 구배 원심분리를 통하여 수득한 것과 비슷한 수준의 바이러스 순도가 보고되었다. 그러나, 이 중 칼럼 정제 과정 이후 단지 23% 정도의 바이러스만 회수되었다. 이와 같이 바이러스 회수율이 낮은 원인은 세포와 이중 칼럼 정제 과정으로부터 바이러스를 방출시키기 위해 세포를 용해시키는데 냉동/해동 단계가 이용되었기 때문이다. 이와 같이, 크로마토그래피 또는 CsCl 구배 원심분리를 이용하여 아데노바이러스를 정제하는 방법은 그 과정이 복잡하고 최종단계에서 별도의 투석 또는 농축 과정이 필요하기 때문에 손실이 발생하는 문제점이 있다.

한편, 아데노바이러스의 DNA는 박테리아로부터 얻은 아데노바이러스와 달리 실제 아데노바이러스 내에서는 말단 단백질(terminal protein)이 DNA의 5’ 말단에 공유결합으로 연결되어 있다. 이 말단 단백질은 숙주세포 내의 핵산말단가수분해효소(exonuclease)로부터 viral DNA를 보호하고 주형 활성(template activity)을 높여 DNA 복제효율을 높이는 역할을 한다. 또한, 아데노바이러스 DNA-host nuclear matrix를 매개하여 전사를 촉진시킨다(Dunsworth-Browne et al, Adenovirus terminal protein protects single stranded DNA from digestion by a cellular exonuclease. Nucleic Acids Res 8, 543-554;?Pronk, R.et al, The adenovirus terminal protein influences binding of replication proteins and changes the origin structure. Nucleic Acids Res 21, 2293-2300; Schaack, J. et al., Adenovirus terminal protein mediates both nuclear matrix association and efficient transcription of adenovirus DNA. Genes Dev 4, 1197-1208). 이에 따라, 아데노바이러스 DNA-말단 단백질 복합체(DNA-TPC)를 이용하게 되면 재조합 아데노바이러스의 생성 효율을 높일 수 있다.

이에 본 발명자들은 아데노바이러스 DNA-말단 단백질 복합체를 효율적으로 분리해낼 수 있는 방법을 개발하기 위하여 노력한 결과, 친수성 분리막에 진공을 이용한 감압식 여과법을 이용함으로써 종래의 분리 방법에 비하여 간단한 절차로 더 많은 양의 DNA-말단 단백질 복합체를 분리할 수 있는 방법을 완성하게 되었다.

본 발명의 목적은 친수성 분리막을 이용하여 진공 감압으로 아데노바이러스 DNA-말단 단백질 복합체를 분리하는 방법을 제공하는 데 있다.

본 발명은 상기 목적을 달성하기 위하여,

(a) 바이러스의 외피 단백질을 분해하는 단계;

(b) 상기 외피 단백질이 분해된 바이러스 시료를 친수성 분리막 위에 넣어주는 단계;

(c) 분리막 하단에 감압을 형성하는 단계; 및

(d) 바이러스 시료로부터 불순물을 여과하는 단계를 포함하는 바이러스 DNA-말단 단백질 복합체를 분리하는 방법을 제공한다.

본 발명은 또한,

(a) 바이러스의 외피 단백질을 분해하는 단계;

(c) 분리막 하단에 감압을 형성하는 단계;

(d) 바이러스 시료로부터 불순물을 여과시켜 바이러스 DNA-말단 단백질 복합체를 수득하는 단계;

(e) 상기 바이러스 DNA-말단 단백질 복합체를 운반벡터와 시험관 내에서 재조합시키는 단계; 및

(f) 상기 재조합 벡터를 숙주세포에 형질전환시켜서 재조합 바이러스의 생성효율을 증가시키는 방법을 제공한다.

본 발명에 있어서, 상기 바이러스는 아데노바이러스, HBV (hepatitis B virus), Φ29 및 스트렙토미세스(Streptomyces)로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있다. 본 발명에서는 아데노바이러스만을 이용하여 아데노바이러스 DNA-말단 단백질 복합체를 분리하는 실험을 수행하였으나, 아데노바이러스 이외에도 HBV (hepatitis B virus), Φ29 또는 스트렙토미세스의 DNA와 단백질 복합체를 분리하기 위하여 본 발명이 적용될 수 있다. 나아가, 바이러스가 아닐지라도 공유결합을 이루고 있는 DNA-단백질 복합체의 효율적인 분리를 위하여 본 발명이 활용될 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 분리막은 사이즈 배제(size-exclusion) 방법으로 물질의 분리가 가능한 막인 것을 특징으로 할 수 있고, 셀룰로오즈, 나일론, PVDF(polyvinylidene difluoride), PES (polyether sulphone), PTFE (polytetrafluoroethlene membrane) 및 polycarbonate로 구성된 군에서 선택될 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 셀룰로오즈는 300 내지 400kDa의 분자량을 가지는 것을 특징으로 할 수 있고, 또한 130 내지 280micron의 두께를 가지는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 비교예 1의 FPLC(fast protein liquid chromatography)는 혼합물로부터 단백질을 분리, 정제하기 위하여 사용되는 크로마토그래피 기술을 의미한다.

본 발명에 있어서, 비교예 2의 구배 원심분리법은 원심력을 이용하여 용질 분자를 무게, 모양, 크기 등의 차이에 따라 분리하는 방법을 의미한다.

본 발명에 있어서, 비교예 3의 Qiagen사의 컬럼은 실리카겔 막으로 구성된 일반적인 DNA 분리용 컬럼이고, 비교예 4의 밀리포어사의 Centricon, microcon 등과 같은 컬럼은 셀룰로오스로 구성된 일반적인 단백질 분리용 컬럼이다.

본 발명에서 사이즈 배제(size-exclusion) 방법이란 분자체 효과를 이용하여 물질을 분리하는 것으로, 분리막 내부로 침투할 수 있는지 여부에 따라 크기가 다른 분자를 분리하는 것을 말한다.

본 발명에 있어서, 셀룰로오즈는 300 내지 400kDa의 분자량, 130 내지 280 micron의 두께를 가지는 경우에 분해된 외피 단백질 시료로부터 불순물이 원활히 여과되어 아데노바이러스 DNA-말단 단백질 복합체를 분리해낼 수 있다.

본 발명에 따른 아데노바이러스 DNA-말단 단백질 복합체의 분리방법을 이용하면 기존의 방법에 비하여 간단한 절차로 더 많은 아데노바이러스 DNA-말단 단백질 복합체를 분리할 수 있어 유용하다.

도 1은 친수성 분리막을 이용한 진공감압 방식을 이용하여 아데노바이러스 DNA-말단 단백질 복합체와 말단 단백질이 결합되지 않은 플라스미드 DNA의 분리효율을 비교한 결과를 나타낸 것이다(M:마커, 레인 1: 아데노바이러스 플라스미드 DNA, 레인 2: 아데노바이러스 DNA-말단 단백질 복합체).
도 2는 친수성 분리막을 이용한 진공감압 방식과 기존의 분리방법을 이용하여 아데노바이러스 DNA-말단 단백질 복합체를 분리한 결과를 나타낸 것이다(M:마커, 레인 1:FPLC, 레인 2:친수성 분리막을 이용한 진공 감압 분리, 레인 3:gradient ultra-centrifugation, 레인 4:Protein 분리용 컬럼 (centricon), 레인 5:DNA 분리용 컬럼(Qiagen)).

이하, 본 발명을 하기의 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

분리막의 제조

300 kDa 이상의 분획 분자량을 가지는 두께 130~280 micron의 셀룰로오즈(cellulose) 또는 PVDF(polyvinylidene difluoride) 등과 같은 친수성 분리막과 함께 폴리에틸렌 또는 폴리프로필렌 등을 지지체로 하여, 이를 폴리프로필렌 등으로 된 실린더 구조에 고정하였다. 실린더의 하부에는 진공에 의한 감압이 걸리도록 구성하여 진공펌프에 연결하였으며, 작동 시 분리막 상단에서 하단 방향으로 압력이 걸려 시료 내의 불순물이 감압에 의해 분리막 아래로 여과되도록 구성하였다.

아데노바이러스 DNA -말단 단백질 복합체의 분리

본 발명에 따른 분리 방법을 이용한 아데노바이러스 DNA-말단 단백질 복합체의 분리 효율과 말단 단백질이 결합되지 않은 DNA의 분리 효율을 비교하였다. 아데노바이러스 벡터로 대장균을 이용하여 생산한 플라스미드 DNA와 정제된 아데노바이러스로부터 분리한 viral DNA(DNA-말단 단백질 복합체) 각각을 동일한 양으로 준비하고, 본 발명의 친수성 분리막을 이용한 진공 감압으로 분리한 다음, 각각 동량의 샘플을 1% 아가로스를 이용한 아가로스 겔 분석으로 확인한 결과, DNA-말단 단백질 복합체의 경우가 플라스미드 DNA에 비하여 상대적으로 높은 분리 효율을 나타내는 것을 확인하였다(도 1).

또한, 본 발명에 따른 분리 방법을 이용하여 아데노바이러스 DNA-말단 단백질 복합체를 분리하고, 기존의 분리 방법을 이용한 경우와 분리 수율을 비교하였다. HEK-293 세포를 이용하여 5 X 10^10 이상의 재조합 아데노바이러스를 획득하여, cell lysis 와 CsCl 농도구배 초원심분리 (CsCl gradient ulta-centrifugation) 방법으로 정제된 바이러스를 획득하였다. 정제된 바이러스는 Gu-HCl을 이용하여 아데노바이러스의 겉면을 둘러싸고 있는 capsid 를 분해하는 과정을 거친 후, 각각 동일한 양으로 분주하여, 1) FPLC(비교예 1), 2) 친수성 분리막을 이용한 진공 감압(본 발명), 3) Gradient ultra-centrifugation(비교예 2), 4) Protein 분리목적의 컬럼(비교예 4), 5) DNA 분리 목적의 컬럼(비교예 3)을 이용하여 DNA 분리과정을 거친 후, 농축과정 등을 거치지 않은 상태에서 동량의 시료에 대한 agarose gel analysis 를 수행하여 나타나는 DNA band 의 양을 육안으로 확인하고, 수율을 비교하였다.

보다 구체적으로, 본 발명에 따른 분리방법의 경우, CsCl 농도구배 초원심분리 (CsCl gradient ultra-centrifugation) 방법으로 정제된 아데노바이러스에 동일한 부피의 6 M Gu-HCl을 첨가하여 외피 단백질(capsid protein)을 변성(denature) 시킨 후, 이를 미리 준비된 셀룰로오즈로 구성된 친수성 분리막 위에 넣어주고, 아래에서 진공감압이 걸리도록 하여 분리막 아래로 기타 불순물이 제거되도록 한 후, 여기에 10 mM TE 버퍼로 3회 세척한 다음, 다시 10 mM Tris 버퍼를 넣어주고 shaking으로 용출시켜 DNA량을 확인하였다. FPLC의 경우, Superdex-200 16/30 column 을 이용하여 크기 배제(size-exclusion) 원리를 기반으로 순차적으로 분리한 후, slide A lyzer dialysis cassette(MWCO 10 kDa) 으로 pH8.0 TE 버퍼에 투석하였고, gradient ultra-centrifugation 의 경우, 2.8 M CsCl과 4 M Gu-HCl을 이용한 밀도구배 원심분리법을 적용하여 55,000rpm으로 16시간 동안 원심분리한 후, 확인되는 DNA-말단 단백질 복합체 분획을 EtBr spot test로 확인하고 모아서 투석하였으며, 그 외의 분리막 기반의 키트를 이용한 분리는 제조사 매뉴얼의 방법을 따라 수행하였다.

본 발명에 따른 분리 방법은 기존의 방법과 비교하여 별도의 투석, 농축 과정이 필요하지 않아 방법에 용이하고, 또한 아데노바이러스 DNA-말단 단백질 복합체의 회수율은 기존의 방법에 비하여 높은 회수율을 나타내었다(표 1, 표 2 및 도 2).

	비교예 1 (FPLC)	비교예 2 (Gradient Centrifugation)	비교예 3 (Qiagen column)	비교예 4 (Centricon)	친수성 분리막을 이용한 감압식 여과법
Virion Lysis	○	○	○	○	○
분리 전 농축	○	△	○	○	×
분리 후 투석	○	○	×	×	×
분리 후 농축	○	×	×	×	×

아데노바이러스 DNA-말단 단백질의 회수율

분리 방법	비교예 1 (FPLC)	비교예 2 (Gradient Centrifugation)	비교예 3 (Qiagen column)	비교예 4 (Centricon)	친수성 분리막을 이용한 감압식 여과법
DNA-TPC 회수율 (%)	80	70	0	50	90
DNA-TPC 회수율 (%)	60 (투석 후)	50 (투석 후)	0	50	90

시험관내에서 위치-특이적 재조합기술( In vitro site - specific recombination )을 이용한 재조합 아데노바이러스의 제조

시험관내에서 위치-특이적 재조합 부위(In vitro site-specific recombination site)를 포함하고 있는 벡터를 이용하여 아데노바이러스를 대량 제조하였다. 그 다음 아데노바이러스를 CsCl gradient ultra centrifugation으로 정제하고, 본 발명에 따른 분리 방법을 이용하여 아데노바이러스로부터 시험관내에서 위치-특이적 재조합 부위를 포함하는 아데노바이러스 DNA-말단 단백질 복합체를 획득하였다. 이와 같이 획득한 아데노바이러스 DNA-말단 단백질 복합체를 목적 유전자를 가지고 있는 운반벡터와 시험관내에서 재조합시킨 후 곧바로 숙주세포인 HEK293 세포주에 트랜스펙션시키고 생성되는 아데노바이러스의 생성률을 확인하였다. 대조군으로는 말단 단백질이 붙어있지 않은 naked DNA를 사용하여 동일한 방법으로 시험관내에서 재조합시킨 후 HEK293 세포주에 트랜스펙션시켜 생성되는 아데노바이러스의 생성율을 확인하였다(표 3).

그 결과, 본 발명에 따른 아데노바이러스 DNA-말단 단백질 복합체를 이용한 경우에 말단 단백질이 결합되어 있지 않은 아데노바이러스 DNA를 이용한 경우보다 숙주세포 내에서 바이러스의 생성효율이 높은 것을 확인하였다.

재조합 아데노바이러스의 생성 효율

	DNA-TPC를 이용			Naked DNA를 이용
HEK-293 세포수 (cells)	1 X 10⁴	5 X 10⁴	2 X 10⁵	1 X 10⁴	5 X 10⁴	2 X 10⁵
트랜스펙션 후 생성되는 플라크 수	3~4	15~20	60~80	×	5~7	20~30

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims

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(a) 바이러스의 외피 단백질을 분해하는 단계;
(b) 상기 외피 단백질이 분해된 바이러스 시료를 친수성 분리막 위에 넣어주는 단계;
(c) 분리막 하단에 감압을 형성하는 단계;
(d) 바이러스 시료로부터 불순물을 여과시켜 바이러스 DNA-말단 단백질 복합체를 수득하는 단계;
(e) 상기 바이러스 DNA-말단 단백질 복합체를 운반벡터와 시험관 내에서 재조합시키는 단계; 및
(f) 상기 재조합 벡터를 숙주세포에 형질전환시켜서 재조합 바이러스의 생성효율을 증가시키는 방법.
제 7항에 있어서,
상기 바이러스는 아데노바이러스, HBV (hepatitis B virus), Φ29 및 스트렙토미세스(Streptomyces)로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 재조합 바이러스의 생성효율을 증가시키는 방법.
제 7항에 있어서,
상기 분리막은 사이즈 배제(size-exclusion) 방법으로 물질의 분리가 가능한 막인 것을 특징으로 하는 재조합 바이러스의 생성효율을 증가시키는 방법.
제 7항에 있어서,
상기 분리막은 셀룰로오즈, 나일론, PVDF(polyvinylidene difluoride), PES (polyether sulphone), PTFE (polytetrafluoroethlene membrane) 및 polycarbonate로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 재조합 바이러스의 생성효율을 증가시키는 방법.
제 10항에 있어서,
상기 셀룰로오즈는 300 내지 400kDa의 분자량을 가지는 것을 특징으로 하는 재조합 바이러스의 생성효율을 증가시키는 방법.
제 10항에 있어서,
상기 셀룰로오즈는 130 내지 280micron의 두께를 가지는 것을 특징으로 하는 재조합 바이러스의 생성효율을 증가시키는 방법.