JP5898261B2 - ポックス・ウイルスの精製方法 - Google Patents
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Description
3つの実施例に使用した緩衝液としては、10mMのトリス塩酸緩衝液、pH7.4;10mMのトリス塩酸緩衝液、pH9.0;10mMのトリス塩酸/1M NaCl緩衝液、pH7.4;10mMのトリス塩酸/1M NaCl緩衝液、pH9.0が挙げられる。用いた他の試薬としては、0.5M MgCl2、1M EDTA、ベンゾナーゼ・エンドヌクレアーゼ(EM Industries,inc.社製、カタログ番号1.01694.0002および1.1697.0002)、ALVAC−HIV(vCP1521)/EB14採取物、ALVAC黒色腫(vCP2264)/CEF採取物、Trovax/ニワトリ胚線維芽細胞(CEF)およびTrovax/アヒル細胞株(Cell & Viral Platform社製(カナダ国AvP所在))が挙げられる。本明細書で使用したクロマトグラフのマトリクスとしては、「セファロース」4FF弱陰イオン交換体(例えば、ANX「セファロース」4FF(GE Healthcare社製、カタログ番号17−1287−01および171287−04))、「セファロース」4FF(GE Healthcare社製、カタログ番号17−0149−01および17−0149−05)、および「セファロース」6FF(GE Healthcare社製、カタログ番号17−0159−01)が挙げられる。
A.典型的な方法
本明細書に記載の精製方法は、ポックス・ウイルス系のワクチンの精製に有用である。このようなポックス・ウイルスとしては、限定はしないが、ALVAC−2などのALVACウイルスおよびそれらの誘導体が挙げられる。一般に、本方法は、次の工程を有してなる:
1.例えばバイオリアクターを使用して、細胞中に生じたサンプルからポックス・ウイルス採取物を入手し、その採取物を遠心分離によって濃縮する(すなわち10倍);
2.直接的な超音波分解による細胞破壊などの適切な方法によって細胞内のポックス・ウイルスを放出し、ポックス・ウイルスの粗調製物を生成する;
3.例えば、5μmおよび3μmのデプスフィルタを用いた逐次的ろ過などを使用して、前記ポックス・ウイルスの粗調製物を清澄する;
4.ベンゾナーゼ・ヌクレアーゼなどの試薬を使用して、前記清澄化したポックス・ウイルスの粗調製物内に存在する遊離のDNAを分解する;
5.「セファロース」4FF/6FFなどの適切なクロマトグラフのマトリクスおよび緩衝系を使用してゲルろ過することにより、半精製したポックス・ウイルス調製物を生成する;
6.「セファロース」4FF(ANX)などの適切なイオン交換マトリクスを使用して、実質的に精製された、本質的に精製された、または精製されたポックス・ウイルス調製物を精製する;
7.ろ過(すなわち、タンジェンシャルフローろ過)によって緩衝液を濃縮および交換する。
例えばバイオリアクター中で生成したサンプルからのポックス・ウイルス採取物の入手、および遠心分離による濃縮(10倍)
ALVAC HIVを、バイオリアクター(例えば10Lのバイオリアクター)において、鳥細胞系EB14/074内で増殖させた。培養液を採取し、1Lの殺菌した遠心分離ボトル(700mL/ボトル)に等分して入れ、Jouan KR422遠心分離機を使用して4000×gで40分間、4℃で遠心分離にかけた。上清を廃棄し、50mLの10mM トリス塩酸 pH7.0〜9.0(ボトルあたり)に細胞を再懸濁した。混合物を強攪拌し、1Lの殺菌したナルゲンボトルに移した。10mMのトリス塩酸 pH7.0〜9.0を用いて、濃縮した材料の最終体積を、最初の採取体積の1/10にし、10倍(10×)濃度の採取物を生成した。さらに使用するまで、濃縮採取物を−80℃の冷凍庫に保管した。
注入/排出管を備えた超音波処理装置をオートクレーブにかけた。Easyload II Masterflexポンプを超音波処理装置の注入ラインに接続した。200mLの10mM トリス塩酸 pH7.0〜9.0緩衝液を、50mL/分の流量でポンプで送り出すことにより、超音波処理装置を平衡化し、ラインを結びつけた。10×濃縮した採取物を、50mL/分の流量で超音波処理装置にポンプで通した。サンプルが超音波処理装置の注入口に達したら、超音波処理装置を55〜65ワットの出力で起動させた。次に、超音波分解した採取物を、超音波処理装置の排出口を通じて滅菌ボトル内に回収した。これがポックス・ウイルスの粗調製物である。
注入/排出管に連結させて設置した5μm/3μmのフィルタ(PALL社製、BY050P6およびBY030P6)をオートクレーブにかけた。Easyload II Masterflexポンプを5μmフィルタの注入ラインに接続した。200mLの10mM トリス塩酸 pH7.0〜9.0を200mL/分のポンプ流量で、ポンプで送り込むことにより、デプスフィルタを平衡化した。超音波分解した採取物を、等量の10mMのトリス塩酸 pH7.0〜9.0緩衝液で希釈した。最大500mLの希釈採取物を、200mL/分の流量、続いて400mL/分の流量で、一連の5μm/3μmのデプスフィルタ(5μm、続いて3μmフィルタ)を通じてポンプで送り込み、残りのサンプルを回収した。50mLの10mM トリス塩酸 pH7.0〜9.0でデプスフィルタをすすぎ、ホールドアップサンプルを排出させた。さらに使用するまで、清澄化したポックス・ウイルスの粗調製物を−80℃の冷凍庫に保管した。
ベンゾナーゼ・ヌクレアーゼを、10〜50単位/mlの最終濃度まで、あらかじめ選択された量の清澄化したポックス・ウイルス調製物に加えた。MgCl2(ヌクレアーゼ触媒)を、2.0mMの最終濃度に至るまで加えた。混合容器内の成分を、マグネティックスターラー撹拌子で、20±3℃で1〜2時間(特定の調製物に応じて決まる)混合した。消化の終わりに、5mMの最終濃度でEDTAを加え、酵素反応を停止させた。
カラム、アダプターおよびそれに関連する管類を、カラムに1M NaOHを充填することによって一晩浄化した。次に、NaOHを排出し、カラム、アダプターおよび関連するラインを2−カラム体積の注射用蒸留水(WFI)ですすぎ、続いて、1−カラム体積の70%エタノールで浄化した。次に、カラムを10cmのWFIで満たすか、または緩衝液で平衡化し、所望の体積の樹脂(「セファロース」4FFまたは「セファロース」6FF)をカラムに注ぎ、20cmの高さのカラムに充填した。WFIを「セファロース」4FFまたは「セファロース」6FFの溶媒と混合して均質な溶液を生成した。高さ調節ハンドルを使用して、最上部のアダプターを液体の表面の3〜10cm上に配置した。最上部のアダプターの注入管をAKTA explorerシステムに取り付け、ポンプを通じて70%エタノールを通し、ラインを浄化し、カラムネットを湿らせ、AKTAシステムを用いて閉じ込められた空気を排除した。上部に1〜2cmの透明な液体層が見えるまで、樹脂を静置した。最上部のアダプターを透明な液体層の下1〜2cmまで下げて、アダプターのO−リングを封止した。カラム排出ラインをAKTA explorerシステムに取り付けた。カラムを充填するため、WFIまたは平衡緩衝液のいずれかを、AKTAシステムを使用して、ポンプで、23〜30cm/時間の速度で送り出した。樹脂がおよそ20cmの高さまで充填されたら、最上部のアダプターを落ち着かせた樹脂床の上およそ0.5cmまで下げ、封止調節ノブを時計回りに回転させてアダプターのO−リングを封止した。
・15cm/時間の流量
・50mLの10mM トリス塩酸 pH7.0〜9.0で平衡化
・サンプル負荷体積:カラム体積の15%
・2−カラム体積の10mMのトリス塩酸 pH7.0〜9.0で溶出
最初の溶出ピークは、70〜90%のウイルス(500mL)を含むことを示し、これを500mlの殺菌したナルゲンボトル内に回収し、この半精製したポックス・ウイルスの調製物を、さらに使用するまで、4℃で保管した。
適切な体積(ゲルろ過ウイルス含有画分の体積と等しい乾燥樹脂体積)のANX「セファロース」4FF(GE Healthcare社製、カタログ番号17−1287−01および171287−04)樹脂スラリー(20%エタノール中)を、2Lのナルゲンボトルに注ぎ(マグネティックスターラー攪拌子を含む)、樹脂を落ち着かせた。Masterflexポンプを使用して200mL/分の流量でポンプによって送り出すことにより、エタノールをを除去した。2−樹脂体積のWFIで樹脂を2回洗浄後、2−樹脂体積の10mMのトリス塩酸 pH7.0〜9.0を用いて平衡化した(2回)。樹脂を落ち着かせ、200〜500mL/分の速度で、ポンプによって送り出すことにより、緩衝液を除去した。落ち着かせた樹脂に等量のサンプルを加え、20±3℃で1時間混合した。樹脂を落ち着かせ、200〜500mL/分のポンプ速度でポンプによって送り出すことにより、結合していないサンプルをを除去した。次に、2−樹脂体積の10mMのトリス塩酸 pH7.0〜9.0で樹脂を2回洗浄した。次に、樹脂を落ち着かせ、得られた洗浄サンプルを、200〜500mL/分のポンプ速度でポンプによって除去した。ウイルスを2−樹脂体積の10mMのトリス塩酸 pH7.0〜9.0/1M NaClで3回、溶出させて、精製ポックス・ウイルス調製物を生成した。次に樹脂を落ち着かせ、溶出液を、200〜500mL/分の流量で、ポンプによって滅菌ボトル内に移した。54μmのフィルタ(ミリポア社製ポリガードCN optical XL5)を使用して、500〜1000mL/分のポンプ速度で、残留樹脂を溶出液から除去した。
TFFカートリッジの注入(供給)ラインをMasterflexポンプに繋がる管に接続し、透過排出口の1つをクランプで固定した。カートリッジを通じて70%エタノールをポンプで送り出し、カートリッジおよび関連するラインを一晩、溶解した貯蔵グリセロールに浸漬し、システムを浄化した。カートリッジを10〜12LのWFIを用いて、200mL/分のポンプ速度、0.2〜0.4バールの膜間差圧(TMP)ですすぎ、エタノールを除去し、水分フラックスについて試験した。透過流量およびTMPを測定することにより、清浄な水分フラックス試験を行った:
フラックス[リットル、平方メートル、時間(LMH)/バール]=
{[透過流量(mL/分)/カートリッジ面積(m2)]×0.06}/TMP(バール)
フラックスは、分析証明書に示されるように、新しいカートリッジでは399LMH/バールよりも大きくなくてはならない。カートリッジは、浸透ラインをクランプで固定することにより、0.5〜1Lの10mMのトリス塩酸 pH7.0〜9.0を、200mL/分のクロスフロー流量で30分間、循環させることによって平衡化した。8000〜10000秒-1のせん断速度および0.4〜1バールのTMPで、溶出液の最初の体積の1/10〜1/3までサンプルを濃縮した。3体積の10mM トリス塩酸 pH7.0〜9.0で連続的なダイアフィルトレーションをすることにより緩衝液の交換を行った。ダイアフィルタにかけたサンプルを所望の体積まで濃縮した。浸透ラインをクランプ固定し、濃縮物を5〜10分間、上記せん断速度で循環させた。濃縮サンプルの体積を回収し、測定した。200mLの10mM トリス塩酸 pH7.0〜9.0で、上記せん断速度でポンプによる送り出しによってシステムを洗浄し、洗浄液を回収した。1Lの70%エタノールを通すことによってシステムを浄化した。
Qiagen QIAamp DNABlood Miniキットを用いて、本質的に上述の通りにDNA抽出を行った。基本的な手順の例外として:
1.Qiagen DNeasy Tissueキット(50)(カタログ番号69504)を使用した;
2.ATL緩衝液、プロテイナーゼKおよび2−メルカプトエタノール(SOPのように)および出発物質サンプルを含む組織溶解工程には、2−メルカプトエタノールを使用しなかった;
3.出発サンプルのサイズは200μlであった(SM);
4.2回目の洗浄工程においてサンプルを13,200rpm(14,000rpmの代わりに)で遠心分離にかけた。
1.2gのアガロースを250mLの三角フラスコ内に入れ;
100mLの1×TAEを加えて攪拌混合し;
混合物を1.5分間、マイクロ波に供してアガロースを溶解させ;
加熱混合物を〜5分間、約60℃まで冷却し;
10μlの臭化エチジウムを加えて攪拌混合し;
アガロース溶液をゆっくりとタンクに注いでコームを挿入し;
ゲルを30分間、固化させ;
1×TAEの緩衝液をゲルタンク内に注ぎ、ゲルを2〜5mmの深さに沈めた。各DNAサンプルの適正な量(18μl)を新しいマイクロチューブ内に移し;
10×負荷緩衝液(2μl)を適正な量で各管内に加え;
サンプルを負荷して、75Vで〜40分間、ゲルを泳動させることによって、電気泳動を行った。次に、UV光の下でゲルの写真を撮影し、サンプルを観察した。
1.PBS中、タンパク質標準BSAの7種類の希釈を、試験すべきタンパク質溶液の代表として調製した。250μg/mLの保管BSAを使用して、このマイクロタイタープレートアッセイにおけるBSAの範囲は、2.5〜20μg/ウェルであった。タンパク質溶液を2回アッセイした。
2.各ウェル内のタンパク質含量が標準曲線の範囲内になるように、適切な体積の各サンプルを2回、隣接したマイクロタイタープレートウェル内に負荷した。
3.適切な体積のPBSを全体積が200μlになるまで各ウェル内に加えた。各サンプルウェルに50μlの濃縮色素試薬を加えた。マルチチャンネルピペッターを使用してサンプルおよび試薬を完全に混合した。
4.プレートを、室温で15分間、インキュベートした。
5.CurveEX回帰を用いて、Dynexプレートリーダー上の595nmにおける吸光度を測定した。
1.マイクロタイタープレートプレートに100μlの抗EB14抗体を5μg/mlでコーティングし、0.05MのNa2CO3/NaHCO3、pH9.6において18時間、室温でインキュベートした。
2.プレートを300μlの5%BSA/PBSで遮断し、室温で1時間インキュベートし、続いて0.1% BSA/PBS/0.1% Tween20で2回洗浄した。
3.0.1% BSA/PBS/0.1% Tween20中、希釈した100μlの抗原を加え、その後、室温で1時間、インキュベーションし、その後、0.1% BSA/PBS/0.1% Tween20で5回洗浄した。
4.0.1% BSA/PBS/0.1% Tween20中の100μlのビオチン−抗EB14 抗体を0.4/mlで加え、その後、 室温で1時間インキュベーションし、その後、0.1% BSA/PBS/0.1% Tween20で5回洗浄した。
5.0.1% BSA/PBS/0.1% Tween20中、1/20000に希釈した100μlのアビジン−HRPを加え、その後、室温で1時間インキュベーションし、その後、0.1% BSA/PBS/0.1% Tween20で5回洗浄した。
6.100μlのTMB/H2O2(1:9)を加えて室温で10分間インキュベートし、50μlの1M H2SO4で反応を停止した。
7.Dynexプレートリーダーを用いて、450nmにおける吸光度を測定した。
ALVAC特異的な定量的PCRを使用して、ALVAC DNAおよびゲノムの等価性の定量化(GEQ)を行った。詳細については、QO SOP New:Quantification of ALVAC DNA using Quantitative PCRを参照されたい。鳥類qPCRはフランス国AvPにおいて開発されている。
1.EMD ELISAキットから提供される、2つの異なる範囲のベンゾナーゼ・エンドヌクレアーゼ標準の6種類の希釈物を調製した。範囲は、5μg/mLの保管ベンゾナーゼを使用して0.1〜100ng/mlであった。サンプルを2回アッセイした。体積の各ウェルが100μlになるように希釈した緩衝液1を用いて、標準をプレート上に負荷した。
2.100μlの各サンプル溶液を、別々のマイクロタイタープレートウェルに負荷した。
3.100μlの緩衝液1を各ブランクウェルに加えた。
4.サンプルを室温で2時間インキュベートした。
5.何回もプレートのタッピングを繰り返しながら、プレートをペーパータオル上に逆さにして空け、液体の完全な移動を確実にした。次にウェルを緩衝液1で満たし、再び空にする前に1分間インキュベートした。ステップ5を3回繰り返した。
6.保管試薬B(西洋わさびペルオキシダーゼ複合抗体)に由来する緩衝液1で1:100に希釈した100μlの試薬Bとともに、室温で1時間、サンプルをインキュベートした。
7.次に、プレートをステップ6に記載したように洗浄した。
8.60μlの試薬Cを各ウェルに加え、その後、15分間インキュベーションした(インキュベーションの間、プレートを光から保護するべきである)。
9.140μlの停止試薬(0.2M H2SO4)を各ウェルに加えることによって、酵素反応を停止した。
10.次に、Dynexプレートリーダーを使用して、各ウェルの450nmにおける吸光度を読み取った。
QT35細胞を使用するCCID50アッセイによって、ALVACウイルスの力価を測定した。詳細については、SOP番号22PD−039バージョン4.0を参照のこと。例外:精製工程の間のオープンシステムへのサンプルの曝露に起因する、CCID50アッセイにおける汚染を排除するため、SOPに記載される2倍の感染溶媒中の抗生物質を使用した。試験サンプルは間接的に超音波分解した。
上述の手順は、90%を超える不純物(例えば、限定はしないが、鳥類DNAおよび/または非ベクタータンパク質を含むものなど)を除去した組成物(精製された調製物)を提供する。3つの実施の形態では(表2)、精製工程からの全般的なウイルス回収は20〜52%であった。清澄化の工程は、全タンパク質の55〜71%を除去した。続くゲルろ過工程では、全タンパク質の61〜72%を除去した。さらには、ANXイオン交換バッチ吸着工程では68〜78%を除去し、その後のTFFの工程では、バッチ吸着で得られた材料から、さらに全タンパク質の33〜41%を除去した。結果として、全タンパク質の全般的な除去は、およそ97.6〜98.2%であった。最終的な精製された生成物中の鳥類タンパク質は、98〜99%除去された。タンパク質全体(pg)のCCID50に対する比は11対17であった(表2)。
1.材料
以下の研究に用いられた材料には次のものが挙げられる:QT35細胞;QT35成長培地:SOP番号22PD−039;ハムF−10培地(Gibco社カタログ番号11550−043);Hank's溶液を用いた培地199(Gibco社カタログ番号12350−039);ウシ胎仔血清(FBS)、JRH社カタログ番号12107−78P;トリプトースリン酸ブイヨン粉末(Difco社製、BD260300);ペニシリン・ジヒドロストレプトマイシン(Gibco社製);ベンゾナーゼ・エンドヌクレアーゼ、EM Industries,inc.社カタログ番号1.01694.0002および1.1697.0002;ベンゾナーゼ・エンドヌクレアーゼELISAキット、EMD Chemicals,inc.社カタログ番号1.01681.0002;DNAeasyキット、Qiagen社製、カタログ番号69504;Quant−iT PicoGreen dsDNAアッセイキット、Invitrogen社製、カタログ番号P11496;PBLトリプチケースソイブロス、Beckon Dickenson社製;5%のヒツジ血液を含むトリプティックソイ寒天培地(TSA II);ANX「セファロース」4FF樹脂、Amersham Biosciences社製、カタログ番号17−1287−01および171287−04;および、「セファロース」4FF樹脂、Amersham Biosciences社製、カタログ番号17−0149−01および17−0149−05。
a.超音波分解を使用するウイルス放出
ALVAC−黒色腫採取物を、遠心分離(4000×g、4℃で40分間)を用いて最初に清澄化し、その後、ALVAC−HIVウイルスについて上述したように、5μm/3μmのデプスフィルタを用いてろ過した。冷凍した場合には、ウイルスサンプルをWFI水を含む37℃の水浴で解凍した。CCID50アッセイで試験する前に、ウイルスを超音波分解した。サンプルを15mlまたは50mLの試験管に入れて、冷却した氷水で満たしたVirtisソニケーターのカップホーン内で1分間を2回、1秒オン/1秒オフのパルスおよび7.5の出力を用いて、超音波分解した。超音波分解の後、サンプルを氷上で冷却し、超音波分解の間水温をモニタした。必要に応じて少量の氷を加えた。
QT35細胞を使用するCCID50アッセイによってALVACウイルスの力価を測定した。詳細については、SOP番号22PD−039バージョン4.0を参照のこと。例外:精製工程の間のオープンシステムへのサンプルの曝露に起因する、CCID50アッセイにおける汚染を排除するため、SOPに記載される2倍の感染溶媒中の抗生物質を使用した。試験サンプルは間接的に超音波分解した。
下記のように電子顕微鏡法を用いてサンプルをを試験した:
1.出発物質を−80℃の冷凍庫から取り出し、37℃の水浴で解凍した。
2.出発物質を、必要に応じて、10mMのトリス塩酸 pH8.0;9.0;または10.0で10倍に希釈した。
3.サンプルを間接的に超音波分解した。
4.適用時、室温で2時間、または2〜8℃で一晩のいずれかで、サンプルをインキュベートした。
5.適切なインキュベーション時間の後、インキュベートしたウイルスの懸濁液に対して1:1の体積比でパラホルムアルデヒドおよびグルタルアルデヒドを含む固定緩衝液を用いて、ウイルスを固定した。トロント大学の電子顕微鏡の研究室で検査するまで、固定化したウイルスサンプルを2〜8℃で保管した。
6.直接滴定法を使用する逆染色法による透過型電子顕微鏡での検査のためのサンプルを調製した。サンプルの液滴(5μl)をカーボン−フォルムバーでコーティングした400メッシュの銅格子上に直接置いた。サンプルは、2%のリンタングステン酸PTA(pH6.5)または2%の酢酸ウラニル(UA)の液滴(10μl)を準備した格子の上に加えることによってネガティブ染色した。30秒〜1分後、格子をペーパーフィルタでブロット乾燥させた。サンプルを、75KvにおけるHitachi H 7000透過型電子顕微鏡で検査し、写真撮影した。
ウイルスのサンプルを37℃の水浴で解凍し、セクション5.2.1に記載されるように間接的に超音波分解した。所望の量の清澄化した材料を、20±3℃で所望の期間、さまざまな量(U/ml)のベンゾナーゼで処理した。別記しない限り、MgCl2を2.0mMの最終濃度になるまで加えた。攪拌子を用いて成分を混合し、規定の条件に従って、懸濁液をインキュベートした。指定されたインキュベーション時間の後、さらなる分析のため、サンプルを−80℃に維持した。
Qiagen QIAamp DNABlood Miniキットを使用して、本質的に記載されるとおりに、DNA抽出を行った。基本的な手順の例外として、下記のものが挙げられる:
1.Qiagen DNeasy Tissueキット(50)(カタログ番号69504)を使用した;
2.ATL緩衝液、プロテイナーゼKおよび2−メルカプトエタノール(SOPの通り)および出発物質サンプルを含む組織溶解工程には2−メルカプトエタノールは使用しなかった;
3.出発サンプルサイズは200μlであった(SM);
4.2回目の洗浄工程において、13,200rpm(14,000rpmの代わりに)で、サンプルを遠心分離にかけた。
1.2gのアガロースを250mLの三角フラスコ内に入れ;
100mLの1×TAEを加えて攪拌混合し;
混合物を1.5分間、マイクロ波に供してアガロースを溶解させ;
加熱混合物を〜5分間、約60℃まで冷却し;
10μlの臭化エチジウムを加えて攪拌混合し;
アガロース溶液をゆっくりとタンクに注いでコームを挿入し;
ゲルを30分間、固化させ;
1×TAEの緩衝液をゲルタンク内に注ぎ、ゲルを2〜5mmの深さに沈めた。各DNAサンプルの適正な量(18μl)を新しいマイクロチューブ内に移し;
10×負荷緩衝液(2μl)を適正な量で各管内に加え;
サンプルを負荷して、75Vで〜40分間、ゲルを泳動させることによって、電気泳動を行った。次に、UV光の下でゲルの写真を撮影し、サンプルを観察した。ウイルスの出発物質および精製された生成物のDNAを、PicoGreenアッセイ(分子プローブ、Eugene社製(米国オレゴン州所在))によって決定した。キットの基本的な指示書に関して、唯一の例外は、プレートにおける連続希釈の前に、粗サンプルから抽出したDNAを1:5に希釈したことである。
標準として、タンパク質標準(PBS中に溶解したBSA)の8種類の希釈物を、試験すべきタンパク質溶液の代表として使用した。このマイクロタイタープレートアッセイにおけるBSAの範囲は、低濃度のサンプルでは1.25〜10.0μg/ウェルであり、高濃度のサンプルでは10.0〜60.0μg/ウェルである。保管BSA溶液(250μg/ML)を使用した。タンパク質溶液を2回アッセイした。適切な体積の各サンプルを、各ウェル内のタンパク質含量が標準曲線内に入るように、2回、隣接したマイクロタイタープレートウェルに負荷した。全体積が200μlになるように、適切な体積のPBSを各ウェルに加え、50μLの濃縮した色素試薬を各サンプルウェルに加えた。マルチチャンネルピペッターを使用してサンプルおよび試薬を完全に混合し(およそ10回)、室温で15分間インキュベートし、CurveEX直線回帰を使用し、Dynexプレートリーダー上で、595nmにおける吸光度を測定した。
樹脂を下記のように調製した:
1.樹脂625mL(500mLの乾燥樹脂)を2Lのナルゲンボトルに注ぎ、落ち着かせた。
2.Masterflexデジタル標準駆動を使用して、および/またはピペットにより、ポンプによって送り出すことにより可能な程度まで、エタノールを除去した。
3.2体積(1000mL)のWFI水を加えることによって樹脂を洗浄し、攪拌プレート上で10分間混合した。落ち着かせた後、WFIをポンプおよび/またはピペットによって除去した。次に、この工程を繰り返した。
4.2体積(1000mL)の10mMのトリス塩酸 pH7.4を用いて樹脂を平衡化し、10分間混合した。落ち着かせた後、10mMのトリス塩酸 pH7.4を、ポンプおよび/またはピペットによって除去した。次に、この工程を繰り返した。
バッチ吸着システムを図1に示すように配置した。樹脂は、次のように調製した:エタノールを、6.25Lの樹脂(5.0Lの乾燥樹脂)を含む15Lのスピナーフラスコの外にポンプで送り出した;2体積(10L)のWFI水を用いて樹脂を洗浄し、10分間混合した;落ち着かせた後、WFIを1L/分で、ポンプで送り出し、この工程を1回繰り返した。次に、2体積(10L)の10mMのトリス塩酸 pH7.4を用いて樹脂を平衡化し、10分間混合した。落ち着かせた後、次に、10mMのトリス塩酸 pH7.4緩衝液を1L/分の速度で、ポンプで送り出し、この工程を1回繰り返した。攪拌プレートを用いて、5Lのサンプルを、平衡化した樹脂と60分間混合した。落ち着かせた後、結合していないサンプルを、750mL/分の速度でポンプにより送り出すことにより、別々の容器に取り出した。次いで、サンプルを、2体積(10L)の10mMのトリス塩酸 pH7.4で、10分間混合することにより、洗浄した。落ち着かせた後、洗浄したサンプルを、1L/分の速度で、ポンプで送り出した。次にこの工程を繰り返し、合わせた洗浄1/2サンプルを得た。サンプルを10mMのトリス塩酸 pH7.4/1M NaClと10分間混合することによって、ウイルスを樹脂から溶出させた。落ち着かせた後、溶出サンプルを、1L/分の速度で、30μmフィルタを通じてポンプにより送り出すことにより、別々の容器に取り出した。この工程をさらに2回繰り返し、合わせたろ過溶出液を得た。溶出サンプルをできれば−80℃、または4℃で保管した。
より簡便な溶液排出のため、24サイズのシリコーン製チューブを、BPGカラムの底部排出口に接続した。カラム、アダプターおよび関連する管類を、カラムに0.1M NaOHを一晩充填することによって浄化した。NaOHを排出し、カラムを2−カラム体積のWFIですすいだ。カラムネットを70%エタノールで湿らせ、閉じ込められた空気を排除した。カラムを、10〜15センチのWFIで満たすか、または緩衝液で平衡化した。樹脂を強振とうして均質な溶媒スラリーを調製した。充填カラムの毎リットルにつき、1.25Lまたは溶媒スラリーをポンプで送り出すか、または注入する。よって、20cmの高さのカラムを充填するためには、BPG100(10cm直径のカラム)では1.5L、BPG200(20cm直径のカラム)では6.5Lの充填した樹脂が必要とされる。均質な溶媒スラリーをカラムに注入し、それをWFIと混合/緩衝液で平衡化した。1.5Lの充填したカラム床に、1.88Lの溶媒スラリーを注いだ。6.5Lの充填したカラム床に、8.13Lの溶媒スラリーを注いだ。1〜2cmの上部の透明な液体層が見られるまで、樹脂を落ち着かせた。底部の排出口を開放し、液体をゆっくりと排出し、上部の透明な液体層が維持されることを確実にした。アダプターを挿入し、樹脂を所望のカラムの高さに落ち着かせるときに、液体の表面の3〜10cm上になることを確実にした。次に、最上部のアダプター注入管をAKTA explorerシステムに接続した。70%エタノールを用いてラインを浄化し、カラムネットを湿らせ、AKTAシステムを用いて任意の閉じ込められた空気を排除した。次に、液体が最上部のアダプターネットから出始めたときにAKTAシステムポンプを停止した。次いで、アダプターを、落ち着かせた樹脂床の上およそ0.5cmまで下げ、封止調節ノブを時計回りに回転させることにより、アダプターのO−リングを封止した。24サイズのシリコーン排出管をAKTA適合性の排出管に交換し、AKTAシステムに接続した。2−CVの平衡化する緩衝液をポンプで送り出すことにより、樹脂を平衡化した。次いで、3Lの10mMのトリス塩酸 pH9/150mM NaClを、20mL/分の速度で、BPG100カラムに、13Lの10mMのトリス塩酸 pH9/150mM NaClを80mL/分の速度で、BPG200カラムに、それぞれポンプで送り出した。
1.すべてのバルブに側路を設けて、高流量における背圧を低減するように、AKTA explorerシステムを適合させた。
2.サンプルライン(A15)を、100mLの70%EtOHを用いて手動で浄化し、200mLのWFIですすぎ、AKTA explorerシステムを用いて、100mLの10mM トリス塩酸 pH9/150mM NaClで平衡化した。バイオフード内の廃棄物ラインを使用して廃棄物を回収し、そのラインを浄化し、平衡化した。
3.上述のようにカラムを充填した。
4.BPG100充填カラム(1.5Lの「セファロース」4FF)をAKTA explorerシステムに接続した。
5.すべての処理パラメータ(伝導性およびpH)の曲線が安定するまで、2CV(3.0L)の10mMのトリス塩酸 pH9.0/150mMのトリス塩酸緩衝液で樹脂を手動で平衡化した。
6.バイオフード内で、サンプルライン(A15)を、カラムに負荷すべき清澄化した採取物サンプルに挿入した;サンプル負荷体積は、カラム体積の12〜18%の範囲内でなくてはならない。
7.あらかじめプログラムした方法を使用してクロマトグラフィーを行った:
・開始条件:流量 20mL/分
・50mLの10mMのトリス塩酸 pH9/150mM NaClで平衡化
・負荷:225mL(15%)のベンゾナーゼ処理した清澄化採取物
・溶出:1800mLの10mMのトリス塩酸 pH9/150mM NaCl
・浄化:1800mLの1M NaOH
・すすぎ:3000mLのWFI
・保管:2000nmLの20%EtOH
注記:浄化、すすぎおよび保管の工程は、将来的に、同一の樹脂を再生する場合にのみ必要とされる。
8.ウイルス(〜500mL)を含む最初のピークを0.5Lの殺菌したナルゲンボトル内に回収し、さらに使用するまで4℃の冷蔵庫で保管した。
カートリッジ調製物は次のように達成した:
1.TFFカートリッジ、UFP−500−E−H22LAを、クランプ固定した透過排出口の1つを用いて最小システム上に接続した。
2.管類およびカートリッジに70%エタノールを、3barg以下のTMPで1分間流した。
3.浸透ラインを開放し、およそ10分間流し続けてグリセロールを溶解し、カートリッジを浄化した。
4.ポンプを停止し、すべてのラインをクランプ固定した。次に、それを一晩、静置した。
5.浸透ラインを閉鎖してシステムにWFI水を1分間流し、エタノールを除去し、フローを確立した。
6.浸透ラインを開放し、5〜10分間、連続的に流して、残留エタノールを除去した。
7.最小TMPで水分フラックス試験を行った(水分フラックスは分析証明書に示される値以上でなければならない(≧399LMH/barg))。
1.30mLの溶媒を、20分間、所望のせん断速度に対応する流量で循環させた。
2.浸透ラインを閉鎖してシステムに150〜250mLの10mM トリス塩酸 pH7.4を流すことによって溶媒を除去した。
3.浸透ラインを開放し、10mMのトリス塩酸 pH7.4を用いて、20分間、所望のせん断速度に対応する流量で循環させた。
1.浸透ラインを閉鎖して、サンプルを1分間、所望のせん断速度に対応する流量で循環させてフローを確立した。
2.浸透ラインを開放して濃縮を開始し、別々の廃棄物容器に回収した。
1.所望の濃度達成時に、1ダイアフィルトレーション体積をサンプル容器に加えることによって、ダイアフィルトレーションを開始した。
2.濃度達成時に、工程1をさらに2回繰り返して、3ダイアフィルトレーション体積を完了した。
3.ほぼゼロ体積までサンプルを濃縮し、空気がカートリッジ内に入らないように注意すると同時に、副産物を別々の容器に回収した。
4.十分な体積の10mMのトリス塩酸 pH7.4緩衝液を、元のサンプル容器に加えて、サンプルを希釈し、濃度を補正した。
5.サンプルを−80℃で保管した。
1.貯蔵グリセロールの除去を容易にするため、クロスフローカートリッジ(UFP−500−C−H24U)を、25%EtOHに一晩浸漬した。
2.クロスフローカートリッジを1550mLのWFIですすぎ、Method Wizard、続いて、Method Editor windowにおけるPreproduct stepsから選択される、あらかじめプログラムした方法を使用して、420mLの10mMのトリス塩酸 pH9.0で平衡化した。
3.膜システム評価、続いて、Method Editor windowにおける正規化水分フラックスを選択することにより、すすいだカートリッジを使用して水分フラックスをチェックし、水分フラックスが分析証明書に示される以上(≧399LMH/barg)になることを確実にした。所望の水分フラックスに達しなかった場合には、追加のすすぎを行った。
4.400mLのANX溶出液を40mLまで濃縮し、10mMのトリス塩酸 pH9.0緩衝液を用いて連続的なダイアフィルトレーションを行った。あらかじめプログラムした方法は、Method Wizard、続いて、Method Editor windowにおけるProduct stepsから選択した。
5.次に、濃縮したサンプルを試験用に採取した。
6.必要な場合には、TFF濃縮化サンプルを使用し、各せん断速度についてTMP最適化またはフラックス最適化を行った。あらかじめプログラムした方法は、Method Wizard、続いて、Method Editor windowにおけるUF process optimizationから選択した。
7.膜システム評価、続いて、Method Editor windowにおけるProcess optimizationにおいて生じたTMPに対するフラックスのグラフから最適なフラックスを決定した。
8.カートリッジを浄化し、AKTAクロスフローシステムに、Method Wizard、続いて、Method Editor windowにおけるPostproduct stepsのあらかじめプログラムした方法を使用した。
1.TFFカートリッジ、UFP−500−C−3×2MAおよびUFP−500−C−6Aを、Masterflexデジタル規格駆動ポンプ(Cole−Parmer Instrument Company社製、モデル77201−62、2L規模用)およびMasterflex I/P Easy loadポンプ(Cole−Parmer Instrument Company社製、モデル7529−10、10L規模用)を、クランプ固定した透過排出口の1つ(供給側に近い)に接続した。
2.カートリッジを70%エタノールに一晩浸漬してグリセロールを溶解し、同時にカートリッジを浄化した。
3.1L/分のクロスフロー流量および最小TMPで、カートリッジを10L(2L規模)または100L(10L規模)のWFIですすぎ、エタノールを排除した。
4.透過流量およびTMPを測定することにより、清浄な水分フラックス試験を行った。フラックス(LMH/バール)={[透過流量(mL/分)/カートリッジ面積(m2)]×0.06}/TMP(バール)。分析証明書によれば、新しいカートリッジでは、≧399LMH/bargでなければならない。
5.浸透ラインを約20分間クランプで固定することによって、1L(2L規模)および6L(10L規模)の10mMのトリス塩酸 pH9.0/1.0M NaClを1L/分のクロスフロー流量で循環させることにより、カートリッジを平衡化した。
6.イオン交換バッチ吸収溶出液から得られたウイルス材料をプールした。
7.副産物の管にはクランプ固定をすることなく、供給流量を徐々に増大させることによって、すなわち1L/分で10分間、1.5L/分で10分間、2.1L/分で10分間および4.3L/分で残りの濃縮工程を流すことによって、サンプルを、溶出液の体積の1/3まで濃縮した。透過流量および供給圧を測定した。
8.等量の10mMのトリス塩酸 pH9.0を3倍濃縮したサンプルに加えて、ダイアフィルトレーションおよび、出発体積の1/3まで濃縮を行った。
9.ダイアフィルトレーションを3回繰り返した。
10.およそ100mL(2L規模用)、500mL(10L規模用)までサンプルをさらに濃縮した。
11.ダイアフィルタにかけた濃縮物を、少し速い供給速度で5〜10分間、循環させた。
12.濃縮したサンプルを回収および測定した。
13.次に、200mL(2L規模用)および1L(10L規模用)の10mMのトリス塩酸 pH9.0を通すことによって、システムを洗浄した。
14.次にその体積の洗浄サンプルを回収した。
15.1Lの70%エタノールを通すことによって、システムを洗浄した。
本明細書に記載の精製方法は、次の工程を有してなる:(a)遠心分離を使用する粗採取物の濃縮、(b)細胞の溶解、凝集物の粉砕、およびウイルスの放出のためのsonitubeを使用する直接的な超音波分解、(c)5μm/3μmフィルタを使用するディプスフィルトレーションによる材料の清澄化、(d)ベンゾナーゼ処理による遊離のDNAの分解、(e)「セファロース」4FFゲルろ過クロマトグラフィーによるウイルスの精製および残留ベンゾナーゼの除去、(f)ANXイオン交換バッチ吸着によるウイルスのさらなる精製、および(g)タンジェンシャルフローろ過によるウイルス材料の精製および濃縮、および緩衝液の交換。本方法の各工程を、後にCEFに生じるALVAC黒色腫のDNAの低減について評価した。
ベンゾナーゼ濃度を、EB14(上述)内で増殖するALVAC HIVにおける遊離のDNAの分解のための、20±3℃で2時間の反応時間を有する、50U/mLと規定した。これらの条件を、3つの別々のロットのALVAC黒色腫/CEF(vCP1584、PX−06025、およびPX−06026)における遊離のDNAの消化に適用したデータは、ベンゾナーゼ処理後のこれらの調製物からのウイルス回収が、23%〜79%変化することを示し、これはALVAC HIV/EB14について観察されるよりも低かった。結果は、ALVAC/EB14について規定されたベンゾナーゼの消化条件を、ALVAC/CEF用に修正すべきであることを示唆した。
ALVAC HIV/EB14について規定される条件を用いて、次に、ゲルろ過クロマトグラフィーを、ALVAC黒色腫/CEFの精製について評価した。清澄化したサンプル(225ml)を、20mL/分の流量で、直径10cmの1.5L(樹脂)カラムに負荷した。ゲルろ過からの2つのロットにおけるウイルス回収は、それぞれ84%および87%であり、DNA全体の除去は90%を超えた(表5)。データは、ALVAC/EB14について規定される条件を用いたゲルろ過クロマトグラフィーが、同様のウイルス収量および不純物除去を伴って、ALVAC黒色腫/CEFを精製するのに適していることを示唆した。
ALVAC HIV/EB14について規定される条件を用いたANX「セファロース」4FFイオン交換バッチ吸着を、ALVAC黒色腫/CEFの精製について評価した。10mMのトリス塩酸 pH9.0緩衝液中、ゲルろ過から得られる画分を等量のANX「セファロース」4FF樹脂と混合した。1M NaClを含む、10mMのトリス塩酸 pH9.0を用いて、ウイルスを溶出した。2つの研究から得られたウイルスの回収率は、それぞれ、76%および100%であった。マイクロBradfordアッセイによって測定した全タンパク質、およびPicogreenアッセイによって測定した全DNAは、アッセイの検出限界未満であった。それにもかかわらず、ALVAC HIV/EB14について規定された条件を用いたANX「セファロース」4FFイオン交換バッチ吸着は、CEFにおいて生じたALVAC黒色腫の精製に使用することができる。
ANXイオン交換バッチ吸着からの溶出液の濃縮および緩衝液の交換に、TFFを使用した。ALVAC HIV/EB14について開発したTFF工程をALVAC黒色腫/CEFの溶出液の濃縮に用いる場合、ウイルス回収率は16〜17%であり(表7)、ALVAC HIV/EB14のものよりも低かった。ALVAC HIV/EB14の溶出液(TFF用の出発物質)のウイルス力価(logCCID50)が5〜6であるのに対し、ALVAC黒色腫/CEFのものは6〜7であることは知られていた。しかしながら、ALVAC HIV/EB14の溶出液における全タンパク質レベルはおよそ10μg/mlであるのに対し、ALVAC黒色腫/CEFのものはBradfordアッセイの検出限界未満(1.25μg/ml)であった。さらには、ALVAC黒色腫/CEFに由来するTFF濃縮物の全タンパク質濃度は15.2〜40μg/mlであり、ALVAC HIV/EB14のものより低かった(109〜226μg/ml)。よって、不純物に対するウイルス力価の比は、ALVAC黒色腫/CEFにおいて高く、これは、TFF工程の間のウイルスの必要以上の損失の原因でありうる。
1.遊離のDNAのベンゾナーゼ分解の最適化の方法
さまざまな濃度のベンゾナーゼを、室温で2時間、遊離のDNAの消化について試験した。表8に示すように、10U/mLのベンゾナーゼを使用する場合、DNA全体で4.2倍低減された。ベンゾナーゼ濃度を25U/mlまたは90U/mlに増大させた場合、DNAの低減は、それぞれ、わずかに5.5倍または5.8倍に増加したが、ベンゾナーゼを0U/mlから10U/mlに増大させた結果のように顕著ではなかった。加えて、10U/mlのベンゾナーゼを使用した場合、ベンゾナーゼ消化後の最も高いウイルス回収率(77%)を得た。したがって、10U/mLのベンゾナーゼを、CEFにおいて生じるALVAC中の遊離のDNAの消化用に選択した。
ALVAC HIV/EB14に伝開発した精製工程において、10mMのトリス塩酸 pH9.0をゲルろ過およびANXイオン交換バッチ吸着に使用した。安定性試験から得たデータは、ALVACが、10mMのトリス塩酸 pH7.4中で、同等またはそれ以上に安定であるように見えることを示唆した。精製工程における緩衝液の使用を単純化するため、2つのpH条件下でウイルス回収率を比較した。
a.ALVACのTFFカートリッジへの吸着の評価
TFFの工程からのALVAC黒色腫/CEFの低い収率に内在する潜在的なメカニズムを理解するため、精製工程の間のALVACのTFF膜への吸着を最初に検査した。ウイルスを、クランプで固定した透過ポートを有するTFFシステム内に、さまざまな期間で循環させた。膜にはTMPを適用しておらず、ウイルスの損失はウイルスの膜への吸着か、またはせん断損傷に起因しているに違いない。TFFの間のウイルスの損失について、2つのせん断速度を比較した。力価の低下は循環時間の長さと関連付けられ、循環時間が長いほど力価の低下が大きいことが判明した。8000秒-1または12000秒-1のせん断速度で30分間の循環後、同様のウイルスの損失が観察され(それぞれ13%および15%の損失)、損失は主にウイルスの膜への吸着に起因しうることが示唆された。さらには、ウイルスを2時間循環させた場合、せん断速度が大きいほどウイルスの損失が大きい、すなわち、8000秒-1の場合と比較して12000秒-1のせん断速度におけるウイルスの損失は15%を超える(表11)。これらの結果は、ALVACがTFF膜に吸着されうること、およびより高いせん断速度が長期に及ぶ工程においてさらなる生成物の損失を生じうることを示唆した。したがって、TFF工程の所要時間はできるだけ短くすべきであり、せん断速度は8000秒-1〜12000秒-1に調節して、TFF工程の間のウイルスの損失を最小限に抑えるべきである。
最適な動作TMPを確立するため、2種類のカートリッジ(1mmおよび0.5mmのルーメン内径)を使用するTFFのフラックスLMH(リットル/メートル2/時間)を、さまざまな動作せん断速度について評価した(表10)。ALVAC黒色腫/CEFのANXイオン交換溶出液をTFFのための材料として用い、38cm2のカートリッジを使用して、TFF試験を行った。データは、ルーメン内径1mmのカートリッジを使用し、せん断速度が8000秒-1である場合、TMPが0.75バールまで増大したときにフラックス(LMH)がプラトーに達したことを示した。さらに高いせん断速度10000秒-1を使用すると、フラックスは、より遅く、TMPが1.5バールに達したときに、プラトーに達した(図2)。性能曲線の線形範囲(図2)に基づいて、8000、10000および12000秒-1のせん断速度についての最適な動作TMPは、それぞれ<0.5バール、<0.75バールおよび<0.75バールであることが示された。同様に、0.5mmのルーメン内径を有するカートリッジを使用する、異なるせん断速度についての動作TMPは、8000秒-1および12000秒-1のせん断速度について、それぞれ、<0.5バールおよび<0.6バールであることが示唆された。
異なるせん断速度についての最適なTFF動作範囲の決定後、TFFの性能、すなわち、所定のせん断速度およびTMPについて、フラックスの濃度係数に対する曲線を試験した。8000秒-1のせん断速度および0.5バールのTMP(最適なTMP範囲<0.75バール)を用いる場合(0.5mmのルーメン内径を有するカートリッジについて)、フラックスは、サンプルを2倍に濃縮した場合に、105LMHから58LMHまで降下し(およそ2倍)、濃縮工程の最初における膜のファウリングが示唆された。TFF性能の乏しさは、高いTMPに起因すると考えられ、したがって、以後の試験には、より低いTMPである0.2バールを用いた。しかしながら、同様のフラックスの低下が観察され、より低いTMPが膜のファウリングを予防する助けにならなかったことを示唆した(図3)。0.5mmのルーメン内径を有するTFFカートリッジを、さまざまなせん断速度下における性能についても評価した(図4)。8000秒-1または10000秒-1のせん断速度において、サンプルを2倍濃縮したときに、フラックスの約2倍の低下が観察された。これらの結果は、膜のファウリングが、せん断速度、TMPまたはルーメン内径にかかわらず生じることを示唆している。
上述の試験から、ALVACウイルスをTFF膜に吸着させると、ルーメン内径、TMPおよびせん断速度にかかわらず、膜のファウリングが生じることが判った。次の試験すべき因子は、ウイルスの吸着および膜のファウリングを低減することを目的として、膜をウイルスに曝露する前に、膜が特定の試薬を受けることができるか否かであった。ウイルス感染に使用した溶媒およびCEFにおいて生じた清澄化ALVACを、TFF膜のプライミング試薬として評価した。ウイルス材料に導入する前に、上記試薬をTFF中に20分間、循環させた。溶媒または清澄化したウイルスの材料を受けた膜を用いたTFFからのウイルス回収は、プライミングなしにTFFから回収したものと同様であり(データ示さず)、TFF膜のプライミングはウイルスの収率を増大させないことが示唆された。
CEF vcp 2264(ロット番号PX−06025)において生じたALVAC黒色腫を、ALVAC HIV/EB14についての修正した精製工程を使用して精製した。遊離DNAのベンゾナーゼ消化、ゲルろ過クロマトグラフィー、ANXイオン交換バッチ吸着およびTFFを含めた精製工程からのウイルス回収は、それぞれ、100%、66%、100%および40%であった。ベンゾナーゼ処理およびANXイオン交換からのウイルスの収率は、工程の最適化で著しく改善された。しかしながら、TFFの工程からのウイルス回収は、20%から40%にわずかに上昇した。非特異的吸着および膜のファウリングは、TFFの性能の劣化につながりうる。全般的なウイルス収率は28%であった。タンパク質全体の除去は99%であり、タンパク質全体の最終濃度は8.9μg/回であった。DNA全体の除去は95.7%であり、最終的なDNA濃度は172ng/回であった。EB14において生じたALVACの精製から得られた先のデータは、精製された生成物における鳥類DNAのDNA全体に対する平均比が1.7%であったことを示した。同一の鳥類DNAのDNA全体に対する比であると仮定すると、精製されたALVAC黒色腫/CEFにおける鳥類DNAレベルは、2.9ng/回と推定することができる(172ng/ml×1.7%*10^7/10^7.29=2.9ng/回、1回あたりのCCID50を10^7と仮定)。ALVAC黒色腫/CEFの精製から得られた結果を表13にまとめた。
清澄化したALVAC黒色腫/CEF(logCCID50>8.5に達する)を、安定性試験のために濃縮した。TFFを濃度手法として評価し、2種類のTFFシステム(AKTA−クロスフローおよび最小TFF)、異なるせん断速度、およびTMPを比較した。ウイルスが、8.7〜9.0の最終的なtire logCCID50で試験したすべての条件から、100%回収されることを見出した。タンパク質全体の除去は15〜30%であったが、DNA全体が100%維持された(表14)。よって、宿主細胞DNA(CEFなどの初代細胞に由来する)の低減が大きな懸案事項でない場合には、CEFにおいて生じたALVAC採取物を、TFFを使用して濃縮し、力価/mlを増大させることができる。
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・米国特許第5,719,049号明細書
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Claims (7)
- 細胞培養物から、無傷のポックスウイルス粒子以外の成分が10重量%未満である精製ポックスウイルス調製物を作成する方法であって、
a)細胞内ポックスウイルスを含むポックスウイルス含有細胞を採取して、細胞と緩衝液とから成る濃縮採取物を作成し、
b)直接の超音波処理によって前記濃縮採取物中の細胞を破砕し、得られた生成物をヌクレアーゼで処理して、粗ポックスウイルス調製物を作成し、
c)前記粗ポックスウイルス調製物をゲルろ過に供して、半精製ポックスウイルス調製物を作成し、さらに
d)前記半精製ポックスウイルス調製物を、陰イオン交換クロマトグラフィーに供し、等体積の陰イオン交換樹脂と前記半精製ポックスウイルス調製物とを1時間混合した後、7.0〜9.0のpHを有するトリス緩衝液で洗浄および溶出させて、精製ポックスウイルス調製物を作成する、
各工程を有してなる方法。 - 前記工程c)において、粗ポックスウイルス調製物を、10mMのトリス塩酸 pH7.0〜9.0で平衡化したセファロース(商標)4ファスト・フローまたはセファロース(商標)6ファスト・フローの樹脂でのゲルろ過に供して、半精製ポックスウイルス調製物を作成し、
前記工程d)において、前記半精製ポックスウイルス調製物を、ポックスウイルスが樹脂に吸着するように、10mMのトリス塩酸 pH7.0〜9.0で平衡化したANXセファロース(商標)4ファスト・フロー樹脂での陰イオン交換クロマトグラフィーに供し、さらに、樹脂に吸着されたポックスウイルスを、10mMのトリス塩酸 pH7.0〜9.0/1M NaClを用いて溶出させる、請求項1記載の方法。 - 前記工程c)を行う前に、前記粗ポックスウイルス調製物が清澄化されることを特徴とする請求項2記載の方法。
- 該方法が、混入物質から組換えポックスウイルスのビリオンを精製するために使用され、前記工程a)の前に、ポックスウイルスベクターを適切な宿主細胞内に導入し、および該宿主細胞を培養してポックスウイルスのビリオンを生成する工程を含み、該宿主細胞から粗ポックスウイルス調製物が調製される、請求項1記載の方法。
- 前記陰イオン交換クロマトグラフィーが、強陰イオン交換体および弱陰イオン交換体からなる群より選択されるイオン交換マトリクスを用いて行われることを特徴とする請求項4記載の方法。
- 前記陰イオン交換クロマトグラフィーが、Qセファロース(商標)ファスト・フロー、DEAEセファロース(商標)ファスト・フロー、およびANXセファロース(商標)4ファスト・フローからなる群より選択されるイオン交換マトリクスを用いて行われることを特徴とする請求項4記載の方法。
- 前記イオン交換マトリクスがANXセファロース(商標)4ファスト・フローであることを特徴とする請求項6記載の方法。
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