CN108159411A - 一种流感病毒亚单位疫苗纯化方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种含有四步纯化工艺的流感病毒亚单位疫苗的制备方法和由所述方法制备得到的疫苗，本发明提供的流感病毒亚单位疫苗四步纯化工艺，弥补了现有技术中三步纯化工艺的不足，既降低了疫苗中卵清蛋白的含量，又增强了病毒裂解效果，提高了HA等有效抗原物质的含量。

Description

一种流感病毒亚单位疫苗纯化方法及其应用

技术领域

本发明属于医药领域，涉及一种流感疫苗的制备方法及利用该方法制备得到的疫苗。

背景技术

流行性感冒病毒(influenza virus，简称流感病毒)，是一种引起人、禽、畜共患的急性呼吸道传染病。根据病毒表面血凝素和神经氨酸酶结构及其基因特性的不同分为许多亚型，目前已发现的血凝素有16个亚型(H1～H16)，神经氨酸酶有10个亚型(N1～N10)。

接种流感疫苗是预防流感发生与传播的最佳方法。流感病毒亚单位疫苗是用裂解剂将病毒裂解而制得，疫苗中含有血凝素/神经氨酸酶表面抗原和其它抗原，病毒包膜被破坏，脂质被去除，具有较高的免疫原性，副反应较低，可用于儿童、成人和老年人。

在目前的流感病毒亚单位疫苗生产中，纯化工艺一般包括三步：流感病毒裂解前纯化、流感病毒裂解后纯化和最终的洗滤纯化，或者是，流感病毒裂解时纯化、裂解后纯化和最终洗滤纯化，只注重病毒裂解前的纯化而忽略了裂解过程中的纯化，虽然降低卵清蛋白等杂质，但是忽略了使裂解剂与病毒充分接触，从而影响了病毒裂解效果，同时因为无法使裂解下来的HA和NA进入到相应密度的蔗糖区间，进而无法在裂解时对HA和NA起到富集和纯化作用；只注重病毒裂解过程中的纯化而忽略了裂解前的纯化，虽然增强了流感病毒的裂解效果和裂解过程中对有效抗原物质HA和NA的富集、纯化作用，但是忽略了对卵清蛋白等杂质的进一步去除。例如，在现有技术CN102068692A、CN103520716A、CN106668854A中公开了的流感裂解疫苗制备方法中，采用的是流感病毒裂解前纯化、流感病毒裂解后纯化和最终的洗滤纯化，现有技术CN104888212A中公开了的流感裂解疫苗制备方法中，采用了流感病毒裂解时纯化、裂解后纯化和最终洗滤纯化的纯化方式。通过三步纯化工艺能够大大降低流感病毒亚单位疫苗中的卵清蛋白、裂解剂和甲醛等杂质的含量，减少不良反应的发生，提高疫苗的安全性。但是疫苗中的卵清蛋白等杂质不可能完全去除，因而，需要在研发过程中不断改进工艺方法，尽可能的降低杂质的含量，提高有效抗原物质含量，不断提高产品的安全性和有效性。

发明内容

针对现有技术中的缺陷，本发明提供了一种可以降低杂质和提高有效抗原物质的流感疫苗制备方法。

本发明提供了一种流感疫苗制备方法，所述的制备方法采用了四步纯化工艺。

一种制备流感病毒亚单位疫苗的方法，所述方法的步骤包括：

(1)病毒的增殖、浓缩；(2)病毒裂解前纯化；(3)病毒的裂解；(4)裂解液的纯化；(5)裂解液的灭活；(6)灭活液的洗滤纯化。

所述的步骤(2)病毒裂解前纯化所用方法为密度梯度离心法；

所述的步骤(3)病毒的裂解为病毒裂解与蔗糖密度梯度离心同时进行。

优选的，所述的步骤(2)病毒裂解前纯化中包括：1)制作蔗糖密度梯度；2)上样与离心；3)加入液体进行循环；4)收集目标液。

具体的，所述的步骤(2)病毒裂解前纯化中包括：

1)配制蔗糖浓度梯度溶液，启动超速离心机，抽真空，排气泡，制作蔗糖密度梯度；

2)加入病毒浓缩液，同时，对病毒浓缩液进行离心；

3)病毒浓缩液加完后，加入液体进行循环；

4)收集目标液。

在本发明的具体实施例中，所述的步骤(2)病毒裂解前纯化中包括：

1)分别配制浓度为10％～20％、25％～35％、50％～60％的蔗糖溶液，启动超速离心机，在2000～4000rpm，15～25℃条件下抽真空，加入PBS或水或生理盐水排转子中气泡，依次加入浓度为10％～20％、25％～35％、50％～65％的蔗糖溶液制作蔗糖密度梯度；

2)设定转速20000～30000rpm、温度0～25℃、加入病毒浓缩液，控制流速为25～45ml/min，上样体积为3-7L/台次；

3)进样全部完毕后，加入PBS或水或生理盐水进行循环，循环时间为40～80min；

4)将离心机转速降到2000～4000rpm，20～60min后，从边孔打入蔗糖溶液，从中孔出液，收集目标液。

所述的步骤(3)病毒的裂解中具体采用病毒裂解与蔗糖密度梯度离心同时进行的方式，所述的蔗糖密度梯度离心液中含有蔗糖溶液与裂解剂。

所述的步骤(3)病毒的裂解中包括：

1)制作蔗糖密度梯度；2)上样与离心；3)加入液体进行循环；4)收集目标液。

优选的，所述的步骤(3)病毒的裂解中包括：

1)配制裂解剂，启动超速离心机，抽真空，排气泡，制作蔗糖密度梯度

2)加入步骤(2)得到的收集液，同时，对收集液进行离心；

3)收集液加完后，加入液体进行循环；

4)收集目标液。

所述的步骤(3)病毒的裂解中，所述的步骤1)配制裂解剂时，用浓度为10％～60％蔗糖溶液为溶剂配制浓度为0.1％～1.5％裂解剂，优选的，所述的配制得到裂解剂的浓度为1.5％。

所述的裂解剂为Triton X-100和/或Triton N-101，优选的，所述的裂解剂为Triton N-101。

所述的裂解剂中的溶剂为蔗糖溶液，优选的，所述的溶剂为15％～60％蔗糖溶液，例如，15％，20％，25％，30％，35％，40％，45％，50％，55％，60％的蔗糖溶液。

所述的步骤(3)病毒的裂解中，所述的步骤2)上样与离心中，在加入步骤(2)得到的收集液的同时对收集液进行离心，加入收集液时的流速为25～45ml/min，上样体积为3-7L/台次，优选的，加入收集液时的流速为30～40ml/min，上样体积为4-6L/台次，在20000～30000rpm、0～25℃条件下离心，优选的，在25000rpm、20℃条件下离心。

所述的步骤(3)病毒的裂解中，所述的步骤3)加入液体进行循环中，收集液加完后，加入液体进行循环，循环时间为40～80min，优选的，循环时间为60min，所述的液体为PBS或水或生理盐水，优选的，所述的液体为PBS。

所述的步骤(3)病毒的裂解中，所述的步骤4)收集目标液中，将离心机转速降到2000～4000rpm，20～60min后，优选的，将离心机转速降到3000rpm，30min后注入质量百分比为40％～60％的蔗糖溶液，优选的，注入质量百分比为50％～60％的蔗糖溶液，更优选的，注入质量百分比为60％的蔗糖溶液，根据紫外吸收曲线收集目的蛋白峰，收集蔗糖浓度为5％～30％之间的蛋白峰，优选的，收集蔗糖浓度为6％～25％之间的蛋白峰，更优选的，收集蔗糖浓度为9％～20％之间的蛋白峰。

所述的步骤(3)病毒的裂解中，制作的蔗糖密度梯度溶液中含有裂解剂，使病毒裂解与密度梯度离心同时进行。当血凝素(HA)与神经氨酸酶(NA)被裂解下来后，立刻进入相应的蔗糖区间，一方面流感病毒的有效抗原物质血凝素和神经氨酸酶进入到固定蔗糖区间，对血凝素和神经氨酸酶起到富集的作用，使流感病毒有效抗原物质得到纯化；另一方面病毒裂解与蔗糖密度梯度离心同时进行，既使病毒得到充分裂解，又减少了工艺程序和时间，降低了时间成本和人力成本。

优选的，所述的步骤(4)裂解液的纯化中是以凝胶层析，离子交换层析，吸附层析以及亲和层析中的一种或者两种以上的方法进行纯化。

优选的，所述的步骤(4)裂解液的纯化中是以凝胶层析法进行纯化。

优选的，所述的步骤(6)灭活液的洗滤纯化是对病毒灭活液进行洗滤去除杂质。

在本发明的实施方式中，所述的步骤(1)病毒的增殖、浓缩中包括：1)工作种子批毒种稀释；2)接种；3)培养；4)病毒收获；5)离心澄清合并；6)病毒合并液浓缩。

优选的，所述的步骤(1)病毒的增殖、浓缩中包括：

1)工作种子批毒种稀释到的终浓度为0.5lgEID50/ml～10lgEID50/ml；

2)按接种剂量为0.05ml/胚～2.0ml/胚的剂量接种于鸡胚尿囊腔；

3)培养的温度为30～38℃，培养的时间为24～96h进行培养；

4)筛选活鸡胚，将所述的活鸡胚置于0～10℃环境中，放置10～30h，收获尿囊液；

5)将单型流感病毒的尿囊液经离心澄清后合并为单价病毒合并液；

6)用100万截留分子量超滤膜对单价病毒合并液进行超滤浓缩，浓缩倍数10-100倍。

所述的步骤(1)病毒的增殖、浓缩中工作种子批毒种稀释到的终浓度为0.5lgEID50/ml～10lgEID50/ml，优选的，所述的终浓度为1.0lgEID50/ml～8lgEID50/ml，更优选的，所述的终浓度为1.5lgEID50/ml～6lgEID50/ml，特别优选的，所述的终浓度为2.0lgEID50/ml～5.0lgEID50/ml。

所述的步骤(1)病毒的增殖、浓缩中接种的剂量为0.05ml/胚～2.0ml/胚的剂量接种于鸡胚尿囊腔，优选的，所述的接种的剂量为0.1ml/胚～1.0ml/胚，更优选的，所述的接种的剂量为0.15ml/胚～0.5ml/胚，特别优选的，所述的接种的剂量为0.2ml/胚。

所述的步骤(1)病毒的增殖、浓缩中培养的温度为30～38℃，优选的，所述的培养的温度为32～37℃，更优选的，所述的培养的温度为33～35℃，例如，33℃，33.5℃，34℃，34.5℃，35℃；所述的培养的时间为24～96h，优选的，所述的培养的时间为36～84h，更优选的，所述的培养的时间为48～72h，例如，48h，54h，60h，66h，72h。

所述的步骤(1)病毒的增殖、浓缩中，筛选活鸡胚，将所述的活鸡胚置于0～10℃环境中，优选的，将所述的活鸡胚置于2～8℃环境中，例如，2℃，3℃，4℃，5℃，6℃，7℃，8℃，放置10～30h，优选的，放置12～24h，例如，12h，13h，14h，15h，16h，17h，18h，19h，20h，21h，22h，23h，24h，收获尿囊液。

所述的步骤(1)病毒的增殖、浓缩中，用100万截留分子量超滤膜对单价病毒合并液进行超滤浓缩，浓缩倍数10-100倍，优选的，所述的浓缩倍数20-60倍，例如，20倍，30倍，40倍，50倍，60倍。

所述的步骤(5)裂解液的灭活中，用甲醛，戊二醛，高锰酸钾，环氧乙烷，过氧乙酸，过氧化氢，二氧化氯，辛酸盐，β-丙内酯中的一种或两种以上对纯化得到的蛋白进行灭活。

所述的制备流感病毒亚单位疫苗的方法还包括步骤(7)半成品配制，优选的，所述的步骤(7)半成品配制中，根据各单价原液的血凝素含量，将各型流感病毒按同一血凝素含量进行半成品配制。

所述的(7)半成品配制步骤中，根据各单价原液的血凝素含量，将各型流感病毒按同一血凝素含量进行半成品配制，即为半成品。

本发明第二方面提供了一种流感病毒亚单位疫苗，所述的疫苗是由上述方法制备得到，所述的疫苗是用于预防由甲型流感病毒，乙型流感病毒，丙型流感病毒引起的流感，例如，由HANA流感病毒、B型流感病毒引起的流感，所述HA是指H1～H16，所述NA是指N1～N10，所述HANA是由H1～H16与N1～N10排列组合成的，具体的如，由H1N1，H1N5，H2N2，H3N2，H5N1，H7N9，H9N2等引起的流感，所述B型流感病毒包括两个谱系：Victoria系与Yamagata系，即BV与BY。

本发明提供的四步纯化工艺生产的流感疫苗中卵清蛋白等杂质含量显著降低，而且，在病毒裂解的同时进行密度梯度离心纯化，既增强了病毒裂解的效果，又对HA和NA进行富集纯化，保证了有效抗原物质的含量，弥补了现有三步纯化工艺的不足，既降低了疫苗中卵清蛋白的含量，又增强了病毒裂解效果，提高了HA等有效抗原物质的含量，提升了流感疫苗的安全性和有效性。

附图说明

图1所示为裂解前纯化加单独裂解工艺处理的流感病毒裂解电镜图片。

图2所示为裂解前纯化加裂解时纯化工艺处理的流感病毒裂解电镜图片。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

(1)病毒的增殖、浓缩

将工作种子批毒种稀释到终浓度为2.0lgEID50/ml后，以0.2ml/胚的剂量接种于鸡胚尿囊腔，置33℃培养48小时，筛选活鸡胚，置4℃冷胚12小时后，收获尿囊液，单型流感病毒的尿囊收获液经离心澄清后合并为单价病毒合并液，用100万截留分子量超滤膜对单价病毒合并液进行超滤浓缩，浓缩倍数20倍。

(2)病毒裂解前纯化

分别配制15％、30％和60％蔗糖溶液，将转子装入超速离心机，启动并安装转头，关闭舱门，同时设定转速1000rpm，待转头稳定后，开始抽真空，温度20℃。抽真空结束后，设定转速为3000rpm，采用中路和边路多次倒换进PBS以排空转子中气泡。排完气泡开始制作蔗糖密度梯度，由边孔进液，中孔出液，依次进15％蔗糖溶液、30％蔗糖溶液、60％蔗糖溶液。梯度制作完成后，设定转速25000rpm，温度20℃，从中孔进样加入病毒浓缩液，控制流速为流速至30ml/min，上样体积为6L/台次，进样全部完毕后，改为PBS循环1h。循环完毕后，降速至3000rpm，在3000rpm等待30min后，由边孔进60％的蔗糖，从中孔出液，根据紫外吸收曲线收集目的蛋白峰，检测各段蛋白峰的血凝滴度，选择血凝滴度最大的蛋白峰的收集液进行下步实验。

(3)病毒的裂解

分别用15％、30％蔗糖溶液配制裂解剂终浓度不高于1.5％的Triton N-101和蔗糖混合溶液，置于15℃。将转子装入超速离心机，启动并安装转头，关闭舱门，同时设定转速1000rpm，待转头稳定后，开始抽真空，温度20℃。抽真空结束后，设定转速为3000rpm，采用中路和边路多次倒换进PBS以排空转子中气泡。排完气泡开始制作蔗糖密度梯度，由边孔进液，中孔出液，依次进15％Triton N-101和蔗糖混合溶液、30％Triton N-101和蔗糖混合溶液以及60％蔗糖溶液。梯度制作完成后，设定转速25000rpm，温度20℃，从中孔进样加入初次纯化的收集液，控制流速为流速至30ml/min，上样体积为6L/台次，进样全部完毕后，改为PBS循环1h。循环完毕后，降速至3000rpm，在3000rpm等待30min后，由边孔进60％的蔗糖，从中孔出液，根据紫外吸收曲线收集目的蛋白峰，收集蔗糖浓度为9％～20％之间的蛋白峰。

(4)裂解液的纯化

以Sephadex-G25为介质进行凝胶层析，洗脱液为0.01mol/L磷酸盐缓冲液，根据紫外吸收曲线收集层析液，经稀释、除菌过滤，对除菌过滤后层析液的蛋白质含量进行检测，应不高于2500μg/ml，如果高于2500μg/ml应稀释至该浓度。

(5)裂解液的灭活

在除菌过滤后的层析液中加入终浓度为200μg/ml的甲醛置4℃灭活2天。

(6)灭活液的洗滤纯化

对病毒灭活液进行洗滤，去除甲醛等杂质，再经除菌过滤后即为单价原液。

实施例2

一种四价流感病毒亚单位疫苗，所述每剂四价流感病毒亚单位疫苗中含有H1N1型、H3N2型及B型的两个谱系BY和BV毒株，每价抗原含量为30～36μg/mL。

(1)病毒的增殖、浓缩

将工作种子批毒种稀释到终浓度为5.0lgEID50/ml范围内后，以0.2ml/胚的剂量接种于鸡胚尿囊腔，置35℃培养72小时，筛选活鸡胚，置8℃冷胚24小时后，收获尿囊液，单型流感病毒的尿囊收获液经离心澄清后合并为单价病毒合并液。用100万截留分子量超滤膜对单价病毒合并液进行超滤浓缩，浓缩倍数60倍。

(2)病毒裂解前纯化

分别配制15％、30％和60％蔗糖溶液，将转子装入超速离心机，启动并安装转头，关闭舱门，同时设定转速1000rpm，待转头稳定后，开始抽真空，温度20℃。抽真空结束后，设定转速为3000rpm，采用中路和边路多次倒换进PBS以排空转子中气泡。排完气泡开始制作蔗糖密度梯度，由边孔进液，中孔出液，依次进15％蔗糖溶液、30％蔗糖溶液、60％蔗糖溶液。梯度制作完成后，设定转速25000rpm，温度20℃，从中孔进样加入病毒浓缩液，控制流速为流速至40ml/min，上样体积为4L/台次，进样全部完毕后，改为PBS循环1h。循环完毕后，降速至3000rpm，在3000rpm等待30min后，由边孔进60％的蔗糖，从中孔出液，根据紫外吸收曲线收集目的蛋白峰，检测各段蛋白峰的血凝滴度，选择血凝滴度最大的蛋白峰的收集液进行下步实验。

(3)病毒的裂解

分别用15％、30％蔗糖溶液配制裂解剂终浓度不高于1.5％的Triton N-101和蔗糖混合溶液，置于15～25℃。将转子装入超速离心机，启动并安装转头，关闭舱门，同时设定转速1000rpm，待转头稳定后，开始抽真空，温度20℃。抽真空结束后，设定转速为3000rpm，采用中路和边路多次倒换进PBS以排空转子中气泡。排完气泡开始制作蔗糖密度梯度，由边孔进液，中孔出液，依次进15％Triton N-101和蔗糖混合溶液、30％Triton N-101和蔗糖混合溶液以及60％蔗糖溶液。梯度制作完成后，设定转速25000rpm，温度20℃，从中孔进样加入初次纯化的收集液，控制流速为流速至30～40ml/min，上样体积为4-6L/台次，进样全部完毕后，改为PBS循环1h。循环完毕后，降速至3000rpm，在3000rpm等待30min后，由边孔进60％的蔗糖，从中孔出液，根据紫外吸收曲线收集目的蛋白峰，收集蔗糖浓度为9％～20％之间的蛋白峰。

(4)裂解液的纯化

以Sephadex-G25为介质进行凝胶层析，洗脱液为0.01mol/L磷酸盐缓冲液，根据紫外吸收曲线收集层析液，经稀释、除菌过滤，对除菌过滤后层析液的蛋白质含量进行检测，应不高于2500μg/ml，如果高于2500μg/ml应稀释至该浓度。

(5)裂解液的灭活

在除菌过滤后的层析液中加入终浓度为200μg/ml的甲醛置8℃灭活2天。

(6)灭活液的洗滤纯化

对病毒灭活液进行洗滤，去除甲醛等杂质，再经除菌过滤后即为单价原液。

(7)半成品配制

根据各单价原液的血凝素含量，将各型流感病毒按同一血凝素含量进行半成品配制(血凝素配制量可在30～36μg/ml范围内，每年各型流感病毒株应按同一血凝素含量进行配制)，即为半成品。

实施例3不同纯化工艺的流感病毒裂解电镜图

一、材料：

H1N1型流感病毒浓缩液

二、方法：

将H1N1型流感病毒浓缩液，分别采用两种不同的病毒纯化工艺进行裂解。

第一种是现有三步纯化法采用的裂解前纯化加单独裂解工艺：先将病毒浓缩液进行蔗糖密度梯度离心，以紫外分光光度计记录在280nm处的吸光值，检测各区段的血凝滴度，收集血凝滴度高的目的峰作为病毒纯化液，再向病毒纯化液中按照终浓度1.0％加入Triton N-101裂解剂，裂解时间为4h，期间每隔15min摇晃一次，裂解结束后取样做电镜检测。

第二种是本专利所述裂解前纯化加裂解时纯化工艺：将病毒浓缩液采用本专利所述的方法先进行裂解前密度梯度离心纯化，收集血凝滴度最大的纯化液进行裂解时密度梯度离心纯化，裂解剂终浓度为1.0％，裂解时间为4h，收集蔗糖浓度为9％～20％之间的蛋白峰，取样做电镜检测。

三、结果分析：

使用不同纯化工艺对流感病毒进行裂解处理并进行电镜观察发现，在裂解剂种类、裂解剂浓度和裂解时间相同的情况下，采用裂解前纯化加单独裂解工艺处理的样品视野中有未完全裂解的病毒颗粒(图1)，而采用裂解前纯化加裂解时纯化工艺处理的样品视野中，流感病毒裂解较充分，未见完整病毒颗粒(图2)。这说明本专利所述的四步纯化法中裂解前纯化加裂解时纯化工艺对流感病毒的裂解效果要比现有的三步纯化法中采用裂解前纯化加单独裂解的工艺更好。

实施例4不同纯化工艺的单价原液血凝素含量

一、材料：

H1N1型流感病毒浓缩液

二、方法：

将H1N1型流感病毒浓缩液，分别采用两种不同的病毒纯化工艺制备单价原液。

方法一：采用流感病毒裂解前纯化、流感病毒裂解后纯化和最终的洗滤纯化的三步纯化法，此法中间病毒裂解为单独步骤，采用手工摇晃法，1.0％Triton N-101裂解剂，裂解时间为4h，其余步骤同本专利所述方法。

方法二：采用本专利所述四步纯化法制备单价原液。

血凝素检测采用单向免疫扩散法。将抗原参考品和供试品分别加至含有相应抗体参考品的1.5％琼脂糖凝胶板上，孔径为4mm，每孔10μl，20～25℃放置至少18小时。用PBS浸泡1小时后，压胶、干燥、染色、脱色。准确测量抗原参考品和供试品形成的沉淀环直径，以抗原参考品形成的沉淀环直径对其相应抗原浓度作直线回归，求得直线回归方程，代入供试品的沉淀环直径，即可得到供试品的血凝素含量。

三、结果分析：

对采用不同纯化工艺制备的H1N1型单价原液测定血凝素含量发现，采用三步纯化法(流感病毒裂解前纯化、流感病毒裂解后纯化和最终的洗滤纯化)制备的三个批次单价原液血凝素含量平均值为183.1μg/ml，该测定值小于采用四步纯化法制备的三批单价原液的血凝素含量平均值208.6μg/ml，且两种方法的测定值具有显著差异，因此，本发明所述的四步纯化法比现有的三步纯化法(流感病毒裂解前纯化、流感病毒裂解后纯化和最终的洗滤纯化)提升了对有效抗原物质HA的富集和纯化作用，提高了HA的含量。

表1不同纯化工艺制备单价原液的血凝素含量

实施例5不同纯化工艺生产的四价流感病毒亚单位疫苗中卵清蛋白含量

一、材料：

H1N1、H3N2、BY和BV四个型流感病毒浓缩液

二、方法：

将四种型别流感病毒浓缩液，分别采用两种不同的病毒纯化工艺制备四价流感病毒亚单位疫苗。

方法一：采用流感病毒裂解时纯化、裂解后纯化和最终的洗滤纯化的三步纯化法。

方法二：采用本发明所述四步纯化法。

三、结果分析：

从实验结果可以看出，采用三步纯化法制备的三批四价流感病毒亚单位疫苗中卵清蛋白的含量平均值为119.3ng/ml，而采用本专利所述的四步纯化法制备的四价流感病毒亚单位疫苗中卵清蛋白的含量平均值为45.7ng/ml，四步纯化法制备的疫苗中卵清蛋白杂质的含量更低。

表2不同纯化工艺制备四价流感病毒亚单位疫苗的卵清蛋白含量

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种制备流感病毒亚单位疫苗的方法，所述方法的步骤包括：(1)病毒的增殖、浓缩；(2)病毒裂解前纯化；(3)病毒的裂解；(4)裂解液的纯化；(5)裂解液的灭活；(6)灭活液的洗滤纯化，其特征在于，所述的步骤(2)病毒裂解前纯化所用方法为密度梯度离心法，

所述的步骤(3)病毒的裂解为病毒裂解与蔗糖密度梯度离心同时进行。

2.根据权利要求1所述的一种制备流感病毒亚单位疫苗的方法，其特征在于，所述的步骤(2)病毒裂解前纯化中包括：1)制作蔗糖密度梯度；2)上样与离心；3)加入液体进行循环；4)收集目标液。

3.根据权利要求1所述的一种制备流感病毒亚单位疫苗的方法，其特征在于，所述的步骤(3)病毒的裂解中包括：1)制作蔗糖密度梯度；2)上样与离心；3)加入液体进行循环；4)收集目标液。

4.根据权利要求1所述的一种制备流感病毒亚单位疫苗的方法，其特征在于，所述的步骤(4)裂解液的纯化中是以凝胶层析，离子交换层析，吸附层析以及亲和层析中的一种或者两种以上的方法进行纯化。

5.根据权利要求1所述的一种制备流感病毒亚单位疫苗的方法，其特征在于，所述的步骤(6)灭活液的洗滤纯化是对病毒灭活液进行洗滤去除杂质。

6.根据权利要求1所述的一种制备流感病毒亚单位疫苗的方法，其特征在于，所述的步骤(1)病毒的增殖、浓缩中包括：1)工作种子批毒种稀释；2)接种；3)培养；4)病毒收获；5)离心澄清合并；6)病毒合并液浓缩。

7.根据权利要求1所述的一种制备流感病毒亚单位疫苗的方法，其特征在于，所述的步骤(5)裂解液的灭活中，用甲醛，戊二醛，高锰酸钾，环氧乙烷，过氧乙酸，过氧化氢，二氧化氯，辛酸盐，β-丙内酯中的一种或两种以上对纯化得到的蛋白进行灭活。

8.根据权利要求1所述的一种制备流感病毒亚单位疫苗的方法，其特征在于，所述的制备流感病毒亚单位疫苗的方法还包括步骤(7)半成品配制。

9.一种流感病毒亚单位疫苗，所述的疫苗的制备方法为：(1)病毒的增殖、浓缩；(2)病毒裂解前纯化；(3)病毒的裂解；(4)裂解液的纯化；(5)裂解液的灭活；(6)灭活液的洗滤纯化，其特征在于，所述的疫苗是用于预防由甲型流感病毒，乙型流感病毒，丙型流感病毒引起的流感。

10.根据权利要求9所述的一种流感病毒亚单位疫苗，其特征在于，所述的流感由HANA流感病毒和/或B型流感病毒引起的流感，所述HA是指H1～H16，所述NA是指N1～N10，所述HANA是由H1～H16与N1～N10排列组合成的，所述B型流感病毒选自Victoria系和/或Yamagata系。