RU2683508C1 - Штамм вируса для изготовления вакцинных препаратов против геморрагической лихорадки с почечным синдромом (варианты) - Google Patents
Штамм вируса для изготовления вакцинных препаратов против геморрагической лихорадки с почечным синдромом (варианты) Download PDFInfo
- Publication number
- RU2683508C1 RU2683508C1 RU2018118856A RU2018118856A RU2683508C1 RU 2683508 C1 RU2683508 C1 RU 2683508C1 RU 2018118856 A RU2018118856 A RU 2018118856A RU 2018118856 A RU2018118856 A RU 2018118856A RU 2683508 C1 RU2683508 C1 RU 2683508C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- vero
- virus
- strain
- hemorrhagic fever
- sochi
- Prior art date
Links
- 241000700605 Viruses Species 0.000 title claims abstract description 65
- 208000032982 Hemorrhagic Fever with Renal Syndrome Diseases 0.000 title claims abstract description 32
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 title claims abstract description 24
- 229940079593 drug Drugs 0.000 title description 3
- 239000003814 drug Substances 0.000 title description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims abstract description 21
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 claims abstract description 19
- 210000003292 kidney cell Anatomy 0.000 claims abstract description 11
- 230000002265 prevention Effects 0.000 claims abstract description 8
- 241000150347 Bunyavirales Species 0.000 claims abstract description 6
- 241000150362 Hantaviridae Species 0.000 claims abstract description 6
- 241000150562 Hantaan orthohantavirus Species 0.000 claims abstract description 5
- 241000150528 Dobrava-Belgrade orthohantavirus Species 0.000 claims abstract description 3
- 241000867607 Chlorocebus sabaeus Species 0.000 claims description 10
- 238000011321 prophylaxis Methods 0.000 claims description 2
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 claims 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 abstract description 12
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 2
- 244000025254 Cannabis sativa Species 0.000 abstract 2
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 abstract 2
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 40
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 15
- 238000000034 method Methods 0.000 description 13
- 239000002356 single layer Substances 0.000 description 12
- 210000003501 vero cell Anatomy 0.000 description 12
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 12
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 10
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 10
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 8
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 8
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 8
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 7
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 7
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 7
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 7
- 241000150452 Orthohantavirus Species 0.000 description 6
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 6
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 6
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 6
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 6
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 6
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 6
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 6
- 239000012531 culture fluid Substances 0.000 description 5
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 5
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 5
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 4
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 4
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 4
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 4
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 4
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 4
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 4
- 210000002845 virion Anatomy 0.000 description 4
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 4
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 4
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 4
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 4
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 3
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 3
- 230000006978 adaptation Effects 0.000 description 3
- WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K aluminium hydroxide Chemical compound [OH-].[OH-].[OH-].[Al+3] WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 3
- 235000013399 edible fruits Nutrition 0.000 description 3
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 3
- 238000004264 monolayer culture Methods 0.000 description 3
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 3
- 230000001902 propagating effect Effects 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 2
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- 101710118046 RNA-directed RNA polymerase Proteins 0.000 description 2
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 2
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 2
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 2
- GPKUGWDQUVWHIC-UHFFFAOYSA-N [4-(4-hydrazinylphenyl)phenyl]hydrazine tetrahydrochloride Chemical compound Cl.Cl.Cl.Cl.NNC1=CC=C(C=C1)C1=CC=C(NN)C=C1 GPKUGWDQUVWHIC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 2
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 2
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 2
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 2
- 244000309466 calf Species 0.000 description 2
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 231100000676 disease causative agent Toxicity 0.000 description 2
- 239000002270 dispersing agent Substances 0.000 description 2
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 2
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 2
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 2
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 2
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 2
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 239000012678 infectious agent Substances 0.000 description 2
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 2
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 2
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 2
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 229920000609 methyl cellulose Polymers 0.000 description 2
- 239000001923 methylcellulose Substances 0.000 description 2
- 235000010981 methylcellulose Nutrition 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 229940031346 monovalent vaccine Drugs 0.000 description 2
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 2
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 2
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 2
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 2
- 241000894007 species Species 0.000 description 2
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 2
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 2
- 230000017613 viral reproduction Effects 0.000 description 2
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 description 1
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 description 1
- 102000016911 Deoxyribonucleases Human genes 0.000 description 1
- 108010053770 Deoxyribonucleases Proteins 0.000 description 1
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 208000008913 Hantavirus Infections Diseases 0.000 description 1
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 1
- 102000012750 Membrane Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108010090054 Membrane Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 108090001074 Nucleocapsid Proteins Proteins 0.000 description 1
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 1
- 241000713112 Orthobunyavirus Species 0.000 description 1
- 239000008118 PEG 6000 Substances 0.000 description 1
- 229920002584 Polyethylene Glycol 6000 Polymers 0.000 description 1
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 description 1
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 1
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 1
- 108010067390 Viral Proteins Proteins 0.000 description 1
- 108020000999 Viral RNA Proteins 0.000 description 1
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 1
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 1
- 230000003044 adaptive effect Effects 0.000 description 1
- 239000003463 adsorbent Substances 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- XKMRRTOUMJRJIA-UHFFFAOYSA-N ammonia nh3 Chemical compound N.N XKMRRTOUMJRJIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002075 anti-alcohol Effects 0.000 description 1
- 230000000840 anti-viral effect Effects 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 108010058966 bacteriophage T7 induced DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M caesium chloride Chemical compound [Cl-].[Cs+] AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 108091092356 cellular DNA Proteins 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 230000000120 cytopathologic effect Effects 0.000 description 1
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 1
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 1
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 1
- 230000007850 degeneration Effects 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 230000012202 endocytosis Effects 0.000 description 1
- 210000001163 endosome Anatomy 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- -1 for example Substances 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 210000002288 golgi apparatus Anatomy 0.000 description 1
- 208000029629 hantavirus infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- 238000007654 immersion Methods 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 238000010166 immunofluorescence Methods 0.000 description 1
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 1
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 1
- 229940031551 inactivated vaccine Drugs 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 238000010255 intramuscular injection Methods 0.000 description 1
- 239000007927 intramuscular injection Substances 0.000 description 1
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 230000020477 pH reduction Effects 0.000 description 1
- 230000035515 penetration Effects 0.000 description 1
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 230000003449 preventive effect Effects 0.000 description 1
- 230000000644 propagated effect Effects 0.000 description 1
- 229940021993 prophylactic vaccine Drugs 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 1
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 1
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 1
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 1
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 1
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 1
- 229940126581 whole-virion vaccine Drugs 0.000 description 1
- 239000012224 working solution Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Virology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
Изобретение относится к области биотехнологии. Изобретение представляет собой штамм ДОБ-СОЧИ/VERO (DOB-SOCHI/VERO) вируса Добрава/Белград (Dobrava-Belgrade orthohantavirus, семейство Hantaviridae, отряд Bunyavirales), депонированный под №1282 в Государственной коллекции вирусов (Институт вирусологии им. Д.И. Ивановского ФГБУ «НИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России), адаптированный к размножению в культуре клеток почек зеленой мартышки Vero, предназначенный для изготовления вакцинных препаратов для специфической профилактики геморрагической лихорадки с почечным синдромом, а также штамм XTH-P88/VERO (HTN-P88/VERO) вируса Хантаан (Hantaan orthohantavirus, семейство Hantaviridae, отряд Bunyavirales), депонированный под №1283 в Государственной коллекции вирусов (Институт вирусологии им. Д.И. Ивановского ФГБУ «НИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России), адаптированный к размножению в культуре клеток почек зеленой мартышки Vero, предназначенный для изготовления вакцинных препаратов для специфической профилактики геморрагической лихорадки с почечным синдромом. 2 н.п. ф-лы, 1 табл., 1 пр.
Description
Изобретение относится к области вирусологии, в частности, к получению штаммов-продуцентов, предназначенных для вакцинопрофилактики вирусных инфекций, а именно хантавирусной инфекции - геморрагической лихорадки с почечным синдромом (ГЛПС). Возбудителями ГЛПС являются 4 вируса: ПУУМАЛА (ПУУ), ХАНТААН (ХТН), СЕУЛ (СЕУ) и ДОБРАВА/БЕЛГРАД (ДОБ), которые циркулируют среди диких мышевидных грызунов и могут заражать людей, вызывая у них тяжёлое заболевание. Наиболее тяжелое клиническое течение ГЛПС вызывают: геновариант вируса ДОБ – вирус СОЧИ (ДОБ-СОЧИ) и вирус ХТН с летальностью 14% и 6% соответственно. Образцы вирусов, полученные в результате выделения вирусологическими методами из крови больных ГЛПС и органов погибших от ГЛПС людей или инфицированных животных, называются штаммами выше перечисленных вирусов – возбудителей ГЛПС. После детального изучения молекулярно-биологических характеристик штаммы могут быть использованы для изготовления диагностических и вакцинных препаратов.
Известно, что трудности, связанные с разработкой вакцинных препаратов против хантавирусов – возбудителей ГЛПС обусловлены особенностями репродукции штаммов этих вирусов в чувствительных клеточных системах. Для них характерен довольно длительный цикл размножения, низкий уровень продукции и отсутствие цитопатогенного действия. В связи с этим основное затруднение состоит в адаптации штаммов к разрешенной для вакцинного производства перевиваемой культуре клеток Vero.
Задачей предлагаемого изобретения является разработка вакцинного препарата и способа производства вакцинного препарата для профилактики геморрагической лихорадки с почечным синдромом. Указанная задача решается при помощи получения впервые в мире штамма вируса ДОБ-СОЧИ, а также штамма вируса ХТН, способных к размножению в разрешенной для вакцинного производства перевиваемой культуре клеток Vero с накоплением вирусной массы в количествах, достаточных для изготовления вакцинных препаратов для специфической профилактики ГЛПС.
Описываемое изобретение включает в себя штамм ДОБ-СОЧИ/VERO (DOB-SOCHI/VERO) вируса Добрава/Белград (Dobrava-Belgrade orthohantavirus, семейство Hantaviridae, отряд Bunyavirales), депонированный под №1282 в Государственной коллекции вирусов (Институт вирусологии им. Д.И. Ивановского ФГБУ «НИЦЭМ им. Н. Ф. Гамалеи» Минздрава России), адаптированный к размножению в культуре клеток почек зелёной мартышки Vero, предназначенный для изготовления вакцинных препаратов для специфической профилактики геморрагической лихорадки с почечным синдромом, а также его производные.
Описываемое изобретение также включает в себя штамм ХТН-Р88/VERO (HTN-P88/VERO) вируса Хантаан (Hantaan orthohantavirus, семейство Hantaviridae, отряд Bunyavirales), депонированный под №1283 в Государственной коллекции вирусов (Институт вирусологии им. Д.И. Ивановского ФГБУ «НИЦЭМ им. Н. Ф. Гамалеи» Минздрава России), адаптированный к размножению в культуре клеток почек зелёной мартышки Vero, предназначенный для изготовления вакцинных препаратов для специфической профилактики геморрагической лихорадки с почечным синдромом, а также его производные.
В описании данного изобретения термины «включает» и «включающий» интерпретируются как означающие «включает, помимо всего прочего». Указанные термины не предназначены для того, чтобы их истолковывали как «состоит только из».
Если не определено отдельно, технические и научные термины в данной заявке имеют стандартные значения, общепринятые в научной и технической литературе.
Термин «антиген» обозначает любое вещество, которое организм субъекта рассматривает как чужеродное или потенциально опасное и против которого организм может индуцировать (запускать) иммунный ответ. Это могут быть компоненты инфекционного агента, такие как, например, фрагменты белков вируса или бактерии, а также инфекционные агенты, сохранившие, хотя бы частично, присущую им структуру.
Термин «производные» для штаммов вирусов, депонированных под номерами №1282 и №1283 в Государственной коллекции вирусов (Институт вирусологии им. Д.И. Ивановского ФГБУ «НИЦЭМ им. Н. Ф. Гамалеи» Минздрава России), обозначает вирусы, полученные из исходных вирусов, депонированных под номерами №1282 и №1283, имеющие схожие характеристики репликации, но отличающиеся в одной или нескольких областях генома. Под характеристиками репликации следует понимать способность и скорость размножения в культуре клеток почек зелёной мартышки Vero, а также способность к размножению в мышах линии Balb/c.
В предлагаемом изобретении описаны вакцинные штаммы ДОБ-СОЧИ/VERO и ХТН-Р88/VERO, способные к размножению в перевиваемой культуре клеток почек зелёной мартышки, линии Vero (ATCC CCL-81), и используемые для накопления вирусной массы с целью изготовления профилактической вакцины против ГЛПС.
Методика выделения вирусных штаммов.
Исходно штаммы Орлова/Сочи-09 и P-88/Хабаровск-89 были выделены в наиболее пермиссивной для размножения хантавирусов культуре клеток почек зелёной мартышки, линии Vero-E6 (ATCC CRL-13001): первый - из крови больной из Сочи, погибшей от ГЛПС в 2009 г., второй из крови больного ГЛПС из Хабаровска в 1989 г.
Клетки Vero-E6 выращивают на среде 2МЕМ с 5% телячьей сыворотки. В качестве поддерживающей рост клеток (после заражения) применяют ту же среду с 1% телячьей сыворотки. Для изоляции вируса в клетках Vero-E6 использовали цельную кровь, взятую в остром периоде болезни от больного ГЛПС. Через 10-12 дней культивирования при 37 °С заражённые клетки снимают со стекла для выявления вирусспецифического антигена, после чего ими заражают свежие клетки. Выявление вирусного антигена осуществляют с помощью непрямого метода флюоресцирующих антител (МФА). Для приготовления препаратов для исследования в МФА клетки снимают со стекла смесью 0,02% версена и 2,5% трипсина, готовят суспензию инфицированных клеток (450-550 тыс. кл/мл) и вносят её по 0,005 мл в лунки предметных стёкол для иммунофлюоресценции. После высушивания стёкла помещают на 20 минут в охлажденный ацетон для фиксации клеток и затем высушивают при комнатной температуре. На готовые препараты наносят соответственно референс сыворотки от больных ГЛПС с антителами к известным вирусам-возбудителям ГЛПС в разведениях, начиная с 1:64 и заканчивая разведением, соответствующим титру сыворотки, а также нормальную сыворотку, не содержащую антител к возбудителям ГЛПС, в разведениях с 1:16 до 1:64. Препараты помещают во влажную камеру и инкубируют при 37±1 °С в течение 30 мин (или при 6±2 °С в течение 18 час). После окончания экспозиции препараты 3-кратно отмывают физиологическим раствором (0,85% NaCl), промывают дистиллированной водой, высушивают и наносят на них ФИТЦ-конъюгат против иммуноглобулинов человека. Препараты помещают во влажную камеру и инкубируют при 37±1 0С в течение 30 мин. После чего их 3-х кратно промывают физиологическим раствором и 1-кратно дистиллированной водой, высушивают и исследуют с помощью люминесцентного микроскопа, используя водно-иммерсионный объектив х 65. Аналогичные процедуры исследования клеток на присутствие вирусспецифического антигена повторяют с той же периодичностью после каждого из 5-6 пассажей инфицированных клеток. В случае обнаружения специфического антигена в клетках проводят сбор культурального вируса, который затем помещают на хранение в дъюар с жидким азотом.
После выделения и закрепления в 10 пассажах в культуре клеток Vero-E6 штаммы подвергли адаптированию к размножению в культуре клеток линии Vero.
Методика адаптации штаммов заключается в следующем.
Для первичного заражения клеток Vero используют вируссодержащую суспензию клеток Vero-E6, инфицированных штаммами Орлова/Сочи-09 и P-88/Хабаровск-89 . Вирус (в ампулах или пробирках) извлекают из жидкого азота, оттаивают при комнатной температуре или в водяной бане (18±1) °С и разводят средой Игла МЕМ с двойным содержанием аминокислот и витаминов до концентрации, обеспечивающей множественность заражения 0,1-0,5 фокус образующих единиц (ФОЕ) на клетку. Культуру клеток Vero перед заражением дважды отмывают рабочим pacтвopoм Хенкса, после чего в 1 л роллерную бутыль с монослоем клеток вносят 15 мл инокулята вируса. Для адсорбции вируса на клетки, зараженные бутыли помещают в роллерную установку и инкубируют 1 час при температуре (37±I) °C. Пo истечении указанного времени в каждую бутыль вносят 100 мл поддерживающей среды Игла MEM с двойным содержанием аминокислот и витаминов (без добавления сыворотки крови плодов коров) и снова помещают в роллерную установку в термостатную комнату с температурой (37±I) °C. Сбор вируса осуществляют на 8-10 день с момента заражения клеток. Перед сбором вируса бутыли с зараженной культурой просматривают под микроскопом. Выбраковывают флаконы с признаками дегенерации клеток и бактериальной контаминацией. После удаления поддерживающей среды в зараженные флаконы вносят по 25-30 мл диспергента 0,02%-ный раствор версена, подогретого в термостате до температуры (36±1) °С. Поворачивая флакон, обмывают этим раствором весь монослой клеток, затем диспергент стерильно удаляют и обеззараживают автоклавированием. Культуру клеток оставляют при температуре (18±2) °С до тех пор, пока клетки не начнут отслаиваться от стекла. Отслоившиеся зараженные клетки ресуспендируют в минимальном объёме вируссодержащей культуральной жидкости, предварительно отобранной из флакона с зараженной культурой (15 мл на 1 литровый роллерный флакон). Клеточную взвесь из всех зараженных флаконов объединяют, 3-х кратно замораживают при температуре минус (70±1) °С, оттаивают при температуре (18±2) °С и стерильно разливают по (1,5±0,1) мл в криогенные пробирки, маркируют и хранят пpи температуре минус (70±2) °С. Аналогичные процедуры применяют при последующих пассажах, при этом, материалы каждого пассажа исследуют на содержание инфекционного вируса с помощью метода фокусобразующих единиц (ФОЕ). Монослой клеток Vero-E6, выращенных в 24-луночных панелях (фирма Costar), заражают 10-кратными разведениями вируссодержащей культуральной жидкости. После контакта с клетками при 37±1° С в течение 1 часа инокулят удаляют и вносят 0,6% метилцеллюлозное покрытие (800 мкл на лунку). После инкубации при 37±1° С в течение 6 - 8 суток, полужидкое покрытие удаляют, клетки однократно отмывают 0,85% раствором NaCl. Для фиксации монослоя клеток вносят в лунки панели по 400 мкл 96 % спирта и после 20 минутной экспозиции при комнатной температуре спирт удаляют, клетки 3-х кратно по 10 мин отмывают 0,85% раствором NaCl и вносят в каждую лунку по 200 мкл специфической анти-ХТН или анти-ДОБ сыворотки в дозе 16 - 32 ед. После контакта при 37±1 °С в течение 60 мин клетки 3-х кратно по 5 мин отмывают 0,85% раствором NaCl, вносят в лунки по 200 мкл меченные пероксидазой хрена белок «А». После контакта в течение 60 мин при 37±1° С или 18 час при 6±2° С клетки 3-х кратно по 10 мин отмывают 0,85% раствором NaCl и вносят индикатор пероксидазы хрена. В качестве субстрат-индикаторной системы применяют 0,05% диаминобензидин тетрахлорид с добавлением 0,02% NiCl2 и 0,01% Н2О2, после чего через 15-20 мин. проводят учёт опыта. Количество инфицированных колоний клеток в виде темно-серых пятен определяют визуально, и титр вируса выражают в виде lg ФОЕ в 1 мл вносимого для инфицирования клеток образца.
На уровне 7-го пассажа в клетках Vero штаммы Орлова/Сочи-09 и P-88/Хабаровск-89 очищают от клеточной ДНК путём обработки дезоксирибонуклеазой в концентрации 0,3 мкг/мл в оптимальных для этого фермента условиях. При этом, по данным метода молекулярной гибридизации, концентрация клеточной ДНК снижается до уровня менее 10 пг/мл. Далее вирус концентрируют осаждением при помощи 7,5 %-ного раствора ПЭГ-6000 при температуре (6±2) °С в течение (18±2) часов и очищают зональным центрифугированием (25.000 об/мин, 3,5 час, 5°С) в градиенте плотности сахарозы (5-20%) с последующей фильтрацией через мембранный фильтр с диаметром пор 0,22 мкм.
Полученными материалами штаммов Орлова/Сочи-09 и P-88/ Хабаровск-89 заражают культуру клеток Vero и пассируют в этой культуре до достижения стабильного размножения вирусов с титрами не менее 5,5 lg ФОЕ/мл.
Адаптированные к культуре клеток Vero вирусные штаммы Орлова/Сочи-09 и P-88/ Хабаровск-89 получили название вакцинных штаммов ДОБ-СОЧИ/VERO и ХТН-Р88/VERO.
Нижеследующие примеры осуществления способа приведены в целях раскрытия характеристик настоящего изобретения и их не следует рассматривать как каким-либо образом ограничивающие объем изобретения.
Штаммы ДОБ-СОЧИ/VERO и ХТН-Р88/VERO исследовали на видовую специфичность (с использованием непрямого МФА с моновалентными антигенами и реакции нейтрализации) и специфическую активность (иммуногенность) на мышах Balb/c.
Методика определения вируснейтрализующих антител.
Для определения вируснейтрализующих антител исследуемые сыворотки в 2-х кратных разведениях смешивают с 50-100 ФОЕ каждого из взятых для идентификации вирусов ХТН и ДОБ и инкубируют при 6 ±2 °С в течение 18-20 часов. На монослой клеток Vero-E6, выращенных в 24 луночных панелях (Сostar), вносят по 0,2 мл вирус-сывороточной смеси и инкубируют при 37±1 °С в течение 1 часа. Затем добавляют метилцеллюлозное покрытие и через 6-7 дней инкубации при 37±1 °С полужидкое покрытие удаляют и монослой фиксируют 96° спиртом. Образовавшиеся в культуре клеток фокусы выявляют с помощью твёрдофазного иммуноферментного метода, используя специфические анти-ХТН и анти- ДОБ сыворотки и меченный пероксидазой хрена белок “А”. В качестве индикаторной системы применяют 0,05% диаминобензидин тетрахлорид с добавлением 0,02% NiCl2 и 0,01% Н2О2, после чего через 15-20 мин проводят учёт опыта. Титр вируснейтрализующих антител определяют по 80% подавлению числа фокусобразующих единиц (ФОЕ).
Методика определения специфической иммуногенной активности.
Предварительно из вируссодержащих жидкостей клеток Vero, инфицированных штаммами ДОБ-СОЧИ/VERO и ХТН-Р88/VERO, готовят инактивированные, концентрированные, очищенные и адсорбированные на гидроокиси алюминия препараты. Для иммунизации используют мышей линии Balb/c 9-10 недельного возраста, весом 18-20 г, которым вводят исследуемые препараты в объёме 0,5 мл внутримышечно трехкратно с 2-х недельным интервалом. В качестве контрольных используют мышей Balb/c, которым в те же сроки вводят только адсорбент - гидроокись алюминия. Через 2 недели после последней инъекции у животных берут из орбитальной вены кровь и готовят из неё сыворотку. В полученных сыворотках крови определяют титр вируснейтрализующих антител к вирусам ХТН и ДОБ, используя выше описанный метод определения вируснейтрализующих антител.
При исследовании штаммов ДОБ-СОЧИ/VERO и ХТН-Р88/VERO в перекрёстных опытах МФА и РН с прототипными штаммами вирусов ПУУ, ХТН, ДОБ, СЕУ подтверждена их видоспецифичность, а в опытах на мышах линии Balb/c - иммуногенная активность. Помимо результатов иммунологических исследований видоспецифичность штаммов подтверждена данными молекулярно-генетических исследований. Следовательно, по антигенным и молекулярно-биологическим свойствам штаммы ДОБ-СОЧИ/VERO и ХТН-Р88/VERO соответствуют естественно циркулирующим в природе прототипным штаммам вирусов ХТН и ДОБ.
Ниже представлены морфологические характеристики варианта № 1– штамм ДОБ-СОЧИ/VERO и варианта № 2 – штамм ХТН-Р88/VERO «Штамма вируса для изготовления вакцинных препаратов против геморрагической лихорадки с почечным синдромом».
Вирионы имеют округлую форму с размером в диаметре от 90 до 120 нм. Липидосодержащая оболочка имеет выступы – пепломеры, длиной до 10 нм, сформированные вирионными гликопротеинами; вирусные частицы морфологически однородны. Вирионы располагаются в цитоплазме клетки, наибольшее их скопление наблюдается в цитоплазмитической сети и везикулах аппарата Гольджи. Плавучие плотности вирусных частиц в растворах сахарозы и хлорида цезия составляют 1.16-1,17 и 1,2-1,21 г/мл соответственно. Хантавирусы инактивируются растворителями липидов и термообработкой при температуре 50°С; стабильны в нейтральной среде при значениях рН от 5,5 до 8. Вирион проникает в клетку, прикрепляясь к ее поверхности участками одного или обоих наружных белков (G1 и G2), с последующим эндоцитозом. Предполагается, что необходимым условием проникновения вируса в клетку является закисление эндосом, что приводит к изменению конформации G1:G2 гетеродимеров и способствует слиянию клеточной и вирусной мембран.
Далее представлены биотехнологические характеристики варианта № 1– штамм ДОБ-СОЧИ/VERO и варианта № 2 – штамм ХТН-Р88/VERO «Штамма вируса для изготовления вакцинных препаратов против геморрагической лихорадки с почечным синдромом».
Как известно, хантавирусы плохо размножаются даже в пермиссивных клеточных культурах. После заражения полученными в результате адаптации штаммами монослойной культуры клеток Vero получают от 3 до 5 сборов вируссодержащей биомассы со средним титром 5,5 lg ФОЕ/мл, что указывает на возможность их использования для вакцинопрофилактики ГЛПС. Заявленные штаммовые варианты, получив в результате адаптации к размножению в клетках Vero способность накапливаться в высоких титрах в культуральной жидкости, сохранили свои основные характеристики, включая их иммуногенность. Иммуногенные свойства штаммовых вариантов определяли в опытах на мышах линии Balb/c по образованию вирус нейтрализующих антител в ответ на введение внутримышечно 3-х кратно с 2-х недельным интервалом препаратов, приготовленных по схеме производства инактивированной цельновирионной вакцины, описанных в примерах 1 и 2. Методика определения вируснейтрализующих антител по подавлению фокус образующих единиц была приведена выше. Как видно из таблицы 1, заявленные штаммы обладают достаточно высокой иммуногенной активностью.
Таблица 1
Выявление нейтрализующих антител в сыворотках крови мышей Balb/c
| Разведения штаммовых вариантов | Титр нейтрализующих антител к штаммам | |
| ДОБ-СОЧИ/VERO | ХТН-Р88/VERO | |
| Н/Р | 136* | 158 |
| 1/2 | 54 | 64 |
| 1/4 | 20 | 22,5 |
| 1/8 | 12,5 | 14 |
| 1/16 | 10 | 8,8 |
| 1/32 | 7,5 | 6 |
| 1/64 | 2,5 | 3,5 |
| 1/128 | 0 | 0 |
* - средний арифметический титр сыворотки (величина, обратная её разведению), обеспечивающий подавление 50% ФОЕ/мл
Ниже представлены молекулярно-генетические характеристики варианта № 1– штамм ДОБ-СОЧИ/VERO и варианта № 2 – штамм ХТН-Р88/VERO «Штамма вируса для изготовления вакцинных препаратов против геморрагической лихорадки с почечным синдромом».
Геном вирусов представляет собой сегментированную одноцепочечную негативную РНК. Три сегмента генома - большой (L), средний (M) и малый (S) - кодируют вирусную РНК-зависимую РНК-полимеразу RdRp, поверхностные гликопротеины G1 и G2 и нуклеокапсидный белок N, соответственно. Каждый из геномных сегментов имеет единственную функционирующую открытую рамку считывания (ОРС). Вирусные белки - RdRp, G1, G2 и N - имеют молекулярные массы 200, 72, 56 и 45 KДа соответственно. Все три сегмента хантавирусной РНК имеют на 3'-концах одну и ту же характерную короткую последовательность 3'-AUCAUCAUCUG-…-5', отличающую их от других буньявирусов.
Подготовка образцов для сиквенирования включает: выделение тотальной РНК из лизата зараженных клеток Vero с помощью реагента Trizol (GibcoBRL), обратной транскрипции с использованием статистического гексануклеотида в качестве праймера, полимеразную цепную реакцию (ПЦР) в стандартных условиях с применением родоспецифических праймеров генома хантавирусов, комбинирование праймеров, комплементарных различным участкам малого и среднего сегментов генома, клонирование ПЦР-фрагмeнтов с использованием вeктора pCR 2.0 (TA cloning kit; Invitrogen). Для каждого из образцов были приготовлeны 3 клона, источником которых являлись различныe колонии. Сeквeнированиe проводили с использованиeм Sequenase version 2.0 (United States Biochemicals) в обоих направлeниях.
В результате были получены следующие сиквенсы:
1) S сегмент генома варианта № 1 – штамм ХТН-Р88/VERO - SEQ ID NO:1
ACTAGAATAACGATGGCAACTATGGAGGAATTGCAGAGGGAAATCAATGCCCACGAGGGTCAACTGGTGATAGCCAGGCAGAAGGTTAGGGATGCAGAAAAGCAGTATGAAAAGGATCCAGATGAGTTAAACAAGAGAGCATTGACAGATCGAGAGGGTGTTGCAGTATCCATCCAAGCAAAGGTTGATGAATTAAAGAGGCAACTGGCAGATCGGATCGCAACCGGGAAGAATCTTGGAAAGGAACAAGACCCAACAGGGGTAGAACCTGGAGATCATCTGAAAGAGAGATCAATGCTCAGTTATGGAAATGTTCTTGACTTAAACCACCTGGATATTGATGAGCCGACAGGACAGACAGCAGACTGGCTGAGCATTGTTGTCTATCTTACATCCTTTGTTGTCCCAATACTTCTGAAAGCTCTGTATATGTTAACAACAAGGGGGAGGCAGACCACCAAGGACAATAAGGGAACTCGGATTCGATTCAAGGATGATAGTTCCTTCGAGGATGTCAATGGCATCCGGAAGCCAAAACATCTATATGTGTCCTTGCCAAATGCACAGTCAAGTATGAAAGCAGAAGAGATTACACCTGGTAGATATAGAACAGCAATTTGTGGGCTTTATCCTGCACAAATTAAGGCAAGACAGATGATTAGTCCTGTCATGAGTGTGATCGGATTCCTGGCTCTGGCAAAAGATTGGAGTGACCGCATTGAGCAGTGGTTAAGTGAACCCTGTAAGCTTCTTCCAGACACAGCAGCAGTTAGCCTCCTTGGTGGTCCTGCTACCAACAGGGACTACCTACGGCAGCGGCAAGTGGCATTAGGCAATATGGAAACAAAAGAGTCTAAGGCTATACGCCAACATGCAGAGGCAGCAGGCTGTAGCATGATTGAGGACATTGAGTCACCATCCTCAATATGGGTGTTTGCTGGAGCACCAGACCGCTGTCCACCAACATGTCTTTTCATTGCAGGTATTGCTGAGCTTGGGGCATTTTTTTCCATCTTGCAGGACATGCGGAATACAATCATGGCATCCAAGACAGTTGGAACCTCTGAGGAGAAGCTGCGGAAGAAATCTTCATTCTATCAGTCTTATCTCAGGAGAACACAATCAATGGGAATACAACTGGATCAGAGGATAATTGTGCTCTTCATGGTAGCTTGGGGGAAAGAGGCAGTGGATAACTTCCACCTAGGAGATGATATGGATCCTGAGCTGCGAACACTAGCACAGAGCCTGATTGATGTTAAAGTGAAGGAAATTTCTAACCAAGAGCCTTTAAAATTGTAATCAGTGAATGTATAACCCTCATTATGTGATTATTATATACTACTGAATCATTATCAATCATATTTGCACTATTATTATCAGGGGAATCAGTATATCAGGGTAAGGGCACATTTATGGGTGGGAATCATTACTCAGAGGGTGGGTCAGTTAATCCGTTGTGGGTGGGTTTAGTTCCTGGCTGCCTTAAGTAGCCTTTTTTTGTATATATGGATGTAGATTTCATTTGATCCTTAAACTAATCATGCTCTCTTTCCTTTTCCTCCTGCTTTCTCTGCTTACTAACAACAACATTCTACCTCAACACAAAACTACCTCAACTAAACTACCTCATTAAATTGCTCCTTGA
2) М сегмент генома варианта № 1 – штамм ХТН-Р88/VERO - SEQ ID NO:2
GAAAGCAGTCAATCAGCAACATGGGGATGTGGAAGTGGCTAGTAATAGCCAGTTTAGTAGGGCCTGTTTTGGCACTGCGAAATGTGTATGACATGAAAATTGAATGCCCCCACACAGTAAGTTTCGGAGAAAACAGTGTGATAGGGTATGTGGAGTTACCCCCTATGCCATTGGCTGACACAGCACAGATGGTGCCTGAGAGTTCTTGCAGCATGGATAATCATCAGTCAATAAACACTATAACAAAATACACTCAGGTAATCTGGAGAGGAAAGGCAGATCCGGGACAATCCAGTCAGAATTCATTCGAAACAGTGTCTACTGAAGTTGACTTGAAAGGAACATGTGTTTTAAAGCATAAGATGGTGGAAGAATCATACCGCAGCCGGAAGTCAATAACCTGTTATGACCTTTCTTGTAATAGTACTTATTGCAAGCCAACATTATATATGATTGTACCGATCCATGCATGTAATATGATGAAGAGCTGTCTAATTGCATTAGGGCCATACAGAGTGCAGGTAGTGTATGAGAGAACCTACTGTATGACAGGAGTCTTAATTGAAGGAAAATGTTTTGTCCCAGATCAAAGTGTTGTTAGCATTATTAAGCATGGGATCTTTGATATTGCAAGTGTTCATATTGTATGTTTCTTTGTTGCAATTAAGGGGAACACCTATAAACTCTTTGAACAGGTTAAGAAATCGTTTGAGTCAACTTGCAATGATACTGAGAATAAAGTACAGGGTTATTACATCTGTATTGTGGGAGGAAATTCTGCACCCATCTATGTCCCTACACTCGATGATTTCAGGTCCATGGAGGCATTTACAGGAATCTTTAAGTCACCGCATGGAGAAGACCATGACCTTGCTGGGGAGGAAATTGCTTCATACTCCATAGTTGGACCTGCAAATGCAAAAGTCCCTCATAGTGCAAGCTCAGACACACTAAGTTTAATTGCTTATTCAGGTATACCATCTTATTCTTCCCTGAGTATCTTGACAAGTTCAACAGATGCTAAGCATGTGTTTAGCCCTGGATTGTTCCCAAAGCTCAACCATACAAACTGTGATAAGAGTGCCATACCGCTTACATGGACTGGGATGATTGATTTACCTGGATACTATGAGGCCATACACCCTTGCACAGTTTTTTGTGTACTGTCAGGCCCTGGAGCTTCATGTGAAGCATTTTCTGAAGGTGGAATTTTCAACATAACTTCCCCCATGTGCTTAGTTTCAAAGCAAAATCGGTTCCGGCTAACAGAGCAGCAGGTGAACTTTGTGTGTCAAAGAGTAGACATGGACATTGTTGTGTACTGCAATGGGCAGCGGAAAGTAATATTAACAAAAACTTTAGTTATTGGGCAATGTATATATACTATAACAAGCTTGTTTTCACTACTACCTGGGGTAGCACATTCTATTGCTGTGGAACTATGTGTGCCTGGATTCCATGGCTGGGCTACAGCTGCTTTGCTTGTTACATACTGTTTTGGATGGGTCCTTATACCAGCTGTCACGTTTGTTATACTAACAGTCTTAAAGTTTGTTGCTAACATTTTTCACACAAGCAACCAAGAGAACAGGCTGAAATCAGTATTGAGAAAAATAAAAGAGGAGTTTGAAAAGACAAAGGGGTCAATGGTATGTGATGTTTGTAAGTATGAATGTGAAACCTATAAAGAATTAAAGGCACATGGGGTATCTTGCCCCCAATCTCAATGCCCTTACTGTTTTACTCATTGTGAGCCTACAGAGGCAGCATTTCAAGCCCACTATAAAGTATGCCAGGTAACTCACAGGTTCAGGGATGATCTTAAAAAGACTGTCACTCCTCAGAATTTCACACCAGGTTGTTATCGGACATTAAATTTATTTAGATACAAAAGTAGATGTTACATTTTCACAATGTGGGTATTCCTTCTCATTCTGGAATCTATACTGTGGGCTGCTAGTGCATCAGAAACACCGTTAGCTCCTGTTTGGAATGACAATGCCCATGGTGTTGGTTCTGTGCCCATGCACACAGATCTGGAGCTTGATTTTTCTCTGACATCCAGCTCTAAGTATACATACCGCAGGAAGCTAACAAACCCACTGGAAGAGGCACAATCAATTGATCTCCATATTGAAATAGAAGAGCAAACAATTGGTGTTGATGTGCACGCTCTAGGACATTGGTTTGATGGCCGTCTTAATCTTAAAACATCCTTTCACTGTTATGGTGCCTGTACAAAGTACGAGTACCCATGGCATACTGCAAAGTGTCACTATGAACGAGATTACCAATATGAGACAAGTTGGGGCTGTAATCCATCAGACTGCCCCGGGGTGGGTACAGGCTGCACAGCATGTGGGCTTTATCTTGACCAGTTAAAACCAGTTGGTAGTGCATATAAAATCATTACAATAAGATATAGTAGAAGAGTTTGTGTTCAGTTTGGAGAAGAAAACCTTTGTAAAATTATAGACATGAATGATTGCTTTGTATCTAGACATGTTAAAGTCTGTATTATTGGAACAGTTTCTAAGTTTTCACAAGGTGATACACTATTGTTTTTCGGGCCACTTGAAGGTGGTGGTTTGATATTTAAACACTGGTGTACATCTACATGTCAGTTTGGTGACCCAGGAGACATCATGAGCCCAAGGGACAAAGGTTTTTTATGCCCTGAGTTCCCAGGTAGTTTTAGAAAgAAATGTAATTTTGCTACTACTCCTATTTGTGAGTATGATGGAAATATGGTTTCGGGTTATAAAAAAGTGATGGCAACAATTGACTCTTTCCAATCCTTCAATACAAGCACTATGCACTTTACTGATGAGAGGATAGAATGGAAAGACCCTGATGGAATGTTGAGGGACCATATAAATATTTTAGTAACAAAGGATATTGATTTTGATAACCTTGGTGAAAACCCCTGTAAAATTGGCTTGCAGACATCTTCTATTGAAGGGGCATGGGGTTCTGGTGTAGGCTTTACACTTACATGCTTGGTATCATTAACAGAGTGTCCTACTTTTTTAACCTCCATTAAGGCCTGTGACAAAGCTATTTGTTATGGTGCAGAAAGTGTGAAATTAACGAGAGGACAAAATACAGTGAAGGTATCAGGGAAAGGTGGCCATAGTGGTTCAACTTTCAAATGTTGCCATGGGGAAGACTGTTCACAAATTGGGCTCCATGCTGCTGCACCCCACCTTGATAAAGTTAATGGGATCTCTGAAATAGAAAACAGTAAAGTATATGATGATGGAGCACCACAATGTGGTATAAAATGTTGGTTTGTCAAATCAGGGGAATGGATTTCAGGGATATTTAGTGGCAATTGGATTGTGCTCATTGTCCTCTGTGTGTTCTTACTATTTTCATTGGTCTTACTAAGCATCCTTTGCCCTGTCAGGAAGCATAAAAAATCATAGCTAGATGATGCTGTTATCAAGTTATTGTATATAGCTTTAACATATATACTAATTTTTATATTCCAGGACACTTTATCTAACACACTAAAAAAAATAGTAGCTTTCTAACCACAAAACTTAGATTTTTCTTCTGTATGATGTCTTAACATC
3) S сегмент генома варианта № 2 – штамм ДОБ-СОЧИ/VERO - SEQ ID NO:3
TAGTAGTATGCTCCCTAAAAAGCACTACACTAAAGATGGCAACATTGGAGGAACTCCAAAAGGAAATTAACAACCATGAAGGCCAACTGGTGATCGCCAGACAGAAGGTAAAGGATGCAGAAAAGCAATATGAGAAGGACCCTGATGACCTGAATAAAAGGGCATTAAGCGATCGGGAAAGTGTTGCACAGTCAATCCAAGGGAAAATTGATGAGTTGCGGAGACAGCTGGCTGACCGTGTGGCTGCAGGAAAAAATATTGGAAAAGAAAGGGATCCAACTGGACTAGACCCTGGTGATCATCTCAAAGAGAAGTCGATGCTCAGTTACGGGAATGTAATTGATCTTAATCACTTGGATATTGATGAACCAACAGGGCAAACTGCTGACTGGCTGAGCATTGTGGTCTATCTTACATCATTTGTGGTTCCAATACTTCTGAAGGCTCTTTACATGCTAACAACCAGAGGGAGACAAACTACTAAAGACAATAAAGGAATGAGGATTCGGTTCAAGGATGACAGTTCTTTTGAGGATGTGAACGGGATTCGAAAGCCAAAGCACCTGTTTCTGTCAATGCCCAATGCGCAATCCAGTATGAAAGCAGATGAGATCACACCAGGTCGATTCAGGACTGCAGTTTGTGGACTATATCCAGCTCAGGTTAAAGCAAGGAATTTGGTCAGTCCTGTAATGAGTGTGATTGGGTTTGTATCCCTTGCTAAAAACTGGACAGAGCGGGTTGAGGAATGGCTTGATCTCCCATGCAAGCTACTATCTGAGCCATCTCCCACGTCTTTGACTAAAGGCCCATCCACTAATCGTGACTACTTGAATCAAAGACAGGGGGCGCTTGCAAAAATGGAAACAAAGGAAGCTCAGGCTGTAAGGAAGCATGCCATAGATGCTGGTTGTAACCTTGTTGATCACATTGATTCACCATCATCAATTTGGGTCTTTGCAGGAGCACCTGATAGATGCCCCCCTACCTGCTTATTTGTTGCAGGCATGGCAGAGCTAGGTGCATTTTTTGCTGTCCTTCAAGATATGAGGAACACCATCATGGCATCGAAGACTATTGGGACATCAGAGGAGAAGTTGCGGAAGAAATCCTCTTTCTACCAGTCATATCTTAGAAGAACACAATCTATGGGAATACAACTGGATCAGCGTATTATTGTGCTTTTCATGGTGGACTGGGGTAAGGAAGCAGTTGACAGTTTCCATCTCGGTGATGACATGGACCCTGAGCTTCGAGGCCTGGCACAGGCACTGATTGATCAGAAAGTGAAGGAGATATCTAATCAGGAGCCGCTTAAGCTTTAAATGTATGTATTGCTTGTACCCCTGCTTTATGTAATCCCACATATGCTGCATTAATTGCTTGAACTGGAATTATTATCACTAGGGGATGGGTTGGGTGGGCCATTTATCCGTTATGTAATCTCAGGGTGGTTTAGGACGTCACCTTAAGTGACTATTTTTTGTATATATGGATGTAGATTTCAATTGATCTGTACTAACACCTTACTTCTTTCTTTTCCTTTCTTTACTAACAACAACTATCTACCGCAAAACAACAACACTACCTCAACAACTACTACCTCATTGATTTGCTTCCTGAATGTCTTTTTAGGGAGTCTACTACTA
4) М сегмент генома варианта № 2 – штамм ДОБ-СОЧИ/VERO - SEQ ID NO:4
AGTAGTAGACACCGCAAGAAAGAGCAGTTAAATAACAGCATAATCATGTGGGGTTTACTATTGACAATGATTTTGATCGATTTCGGGGCAACCCTTAGGAATGTCTATGACATGAGGATAGAATGCCCACATTCTGTCAACTTCGGGGAAAGCAGTGTATCAGGGAAAGTGGAGCTACCACCAGTTCTACTTAGTGAGGTAGAGACGCTTGTCCCAGAAAGCTCTTGCAATATGGATAATCACCAATCAATGTCAATCATACAAAAAGTCACTCAACTAACTTGGAGAAAGAAGGCTGATAAAGCGCAGGCAGCAAAAGACTCATTTGAAATTACCTCAGGTGAAGTCAGCTTGAAAGGTACATGCACCTTAACACATAGAATGGTTGAGGACTCTCATAGGAATAGAAAGTCAATAATATGTTATGACCTATCCTGTAATTCAACCCATTGTAAACCAACAATGCACATGATAGTTCCCATTCACTCATGTAATATGATGAAGAGCTGCCTGGTAGGCCTTGGACCTTACCGCATCCAGGTTGTTTATGAAAGAACATACTGCACAACTGGTATCCTAACAGAAGGAAAATGCTTTGTCCCTGATCAGAGCATTGTGAATGTCATAAAAAATGGTGTGTTTGATATTGCCAGTGTTAGTATTGTTTGCTTCTTCGTGAGAGTGAAGGGTACAAATTACAATATAATGGCTAGCATCAAAACAGCTACATCAAATAATTGTAATGACACTGGCAATAAAGTGCAGGGGTATTATCTGTGTATTGTGGGTGGAAATTCTTCACCAGTGTATGTACCATCAACTACTGATTTCCGTTCAATGGAAGCACTTGCAAGTATGCTTAGAGCACCCCATGGTGAAGATCATGATTTAGCTGGAGAAGAAGTTGCAACATATTCAATTGCTGGTCAAGTTGAAGGTAAAGTCCCCCACACTGCAAGTACAGCAAACATGCTCCTCACTGCATTCTCAGGGGTTCCTAGCTATTCTTCACTCAGCGTCTTCACTGGCAGTCAGGATGGCCCTATTGTATATAGTCCTGGATTGTTTCCTAAACTGAACCAATCATCATGTGATAAGGTTGGGCTGCCTCTAATATGGGAAGGTTACATTGACTTGCCAGGTTACTATGAAACAGTACATCAGTGCAATGTTTTCTGTGTTCTTTCAGGCCCTGGAGCATCATGTGAGGCATTCTCAGAGGGTGGAATATTCAACATAACATCTCCAAACTGTATGGTCTCTAAACAAAATAGATTCCGGGCTGCTGAACAACAGGTTAACTTTGCATGCCAAAGGGTTGACCAGGACATTTTAATCTTCTGTAATGGTCAGAAGAAAACAATCCTGACAAAAACATTAGTCATTGGTCAATGTATCTACTCAATAACAAGTTTATTTTCAATCATGCCAGGTGTAGCACATTCAATTGCAATTGAATTATGTGTGCCAGGTTTCCATGGGTGGGCAACAGCTGCCCTCCTCACAACATTCTGCTTTGGTTGGGTATTAATCCCATCTATTACCTTGGCTGTACTTGTTGTCTTAAAGTTTTTTGCTGCAATCTTACACAATAGTTCCCAGGAAAACCGGTTCAAGCTCATCTTGAAAAAGATCAAGGAAGAGTTTGAAAAAACAAAGGGTTCAATGGTTTGTGAGGTATGCAAGTATGAGTGTGAGACAGGGAAGGAATTAAAAGCACATAATCTATCCTGCCCGCAATCACAGTGTCCCTATTGTTTCACACACTGTGAACCAACTGAGTCAGCATTTCAAGCTCATTATAAGGTGTGCCAGGTAACACATAGATTTAGAGATGATCTGAAAAAGACTATAACACCTCAATCTACTAGCCCTGGGTGTTACCGGACCTTGAACTTGTTCAGGTACAAAAGTAGGTGTTATATATTCACAGTGTGGGTAGTTCTCCTTGTTGTAGAGTCAGTGATGTGGGCAGCCAGTGCTTCAGAGACAGTATTAGAGCCCTCATGGAATGATAACGCACATGGAGTTGGTGTAGTGCCTATGCATACAGACTTGGAATTAGATTTTTCTCTCCCATCAAGCTCGAAGTATACGTATAAAAGAAAGCTAACGAGCCCTATAAATCAGGAACAATCTGTTGACCTACACATTGAGATAGAGAGCCAAGGAATTTCTACAAGTGTCCATGCTTTAGGCCATTGGTTTGATGGTAGGTTAAACCTAAAGACATCATTTCACTGTTACGGTGCCTGTACAAAGTATGAATACCCTTGGCATACTGCAAGATGTCACTTTGAAAGAGATTTTGAGTATGAGAATAGTTGGGGTTGTAATCCAGCTGACTGCCCTGGTATTGGTACAGGTTGTACAGCATGTGGCATCTATATCGACCAGTTGAAGCCTGTGGGCAGTGCATACAAGCTGATTACAGTCCGTTATAGCCGCAAAGTCTGTGTCCAGTTTGGAGAGGAAAACTTATGTAAAACTATTGACATGAATGACTGTTTTGTCACAAGGCATGTGAAAGTCTGTATTATTGGGACAGTCTCAAAATTCTCTCAAGGGGACACACTGGTATTTTTAGGTCCTATGGAGGGTGGAGGGCTAATATTTAAAGACTGGTGTACAAGCACATGTCAGTTTGGAGATCCAGGAGACATTATGAGTCCCAAGGATAAGGGATTTAGTTGTCCAGAATTCACTGGTCACTTCCGCAAAAAGTGCAACTTTGCAACGACACCTGTATGTGAATATGATGGGAATATGGTATCTGGATATAAGAAGGTCATGGCAACTATTGATTCTTTTCAAGCATTTAACACAAGTTCTATCCATTACACAGATGAGCGGATTGAATGGAAAGATCCAGATGGGATGTTGAAGGACCATCTTAATATATTGGTTACAAAAGATATTGATTTTGAAAACCTTGGAGACAATCCGTGTAAGGTGGGACTTCAGACTGTTTCCATTGAAGGTGCATGGGGTTCAGGGGTTGGGTTCACTTTAACATGCCAGGTTTCTTTAACTGAATGTTCTCGTTTCTTGACCTCAATCAAAGCTTGTGACAAGGCAATATGCTATGGCGCACAGAGTAGCACCCTCATTCGAGGACAAAATACAGTAAAAGTGTCTGGGAAGGGAGGACATAGTGGTTCATCCTTTAAGTGTTGCCATGGAACTGATTGCTCACAGCAAGGATTGCAAGCTAGTGCACCCCATCTTGACAAGATTAATGGTATTGTAGAACAAGAAAATGAAAAAGTTTATGACGATGGTGCACCACAGTGTGGTATTTCATGCTGGTTTGTGAAGTCTGGAGAATGGATTCAAGGTATCTTCAATGGGAATTGGATTGTAACTGTTGTCCTAATCTTTTTCTTCATCCTATCATTGATATTGCTCAGCATCTTTTGTCCAATTCGAAAGCATAAACGCTCCTAGCATGGAACTGTATATGGATTGATGCTGCTTGCTTGTTAATCTGCTTTTTTTAATAATGCCATTTTATACTTACTAACCTATATTTCTAAAAAAAATAGACTCTTTACTACTAGATTTCCTAGTCCTTTATTACGTGGGTATTTCTATATCTTGCGGAGCATACTACTA
Полученные штаммы ДОБ-СОЧИ/VERO и ХТН-Р88/VERO при размножении в разрешенной для вакцинного производства культуре клеток Vero могут быть использованы для накопления вирусной массы при производстве инактивированной вакцины против ГЛПС.
Для лучшего понимания приведены следующие примеры.
№ 1– штамм ДОБ-СОЧИ/VERO и варианта № 2 – штамм ХТН-Р88/VERO
Пример 1
Вируссодержащую культуральную жидкость получают путем репродуцирования штамма ДОБ-СОЧИ/VERO вируса ДОБ в монослойной перевиваемой культуре клеток почек зеленой мартышки (Vero). Монослой клеток получают в роллерных бутылях объемом 1 л в среде Игла МЕМ с двойным набором витаминов и аминокислот и 5% сыворотки крови плодов коров. После заражения монослойных культур для поддержки вирусного размножения используется среда, не содержащая компонентов сыворотки крови. Сбор вируссодержащей жидкости начинают на 6 день. С одного монослоя клеток получают от 3 до 5 сборов вируссодержащей жидкости, Полученную вируссодержащую жидкость со средним титром 5,5 lg ФОЕ/мл осветляют с помощью ультрафильтрационных кассет (Мillipore) с молекулярным весом проходимых частиц 100 000 Дальтон и площадью 0,2м2 , инактивируют формалином в концентрации 1:4000 при 6 0С в течение 30 суток и концентрируют в 70 – 200 раз. Инактивированный концентрат очищают на колонке 2,6/70 с Сефарозой 6 Фаст Флоу со скоростью 7 мл/мин. Концентрация общего белка в очищенном концентрате составляет 100±50 мкг/мл. Очищенный инактивированный концентрат фильтруют через фильтр 0,22 мкм и используют для приготовления сорбированной на гидроокись алюминия моновалентной вакцины.
Пример 2
Вируссодержащую культруральную жидкость получают путем репродуцирования штамма ХТН-Р88/VERO вируса ХТН в монослойной перевиваемой культуре клеток почек зеленой мартышки (Vero). Монослой клеток получают в роллерных бутылях объемом 1 л в среде Игла МЕМ с двойным набором витаминов и аминокислот и 5% сыворотки крови плодов коров. После заражения монослойных культур для поддержки вирусного размножения используется среда, не содержащая компонентов сыворотки крови. Сбор вируссодержащей жидкости начинают на 6 день. С одного монослоя клеток получают от 3 до 5 сборов вируссодержащей ждикости, Полученную вируссодержащую жидкость со средним титром 5,5 lg ФОЕ/мл осветляют с помощью ультрафильтрационных кассет (Мillipore) с молекулярным весом проходимых частиц 100 000 Дальтон и площадью 0,2м2 , инактивируют формалином в концентрации 1:4000 при 60С в течение 30 суток и концентрируют в 70 – 200 раз. Инактивированный концентрат очищают на колонке 2,6/70 с Сефарозой 6 Фаст Флоу со скоростью 7 мл/мин. Концентрация общего белка в очищенном концентрате составляет 100±50 мкг/мл. Очищенный инактивированный концентрат фильтруют через фильтр 0,22 мкм и используют для приготовления сорбированной на гидроокись алюминия моновалентной вакцины.Вакцинные штаммы, приготовленные по описанному выше способу, содержат допустимые количества балластных компонентов, таких, как клеточный белок и дезоксирибонуклеиновая кислота, обладают иммуногенной активностью: сыворотки, полученные при 3-кратной иммунизации мышей Balb/c с интервалом 14 дней содержат антивирусные, в том числе вируснейтрализующие, антитела.
Штаммы ДОБ-СОЧИ/VERO и ХТН-Р88/VERO являются уникальными штаммами-продуцентами, которые могут быть применены для изготовления профилактических вакцин против вирусов ДОБ и ХТН.
В результате адаптации штаммов ДОБ-СОЧИ/VERO и ХТН-Р88/VERO к размножению в перевиваемой культуре клеток почек зелёной мартышки Vero впервые получена система вирус/клетка-хозяин, используемая как источник вирусной массы для изготовления инактивированной вакцины против ГЛПС.
Штаммы ДОБ-СОЧИ/VERO и ХТН-Р88/VERO антигенно идентичны циркулирующим в природе штаммам вирусов ДОБ и ХТН, и, вследствие этого, пригодны для изготовления вакцинных препаратов для специфической профилактики ГЛПС. Штаммы ДОБ-Сочи/VERO и ХТН-Р88/VERO не теряют своих антигенных и инфекционных свойств при хранении в течение двух лет (срок наблюдения) при температуре минус 70 0С.
Несмотря на то, что изобретение описано со ссылкой на раскрываемые варианты воплощения, для специалистов в данной области должно быть очевидно, что конкретные подробно описанные случаи приведены лишь в целях иллюстрирования настоящего изобретения, и их не следует рассматривать как каким-либо образом ограничивающие объем изобретения. Должно быть, понятно, что возможно осуществление различных модификаций без отступления от сути настоящего изобретения.
Claims (2)
1. Штамм ДОБ-СОЧИ/VERO (DOB-SOCHI/VERO) вируса Добрава/Белград (Dobrava-Belgrade orthohantavirus, семейство Hantaviridae, отряд Bunyavirales), депонированный под №1282 в Государственной коллекции вирусов (Институт вирусологии им. Д.И. Ивановского ФГБУ «НИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России), адаптированный к размножению в культуре клеток почек зеленой мартышки Vero, предназначенный для изготовления вакцинных препаратов для специфической профилактики геморрагической лихорадки с почечным синдромом.
2. Штамм XTH-P88/VERO (HTN-P88/VERO) вируса Хантаан (Hantaan orthohantavirus, семейство Hantaviridae, отряд Bunyavirales), депонированный под №1283 в Государственной коллекции вирусов (Институт вирусологии им. Д.И. Ивановского ФГБУ «НИЦЭМ им. Н. Ф. Гамалеи» Минздрава России), адаптированный к размножению в культуре клеток почек зеленой мартышки Vero, предназначенный для изготовления вакцинных препаратов для специфической профилактики геморрагической лихорадки с почечным синдромом.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2018118856A RU2683508C1 (ru) | 2018-05-23 | 2018-05-23 | Штамм вируса для изготовления вакцинных препаратов против геморрагической лихорадки с почечным синдромом (варианты) |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2018118856A RU2683508C1 (ru) | 2018-05-23 | 2018-05-23 | Штамм вируса для изготовления вакцинных препаратов против геморрагической лихорадки с почечным синдромом (варианты) |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2683508C1 true RU2683508C1 (ru) | 2019-03-28 |
Family
ID=66089963
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2018118856A RU2683508C1 (ru) | 2018-05-23 | 2018-05-23 | Штамм вируса для изготовления вакцинных препаратов против геморрагической лихорадки с почечным синдромом (варианты) |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2683508C1 (ru) |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2423520C1 (ru) * | 2009-12-30 | 2011-07-10 | Евгений Александрович Ткаченко | Штамм вируса - возбудителя геморрагической лихорадки с почечным синдромом для изготовления вакцинных препаратов (варианты) |
-
2018
- 2018-05-23 RU RU2018118856A patent/RU2683508C1/ru active
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2423520C1 (ru) * | 2009-12-30 | 2011-07-10 | Евгений Александрович Ткаченко | Штамм вируса - возбудителя геморрагической лихорадки с почечным синдромом для изготовления вакцинных препаратов (варианты) |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| МАЛКИН Г.А., Особенности размножения хантавирусов в культурах клеток, авто диссертации, Москва 2015. * |
| МАЛКИН Г.А., Особенности размножения хантавирусов в культурах клеток, автореферат диссертации, Москва 2015. * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US8277814B2 (en) | Avian Astrovirus | |
| CN107312746B (zh) | 一种猪圆环病毒2型的大规模全悬浮培养方法 | |
| CN104099301B (zh) | 柯萨奇病毒a16型病毒株、用途、疫苗及其制备方法 | |
| JP2013531503A (ja) | 細胞培養におけるウイルス生産中に外来性媒介体を取り除くための方法 | |
| CN113564133B (zh) | 柯萨奇病毒a16型毒株及其免疫原性组合物和应用 | |
| AU2014273183A1 (en) | Scale drop disease (SDD) causative virus and derivatives thereof | |
| RU2603003C1 (ru) | Вакцина инактивированная сорбированная против ящура типов а, о, азия-1 | |
| RU2451745C2 (ru) | ШТАММ А 2045/КИРГИЗИЯ/2007 ВИРУСА ЯЩУРА Aphtae epizooticae ТИПА А ДЛЯ КОНТРОЛЯ АНТИГЕННОЙ И ИММУНОГЕННОЙ АКТИВНОСТИ ПРОТИВОЯЩУРНЫХ ВАКЦИН И ДЛЯ ИЗГОТОВЛЕНИЯ БИОПРЕПАРАТОВ ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ И СПЕЦИФИЧЕСКОЙ ПРОФИЛАКТИКИ ЯЩУРА ТИПА А | |
| RU2683508C1 (ru) | Штамм вируса для изготовления вакцинных препаратов против геморрагической лихорадки с почечным синдромом (варианты) | |
| US11767356B1 (en) | Canine parvovirus nanobody CPV-VHH-E3 and application thereof | |
| RU2423520C1 (ru) | Штамм вируса - возбудителя геморрагической лихорадки с почечным синдромом для изготовления вакцинных препаратов (варианты) | |
| RU2665849C1 (ru) | Вакцина инактивированная эмульсионная против ящура типа О | |
| CN115141273A (zh) | 一种猫杯状病毒的单克隆抗体及其应用 | |
| KR101092977B1 (ko) | 닭전염성 기관지염 바이러스 및 이를 포함하는 닭전염성 기관지염 백신 | |
| RU2563522C1 (ru) | ШТАММ О №2102/Забайкальский/2010 ВИРУСА ЯЩУРА Aphtae epizooticae ТИПА О ДЛЯ КОНТРОЛЯ АНТИГЕННОЙ И ИММУНОГЕННОЙ АКТИВНОСТИ ПРОТИВОЯЩУРНЫХ ВАКЦИН И ДЛЯ ИЗГОТОВЛЕНИЯ БИОПРЕПАРАТОВ ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ И СПЕЦИФИЧЕСКОЙ ПРОФИЛАКТИКИ ЯЩУРА ТИПА О | |
| RU2682876C1 (ru) | Вакцина инактивированная эмульсионная против ящура типа О | |
| CN108707589B (zh) | 一种牛病毒性腹泻病毒SMU-Z6/1a/SC/2016分离株及其应用 | |
| RU2242513C1 (ru) | Штамм а (грузия) 1999/№1721 вируса ящура типа а для изготовления диагностических и вакцинных препаратов | |
| RU2294760C2 (ru) | Вакцина инактивированная сорбированная против ящура типа а | |
| RU2603255C9 (ru) | ШТАММ А №2155/Забайкальский/2013 ВИРУСА ЯЩУРА Aphtae epizooticae ТИПА А ДЛЯ КОНТРОЛЯ АНТИГЕННОЙ И ИММУНОГЕННОЙ АКТИВНОСТИ И ДЛЯ ИЗГОТОВЛЕНИЯ БИОПРЕПАРАТОВ ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ И СПЕЦИФИЧЕСКОЙ ПРОФИЛАКТИКИ ЯЩУРА ТИПА А | |
| RU2526570C2 (ru) | Вакцина против ящура типа а инактивированная сорбированная | |
| RU2563345C1 (ru) | Вакцина инактивированная сорбированная против ящура типа а | |
| RU2297452C2 (ru) | Штамм азия-1/таджикистан/2004(1960) вируса ящура типа азия-1 для изготовления диагностических и/или вакцинных препаратов | |
| RU2451073C2 (ru) | Метод первичной изоляции штаммов вируса респираторно-синцитиальной инфекции крупного рогатого скота, штамм вируса bovine respiratory syncitial virus для изготовления диагностических препаратов | |
| RU2708326C1 (ru) | Штамм О N2344/Монголия/2017 вируса ящура Aphtae epizooticae типа О для изготовления биопрепаратов для диагностики и специфической профилактики ящура типа О |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| TC4A | Change in inventorship |
Effective date: 20191216 |
|
| PD4A | Correction of name of patent owner |