CN111803625B

CN111803625B - 一种亚单位流感疫苗裂解剂及其应用

Info

Publication number: CN111803625B
Application number: CN202010938614.XA
Authority: CN
Inventors: 高辉; 阮承迈; 李凤凯; 赵斌
Original assignee: Tianjin Zhongyi Anjian Biotechnology Co ltd
Current assignee: Tianjin Zhongyi Anjian Biotechnology Co ltd
Priority date: 2020-09-09
Filing date: 2020-09-09
Publication date: 2020-12-18
Anticipated expiration: 2040-09-09
Also published as: CN111803625A

Abstract

本发明公开了一种亚单位流感疫苗裂解剂及其应用。属于疫苗制备技术领域。包括质量浓度0.1~5%的壬苯醇醚‑9、质量浓度1~5 g/L的氢氧化钠、质量浓度5~20 g/L的磷酸二氢钠、质量浓度10～60%的蔗糖，余量为蒸馏水。本发明采用裂解剂加入密度梯度离心过程的方式，由于配方具有高效裂解流感病毒的特点，无需事先裂解病毒颗粒，而是在离心过程同时裂解，即一步法裂解，缩短纯化处理过程，可使产物PAGE电泳无明显的M蛋白带和N蛋白带，且疫苗主要抗原组分HA纯度高于90%，大于采用事先裂解以及其它裂解剂配方的产物。

Description

一种亚单位流感疫苗裂解剂及其应用

技术领域

本发明涉及疫苗制备技术领域，更具体的说是涉及一种亚单位流感疫苗裂解剂及其应用。

背景技术

流感病毒在纯化后就会使用裂解剂裂解，其实裂解说的简单点就是利用裂解剂的化学作用把病毒给“分解” 了，完整的病毒解离成“碎片”，流感病毒被解离的顺序为双层脂质膜&血凝素，神经氨酸酶，基质蛋白，核蛋白。因为血凝素的分子量是最大的，因此可以在裂解后通过超速离心和超滤方法去除裂解剂和其它杂质蛋白。

亚单位流感疫苗在生产过程中，为了保证抗原纯度，必须仅裂解流感病毒表面的脂质膜，分离其表面的HA，而不触及病毒内核部分，如核酸和M、N蛋白。现在大多数流感病毒疫苗产品的裂解剂都是TRITON-X100、TWEEN-80等，其裂解回收产物都含有较多杂蛋白，其产物中HA纯度往往低于80%，尤其有明显的M蛋白或N蛋白回收，而M蛋白或N蛋白会引起疫苗明显的副作用。

因此，如何提供一种亚单位流感疫苗裂解剂，提高纯度降低副作用是本领域技术人员亟需解决的问题。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种亚单位流感疫苗裂解剂及其应用。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种亚单位流感疫苗裂解剂，每升包括：质量浓度0.1~5%的壬苯醇醚-9、质量浓度1~5 g/L的氢氧化钠、质量浓度5~20 g/L的磷酸二氢钠、质量浓度10～60%的蔗糖，余量为蒸馏水。

有益效果在于：该配方有利于壬苯醇醚-9裂解流感病毒时主要破坏流感病毒脂质膜结构，释放出HA，不触及病毒内核部分，如核酸和M、N蛋白。

本发明还提供了一种上述的亚单位流感疫苗裂解剂在疫苗质量检测中的应用。

本发明还提供了一种上述的亚单位流感疫苗裂解剂在制备疫苗中的应用。

本发明还提供了一种上述的亚单位流感疫苗裂解剂在裂解病毒颗粒悬浮液中降低M、N蛋白的方法，包括以下步骤：

（1）先取氢氧化钠，磷酸二氢钠，搅拌溶解于蒸馏水中，然后称取壬苯醇醚-9，搅拌溶解，加蔗糖400~600 g，溶解后，加水至1000 ml得溶液A；

（2）另取氢氧化钠，磷酸二氢钠，搅拌溶解于蒸馏水中，然后称取壬苯醇醚-9，搅拌溶解，加蔗糖100~400 g，溶解后，加水至1000 ml得溶液B；且，溶液B比溶液A蔗糖用量少200~300 g；

（3）把溶液A加入区带离心转子离心，然后加入溶液B，继续离心，形成密度梯度后连续加入的病毒颗粒悬浮液；加样完毕后，再离心；之后加入质量浓度60%蔗糖溶液，收取密度在1%～20%之间的液体。

有益效果在于：（1）步骤在于提供高浓度蔗糖的裂解液，以利于快速形成密度梯度；

（2）步骤在于提供低浓度蔗糖的裂解液，以利于快速形成密度梯度；

（3）步骤在于利用高浓度蔗糖溶液排出梯度密度上层的低密度液体，即需要回收的蔗糖浓度在1%～20%之间部分。

优选的：步骤（3）离心转速为8000~12000×g，离心时间5~15 min。

优选的：步骤（3）继续离心转速为15000~30000×g，时间为30~60 min。

优选的：步骤（3）溶液A、溶液B、病毒颗粒悬浮液和60%蔗糖溶液的体积比为1：1：（4~10）：（0.1~0.5）。

优选的：步骤（3）再离心的转速为15000~30000×g，时间为0.5~42 h。

优选的：步骤（3）离心、继续离心、再离心温度均为2~8℃。

优选的：病毒颗粒悬浮液的制备方法：将毒种在37℃水浴中解冻后，接种在鸡胚尿囊腔内；33~37℃培养48~120 h，收获尿囊液，再经截留分子量为100~1000 KDa超滤浓缩到原体积的八十分之一~十分之一。

有益效果在于：对疫苗株流感病毒进行扩增，并且提高需要进行纯化的单位体积内病毒含量，便于进行下一步纯化工作进行。

经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明公开提供了一种亚单位流感疫苗裂解剂及其应用，技术效果在于采用裂解剂加入密度梯度离心过程的方式，由于配方具有高效裂解流感病毒的特点，无需事先裂解病毒颗粒，而是在离心过程同时裂解。该方案的优势为一步法裂解，缩短纯化处理过程，并且采用该方案可使产物PAGE电泳无明显的M蛋白带和N蛋白带，且疫苗主要抗原组分HA纯度高于90%，大于采用事先裂解以及其它裂解剂配方的产物。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。

图1附图为本发明提供的裂解产物纯度示意图，其中， M-蛋白分子量标准；NR-非还原型电泳；R-还原型电泳；HA-主要流感抗原条带；泳道中的黑色圆点为分析软件识别点。

图2附图为本发明提供的乙型流感病毒YAMAGATA亚型裂解产物电泳条带扫描示意图，其中，1为杂峰，2为峰HA1，3为HA2，2和3之间的峰为糖苷酶不计入。

图3附图为本发明提供的裂解效果对照示意图，其中泳道1-本发明裂解剂裂解的乙型YAMAGATA病毒。泳道2为常用方法制备的乙型YAMAGATA。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明实施例公开了一种亚单位流感疫苗裂解剂及其应用。

实施例中所需原料、试剂、疫苗（毒种）均为市售渠道（毒种也可实验室自行采集制备）获得对其品牌来源并无限定满足实验需要即可，例如，毒种包括甲型H1N1(A/California/7/2009)，H3N2（A/Switzerland/9715293/2013），乙型YAMAGATA亚型（B/NYMCBX-35）和VICTORIA亚型（B/Phuket/3073/2013），均购自英国NIBSC，也可以为WHO规定的季节性流感毒种，而具体的毒株因每年流行株而定没有限定，壬苯醇醚-9购自湖北楚盛威化工有限公司；区带离心机购自HITACH（CM-70）；未提及的方法，均为常规实验方法。在此不再赘述

实施例1

病毒颗粒制备：取9～11日龄鸡胚，接种流感病毒病毒毒种（毒种甲型H1N1购自英国NIBSC，毒株因每年流行株而定，按WHO规定的季节性流感毒种分发实验室），所购毒种在37℃水浴中解冻后，接种在鸡胚尿囊腔内；35℃培养72小时，收获尿囊液，再经0.1m²超滤膜包（PALL公司产品，截留分子量为100 KDa）超滤浓缩到原体积的十分之一，备用。

实施例2

病毒颗粒制备：取9～11日龄鸡胚，接种流感病毒病毒毒种（毒种乙型YAMAGATA购自英国NIBSC，毒株因每年流行株而定，按WHO规定的季节性流感毒种分发实验室），所购毒种在37℃水浴中解冻后，接种在鸡胚尿囊腔内；35℃培养72小时，收获尿囊液，再经0.1m²超滤膜包（PALL公司产品，截留分子量为1000 KDa）超滤浓缩到原体积的八十分之一，备用。

实施例3

病毒裂解液的制备：

取2.9 g氢氧化钠，13 g磷酸二氢钠，搅拌溶解于500 ml蒸馏水中，然后按1.5 g称取壬苯醇醚-9，搅拌溶解，加蔗糖600 g，溶解后，加水至1000 ml（A液）；

另取2.9 g氢氧化钠，13 g磷酸二氢钠，搅拌溶解于500 ml蒸馏水中，然后按1.5 g称取壬苯醇醚-9，搅拌溶解，加蔗糖100 g，溶解后，加水至1000 ml(B液)；

把A液加入转速为10000×g的区带离心转子离心5 min，然后加入B液；继续25000×g离心45 min，形成密度梯度后连续加入5000 mL实施例1制备的甲型H1N1病毒浓缩液；加样完毕后，继续4℃离心2 h；之后加入60%蔗糖溶液100 ml，收取密度在1%～20%之间的液体。

实施例4

病毒裂解液的制备：

取7 g氢氧化钠，34 g磷酸二氢钠，搅拌溶解于2500 ml蒸馏水中，然后按6 g称取壬苯醇醚-9，搅拌溶解，加蔗糖3000 g，溶解后，加水至5000 ml（A液）；

另取7g氢氧化钠，34 g磷酸二氢钠，搅拌溶解于500 ml蒸馏水中，然后按6g称取壬苯醇醚-9，搅拌溶解，加蔗糖500 g，溶解后，加水至5000 ml(B液)；

把A液加入转速为10000×g的区带离心转子离心15 min，然后加入B液；继续23000×g离心60 min，形成密度梯度后连续加入20000 mL实施例1制备的甲型H1N1病毒浓缩液；加样完毕后，继续4℃离心3 h；之后加入60%蔗糖溶液2500 ml，收取密度在5%～19%之间的液体。

实施例5

与实施例3的区别仅在于加入5000 mL实施例2制备的乙型YAMAGATA病毒浓缩液，其余同实施例3。

实验效果：

将实施例5制得的产物，经G25层析柱层析去除蔗糖和裂解剂，取5 μl进行PAGE电泳（参见图1）和条带扫描（参见图2）。

其中 M-蛋白分子量标准；NR-非还原型电泳；R-还原型电泳；HA-主要流感抗原条带。

结果用AlphaImage软件进行蛋白含量分析，其中，计算公式为：

纯度=（峰HA1+峰HA2）/（峰HA1+峰HA2+峰1）；

从图2中可以看出，本发明所用裂解剂以及裂解方案所得产物没有可见M蛋白带，本产品纯度经分析计算达到90%以上。

对比实验

取1种已知用裂解+区带离心方法（两步法）获得的流感病毒抗原（泳道2为乙型YAMAGATA）和实施例5获得的流感病毒抗原（泳道1，乙型YAMAGATA）各取5 μl进行非还原型PAGE电泳。

结果如图3。表明，采用本发明可使产物PAGE电泳无明显的M蛋白带和N蛋白带，且疫苗主要抗原组分HA纯度高于90% 。

本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。

对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

Claims

1.一种亚单位流感疫苗裂解剂在裂解病毒颗粒悬浮液中降低M、N蛋白的方法，其特征在于，所述亚单位疫苗裂解剂每升包括：质量浓度0.1~5%的壬苯醇醚-9、质量浓度1~5 g/L的氢氧化钠、质量浓度5~20 g/L的磷酸二氢钠、质量浓度10～60%的蔗糖，余量为蒸馏水；

所述方法包括以下步骤：

（3）把溶液A加入区带离心转子离心，然后加入溶液B，继续离心，形成密度梯度后连续加入病毒颗粒悬浮液；加样完毕后，再离心；之后加入质量浓度60%蔗糖溶液，收取密度在1%～20%之间的液体；

步骤（3）所述离心转速为8000~12000×g，离心时间5~15 min；

步骤（3）所述继续离心转速为15000~30000×g，时间为30~60 min；

步骤（3）所述溶液A、溶液B、病毒颗粒悬浮液和60%蔗糖溶液的体积比为1：1：（4~10）：（0.1~0.5）；

步骤（3）所述再离心的转速为15000~30000×g，时间为0.5~42 h；

步骤（3）所述离心、继续离心、再离心温度均为2~8℃。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述病毒颗粒悬浮液的制备方法：将毒种在37℃水浴中解冻后，接种在鸡胚尿囊腔内；33~37℃培养48~120 h，收获尿囊液，再经截留分子量为100~1000 KDa超滤浓缩到原体积的1/80~1/10。