CN102190701B - 一种流感病毒血凝素大规模分离纯化方法 - Google Patents

Abstract

一种流感病毒血凝素大规模分离纯化方法，包括：制备糖链磁性微粒复合物；将初步纯化后的裂解的经鸡胚增殖的流感病毒或细胞培养的流感病毒液与糖链磁性微粒复合物进行混合；对特异吸附血凝素的糖链磁性微粒复合物进行清洗，除去病毒液中的杂质；将与糖链磁性微粒复合物结合的流感病毒血凝素进行洗脱；对洗脱的流感病毒血凝素进行鉴定；糖链磁性微粒复合物的再生，重复使用。本发明能从灭活裂解经鸡胚增殖的流感病毒或细胞培养的流感病毒液中大规模分离纯化流感病毒血凝素，为大规模制造流感血凝素疫苗提供了条件。

Description

一种流感病毒血凝素大规模分离纯化方法

技术领域

本发明涉及一种能从灭活裂解经鸡胚增殖的流感病毒或细胞培养的流感病毒液中大规模分离纯化流感病毒血凝素的技术，可用于流感亚单位疫苗的生产过程中，具体涉及一种流感血凝素疫苗中应用的流感血凝素大规模分离纯化方法。

背景技术

流行性感冒(influenza，简称流感)是一种传染性强、传播速度快的急性呼吸道感染疾病。该病系流感病毒引起，病毒属正粘病毒科，直径80-120nm，球形或丝状。流感病毒可分为甲(A)、乙(B)、丙(C)三型，甲型病毒经常发生抗原变异，传染性大，传播迅速，易发生大范围流行。其主要通过空气中的飞沫、人与人之间的接触或与被污染物品的接触传播。典型的临床症状是：急起高热、全身疼痛、显著乏力和轻度呼吸道症状。一般秋冬季节是其高发期，所引起的并发症和死亡现象非常严重。尤其当人群对新的流感病毒变异株尚缺乏免疫力时，可酿成世界性大流行，其特点为突然发生与迅速传播，1917～1919年曾发生极广泛的世界性大流行，引致2000万人死亡。2009年甲型H1N1流感在全球至少已造成一万人死亡。

甲型流感病毒呈多形性，其中球形直径80～120nm，有囊膜。基因组为分节段单股负链RNA。其表面主要有两种糖蛋白纤突，即血凝素(hemagglutinin，HA)和神经氨酸酶(Neuraminidase，NA)。依据HA和NA蛋白抗原性的不同，目前可分为16个HA亚型(HA1～16)和9个NA亚型(N1～9)。感染人的流感病毒称为人流感病毒，感染禽的流感病毒称为禽流感病毒，既感染人又感染禽的流感病毒称为人禽流感病毒。

血凝毒是流感病毒最主要的表面蛋白质(80％)，作为识别受体的大分子既是一种糖结合蛋白，同时是糖基化蛋白质。由三个相同的亚基组装而成，每个亚基上包含3-9个糖基化位点，均为N型糖基化修饰，糖链在HA表面的覆盖率能达到20％。糖基化位点和糖链结构取决于甲型流感病毒的亚型和宿主细胞。人流感病毒HA主要识别和结合末端为唾液酸(SA)α2-6半乳糖(Gal)的唾液酸低聚糖受体，其存在于人呼吸道上皮细胞表面；禽流感病毒HA的主要识别和结合末端为SA α2-3Gal的唾液酸低聚糖受体，其广泛存在于禽肠胃道的上皮细胞表面。感染人的禽流感病毒亚型主要为H5N1、H9N2、H7N7，其中感染H5N1的患者病情重，病死率高。流感病毒的传染源主要为患禽流感或携带禽流感病毒的鸡、鸭、鹅等家禽，特别是鸡；但不排除其它禽类或猪成为传染源的可能。患者为主要传染源，尤以轻型患者及隐性感染者起重要作用，因其不易被发现，活动范围又广。现已从抗原上证实动物(猪、马、鸟)流感病毒与人类流感病毒属同源，故动物流感可传至人群，但大多在流行初期作为启动因素或远距离传播上起一定作用。传播途径主要经呼吸道传播，通过密切接触感染的禽类及其分泌物、排泄物，受病毒污染的水等，以及直接接触病毒毒株被感染。

20世纪末生物技术的飞跃发展，促进了疫苗学的形成与发展，以疫苗等生物制品为中心的生物技术研究已经成为全球发展最快的领域之一，而疫苗学在预防流感中所起到的作用也是世人所瞩目的。国内外的流感防治实践表明，疫苗免疫是防止流感暴发和造成巨大损失的主要措施、关键环节和最后防线。目前，应用的流感常规疫苗主要是灭活苗。20年来，灭活疫苗的制备技术不断改进，并已经广泛应用于人类和禽类的免疫，大量的临床试验已证实其可以有效地阻止临床发病和死亡。单批疫苗生产需经历病毒接种、病毒培养、病毒灭活、纯化、裂解、配比、分包装及批签发等步骤才能最终投入使用。但是这种疫苗的制造方法、免疫效果的可靠性，大面积应用的可行性及动物安全性，均存在不少缺点。例如，甲型H1N1流感疫苗采用世界卫生组织推荐的甲型H1N1流感病毒株，疫苗的生产工艺与往年的季节性流感疫苗基本相同，均需经过鸡胚培养、灭活病毒、纯化、裂解等工艺后制成。对鸡蛋或疫苗中任何其他成分(包括辅料、甲醛、裂解液等)、特别是卵清蛋白过敏者为不适合接种人群。随着禽流感病毒多种亚型的发现以及基础免疫学理论、分子生物学及其生物技术的发展，以往疫苗的研制技术和生产方法以及研制所依据的免疫学基础，都在一定程度上无法适应病毒的新发现和新进展所需。在研究领域和应用领域中出现的各种问题需要在整个理论与技术层次上有所突破和提高。大量的新型疫苗由此而生，所谓新型疫苗即利用基因重组、基因表达、DNA合成、反向遗传操作等技术，加速致病抗原的分离与鉴定、致病微生物的修饰与改造，促进疫苗生产技术的发展。总结起来主要有以下几类：

1)全病毒灭活疫苗

一般用甲醛灭活经鸡胚增殖的流感病毒，再辅以佐剂制成。该疫苗安全性好，具有良好的免疫保护作用，可制备多价疫苗，而且各亚型之间不产生免疫干扰。全病毒灭活疫苗具有制备工艺简单，免疫效果好，免疫持续期长等特点，已被许多国家作为商品化的禽流感疫苗在家禽中使用，有效的避免了禽流感的大暴发或大流行。但是，由于灭活疫苗成本高；免疫注射过程中，容易造成病原扩散；免疫接种的动物呈血清学阳性，且不能与自然感染区分，影响疫情监测。这些在一定程度上限制了该苗的应用，也给其疫苗的研制带来了新的挑战。

2)裂解病毒疫苗

裂解病毒疫苗是建立在全病毒灭活疫苗的基础之上的，通过选择适当的裂解剂和裂解条件裂解病毒。去除病毒核酸和大分子蛋白保留抗原的有效成分，经过不同的工艺去除裂解剂和纯化有效抗原成分制备而成的。临床试验表明，用裂解剂裂解病毒，制成裂解疫苗，在儿童中接种取得良好的效果。

3)亚单位疫苗

血凝素是构成流感病毒囊膜纤突的主要成分之一，在病毒吸附及穿膜的过程中起关键作用，可刺激机体产生中和抗体，为流感病毒中最为重要的保护性抗原。在基因工程疫苗中由于亚单位疫苗安全性高，而且已研制出的亚单位疫苗在抵抗同源病毒的攻击方面显示了良好的保护力，因而具有很好的应用前景。中和抗体预防感染，在没有抗原漂移和(或)抗原转换情况下长期保护，产生亚型特异性的CTL反应。

4)细胞培养的流感疫苗

目前，市场上灭活流感疫苗是用鸡胚生产的，所以高质量鸡胚必须及时充足的供应才能保证生产。用细胞替代鸡胚具有很大的优势，细胞生产的过程的将更快，更容易质量控制以及更大规模的生产。病毒在无血清甚至无蛋白的培养基培养将明显减少微生物的感染以及对鸡胚卵清蛋白的过敏。用细胞替代鸡胚在哺乳动物细胞培养的流感病毒和那些人的临床标本将更相似。在哺乳动物细胞培养的流感病毒制备的灭活疫苗比鸡胚制备能诱导更多的血清抗体，提供更强的保护。2种哺乳动物细胞被MDCK和VERO系在一些国家已授权可以生产灭活的流感疫苗。

发明内容

本发明的目的在于提供一种流感血凝素大规模分离纯化方法，其能从灭活裂解经鸡胚增殖的流感病毒或细胞培养的流感病毒液中大规模分离纯化流感病毒血凝素的技术，可用于流感亚单位疫苗的生产过程中；能够除去鸡蛋或疫苗中任何其他化学成分(包括辅料、甲醛、裂解液等)以及其他蛋白组分以避免这些杂质对人体产生不良反应，因而能提高流感疫苗的安全性，血凝素为流感病毒中最为重要的保护性抗原，可刺激机体产生中和抗体，亚型特异性的CTL反应，预防感染，在没有抗原漂移和/或抗原转换情况下长期保护人体，因而具有很好的应用前景。

本发明的技术解决方案是：

一种流感病毒血凝素大规模分离纯化方法，其特殊之处在于，该方法包括以下步骤：

第一步：制备糖链磁性微粒复合物；

第二步：将初步纯化后的裂解的经鸡胚增殖的流感病毒或细胞培养的流感病毒液与糖链磁性微粒复合物进行混合；

第三步：对特异吸附血凝素的糖链磁性微粒复合物进行清洗，除去病毒液中的杂质；

第四步：将与糖链磁性微粒复合物结合的流感病毒血凝素进行洗脱；

第五步：对洗脱的流感病毒血凝素进行鉴定；

第六步：糖链磁性微粒复合物的再生，重复使用。

上述第一步中制备糖链磁性微粒复合物包括以下步骤：

1)取2支离心管，分别放入羟基化磁性微粒1-15g；

2)对羟基化磁性微粒进行磁性分离；

3)对分离后的羟基化磁性微粒弃上清，并加入无水乙醇进行清洗；

4)对无水乙醇清洗后的羟基化磁性微粒再次弃上清，再加入偶联缓冲液进行清洗；

5)在装有偶联缓冲液清洗过的羟基化磁性微粒的2支离心管中每管加入90mL偶联缓冲液，并在其中一管加入15mmol/L含SAα2-3Gal的糖链10-100mL；另一管加入15mmol/L含SAα2-6Gal的糖链10-100mL；

6)对2支离心管内的羟基化磁性微粒、偶联缓冲液、糖链、进行混匀；并进行2-10小时的振荡反应；糖链共价偶联到磁性微粒上，形成糖链磁性微粒复合物；

7)对糖链磁性微粒复合物进行磁性分离；

8)对磁性分离后的糖链磁性微粒复合物弃上清；并用结合缓冲液清洗

9)对结合缓冲液清洗后的糖链磁性微粒复合物置于保存缓冲液中保存。

上述偶联缓冲液是0.2mol/L乙酸乙酸钠，其pH是5.4；所述结合缓冲液是PBS，其pH是7.2；所述清洗缓冲液是PBST，其pH7.2。

上述第二步中将初步纯化后的裂解的经鸡胚增殖的流感病毒或细胞培养的流感病毒液与糖链磁性微粒复合物进行混合包括以下步骤：

1)将两种糖链磁性微粒复合物放入离心管中；

2)在离心管中加入200-1000mL结合缓冲液，20-500mL初步纯化的流感病毒液和1-10mL的苯甲基磺酞氟，并混合均匀；

3)进行0.5-2小时的振荡反应，血凝素特异吸附到糖链磁性微粒复合物上。

上述第三步对特异吸附血凝素的糖链磁性微粒复合物进行清洗，除去病毒液中的杂质包括以下步骤：

1)对特异吸附血凝素的糖链磁性微粒复合物进行磁性分离；

2)弃上清；并用清洗液清洗糖链磁性微粒复合物。

上述第四步将与糖链磁性微粒复合物结合的流感病毒血凝素进行洗脱包括以下步骤：

1)将100-1000mL洗脱液加到装有清洗后的吸附有血凝素的糖链磁性微粒复合物的离心管中；

2)进行0.1-2h的振荡洗脱；

3)对糖链磁性微粒复合物进行磁性分离，获得上清液，即为纯化的流感病毒血凝素。

上述洗脱液为0.1～1％SDS或0.1mol/L HCl-甘氨酸缓冲液，其pH为2.8。

上述第五步对洗脱的流感病毒血凝素进行鉴定采用对流感病毒血凝素进行聚丙烯酰胺凝胶电泳分析法和用MODI-TOF质谱法检测法。

上述第六步糖链磁性微粒复合物的再生，重复使用包括以下步骤：

1)用结合缓冲液对洗脱血凝素后的糖链磁性微粒复合物清洗多次，即可重复使用；

2)对结合缓冲液清洗后的糖链磁性微粒复合物可置于保存缓冲液中保存。

上述羟基化磁性微粒和糖链偶联的最佳配比为0.45mmol/g。

本发明的优点在于：能从灭活裂解经鸡胚增殖的流感病毒或细胞培养的流感病毒液中大规模分离纯化流感病毒血凝素，为大规模制造流感血凝素疫苗提供了条件，能够除去鸡蛋或疫苗中任何其他化学成分(包括辅料、甲醛、裂解液等)以及其他蛋白组分以避免这些杂质对人体产生不良反应，因而也能提高流感疫苗的安全性；血凝素为流感病毒中最为重要的保护性抗原，可刺激机体产生中和抗体，亚型特异性的CTL反应，预防感染，在没有抗原漂移和/或抗原转换情况下长期保护人体，因而具有很好的应用前景。

附图说明

图1为本发明以H5N2禽流感病毒Mallard/JX/16/05为例的电泳结果图；

其中1-8泳道依次为

1：蛋白Marker；2：未与糖链磁粒复合物发生结合的蛋白；3：清洗完毕后的洗液组份；4：禽类易感病毒血凝素；5：未与糖链磁粒复合物发生结合的蛋白；6：清洗完毕后的洗液组份；7：人类易感病毒血凝素；8：病毒总蛋白。

具体实施方式

本发明首先分别将SAα2-3Gal的糖链和SAα2-6Gal的糖链或还原末端功能化(氨基化或肼化或羧基化等)的SAα2-3Gal的糖链和SAα2-6Gal的糖链共价偶联于固相载体(磁性微粒或树脂或玻璃微球或高分子聚合物等)上，

制备出这两种糖链固相载体复合物。

流感病毒灭活液超滤浓缩后，再通过层析、过滤、离心等物理方法多次纯化，之后加入裂解液使病毒裂解，进一步纯化去除裂解剂及杂蛋白后获得疫苗纯化液，之后除菌过滤，最终就得到了高纯度的疫苗原液。然后将等量混合的上述两种糖链固相载体复合物加到高纯度的疫苗原液中，血凝素被糖链固相载体复合物特异吸附，经过清洗，除去病毒灭活液中的杂质(如鸡胚里面的蛋白、细胞中的蛋白和灭活用的化学试剂等)，最后从糖链固相载体复合物上洗脱血凝素。

以将SAα2-3Gal的糖链和SAα2-6Gal的糖链分别共价偶联于羟基化的磁性微粒为例。

本发明提供的流感病毒血凝素大规模分离纯化方法，包括以下步骤：

第一步：制备糖链磁性微粒复合物；

第二步：将初步纯化后的裂解的经鸡胚增殖的流感病毒或细胞培养的流感病毒液与糖链磁性微粒复合物进行混合；

第三步：对特异吸附血凝素的糖链磁性微粒复合物进行清洗，除去病毒液中的杂质。

第四步：将与糖链磁性微粒复合物结合的流感病毒血凝素进行洗脱；

第五步：对洗脱的流感病毒血凝素进行鉴定。

第六步：糖链磁性微粒复合物的再生，重复使用。

上述第一步中制备糖链磁性微粒复合物包括以下步骤；

1)取2支离心管，分别放入羟基化磁性微粒1-15mg(3mg)；

2)对羟基化磁性微粒进行磁性分离；

3)对分离后的羟基化磁性微粒弃上清，并加入无水乙醇进行清洗；

4)对无水乙醇清洗后的羟基化磁性微粒再次弃上清，再加入偶联缓冲液进行清洗；

5)在装有偶联缓冲液清洗过的羟基化磁性微粒的2支离心管中每管加入90μL偶联缓冲液，并在其中一管加入15mmol/L含SAα2-3Gal的糖链10-100μL(10μL)；另一管加入15mmol/L含SAα2-3Gal的糖链10-100μL(10μL)。羟基化磁性微粒和糖链偶联质量的最佳配比为6∶1。

6)对2支离心管内的羟基化磁性微粒、偶联缓冲液、糖链、进行混匀；并进行2-10小时的振荡反应，以8小时为佳；糖链共价偶联到磁性微粒上，形成糖链磁性微粒复合物。

7)对糖链磁性微粒复合物进行磁性分离；

8)对磁性分离后的糖链磁性微粒复合物弃上清；并用结合缓冲液清洗3次；

9)对结合缓冲液清洗后的糖链磁性微粒复合物置于保存缓冲液中保存。

上述第二步中将初步纯化后的裂解的经鸡胚增殖的流感病毒或细胞培养的流感病毒液与糖链磁性微粒复合物进行混合包括以下步骤：

1)将等量的两种糖链磁性微粒复合物放入一个离心管中；

2)在离心管中分别加入200-1000μL结合缓冲液，20-500μL初步纯化的流感病毒液和1-10μL的苯甲基磺酞氟，并混合均匀；

3)进行0.5-2小时的振荡反应，血凝素特异吸附到糖链磁性微粒复合物上。

上述第三步对特异吸附血凝素的糖链磁性微粒复合物进行清洗，除去病毒液中的杂质包括以下步骤：

1)对特异吸附血凝素的糖链磁性微粒复合物进行磁性分离；

2)弃上清；并用清洗液清洗糖链磁性微粒复合物三次；

上述第四步将与糖链磁性微粒复合物结合的流感病毒血凝素进行洗脱包括以下步骤：

3)将100-1000μL洗脱液(0.1～1％SDS或0.1mol/L HCl-甘氨酸缓冲液，pH 2.8)加到装有清洗后的吸附有血凝素的糖链磁性微粒复合物的离心管中。

4)进行0.1-2h的振荡洗脱；

5)对糖链磁性微粒复合物进行磁性分离，获得上清液，即为纯化的流感病毒血凝素；

上述第五步对洗脱的流感病毒血凝素进行鉴定主要采用两种方法，一种方法是对流感病毒血凝素进行聚丙烯酰胺凝胶电泳分析；第二种方法用MODI-TOF质谱法检测，流感病毒血凝素分子量为70KD左右。

上述第六步糖链磁性微粒复合物的再生，重复使用包括以下步骤：

1)用结合缓冲液对洗脱血凝素后的糖链磁性微粒复合物清洗3次，即可重复使用。

2)对结合缓冲液清洗后的糖链磁性微粒复合物可置于保存缓冲液中保存。SAα2-3Gal：3’-N-Acetylneuraminyl-N-acetyllactosamine sodium salt(α-NeuNAc-(2→3)-β-D-Gal-(1→4)-D-GlcNAc)或3’-Sialyllactose(α-NeuNAc-(2→3)-β-D-Gal-(1→4)-D-Glc)

SAα2-6Gal：6’-Sialyllactose sodium salt(α-NeuNAc-(2→6)-β-D-Gal-(1→4)-D-Glc)

偶联缓冲液：0.2mol/L乙酸乙酸钠(pH 5.4)

结合缓冲液：PBS，pH7.2

清洗缓冲液：PBST，pH7.2

洗脱液：0.5％SDS或0.1mol/L HCl-甘氨酸缓冲液，pH 2.8

Claims (9)

1.一种流感病毒血凝素大规模分离纯化方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：

第一步：制备糖链磁性微粒复合物；

第二步：将初步纯化后的裂解的经鸡胚增殖的流感病毒液或细胞培养的流感病毒液与糖链磁性微粒复合物进行混合；

第三步：对特异吸附血凝素的糖链磁性微粒复合物进行清洗，除去病毒液中的杂质；

第四步：将与糖链磁性微粒复合物结合的流感病毒血凝素进行洗脱；

第五步：对洗脱的流感病毒血凝素进行鉴定；

第六步：糖链磁性微粒复合物的再生，重复使用；

所述制备糖链磁性微粒复合物包括以下步骤：

1)取2支离心管，分别放入羟基化磁性微粒1-15g；

2)对羟基化磁性微粒进行磁性分离；

3)对分离后的羟基化磁性微粒弃上清，并加入无水乙醇进行清洗；

4)对无水乙醇清洗后的羟基化磁性微粒再次弃上清，再加入偶联缓冲液进行清洗；

5)在装有偶联缓冲液清洗过的羟基化磁性微粒的2支离心管中每管加入90mL偶联缓冲液，并在其中一管加入15mmol/L含SAα2-3Gal的糖链10-100mL；另一管加入15mmol/L含SAα2-6Gal的糖链10-100mL；

6)对2支离心管内的羟基化磁性微粒、偶联缓冲液、糖链进行混匀；并进行2-10小时的振荡反应；糖链共价偶联到磁性微粒上，形成糖链磁性微粒复合物；

7)对糖链磁性微粒复合物进行磁性分离；

8)对磁性分离后的糖链磁性微粒复合物弃上清；并用结合缓冲液清洗3次；

9)对结合缓冲液清洗后的糖链磁性微粒复合物置于保存缓冲液中保存。

2.根据权利要求1所述流感病毒血凝素大规模分离纯化方法，其特征在于，所述偶联缓冲液是0.2mol/L乙酸钠，其pH是5.4；所述结合缓冲液是PBS，其pH是7.2；所述保存缓冲液是PBST，其pH7.2。

3.根据权利要求2所述流感病毒血凝素大规模分离纯化方法，其特征在于，所述第二步中将初步纯化后的裂解的经鸡胚增殖的流感病毒液或细胞培养的流感病毒液与糖链磁性微粒复合物进行混合包括以下步骤：

1)将两种糖链磁性微粒复合物放入离心管中；

2)在离心管中加入200-1000mL结合缓冲液，20-500mL初步纯化的流感病毒液和1-10mL的苯甲基磺酞氟，并混合均匀；

3)进行0.5-2小时的振荡反应，血凝素特异吸附到糖链磁性微粒复合物上。

4.根据权利要求1所述流感病毒血凝素大规模分离纯化方法，其特征在于，所述第三步对特异吸附血凝素的糖链磁性微粒复合物进行清洗，除去病毒液中的杂质包括以下步骤：

1)对特异吸附血凝素的糖链磁性微粒复合物进行磁性分离；

2)弃上清；并用清洗液清洗糖链磁性微粒复合物。

5.根据权利要求1所述流感病毒血凝素大规模分离纯化方法，其特征在于，所述第四步将与糖链磁性微粒复合物结合的流感病毒血凝素进行洗脱包括以下步骤：

1)将100-1000mL洗脱液加到装有清洗后的吸附有血凝素的糖链磁性微粒复合物的离心管中；

2)进行0.1-2h的振荡洗脱；

3)对糖链磁性微粒复合物进行磁性分离，获得上清液，即为纯化的流感病毒血凝素。

6.根据权利要求5所述流感病毒血凝素大规模分离纯化方法，其特征在于：所述洗脱液为0.1～1％SDS或0.1mol/L HCl-甘氨酸缓冲液，其pH为2.8。

7.根据权利要求1所述流感病毒血凝素大规模分离纯化方法，其特征在于，所述第五步对洗脱的流感病毒血凝素进行鉴定采用对流感病毒血凝素进行聚丙烯酰胺凝胶电泳分析法和用MODI-TOF质谱法检测法。

8.根据权利要求1所述流感病毒血凝素大规模分离纯化方法，其特征在于，所述第六步糖链磁性微粒复合物的再生，重复使用包括以下步骤：

1)用结合缓冲液对洗脱血凝素后的糖链磁性微粒复合物清洗多次，即可重复使用；

2)对结合缓冲液清洗后的糖链磁性微粒复合物可置于保存缓冲液中保存。

9.根据权利要求2～8任一所述流感病毒血凝素大规模分离纯化方法，其特征在于：所述羟基化磁性微粒和糖链偶联的最佳配比为0.45mmol/g。

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