CN102397540B

CN102397540B - A型禽流感重组噬菌体疫苗及其构建方法

Info

Publication number: CN102397540B
Application number: CN 201110373859
Authority: CN
Inventors: 徐海; 王义伟; 侯继波
Original assignee: Jiangsu Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Jiangsu Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2011-11-23
Filing date: 2011-11-23
Publication date: 2013-05-08
Anticipated expiration: 2031-11-23
Also published as: CN102397540A

Abstract

本发明提供了一种A型禽流感重组噬菌体疫苗及其构建方法，所说的疫苗以重组噬T7菌体为抗原，所说的重组T7噬菌体表面表达有氨基酸序列如SEQIDNO：2所示的H5亚型禽流感病毒M2蛋白膜外区23肽(M2e)，所说的M2e由两拷贝的M2e基因插入T7噬菌体P10B基因下游表达获得。本发明具有如下技术效果：(1)用T7噬菌体载体制备的重组噬菌体疫苗能够克服M2e自身免疫原性较弱的不足，有效的提高免疫原性，刺激机体产生更高水平的抗体。(2)M2蛋白在禽流感病毒不同亚型之间具有保守型，该重组噬菌体疫苗有望成为“通用型”禽流感疫苗的情景。(3)由于T7噬菌体易于培养、便于纯化，用于生产基因工程疫苗具有多种优势，本发明制备的A型禽流感重组噬菌体味疫苗便于大规模生产、成本低廉。

Description

A型禽流感重组噬菌体疫苗及其构建方法

技术领域

本发明涉及T7噬菌体展A型禽流感病毒M2蛋白膜外区23肽的重组噬菌体构建及应用，属于分子生物技术领域。

背景技术

禽流感(Avian Inlfuenza，AI)是由A型流感病毒引起的禽类(家禽和野禽)的一种从呼吸系统到严重全身性败血症等的多种疾病综合症。该病被世界卫生组织规定为A类传染病，也被我国列为一类动物疾病。一般来说，不同的流感病毒有着不同的宿主特异性，即禽流感病毒很难感染人类，人流感病毒也很难感染禽类。然而1997年香港从18个病人体内分离出高致病性H5N1禽流感，第一次明确禽类流感病毒未经过中间宿主就跨越物种屏障直接传染给人。

禽流感病毒(Avian infuenza virus，AIV)为正粘病毒科流感病毒属A型流感病毒，病毒颗粒呈球形或多形态。其基因组是长约13.6Kb的8个分节段的单股负链RNA，共编码10个多肽，分别为血凝素HA，神经氨酸酶NA，核蛋白NP，RNA多聚酶的复合物PB1、PB2、PA，基质蛋白M1、M2以及非结构蛋白NS1和NS2。病毒RNA片段通过与核蛋白相结合进行病毒的复制。病毒聚合酶PA、PB1和PB2聚合形成核蛋白复合体(RNP)，负责RNA的复制和转录。病毒的包膜来自宿主细胞的双层类脂膜，膜上镶嵌着3种膜蛋白，分别为HA、NA和M2蛋白。HA在病毒与宿主细胞膜结合时与受体结合，是重要的中和抗原；NA在新复制的子代病毒释放上起重要作用，也是重要的抗原；M2蛋白具有离子通道活性，可调节膜内pH，它的作用能被一些抗病毒药所抑制，如金刚烷胺(Amantadine)和金刚乙胺(Rimantadine)，其中金刚烷胺是通过阻断M2的离子通道作用来抑制病毒复制，从而有助于阻止病情发展，减轻病情。

M2基因包含14～39和728～995两个部分，其初始转录产物在剪切40～727位的内含子后，拼接成成熟的mRNA后翻译成M2蛋白。M2蛋白是97个氨基酸的完整膜蛋白，大量表达于感染细胞表面^[6]，包括细胞外氨基端(23个氨基酸残基)、跨膜区(25～43氨基酸残基)以及位于细胞内的羧基端(54个氨基酸残基)。膜表面的M2蛋白是以四聚体形式存在的，首先两个M2蛋白单体通过N端17位和19位的Cys之间形成的二硫键形成二聚体，然后两个二聚体再通过非共价键作用而形成四聚体，它们的跨膜区形成一个跨膜螺旋，作为离子通道。其中的37位His为质子结合位点，对离子通道的功能是至关重要的，而W41则作为粒子通道的大门，对离子通道的功能同样重要。

目前使用的禽流感疫苗主要是直接诱导针对病毒膜蛋白HA产生中和抗体。虽然这些疫苗的应用在对防控流感的过程中起到很好的作用，但是由于流感病毒HA和NA亚型众多，经常发生抗原转变和抗原漂移，使其抗原性表现出很大的变异。虽然近年来对流感病毒表面抗原HA和NA氨基酸序列甚至三维结构进行了测定，但流感病毒表面抗原的变异规律及其抗原决定簇出现的规律仍无法预测，因此每年都必需针对当年的流感病毒流行株来开发新疫苗，给流感疫苗的生产供应和免疫实施都带来很大困难。与HA、NA不同，流感病毒M2的氨基酸序列高度保守，从1933年首次分离到人A型流感病毒株A/WS/33(H1N1)以来，尽管经历了4次世界性大流行，M2胞外区都未发现明显差异。对1918年西班牙的流感毒株测序结果也是如此。虽然流感患者中只有少部分能查到M2抗体，但M2的抗血清确实有抑制流感病毒复制的功能。因此，人们认为M2也是流感病毒的保护性抗原，有可能发展成为具有交叉保护能力的“通用流感疫苗”的候选抗原，可以解决上述HA、NA变异和疫苗更换毒株问题，因此，目前世界各国都正在进行M2相关疫苗的研制。

发明内容

本发明的目的是克服现有禽流感疫苗缺少交叉保护的缺点，提供一种免疫效率高、通用性好的A型禽流感重组噬菌体疫苗。

本发明的A型禽流感重组噬菌体疫苗，以重组噬T7菌体为抗原，所说的重组T7噬菌体表面表达有氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示的H5亚型A禽流感病毒M2蛋白膜外区23肽(M2e)，所说的H5亚型禽流感病毒是比对NCBI发表的H5亚型禽流感病毒基因序列后选取的优势流行毒株，所说的M2e基因由两拷贝的优势流行毒株的M2e基因插入T7噬菌体P10B基因下游表达获得。

所述的两拷贝的M2e基因选自以下序列的核苷酸：

1)具有SEQ ID NO：1所示核苷酸序列；

2)具有SEQ ID NO：1所示序列经增加或减少拷贝数的核苷酸序列；

3)具有SEQ ID NO：1所示序列经改变、缺失或增加一个或几个核苷酸但仍表达具有GnRH主要抗原活性多肽的核苷酸序列。

所说的疫苗中还包含用于乳化重组T7噬菌体的白油佐剂。

本发明的A型禽流感重组噬菌体疫苗的构建方法，包括下列步骤：

A、构建重组噬菌体

(1)合成一段DNA序列，该DNA序列克隆至pUC-19载体多克隆位点中，DNA序列的5’端有酶切位点EcoRⅠ，3’端含有酶切位点HindⅢ，其DNA序列如SEQ ID NO：3所示；

(2)用限制性内切酶EcoRⅠ、HindⅢ将上述DNA序列从pUC-19载体上切下后插入T7噬菌体多克隆位点的EcoRⅠ和HindⅢ之间，构建重组噬菌体；

(3)用T7噬菌体包装蛋白组装重组噬菌体，包装产物通过琼脂糖夹心法扩增，用PCR方法筛选阳性重组噬菌体，重组噬菌体展示两拷贝的M2e，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示；

B、重组噬菌体的制备

甘油冻存的E.coli BL21菌株在LB体培养基平面上划线接种，37℃过夜培养；

从平皿上挑取单菌落，接种5mL LB培养液，37℃、200转/分震荡培养过夜，取3mL过夜培养物接种300mL LB培养液，培养至OD₆₀₀=0.8左右，挑取平皿上的单个噬菌斑，接种到培养好的BL21宿主菌中，37℃、100转/分震荡培养2-3小时，直至菌液由浑浊变为澄清，用PEG沉淀的方法回收噬菌体，并按常规的方法测定噬菌体滴度，将回收的噬菌体调整浓度为2×10¹³pfu/mL，并按照4‰的比例加入甲醛溶液，37℃、100转/分震荡灭活过夜；

C、制备重组噬菌体油乳剂疫苗

1）疫苗油相的制备：4mL司本80，2mL司本85，94mL 10号矿物油，2g硬脂酸铝，充分混匀，121℃高压20分钟；疫苗水相的制备：94mL滴度为2×10¹³pfu/mL的灭活噬菌体，4mL高压灭菌吐温-80，3000转/分钟搅拌均匀；

2）按照水相：油相比1:3的比例在高速乳化器上乳化至稳定的油包水结构，即为制备的重组噬菌体油乳剂疫苗；

所述的公猪去异味重组噬菌体疫苗的构建方法中，重组T7噬菌体的载体为T7 Select 415-1b。

本发明具有如下技术效果：

(1)本发明利用噬菌体具有的病毒样颗粒的佐剂的特性，用T7噬菌体载体制备的重组噬菌体疫苗能够克服M2e自身免疫原性较弱的不足，有效的提高免疫原性，刺激机体产生更高水平的抗体。

(2)M2蛋白在禽流感病毒不同亚型之间具有保守型，该重组噬菌体疫苗有望成为“通用型”禽流感疫苗的情景。

(3)由于T7噬菌体易于培养、便于纯化，用于生产基因工程疫苗具有多种优势，本发明制备的A型禽流感重组噬菌体味疫苗便于大规模生产、成本低廉。

附图说明

图1为重组T7噬菌体的基因鉴定。泳道1为DL2000 DNA Marker；泳道2为T7噬菌体载体对照；泳道3为重组T7噬菌体。

图2为重组噬菌体SDS-PAGE鉴定。泳道1为Blue Plus Protein Marker；泳道2为T7 Select 415-1b；泳道3为T7-FMD-VP1。

图3为重组噬菌体Western-blot鉴定。泳道1为Blue Plus Protein Marker；泳道2为T7 Select 415-1b；泳道3为T7-FMD-VP1。

图4为A型禽流感疫重组噬菌体疫苗免疫ELISA抗体水平图。

具体实施方式

实施例中，

编码如SEQ ID NO：3所示基因，是M2e主要抗原表位，为常规技术。

限制性内切酶EcoRⅠ、HindⅢ购自大连宝生物生物工程公司。

T7噬菌体载体、T7包装蛋白、E.coli BL21购自Novagen公司。

T7噬菌体的提取为常规技术。

T7噬菌体滴度的测定为常规技术。

实施例1 构建重组噬菌体

由商业公司合成一段DNA序列，该DNA序列已克隆至pUC-19载体多克隆位点中，DNA序列的5’端有酶切位点EcoRⅠ，3’端含有酶切位点HindⅢ，其DNA序列如SEQ ID NO：3所示

用限制性内切酶EcoRⅠ、HindⅢ将上述DNA序列从pUC-19载体上切下后插入T7噬菌体多克隆位点的EcoRⅠ和HindⅢ之间，构建重组噬菌体。

重组pUC-19载体双酶切体系：

ddH₂O	16.0 μL
		10×H Buffer	5.0 μL
pUC-19载体	25.0μL
		EcoRⅠ	2.0 μL
HindⅢ	2.0 μL

混匀上述反应体系，并置于37 ℃水浴作用4 小时，酶切产物同样经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定后，胶回收试剂盒进行切胶回收鉴定。

T7噬菌体载体双酶切体系：

ddH2O	11.0 μL
		10×T Buffer	2.0 μL
T7-Select 415b载体	5.0μL
		EcoRⅠ	1.0 μL
HindⅢ	1.0 μL

混匀上述反应体系，并置于37 ℃水浴作用4小时，酶切产物同样经0.5%琼脂糖凝胶电泳鉴定后，胶回收试剂盒进行切胶回收鉴定。

连接反应体系：

DNA片段回收产物	2.0 μL
		T7-Select 415b载体回收产物	0.5 μL
ddH2O	1.75 μL
		T4 DNA Ligase	0.25 μL
10×T4 DNALigase Buffer	0.5 μL

16℃连接过夜。

重组噬菌体的包装：

连接产物	5.0 μL
		T7 Packing Extracts	25.0 μL

22℃包装2小时，在包装反应体系中加入270μL LB培养液终止反应。

包装产物的平板扩增：

100μL包装反应物与250μL新鲜过夜培养的BL21菌液(OD600=1.0)混匀后，迅速与3mL融化的45℃温浴的顶层琼脂混合均匀平铺LB平皿，待顶层琼脂凝固后，37℃倒置培养至形成噬菌斑。挑取噬菌斑，PCR方法筛选阳性重组噬菌体。重组噬菌体表面展示M2e，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

实施例2 大量扩增重组噬菌体

甘油冻存的E.coli BL21菌株在LB体培养基平面上划线接种，37℃过夜培养；从平皿上挑取单菌落，接种5mL LB培养液，37℃、200转/分震荡培养过夜。取3mL过夜培养物接种300mL LB培养液，培养至OD₆₀₀=0.8左右。挑取平皿上的单个噬菌斑，接种到培养好的BL21宿主菌中，37℃、100转/分震荡培养2-3小时，直至菌液由浑浊变为澄清。用PEG-NaCl沉淀的方法回收噬菌体，并按常规的方法测定噬菌体滴度。将回收的噬菌体调整浓度为2×10¹³pfu/mL，并按照4‰的比例加入甲醛溶液，37℃、100转/分震荡灭活过夜。

实施例3 制备A型禽流感重组噬菌体油乳剂疫苗

重组噬菌体去异味油乳剂疫苗的制备方法如下：

疫苗油相的制备：4mL司本80，2mL司本85，94mL 10号矿物油，2g硬脂酸铝，充分混匀，121℃高压20分钟。疫苗水相的制备：94mL滴度为2×10¹³pfu/mL的灭活噬菌体，4mL高压灭菌吐温-80，3000转/分钟搅拌均匀。按照水相：油相比1:3的比例，在组织捣碎机加入150mL油相，一边缓慢搅拌一边缓慢加入50mL水相，带充分混匀后，10000转/快速搅拌2分钟至形成稳定的油包水结构，即为制备的重组噬菌体油乳剂疫苗，4℃保存备用。

实施例4 A型禽流感重组噬菌体油乳剂疫苗免疫效果

将上述制成的A型禽流感重组噬菌体油乳剂疫苗免疫3周龄禽流感非免疫鸡。重组T7噬菌体疫苗中抗原含量达到5×10¹²pfu/mL，每只鸡每次免疫0.2mL。具体操作如下：

将40只3周龄禽流感非免疫鸡分为4个组，每组10只。A型禽流感重组噬菌体疫苗、KLH-M2e多肽疫苗、H9亚型禽流感灭活疫苗各免疫10只鸡，其余10只作为空白对照。分别在免疫后的0、2、4、6、8周采血，检测ELSIA、中和抗体水平。

如图4所示，多肽ELISA检测结果表明：A型禽流感重组噬菌体疫苗免疫后机体产生高水平的抗M2e抗体，免疫后两周抗体迅速升高，OD₄₅₀值到达1.2以上，免疫后2到8周抗体水平仍有小幅上升，并能维持在OD₄₅₀1.5左右；M2e偶联KLH的多肽疫苗免疫后抗体上升缓慢，免疫后4周抗体到达高峰，但OD₄₅₀值仅有0.6。H9亚型禽流感灭活疫苗免疫后检测不到针对M2e的抗体，其OD值与空白对照相当。

表1为A型禽流感重组噬菌体疫苗免疫后血清中和抗体水平，如表1所示，鸡胚中和试验表明：在免疫后第4周，A型禽流感重组噬菌体疫苗免疫组其抗体能够完全中和50个EID₅₀含量的H9亚型禽流感病毒；KLH-M2e多肽疫苗免疫组抗体对25个EID₅₀含量的H9亚型禽流感病毒仅有80%的中和能力。中和试验表明A型禽流感重组噬菌体疫苗能够对不用亚型的禽流感病毒有中和作用，该疫苗有望成为禽流感“通用疫苗”。

表1：

<110> OrganizationName : 江苏省农业科学院

Application Project

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<120> Title : A型禽流感重组噬菌体疫苗及其构建方法

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Claims

1.A型禽流感重组噬菌体疫苗，其特征在于，以重组T7噬菌体为抗原，所说的重组T7噬菌体表面表达有氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示的H5亚型A禽流感病毒M2蛋白膜外区23肽，即M2e肽，所说的H5亚型禽流感病毒是比对NCBI发表的H5亚型禽流感病毒基因序列后选取的优势流行毒株，所说的M2e肽由两拷贝的优势流行毒株的M2e基因插入T7噬菌体P10B基因下游表达获得，所说的疫苗中还包含用于乳化重组T7噬菌体的白油佐剂，所述的重组T7噬菌体的载体为T7 Select 415-1b。

2.根据权利要求1所述的A型禽流感重组噬菌体疫苗，其特征在于，所述的两拷贝的M2e基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

3.权利要求1-2中任意一种A型禽流感重组噬菌体疫苗的构建方法，其特征在于，包括下列步骤：

A、构建重组噬菌体

B、重组噬菌体的制备

甘油冻存的E.coli BL21菌株在LB体培养基平面上划线接种，37℃过夜培养；从平皿上挑取单菌落，接种5mL LB培养液，37℃、200转/分震荡培养过夜，取3mL过夜培养物接种300mL LB培养液，培养至OD₆₀₀=0.8左右，挑取平皿上的单个噬菌斑，接种到培养好的BL21宿主菌中，37℃、100转/分震荡培养2-3小时，直至菌液由浑浊变为澄清，用PEG沉淀的方法回收噬菌体，并按常规的方法测定噬菌体滴度，将回收的噬菌体调整浓度为2×10¹³pfu/mL，并按照4‰的比例加入甲醛溶液，37℃、100转/分震荡灭活过夜；

C、制备重组噬菌体油乳剂疫苗。