CN105408347A - 寡聚流感免疫原性组合物 - Google Patents

Abstract

本发明描述了用于预防流感病毒感染的蛋白质和免疫原性组合物，其中所述免疫原性组合物包含免疫原如甲型流感病毒的M2e和HA2FP结构域以及免疫增强物如人IgG的Fc片段以及任选的稳定化序列。

Description

寡聚流感免疫原性组合物

与相关申请的交叉引用

本申请根据35U.S.C.§119(e)要求于2013年2月15日提交的美国临时专利申请61/765,519的权益，其全部内容以引用并入本文。

关于联邦资助研究的声明

本发明是在美国国立卫生研究院授予的批准号为R03AI088449的政府支持下进行的。政府对本发明享有一定的权力。

技术领域

本公开内容涉及用于预防流感感染的免疫原性组合物。

背景技术

属于正粘病毒(Orthomyxoviridae)科的甲型流感病毒可在人类、禽类或驯养食用动物中导致流感。该病毒可基于其表面糖蛋白、血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)而被进一步分为不同亚型。在已知的18种HA和11种NA中，三种HA亚型(H1、H2和H3)和两种NA亚型(N1和N2)在人类中是最常见的。H1N1和H3N2是导致人类季节性流感和全球流行性流感的主要亚型。2009年的流感流行是由猪源性甲型流感病毒H1N1所引起的。这已导致人们对高致病性禽流感(HPAI)H5N1病毒的流行可能性的关注增加。因此，迫切需要开发针对不同甲型流感病毒株的有效且安全的疫苗以预防流感在未来爆发。

发明概述

本文公开了用于预防和治疗流感病毒感染的蛋白质和免疫原性组合物。

在一个实施方式中，提供了包含免疫原序列的蛋白质，所述免疫原序列包含甲型流感病毒基质蛋白M2e结构域或其片段，以及甲型流感病毒血凝素融合肽(FP)结构域或其片段；以及免疫增强物(immunopotentiator)序列。

在一个实施方式中，FP结构域来自于甲型流感病毒血凝素亚型1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17或18。在另一个实施方式中，FP结构域和M2e结构域独立地来自于选自H1N1病毒、H1N2病毒、H2N2病毒、H3N2病毒、H5N1型病毒、H7N2病毒、H7N3病毒、H7N7病毒、H7N9病毒、H9N2病毒或H10N8病毒的甲型流感病毒。在另一个实施方式中，FP结构域的氨基酸序列与SEQIDNO.3、7、17、18、19或20中的一个至少90％相同。在另一个实施方式中，M2e结构域的氨基酸序列与SEQIDNO.4、8、21、22、23或24中的一个至少90％相同。在某些实施方式中，免疫原包括M2e-FP或FP-M2e。

在另一个实施方式中，蛋白质还包含稳定化序列。在另一个实施方式中，所述稳定化序列为折叠子(Fd)或GCN4序列。

在另一个实施方式中，免疫增强物序列为人IgGFc的Fc片段序列、C3d序列、旋盘尾丝虫(Onchocercavolvulus)ASP-1序列、霍乱毒素序列或胞壁酰肽序列。在另一个实施方式中，免疫增强物序列与SEQIDNO.10的人IgGFc序列至少90％相同。

在另一个实施方式中，所述蛋白质为融合蛋白。在一个实施方式中，所述免疫增强物序列被连接至免疫原序列的C端。在另一个实施方式中，所述稳定化序列被连接至免疫原序列的C端；且免疫增强物序列被连接至稳定化序列的C端。在某些实施方式中，融合蛋白包括M2e-FP-Fc、FP-M2e-Fc、M2e-FP-FdFc或FP-M2e-FdFc。

在另一个实施方式中，所述融合蛋白还包含位于至少一个以下位置的连接子序列：免疫原序列的M2e和FP结构域之间、免疫原序列和稳定化序列之间，以及稳定化序列和免疫增强物序列之间。在另一个实施方式中，所述连接子为(GGGGS)_n，其中n为0和8之间的整数。在一个实施方式中，n为1。

还提供了一种免疫原性组合物，其包含本文所公开的蛋白质以及至少一种药学上可接受的赋形剂。在另一个实施方式中，所述免疫原性组合物还包含佐剂。

本文还提供了一种在受试者中诱导针对流感病毒的免疫应答的方法，其包括向所述受试者施用本文所公开的免疫原性组合物或蛋白质。在另一个实施方式中，所述免疫应答为保护性免疫应答。在另一个实施方式中，所述流感病毒是甲型流感病毒、乙型流感病毒或丙型流感病毒。

本文还提供了一种预防受试者的流感病毒感染的方法，其包括向所述受试者施用本文所公开的免疫原性组合物或蛋白质。在另一个实施方式中，免疫应答为保护性免疫应答。在另一个实施方式中，所述流感病毒是甲型流感病毒、乙型流感病毒或丙型流感病毒。

附图简述

图1A-B示出了含甲型流感病毒H5N1M2e和FP结构域的与折叠子(Fd)和人IgG可结晶(Fc)部分片段融合(M2e-FP-FdFc，其也被称为M2e-FP-FdFc)或与Fc融合(M2e-FP-Fc)或M2e仅与Fc融合(M2e-Fc)以及H7N9M2e和FP与Fd以及人IgG的Fc融合(H7N9M2e-FP-FdFc)的所构建的重组融合蛋白的示意性结构。H5N1和H7N9甲型流感病毒的M2e和FP的高度保守序列以及Fd序列被列在顶部。H5N1和H7N9的M2e和FP中氨基酸残基的差异用下划线标出。

图2A-C示出了通过SDS-PAGE和Western印迹进行的重组M2e-FP融合蛋白的表征。用SDS-PAGE分析纯化的H5N1M2e-FP融合蛋白，然后考马斯蓝染色(图2A)并通过分别使用H5N1M2e-(图2B)和HA2-特异性MAb进行Western印迹(图2C)。在左边示出了蛋白质分子量标记(kDa)。MAb以1：3000进行稀释以用于H5N1病毒的M2e(#16)和HA2(1B12)。

图3A-B示出了由重组H5N1M2e-FP融合蛋白所诱导的抗流感IgG抗体应答。PBS被用作阴性对照。图3A：在每次接种后10天收集的小鼠血清(1：6400)中检测H5N1M2e-FP特异性IgG抗体应答。数据被表示为每组5只小鼠的平均A450±标准差(SD)。图3B：IgG抗体的结合至重组H5N1M2e-FP融合蛋白的能力，其中在最后一次接种后10天收集的小鼠血清中检测IgG抗体。数据被表示为各稀释点的每组5只小鼠的平均A450±SD。

图4A-B示出了IgG1(图4A)和IgG2a(图4B)抗体的结合至重组H5N1M2e-FP融合蛋白的能力，其中在最后一次接种后10天收集的小鼠血清中检测抗体。PBS被用作阴性对照。数据被表示为各稀释点的每组5只小鼠的平均A450±SD。

图5A-B示出了由重组H5N1M2e-FP融合蛋白诱导的针对1050％致死剂量(LD₅₀)的H5N1病毒攻击的跨分支(cross-clade)保护。接种的小鼠经鼻内(i.n.)分别受到10LD₅₀的H5N1病毒分支1：A/越南/1194/2004(VN/1194)(图5A)或分支2.3.4：A/深圳/406H/06(SZ/406H)(图5B)的攻击，并监控被攻击小鼠的存活率(％)2周。用时序检验(log-ranktest)的Kaplan-Meier生存分析来分析每组8只小鼠的生存曲线之间的显著性。*和**分别指示与对照组相比P<0.05和P<0.01。

图6A-B示出了由重组H5N1M2e-FP融合蛋白诱导的针对3LD₅₀的H5N1病毒攻击的跨分支保护。接种的小鼠经鼻内(i.n.)受到3LD₅₀的H5N1病毒分支1：VN/1194(图6A)或分支2.3.4：SZ/406H(图6B)的攻击，并监控被攻击小鼠的存活率(％)2周。用时序检验的Kaplan-Meier生存分析来分析每组8只小鼠的生存曲线之间的显著性。**和***分别指示与对照组相比P<0.01和P<0.0001。

图7A-B示出了来自在致命性H5N1病毒攻击后接种重组H5N1M2e-FP融合蛋白的小鼠肺组织的病毒滴度。接种的小鼠经鼻内(i.n.)分别受到10LD₅₀(图7A)或3LD₅₀(图7B)的H5N1病毒分支1：VN/1194或分支2.3.4：SZ/406H的攻击，并在攻击后5天在所收集的肺组织中检测病毒滴度。数据被表示为Log₁₀TCID₅₀/g肺组织，并被表现为每组5只小鼠的几何平均滴度(GMT)±SD。检测的下限为1.5Log₁₀TCID₅₀/g组织。在不同组之间的P值被示出。

图8示出了重组H5N1M2e-FP融合蛋白与重组H7N9M2e-FP-FdFc蛋白质所诱导的IgG抗体应答的交叉反应性的检测。PBS被用作阴性对照。在最后一次接种后10天收集的小鼠血清中检测IgG抗体。数据被表示为各稀释点的每组5只小鼠的平均A450±SD。

术语定义

为了便于对下面的详细描述、实施例和所附权利要求的理解，参考下列定义是有用的。这些定义的性质是非限制性的且仅仅是为方便读者而提供的。

基因：本文所使用的“基因”是指具有基因构建体所需的或修改基因构建体的表达所需的启动子和/或其他调控序列的基因构建体的至少一部分。

宿主：如在本文所使用的，“宿主”是指本发明免疫原性组合物的接受者。示例性宿主是哺乳动物，包括但不限于灵长类动物、啮齿类动物、牛、马、狗、猫、绵羊、山羊、猪和大象。在本发明的一个实施方式中，宿主为人。对于本公开内容的目的而言，宿主等同于“被接种者”。

免疫原：如在本文所使用的，术语“免疫原”是指在宿主中引发免疫应答的任何物质。

免疫原性组合物：如在本文中所使用的，“免疫原性组合物”指具有或不具有佐剂的所表达的蛋白质或重组载体，其在体内表达和/或分泌免疫原，且其中所述免疫原在宿主中引发免疫应答。本文所公开的免疫原性组合物可以是或可以不是免疫保护性或治疗性的。当免疫原性组合物可预防、改善、缓和或消除宿主的疾病时，免疫原性组合物任选地被称为疫苗。然而，术语免疫原性组合物不旨在局限于疫苗。

融合蛋白：如在本文中所使用的，术语“融合蛋白”指通过结合最初编码分离的蛋白质或肽的两个或更多个核酸序列而创建的蛋白质。典型地，融合蛋白是由重组DNA技术人工创建的。组合的核苷酸序列的表达产生包括来自所有来源的序列的融合蛋白。

发明详述

特别是由于高致病性禽流感(HPAI)H5N1病毒的不同毒株的流行可能性，迫切需要开发针对不同的甲型流感病毒(IAV)的有效且安全的免疫原性组合物以预防未来的流感爆发。本公开内容描述了基于IAV血凝素(HA)2的基质蛋白2胞外结构域(M2e)和“融合肽”结构域(FP)的流感免疫原性组合物的开发。该免疫原性组合物在被免疫动物中诱导强的免疫应答以及广泛的交叉保护性免疫。

能够提供异源亚型免疫性的通用流感免疫原性组合物将使公共健康获得巨大的进步。本文公开了流感免疫原性组合物融合蛋白，其包含两个免疫原IAVHA2蛋白质的M2e胞外结构域和FP结构域，其随后与免疫增强物相连接。任选地，三聚稳定化序列位于免疫原和免疫增强物之间。免疫原可以是任何顺序的；然而，免疫增强物在免疫原的C端。

如本文关于流感免疫原性组合物所使用的，术语“通用”指可诱导针对与免疫原来源不同的分支或毒株的流感病毒的保护性免疫应答的免疫原性组合物。例如，由来自H5N1病毒的序列构成的免疫原性组合物也可针对H1N1或H7N9病毒提供保护。此外，由来自一种IAV的序列所构成的免疫原性组合物也针对所有或大多数其他IAV提供保护。此外，由来自IAV的序列构成的免疫原性组合物也针对乙型流感病毒或丙型流感病毒提供保护。

基于在病毒表面上的两种蛋白质HA和神经氨酸酶(NA)，甲型流感病毒被分成亚型。例如，“H7N2病毒”指示具有HA7蛋白质和NA2蛋白质的IAV亚型。类似地，“H5N1”病毒具有HA5蛋白质和NA1蛋白质。存在18种已知的HA亚型和11种已知的NA亚型。HA和NA蛋白质的多种不同的组合也是可能的。不管免疫原来自何种毒株，所要求保护的免疫原性组合物针对其他IAV毒株的感染提供保护。此外，所公开的免疫原性组合物针对乙型流感病毒和丙型流感病毒感染是保护性的。

流感病毒进一步通过其血清型进行分类并通过病毒类型、地理起源、毒株号、分离年份和病毒亚型进行标示。例如，A/安徽/1/2005(H5N1)指于2005年源于中国安徽的IAV，其毒株号为1且为H5N1亚型。

血凝素(HA)为流感病毒的同源三聚体整合膜糖蛋白。其为圆筒状且约为13.5纳米长。构成HA的三个相同的单体构建成中央α螺旋卷曲；三个球形头含有唾液酸结合位点。HA单体被合成为前体，其随后被糖基化并被剪切成两个较小的多肽：HA1和HA2亚基。每个HA单体由通过HA2在膜中固定的长的螺旋链和其上的大HA1球的组成。HA的最保守区域位于HA2亚基的N端，被称为“融合肽”(FP)的氨基酸(aa)的相对疏水序列。在一个实施方式中，FP结构域包含IAV的HA2亚基的前20-30个aa。在另一些实施方式中，FP结构域包含IAV的HA2亚基的前21-29个aa、前22-29个aa、前23-28个aa、前21个aa、前22个aa、前23个aa、前24个aa、前25个aa、前26个aa、前27个aa、前28个aa或前29个aa。示例性FP结构域可在SEQIDNO.3、7、17、18、19和20中找到。

流感病毒M2蛋白是跨膜离子通道，其允许质子通过病毒包膜移动并酸化病毒核心，这导致核心分解并释放病毒RNA和核心蛋白。M2蛋白的外部结构域(M2e)为23个aa长并具有高度保守序列。示例性M2e结构域可在SEQIDNO.4、8、21、22、23和24中找到。

之前设计的基于流感HA的疫苗不能在宿主中诱导高度有力和广泛的中和应答，这最可能是因为这些疫苗无法正确地保持稳定和可溶的三聚体构型，或其缺乏有效的免疫原性以诱导高水平的中和抗体。目前所描述的免疫原性组合物已通过将IgG的Fc(可结晶片段)连接至IAV片段而解决了这些问题，这导致免疫原的免疫原性增强，从而针对广谱的流感病毒诱导高水平的交叉保护。此外，Fc片段有通过其二硫键形成非共价二聚体的趋势，其可允许融合蛋白形成二聚物、六聚物或其他形式的寡聚物，从而产生更具免疫原性的分子。在某些实施方式中，在需要改善构型稳定性的情况下，稳定化或三聚化序列允许融合蛋白保持稳定且可溶的三聚体构型。

针对特定病毒的不同毒株诱导抗体的能力解决了所有流感疫苗制造商所面临的显著障碍，即一毒株一疫苗的问题。此外，所描述的免疫原性组合物不需要用鸡卵生长病毒——这是一个主要的优点，这不仅显著降低了制造时间和成本，而且还允许孕妇和对鸡卵蛋白变应的人接受疫苗。所公开的蛋白质改为由标准的重组蛋白生产方式进行生产的。

在一个实施方式中，本免疫原性组合物或蛋白质的FP结构域组分包括来自任何亚型，即亚型H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15、H16、H17或H18的IAVHA的序列。在另一个实施方式中，FP结构域组分来自亚型H1、亚型H2、亚型H3、亚型H5、亚型H7或亚型H9的IAVHA。在另一个实施方式中，FP结构域来自H1N1IAV、H1N2IAV、H2N2IAV、H3N2IAV、H5N1IAV、H7N2IAV、H7N3IAV、H7N7IAV、H7N9IAV、H9N2IAV或H10N8IAV；或任何IAV的FP序列。在另一个实施方式中，本免疫原性组合物的M2e组分可包括来自H1N1IAV、H1N2IAV、H2N2IAV、H3N2IAV、H5N1IAV、H7N2IAV、H7N3IAV、H7N7IAV、H7N9IAV、H9N2IAV或H10N8IAV的序列；或任何IAV的M2e序列。上述结构域中每个的氨基酸和核酸序列均可在流感研究数据库中找到(http://www.fludb.org/brc/home.do？decorator＝influenza)。在本文中，术语“蛋白质”和“多肽”指类似的结构并可互换使用。

表1连接免疫增强物的寡聚流感免疫原性组合物的氨基酸序列。

在一个实施方式中，稳定化序列包含将HA序列稳定为三聚体或寡聚物构型中序列。如在本文中所使用的，术语稳定化序列、三聚体基序和三聚化序列是可互换的且是等同的。合适的稳定化序列包括但不限于T4纤维蛋白序列(折叠子样序列)的C端结构域的27个aa区域；(GYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFL，SEQIDNO.9或GSGYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFL，SEQIDNO.13)、GCN4序列(MKQIEDKIEEILSKIYHIENEIARIKKLIGEV；SEQIDNO.14)序列、IQ序列(RMKQIEDKIEEIESKQKKIENEIARIKK；SEQIDNO.15)或IZ序列(IKKEIEAIKKEQEAIKKKIEAIEK；SEQIDNO.16)。其它合适的稳定化方法包括但不限于2,2-联吡啶-5-羧酸(BPY)、二硫键和温和连接(facileligation)。

在另一个实施方式中，所述免疫增强物包括用于加强免疫原性组合物的免疫原性的序列。合适的免疫增强物包括但不限于人IgG的Fc片段(SEQIDNO.10)、C3d(SEQIDNO.25)、促进结合至增强其树突细胞和B细胞摄取的抗原的抗体形成的补体片段、Ov-ASP-1(活化相关分泌基因家族(activationassociatedsecretedgenefamily)的旋盘尾丝虫同系物)(见美国20060039921，其关于Ov-ASP-1佐剂的全部公开内容通过引用并入本文)、霍乱毒素(SEQIDNO.26)、胞壁酰二肽，和其片段。

在一个实施方式中，所述免疫增强物为免疫球蛋白Fc片段。免疫球蛋白分子由通过二硫键保持在一起的两个轻链(LC)和两个重链(HC)构成，从而使链形成Y形。Y(HC的羧基末端)的基部起调节免疫细胞活性的作用。这个区域被称为Fc区，并且是由构成取决于抗体种类的两个或三个恒定结构域的两个HC构成的。通过结合至特定的蛋白质，Fc区确保每个抗体生成用于给定抗原的适当的免疫应答。Fc区还结合多种细胞受体，如Fc受体以及其他免疫分子，如补体蛋白。由此，其介导不同的生理作用，包括调理作用、细胞裂解和肥大细胞、嗜碱细胞和嗜酸细胞的脱粒。

在图1中示出示例性免疫原性组合物。在某些实施方式中，融合蛋白的M2e结构域和FP结构域序列通过包含(GGGGS)_n(SEQIDNO.27)(其中n为0-8的整数)的柔性连接子连接。在某些实施方式中，n为0、n为1、n为2、n为3、n为4、n为5、n为6、n为7或n为8。此外，融合蛋白的FP和Fd和/或Fc部分通过包含(GGGGS)_n(其中n为0-8的整数)的柔性连接子连接。在某些实施方式中，n为0、n为1、n为2、n为3、n为4、n为5、n为6、n为7或n为8。

在额外的实施方式中，提供了免疫原性组合物的保守性修饰变体的用途。本文所描述的变体保持了母体或源分子的生物活性。

如本文中所使用的，“保守替换”涉及用一个氨基酸替换在下列保守替换组之一中找到的另一个氨基酸：第一组：丙氨酸(Ala)、甘氨酸(Gly)、丝氨酸(Ser)、苏氨酸(Thr)；第二组：天冬氨酸(Asp)、谷氨酸(Glu)；第三组：天冬酰胺(Asn)、谷氨酰胺(Gln)；第四组：精氨酸(Arg)、赖氨酸(Lys)、组氨酸(His)；第五组：异亮氨酸(Ile)、亮氨酸(Leu)、甲硫氨酸(Met)、缬氨酸(Val)；和第六组：苯丙氨酸(Phe)、酪氨酸(Tyr)、色氨酸(Trp)。

此外，氨基酸可通过类似的功能或化学结构或成分(例如，酸性、碱性、脂肪族、芳香族、含硫)而被分成保守替换组。例如，脂肪族分组可包括用于替换的Gly、Ala、Val、Leu和Ile。另一些含有被认为是彼此互为保守替换的氨基酸的组包括：含硫：Met和半胱氨酸(Cys)；酸性的：Asp、Glu、Asn和Gln；小脂肪族非极性或弱极性的残基：Ala、Ser、Thr、Pro和Gly；极性且带负电荷的残基及其酰胺：Asp、Asn、Glu和Gln；极性且带正电荷的残基：His、Arg和Lys；大脂肪族非极性的残基：Met、Leu、Ile、Val和Cys；以及大芳香族残基：Phe、Tyr和Trp。

所述修饰(其在正常情况下不改变一级序列)包括在体内或体外的多肽或蛋白质的化学衍生，例如，乙酰化或羧化。此外，还包括糖基化修饰，例如通过在其合成和加工或在进一步的加工步骤中修改多肽或蛋白质的糖基化模式而做的修饰；例如，通过将多肽或蛋白质暴露于影响糖基化的酶，例如哺乳动物的糖基化或去糖基化酶。还包括具有磷酸化aa残基(例如磷酸酪氨酸、磷酸丝氨酸或磷酸苏氨酸)的序列。

还包括已使用普通分子生物学技术进行修饰以改善其对蛋白水解降解的抗性或优化溶解性的蛋白质。这种蛋白质的类似物包括含有非天然存在的L-氨基酸的(如D-氨基酸或非天然存在的合成氨基酸)残基的那些。本文所公开的蛋白质不限于本文所列的具体示例性过程中的任一个的产物。

因此，本文所公开的是M2e结构域序列、FP结构域序列、免疫增强物序列、人Fc序列、Fd序列、GCN4序列、IQ序列、IZ序列、融合蛋白序列或具有一个或几个aa缺失、替换和/或添加并保持未替换的肽或蛋白质的生物活性的蛋白质序列。

如本文中所使用的，基本上相同的多肽序列通常享有大于95％的aa同一性。然而，要认识到，作为剪切变体产生而含有小于上述同源性水平的蛋白质(和编码这种蛋白质的DNA或mRNA)或通过保守性aa替换(或简并密码子替换)而修饰的蛋白质均被认为在本公开的范围之内。如本领域的技术人员易于认识到的，已设计出多种方式以比对用于比较的序列，例如BLOSUM62评分矩阵，如Henikoff和Henikoff在Proc.Natl.AcadSci.USA89:10915(1992)中所描述的。方便地用于该目的的算法已广泛可得(见，例如Needleman和Wunsch，J.Mol.Bio.48:443(1970))。

因此，与M2e结构域序列、FP结构域序列、免疫增强物序列、人Fc序列、Fd序列、GCN4序列、IQ序列、IZ序列、融合蛋白序列或本文所公开的蛋白序列85％-100％相同的aa序列均在本公开的范围内。在该实施方式的一些方面中，aa序列与M2e结构域序列、FP结构域序列、免疫增强物序列、人Fc序列、Fd序列、GCN4序列、IQ序列、IZ序列、融合蛋白序列或本文所公开的蛋白序列至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同。

下列表达系统适用于表达所公开的蛋白质、免疫原、免疫增强物和稳定化序列：哺乳动物细胞表达系统，例如但不限于pcDNA和GS基因表达系统；昆虫细胞表达系统，例如但不限于Bac-to-Bac、杆状病毒和DES表达系统；以及大肠杆菌(Escherichiacoli)表达系统，包括但不限于pET、pSUMO和GST表达系统。

多种优点与蛋白质在哺乳动物细胞表达系统中表达有关。哺乳动物细胞表达系统是用于表达重组蛋白的相对成熟的真核系统。其更可能实现具有合适糖基化的正确折叠的可溶性蛋白，使所表达的蛋白质保持其天然构型并保持足够的生物活性。该系统可瞬时或稳定地表达重组抗原并促进信号合成。以这种方式表达的重组蛋白可保持良好的抗原性和免疫原性。然而，昆虫和细菌表达系统提供了在某些条件下可适合的廉价且有效的蛋白质表达。

最佳的纯化系统取决于标签是否与融合蛋白相连接或融合。如果融合蛋白与IgGFc、蛋白质A或蛋白质G相融合，则使用亲和层析进行纯化。如果融合蛋白与GST蛋白相融合，则将GST柱用于纯化。如果融合蛋白在N或C端与6xHis标签相连接，则可使用His标签柱纯化所表达的蛋白质。如果没有标签与融合蛋白相连接，则可使用快速蛋白液相色谱(FPLC)、高效液相色谱(HPLC)或其他色谱法纯化所表达的蛋白。

在某些实施方式中，所述免疫原性组合物还包含佐剂或与佐剂一起施用。适于在动物中使用的佐剂包括但不限于弗氏完全或不完全佐剂、西格玛佐剂系统(SAS)和Ribi佐剂。适于在人类中使用的佐剂包括但不限于MF59(水包油乳液佐剂)、MontanideISA51或720(矿物油基或可代谢油基佐剂)、氢氧化铝、-磷酸酯/盐或-氧化物、(以丙烯酸聚合物为基础的佐剂、IntervetInc.，Millsboro,DE)、聚丙烯酸、基于例如矿物油如BAYOL^TM或MARCOL^TM(EssoImperialOilLimited,Canada)的水包油或油包水乳液，或植物油如维生素E乙酸酯、皂甙和旋盘尾丝虫活化相关蛋白-1(Ov-ASP-1)(见美国20060039921，其关于Ov-ASP-1佐剂的全部内容通过引用并入本文)。然而，具有佐剂活性的组分是广泛已知的，且通常可使用不对疫苗和/或免疫原性组合物的功效或安全性产生不利干扰的任何佐剂。

根据本文所公开的多种实施方式的免疫原性组合物可以液体、冷冻悬液或冻干的形式进行制备和/或销售。通常，根据本公开制备的疫苗和/或免疫原性组合物含有通常用于这类组合物的药学上可接受的载体或稀释剂。载体包括但不限于稳定剂、防腐剂和缓冲剂。合适的稳定剂是，例如SPGA、吐温组合物(如从A.G.Scientific,Inc.,SanDiego,CA购得的)、碳水化合物(如山梨醇、甘露醇、淀粉、蔗糖、葡聚糖、谷氨酸或葡萄糖)、蛋白质(如干乳清、白蛋白或酪蛋白)或它们的降解产物。合适的缓冲剂的非限制性实例包括碱金属磷酸盐。合适的防腐剂为硫柳汞(thimerosal)、雷硫汞(merthiolate)和庆大霉素。稀释剂包括水、水性缓冲剂(如缓冲盐水)、醇和多元醇(如甘油)。

本文还公开了使用所公开的蛋白质或免疫原性组合物诱导对流感病毒的免疫应答的方法。通常，所述蛋白质或免疫原性组合物可皮下、经皮、粘膜下或肌内以有效量施用以预防感染所针对的流感病毒和/或治疗流感病毒感染。有效量被定义为蛋白质或免疫原性组合物在接种的动物中诱导抵抗有毒力病毒的攻击的免疫力的免疫量。免疫力在本文中被定义为与未接种的组相比，在接种后在动物群体中诱导出显著更高水平的保护。

保护性免疫应答可包括体液免疫应答和细胞免疫应答。针对流感的保护被认为是主要通过针对表面蛋白的血清抗体(体液免疫应答)而赋予的，其中粘膜IgA抗体和细胞介导的免疫应答也发挥作用。细胞免疫应答有益于针对流感病毒感染的保护，其中CD4+和CD8+T的细胞应答是得到充分证实的。CD8+免疫对于杀死病毒感染的细胞特别重要。

进一步地，在所述蛋白质和/或免疫原性组合物的多种剂型中，如本领域普通技术人员所已知的，可添加合适的赋形剂、稳定剂等。

所公开的蛋白质、免疫原性组合物和方法可用于在流感病毒易感的受试者(例如但不限于人、灵长类动物、驯养动物、野生动物或禽)中预防流感病毒感染。

实施例

实施例1

H5N1病毒的重组疫原性蛋白质的构建和检测

编码与Fd相融合的H5N1IAV的24个aa的M2e结构域(M2e的1-24个残基)和28个aa的FP结构域(HA2的1-28个残基)的基因从作为模板的含M2e的质粒和IAVH5N1(A/安徽/1/2005(H5N1))的全长HA质粒(使用重叠引物与Fd片段融合在一起)通过PCR扩增，接着pFUSE-hlgG1-Fc2表达载体，生成H5N1M2e-FP-FdFc(下文被称为M2e-FP-FdFc)。为了进行比较，扩增的H5N1M2e-FP基因或M2e基因也被直接插入上述表达载体中，分别形成M2e-FP-Fc和M2e-Fc(图1)。H7N9M2e-FP-FdFc(例如，M2e-FP-FdFc)通过对H7N9(A/安徽/1/2013(H7N9))流感病毒的M2e和FP序列进行PCR扩增并使用重叠引物与Fd相融合，且随后插入pFUSE-hlgG1-Fc2表达载体中而构建。序列已确认的重组质粒经磷酸钙法被转染至哺乳动物293T细胞中，通过使用收集的培养上清液的蛋白质A亲和层析纯化相关的重组蛋白。所表达的蛋白质通过使用M2e-和HA2-特异性mAb的SDS-PAGE和Western印迹进行表达和特异性确认(图2)。

然后，使用三种纯化的H5N1M2e-FP融合蛋白来以三个周间隔免疫小鼠三次，在免疫前和每次接种后10日收集血清以检测M2e-和FP-特异性抗体和亚型的产生(图3-4)。分别使用1050％致死剂量(10LD₅₀)和3LD₅₀检测接种的小鼠抵抗覆盖分支1：A/越南/1194/2004(VN/1194)或分支2.3.4：A/深圳/406H/06(SZ/406H)的H5N1病毒攻击的跨分支保护(图5-6)。监控被攻击的小鼠2周，在这之后计算存活率(％)。在病毒攻击后5日在所收集的小鼠肺组织中还检测了病毒滴度(图7)。

实验结果显示，重组H5N1M2e-FP融合蛋白能够在转染细胞的培养上清液中以高纯度表达，并被特异性靶向IAV的M2e和FP结构域的mAb所识别。所有三种融合蛋白，特别是融合Fd和Fc的M2e-FP(M2e-FP-FdFc)，能够形成具有构象结构的高分子量分子(图2)。这些融合蛋白，特别是M2e-FP-FdFc，在接种的小鼠血清中诱导高强度的M2e和/或FP-特异性IgG抗体和IgG1和IgG2a亚型，其在最后一次接种后达到最高的抗体滴度。一般而言，M2e-FP-FdFc蛋白质诱导比M2e-FP-Fc或M2e-Fc相对更强的抗体应答，这可能是由于添加的Fd和Fc促进高分子量分子形成，因此提高了免疫原性(图3-4)。重要的是，Me-FP的重组融合蛋白能够保护接种的小鼠抵抗分别10LD₅₀和3LD₅₀的VN/1194和SZ/406HH5N1病毒的检测毒株。特别地，M2e-FP-FdFc蛋白质完全交叉保护所有接种小鼠抵抗分支1：VN/1194和分支2.3.4：SZ/406H在3LD₅₀致死剂量的攻击，其还交叉保护了70％的接种小鼠抵抗这两种病毒在10LD₅₀致死剂量的攻击。作为比较，M2e-FP-Fc，特别是M2e-Fc提供了显著更低的保护率。在PBS对照组中没有小鼠在两种病毒株攻击第9-11天后存活(图5-6)。相应地，在VN/1194和SZ/406HH5N1病毒分别以3LD₅₀和10LD₅₀的致死攻击后，在接种M2e-FP-FdFc，随后是M2e-FP-Fc和随后是M2-Fc蛋白质的小鼠中检测到更低水平的病毒滴度。然而，在PBS对照组中的病毒滴度仍显著高于所有检测小鼠的接种组(图7)。用H7N9M2e-FP-FdFc蛋白质检测这些接种小鼠血清的交叉反应性显示，所有三个H5N1融合蛋白均能够在接种的小鼠中诱导这样的IgG抗体应答，即其与含有新出现的禽IAVH7N9的M2e和FP结构域的保守序列的重组蛋白交叉反应(图8)，这表明这些H5N1融合蛋白具有针对H7N9IAV感染的潜在保护性。

上述结果表明，含有M2e和FP的高度保守表位序列并与Fd和Fc相融合的所表达的重组流感免疫原性组合物(M2e-FP-FdFc)具有被开发为针对不同流感病毒(包括IAV)的“通用”流感疫苗的巨大潜力，这意味着其在预防未来流感大爆发中的能力。

除非另有说明，否则在说明书和权利要求书中所有表示成分数量、特性如分子量、反应条件等的数字均应被理解为在所有的情况下均可用术语“约”进行修饰。因此，除非有相反的说明，否则在说明书和所附的权利要求中所列的数值参数均为可根据本发明所追求的所需特性而发生变化的近似值。最起码且并不旨在将等同物的教义的应用限制为权利要求的范围，每个数值参数应至少按照所报道的有效数字的数量，并采用一般四舍五入的技术进行解释。尽管规定本发明的宽广范围的该数值范围和参数为近似值，但在具体实例中所列出的数值也要尽可能精确地进行报道。然而，任何数值均固有地含有某些误差，这些误差是由其各自的试验测量的标准差而必然导致的。

在描述本发明的上下文中(特别是在下列权利要求的上下文中)未使用数量词修饰时要被解释为包括单数和复数，除非本文另有说明外或通过上下文发现明显矛盾外。本文中值的范围的叙述仅旨在用作单独提及在本范围内的每个单独值的速记方法。除非本文另有说明外，每个单独的值均被并入本说明书中，如其在本文中单独列举一样。本文所述的所有方法可按任何合适的顺序进行，除非本文另有说明外或通过上下文发现明显矛盾外。使用本文所提供的任何和所有的实例或示例性语言(例如，“如”)仅旨在更好地阐明本发明而不会对以其他方式要求保护的本发明的范围构成限制。说明书中的任何语言不应被解释为指示实践本发明所必需的任何非要求保护的元素。

本文所公开的本发明的可替代元素或实施例的分组不应被解释为限制。可单独或与该组其它成员或与本文所找到的其他元素以任何组合的方式提及和要求保护每组成员。可预料的是，出于便利性和/或专利性的原因，一个组中的一个或多个成员可被包括在一个组中或从一个组中删除。当发生任何这种包括或删除时，本说明书被认为是含有修改后的组，从而完成在所附权利要求中使用的所有马库西组的书面描述。

本文描述了本发明的某些实施方式，其包括了发明人已知的实施本发明的最佳模式。当然，对于本领结构域的普通技术人员来说，在阅读上述描述后，这些所述实施方式的变型将变得更为显而易见。发明人期望本领结构域的技术人员适当地采用这些变型且发明人希望本发明能按不同于本文所述的具体方式予以实施。因此，本发明包括如适用法律所允许的在所附权利要求中所述主题的所有修改和等同物。此外，在其所有可能的变型中的上述元素的任何组合均包括在本发明中，除非本文另有说明外或通过上下文发现明显矛盾外。

本文所公开的具体实施例可使用由......组成或大体由......组成的语言在权利要求中进行进一步地限制。当在权利要求中使用时，无论每个修正提交的还是添加的，过渡术语“由......组成”不包括未在权利要求中指定的任何元素、步骤或成分。过渡术语“基本由......组成”将权利要求的范围限制为所指定的材料或步骤或那些实质上不影响基本和新颖特征的材料或步骤。因此，本发明所要求保护的实施方式均在本文进行了本质上或明确地描述和启用。

此外，在整个说明书中对专利和印刷出版物进行了许多参考。上述参考和印刷出版物中的每一个均通过引用的方式全部并入本文。

最后，要理解的是，本文所公开的发明的实施方式是用来说明本发明的原理的。在本发明的范围中可采用其他修改。因此，可按举例的方式而非限制的方式根据本文的教导使用本发明的可替代配置。因此，本发明并不局限于精确示出和描述的那些。

Claims (29)

1.蛋白质，其包含：

免疫原序列，所述免疫原序列包含甲型流感病毒基质蛋白M2e结构域或其片段，和甲型流感病毒血凝素融合肽(FP)结构域或其片段；以及

免疫增强物序列。

2.根据权利要求1所述的蛋白质，其中所述FP结构域来自甲型流感病毒血凝素亚型1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17或18。

3.根据权利要求1所述的蛋白质，其中所述FP结构域和所述M2e结构域独立地来自选自以下的甲型流感病毒：H1N1病毒、H1N2病毒、H2N2病毒、H3N2病毒、H5N1病毒、H7N2病毒、H7N3病毒、H7N7病毒、H7N9病毒、H9N2病毒或H10N8病毒。

4.根据权利要求1所述的蛋白质，其中所述FP结构域的氨基酸序列与SEQIDNO.3、7、17、18、19或20之一至少90％相同。

5.根据权利要求1所述的蛋白质，其中所述M2e结构域的氨基酸序列与SEQIDNO.4、8、21、22、23或24之一至少90％相同。

6.根据权利要求1所述的蛋白质，其中所述蛋白质还包含稳定化序列。

7.根据权利要求4所述的蛋白质，其中所述稳定化序列为折叠子(Fd)或GCN4序列。

8.根据权利要求1所述的蛋白质，其中所述免疫增强物序列为人IgGFc的Fc片段序列、C3d序列、旋盘尾丝虫(Onchocercavolvulus)ASP-1序列、霍乱毒素序列或胞壁酰肽序列。

9.根据权利要求1所述的蛋白质，其中所述免疫增强物序列与SEQIDNO.10的人IgGFc序列至少90％相同。

10.根据权利要求1所述的蛋白质，其中所述蛋白质为融合蛋白。

11.根据权利要求10所述的蛋白质，其中所述免疫原包括M2e-FP。

12.根据权利要求10所述的蛋白质，其中所述免疫原包括FP-M2e。

13.根据权利要求10所述的蛋白质，其中所述免疫增强物序列被连接至所述免疫原序列的C端。

14.根据权利要求10所述的蛋白质，其中所述稳定化序列被连接至所述免疫原序列的C端；以及所述免疫增强物序列被连接至所述稳定化序列的C端。

15.根据权利要求11所述的蛋白质，其中所述融合蛋白包括M2e-FP-Fc。

16.根据权利要求12所述的蛋白质，其中所述融合蛋白包括FP-M2e-Fc。

17.根据权利要求11所述的蛋白质，其中所述融合蛋白包括M2e-FP-FdFc。

18.根据权利要求12所述的蛋白质，其中所述融合蛋白包括FP-M2e-FdFc。

19.根据权利要求10所述的蛋白质，其中所述融合蛋白还包含位于至少一个以下位置处的连接子序列：所述免疫原序列的M2e和FP结构域之间、所述免疫原序列和所述稳定化序列之间，以及所述稳定化序列和所述免疫增强物序列之间。

20.根据权利要求19所述的蛋白质，其中所述连接子为(GGGGS)_n，其中n为0和8之间的整数。

21.根据权利要求20所述的蛋白质，其中n为1。

22.免疫原性组合物，其包含根据权利要求1-15中任一项所述的蛋白质以及至少一种药学上可接受的赋形剂。

23.根据权利要求16所述的免疫原性组合物，其中所述免疫原性组合物还包含佐剂。

24.一种在受试者中诱导针对流感病毒的免疫应答的方法，其包括：

向所述受试者施用根据权利要求16所述的免疫原性组合物。

25.根据权利要求19所述的方法，其中所述免疫应答为保护性免疫应答。

26.根据权利要求19所述的方法，其中所述流感病毒是甲型流感病毒、乙型流感病毒或丙型流感病毒。

27.一种预防受试者被流感病毒感染的方法，其包括：

向所述受试者施用根据权利要求16所述的免疫原性组合物。

28.根据权利要求27所述的方法，其中免疫应答为保护性免疫应答。

29.根据权利要求27所述的方法，其中所述流感病毒是甲型流感病毒、乙型流感病毒或丙型流感病毒。