CN112126647A

CN112126647A - 一种流感病毒的环状rna疫苗

Info

Publication number: CN112126647A
Application number: CN202011050576.0A
Authority: CN
Inventors: 刘文军; 李晶; 闵洁; 白志华
Original assignee: Institute of Microbiology of CAS
Current assignee: Institute of Microbiology of CAS
Priority date: 2020-09-29
Filing date: 2020-09-29
Publication date: 2020-12-25
Anticipated expiration: 2040-09-29
Also published as: CN112126647B

Abstract

本发明公开了一种流感病毒的环状RNA疫苗。本发明提供了一种环状RNA分子(HA2‑M2e circ mRNA)，如序列表的序列8所示。本发明还提供了一种蛋白质(HA2‑M2e circ mRNA翻译得到的蛋白质)，如序列表的序列2所示。本发明还保护所示蛋白质的编码基因。本发明还保护含有所述编码基因的DNA分子。所述环状RNA分子、所述蛋白、所述基因均可用于制备广谱于多种流感病毒的疫苗。本发明对于流感病毒的防控具有重大的应用推广价值。

Description

一种流感病毒的环状RNA疫苗

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种流感病毒的环状RNA疫苗。

背景技术

信使RNA，即messenger RNA(mRNA)是经由DNA模板链转录而来，其序列与编码链相同，与模板链互补。与原核生物不同，真核生物中携带遗传信息的mRNA由编码蛋白的外显子和无编码功能的内含子间隔排列组成。只有经过正确修饰、剪接的成熟mRNA才能作为信息模板转运到细胞质中进一步翻译产生蛋白质。

环状RNA，即circular RNA(circRNA)是一类内源性非编码RNA，在原核和真核生物细胞中广泛存在。真核细胞中的环状RNA来自于mRNA前体(pre-mRNA)的反向剪接。目前发现的circRNA根据其在基因组中的来源不同可以分为以下三类，即外显子来源的circRNA、内含子来源的circRNA以及由外显子和内含子共同组成的circRNA。与线性RNA不同，circRNA可形成不具有5′端帽子和3′端多聚腺苷酸尾巴的共价闭合环状结构，这使得circRNA可免受核糖核酸酶和核酸外切酶的降解，具有比线性RNA更长的半衰期以及更强的稳定性。内源性的circRNA有时也可作为转录本翻译产生蛋白质，包含有内部核糖体进入位点(IRES)的外源合成的circRNA也可以被翻译。

基于mRNA修饰和递送工具的发展，mRNA疫苗成为传染病防治领域的重要手段。其优势在于一旦获得病毒抗原序列，可在数周内迅速设计和制造具有临床规模的mRNA疫苗，使其在应对大流行暴发方面非常具有吸引力。然而，由于mRNA稳定性差等原因，尚未有成功的mRNA疫苗问世。

发明内容

本发明的目的是提供一种流感病毒的环状RNA疫苗。

本发明提供了一种环状RNA分子(HA2-M2e circ mRNA)，如序列表的序列8所示。HA2-M2e circ mRNA是由序列表的序列6所示的DNA分子或重组质粒IAV-circmRNA-1.0-pBluescript II KS(+)或线性化的重组质粒IAV-circmRNA-1.0-pBluescript II KS(+)进行体外转录得到的。所述体外转录的反应体系中含有ATP、CTP、GTP和UTP。所述反应体系具体可为(20μl)：1μg线性化质粒，2μl NTP混合物，2μl 10×反应buffer和T7转录酶，余量为DEPC水。NTP混合物提供的有效成分为ATP、CTP、GTP和UTP。反应体系中，ATP、CTP、GTP和UTP的浓度均为100mM，T7转录酶的含量为100U。

本发明还提供了一种环状RNA分子(HA2-M2e circ mRNA_m6A/A)，为将HA2-M2e circmRNA中腺嘌呤核糖核苷酸替换为N6-甲基腺嘌呤核糖核苷酸的环状RNA分子。HA2-M2e circmRNA_m6A/A具体为将HA2-M2e circ mRNA中部分腺嘌呤核糖核苷酸替换为N6-甲基腺嘌呤核糖核苷酸的环状RNA分子。HA2-M2e circ mRNA_m6A/A中，N6-甲基腺嘌呤核糖核苷酸与腺嘌呤核糖核苷酸的摩尔配比为1:99。N6-甲基腺嘌呤核糖核苷酸随机分布。HA2-M2e circ mRNA_m6A/A是由序列表的序列6所示的DNA分子或重组质粒IAV-circmRNA-1.0-pBluescript II KS(+)或线性化的重组质粒IAV-circmRNA-1.0-pBluescript II KS(+)进行体外转录得到的。所述体外转录的反应体系中含有ATP、CTP、GTP、UTP和m6A-ATP。反应体系中，ATP和m6A-ATP的摩尔配比为99:1。所述反应体系具体可为(20μl)：1μg线性化质粒，2μl NTP混合物，m6A-ATP，2μl 10×反应buffer和T7转录酶，余量为DEPC水。NTP混合物提供的有效成分为ATP、CTP、GTP和UTP。反应体系中，ATP的浓度为99mM，CTP、GTP和UTP的浓度均为100mM，m6A-ATP的浓度为1mM，T7转录酶的含量为100U。

重组质粒IAV-circmRNA-1.0-pBluescript II KS(+)：将序列表的序列6所示的DNA分子取代pBluescript II KS(+)质粒中的小片段(该小片段如序列表的序列7所示)，得到重组质粒IAV-circmRNA-1.0-pBluescript II KS(+)。

线性化的重组质粒IAV-circmRNA-1.0-pBluescript II KS(+)：取重组质粒IAV-circmRNA-1.0-pBluescript II KS(+)，采用限制性内切酶XhoI进行酶切，得到线性化的重组质粒IAV-circmRNA-1.0-pBluescript II KS(+)。

本发明还保护蛋白质，为如下(a)或(b)：

(a)蛋白质(HA2-M2e circ mRNA翻译得到的蛋白质，命名为HA2-M2e蛋白)，如序列表的序列2所示；

(b)蛋白质，如序列表的序列1所示。

本发明还保护所述蛋白质的编码基因。

所述蛋白质的编码基因具体可如序列表的序列3所示。

含有所述基因的DNA分子也属于本发明的保护范围。

所述DNA分子具体可如序列表的序列4或序列表的序列5或序列表的序列6所示。

本发明还保护含有所述基因的重组质粒。

本发明还保护含有所述DNA分子的重组质粒。

本发明还保护含有所述基因的重组微生物。

本发明还保护含有所述DNA分子的重组微生物。

以上任一所述重组质粒具体可为重组质粒IAV-circmRNA-1.0-pBluescript IIKS(+)。

以上任一所述重组微生物具体可为将重组质粒IAV-circmRNA-1.0-pBluescriptII KS(+)导入大肠杆菌BL21(DE3)得到的重组菌。

本发明还保护以上任一所述环状RNA分子、以上任一所述蛋白质、以上任一所述基因、以上任一所述DNA分子、以上任一所述重组质粒或以上任一所述重组微生物在制备流感病毒疫苗中的应用。

本发明还保护以上任一所述环状RNA分子、以上任一所述蛋白质、以上任一所述基因、以上任一所述DNA分子、以上任一所述重组质粒或以上任一所述重组微生物作为流感病毒疫苗的应用。

本发明还保护一种流感病毒疫苗，其活性成分为以上任一所述环状RNA分子、以上任一所述蛋白质、以上任一所述基因、以上任一所述DNA分子、以上任一所述重组质粒或以上任一所述重组微生物。

以上任一所述流感病毒具体可为A型流感病毒。

以上任一所述流感病毒具体可为甲型流感病毒。

以上任一所述流感病毒具体可为H1N1亚型流感病毒、H3N2亚型流感病毒、H5N6亚型流感病毒、H7N9毒亚型流感病毒或H9N2亚型流感病毒。

本发明的发明人首先设计了具有多种流感病毒抗原的蛋白质及其编码RNA，进一步通过序列设计使携带抗原信息的mRNA环化成为circRNA。环状RNA具有良好的稳定性，且不会影响蛋白质的表达。此外，通过核酶介导的体外转录环化环状RNA本身可激活RIG-I信号通路，不需要额外添加免疫佐剂即可起到增强免疫的效果，其激活效果较polyI:C稍强。为了降低部分人群对polyI:C这种免疫增强剂的副作用，在体外转录过程中按比例对其进行m6A修饰，在保证蛋白翻译的同时，适当降低其对RIG-I信号通路的过分激活。本发明提供的疫苗对于多种亚型的流感病毒均具有良好的免疫保护效果，对于人或动物的流感防控具有重大应用价值。

附图说明

图1为环化鉴定的电泳图。

图2为Western blot的结果图。

图3为采用H1N1-WSN-HA抗原作为包被原的结果。

图4为采用H1N1-M2e抗原作为包被原的结果。

图5为采用H3N2-M2e抗原作为包被原的结果。

图6为采用H5-M2e抗原作为包被原的结果。

图7为采用H7N9-M2e抗原作为包被原的结果。

图8为采用H9N2-M2e抗原作为包被原的结果。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。如无特殊说明，实施例中的PBS缓冲液均为pH 7.2、0.01M的PBS缓冲液。

如无特殊说明，以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

实施例1、构建重组质粒

通过大量毒株序列分析，对H1N1-WSN-HA抗原进行截短改造，基于病毒变异引入多点突变，整合H1N1-M2e抗原、H3N2-M2e抗原、H5-M2e(H5N1、H5N6)抗原、H7N9-M2e抗原、H9N2-M2e抗原，各区段之间采用GGGGS连接，设计得到序列表的序列1所示的蛋白质。在序列表的序列1所示蛋白质的N端增加白细胞介素-2信号肽，同时在C端增加Flag标签，设计得到序列表的序列2所示的蛋白质。

通过密码子优化，得到序列表的序列3所示的DNA分子，编码序列表的序列2所示的蛋白质。在序列表的序列3所示DNA分子的下游增加IRES序列，得到序列表的序列4所示的DNA分子。IRES具有招募核糖体的功能。

利用序列4的末端序列并增加部分核苷酸，使序列中具有四个环化位点：环化位点C1(TGATAAT)、环化位点C1’(GTTATCA)、环化位点C10(ATGTA)、环化位点C10’(TACAT)。然后在上游增加介导体外剪切环化的核酶3’端内含子序列，在下游增加介导体外剪切环化的核酶5’端内含子序列。得到序列表的序列5所示的DNA分子。

序列表的序列6所示的DNA分子中，第1-19位核苷酸组成T7启动子，第28-2312位核苷酸与序列表的序列5一致。将序列表的序列6所示的DNA分子取代pBluescript II KS(+)质粒中的小片段(该小片段如序列表的序列7所示)，得到重组质粒IAV-circmRNA-1.0-pBluescript II KS(+)。序列表的序列6所示DNA分子转录得到序列表的序列8所示的环化RNA，环化RNA翻译得到序列表的序列2所示的蛋白质。将序列表的序列2所示的蛋白质命名为HA2-M2e蛋白。

实施例2、制备环化RNA

1、取重组质粒IAV-circmRNA-1.0-pBluescript II KS(+)，采用限制性内切酶XhoI进行酶切，回收线性化质粒。

2、转录得到RNA

反应体系(20μl)：1μg线性化质粒，2μl NTP混合物，2μl 10×反应buffer和T7转录酶，余量为DEPC水。NTP混合物提供的有效成分为ATP、CTP、GTP和UTP。反应体系中，ATP、CTP、GTP和UTP的浓度均为100mM，T7转录酶的含量为100U。NTP混合物：北京盛科博源生物科技有限公司，产品目录号为70906。10×反应buffer：上海远慕生物科技有限公司，产品目录号为YM-MY162J。T7转录酶：北京百奥莱博生物科技有限公司，产品目录号为JN0010。

反应条件：37℃水浴，16h。

3、完成步骤2后，采用QIAGEN公司的RNA纯化试剂盒进行纯化，得到纯化后RNA。

4、线性RNA的消化

取步骤3得到的纯化后RNA，先72℃孵育5min，再冰浴孵育2min，然后加入RNase R(每1μg RNA加入1U RNase R)并37℃孵育3h。

5、完成步骤4后，采用QIAGEN公司的RNA纯化试剂盒进行纯化，得到纯化后RNA。

6、环化鉴定

取步骤5得到的纯化后RNA，采用反转录引物进行反转录，然后采用环化位点鉴定引物对进行PCR扩增，然后进行1％琼脂糖凝胶电泳。

反转录引物：5'-CGCTACAGACGTTGTTTGTCTTCAAGAAGC-3'。

环化位点鉴定引物对如下：

F：5'-GTGCCACGTTGTGAGTTGGATAGTTGTG-3'；

R：5'-TGCAGCTCAGCAGCTGCATCCTGTAC-3'。

电泳图见图1的泳道1，显示约250bp的目标带，表明得到了环化RNA。

实施例3、采用HA2-M2e circ mRNA制备HA2-M2e蛋白

2、转录得到RNA并进行纯化

取步骤1得到线性化质粒，使用HiScribe^TMT7 High Yield RNA Synthesis Kit(New England Biolabs(UK)Ltd)进行体外转录，具体操作步骤按照说明书进行。

3、取步骤2的产物，采用RNeasy Mini Kit(QIAGEN)进行纯化，得到纯化后RNA。

4、环化鉴定

方法同实施例2的步骤6。

电泳图见图1的泳道2，显示约250bp的目标带，表明得到了环化RNA。

因此，将步骤3得到的纯化后RNA命名为HA2-M2e circ mRNA。

5、HA2-M2e circ mRNA的体外表达鉴定

(1)取24孔板，接种HEK293T细胞(200000个细胞/孔)，采用含10％血清和1％青链霉素的培养基(Thermo Fisher Scientific)培养18小时。

(2)完成步骤(1)后，在转染前一小时更换为无血清的Opti-MEM培养基(ThermoFisher Scientific)，然后借助Lipofectamine^TM2000转染试剂(Thermo FisherScientific)转染HA2-M2e circ mRNA(1μg RNA/孔)，培养6小时。

(3)完成步骤(2)后，将培养基替换为含10％血清和1％青链霉素的培养基(ThermoFisher Scientific)，培养42小时。

(4)完成步骤(3)后，1000g离心10min，收集上清液。

(5)取步骤(4)得到的上清液，进行非还原型SDS-PAGE，然后进行Western blot。Western blot采用的一抗为抗Flag标签的单克隆抗体(mAb)(Sino Biological)，二抗为抗鼠源抗体(gAb)(EASYBIO BE0105-100)。

结果见图2。结果表明，得到了HA2-M2e蛋白。

6、HA2-M2e circ mRNA体外表达量的检测

(1)取24孔板，接种HEK293T细胞(100000个细胞/孔)，采用含10％血清和1％青链霉素的培养基(Thermo Fisher Scientific)培养18小时。

(2)完成步骤(1)后，在转染前一小时更换为无血清的Opti-MEM I培养基(ThermoFisher Scientific)，然后借助Lipofectamine^TM2000转染试剂(Thermo FisherScientific)转染HA2-M2e circ mRNA(1μg RNA/孔)，培养6小时。

(3)完成步骤(2)后，将培养基替换为含10％血清和1％青链霉素的培养基(ThermoFisher Scientific)，培养24小时。

(4)完成步骤(3)后，1000g离心10min，收集上清液。

(5)取步骤(4)得到的上清液，进行聚丙烯凝胶电泳检测，显示单一条带且符合预期分子量，结果表明，上清液中含有电泳纯的目标蛋白。

(6)取步骤(4)得到的上清液，采用BradFord法检测蛋白浓度，计算蛋白产量。

经换算，每毫升细胞培养上清中含有500μg HA2-M2e蛋白。

实施例4、制备具有m6A的环化RNA

2、转录得到RNA

反应体系(20μl)：1μg线性化质粒，2μl NTP混合物，m6A-ATP，2μl 10×反应buffer和T7转录酶，余量为DEPC水。NTP混合物提供的有效成分为ATP、CTP、GTP和UTP。反应体系中，ATP浓度为99mM、CTP、GTP和UTP的浓度均为100mM，m6A-ATP的浓度为1mM，T7转录酶的含量为100U。10×反应buffer：上海远慕生物科技有限公司，产品目录号为YM-MY162J。T7转录酶：北京百奥莱博生物科技有限，产品目录号为JN0010。m6A-ATP：TriLink Biotechnologies，产品目录号为Cat#N-1013-1。

反应条件：37℃水浴，16h。

4、线性RNA的消化

取步骤3得到的纯化后RNA，先72℃孵育5min，再冰浴孵育2min，然后加入RNase R(每1μg RNA加入1URNase R)并37℃孵育3h。

6、环化鉴定

方法同实施例2的步骤6。

电泳图见图1的泳道3，显示约250bp的目标带，表明得到了环化RNA。

因此，将步骤5得到的纯化后RNA命名为HA2-M2e circ mRNA_m6A/A。由于反应体系中同时含有ATP和m6A-ATP，且两者的摩尔配比为99：1，基于等几率结合的原则，HA2-M2e circmRNA_m6A/A中ATP和m6A-ATP均是随机分布的且二者的摩尔配比为99：1。

7、转录产物体外表达量的检测

同实施例3的步骤6。

每毫升细胞培养上清中含有500μg HA2-M2e蛋白。

实施例5、大批量制备HA2-M2e circ mRNA

1、将重组质粒IAV-circmRNA-1.0-pBluescript II KS(+)导入大肠杆菌BL21(DE3)，得到重组菌。

2、将步骤1得到的重组菌单克隆接种至10mL含100μg/ml氨苄青霉素的液体LB培养基，37℃、220rpm振荡培养16小时。

3、完成步骤2后，离心，收集细胞沉淀，进行细胞破碎，然后提取RNA。

4、取步骤3得到的RNA，采用QIAGEN公司的RNA纯化试剂盒进行纯化，得到纯化后RNA。

5、线性RNA的消化

取步骤4得到的纯化后RNA，先72℃孵育5min，再冰浴孵育2min，然后加入RNase R(每1μg RNA加入1URNase R)并37℃孵育3h。

6、完成步骤5后，采用QIAGEN公司的RNA纯化试剂盒进行纯化，得到纯化后RNA。

7、取步骤6得到的纯化后RNA，先72℃孵育3min，再冰浴孵育2min，然后添加RNAloading dye(New England Biolabs,B0363S)，进行1％琼脂糖凝胶电泳，然后使用Zymoclean胶回收试剂盒(Zymo Research,R1011)回收目标RNA。

8、取步骤7得到的RNA，使用4.6×3300mm size分子筛(Sepax Technologies,215980P-4630)进行HPLC分离纯化。

9、手动收集筛选后的液体，并用RNA Clean&Concentrator-5(Zymo Research,R1013)试剂盒进行浓缩回收。

10、环化鉴定

方法同实施例2的步骤6。

电泳图见图1的泳道4，显示约250bp的目标带，表明得到了环化RNA。

11、检测步骤9得到的RNA总量。

每10mL完成步骤2的培养体系，可制备得到10mg环化RNA。

实施例6、circ mRNA疫苗效力评价

一、免疫方案设计

6-8周龄雌性BALB/c小鼠随机分为7组(每组50只)：阴性对照组、HA2-M2e circmRNA高剂量组、HA2-M2e circ mRNA中剂量组、HA2-M2e circ mRNA低剂量组、HA2-M2e circmRNA_m6A/A高剂量组、HA2-M2e circ mRNA_m6A/A中剂量组和HA2-M2e circ mRNA_m6A/A低剂量组。采用肌内免疫，试验第1天进行初次免疫，试验第14天进行加强免疫，每次免疫剂量相同，单次免疫剂量见表1。单体免疫体积均为500μl(用生理盐水调整)。

表1

阴性对照组	注射500μl生理盐水
		HA2-M2e circ mRNA低剂量组	注射实施例3制备的HA2-M2e circ mRNA 2μg
HA2-M2e circ mRNA中剂量组	注射实施例3制备的HA2-M2e circ mRNA 15μg
		HA2-M2e circ mRNA高剂量组	注射实施例3制备的HA2-M2e circ mRNA 30μg
HA2-M2e circ mRNA<sub>m6A/A</sub>低剂量组	注射实施例4制备的HA2-M2e circ mRNA<sub>m6A/A</sub> 2μg
		HA2-M2e circ mRNA<sub>m6A/A</sub>中剂量组	注射实施例4制备的HA2-M2e circ mRNA<sub>m6A/A</sub> 15μg
HA2-M2e circ mRNA<sub>m6A/A</sub>高剂量组	注射实施例4制备的HA2-M2e circ mRNA<sub>m6A/A</sub> 30μg

二、血清特异性抗体检测

试验第0天(即初次免疫的前1天)、试验第14天(加强免疫前)、试验第28天，分别于小鼠眼眶后静脉丛取血。

包被抗原分别采用如下：H1N1-WSN-HA抗原(如序列表的序列9所示)、H1N1-M2e抗原(如序列表的序列10所示)、H3N2-M2e抗原(如序列表的序列11所示)、H5-M2e抗原(如序列表的序列12所示)、H7N9-M2e抗原(如序列表的序列13所示)、H9N2-M2e抗原(如序列表的序列14所示)。

1、取96孔板，加入包被抗原溶液(100μl/孔)，4℃包被15小时，弃上清。包被抗原溶液中，包被抗原的浓度为5μg/ml。

2、完成步骤1后，取所述96孔板，每孔加入100μl含3g/100ml BSA的PBS缓冲液，37℃封闭1小时，然后采用PBS缓冲液洗涤5次。

3、完成步骤2后，取所述96孔板，加入供试血清样本(50μl/孔)，37℃孵育30分钟。每孔供试血清样本设置3-5个复孔。

供试血清样本的制备方法：取血清，56℃加热30分钟以灭活，得到灭活血清；取灭活血清，采用PBS缓冲液作为溶剂，先稀释至10倍体积，再连续进行2倍梯度稀释，得到供试血清样本。

4、完成步骤3后，弃上清，采用PBS缓冲液洗涤3次，加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗小鼠IgG(1:50 000,ZSGB-BIO),37℃孵育30分钟。

5、完成步骤4后，弃上清，采用PBS缓冲液洗涤5次，加入TMB显色液，37℃避光孵育15分钟，用酶标板阅读器(Bio Tek)读取吸光度(450nm)。

采用H1N1-WSN-HA抗原作为包被原的结果见图3。采用H1N1-M2e抗原作为包被原的结果见图4。采用H3N2-M2e抗原作为包被原的结果见图5。采用H5-M2e抗原作为包被原的结果见图6。采用H7N9-M2e抗原作为包被原的结果见图7。采用H9N2-M2e抗原作为包被原的结果见图8。

三、病毒中和实验

试验第28天，于小鼠眼眶后静脉丛取血。

供试病毒如下：

H1N1亚型流感病毒为WSN病毒A/WSN/1933(H1N1)毒株。记载于如下文献：Neumann,G.et al.,Generation of influenza A viruses entirely from cloned cDNAs.P NatlAcad Sci Usa 96(16),9345(1999)。

H3N2亚型流感病毒为A/Duck/Alberta/78/1976(H3N2)毒株。记载于如下文献：Lizheng Guan.H3N2 avian influenza viruses detected in live poultry markets inChina bind to human-type receptors and transmit in guinea pigs andferrets.Emerg Microbes Infect.2019；8(1):1280-1290。

H5N6亚型流感病毒为A/duck/Vietnam/LBM360c1-4-1/2013(H5N6)毒株。记载于如下文献：Yuhai Bi.Genesis,Evolution and Prevalence of H5N6 Avian InfluenzaViruses in China.Cell Host Microbe.2016.20(6):810-821。

H7N9亚型流感病毒为A/Zhejiang/LS01/2014(H7N9)毒株。记载于如下文献：雷永良et al.,人感染禽流感病毒A/Zhejiang/LS01/2014(H7N9)株HA基因序列分析.《中国卫生检验杂志》2015年第10期。

H9N2亚型流感病毒为A/Chicken/Hebei/4/2008(H9N2)毒株。记载于如下文献：张瑞华et al.,H9N2亚型猪流感病毒对小鼠的致病性及其分子特性研究.《中国预防兽医学报》2011年第07期。

1、将MDCK细胞接种至细胞培养瓶，培养至形成单层细胞。

2、将供试病毒与供试血清等体积混合(每0.2ml混合液含100PFU供试病毒)，37℃静置孵育1小时，然后接种至完成步骤1的细胞培养瓶，37℃孵育1小时，然后加入44℃预热的营养琼脂，平放1小时，凝固后放入37℃、5％CO₂恒温培养箱，孵育7天。

3、完成步骤2后，统计空斑数量，使空斑减少50％的血清稀释度即为该血清的中和效价。

中和效价结果见表2。结果显示，circmRNA疫苗免疫后，小鼠产生了针对甲型流感病毒各亚型毒株的中和抗体。

表2

四、疫苗保护效力评价

试验第28天，每组小鼠分为5个亚组(每组10只)，分别采用不同供试毒株进行攻毒(5种供试毒株的信息见步骤三)，单只小鼠的攻毒剂量均为12.5LD50，鼻腔喷入。完成攻毒后，持续观察21天。

结果如见表3至表7。结果表明，用中高剂量circ mRNA(15μg、30μg)免疫小鼠，可对不同亚型的流感病毒攻击提供完全保护。

表3采用H1N1攻毒后的免疫保护效果评价

表4采用H3N2攻毒后的免疫保护效果评价

表5采用H5N6攻毒后的免疫保护效果评价

表6采用H7N9攻毒后的免疫保护效果评价

表7采用H9N2攻毒后的免疫保护效果评价

以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国科学院微生物研究所

<120> 一种流感病毒的环状RNA疫苗

<130> GNCYX202536

<160> 14

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 405

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<400> 1

Met Lys Ala Lys Leu Leu Val Leu Leu Tyr Ala Phe Val Ala Thr Asp

1 5 10 15

Ala Asp Thr Ile Cys Ile Gly Tyr His Ala Asn Asn Ser Thr Asp Thr

20 25 30

Val Asp Thr Ile Phe Glu Lys Asn Val Ala Val Thr His Ser Val Asn

35 40 45

Leu Leu Glu Asp Gly Gly Gly Gly Ser Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu

50 55 60

Thr Pro Thr Arg Ser Glu Trp Glu Cys Arg Cys Ser Gly Ser Ser Asp

65 70 75 80

Gly Gly Gly Gly Ser Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg

85 90 95

Asn Glu Trp Gly Cys Arg Cys Asn Asp Ser Ser Asp Gly Gly Gly Gly

100 105 110

Ser Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Thr Arg Asn Glu Trp Glu

115 120 125

Cys Arg Cys Ser Asp Ser Ser Asp Gly Gly Gly Gly Ser Ser Leu Leu

130 135 140

Thr Glu Val Glu Thr Pro Thr Arg Thr Gly Trp Glu Cys Asn Cys Ser

145 150 155 160

Gly Ser Ser Glu Gly Gly Gly Gly Ser Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu

165 170 175

Thr Leu Thr Arg Thr Gly Trp Glu Cys Asn Cys Ser Gly Ser Ser Asp

180 185 190

Gly Gly Gly Gly Ser Lys Tyr Val Cys Ser Thr Lys Leu Arg Met Val

195 200 205

Thr Gly Leu Arg Asn Lys Pro Ser Lys Gln Tyr Gln Gly Leu Phe Gly

210 215 220

Ala Ile Ala Gly Phe Thr Glu Gly Gly Trp Thr Gly Met Ile Asp Gly

225 230 235 240

Trp Tyr Gly Tyr His His Gln Asn Glu Gln Gly Ser Gly Tyr Ala Ala

245 250 255

Asp Gln Lys Ser Thr Gln Asn Ala Ile Asn Gly Ile Thr Asn Lys Val

260 265 270

Asn Ser Val Ile Glu Lys Met Asn Thr Gln Tyr Thr Ala Ile Gly Cys

275 280 285

Glu Tyr Asn Asn Ser Glu Lys Cys Met Lys Gln Ile Glu Asp Lys Ile

290 295 300

Glu Glu Ile Glu Ser Lys Ile Trp Cys Tyr Asn Ala Glu Leu Leu Val

305 310 315 320

Leu Leu Glu Asn Glu Arg Thr Leu Asp Phe His Asp Leu Asn Val Lys

325 330 335

Asn Leu Tyr Glu Lys Val Lys Ser Gln Leu Lys Asn Asn Ala Lys Glu

340 345 350

Ile Gly Asn Gly Cys Phe Glu Phe Tyr His Lys Cys Asp Asn Glu Cys

355 360 365

Met Glu Ser Val Arg Asn Gly Thr Tyr Asp Tyr Pro Lys Tyr Ser Glu

370 375 380

Glu Ser Lys Leu Asn Arg Glu Lys Ile Asp Gly Val Lys Leu Glu Ser

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Met Gly Val Tyr Gln

405

<210> 2

<211> 433

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<400> 2

Met Tyr Arg Met Gln Leu Leu Ser Cys Ile Ala Leu Ser Leu Ala Leu

1 5 10 15

Val Thr Asn Ser Met Lys Ala Lys Leu Leu Val Leu Leu Tyr Ala Phe

20 25 30

Val Ala Thr Asp Ala Asp Thr Ile Cys Ile Gly Tyr His Ala Asn Asn

35 40 45

Ser Thr Asp Thr Val Asp Thr Ile Phe Glu Lys Asn Val Ala Val Thr

50 55 60

His Ser Val Asn Leu Leu Glu Asp Gly Gly Gly Gly Ser Ser Leu Leu

65 70 75 80

Thr Glu Val Glu Thr Pro Thr Arg Ser Glu Trp Glu Cys Arg Cys Ser

85 90 95

Gly Ser Ser Asp Gly Gly Gly Gly Ser Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu

100 105 110

Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Gly Cys Arg Cys Asn Asp Ser Ser Asp

115 120 125

Gly Gly Gly Gly Ser Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Thr Arg

130 135 140

Asn Glu Trp Glu Cys Arg Cys Ser Asp Ser Ser Asp Gly Gly Gly Gly

145 150 155 160

Ser Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Thr Arg Thr Gly Trp Glu

165 170 175

Cys Asn Cys Ser Gly Ser Ser Glu Gly Gly Gly Gly Ser Ser Leu Leu

180 185 190

Thr Glu Val Glu Thr Leu Thr Arg Thr Gly Trp Glu Cys Asn Cys Ser

195 200 205

Gly Ser Ser Asp Gly Gly Gly Gly Ser Lys Tyr Val Cys Ser Thr Lys

210 215 220

Leu Arg Met Val Thr Gly Leu Arg Asn Lys Pro Ser Lys Gln Tyr Gln

225 230 235 240

Gly Leu Phe Gly Ala Ile Ala Gly Phe Thr Glu Gly Gly Trp Thr Gly

245 250 255

Met Ile Asp Gly Trp Tyr Gly Tyr His His Gln Asn Glu Gln Gly Ser

260 265 270

Gly Tyr Ala Ala Asp Gln Lys Ser Thr Gln Asn Ala Ile Asn Gly Ile

275 280 285

Thr Asn Lys Val Asn Ser Val Ile Glu Lys Met Asn Thr Gln Tyr Thr

290 295 300

Ala Ile Gly Cys Glu Tyr Asn Asn Ser Glu Lys Cys Met Lys Gln Ile

305 310 315 320

Glu Asp Lys Ile Glu Glu Ile Glu Ser Lys Ile Trp Cys Tyr Asn Ala

325 330 335

Glu Leu Leu Val Leu Leu Glu Asn Glu Arg Thr Leu Asp Phe His Asp

340 345 350

Leu Asn Val Lys Asn Leu Tyr Glu Lys Val Lys Ser Gln Leu Lys Asn

355 360 365

Asn Ala Lys Glu Ile Gly Asn Gly Cys Phe Glu Phe Tyr His Lys Cys

370 375 380

Asp Asn Glu Cys Met Glu Ser Val Arg Asn Gly Thr Tyr Asp Tyr Pro

385 390 395 400

Lys Tyr Ser Glu Glu Ser Lys Leu Asn Arg Glu Lys Ile Asp Gly Val

405 410 415

Lys Leu Glu Ser Met Gly Val Tyr Gln Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp

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Lys

<210> 3

<211> 1302

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 3

atgtacagga tgcagctgct gagctgcatc gccctgagcc tggccctggt gaccaacagc 60

atgaaggcca agctgctggt gctgctgtac gccttcgtgg ccaccgacgc cgacaccatc 120

tgcatcggct accacgccaa caacagcacc gacaccgtgg acaccatctt cgagaagaac 180

gtggccgtga cccacagcgt gaacctgctg gaggacggcg gcggcggcag cagcctgctg 240

accgaggtgg agacccccac caggagcgag tgggagtgca ggtgcagcgg cagcagcgac 300

ggcggcggcg gcagcagcct gctgaccgag gtggagaccc ccatcaggaa cgagtggggc 360

tgcaggtgca acgacagcag cgacggcggc ggcggcagca gcctgctgac cgaggtggag 420

acccccacca ggaacgagtg ggagtgcagg tgcagcgaca gcagcgacgg cggcggcggc 480

agcagcctgc tgaccgaggt ggagaccccc accaggaccg gctgggagtg caactgcagc 540

ggcagcagcg agggcggcgg cggcagcagc ctgctgaccg aggtggagac cctgaccagg 600

accggctggg agtgcaactg cagcggcagc agcgacggcg gcggcggcag caagtacgtg 660

tgcagcacca agctgaggat ggtgaccggc ctgaggaaca agcccagcaa gcagtaccag 720

ggcctgttcg gcgccatcgc cggcttcacc gagggcggct ggaccggcat gatcgacggc 780

tggtacggct accaccacca gaacgagcag ggcagcggct acgccgccga ccagaagagc 840

acccagaacg ccatcaacgg catcaccaac aaggtgaaca gcgtgatcga gaagatgaac 900

acccagtaca ccgccatcgg ctgcgagtac aacaacagcg agaagtgcat gaagcagatc 960

gaggacaaga tcgaggagat cgagagcaag atctggtgct acaacgccga gctgctggtg 1020

ctgctggaga acgagaggac cctggacttc cacgacctga acgtgaagaa cctgtacgag 1080

aaggtgaaga gccagctgaa gaacaacgcc aaggagatcg gcaacggctg cttcgagttc 1140

taccacaagt gcgacaacga gtgcatggag agcgtgagga acggcaccta cgactacccc 1200

aagtacagcg aggagagcaa gctgaacagg gagaagatcg acggcgtgaa gctggagagc 1260

atgggcgtgt accaggacta caaggacgac gacgacaagt aa 1302

<210> 4

<211> 1876

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 4

atgtacagga tgcagctgct gagctgcatc gccctgagcc tggccctggt gaccaacagc 60

atgaaggcca agctgctggt gctgctgtac gccttcgtgg ccaccgacgc cgacaccatc 120

tgcatcggct accacgccaa caacagcacc gacaccgtgg acaccatctt cgagaagaac 180

gtggccgtga cccacagcgt gaacctgctg gaggacggcg gcggcggcag cagcctgctg 240

accgaggtgg agacccccac caggagcgag tgggagtgca ggtgcagcgg cagcagcgac 300

ggcggcggcg gcagcagcct gctgaccgag gtggagaccc ccatcaggaa cgagtggggc 360

tgcaggtgca acgacagcag cgacggcggc ggcggcagca gcctgctgac cgaggtggag 420

acccccacca ggaacgagtg ggagtgcagg tgcagcgaca gcagcgacgg cggcggcggc 480

agcagcctgc tgaccgaggt ggagaccccc accaggaccg gctgggagtg caactgcagc 540

ggcagcagcg agggcggcgg cggcagcagc ctgctgaccg aggtggagac cctgaccagg 600

accggctggg agtgcaactg cagcggcagc agcgacggcg gcggcggcag caagtacgtg 660

tgcagcacca agctgaggat ggtgaccggc ctgaggaaca agcccagcaa gcagtaccag 720

ggcctgttcg gcgccatcgc cggcttcacc gagggcggct ggaccggcat gatcgacggc 780

tggtacggct accaccacca gaacgagcag ggcagcggct acgccgccga ccagaagagc 840

acccagaacg ccatcaacgg catcaccaac aaggtgaaca gcgtgatcga gaagatgaac 900

acccagtaca ccgccatcgg ctgcgagtac aacaacagcg agaagtgcat gaagcagatc 960

gaggacaaga tcgaggagat cgagagcaag atctggtgct acaacgccga gctgctggtg 1020

ctgctggaga acgagaggac cctggacttc cacgacctga acgtgaagaa cctgtacgag 1080

aaggtgaaga gccagctgaa gaacaacgcc aaggagatcg gcaacggctg cttcgagttc 1140

taccacaagt gcgacaacga gtgcatggag agcgtgagga acggcaccta cgactacccc 1200

aagtacagcg aggagagcaa gctgaacagg gagaagatcg acggcgtgaa gctggagagc 1260

atgggcgtgt accaggacta caaggacgac gacgacaagt aacccctctc cctccccccc 1320

ccctaacgtt actggccgaa gccgcttgga ataaggccgg tgtgcgtttg tctatatgtt 1380

attttccacc atattgccgt cttttggcaa tgtgagggcc cggaaacctg gccctgtctt 1440

cttgacgagc attcctaggg gtctttcccc tctcgccaaa ggaatgcaag gtctgttgaa 1500

tgtcgtgaag gaagcagttc ctctggaagc ttcttgaaga caaacaacgt ctgtagcgac 1560

cctttgcagg cagcggaacc ccccacctgg cgacaggtgc ctctgcggcc aaaagccacg 1620

tgtataagat acacctgcaa aggcggcaca accccagtgc cacgttgtga gttggatagt 1680

tgtggaaaga gtcaaatggc tctcctcaag cgtattcaac aaggggctga aggatgccca 1740

gaaggtaccc cattgtatgg gatctgatct ggggcctcgg tacacatgct ttacatgtgt 1800

ttagtcgagg ttaaaaaaac gtctaggccc cccgaaccac ggggacgtgg ttttcctttg 1860

aaaaacacga tgataa 1876

<210> 5

<211> 2285

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 5

gaattctaga gaaaatttcg tctggactag ttacttatcg tgtaaaatct gataaatgga 60

attggttcta cataaatgcc taacgactat ccctttgggg agtagggtca agtgactcga 120

aacgatagac aacttgcttt aacaagttgg agatatagtc cgctctgcat ggcgacatgc 180

agctggatat aattccgggg taagattaac gaccttatct gaacataacg atgtacagga 240

tgcagctgct gagctgcatc gccctgagcc tggccctggt gaccaacagc atgaaggcca 300

agctgctggt gctgctgtac gccttcgtgg ccaccgacgc cgacaccatc tgcatcggct 360

accacgccaa caacagcacc gacaccgtgg acaccatctt cgagaagaac gtggccgtga 420

cccacagcgt gaacctgctg gaggacggcg gcggcggcag cagcctgctg accgaggtgg 480

agacccccac caggagcgag tgggagtgca ggtgcagcgg cagcagcgac ggcggcggcg 540

gcagcagcct gctgaccgag gtggagaccc ccatcaggaa cgagtggggc tgcaggtgca 600

acgacagcag cgacggcggc ggcggcagca gcctgctgac cgaggtggag acccccacca 660

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tgaccgaggt ggagaccccc accaggaccg gctgggagtg caactgcagc ggcagcagcg 780

agggcggcgg cggcagcagc ctgctgaccg aggtggagac cctgaccagg accggctggg 840

agtgcaactg cagcggcagc agcgacggcg gcggcggcag caagtacgtg tgcagcacca 900

agctgaggat ggtgaccggc ctgaggaaca agcccagcaa gcagtaccag ggcctgttcg 960

gcgccatcgc cggcttcacc gagggcggct ggaccggcat gatcgacggc tggtacggct 1020

accaccacca gaacgagcag ggcagcggct acgccgccga ccagaagagc acccagaacg 1080

ccatcaacgg catcaccaac aaggtgaaca gcgtgatcga gaagatgaac acccagtaca 1140

ccgccatcgg ctgcgagtac aacaacagcg agaagtgcat gaagcagatc gaggacaaga 1200

tcgaggagat cgagagcaag atctggtgct acaacgccga gctgctggtg ctgctggaga 1260

acgagaggac cctggacttc cacgacctga acgtgaagaa cctgtacgag aaggtgaaga 1320

gccagctgaa gaacaacgcc aaggagatcg gcaacggctg cttcgagttc taccacaagt 1380

gcgacaacga gtgcatggag agcgtgagga acggcaccta cgactacccc aagtacagcg 1440

aggagagcaa gctgaacagg gagaagatcg acggcgtgaa gctggagagc atgggcgtgt 1500

accaggacta caaggacgac gacgacaagt aacccctctc cctccccccc ccctaacgtt 1560

actggccgaa gccgcttgga ataaggccgg tgtgcgtttg tctatatgtt attttccacc 1620

atattgccgt cttttggcaa tgtgagggcc cggaaacctg gccctgtctt cttgacgagc 1680

attcctaggg gtctttcccc tctcgccaaa ggaatgcaag gtctgttgaa tgtcgtgaag 1740

gaagcagttc ctctggaagc ttcttgaaga caaacaacgt ctgtagcgac cctttgcagg 1800

cagcggaacc ccccacctgg cgacaggtgc ctctgcggcc aaaagccacg tgtataagat 1860

acacctgcaa aggcggcaca accccagtgc cacgttgtga gttggatagt tgtggaaaga 1920

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tgataatatc tacatgttat catataaggt gacttatact tgtaatctat ctaaacgggg 2160

aacctctcta gtagacaatc ccgtgctaaa ttgtaggact gccctttaat aaatacttct 2220

atacttaaag aggtatttat gaaaagcgga atttatcaga ttaaaaatac tttctctaga 2280

gtcga 2285

<210> 6

<211> 2312

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 6

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cttatcgtgt aaaatctgat aaatggaatt ggttctacat aaatgcctaa cgactatccc 120

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tatagtccgc tctgcatggc gacatgcagc tggatataat tccggggtaa gattaacgac 240

cttatctgaa cataacgatg tacaggatgc agctgctgag ctgcatcgcc ctgagcctgg 300

ccctggtgac caacagcatg aaggccaagc tgctggtgct gctgtacgcc ttcgtggcca 360

ccgacgccga caccatctgc atcggctacc acgccaacaa cagcaccgac accgtggaca 420

ccatcttcga gaagaacgtg gccgtgaccc acagcgtgaa cctgctggag gacggcggcg 480

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gcagcggcag cagcgacggc ggcggcggca gcagcctgct gaccgaggtg gagaccccca 600

tcaggaacga gtggggctgc aggtgcaacg acagcagcga cggcggcggc ggcagcagcc 660

tgctgaccga ggtggagacc cccaccagga acgagtggga gtgcaggtgc agcgacagca 720

gcgacggcgg cggcggcagc agcctgctga ccgaggtgga gacccccacc aggaccggct 780

gggagtgcaa ctgcagcggc agcagcgagg gcggcggcgg cagcagcctg ctgaccgagg 840

tggagaccct gaccaggacc ggctgggagt gcaactgcag cggcagcagc gacggcggcg 900

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ccagcaagca gtaccagggc ctgttcggcg ccatcgccgg cttcaccgag ggcggctgga 1020

ccggcatgat cgacggctgg tacggctacc accaccagaa cgagcagggc agcggctacg 1080

ccgccgacca gaagagcacc cagaacgcca tcaacggcat caccaacaag gtgaacagcg 1140

tgatcgagaa gatgaacacc cagtacaccg ccatcggctg cgagtacaac aacagcgaga 1200

agtgcatgaa gcagatcgag gacaagatcg aggagatcga gagcaagatc tggtgctaca 1260

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tgaagaacct gtacgagaag gtgaagagcc agctgaagaa caacgccaag gagatcggca 1380

acggctgctt cgagttctac cacaagtgcg acaacgagtg catggagagc gtgaggaacg 1440

gcacctacga ctaccccaag tacagcgagg agagcaagct gaacagggag aagatcgacg 1500

gcgtgaagct ggagagcatg ggcgtgtacc aggactacaa ggacgacgac gacaagtaac 1560

ccctctccct cccccccccc taacgttact ggccgaagcc gcttggaata aggccggtgt 1620

gcgtttgtct atatgttatt ttccaccata ttgccgtctt ttggcaatgt gagggcccgg 1680

aaacctggcc ctgtcttctt gacgagcatt cctaggggtc tttcccctct cgccaaagga 1740

atgcaaggtc tgttgaatgt cgtgaaggaa gcagttcctc tggaagcttc ttgaagacaa 1800

acaacgtctg tagcgaccct ttgcaggcag cggaaccccc cacctggcga caggtgcctc 1860

tgcggccaaa agccacgtgt ataagataca cctgcaaagg cggcacaacc ccagtgccac 1920

gttgtgagtt ggatagttgt ggaaagagtc aaatggctct cctcaagcgt attcaacaag 1980

gggctgaagg atgcccagaa ggtaccccat tgtatgggat ctgatctggg gcctcggtac 2040

acatgcttta catgtgttta gtcgaggtta aaaaaacgtc taggcccccc gaaccacggg 2100

gacgtggttt tcctttgaaa aacacgatga taatatctac atgttatcat ataaggtgac 2160

ttatacttgt aatctatcta aacggggaac ctctctagta gacaatcccg tgctaaattg 2220

taggactgcc ctttaataaa tacttctata cttaaagagg tatttatgaa aagcggaatt 2280

tatcagatta aaaatacttt ctctagagtc ga 2312

<210> 7

<211> 114

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 7

taatacgact cactataggg cgaattggag ctccaccgcg gtggcggccg ctctagaact 60

agtggatccc ccgggctgca ggaattcgat atcaagctta tcgataccgt cgac 114

<210> 8

<211> 1876

<212> RNA

<213> Artificial sequence

<400> 8

auguacagga ugcagcugcu gagcugcauc gcccugagcc uggcccuggu gaccaacagc 60

augaaggcca agcugcuggu gcugcuguac gccuucgugg ccaccgacgc cgacaccauc 120

ugcaucggcu accacgccaa caacagcacc gacaccgugg acaccaucuu cgagaagaac 180

guggccguga cccacagcgu gaaccugcug gaggacggcg gcggcggcag cagccugcug 240

accgaggugg agacccccac caggagcgag ugggagugca ggugcagcgg cagcagcgac 300

ggcggcggcg gcagcagccu gcugaccgag guggagaccc ccaucaggaa cgaguggggc 360

ugcaggugca acgacagcag cgacggcggc ggcggcagca gccugcugac cgagguggag 420

acccccacca ggaacgagug ggagugcagg ugcagcgaca gcagcgacgg cggcggcggc 480

agcagccugc ugaccgaggu ggagaccccc accaggaccg gcugggagug caacugcagc 540

ggcagcagcg agggcggcgg cggcagcagc cugcugaccg agguggagac ccugaccagg 600

accggcuggg agugcaacug cagcggcagc agcgacggcg gcggcggcag caaguacgug 660

ugcagcacca agcugaggau ggugaccggc cugaggaaca agcccagcaa gcaguaccag 720

ggccuguucg gcgccaucgc cggcuucacc gagggcggcu ggaccggcau gaucgacggc 780

ugguacggcu accaccacca gaacgagcag ggcagcggcu acgccgccga ccagaagagc 840

acccagaacg ccaucaacgg caucaccaac aaggugaaca gcgugaucga gaagaugaac 900

acccaguaca ccgccaucgg cugcgaguac aacaacagcg agaagugcau gaagcagauc 960

gaggacaaga ucgaggagau cgagagcaag aucuggugcu acaacgccga gcugcuggug 1020

cugcuggaga acgagaggac ccuggacuuc cacgaccuga acgugaagaa ccuguacgag 1080

aaggugaaga gccagcugaa gaacaacgcc aaggagaucg gcaacggcug cuucgaguuc 1140

uaccacaagu gcgacaacga gugcauggag agcgugagga acggcaccua cgacuacccc 1200

aaguacagcg aggagagcaa gcugaacagg gagaagaucg acggcgugaa gcuggagagc 1260

augggcgugu accaggacua caaggacgac gacgacaagu aaccccucuc ccuccccccc 1320

cccuaacguu acuggccgaa gccgcuugga auaaggccgg ugugcguuug ucuauauguu 1380

auuuuccacc auauugccgu cuuuuggcaa ugugagggcc cggaaaccug gcccugucuu 1440

cuugacgagc auuccuaggg gucuuucccc ucucgccaaa ggaaugcaag gucuguugaa 1500

ugucgugaag gaagcaguuc cucuggaagc uucuugaaga caaacaacgu cuguagcgac 1560

ccuuugcagg cagcggaacc ccccaccugg cgacaggugc cucugcggcc aaaagccacg 1620

uguauaagau acaccugcaa aggcggcaca accccagugc cacguuguga guuggauagu 1680

uguggaaaga gucaaauggc ucuccucaag cguauucaac aaggggcuga aggaugccca 1740

gaagguaccc cauuguaugg gaucugaucu ggggccucgg uacacaugcu uuacaugugu 1800

uuagucgagg uuaaaaaaac gucuaggccc cccgaaccac ggggacgugg uuuuccuuug 1860

aaaaacacga ugauaa 1876

<210> 9

<211> 565

<212> PRT

<213> Influenza virus

<400> 9

Met Lys Ala Lys Leu Leu Val Leu Leu Tyr Ala Phe Val Ala Thr Asp

1 5 10 15

Ala Asp Thr Ile Cys Ile Gly Tyr His Ala Asn Asn Ser Thr Asp Thr

20 25 30

Val Asp Thr Ile Phe Glu Lys Asn Val Ala Val Thr His Ser Val Asn

35 40 45

Leu Leu Glu Asp Arg His Asn Gly Lys Leu Cys Lys Leu Lys Gly Ile

50 55 60

Ala Pro Leu Gln Leu Gly Lys Cys Asn Ile Thr Gly Trp Leu Leu Gly

65 70 75 80

Asn Pro Glu Cys Asp Ser Leu Leu Pro Ala Arg Ser Trp Ser Tyr Ile

85 90 95

Val Glu Thr Pro Asn Ser Glu Asn Gly Ala Cys Tyr Pro Gly Asp Phe

100 105 110

Ile Asp Tyr Glu Glu Leu Arg Glu Gln Leu Ser Ser Val Ser Ser Leu

115 120 125

Glu Arg Phe Glu Ile Phe Pro Lys Glu Ser Ser Trp Pro Asn His Thr

130 135 140

Phe Asn Gly Val Thr Val Ser Cys Ser His Arg Gly Lys Ser Ser Phe

145 150 155 160

Tyr Arg Asn Leu Leu Trp Leu Thr Lys Lys Gly Asp Ser Tyr Pro Lys

165 170 175

Leu Thr Asn Ser Tyr Val Asn Asn Lys Gly Lys Glu Val Leu Val Leu

180 185 190

Trp Gly Val His His Pro Ser Ser Ser Asp Glu Gln Gln Ser Leu Tyr

195 200 205

Ser Asn Gly Asn Ala Tyr Val Ser Val Ala Ser Ser Asn Tyr Asn Arg

210 215 220

Arg Phe Thr Pro Glu Ile Ala Ala Arg Pro Lys Val Lys Asp Gln His

225 230 235 240

Gly Arg Met Asn Tyr Tyr Trp Thr Leu Leu Glu Pro Gly Asp Thr Ile

245 250 255

Ile Phe Glu Ala Thr Gly Asn Leu Ile Ala Pro Trp Tyr Ala Phe Ala

260 265 270

Leu Ser Arg Gly Phe Glu Ser Gly Ile Ile Thr Ser Asn Ala Ser Met

275 280 285

His Glu Cys Asn Thr Lys Cys Gln Thr Pro Gln Gly Ser Ile Asn Ser

290 295 300

Asn Leu Pro Phe Gln Asn Ile His Pro Val Thr Ile Gly Glu Cys Pro

305 310 315 320

Lys Tyr Val Arg Ser Thr Lys Leu Arg Met Val Thr Gly Leu Arg Asn

325 330 335

Ile Pro Ser Ile Gln Tyr Arg Gly Leu Phe Gly Ala Ile Ala Gly Phe

340 345 350

Ile Glu Gly Gly Trp Thr Gly Met Ile Asp Gly Trp Tyr Gly Tyr His

355 360 365

His Gln Asn Glu Gln Gly Ser Gly Tyr Ala Ala Asp Gln Lys Ser Thr

370 375 380

Gln Asn Ala Ile Asn Gly Ile Thr Asn Lys Val Asn Ser Val Ile Glu

385 390 395 400

Lys Met Asn Thr Gln Phe Thr Ala Val Gly Lys Glu Phe Asn Asn Leu

405 410 415

Glu Lys Arg Met Glu Asn Leu Asn Lys Lys Val Asp Asp Gly Phe Leu

420 425 430

Asp Ile Trp Thr Tyr Asn Ala Glu Leu Leu Val Leu Leu Glu Asn Glu

435 440 445

Arg Thr Leu Asp Phe His Asp Leu Asn Val Lys Asn Leu Tyr Glu Lys

450 455 460

Val Lys Ser Gln Leu Lys Asn Asn Ala Lys Glu Ile Gly Asn Gly Cys

465 470 475 480

Phe Glu Phe Tyr His Lys Cys Asp Asn Glu Cys Met Glu Ser Val Arg

485 490 495

Asn Gly Thr Tyr Asp Tyr Pro Lys Tyr Ser Glu Glu Ser Lys Leu Asn

500 505 510

Arg Glu Lys Ile Asp Gly Val Lys Leu Glu Ser Met Gly Val Tyr Gln

515 520 525

Ile Leu Ala Ile Tyr Ser Thr Val Ala Ser Ser Leu Val Leu Leu Val

530 535 540

Ser Leu Gly Ala Ile Ser Phe Trp Met Cys Ser Asn Gly Ser Leu Gln

545 550 555 560

Cys Arg Ile Cys Ile

565

<210> 10

<211> 23

<212> PRT

<213> Influenza virus

<400> 10

Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Thr Arg Ser Glu Trp Glu Cys

1 5 10 15

Arg Cys Ser Gly Ser Ser Asp

20

<210> 11

<211> 23

<212> PRT

<213> Influenza virus

<400> 11

Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Gly Cys

1 5 10 15

Arg Cys Asn Asp Ser Ser Asp

20

<210> 12

<211> 23

<212> PRT

<213> Influenza virus

<400> 12

Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Thr Arg Asn Glu Trp Glu Cys

1 5 10 15

Arg Cys Ser Asp Ser Ser Asp

20

<210> 13

<211> 23

<212> PRT

<213> Influenza virus

<400> 13

Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Thr Arg Thr Gly Trp Glu Cys

1 5 10 15

Asn Cys Ser Gly Ser Ser Glu

20

<210> 14

<211> 23

<212> PRT

<213> Influenza virus

<400> 14

Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Leu Thr Arg Thr Gly Trp Glu Cys

1 5 10 15

Asn Cys Ser Gly Ser Ser Asp

20

Claims

1.一种环状RNA分子，如序列表的序列8所示。

2.一种环状RNA分子，为将权利要求1所述环状RNA分子中腺嘌呤核糖核苷酸替换为N6-甲基腺嘌呤核糖核苷酸的环状RNA分子。

3.一种蛋白质，为如下(a)或(b)：

(a)蛋白质，如序列表的序列2所示；

(b)蛋白质，如序列表的序列1所示。

4.权利要求3所示蛋白质的编码基因。

5.含有权利要求4所述基因的DNA分子。

6.含有权利要求4所述基因的重组质粒或含有权利要求5所述DNA分子的重组质粒。

7.含有权利要求4所述基因的重组微生物或含有权利要求5所述DNA分子的重组微生物。

8.权利要求1或2所述环状RNA分子、权利要求3所述蛋白质、权利要求4所述基因、权利要求5所述DNA分子、权利要求6所述重组质粒或权利要求7所述重组微生物在制备流感病毒疫苗中的应用。

9.权利要求1或2所述环状RNA分子、权利要求3所述蛋白质、权利要求4所述基因、权利要求5所述DNA分子、权利要求6所述重组质粒或权利要求7所述重组微生物作为流感病毒疫苗的应用。

10.一种流感病毒疫苗，其活性成分为权利要求1或2所述环状RNA分子、权利要求3所述蛋白质、权利要求4所述基因、权利要求5所述DNA分子、权利要求6所述重组质粒或权利要求7所述重组微生物。