CN105664149A - 一种多抗原流感通用疫苗及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开一种多抗原流感通用疫苗及其制备方法，选取甲型流感病毒保守抗原表位M2e和HA2，乙型肝炎病毒外壳蛋白HBc作为抗原表位载体，将抗原表位M2e和HA2以不同的串联组合方式展示在乙型肝炎病毒外壳蛋白HBc的外表面。目前市面上的流感疫苗仅对一种或几种亚型的流感病毒产生防御性，每年需要更新疫苗。本发明选取流感病毒各亚型间保守性的抗原表位来制备通用流感疫苗，能精确地控制免疫反应，对不同亚型的流感病毒起预防作用，而且不需要每年更新疫苗。因此，作为预防流感病毒的药物有着更为广阔的应用前景。

Description

一种多抗原流感通用疫苗及其制备方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，更具体地讲，涉及一种以HBc为载体的甲型流感病毒HA2和M2e流感通用疫苗的设计构建。
背景技术
流行性感冒(Influenza)简称流感，是由流感病毒引起的一种急性呼吸道传染病，传染性强，发病率高。引发流感的病毒是RNA病毒，分甲(A)乙(B)丙(C)三型，甲型(A)流感病毒一般会大幅度蔓延，引起感冒大流行，并不断变异，对人体健康构成极大威胁。流感病毒A在膜上表达两个高免疫原性但极易变化的蛋白：血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)，其中H(H1-H17)、N(N1-N9)，另外病毒表面和内部还有多种抗原相关蛋白，因而，流感病毒有多种亚型。疫苗接种是预防流感的最有效手段，但是由于流感病毒抗原的不断变异和难预测性，给流感疫苗的有针对性研发和防制带来很大的难度。目前的流感疫苗主要是三价灭活的病毒疫苗，其生产周期长，对变种或新出现的亚型保护效果弱，需每年更新。因此，研制能够预防所有流感毒株、可诱导持久保护性免疫的通用流感疫苗成为目前最具有吸引力的流感疫苗研究方向。
HA是流感病毒表面主要的保护性抗原之一，HA基因以先驱肽HA0的形式合成。先驱肽HA0翻译后裂开成HA1和HA2，之间通过二硫键连接。N端的HA1形成球状头部结构域，富含受体结合位点和大部分识别中和抗体的抗原决定簇，具有很高的变异性；而位于C端的HA2形成茎部结构锚定在病毒囊膜中，引起病毒囊膜与细胞膜的融合和病毒粒子核衣壳的释放，其N端的前11个氨基酸在甲型流感病毒中十分保守。因此，基于HA2保守区域的通用疫苗研究一直是一个热点。基质蛋白2(matrixprotein2，M2)只存在于甲型流感病毒中，是一种非糖基化的蛋白，是由97个氨基酸组成的蛋白，分子质量大约为11KD。C端的54个氨基酸位于包膜内(C端胞质尾区)，N末端24个氨基酸残基暴露在包膜外(N端M2e胞外域)，中间第25-43位共19个氨基酸残基跨过脂质双分子层，组成单跨膜区。M2蛋白以同源四聚体的形式存在于内脂膜上，具有质子泵作用，通过控制质子通道活性可调节病毒内的pH值，从而影响流感病毒的复制。膜蛋白M2的氨基酸序列高度保守，尤其是N端仅由24个氨基酸残基组成的胞外区(M2extracellulardomain，M2e)。尽管经历了四次世界性的流感大流行，都未发现明显差异，故有可能发展成为具有交叉保护力的“通用流感疫苗”的候选抗原。但是，M2e和HA2表位的分子量较小，免疫原性低，在体内容易降解，机体免疫系统内仅能获得弱的呈递性，难以产生足够的免疫反应。所以，采用结构较为复杂病毒样颗粒(Virus-likeparticle，VLP)作为抗原表位载体来放大免疫原性就成为现今新疫苗开发的一个研究热点。
病毒样颗粒一般具有天然的自我装配能力，可包裹核酸或其他小分子，可作为基因或药物的装载工具。目前主要用作基因载体，如多瘤病毒的衣壳蛋白VPl、乳头瘤状病毒衣壳蛋白L1和乙肝核心蛋白(HepatitisBviruscoreprotein，HBc)经常被用来制备嵌合HBc-VLP，有报道其具有一定的树突状细胞(DC)靶向性，并能有效地促进DC成熟，同时也能活化单核细胞和巨噬细胞。乙型肝炎病毒核心蛋白(HepatitisBviruscoreprotein，HBc)在大肠杆菌中可自组装形成二十面体对称的类病毒颗粒(Virus-likeparticle，VLP)结构，可以模拟天然病毒的构象，且缺少感染性核酸，安全性好。抗原表位与HBc共同作用可显著增强抗原表位的免疫活性。
发明内容
本发明的第一个目的在于提供一种多抗原流感通用疫苗的制备方法。
本发明的第二个目的在于提供利用多抗原流感通用疫苗的制备方法制备获得的疫苗。
为实现以上目的，本发明公开以下技术方案：一种多抗原流感通用疫苗的制备方法，其特征在于，选取甲型流感病毒保守抗原表位M2e和HA2，乙型肝炎病毒外壳蛋白HBc作为抗原表位载体，将抗原表位M2e和HA2以不同的串联组合方式展示在乙型肝炎病毒外壳蛋白HBc的外表面。
作为一个优选方案，所述抗原表位M2e的序列如SEQIDNO：1所示，所述抗原表位HA2的序列如SEQIDNO：2所示。
作为一个优选方案，所述HBc的序列如SEQIDNO：3所示。
作为一个优选方案，抗原表位M2e和HA2与HBc的串联组合方式为HA-M2e-HBc、M2e-HBc、HBc、3M2e-HBc和3HA-3M2e-HBc。
抗原表位M2e的序列：MSLLTEVETPIRNEWGSRSNDSSD(SEQIDNO：1)(甲硫氨酸—丝氨酸—亮氨酸—亮氨酸—苏氨酸—谷氨酸—缬氨酸—谷氨酸—苏氨酸—脯氨酸—异亮氨酸—精氨酸—天冬酰氨—谷氨酸—色氨酸—甘氨酸—丝氨酸—精氨酸—丝氨酸—天冬酰氨—天冬氨酸—丝氨酸—丝氨酸—天冬氨酸)。
抗原表位HA2的序列：GLFGAIAGF(SEQIDNO：2)(甘氨酸—亮氨酸—苯丙氨酸—甘氨酸—丙氨酸—异亮氨酸—丙氨酸—甘氨酸—苯丙氨酸)。
本发明所提供的抗原表位M2e和HA2，采用基因工程重组蛋白表达方法制备。所述抗原表位M2e和HA2是蛋白抗原产生免疫性的最短序列，能精确的控制免疫反应。
抗原表位载体HBc的序列如SEQIDNO：3所示，即：
为实现本发明第二个目的，本发明公开以下技术方案：利用上述方法制备获得的多抗原流感通用疫苗。
流感通用疫苗关键在对甲型流感病毒保守抗原表位的选择上，特别是M2，HA2。选取M2中1～24aa(M2e)‘MSLLTEVETPIRNEWGSRSNDSSD’及HA2中的1～9aa‘GLFGAIAGF’作为通用序列。所选的保守抗原表位都是小肽，而且是经过如下表中多年来发生的流感的广泛筛选和比对所获得的，由于通常的小肽单独作用引起的免疫原性是很低有限的，而多个组合更具有代表性和通用性(图8，图9)。
本发明选取乙型肝炎病毒外壳蛋白(HBc)作为小肽的载体，HBc可以自组装形成二十面体对称的颗粒样结构，并且能够将连接在其N端的外源序列重复且高密度地展示在颗粒的表面，诱发强烈免疫反应。FluuV在动物模型中显示了较好的型间或亚型间交叉保护效果(图10)。乙型肝炎病毒外壳蛋白(HBc)可以自组装形成二十面体对称的颗粒样结构，并且能够将连接在其N端的外源序列重复且高密度地展示在颗粒的表面，诱发强烈免疫反应。74aa～78aa是HBc免疫显性c/e1区域，两个单体间Cys-61形成单体间二硫键，1～140aa是装配成颗粒所必需的，α5螺旋的氨基酸和C端的臂之间的作用，主要影响着颗粒的装配和稳定性，C端缩短了的HBc149中T＝4型粒子占95％；HBc140中T＝4型粒子占20％。
本发明的优点在于：目前市面上的流感疫苗(主要是三价灭活的病毒)仅对一种或几种亚型的流感病毒产生防御性，每年需要更新疫苗。本发明选取流感病毒各亚型间保守性的抗原表位来制备通用流感疫苗，能精确地控制免疫反应，对不同亚型的流感病毒起预防作用，而且不需要每年更新疫苗。因此，作为预防流感病毒的药物有着更为广阔的应用前景。本发明的通用流感疫苗基因重组表达载体构建简便，纯化工艺简单，生产周期比目前使用鸡胚为基质来生产流感病毒疫苗短。
附图说明
图1为候选疫苗HA-M2e-HBc、M2e-HBc、HBc、3M2e-HBc和3HA-3M2e-HBc基因PCR扩增琼脂糖凝胶电泳图。
图2为候选疫苗HA-M2e-HBc、M2e-HBc、HBc、3M2e-HBc和3HA-3M2e-HBc表达载体设计与构建示意图。
图3为重组蛋白HA-M2e-HBc、M2e-HBc、HBc和3M2e-HBc纯化SDS-PAGE图，其中，A、B、C、D分别为M2e-HBc、HBc、3M2e-HBc和HA-M2e-HBc蔗糖密度梯度离心16h的电泳条带；E、F、G、H分别为M2e-HBc、HBc、3M2e-HBc和HA-M2e-HBc蔗糖密度梯度离心4h的电泳条带。
图4为重组蛋白HA-M2e-HBc、M2e-HBc、HBc和3M2e-HBc的anti-HBcAg抗体Westernblot电泳结果。
图5为HA-M2e-HBc、M2e-HBc、HBc和3M2e-HBc重组蛋白颗粒的透射电镜图。
图6为候选疫苗HA-M2e-HBc、M2e-HBc、HBc和3M2e-HBc免疫小鼠后体重变化的折线分析图。
图7为候选疫苗HA-M2e-HBc、M2e-HBc、HBc和3M2e-HBc免疫小鼠后外周血流式细胞分析图。
图8为通用抗原保守序列的选择。
图9为甲型流感病毒中M2e保守序列(上表)和甲型流感病毒中HA2保守序列(下表)。
图10为蛋白载体Hbc的选择和构建。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如J.萨姆布鲁克(JosephSambrook)等编写的《分子克隆实验指南》中所述的条件，或按照制造厂商所推荐的条件进行实验。
实施例1.候选疫苗HA-M2e-HBc、M2e-HBc、HBc、3M2e-HBc和3HA-3M2e-HBc表达载体设计与构建
试剂与试剂盒：PremixTaqDNA聚合酶，限制内切酶(NdeI、XhoI、NcoI)、DNA连接试剂盒DNALigationKitVer.2.1，琼脂糖凝胶回收试剂盒TaKaRaMiniBESTAgaroseGelDNAExtractionKitVer.4.0，质粒抽提试剂盒TaKaRaMiniBESTPlasmidPurificationKitVer.4.0购置于宝生物工程有限公司(大连)。胰化蛋白胨、酵母提取物购置于Oxoid公司(英国)。硫酸卡那霉素购自生工生物工程股份有限公司(上海)。其他的生化试剂属于国产常规的分析纯试剂。
质粒与菌株：质粒pET-28a(+)，pET-24a(+)，pET-22a(+)(Novagen，USA)；质粒pUC57-HA-M2e-HBc和pUC57-3HA-3M2e-HBc(全基因合成)作为亚克隆模板；E.coliDH5α(Invirogen，USA)作为质粒扩增菌株。
试剂配制：LB液体培养基：称取胰化蛋白胨10g、酵母提取物5g、氯化钠10g，用去离子水定容到1L，121℃高压灭菌20min，常温保存。
LB固体培养基：称取胰化蛋白胨1g、酵母提取物0.5g、氯化钠1g，琼脂粉1.5g，用去离子水定容到100ml，121℃高压灭菌20min，常温保存。
硫酸卡那霉素(50μg/ml)：称取1g，溶于20mlddH2O，使用0.22μm的无菌滤膜过滤除菌，分装，-20℃保存。
TAE电泳缓冲液(50×)：称取Tris碱242g，量取冰醋酸57.1ml，0.5MEDTA(pH8.0)100ml，加去离子水定容至1L。
琼脂糖凝胶(1％)：称取0.7g琼脂糖，加入TAE(1×)70ml，加热溶解，待冷却60℃左右，加入GelRed核酸染液(100×)1ml，插好梳子，倒胶。
pET-28a-HA-M2e-HBc(XhoI/NcoI)重组质粒的构建
引物设计:
正向引物：5’CATGCCATGGGTCTGTTTGGTGCGATTGCAGG3’(SEQIDNO：4)；
反向引物：5’CCGCTCGAGCACCACAGTGGTTTCCGG3’(SEQIDNO：5)。
PCR反应体系：
模板1μl，正向引物1μl，反向引物1μl，PremixTaqDNA聚合酶25μl，ddH2O22μl，总体积50μl。
PCR反应条件：
1、预变性：95℃8min；2、变性：94℃30sec，退火：62℃30sec，延伸：72℃38sec，30个循环；3、再延伸：72℃10min。
琼脂糖凝胶电泳检测目的片段扩增情况，并使用凝胶回收试剂盒回收DNA片段。将回收的PCR产物与载体pET-28a(+)分别进行双酶切。
双酶切PCR回收产物：HA-M2e-HBc基因片段6μl，10×HBuffer2μl，0.1％BSA2μl，NcoI1μl，XhoI1μl，ddH2O8μl，总体积20μl。
双酶切载体：pET-28a(+)5μl，10×HBuffer2μl，0.1％BSA2μl，NcoI1μl，XhoI1μl，ddH2O9μl，总体积20μl。
将酶切后的HA-M2e-HBc片段和pET-28a(+)载体在16℃恒温水浴的条件下，连接10小时。
连接体系：HA-M2e-HBc片段8μl，pET-28a(+)载体4μl，连接试剂盒SolutionI12μl，总体积24μl。
将连接产物转化感受态E.coliDH5α，挑取单菌，LB培养基试管摇菌过夜，通过菌液PCR验证是否有目标条带，将验证的含有目标分子量条带的菌液送样测序。基因测序正确，pET-28a-HA-M2e-HBc(XhoI/NcoI)重组质粒构建成功，构建结果如图2所示。
实施例2.重组蛋白HA-M2e-HBc、M2e-HBc、HBc和3M2e-HBc的表达、纯化及蛋白性能的表征
试剂与试剂盒：异丙基-B-D-硫代吡喃半乳糖苷(IsopropylB-D-I-Thiogalactopyranoside，IPTG)、硫酸卡那霉素购自Sigma-Aldrich公司(美国)，Ni-NTA亲和柱以及填料购置于Biorad公司(美国)，蛋白分子量标准品PremixedProteinMarker(Low)，蛋白上样缓冲液4×ProteinSDSPAGELoadingBuffer，购置于宝生物工程有限公司(大连)。Bradford蛋白质定量试剂盒购置于天根生化科技有限公司(北京)。其他的生化试剂属于国产常规的分析纯试剂。
菌株和质粒：
E.coliBL21(DE3)(Invirogen，USA)作为质粒表达菌株。重组质粒pET-28a-HA-M2e-HBc(XhoI/NcoI)、pET-28a-HA-M2e-HBc(XhoI/NdeI)、pET-28a-M2e-HBc(XhoI/NdeI)、pET-28a-HBc(XhoI/NdeI)、pET-28a-3M2e-HBc(XhoI/NdeI)、pET-28a-3M2e-HBc(XhoI/NcoI)、pET-24a-3HA-M2e-HBc(XhoI/NdeI)和pET-22a-3HA-M2e-HBc(XhoI/NdeI)为本发明上述阶段所构建。
试剂配制：
5×蛋白电泳缓冲液(Tris-甘氨酸)：称取Tris碱15.1g，甘氨酸94g，SDS5g，加双蒸水定容至1L。
15％蛋白电泳分离胶：量取ddH2O2.3ml，30％丙烯酰胺5.0ml，Tris-HCI(pH6.8)2.5ml，10％SDS100μl，10％APS100μl，TEMED100μl，混合均匀。
5％蛋白电泳浓缩胶：量取ddH2O3.15ml，30％丙烯酰胺0.75ml，Tris-HCI(pH6.8)0.57ml，10％SDS45μl，10％APS45μl，TEMED4.5μl，混合均匀。
考马斯亮蓝染色液：称取考马斯亮蓝(R-250)2g，量取乙醇200ml，冰醋酸100ml，去离子水750ml，滤纸过滤，室温保存。
蛋白脱色液：量取乙醇200ml，去离子水750ml，冰醋酸50ml，混合均匀，室温保存。
包涵体洗涤缓冲液BufferB：50mMNaCl，1mMEDTA，1％TritonX-100，溶于PBS中，pH7.4。
包涵体洗涤缓冲液BufferC：1mMEDTA，溶于PBS中，pH7.4。
包涵体透析缓冲液BufferD：0.5mMEDTA，50mMNaCl，2％甘油，0.1％聚乙二醇(PEG)，0.2mM还原型谷胱甘肽，0.1mM氧化型谷胱甘肽，溶于PBS中，pH7.4。
尿素梯度透析缓冲液为0M、1M、2M、3M、4M尿素分别溶于BufferD缓冲液中。
组氨酸标签蛋白纯化缓冲液：
Tris平衡缓冲液：20mMTris-HCl，150mMNaCl，20mM咪唑pH7.4；
Tris咪唑梯度缓冲液：
20mMTris-HCl，150mMNaCl，50mM咪唑pH7.4；
20mMTris-HCl，150mMNaCl，100mM咪唑pH7.4；
20mMTris-HCl，150mMNaCl，200mM咪唑pH7.4；
20mMTris-HCl，150mMNaCl，300mM咪唑pH7.4。
蔗糖梯度溶液：
10％蔗糖(0.8g蔗糖，1mMEDTA，溶解于8mlPBS溶液中)；
20％蔗糖(1.6g蔗糖，1mMEDTA，溶解于8mlPBS溶液中)；
30％蔗糖(2.4g蔗糖，1mMEDTA，溶解于8mlPBS溶液中)；
35％蔗糖(2.8g蔗糖，1mMEDTA，溶解于8mlPBS溶液中)；
40％蔗糖(3.2g蔗糖，1mMEDTA，溶解于8mlPBS溶液中)；
45％蔗糖(3.6g蔗糖，1mMEDTA，溶解于8mlPBS溶液中)；
50％蔗糖(4.0g蔗糖，1mMEDTA，溶解于8mlPBS溶液中)；
60％蔗糖(4.8g蔗糖，1mMEDTA，溶解于8mlPBS溶液中)。
蛋白表征所用试剂配制
转膜缓冲液：2.9g甘氨酸，5.8gTris碱，200ml甲醇，溶于超纯水，定容至1L，室温保存；
10×TBS：12.12gTris碱，40gNaCl，加入400mlddH2O，充分溶解，用盐酸调节PH到7.6，再补充超纯水定容至500ml。使用时将其稀释10倍即可；
TBST缓冲液：量取100ml10×TBS，加入900mlddH2O，再加入1mlTween20，充分混匀，于室温存放；
5％脱脂奶粉(封闭液)：5g脱脂奶粉充分溶解于100mlTBST缓冲液中，保存于4℃。
使用质粒抽提试剂盒将已构建好且测序正确的重组质粒pET-28a-HA-M2e-HBc、pET-28a-M2e-HBc、pET-28a-HBc、pET-28a-3M2e-HBc和pET-24a-3HA-M2e-HBc从克隆宿主菌E.coliDH5α中抽提出来，分别转化至表达宿主菌E.coliBL21(DE3)感受态细胞中。从转化平板上挑取单克隆，接种于含有5mlLB培养基(含50μl/ml卡那霉素)的试管中，37℃，200rpm培养12小时。将培养后的菌液以1:100的比例转接于含有100mlLB培养基(含50μl/ml卡那霉素)的摇瓶中，37℃，200rpm培养，待OD600达到0.6时(约3小时)，加入诱导剂IPTG(终浓度0.5mM/ml)，30℃诱导培养10小时。诱导培养结束后，4℃，8000rpm离心10min，弃去上清，收集菌体。
向离心后的菌体中加入平衡缓冲液，充分重悬菌体后，在冰浴的条件下超声破碎菌体。超声条件：超声功率100w，超声3sec，间歇5sec，循环99次。待菌液破碎至澄清状态时，可认为破碎完全。超声结束后4℃，10000rpm，超速离心10min，收集破碎后的上清和沉淀。分别取少量上清和沉淀的样品，通过SDS-PAGE电泳鉴定，发现HA-M2e-HBc在30℃的诱导条件是包涵体表达，M2e-HBc、HBc、3M2e-HBc三种蛋白在30℃的诱导条件下都是上清表达，3HA-3M2e-HBc构建到不同的表达质粒中都不能得到表达。
上清表达目的蛋白的纯化：将装有Ni-NTA亲和树脂的纯化柱固定好，加入10倍体积的ddH2O，冲洗除去纯化柱中的含20％乙醇的纯化柱保存液。加入10倍柱体积的平衡缓冲液平衡纯化柱。将破碎后的蛋白上清液加入柱中，蛋白上清液在重力的作用下缓慢向下流动。依次用从低到高的不同浓度的咪唑梯度洗脱缓冲液将吸附在镍柱上的蛋白洗脱下来，作分别收集并进行SDS-PAGE检测。用5倍体积的600mM咪唑的缓冲液洗涤柱子，然后用10倍体积的ddH2O清洗柱子，接着用10倍体积的平衡缓冲液平衡柱子，最后用20％乙醇冲洗柱子，于4℃保存柱子。通过Ni-NTA亲和层析，目标蛋白得到有效纯化，纯化的蛋白纯度大于80％。
包涵体表达目的蛋白的Ni-NTA亲和层析纯化：将破碎后的蛋白沉淀用10mlBufferB缓冲液洗涤沉淀，4℃，10000rpm离心10min，弃上清，收集沉淀，重复上述步骤3遍。用10mlBufferC缓冲液洗涤沉淀，4℃，10000rpm离心10min，弃上清，收集沉淀，重复1遍。将洗涤后的沉淀用10ml4M的尿素溶解，4℃，10000rpm离心10min收集的上清液如上述上清表达目的蛋白的纯化步骤进行纯化。
包涵体表达目的蛋白的蔗糖密度梯度离心纯化：先依次从下往上加入蔗糖梯度(60％-10％每种浓度的蔗糖加1ml)，在液面最上层铺上3ml破碎后的蛋白沉淀。35，000rpm(153800×g)，4℃离心4h，离心完成后，从上往下依次取液，注意不要扰动液面，每次1ml，分别收集于1.5mlEP管中，暂存于4℃。
将收集的蛋白样品装入透析袋中，将透析袋依次放入4M、3M、2M、1M、0M尿素的BufferD缓冲液中透析，各个梯度的尿素缓冲液中各透析3h。分别收集透析后的HA-M2e-HBc、M2e-HBc、HBc和3M2e-HBc蛋白，使用Bradford蛋白质定量试剂盒(考马斯亮蓝染色法)，测定纯化透析后四种蛋白的浓度。通过测定四种蛋白纯化液在595nm处的吸光度，与使用BSA标准品测定绘制的标准曲线，计算出两种蛋白的浓度。
将以上四种重组蛋白进行SDS-PAGE电泳，分离出的目的蛋白由Semi-drytransferapparatus(Bio-RadLaboratories)转移至PVDF膜上。将膜用封闭缓冲液(TBST中含有5％脱脂奶粉)转摇封闭2.0h。将PVDF膜浸泡在一抗溶液(每个格子中装稀释1000倍的一抗：TBST6ml+6μl(或10μl)一抗)中，转摇2.0h。用TBST摇洗PVDF膜三遍，每次5min。将PVDF膜浸泡于二抗溶液(每个格子中装稀释5000倍的二抗：TBST6ml+1.2μl二抗)中，转摇2.0h。用TBST洗三遍PVDF膜，每次摇5-10min。洗膜后，取出PVDF膜蛋白面朝上，用滤纸吸去多余的液体，滴加ECL免疫印迹化学发光液(A液和B液按照一定比例混匀)，使之与膜上的HRP基因充分反应，将膜置于生物成像系统中成像分析。WesternBloting结果如图4所示。
将铜网正面朝上放到滤纸上，滴加50μl待观察的蛋白溶液到铜网正中间。待蛋白溶液自然风干后，将滴加蛋白溶液的铜网一面在磷钨酸溶液中浸泡20sec。之后将铜网上多余的磷钨酸溶液用滤纸吸干，样品透射电镜中观察并拍照。电镜结果如图5所示。
实施例3.候选疫苗HA-M2e-HBc、M2e-HBc、HBc和3M2e-HBc活体实验
试剂和动物：FITCanti-mouseCD4(Biolegend)，APCanti-mouseCD8α(Biolegend)，(10×)RBCLysisBuffer(Biolegend)，Freund’sadjuvant(AOGMA，上海)，肝素购置于生工生物工程股份有限公司(上海)。其他的生化试剂属于国产常规的分析纯试剂。BALB/c小白鼠购置于复旦大学实验动物科学部(上海)。
试剂配置：
RBCLysisBuffer(1×)：5ml的RBCLysisBuffer(10×)加入45ml的ddH2O即可配制成50ml的RBCLysisBuffer(1×)溶液；
肝素溶液(150U/ml)：取150U/mg的肝素粉末30mg，充分溶解于30mlddH2O中，即为150U/ml的肝素溶液。
抗原佐剂和抗原混合制成乳剂：将四种抗原按表3.1的蛋白注射量分别与与同等体积的完全弗氏佐剂和非完全弗氏佐剂混合制成乳剂。
表3.1蛋白注射量设计
皮下注射给药：将药液推入背颈部皮下结缔组织，操作时常规消毒注射部位皮肤，然后将皮肤提起，注射针头取一钝角角度刺入皮下，把针头轻轻向左右摆动，易摆动则表示已刺入皮下，再轻轻抽吸，如无回血，可缓慢地将药物注入皮下。拔针时左手拇、食指捏住进针部位片刻，以防止药物外漏。将24只BALB/c小白鼠分为四组：a0，a1，a2，a3，a4，a5为HA-M2e-HBc蛋白免疫组；b0，b1，b2，b3，b4，b5为M2e-HBc蛋白免疫组；c0，c1，c2，c3，c4，c5为HBc蛋白免疫组；d0，d1，d2，d3，d4，d5为3M2e-HBc蛋白免疫组。其中a0，b0，c0，d0组为对照组，不作任何处理。先进行初次免疫，初次免疫8天后加强免疫。
观察免疫后小白鼠体重变化：BALB/c小白鼠体重的称量在每晚固定时间21:00进行。依次称量初次免疫前4天，初次免疫后8天，及加强免疫后16天内的BALB/c小白鼠体重并记录。
流式细胞术检测小白鼠外周血淋巴细胞变化：
准备好毛细玻璃管，先将毛细玻璃管在150U/ml的肝素抗凝溶液中蘸一下，使肝素抗凝溶液充满毛细玻璃管。毛细玻璃管平端先沿着鼻侧眼角慢慢滑动至眼球正下方的眼皮内。毛细玻璃管刺入，动作应稳且快。一般情况下，即会有血液流出，此时可轻轻拧搓毛细玻璃管，加快出血的速度。采血完毕即可拔除毛细玻璃管，用清洁棉球压迫眼部片刻。取血液100μl收集到加有200μl的150U/ml的肝素抗凝溶液的EP管中。
将100μl的小白鼠外周血样品加入到装有200μl的150U/ml的肝素抗凝溶液的EP管中，再加入1μlFITCanti-mouseCD4抗体和1μlAPCanti-mouseCD8α抗体。将混有抗体的小白鼠抗凝血室温避光孵育20min。将10×RBCLysisBuffer稀释成1×RBCLysisBuffer，使用之前将1×RBCLysisBuffer平衡到室温。在含100μl小白鼠外周血样品的Ep管中加入1.0ml1×RBCLysisBuffer，再加入LysisBuffer后立即轻轻混匀，在室温下避光孵育10min，350×g离心5mins，弃上清。PBS重悬细胞(可350×g，5mins清洗细胞，清洗细胞时加20％的血清保护)，将经PBS重悬的细胞上流式细胞仪进行检测。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (6)

1.一种多抗原流感通用疫苗的制备方法，其特征在于，选取甲型流感病毒保守抗原表位M2e和HA2，乙型肝炎病毒外壳蛋白HBc作为抗原表位载体，将抗原表位M2e和HA2以不同的串联组合方式展示在乙型肝炎病毒外壳蛋白HBc的外表面。
2.根据权利要求1所述的一种多抗原流感通用疫苗的制备方法，其特征在于，所述抗原表位M2e的序列如SEQIDNO：1所示。
3.根据权利要求1所述的一种多抗原流感通用疫苗的制备方法，其特征在于，所述抗原表位HA2的序列如SEQIDNO：2所示。
4.根据权利要求1所述的一种多抗原流感通用疫苗的制备方法，其特征在于，所述HBc的序列如SEQIDNO：3所示。
5.根据权利要求1所述的一种多抗原流感通用疫苗的制备方法，其特征在于，抗原表位M2e和HA2与HBc的串联组合方式为HA-M2e-HBc、M2e-HBc、HBc、3M2e-HBc和3HA-3M2e-HBc。
6.利用权利要求1—5任一所述方法制备获得的多抗原流感通用疫苗。
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