CN104902925A - 流感病毒免疫原性组合物及其应用 - Google Patents

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Abstract

包含RNA组分和多肽组分的免疫原性组合物。该RNA组分是自复制RNA。该多肽组分包含来自流感病毒抗原的表位(第一表位)，且该RNA组分编码也包含来自流感病毒抗原的表位(第二表位)的多肽。与单独使用RNA或多肽进行免疫相比，以这两种不同方式进行的表位递送可增强对流感病毒的免疫应答。

Description

流感病毒免疫原性组合物及其应用
本专利申请要求2013年1月10日提交的美国临时申请第61/751,077号的权益，其全部内容通过引用纳入本文。
政府资助的声明
本发明部分是在国防部高级研究计划署(DARPA)授予的第HR0011-12-3-0001号协议的政府支持下完成的。政府对本发明享有某些权利。
技术领域
本发明的领域是用于针对流感病毒进行免疫的RNA和蛋白混合物的非病毒递送。
背景技术
基于核酸的疫苗是诱人的免疫方案。例如，WO2012/006369公开了为实现该目的使用自复制RNA分子，且WO2013/006842描述了一种方法，其中共同递送第一多肽与编码第二多肽的自复制RNA。这两种多肽来自相同病原体，但其不需要是相同的多肽。因此，WO2013/006842公开了其可共有表位或可具有不同表位，但其必须来自相同病原体。这提供了一种组合物，其递送两种不同形式的表位(来自病原体的第一表位，以RNA编码的形式；以及来自相同病原体的第二表位，以多肽的形式)，与单独使用RNA或单独使用多肽免疫相比，该组合物能够增强针对该病原体的免疫应答。
本发明的一个目的是提供使用自复制RNA的其他免疫方法。
发明内容
本发明通常涉及包含RNA组分和多肽组分的免疫原性组合物。该RNA组分是自复制RNA，如下文更详细描述的那样。该多肽组分包含来自流感病毒抗原的表位(第一表位)，且该RNA组分编码也包含来自流感病毒抗原的表位(第二表位)的多肽。如WO2013/006842中所示，与单独使用RNA或单独使用多肽进行免疫相比，以这两种不同方式递送表位的免疫原性组合物可增强对病原体(流感病毒)的免疫应答。
因此，本发明提供了一种免疫原性组合物，其包含(a)包含来自流感病毒抗原的表位的多肽，以及(b)编码包含来自流感病毒抗原的表位的多肽的自复制RNA。
本发明还提供了一种药盒，其包含(a)包含多肽的第一药盒组分，所述多肽包含来自流感病毒抗原的表位，以及(b)包含自复制RNA的第二药盒组分，所述自复制RNA编码包含来自流感病毒抗原的表位的多肽。
本发明还提供了用于治疗和/或预防流感病毒疾病和/或感染的方法、用于诱导针对流感病毒的免疫应答的方法，以及用于为对象接种疫苗的方法，所述方法是通过共同递送上文所述的RNA分子和多肽分子(共同给药)来进行的。
本发明还提供了用于治疗和/或预防流感病毒疾病和/或感染的方法、用于诱导针对流感病毒的免疫应答的方法，以及用于为对象接种疫苗的方法，所述方法是通过依次给予上文所述的RNA分子和多肽分子(初免-加强)来进行的。
在本发明的第一实施方式中，该第一和第二表位都来自流感血凝素(HA)。
在第二实施方式中，该第一和第二表位都来自甲型流感病毒。理想情况下，其都来自具有相同HA亚型的甲型流感病毒毒株，例如都来自H5亚型的甲型流感病毒。在该实施方式的特定方面中，该第一和第二表位都是来自相同HA亚型的血凝素表位。然而，该第一和第二多肽也可能来自具有不同HA亚型的甲型流感病毒毒株，例如一种来自H1毒株且一种来自H5毒株。
在第三实施方式中，该第一表位和该第二表位都来自乙型流感病毒。在该实施方式的特定方面中，该第一和第二表位都是来自乙型流感病毒的血凝素表位。
在第四实施方式中，该第一表位和该第二表位都来自B/Yamagata/16/88样谱系中的乙型流感病毒毒株。在该实施方式的特定方面中，该第一和第二表位都是来自B/Yamagata/16/88样谱系中的乙型流感病毒毒株的血凝素表位。
在第五实施方式中，该第一表位和该第二表位都来自B/Victoria/2/87样谱系中的乙型流感病毒毒株。在该实施方式的特定方面中，该第一和第二表位都是来自B/Victoria/2/87样谱系中的乙型流感病毒毒株的血凝素表位。
流感病毒抗原
流感病毒具有三种类型——甲型、乙型和丙型。甲型流感病毒是最常见的感染人、动物和鸟类的流感病毒。乙型流感病毒大部分发生在人中。丙型流感病毒的感染不在人或哺乳动物中引起任何严重症状。
流感病毒毒株可随季节而变。在目前的大流行间期，目前的季节性三价疫苗包括两种甲型流感毒株(一种H1N1毒株和一种H3N2毒株)和一种乙型流感毒株。大流行流感毒株的特征是：(a)与目前流行的人毒株中的血凝素相比，它含有新的血凝素，即十年以上在人群中未见的血凝素(如H2)，或者从未在人群中发现的血凝素(如通常只出现在鸟群体中的H9)，以至于疫苗接受者和普通人群未曾免疫接触过该毒株的血凝素；(b)它能够在人群中横向传播；和(c)它对人有致病性。大流行毒株通常是H2、H5、H6、H7或H9亚型甲型流感病毒毒株，例如H5N1、H5N3、H9N2、H2N2、H6N1、H7N1、H7N7和H7N9毒株。在H5亚型内，病毒可以属于不同进化支。
甲型流感病毒目前显示17种HA亚型：H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15、H16和H17。其还显示九种NA(神经氨酸酶)亚型：N1、N2、N3、N4、N5、N6、N7、N8和N9。
乙型流感病毒目前不显示不同的HA亚型，但乙型流感病毒毒株属于两种不同的谱系。这些谱系出现于1980年代晚期，并且具有在抗原/遗传上可彼此区分的HA[Rota等(1992)J Gen Virol 73:2737-42]。当前的乙型流感病毒毒株是B/Victoria/2/87样或B/Yamagata/16/88样。通常可从抗原性区分这两种谱系中的毒株，但氨基酸序列的差异也可以区分这两种谱系，例如B/Yamagata/16/88样毒株常常(但并非总是)具有氨基酸残基164缺失(相对‘Lee40’HA序列进行编号)的HA蛋白(GenBank序列GI:325176)。
在一些实施方式中，该第一和第二表位都来自流感病毒血凝素。例如：(a)该第一表位可来自甲型流感病毒血凝素且该第二表位可来自乙型流感病毒血凝素；(b)该第一表位可来自甲型流感病毒血凝素且该第二表位可来自甲型流感病毒血凝素；或者(c)该第一表位可来自乙型流感病毒血凝素且该第二表位可来自乙型流感病毒血凝素。理想情况下，这两种表位都来自相同的流感病毒类型，例如都来自甲型或都来自乙型。
在其中第一和第二表位都来自甲型流感病毒的实施方式中，理想情况下其都是血凝素表位，且来自具有相同HA亚型的甲型流感病毒毒株。例如，两种表位可以都来自H1血凝素、H2血凝素、H3血凝素、H4血凝素、H5血凝素、H6血凝素、H7血凝素、H8血凝素、H9血凝素、H10血凝素、H11血凝素、H12血凝素、H13血凝素、H14血凝素、H15血凝素、H16血凝素或H17血凝素。在一个特定实施方式中，两种表位都来自H1血凝素、H3血凝素或H5血凝素。然而，如上文所述，该第一和第二表位可能都是甲型流感病毒血凝素表位，但其来自具有不同HA亚型的甲型流感病毒毒株(其中这两种表位还可能被相同的抗HA抗体所识别，例如当两种HA亚型共有交叉反应性表位时)。
在其中第一和第二表位都来自乙型流感病毒的实施方式中，理想情况下其都是血凝素表位，且来自相同谱系中的乙型流感病毒毒株。例如，两种表位可以都来自B/Victoria/2/87样谱系中的毒株，或者两种表位可以都来自B/Yamagata/16/88样谱系中的毒株。
在所有实施方式中，通常该第一表位和该第二表位来自相同的流感病毒毒株。在一个特定的实施方式中，该第一表位和该第二表位是相同的表位。然而，在一些实施方式中，该第一表位和该第二表位来自不同的流感病毒毒株，其可以是例如具有相同HA亚型的甲型流感病毒毒株(如2x H1毒株或2x H3毒株)或具有不同HA亚型的甲型流感病毒毒株(如H1毒株和H5毒株)。
自复制RNA
本发明的免疫原性组合物包含编码多肽的RNA组分，所述多肽包含来自流感病毒抗原的表位(第二表位)。给予人后，该RNA在细胞内翻译以在原位提供流感病毒多肽。
该RNA应为+-链，因而其无需任何干预性的复制步骤(例如逆转录)即可由细胞翻译。有利地，其还可结合至免疫细胞表达的TLR7受体，由此启动佐剂效应。优选的+-链RNA是自复制的。自复制RNA分子(复制子)即使在无任何蛋白质的情况下递送至脊椎动物细胞时，能通过从其自身(通过从其自身产生的反义拷贝)转录而导致多种子RNA生成。因此，自复制RNA分子通常是+-链分子，其可在递送至细胞之后直接翻译，而该翻译提供RNA依赖性的RNA聚合酶，该酶随后由所述经递送的RNA生成反义转录本和正义转录本。因此，递送的RNA导致生成多个子RNA。这些子RNA以及共线亚基因组转录本可以自身翻译以提供编码的多肽的原位表达，或可转录以进一步提供与所递送RNA同义的转录本，其经翻译提供多肽的原位表达。此转录序列的总体结果是引入的复制子RNA数量大幅扩增，因此编码的多肽变为细胞的主要多肽产物。
实现自复制的一种合适系统是使用基于α病毒的RNA复制子。这些+-链复制子在递送至细胞之后翻译以得到复制酶(或复制酶-转录酶)。该复制酶被翻译成多聚蛋白，其自动切割产生复制复合物，该复制复合物生成+-链经递送RNA的基因组–-链拷贝。这些—-链转录本可自身转录以得到+-链亲本RNA的更多拷贝并产生编码该多肽的亚基因组转录本。该亚基因组转录本的翻译因此导致感染的细胞原位表达多肽。合适的α病毒复制子可采用来自辛德毕斯病毒、西门利克森林病毒、东部马脑炎病毒、委内瑞拉马脑炎病毒等的复制酶。可采用突变体或野生型病毒序列，例如，已用于复制子的VEEV减毒TC83突变体(WO2005/113782)。
因此优选的自复制RNA分子编码(i)可从自复制RNA分子转录RNA的RNA依赖性RNA聚合酶和(ii)感兴趣的多肽。该聚合酶可以是α病毒复制酶，例如包括α病毒蛋白nsP1、nsP2、nsP3和nsP4中的一种或多种。
虽然天然α病毒基因组除编码非结构复制酶多聚蛋白以外还编码结构病毒体蛋白，但是本发明的自复制RNA分子优选不编码α病毒结构蛋白。因此，优选的自复制RNA可导致细胞中产生其自身的基因组RNA拷贝，但不产生含RNA的病毒体。无法生成这些病毒体说明，不同于野生型α病毒，自复制RNA分子自身不能以感染形式永存。野生型病毒永存必需的α病毒结构蛋白在本发明的自复制RNA中缺失，且其位置被编码感兴趣的多肽的基因占据，从而亚基因组转录本编码多肽而不是结构α病毒病毒体蛋白。
因此，本发明可用的自复制RNA分子可具有两个开放阅读框。第一(5')开放阅读框编码复制酶；第二(3')开放阅读框编码多肽。在一些实施方式中，该RNA可具有额外的(例如，下游)开放阅读框用于例如编码其它多肽(见下文)或编码辅助多肽。
自复制RNA分子可具有与所编码复制酶相容的5'序列。
该自复制RNA分子可源自或基于α病毒以外的病毒，具体而言是正链RNA病毒，且特别是小RNA病毒、黄病毒、风疹病毒、瘟病毒、丙型肝炎病毒、萼状病毒或冠状病毒。但优选α病毒，且合适的野生型α病毒序列为人熟知并可从序列保藏机构如美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection)获得。合适α病毒的代表性示例包括奥拉病毒(ATCC VR-368)、贝巴鲁病毒(ATCCVR-600、ATCC VR-1240)、犰狳病毒(ATCC VR-922)、基孔肯雅病毒(ATCC VR-64、ATCC VR-1241)、东方马脑脊髓炎病毒(Eastern equine encephalomyelitis virus)(ATCC VR-65、ATCC VR-1242)、摩根堡病毒(ATCC VR-924)、格塔病毒(ATCCVR-369、ATCC VR-1243)、克泽拉格齐病毒(ATCC VR-927)、马亚罗(Mayaro)(ATCCVR-66)、马亚罗病毒(ATCC VR-1277)、米德尔堡病毒(Middleburg)(ATCC VR-370)、穆坎博病毒(ATCC VR-580、ATCC VR-1244)、恩杜姆病毒(Ndumu)(ATCCVR-371)、皮春纳病毒(ATCC VR-372、ATCC VR-1245)、罗斯河病毒(ATCC VR-373、ATCC VR-1246)、西门利克森林病毒(ATCC VR-67、ATCC VR-1247)、辛德比斯病毒(ATCC VR-68、ATCC VR-1248)、托纳特(ATCC VR-925)、特里尼蒂病毒(ATCCVR-469)、乌纳病毒(ATCC VR-374)、委内瑞拉马脑脊髓炎病毒(ATCC VR-69、ATCCVR-923、ATCC VR-1250ATCC VR-1249、ATCC VR-532)、西马脑脊髓炎病毒(ATCC VR-70、ATCC VR-1251、ATCC VR-622、ATCC VR-1252)、沃达罗河病毒(ATCC VR-926)和Y-62-33(ATCC VR-375)。包括来自多种不同α病毒的组分的嵌合α病毒复制子也可以是有用的。
自复制RNA分子可具有各种长度，但其通常长5000～25000个核苷酸，如8000～15000个核苷酸或9000～12000个核苷酸。因此，该RNA比siRNA递送中所见的要长。
本发明可用的RNA分子可具有5'帽(例如7-甲基鸟苷)。该帽可增强RNA的体内翻译。
本发明可用的RNA分子的5'核苷酸可具有5'三磷酸基团。在加帽的RNA中，其可通过5'-至-5'桥连接至7-甲基鸟苷。5'三磷酸可增强RIG-I结合并因而促进佐剂效应。
RNA分子可具有3'聚A尾。其还可在其3'末端附近包括聚A聚合酶识别序列(如AAUAAA)。
本发明可用的RNA分子通常为单链。单链RNA一般能通过与TLR7、TLR8、RNA解旋酶和/或PKR结合来起始佐剂效应。以双链形式递送的RNA(dsRNA)可与TLR3结合，并且该受体还可被单链RNA复制过程中形成或在单链RNA的二级结构中形成的dsRNA触发。
本发明可用的RNA分子可通过体外转录(IVT)来方便地制备。IVT可使用(cDNA)模板，其在细菌中以质粒形式产生和增殖或经合成(例如通过基因合成和/或聚合酶链式反应(PCR)工程方法)产生。例如，可采用DNA依赖性RNA聚合酶(例如噬菌体T7、T3或SP6RNA聚合酶)来从DNA模板转录RNA。可按需采用合适的加帽和聚A加成反应(尽管所述复制子的聚A通常在DNA模板内编码)。这些RNA聚合酶可对转录的5'核苷酸有严格的要求，且在一些实施方式中这些要求必须与所编码复制酶的要求匹配，以确保IVT-转录的RNA能作为其自身编码复制酶的底物高效地发挥作用。
如WO2011/005799中所述，自复制RNA可包括(除任何5'帽结构以外)具有经修饰核碱基的一个或多个核苷酸。例如，自复制RNA可包括一种或多种经修饰的嘧啶核碱基，例如假尿苷和/或5-甲基胞苷残基。然而，在一些实施方式中，该RNA包含未经修饰的核碱基，并可包含未经修饰的核苷酸，即，该RNA中所有核苷酸都是标准的A、C、G和U核糖核苷酸(除了任何5'帽结构，其可包含7'-甲基鸟苷)。在其它实施方式中，该RNA可包括含7-甲基鸟苷的5'帽，并且起始1、2或3个5'个核糖核苷酸可在核糖的2'位置被甲基化。
本发明所用的RNA理想情况下仅包括核苷之间的磷酸二酯连接，但在一些实施方式中，其可包含氨基磷酸酯、硫代磷酸酯和/或甲基磷酸酯连接。
该RNA编码包含来自流感病毒抗原的表位的多肽，如下文更详细描述的那样。该RNA理想情况下编码包含流感病毒血凝素片段的多肽。其可编码可溶性胞质抗原，而非膜连接或分泌的抗原(但细胞可在细胞表面上具有胞质抗原作为免疫加工的一部分)。多肽的原位表达会引发抗流感免疫应答。例如，其可导致生成识别流感病毒颗粒的抗体，例如结合病毒颗粒表面血凝素的抗体。理想情况下，引发的抗体是中和或保护性抗体。理想情况下，由原位表达的多肽引发的抗体可免疫特异性结合该表达的多肽以及在本发明的免疫原性组合物中递送的多肽。
多肽组分
本发明的免疫原性组合物包含多肽组分，且该多肽包含来自流感病毒抗原的表位(第一表位)。
该多肽组分可以是单个多肽，但也可以是多链多肽结构(如多肽复合物，例如由两个或多个蛋白形成的复合物)、多亚基蛋白(如三亚基血凝素)或大多肽结构，如VLP(病毒样颗粒)。类似地，该自复制RNA可编码超过一种流感病毒多肽，例如其可编码两种或多种不同的多肽(其可彼此相连形成复合物)，或者其可表达来自超过一种流感病毒毒株(例如来自至少一种甲型流感病毒和至少一种乙型流感病毒)的多肽(如HA)。方便起见，理想情况下自复制RNA表达五种或更少的多肽。
理想情况下，组合物中的多肽(第一多肽)和由自复制RNA编码的多肽(第二多肽)共有至少一个表位。其可共有许多表位，特别是当两个多肽较长(如长度超过80aa)且各自包含多个表位时。
在某些实施方式中，第一多肽和第二多肽共有至少2个、至少3个、至少4个或至少5个共同的B细胞和/或T细胞表位。在某些实施方式中，第一和第二多肽共有至少一个优势免疫表位。在某些实施方式中，第一和第二多肽抗原具有相同的优势免疫表位或相同的主要优势免疫表位。
通常，第一和第二多肽共有共同的氨基酸序列，例如第一和第二多肽是相同的，第一多肽是第二多肽的片段，第二多肽是第一多肽的片段，第一多肽是核心流感序列与第一融合伙伴的融合体且第二多肽是核心流感序列与第二融合伙伴的融合体，等。共有的氨基酸序列理想情况下包含多个表位，且其可以是40个氨基酸或更长，例如大于等于60aa、大于等于80aa、大于等于100aa、大于等于120aa、大于等于140aa、大于等于160aa、大于等于180aa、大于等于200aa、大于等于220aa、大于等于240aa、大于等于260aa、大于等于280aa、大于等于300aa、大于等于320aa、大于等于340aa、大于等于360aa、大于等于380aa、大于等于400aa或更多。共有的氨基酸序列可包含完整的HA1血凝素亚基或其免疫原性片段。
在一些实施方式中，第一和第二多肽彼此间具有至少x％氨基酸序列相同性，其中x的值是80、85、90、92、94、95、96、97、98或99。如果一种多肽短于其他多肽，则应在较短多肽的长度上计算序列相同性。两个氨基酸序列间的序列相同性百分数表示进行比对时所比较的两条序列中相同氨基酸的百分数。可以使用本领域已知的软件程序测定该比对和同源性或序列相同性百分比。优选的比对通过史密斯-沃特曼(Smith-Waterman)同源性搜索算法使用仿射缺口搜索确定，其中缺口开放罚12分，缺口延伸罚2分，BLOSUM矩阵计62分。
除流感来源的氨基酸序列外，该多肽还可包括额外的序列，如促进表达、生产、纯化或检测的序列(例如聚His序列、标签等)。
通常对该多肽进行分离或纯化。因此，其不与通常天然存在(若适用)的分子结合。
通常通过在重组宿主系统中表达来制备多肽。合适的重组宿主细胞包括例如，昆虫细胞(如埃及伊蚊(Aedes aegypti)、苜蓿银纹夜蛾(Autographa californica)、家蚕蛾(Bombyx mori)、果蝇(Drosophila melanogaster)、草地贪夜蛾(Spodopterafrugiperda)和粉纹夜蛾(Trichoplusia ni))、哺乳动物细胞(如人、非人灵长类、马、牛、羊、狗、猫和啮齿类(如仓鼠))、禽类细胞(如鸡、鸭和鹅)、细菌(如大肠杆菌(E.coli)、枯草杆菌(Bacillus subtilis)和链球菌属(Streptococcus spp.))、酵母细胞(如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、白色念珠菌(Candida albicans)、麦芽糖假丝酵母(Candida maltosa)、多形汉森酵母(Hansenual polymorpha)、脆壁克鲁维酵母(Kluyveromyces fragilis)、乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)、季也蒙毕赤酵母(Pichia guillerimondii)、巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)和解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica))、四膜虫细胞(如嗜热四膜虫(Tetrahymena thermophila))或其组合。本领域熟知许多合适的昆虫细胞和哺乳动物细胞。合适的昆虫细胞包括例如，Sf9细胞、Sf21细胞、Tn5细胞、Schneider S2细胞和High Five细胞(源自亲本粉纹夜蛾BTI-TN-5B1-4细胞系的克隆分离物(英杰公司(Invitrogen)))。合适的哺乳动物细胞包括例如，中华仓鼠卵巢(CHO)细胞、人胚胎肾细胞(HEK293细胞，通常由剪切的腺病毒5型DNA转化成)、NIH-3T3细胞、293-T细胞、Vero细胞、HeLa细胞、PERC.6细胞(ECACC保藏号96022940)、Hep G2细胞、MRC-5(ATCC CCL-171)、WI-38(ATCC CCL-75)、胎猕猴肺细胞(ATCC CL-160)、Madin-Darby牛肾(“MDBK”)细胞、Madin-Darby狗肾(“MDCK”)细胞(如MDCK(NBL2)、ATCC CCL34；或MDCK 33016、DSM ACC 2219)、幼仓鼠肾(BHK)细胞如BHK21-F、HKCC细胞等。合适的禽类细胞包括例如，鸡胚胎干细胞(如细胞)、鸡胚胎成纤维细胞、鸡胚胎生殖细胞、鸭细胞(例如Vaccine 27:4975-4982(2009)和WO2005/042728中描述的AGE1.CR和AGE1.CR.pIX细胞系)、EB66细胞等。
合适的昆虫细胞表达系统如杆状病毒系统为本领域技术人员已知，描述于例如Summers和Smith,Texas Agricultural Experiment Station Bulletin No.1555(1987)。杆状病毒/昆虫细胞表达系统的材料和方法是以药盒的形式市售可得的。类似地，细菌和哺乳动物细胞表达系统也是本领域已知的。
可使用常规方法在合适的载体中制备编码多肽的重组构建体。昆虫或哺乳动物细胞中用于重组蛋白表达的许多合适载体为本领域熟知且常用。合适的载体可含许多组分，包括但不限于以下一种或多种：复制起点；可选的标记基因；一种或多种表达控制元件如转录控制元件(如启动子、增强子、终止子)，和/或一种或多种翻译信号；和选择的宿主细胞(如哺乳动物起源的或来自异源哺乳动物或非哺乳动物物种)中用于靶向分泌途径的信号序列或前导序列。例如，为了在昆虫细胞中表达，使用合适的杆状病毒表达载体如pFastBac(英杰公司)生产重组杆状病毒颗粒。该杆状病毒颗粒经扩增，用于传染昆虫细胞以表达重组蛋白。为了在哺乳动物细胞中表达，使用会驱动构建体在所需哺乳动物宿主细胞(如中华仓鼠卵巢细胞)中表达的载体。
多肽可使用任何合适方法进行纯化。例如，本领域已知通过免疫亲和层析纯化多肽的方法。本领域已熟知纯化所需蛋白的合适方法，包括沉淀和各种类型的色谱如疏水相互作用、离子交换、亲和、螯合和尺寸排阻。可用两种或更多这些或其它合适方法实现合适的纯化方案。如果需要，该多肽可包括有助于纯化的“标签”，如表位标签或HIS标签。此类带标签的多肽可通过螯合层析或亲和层析方便地从例如条件培养基中纯化。
本发明中使用的多肽抗原可以是重组多肽，如FlublokTM产品中观察到的那样。该产品含有纯化的HA多肽，其表达于草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)Sf9细胞来源的连续昆虫细胞系中，生长于由化学限定的脂质、维生素、氨基酸和矿物盐组成的无血清培养基中。该多肽经由杆状病毒载体(苜蓿银纹夜蛾(Autographacalifornica)核多面体病病毒)在该细胞系中表达，并随后使用曲通X-100TM(叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇)从细胞中提取并通过柱色谱纯化。单次剂量的FlublokTM产品含有45μg HA/流感菌株，即135μg/3价剂量。其还含有氯化钠、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠和聚山梨酯20。
作为一种使用在重组宿主系统中表达的多肽的有用替代方法，使用包含来自流感病毒颗粒的血凝素的常规流感疫苗。因此，本发明可使用自复制RNA与常规流感疫苗，从而改进后者。病毒颗粒来源的流感疫苗是基于活病毒或灭活病毒，且灭活疫苗可基于完整病毒颗粒、“裂解”病毒颗粒或纯化的表面抗原。病毒颗粒来源的HA也可以病毒体的形式呈递。本发明可使用所有这些类型的流感疫苗。病毒颗粒来源的流感疫苗组合物可以不含佐剂或者可包含佐剂，例如水包油乳液，如含角鲨烯的乳液MF59和AS03。
采用灭活病毒时，该含多肽组合物可包含全病毒、裂解病毒颗粒或纯化的表面抗原(包括血凝素，且通常也包括神经氨酸酶)。灭活病毒的化学方法包括用有效量的以下一种或多种试剂处理：去污剂、甲醛、β-丙内酯、亚甲蓝、补骨脂素、羧基富勒烯(C60)、二元乙胺、乙酰基乙烯亚胺或其组合。本领域已知病毒灭活的非化学方法，例如UV射线或γ射线辐射。
用去污剂(如乙醚、聚山梨醇酯80、脱氧胆酸盐、三正丁基磷酸盐、曲通X100、曲通N101、溴化十六烷基三甲铵、特吉托NP9等)处理纯化的病毒颗粒以获得裂解病毒颗粒，从而产生亚病毒颗粒制品，包括‘吐温-醚’裂解方法。裂解流感病毒的方法是例如本领域熟知的，例如参见WO02/28422、WO02/067983、WO02/074336、WO01/21151、WO02/097072、WO2005/113756等。一般使用破坏浓度的裂解剂破坏或片段化全病毒来裂解该病毒，无论该病毒有无感染性。这种破坏导致病毒蛋白的完全或部分溶解，改变病毒的完整性。优选的裂解剂是非离子型和离子型(例如阳离子)表面活性剂，如烷基糖苷、烷基硫苷、酰基糖、磺基甜菜碱、甜菜碱、聚氧乙烯烷基醚、N,N-二烷基-葡糖酰胺、6-O-(N-庚甲酰)-甲基-α-D-葡萄糖苷(Hecameg)、烷基苯氧基-聚乙氧基乙醇、NP9、季铵化合物、肌氨酰、CTAB(溴化十六烷基三甲铵)、三正丁基磷酸酯、塞弗伦(Cetavlon)、十四烷基三甲铵盐、脂质转染试剂、脂质体转染试剂(lipofectamine)和DOT-MA、辛基-或壬基苯氧基聚氧乙醇(如曲通表面活性剂，如曲通X100或曲通N101)、聚氧乙烯去水山梨糖醇酯(吐温表面活性剂)、聚氧乙烯醚、聚氧乙烯酯等。一种有用的裂解方法利用脱氧胆酸钠和甲醛的连续作用，并且裂解可在病毒颗粒初始纯化期间进行(例如在蔗糖密度梯度溶液中)。因此，裂解过程可包括：澄清含病毒颗粒的材料(以去除非病毒颗粒物质)，浓缩收获的病毒颗粒(例如使用吸附方法，如CaHPO4吸附)，从非病毒颗粒材料中分离全病毒颗粒，用裂解剂在密度梯度离心步骤中裂解病毒颗粒(例如，用含有裂解剂如脱氧胆酸钠的蔗糖梯度)，然后过滤(例如超滤)以去除不需要的物质。另一种有用的裂解病毒颗粒制备物是通过以下方法制备的：使用脱氧胆酸钠裂解病毒颗粒，随后使用脱氧胆酸钠和甲醛以确保灭活，随后进行超滤和灭菌过滤。裂解流感疫苗的示例是BEGRIVACTM、FLUARIXTM、FLUZONETM和FLUSHIELDTM产品。
纯化的流感病毒表面抗原疫苗包含表面抗原HA，一般还包含NA。制备这些纯化形式的蛋白质的方法是本领域熟知的。FLUVIRINTM、AGRIPPALTM和INFLUVACTM产品是流感亚基疫苗。
另一种形式的灭活抗原是病毒体(不含核酸的病毒样脂质体颗粒；Huckriede等(2003)Methods Enzymol 373:74-91)。其可通过使用去污剂溶解病毒，然后去除核衣壳和重建含病毒糖蛋白的膜来制备。一种用于制备病毒体的替代性方法包括将病毒膜糖蛋白加入过量磷脂中，得到膜中具有病毒蛋白质的脂质体。
HA是现有灭活流感疫苗中的主要免疫原，且参照一般由SRID测定的HA水平来标准化疫苗剂量。现有的疫苗一般含有约15μg HA/毒株，但也可使用更低的剂量，例如用于儿童或大流行情况下，或者是使用佐剂时。分数剂量如1/2(即7.5μgHA/毒株)、1/4和1/8以及较高剂量(如3x或9x剂量；Treanor等(1996)J Infect Dis173:1467-70，Keitel等(1996)Clin Diagn Lab Immunol 3:507-10)已有应用。因此，疫苗可包含0.1-150μg HA/流感毒株，特别是0.1-50μg，例如0.1-20μg、0.1-15μg、0.1-10μg、0.1-7.5μg、0.5-5μg等。具体剂量包括例如，约45、约30、约15、约10、约7.5、约5、约3.8、约3.75、约1.9、约1.5等/株。
本发明还可使用活疫苗。通常通过从含病毒颗粒的流体中纯化病毒颗粒来制备这类疫苗。例如，该流体可通过离心澄清并用缓冲液(例如含蔗糖、磷酸钾和谷氨酸单钠)稳定。目前可以获得各种形式的流感病毒疫苗(例如参见Vaccines(《疫苗》)(Plotkins和Orenstein编)第4版，2004，ISBN:0-7216-9688-0的第17和18章)。活病毒疫苗包括米迪缪尼公司(MedImmune)的FLUMISTTM产品。通常对病毒进行减毒，且病毒可以是温度敏感的和/或冷适应的。对于活疫苗，利用组织培养感染剂量中值(TCID50)或荧光病灶单位(FFU)而非HA含量来衡量剂量，且TCID50或FFU一般为106至108(特别是106.5-107.5)/株。
本发明所用的流感株可以具有野生型病毒中的天然HA，或具有修饰HA。例如，已知修饰HA以去除使病毒在禽类物种中具有高致病性的决定簇(如HA1/HA2切割位点周围的超碱性区域(hyper-basic region))。反向遗传学的使用促进了这类修饰。
在所有实施方式中，无论是使用常规的病毒来源的多肽还是使用重组多肽，本发明使用的组合物都可包含来自流感病毒的单个菌株(单价)或来自多个菌株(多价)的HA多肽。因此，组合物可包含来自一种或多种(如1、2、3、4或更多种)流感病毒毒株(包括甲型流感病毒和/或乙型流感病毒)的HA。当疫苗包含来自超过一种毒株的HA时，通常单独制备来自不同毒株的HA并随后将其混合。三价疫苗是典型的，包含来自两种甲型流感病毒毒株(如H1毒株和H3毒株，如H1N1和H3N2)和一种乙型流感病毒(即典型的三价季节性流感疫苗中可见的毒株组合)的HA。四价疫苗也是有用的(WO2008/068631)，其包含来自两种甲型流感病毒毒株和两种乙型流感病毒毒株、或者三种甲型流感病毒毒株和一种乙型流感病毒毒株的HA。具有来自两种甲型流感病毒毒株(例如H1毒株和H3毒株，如H1N1和H3N2)和两种乙型流感病毒毒株(例如一种具有B/Yamagata/16/88样谱系的毒株和一种具有B/Victoria/2/87样谱系的毒株)的HA的四价疫苗是特别有用的。
递送系统
虽然RNA可以裸RNA递送(如仅作为RNA水溶液)，但为了增强进入细胞以及随后的细胞间效应，在特定实施方式中与递送系统(如微粒或乳液递送系统)联用以给予RNA分子。因此，除多肽和RNA组分以外，本发明的组合物还可包含其他组分，如脂质、聚合物或其他可促进RNA进入靶细胞的化合物。许多递送系统为本领域技术人员熟知。
可通过受体介导的胞吞作用将RNA导入细胞，例如美国专利号6,090,619，Wu和Wu(1988)J.Biol.Chem.,263:14621，以及Curiel等(1991)PNAS USA88:8850。美国专利号6,083,741公开了通过将核酸连接聚阳离子组分(如具有3-100个赖氨酸残基的聚L赖氨酸)来将外源核酸导入哺乳动物细胞，所述聚阳离子组分自身偶联至整联蛋白受体结合部分(如具有RGD序列的环肽)。
可将RNA分子经由两亲物递送至细胞，例如美国专利号6,071,890。核酸分子通常可与阳离子两亲物形成复合物。与该复合物接触的哺乳动物细胞能容易地将其吸收。
三种特别有用的递送系统是(i)脂质体(ii)非毒性和可生物降解聚合物微粒(iii)阳离子亚微米水包油乳液。
脂质体
各种两亲性脂质能在水性环境下形成双层以包封含RNA的水性核心，形成脂质体。这些脂质可具有阴离子、阳离子或两性离子亲水头部基团。从阴离子磷脂形成脂质体可追溯到上世纪六十年代，而形成阳离子脂质体的脂质从上世纪九十年代就已有研究。一些磷脂是阴离子型的，但是也有其它两性离子型的和其它阳离子型的。合适的磷脂类型包括但不限于：磷脂酰乙醇胺、磷脂酰胆碱、磷脂酰丝氨酸和磷脂酰甘油，一些有用的磷脂列于表1。有用的阳离子脂质包括但不限于：二油酰-三甲胺丙烷(DOTAP)、1,2-二硬脂氧基-N,N-二甲基-3-氨基丙烷(DSDMA)、1,2-二油氧基-N,N二甲基-3-氨基丙烷(DODMA)、1,2-二亚油氧基-N,N-二甲基-3-氨基丙烷(DLinDMA)、1,2-二亚麻氧基-N,N-二甲基-3-氨基丙烷(DLenDMA)。两性离子脂质包括但不限于：酰基两性离子脂质和醚基两性离子脂质。有用的两性离子脂质示例为DPPC、DOPC和十二烷基磷酸胆碱。其他有用的脂质公开于WO2012/031046。该脂质可以是饱和或不饱和的。优选采用至少一种不饱和脂质来制备脂质体。若不饱和脂质有两个尾部，则这两个尾部都可以是不饱和的，或其可具有一个饱和尾部和一个不饱和尾部。
优选的脂质包含pKa范围为5.0-7.6(如5.7-5.9)的脂质，特别是具有叔胺的脂质(参见WO2012/006378)。
脂质体可由单一脂质或脂质混合物形成。混合物可包括(i)阴离子脂质混合物(ii)阳离子脂质混合物(iii)两性离子脂质混合物(iv)阴离子脂质和阳离子脂质混合物(v)阴离子脂质和两性离子脂质混合物(vi)两性离子脂质和阳离子脂质混合物或(vii)阴离子脂质、阳离子脂质和两性离子脂质混合物。类似地，混合物可包含饱和脂质和不饱和脂质。例如，混合物可包含DSPC(两性离子、饱和)、DlinDMA(阳离子、不饱和)和/或DMG(阴离子、饱和)。采用脂质混合物时，并非混合物中的所有脂质成分都需要是两亲性的，例如可使一种或多种两亲性脂质与胆固醇混合。
可使脂质的亲水部分PEG化(即通过共价连接聚乙二醇修饰)。此修饰可增加稳定性并防止脂质体的非特异性吸收。例如，可使用如WO2005/121348和Heyes等(2005)J Controlled Release 107:276-87中公开的技术将脂质与PEG偶联。可以使用多种长度的PEG，例如0.5-8kDa，1-3kDa(WO2012/031043)或3-11kDa(WO2013/033563)。
实施例中使用DSPC、DlinDMA、PEG-DMG和胆固醇的混合物。可如WO2012/006376中公开的那样制备这些物质。
脂质体通常分为三组：多层囊泡(MLV)、小单层囊泡(SUV)和大单层囊泡(LUV)。MLV的各囊泡中具有多个双层，形成数个分开的水性隔室。SUV和LUV具有包封水性核心的单一双层；SUV通常直径小于等于50nm，而LUV直径大于50nm。本发明所用的脂质体理想上为直径范围50～220nm的LUV。对于包含直径不同的LUV群的组合物：(i)数量上有至少80％的直径应在20-220nm，(ii)该群的平均直径(Zav，以强度计)理想情况下在40-200nm，和/或(iii)直径的多分散性指数应小于0.2。
直径范围为60-180nm的脂质体是特别有用的(WO2012/030901)，如直径范围为80-160nm的那些。就包含直径不同的脂质体群的组合物而言：(i)数量上至少80％的脂质体的直径应是60-180nm且特别地是80-160nm，和/或(ii)该群的平均直径(通过强度，例如Z均值)理想上是60-180nm且特别地是80-160nm。
用于测定脂质体悬浮液中平均颗粒直径和粒度分布的设备是市售可得的。这些设备通常采用动态光散射和/或单粒子光学传感的技术如获自PSS公司(ParticleSizing Systems)(美国圣塔芭芭拉)的AccusizerTM和NicompTM系列仪器，或马文仪器公司(Malvern Instruments)(英国)的ZetasizerTM仪器，或堀场公司(Horiba)(日本京都)的粒径分布分析仪(Particle Size Distribution Analyzer instruments)。动态光散射是测定脂质体直径的优选方法。对于脂质体群体，优选的限定本发明组合物中平均脂质体直径的方法是Z-均值法，即通过动态光散射(DLS)测量的全体脂质体集合的强度加权平均流体动力学尺寸。Z-均值法来源于测量的相关曲线的累积分析，其中假定单个颗粒尺寸(脂质体直径)并将单一指数拟合(single exponential fit)应用于自相关函数。累积分析算法不生成分布，但除强度加权的Z均值外还生成多分散指数。
本领域已知制备合适的脂质体的技术，例如参见Liposomes:Methods andProtocols(《脂质体：方法和实验方案》)，卷一：Pharmaceutical Nanocarriers:Methodsand Protocols(《药物纳米载体：方法和实验方案》)(Weissig编著).哈马那(Humana)出版,2009.ISBN 160327359X；Liposome Technology(《脂质体技术》)，卷I、II和III(Gregoriadis编著).英富曼医疗保健公司(Informa Healthcare)，2006；和Functional Polymer Colloids and Microparticles(《功能性聚合物胶质和微粒》)，卷4(Microspheres,microcapsules&liposomes(微球、微囊和脂质体)).(Arshady和Guyot编著).辞塔斯图书公司(Citus Books)，2002。Jeffs等(2005)PharmaceuticalResearch 22(3):362-372中描述了一种有用的方法，该方法涉及使(i)脂质的乙醇溶液(ii)核酸的水性溶液和(iii)缓冲液混合，然后混合、平衡、稀释并纯化。本发明使用的脂质体优选可通过该混合方法获得。
在一个特定实施方式中，RNA优选包封在脂质体中，从而该脂质体形成围绕含RNA水性核心的外层。已发现该包封可保护RNA免于RNA酶消化。该脂质体可包括一些外部的RNA(如该脂质体的表面)，但至少包埋一半的RNA(理想情况下为全部)。
有用的组合物可包含脂质体和RNA(其N:P比例为1:1至20:1，例如N:P比例为2:1、4:1、8:1或10:1)，其中“N:P比例”是阳离子脂质中的氮原子与RNA中的磷酸的摩尔比(参见WO2013/006825)。
聚合微粒
多种聚合物可形成微粒以包封或吸附RNA，例如参见WO2012/006359。采用基本非毒性的聚合物意味着受体可安全地接受颗粒，而采用可生物降解的聚合物意味着颗粒可在递送后被代谢以避免长期留存。可用的聚合物还可进行灭菌，以辅助制备药物级别制剂。
合适的非毒性和可生物降解的聚合物包括但不限于：聚(α-羟酸)、聚羟基丁酸、聚内酯(包括聚己内酯)、聚二噁烷酮、聚戊内酯、聚原酸酯、聚酸酐、聚氰基丙烯酸酯、酪氨酸源的聚碳酸酯、聚乙烯基吡咯烷酮或聚酯酰胺和其组合。
在一些实施方式中，该微颗粒从聚(α-羟酸)如聚(丙交酯)(“PLA”)、丙交酯和乙交酯的共聚物如聚(D,L-丙交酯-共-乙交酯)(“PLG”)、和D,L-丙交酯和己内酯的共聚物形成。可用的PLG聚合物包括丙交酯/乙交酯摩尔比范围为例如20:80至80:20(如25:75、40:60、45:55、50:50、55:45、60:40、75:25)的那些。可用的PLG聚合物包括分子量为例如5,000-200,000Da(如10,000-100,000、20,000-70,000、30,000-40,000、40,000-50,000Da)的那些。
理想情况下，该微粒的直径范围为0.02μm-8μm。对于含直径不同的微粒群的组合物，数量上至少80％的直径应为0.03-7μm。
制备合适的微粒的技术是本领域熟知的，例如参见Arshady和Guyot，Polymersin Drug Delivery(《药物递送中的聚合物》)(Uchegbu和Schatzlein编著，CRC出版社，2006)特别是第7章，以及Microparticulate Systems for the Delivery ofProteins and Vaccines(《递送蛋白和疫苗的微粒系统》)(Cohen和Bernstein编)，CRC出版社，1996。为了促进RNA的吸收，微粒可包括阳离子表面活性剂和/或脂质，如O’Hagan等(2001)J Virology75:9037-9043；和Singh等(2003)Pharmaceutical Research 20:247-251中所公开。制备聚合微粒的替代方法是通过模塑和固化，如WO2009/132206中所公开。
本发明的微粒可具有40-100mV的ζ电势。
微粒对脂质体的一个优势是可以容易地对其冻干以进行稳定储存。
RNA可吸附到微粒上，并通过在微粒中包含阳离子材料(如阳离子脂质)来促进吸附。
水包油阳离子乳液
已知水包油乳液能用作基于蛋白的流感疫苗的佐剂，如FLUADTM产品中的MF59TM佐剂和PREPANDRIXTM产品中的AS03佐剂。按照本发明的RNA递送能利用水包油乳液，只要该乳液包含一种或多种阳离子分子(参见WO2012/006380、WO2013/006834和WO2013/006837)。例如，阳离子脂质可包含于述乳液中，以提供带负电RNA能结合的带正电液滴表面。因此，在特定实施方式中，使用阳离子亚微米水包油乳液来实现本发明的RNA递送。
该乳液包含一种或多种油。合适的油包括来自例如动物(如鱼)或植物来源的那些油。理想情况下，该油是可生物降解(可代谢)和生物相容的。植物油的来源包括坚果、种籽和谷物。最常见的坚果油的示例有花生油、大豆油、椰子油和橄榄油。可以采用例如获自霍霍巴豆的霍霍巴油。种籽油包括红花油、棉花籽油、葵花籽油、芝麻籽油等。在谷物油中，最常见的是玉米油，但也可以使用其它谷类的油，如小麦、燕麦、黑麦、稻、画眉草、黑小麦等。甘油和1,2-丙二醇的6-10碳脂肪酸酯虽然不天然存在于种籽油中，但可从坚果和种籽油开始，通过水解、分离和酯化合适物质来制备。来自哺乳动物乳汁的脂肪和油是可代谢的，因而可以使用。获得动物来源的纯油所必需的分离、纯化、皂化和其它方法的过程是本领域中熟知的。
大多数鱼类含有容易回收的可代谢油。例如，可用于本文的鱼油的几种示例有鳕鱼肝油、鲨鱼肝油和鲸油(诸如鲸蜡)。通过生化途径以5-碳异戊二烯单位合成许多支链油，其总称为萜类。优选的乳液包含角鲨烯，其是一种支链、不饱和萜类的鲨鱼肝油。也可采用角鲨烯的饱和类似物角鲨烷。包括角鲨烯和角鲨烷在内的鱼油易于从市售来源获得，或可以通过本领域已知的方法获得。
其它有用的油为生育酚，尤其是和角鲨烯联用。当乳液的油相包含生育酚时，可采用α、β、γ、δ、ε或ξ生育酚中的任何一种，但优选α-生育酚。可同时采用D-α-生育酚和DL-α-生育酚。优选的α-生育酚是DL-α-生育酚。可使用包括角鲨烯和生育酚(如DL-α-生育酚)的油的组合。
该乳液中的油可包括油的组合，例如角鲨烯和至少一种其它油。
该乳液的水性组分可以是淡水(如w.f.i.)或可包含其他组分(如溶质)。例如，其可包含盐以形成缓冲液，例如柠檬酸盐或磷酸盐，如钠盐。典型的缓冲剂包括：磷酸盐缓冲剂、三羟甲基氨基甲烷缓冲剂、硼酸盐缓冲剂、琥珀酸盐缓冲剂、组氨酸缓冲剂或柠檬酸盐缓冲剂。优选带缓冲的水相，并且所包含的缓冲剂通常将在5-20mM范围内。
该乳液还包含阳离子脂质。在特定的实施方式中，该脂质为表面活性剂从而其有助于乳液的形成和稳定。可用的阳离子脂质通常包含生理条件下带正电的氮原子，如叔胺或季胺。该氮可在两亲性表面活性剂的亲水头部基团中。有用的阳离子脂质包括但不限于：1,2-二油酰氧基-3-(三甲胺)丙烷(DOTAP)、3'-[N-(N',N'-二甲基氨基乙烷)-氨甲酰基]胆固醇(DC胆固醇)、二甲基双十八烷基-铵(DDA如溴化物)、1,2-二肉豆蔻酰-3-三甲铵丙烷(DMTAP)、二棕榈酰(C16:0)三甲铵丙烷(DPTAP)、二硬脂酰三甲铵丙烷(DSTAP)。其它可用的阳离子脂质有：苯扎氯铵(BAK)、苄索氯铵、溴棕三甲铵(其含十四烷基三甲基溴化铵和可能少量的十二烷基三甲基溴化铵和十六烷基三甲基溴化铵)、十六烷基氯化吡啶(CPC)、十六烷基三甲基氯化铵(CTAC)、N,N',N'-聚氧乙烯(10)-N-牛油-l,3-二氨基丙烷、十二烷基三甲基溴化铵、十六烷基三甲基溴化铵、混合的烷基-三甲基-溴化铵、苄基二甲基十二烷基氯化铵、苄基二甲基十六烷基-氯化铵、苄基三甲基甲醇铵、十六烷基二甲基乙基溴化铵、二甲基十八烷基溴化铵(DDAB)、甲基氯化苄乙铵、氯化十烃季铵、甲基混合的三烷基氯化铵、甲基三辛基氯化铵)、N,N-二甲基-N-[2(2-甲基-4-(1,1,3,3四甲基丁基)-苯氧基]-乙氧基)乙基]-苯甲烷-氯化铵(DEBDA)、二烷基二甲基铵盐、[l-(2,3-二油烯基氧基)-丙基]-N,N,N,三甲基氯化铵、1,2-二酰基-3-(三甲基铵)丙烷(酰基基团＝二肉豆蔻酰、二棕榈酰、二硬脂酰、二油酰)、l,2-二酰基-3(二甲基铵)丙烷(酰基基团＝二肉豆蔻酰、二棕榈酰、二硬脂酰、二油酰)、l,2-二油酰-3-(4'-三甲基-铵)丁酰-sn-甘油、1,2-二油酰-3-琥珀酰-sn-甘油胆碱酯、(4'-三甲基铵)丁酸甲酯)、N-烷基吡啶盐(如溴化十六烷基吡啶和氯化十六烷基吡)、N-烷基哌叮盐、二价阳离子bola型电解质(C12Me6；C12Bu6)、二烷基甘油基磷酸胆碱、溶血卵磷脂、L-α二油酰磷脂酰乙醇胺、胆固醇半琥珀酸胆碱酯、脂聚胺，包括但不限于双十八烷基酰氨基甘氨酰精胺(DOGS)、二棕榈酰磷脂酰乙醇-酰氨基精胺(DPPES)、脂聚-L(或D)-赖氨酸(LPLL、LPDL)、聚(L(或D)-赖氨酸偶联N-戊二酰磷脂酰乙醇胺、具有侧接氨基基团的双十二烷基谷氨酸(C12GluPhCnN+)、具有侧接氨基基团的双十四烷基谷氨酸酯(C12GluPhCnN+)、胆固醇阳离子衍生物，包括但不限于胆固醇基-3β-氧琥珀酰氨基乙烯基三甲基铵盐、胆固醇基-3β-氧琥珀酰氨基乙烯基-二甲基铵、胆固醇基-3β-羧基酰氨基乙烯基三甲基铵盐，和胆固醇基-3β-羧基酰氨基乙烯基二甲基铵。其他有用的阳离子脂质描述于US-2008/0085870和US-2008/0057080。
在特定的实施方式中，该阳离子脂质是生物可降解的(可代谢的)和生物相容的。
除所述油和阳离子脂质以外，乳液可包含非离子型表面活性剂和/或两性离子表面活性剂。这类表面活性剂包括但不限于：聚氧乙烯去水山梨糖醇酯表面活性剂(通常称为吐温)，特别是聚山梨酯20和聚山梨酯80；以商品名DOWFAXTM出售的环氧乙烷(EO)、环氧丙烷(PO)和/或环氧丁烷(BO)的共聚物，如直链EP/PO嵌段共聚物；重复的乙氧基(氧-1,2-乙二基)数量不同的辛苯聚醇，特别感兴趣的是辛苯聚醇9(曲通(Triton)X-100，或叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇)；(辛基苯氧基)聚乙氧基乙醇(IGEPAL CA-630/NP-40)；磷脂如磷脂酰胆碱(卵磷脂)；衍生自十二烷醇、十六烷醇、十八烷醇和油醇的聚氧乙烯脂肪醚(称为苄泽表面活性剂)，如三乙二醇单月桂基醚(苄泽30)；聚氧乙烯-9-月桂醚以及去水山梨糖醇酯(通常称为司盘)，如去水山梨糖醇三油酸酯(司盘85)和去水山梨糖醇单月桂酸酯。乳液中包含的优选的表面活性剂有聚山梨酯80(吐温80；聚氧乙烯去水山梨糖醇单油酸酯)、司盘85(去水山梨糖醇三油酸酯)、卵磷脂和曲通X-100。
乳液中可包含这些表面活性剂的混合物，如吐温80/司盘85的混合物或吐温80/曲通-X100的混合物。聚氧乙烯脱水山梨醇酯(如聚氧乙烯脱水山梨醇单油酸酯(吐温80))和辛苯聚醇(如叔辛基苯氧基-聚乙氧基乙醇(曲通X-100))的组合也适用。另一种有用的组合包括月桂醇聚醚-9加聚氧乙烯山梨糖醇酯和/或辛苯聚醇。可用的混合物可包括HLB值为10-20的表面活性剂(如聚山梨酯80，HLB为15.0)和HLB值为1-10的表面活性剂(如去水山梨醇三油酸酯，HLB为1.8)。
最终乳液中油的含量(体积％)优选为2-20％，如5-15％、6-14％、7-13％、8-12％。约4-6％或约9-11％的角鲨烯含量尤其有用。
最终乳液中表面活性剂的含量(重量％)优选为0.001％～8％。例如：聚氧乙烯去水山梨糖醇酯(如聚山梨酯80)0.2～4％，具体为0.4～0.6％、0.45～0.55％、约0.5％或1.5～2％、1.8～2.2％、1.9～2.1％、约2％、或0.85～0.95％、或约1％；去水山梨糖醇酯(如去水山梨糖醇三油酸酯)0.02～2％，具体约0.5％或约1％；辛基-或壬基苯氧基聚氧乙醇(如曲通X-100)0.001～0.1％，具体为0.005～0.02％；聚氧乙烯醚(如月桂醇聚醚9)0.1～8％，优选0.1～10％且特别是0.1～1％或约0.5％。
油和表面活性剂的绝对含量及其比例可在较广范围内变化而仍能形成乳液。本领域技术人员可容易地改变组分的相对比例以获得需要的乳液，但油和表面活性剂的重量比通常在4:1和5:1之间(油过量)。
确保乳液的免疫刺激活性(特别是在大型动物中)的重要参数是油滴尺寸(直径)。最有效的乳液的液滴尺寸在亚微米级别。合适的液滴尺寸是50-750nm。最常用的平均液滴尺寸小于250nm，如小于200nm、小于150nm。可用的平均液滴尺寸是80-180nm。理想情况下，乳液油滴的至少80％(以数量计)(且特别是至少90％)的直径小于250nm。用于测定乳液中平均液滴尺寸和尺寸分布的设备市售可得。这些设备通常使用动态光散射和/或单颗粒光学感应的技术如获自颗粒尺寸系统公司(Particle Sizing Systems)的AccusizerTM和NicompTM系列仪器(美国圣塔芭芭拉)，或马文仪器公司(Malvern Instruments)的ZetasizerTM仪器(英国)，或堀场集团(Horiba)的颗粒尺寸分布分析仪(Particle Size Distribution Analyzerinstruments)(日本京都)。
理想情况下，液滴尺寸分布(以数量计)仅有一个最大值而不是两个最大值，即围绕平均值(模式)分布有单一液滴群。优选乳液的多分散性小于0.4，如0.3、0.2或更小。
含亚微米液滴和窄尺寸分布的合适乳液可通过使用微流化获得。该技术以高压和高速推动输入组分流通过几何形状固定的通道来降低平均油滴尺寸。这些流接触通道壁、腔体壁并相互接触。所导致的剪切力、冲击力和空化力使液滴尺寸变小。可重复微流化步骤直至得到的乳液含所需平均液滴尺寸和分布。
作为微流化的替代，加热法可用于引起相转化，参见US2007/0014805。这些方法还可提供紧密粒径分布的亚微米乳液。
优选的乳液可过滤灭菌，即其液滴可穿过220nm滤器。除了提供灭菌，这个过程还去除所述乳液中的任何大液滴。
在某些实施方式中，该乳液中的阳离子脂质是DOTAP。该阳离子水包油乳液可含约0.5mg/ml至约25mg/ml的DOTAP。例如，该阳离子水包油乳液可包含约0.5mg/ml至约25mg/ml的DOTAP。在一个示例性实施方式中，该阳离子水包油乳液包含约0.8mg/ml至约1.6mg/ml DOTAP，如0.8mg/ml、1.2mg/ml、1.4mg/ml或1.6mg/ml。
在某些实施方式中，该阳离子脂质为DC胆固醇。该阳离子水包油乳液可含约0.1mg/ml至约5mg/ml的DC胆固醇。例如，该阳离子水包油乳液可包含约0.1mg/ml至约5mg/ml的DC胆固醇。在一个示例性实施方式中，该阳离子水包油乳液包含约0.62mg/ml至约4.92mg/ml DC胆固醇，如2.46mg/ml。
在某些实施方式中，该阳离子脂质为DDA。该阳离子水包油乳液可含约0.1mg/ml至约5mg/ml的DDA。例如，该阳离子水包油乳液可包含约0.1mg/ml至约25mg/ml的DDA。在一个示例性实施方式中，该阳离子水包油乳液包含约0.73mg/ml至约1.45mg/ml DDA，如1.45mg/ml。
某些优选的用于给予患者的本发明组合物包含角鲨烯、司盘85、聚山梨酯80和DOTAP。例如：角鲨烯可以以5-15mg/ml存在；司盘85可以以0.5-2mg/ml存在；聚山梨酯80可以以0.5-2mg/ml存在；且DOTAP可以以0.1-10mg/ml存在。该乳液可包含等量(以体积计)的司盘85和聚山梨酯80。该乳液可包含比表面活性剂多的角鲨烯。该乳液可包含比DOTAP多的角鲨烯。
免疫原性组合物
除RNA和多肽(以及任意递送系统)以外，免疫原性组合物通常还包含药学上可接受的运载体。这类运载体的充分讨论参见Gennaro(2000)Remington:TheScience and Practice of Pharmacy(《雷明登：药物科学与实践》)，第20版。
本发明的药物组合物可包含淡水(例如w.f.i.)或缓冲液(例如，磷酸盐缓冲液、Tris缓冲液、硼酸盐缓冲液、琥珀酸盐缓冲液、组氨酸缓冲液或柠檬酸盐缓冲液)中的活性组分(RNA和多肽)。所含的缓冲盐浓度通常是5-20mM的范围。
本发明药物组合物的pH值通常可以是5.0～9.5，例如6.0～8.0。
本发明组合物可含有钠盐(如氯化钠)以产生张力。NaCl浓度通常为10±2mg/ml，例如约9mg/ml。
本发明的组合物可包含金属离子螯合剂。其可通过去除会加快磷酸二酯键水解的离子来延长RNA的稳定。因此，组合物可包含EDTA、EGTA、BAPTA、三胺五乙酸(pentetic acid)等中的一种或多种。此类螯合剂通常以10～500μM(例如0.1mM)存在。柠檬酸盐(如柠檬酸钠)也可以起螯合剂作用，同时也有利地提供缓冲活性。
本发明的药物组合物的渗透压可以是200mOsm/kg～400mOsm/kg，例如240～360mOsm/kg或290～310mOsm/kg。
本发明的药物组合物可包含一种或多种防腐剂，例如硫柳汞或2-苯氧乙醇。优选不含汞的组合物，而且可制备不含防腐剂的疫苗。
在特定的实施方式中，本发明的药物组合物是无菌的。
在其他特定的实施方式中，本发明的药物组合物热原，如每剂量含有<1EU(内毒素单位，标准量度)，且在一些实施方式中每剂量<0.1EU。
在特定的实施方式中，本发明的药物组合物是不含谷蛋白的。
本发明的药物组合物可以单位剂量形式制备。在一些实施方式中，单位剂量的体积可以是0.1-1.0ml，例如约0.5ml。
本发明的药物组合物可包含一种或多种小分子免疫增强剂。例如，该组合物可包含TLR2激动剂(例如Pam3CSK4)、TLR4激动剂(例如氨烷基氨基葡糖苷磷酸，如E6020)、TLR7激动剂(例如咪喹莫特)、TLR8激动剂(例如雷西莫特)和/或TLR9激动剂(例如IC31)。理想情况下，任何此类激动剂的分子量<2000Da。
可将该组合物制备成溶液或悬浮液形式的注射剂。可制备该组合物供肺部给药，例如，通过吸入器，采用细雾进行所述给药。可制备该组合物供鼻部、耳部或眼部给药，例如，作为喷雾或滴剂进行所述给药。通常是供肌肉内给药的注射剂。
组合物包含免疫学有效量的RNA和多肽，以及需要的任何其它成分。“免疫学有效量”是指以单一剂量或一系列剂量的部分给予个体的对治疗或预防有效的量。该量根据所治疗个体的健康和身体状况、年龄、所治疗个体的分类组(例如，非人的灵长动物、灵长动物等)、个体免疫系统合成抗体的能力、所需的保护程度、疫苗配方、治疗医生对医学情况的评估和其它相关因素而变化。预期该量将落入可通过常规试验确定的较宽范围内。本发明的组合物的多肽和RNA含量通常以每剂量中RNA的量表示。优选的剂量具有小于等于100μg RNA(例如10-100μg，如约10μg、25μg、50μg、75μg或100μg)。可在低得多的水平(例如小于等于1μg/剂量、小于等于100ng/剂量、小于等于10ng/剂量、小于等于1ng/剂量)上观察到表达，但优选0.1μg的最低剂量(参见WO2012/006369)。
本发明还提供含有本发明药物组合物的递送装置(例如注射器、喷洒器(nebuliser)、喷雾器(sprayer)、吸入器、皮肤贴片等)。该装置可用于向对象给予所述组合物。
治疗方法和医学应用
本发明的药物组合物用于在体内使用以引发针对流感病毒的免疫应答。
本发明提供一种在脊椎动物中产生免疫应答的方法，所述方法包括给予有效量的本发明的药物组合物的步骤。该免疫应答优选为保护性免疫应答，并优选涉及抗体和/或细胞介导的免疫。该方法可以产生加强的应答。
本发明还提供本发明的药物组合物在用于在脊椎动物中产生针对流感病毒的免疫应答的方法中的应用。
本发明还提供上述RNA分子和多肽在生产在脊椎动物中产生针对流感病毒的免疫应答的药物中的应用。
借助这些应用和方法在脊椎动物中产生免疫应答后，则能保护该脊椎动物免遭流感病毒感染和/或疾病。该组合物是免疫原性的，且在特定实施方式中更是疫苗组合物。本发明疫苗可以是预防性(即预防感染)或治疗性(即治疗感染)疫苗，但一般是预防性疫苗。
在特定实施方式中，该脊椎动物是哺乳动物，例如人或大型兽类哺乳动物(例如马、牛、鹿、羊、猪)。当疫苗用于预防性用途时，在特定实施方式中人是儿童(如幼童或婴儿)或青少年；当疫苗用于治疗用途时，在特定实施方式中人是青少年或成人。意图用于儿童的疫苗也可给予成年人，例如，以评估安全性、剂量、免疫原性等。
根据本发明制备的疫苗可用于治疗儿童和成人。因此，人患者可以低于1岁、低于5岁、1～5岁、5～15岁、15～55岁或至少55岁。在特定实施方式中，接受疫苗的患者优选老年人(如大于等于50岁，大于等于60岁并特别是大于等于65岁)，儿童(如小于等于5岁)，住院病人、保健护理人员、武装人员和军人、孕妇、慢性病人或免疫缺陷病人。然而该疫苗不仅适用于这些人群，还可用于更广泛的群体。
本发明的组合物通常直接给予患者。可以通过胃肠道外注射(例如，皮下、腹膜内、静脉内、肌肉内、皮内或递送至组织间隙)实现直接递送。替代性的递送途径包括直肠、口服(例如片剂、喷雾)、口颊、舌下、阴道、局部、透皮或经皮、鼻内、眼部、肺部或其它粘膜给予。皮内和肌内给药是两种优选的途径。注射可以通过针头(例如皮下针头)进行，但可另外采用无针注射。肌内剂量通常是0.5ml。
本发明可用于引发全身和/或粘膜免疫，特别是引发增强的全身和/或粘膜免疫。
检测治疗性处理功效的一种方式包括在给予组合物后监测病原体感染。检测预防性处理功效的一种方式涉及监测针对抗原的全身免疫应答(如监测IgG1和IgG2a生成水平)和/或粘膜免疫应答(如监测IgA生成水平)。通常，在免疫后测定抗原特异性血清抗体应答。评估组合物的免疫原性的另一种方法是针对目标多肽筛选患者血清或粘膜分泌物。蛋白和患者样品间的阳性反应表明患者已经产生对受试多肽的免疫应答。组合物的功效还可通过攻击感兴趣病原体感染的合适动物模型来体内确定。
可通过单剂量方案或多剂量方案来进行给药。多剂量可用于初次免疫方案和/或加强免疫方案。在多剂量方案中，可通过相同或不同的途径(如肠胃外初次和粘膜加强，粘膜初次和肠胃外加强等)给予多个剂量。一般以至少1周(例如约2周、约3周、约4周、约6周、约8周、约10周、约12周、约16周等)的间隔给予多个剂量。在一个实施方式中，可在出生后约6周、10周和14周(例如在6周龄、10周龄和14周龄时，如世界卫生组织的免疫扩大项目(“EPI”)中常用的频率)给予多个剂量。在一个替代性实施方式中，间隔约两个月给予两个初次免疫剂量，例如间隔约7、8或9周，在给予第二个初次免疫剂量约6个月～1年后(例如给予第二个初次免疫剂量约6、8、10或12个月后)给予一个或多个加强的免疫剂量。在另一个实施方式中，间隔约两个月给予三个初次免疫剂量，例如间隔约7、8或9周，在给予第三个初次免疫剂量约6个月～1年后(例如给予第三个初次免疫剂量约6、8、10或12个月后)给予一个或多个加强免疫剂量。
药盒
本发明还提供了一种药盒，其包含(a)包含多肽的第一药盒组分，该多肽包含来自流感病毒抗原的表位，以及(b)包含自复制RNA的第二药盒组分，该自复制RNA编码包含来自流感病毒抗原的表位的多肽。
在一个方面中，可混合这两种药盒组分以生成本发明的免疫原性组合物。在另一个方面，该药盒适用于给予免疫方案，其中第一组分在第二组分之前给予，以产生针对流感病毒的免疫应答。
该第一和第二药盒组分可单独储存。其容器可以彼此独立(例如两个小瓶)或彼此相连(例如双腔体注射器中的两个腔体)。
各种或全部两种药盒组分都可以是水性形式。各种或全部两种药盒组分都可以是固体或干燥形式(例如冻干的)。
在共同给予RNA和多肽时，仍需要对其进行单独包装和储存。可在给药前混合这两种组分，例如给药前约72小时内、约48小时内、约24小时，约12小时内、约10小时内、约9小时内、约8小时内、约7小时内、约6小时内、约5小时内、约4小时内、约3小时内、约2小时内、约1小时内、约45分钟内、约30分钟内、约15分钟内、约10分钟内或约5分钟内混合。例如，可在患者床边混合多肽和RNA。
在连续给予各组分时，其可在各自的约4小时内、约3小时内、约2小时内、约1小时内、约45分钟内、约30分钟内、约15分钟内、约10分钟内或约5分钟内给予。初免组合物、加强组合物或上述两者可任选地包含一种或多种递送系统、免疫调节剂(如佐剂)等，如本文所述。
用于药盒组分的合适容器包括例如瓶、小瓶、注射器和试管。容器可由各种材料形成，包括玻璃或塑料。容器可具有无菌进入端口(例如，该容器可以是具有皮下注射针可刺穿塞子的静脉输液袋或小瓶)。
该药盒还可包含第三容器，其包含药学上可接受缓冲剂如磷酸盐缓冲盐水、林格溶液或右旋糖溶液。其还可含有用于最终使用者的其它材料，包括其它药学上可接受的配制溶液，如缓冲剂、稀释剂、滤器、针和注射器或其他递送设备。该药盒还可包含第四容器，其含有佐剂(如水包油乳液)。
该药盒还可包含包装插页，其包含对诱导免疫或者用于治疗感染的方法的书面指导。该包装插页可以是未经批准的包装插页草案，或可以是经食品药物管理局(FDA)或其他管理机构批准的包装插页。
各药盒组分可在不同地点生产(例如由不同商业实体，甚至在不同的国家)并随后合并以形成药盒。因此，本发明包括用于与本文所定义的多肽组装成药盒的本文所定义的RNA以及用于与本文所定义的RNA组装成药盒的本文所定义的多肽。
本发明的一个方面涉及“初免和加强”免疫方案，其中由初免组合物诱导的免疫应答由加强组合物来加强。例如，使用抗原进行(至少一次)初免后(例如给予RNA或多肽后)，使用主要包含不同形式的抗原(例如用RNA代替多肽或反之)的加强组合物。加强组合物的给药通常在初免组合物的给药后数周或数月，例如在给予初免组合物的约1周、约2周、约3周、约4周、约8周、约12周、约16周、约20周、约24周、约28周、约32周、约36周、约40周、约44周、约48周、约52周、约1月、约2月、约3月、约4月、约5月、约6月、约7月、约8月、约9月、约10月、约11月、约12月、约18月、约2年、约3年、约4年、约5年、约6年、约7年、约8年、约9年或约10年后。
概述
术语“包括”涵盖“包含”以及“由……组成”，例如，“包括”X的组合物可以仅由X组成或可以包括其它物质，例如X+Y。
与数值x相关的术语“约”是可任选的，并且表示，例如x±10％。
词语“基本上”不排除“完全”，如“基本上不含”Y的组合物可能完全不含Y。需要时，词语“基本上”可从本发明的定义中略去。
本发明组合物的活性成分可在不同地点生产并随后合并和配制。因此，可在不同时间由不同人员在不同地点(例如在不同国家)进行一个方法的不同步骤。因此，在一些实施方式中，可单独制备包含来自流感病毒抗原的表位的多肽和自复制RNA，甚至由不同实体制备，但随后合并或一起使用。本发明包括随后与本文所定义的多肽联用的本文所定义的RNA以及随后与本文所定义的RNA联用的本文所定义的多肽。在制备这两种组分后任意时间(包括由不同商业实体和/或在不同国家中)，可以对其进行合并、共同配制或联用。因此，无需在相同的地点制备RNA和多肽。
“表位”是抗原的一部分，其可被免疫系统识别(例如被抗体或被T细胞受体识别)。多肽表位可以是线性表位或构象表位。T细胞和B细胞以不同方式识别抗原。T细胞识别包埋在细胞表面上II型或I型MHC分子中的蛋白的肽片段，而B细胞识别未加工抗原的表面特征，其通过免疫球蛋白样细胞表面受体识别。T细胞与B细胞抗原识别机制的差异反映为其表位的不同性质。因此，从抗原的三维结构来看，B细胞识别抗原或病原体的表面特征，而T细胞表位(其包含长度为约8-12个氨基酸的肽)可以是“内部的”和“表面的”。因此，B细胞表位优选暴露在抗原或病原体的表面上且可以是线性或构象的，而T细胞表位通常是线性的但无需可以接触或位于抗原的表面上。B细胞表位一般包含至少约5个氨基酸，但可以小到3-4个氨基酸。T细胞表位(如CTL表位)通常包含至少约7-9个氨基酸，而辅助T细胞表位通常包含至少约12-20个氨基酸。
在使用具有多个表位的多肽抗原免疫个体时，在许多情况下，应答的T淋巴细胞中大多数特异性针对一种或几种来自该抗原的线性表位和/或应答的B淋巴细胞中大多数特异性针对一种或几种来自该抗原的线性或构象表位。这类表位通常称为“优势免疫表位”。在具有若干优势免疫表位的抗原中，单个表位可以是最具优势的，且通常称作“主要”优势免疫表位。其余优势免疫表位通常称作“次要”优势免疫表位。
具体实施方式
实施例1：H5N1研究
使用来自流感A/Turkey/Turkey/2005(H5N1)的血凝素免疫Balb/C小鼠。在第0和56天时给予组合物，并在第0、21、56和72天时对血清进行取样。以蛋白质或自复制α病毒RNA复制子内编码(或两者组合)的形式递送血凝素。RNA与阳离子纳米乳液(CNE)一起递送，且蛋白质在缓冲液中递送或与水包油乳液佐剂(MF59)一起递送。对照接受单独的缓冲液(PBS)或卵清蛋白。小鼠分为10组，每组12只小鼠：
表2显示第72天时的血凝反应抑制(HI)效价(GMT)。RNA和蛋白质的混合物(组9)显示与MF59佐剂化的蛋白质(组8)一样高的效价。在微中和测试中观察到类似的效果，其中针对三种不同H5N1毒株的效价与使用MF59佐剂化的蛋白质获得的效价仍是可比的。
表2：H5N1特异性HI效价(GMT)
组 GMT
1 0
2 0
3 3932
4 22949
5 81950
6 100147
7 16289
8 257126
9 323843
10 1007
使用特异性针对HA533-541肽的MHCI五聚体在第105天时测量CD8+T细胞。该肽在H1和H5毒株之间保守。表3显示五聚体阳性细胞的频率(CD8+CD44h T细胞的百分比)，结果显示使用混合的RNA/蛋白质组合物导致抗原特异性T细胞在免疫后长时间维持于循环中。
表3：HA533-541五聚体+CD8T细胞(％)
组 平均值 标准差
1 0.04 0.02
3 0.20 0.15
4 0.65 0.39
5 0.45 0.12
6 0.33 0.10
7 0.04 0.01
8 0.05 0.03
9 0.63 0.25
10 0.03 0.03
表4显示第二剂量后12周的H5特异性CD8+T细胞应答(抗原特异性CD8+T细胞，IFNγ的百分比)。组9显示最高的抗原特异性CD8+T细胞比例。
表4：H5特异性IFNγ+CD8T细胞(％)
组 平均值 标准差
1 0.02 0.02
3 0.25 0.12
4 0.67 0.30
5 0.70 0.28
6 0.62 0.34
7 0.02 0.05
8 0.01 0.04
9 0.95 0.73
10 -0.02 0.04
实施例2：H1N1/H5N1研究
使用来自具有不同HA亚型的两种甲型流感病毒毒株：A/California/7/09(H1N1)；以及A/Turkey/Turkey/2005(H5N1)的血凝素对小鼠进行免疫。在第0和56天时给予组合物，并在第0、21、42、55和70天时对血清进行取样。以蛋白质或自复制α病毒RNA复制子内编码(或两者组合)的形式递送血凝素。RNA与阳离子纳米乳液(CNE)一起递送，且蛋白质在缓冲液中递送或与水包油乳液佐剂(MF59)一起递送。对照接受单独的缓冲液(PBS)。小鼠分为10组，每组6只小鼠，如下：
表5显示第70天时所示实验组中的HI效价(GMT)。抗H5结果确认H5复制子增强了针对以蛋白形式递送的H5血凝素的免疫应答(比较组3和5)。此外，组6的抗H1结果显示H5复制子也能够增强抗H1应答(比较组6和8)至含有MF59佐剂的H1蛋白所能达到的增强水平(组9)。
表5：HI效价(GMT)
表6显示H1或H5血凝素的抗原特异性IFNγ+CD8+T细胞应答的百分比。针对H5的抗原特异性T细胞应答确认H5复制子增强了针对以蛋白形式递送的H5血凝素的免疫应答，其中在组5中观察到最佳结果。所有的复制子组(即组2、5、6和7)都显示其H5特异性应答高于蛋白抗原所达到水平(即组3和4)、甚至高于含有MF59佐剂的蛋白所达到水平(组4)。对于H1特异性应答观察到相同的效果。
因此，用于以两种不同方式递送血凝素的蛋白和复制子的组合(即组5和6)提供了强HI效价以及高比例的流感特异性功能性T细胞。
表6：IFNγ+CD8T细胞(％)
应理解，仅以举例的方式描述了本发明，可对之进行修改而仍在本发明的范围和构思内。
表1：有用的磷脂

Claims (25)

1.一种免疫原性组合物，其包含：(i)编码第一多肽抗原的自复制RNA分子，所述第一多肽抗原包含来自流感病毒抗原的第一表位；以及(ii)第二多肽抗原，所述第二多肽抗原包含来自流感病毒抗原的第二表位；其中
(a)所述第一和第二表位都来自流感血凝素；
(b)所述第一和第二表位都来自甲型流感病毒；和/或
(c)所述第一表位和所述第二表位都来自乙型流感病毒。
2.如权利要求1所述的免疫原性组合物，所述第一和第二表位都来自甲型流感病毒血凝素。
3.如权利要求2所述的免疫原性组合物，所述第一和第二表位都来自甲型流感病毒血凝素的相同亚型，例如都来自H5血凝素。
4.如权利要求2所述的免疫原性组合物，所述第一和第二表位来自甲型流感病毒血凝素的不同亚型。
5.如权利要求3所述的免疫原性组合物，所述第一和第二表位都来自相同的甲型流感病毒血凝素。
6.如权利要求1所述的免疫原性组合物，所述第一和第二表位都来自乙型流感病毒血凝素。
7.如权利要求6所述的免疫原性组合物，所述第一和第二表位都来自乙型流感病毒血凝素的相同谱系。
8.如权利要求7所述的免疫原性组合物，所述第一和第二表位都来自相同的乙型流感病毒血凝素。
9.如前述权利要求中任一项所述的免疫原性组合物，所述第一和第二表位是相同的。
10.如前述权利要求中任一项所述的免疫原性组合物，所述第一和第二多肽抗原共有至少两个B细胞表位。
11.如前述权利要求中任一项所述的免疫原性组合物，其中，(a)所述第一和第二多肽抗原共有共同的氨基酸序列，所述氨基酸序列包含多个表位且是80个氨基酸或更长，例如120个氨基酸或更长，和/或(b)所述第一和第二多肽抗原彼此间具有至少80％氨基酸序列相同性。
12.如前述权利要求中任一项所述的免疫原性组合物，所述自复制RNA是α病毒来源的RNA复制子。
13.如前述权利要求中任一项所述的免疫原性组合物，所述自复制RNA分子包含一个或多个修饰的核苷酸。
14.如前述权利要求中任一项所述的免疫原性组合物，包含(i)脂质体，(ii)非毒性且可生物降解的聚合物微粒或(iii)阳离子亚微米水包油乳液。
15.如前述权利要求中任一项所述的免疫原性组合物，所述第二多肽抗原是灭活流感病毒疫苗，例如全病毒颗粒、裂解病毒颗粒或纯化的表面抗原疫苗。
16.如权利要求15所述的免疫原性组合物，所述灭活流感病毒疫苗含有佐剂，例如含有水包油乳液佐剂。
17.如权利要求1-14中任一项所述的免疫原性组合物，所述第二多肽抗原是重组血凝素。
18.一种治疗或预防流感疾病和/或感染的方法，所述方法包括给予有此需要的对象治疗有效量的权利要求1-17中任一项所述的组合物。
19.一种在对象中诱导免疫应答的方法，所述方法包括将治疗有效量的权利要求1-17中任一项所述的组合物给予有此需要的对象。
20.一种编码包含来自流感病毒抗原的第一表位的多肽抗原的自复制RNA分子，其用于与包含来自流感病毒抗原的第二表位的多肽抗原联用，其中(a)所述第一和第二表位都来自流感血凝素；(b)所述第一和第二表位都来自甲型流感病毒；和/或(c)所述第一表位和所述第二表位都来自乙型流感病毒。
21.一种包含来自流感病毒抗原的第二表位的多肽抗原，其用于与编码包含来自流感病毒抗原的第一表位的多肽抗原的自复制RNA分子联用，其中(a)所述第一和第二表位都来自流感血凝素；(b)所述第一和第二表位都来自甲型流感病毒；和/或(c)所述第一表位和所述第二表位都来自乙型流感病毒。
22.权利要求20中所述用途的自复制RNA分子或权利要求21中所述用途的多肽抗原，所述多肽抗原是灭活流感病毒疫苗。
23.一种药盒，其包含(a)包含多肽的第一药盒组分，所述多肽包含来自流感病毒抗原的表位，以及(b)包含自复制RNA的第二药盒组分，所述自复制RNA编码包含来自流感病毒抗原的表位的多肽。
24.如权利要求23所述的药盒，所述第一和第二药盒组分可经混合以提供权利要求1-17中任一项所限定的组合物。
25.如权利要求23或24所述的药盒，所述第一药盒组分是灭活流感病毒疫苗(例如全病毒颗粒、裂解病毒颗粒或纯化的表面抗原疫苗)，其任选地含有佐剂。
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105664149A (zh) * 2016-02-24 2016-06-15 华东理工大学 一种多抗原流感通用疫苗及其制备方法
CN113164584A (zh) * 2018-08-17 2021-07-23 葛兰素史密丝克莱恩生物有限公司 免疫原性组合物及其用途

Families Citing this family (38)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102939103A (zh) 2010-03-30 2013-02-20 西奈山医学院 流感病毒疫苗及其应用
PL3243526T3 (pl) 2010-07-06 2020-05-18 Glaxosmithkline Biologicals S.A. Dostarczanie rna w celu wyzwolenia wielu szlaków immunologicznych
MX2013000164A (es) 2010-07-06 2013-03-05 Novartis Ag Liposomas con lipidos que tienen valor de pka ventajoso para suministro de arn.
US10487332B2 (en) 2010-07-06 2019-11-26 Glaxosmithkline Biologicals Sa Immunisation of large mammals with low doses of RNA
WO2012019168A2 (en) 2010-08-06 2012-02-09 Moderna Therapeutics, Inc. Engineered nucleic acids and methods of use thereof
DK3981427T3 (da) 2010-08-31 2022-07-11 Glaxosmithkline Biologicals Sa Pegylerede liposomer til afgivelse af immunogen-kodende RNA
DE19177059T1 (de) 2010-10-01 2021-10-07 Modernatx, Inc. N1-methyl-pseudouracile enthältendes ribonucleinsäuren sowie ihre verwendungen
EP4098325A1 (en) 2010-10-11 2022-12-07 GlaxoSmithKline Biologicals S.A. Antigen delivery platforms
DE12722942T1 (de) 2011-03-31 2021-09-30 Modernatx, Inc. Freisetzung und formulierung von manipulierten nukleinsäuren
ES2656050T3 (es) * 2011-07-06 2018-02-22 Glaxosmithkline Biologicals Sa Composiciones de combinación inmunogénica y usos de las mismas
US9464124B2 (en) 2011-09-12 2016-10-11 Moderna Therapeutics, Inc. Engineered nucleic acids and methods of use thereof
CN104185476A (zh) 2011-09-20 2014-12-03 西奈山医学院 流感病毒疫苗及其应用
MX2014007233A (es) 2011-12-16 2015-02-04 Moderna Therapeutics Inc Composiciones de nucleosidos, nucleotidos y acidos nucleicos modificados.
US10501512B2 (en) 2012-04-02 2019-12-10 Modernatx, Inc. Modified polynucleotides
US9283287B2 (en) 2012-04-02 2016-03-15 Moderna Therapeutics, Inc. Modified polynucleotides for the production of nuclear proteins
EP2834259A4 (en) 2012-04-02 2016-08-24 Moderna Therapeutics Inc MODIFIED POLYNUCLEOTIDES
US9572897B2 (en) 2012-04-02 2017-02-21 Modernatx, Inc. Modified polynucleotides for the production of cytoplasmic and cytoskeletal proteins
WO2014028429A2 (en) 2012-08-14 2014-02-20 Moderna Therapeutics, Inc. Enzymes and polymerases for the synthesis of rna
CA2892529C (en) 2012-11-26 2023-04-25 Moderna Therapeutics, Inc. Terminally modified rna
CN108641002A (zh) 2012-12-18 2018-10-12 西奈山伊坎医学院 流感病毒疫苗及其用途
US20160024181A1 (en) 2013-03-13 2016-01-28 Moderna Therapeutics, Inc. Long-lived polynucleotide molecules
US9908930B2 (en) 2013-03-14 2018-03-06 Icahn School Of Medicine At Mount Sinai Antibodies against influenza virus hemagglutinin and uses thereof
US10258698B2 (en) 2013-03-14 2019-04-16 Modernatx, Inc. Formulation and delivery of modified nucleoside, nucleotide, and nucleic acid compositions
WO2015048744A2 (en) 2013-09-30 2015-04-02 Moderna Therapeutics, Inc. Polynucleotides encoding immune modulating polypeptides
CA2926218A1 (en) 2013-10-03 2015-04-09 Moderna Therapeutics, Inc. Polynucleotides encoding low density lipoprotein receptor
RU2746406C2 (ru) 2014-04-23 2021-04-13 МОДЕРНАТиЭкс, ИНК. Вакцины на основе нуклеиновых кислот
WO2016118937A1 (en) 2015-01-23 2016-07-28 Icahn School Of Medicine At Mount Sinai Influenza virus vaccination regimens
SG10201910433VA (en) 2015-05-15 2020-01-30 Curevac Ag Prime-boost regimens involving administration of at least one mrna construct
AU2016336344A1 (en) 2015-10-05 2018-04-19 Modernatx, Inc. Methods for therapeutic administration of messenger ribonucleic acid drugs
WO2017070620A2 (en) * 2015-10-22 2017-04-27 Modernatx, Inc. Broad spectrum influenza virus vaccine
JP2019511255A (ja) 2016-01-11 2019-04-25 バーンダリ，インク． マイクロニードル組成物およびそれを使用する方法
CN109641041A (zh) 2016-06-15 2019-04-16 西奈山伊坎医学院 流感病毒血细胞凝集素蛋白及其用途
WO2018170245A1 (en) 2017-03-15 2018-09-20 Modernatx, Inc. Broad spectrum influenza virus vaccine
CA3058652A1 (en) 2017-04-07 2018-10-11 Icahn School Of Medicine At Mount Sinai Anti-influenza b virus neuraminidase antibodies and uses thereof
WO2018232357A1 (en) 2017-06-15 2018-12-20 Modernatx, Inc. Rna formulations
JP2020524143A (ja) * 2017-06-15 2020-08-13 インフェクシャス ディズィーズ リサーチ インスティチュート ナノ構造脂質担体、安定エマルジョン、およびその使用
US11639329B2 (en) 2017-08-16 2023-05-02 Acuitas Therapeutics, Inc. Lipids for use in lipid nanoparticle formulations
EP3675817A1 (en) 2017-08-31 2020-07-08 Modernatx, Inc. Methods of making lipid nanoparticles

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2008033966A2 (en) * 2006-09-12 2008-03-20 Alphavax, Inc. Alphavirus replicon particles matched to protein antigens as immunological adjuvants
CA2766907A1 (en) * 2009-07-06 2011-01-13 Novartis Ag Self replicating rna molecules and uses thereof
CN102149405A (zh) * 2008-07-11 2011-08-10 米迪缪尼股份有限公司 流感血凝素和神经氨酸酶变体
WO2012006369A2 (en) * 2010-07-06 2012-01-12 Novartis Ag Immunisation of large mammals with low doses of rna

Family Cites Families (55)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6015686A (en) * 1993-09-15 2000-01-18 Chiron Viagene, Inc. Eukaryotic layered vector initiation systems
DE69536153D1 (de) 1994-11-17 2011-05-05 Ich Productions Ltd Internalisierung von dna, unter verwendung von konjugaten des poly-l-lysins und eines peptidligands des integrin-rezeptors
US6071890A (en) 1994-12-09 2000-06-06 Genzyme Corporation Organ-specific targeting of cationic amphiphile/DNA complexes for gene therapy
US6451592B1 (en) * 1996-04-05 2002-09-17 Chiron Corporation Recombinant alphavirus-based vectors with reduced inhibition of cellular macromolecular synthesis
US6090619A (en) 1997-09-08 2000-07-18 University Of Florida Materials and methods for intracellular delivery of biologically active molecules
DE60036952T2 (de) 1999-09-24 2008-08-07 Glaxosmithkline Biologicals S.A. Influenzavirus-impfstoffzusammensetzung zur nasalen anwendung
GB0024089D0 (en) 2000-10-02 2000-11-15 Smithkline Beecham Biolog Novel compounds
CA2438960A1 (en) 2001-02-23 2002-09-06 Glaxosmithkline Biologicals S.A. Influenza vaccine formulations for intradermal delivery
EP2269639B1 (en) 2001-02-23 2018-11-28 GlaxoSmithKline Biologicals s.a. Influenza vaccine formulations for intradermal delivery
MY134424A (en) 2001-05-30 2007-12-31 Saechsisches Serumwerk Stable influenza virus preparations with low or no amount of thiomersal
WO2004055166A2 (en) * 2002-12-13 2004-07-01 Alphavax, Inc. Multi-antigenic alphavirus replicon particles and methods
ES2429338T3 (es) 2002-12-23 2013-11-14 Vical Incorporated Vacuna basada en polinucleótidos optimizados por codones contra infección por citomegalovirus humano
PL1608762T3 (pl) * 2003-03-20 2014-06-30 Alphavax Inc Udoskonalone replikony alfawirusowe i konstrukty plazmidów pomocniczych
EP2581093B1 (en) * 2003-06-16 2015-03-18 MedImmune, LLC Influenza hemagglutinin and neuraminidase variants
EP1528101A1 (en) 2003-11-03 2005-05-04 ProBioGen AG Immortalized avian cell lines for virus production
WO2005113756A1 (en) 2004-05-14 2005-12-01 Glaxosmithkline Biologicals S.A. Method
US20060024670A1 (en) 2004-05-18 2006-02-02 Luke Catherine J Influenza virus vaccine composition and methods of use
MXPA06013124A (es) 2004-05-18 2007-05-23 Alphavax Inc Vectores de alfavirus derivados de tc-83, particulas y metodos.
JP4796062B2 (ja) 2004-06-07 2011-10-19 プロチバ バイオセラピューティクス インコーポレイティッド 脂質封入干渉ｒｎａ
US8703095B2 (en) 2005-07-07 2014-04-22 Sanofi Pasteur S.A. Immuno-adjuvant emulsion
EP2037959B1 (en) * 2006-06-07 2016-01-27 The Trustees Of Princeton University Cytomegalovirus surface protein complex for use in vaccines and as a drug target
AU2007300663A1 (en) * 2006-07-21 2008-04-03 Pharmexa Inc. Inducing cellular immune responses to influenza virus using peptide and nucleic acid compositions
PL2121011T3 (pl) 2006-12-06 2014-10-31 Novartis Ag Szczepionki zawierające antygeny czterech szczepów wirusa grypy
US20100015218A1 (en) * 2007-02-16 2010-01-21 Vasant Jadhav Compositions and methods for potentiated activity of biologically active molecules
DK2173376T3 (en) * 2007-08-02 2015-06-29 Biondvax Pharmaceuticals Ltd Multimeric multi-epitope influenza vaccines
WO2009132206A1 (en) 2008-04-25 2009-10-29 Liquidia Technologies, Inc. Compositions and methods for intracellular delivery and release of cargo
JP5667566B2 (ja) * 2008-08-06 2015-02-12 ノバルティス アーゲー 免疫原性組成物における使用のための微粒子
PL3178490T3 (pl) * 2009-07-15 2022-08-01 Glaxosmithkline Biologicals S.A. Kompozycje białka f rsv i sposoby ich wytwarzania
JO3257B1 (ar) * 2009-09-02 2018-09-16 Novartis Ag مركبات وتركيبات كمعدلات لفاعلية tlr
MX2012002723A (es) * 2009-09-02 2012-04-11 Novartis Ag Composiciones inmunogenicas que incluyen moduladores de la actividad de receptores tipo toll.
US9163068B2 (en) * 2009-11-03 2015-10-20 The United States of America as represented by the Secretary of the Department of Health and Human Services, National Institutes of Health, Office of Technology Transfer Influenza virus recombinant proteins
WO2012082165A1 (en) * 2010-01-24 2012-06-21 Novartis Ag Irradiated biodegradable polymer microparticles
US9192661B2 (en) * 2010-07-06 2015-11-24 Novartis Ag Delivery of self-replicating RNA using biodegradable polymer particles
EP2591097A1 (en) * 2010-07-06 2013-05-15 Novartis AG Norovirus derived immunogenic compositions and methods
CN103052400B (zh) * 2010-07-06 2016-11-16 诺华股份有限公司 自我复制rna分子的病毒样递送颗粒
US9770463B2 (en) * 2010-07-06 2017-09-26 Glaxosmithkline Biologicals Sa Delivery of RNA to different cell types
MX2013000164A (es) 2010-07-06 2013-03-05 Novartis Ag Liposomas con lipidos que tienen valor de pka ventajoso para suministro de arn.
BR112013000391B8 (pt) 2010-07-06 2022-10-04 Novartis Ag Composição de emulsão catiônica de óleo em água e seu uso
PL3243526T3 (pl) * 2010-07-06 2020-05-18 Glaxosmithkline Biologicals S.A. Dostarczanie rna w celu wyzwolenia wielu szlaków immunologicznych
FI4043040T3 (fi) * 2010-08-31 2023-04-04 Glaxosmithkline Biologicals Sa Pieniä liposomeja immunogeeniä koodaavan rna:n toimittamiseksi
ES2727583T3 (es) 2010-08-31 2019-10-17 Glaxosmithkline Biologicals Sa Lípidos adecuados para la administración liposómica de ARN que codifica proteínas
DK3981427T3 (da) 2010-08-31 2022-07-11 Glaxosmithkline Biologicals Sa Pegylerede liposomer til afgivelse af immunogen-kodende RNA
WO2012034025A2 (en) * 2010-09-09 2012-03-15 Virginia Commonwealth University Human cytomegalovirus vaccine
EP4098325A1 (en) * 2010-10-11 2022-12-07 GlaxoSmithKline Biologicals S.A. Antigen delivery platforms
EP4144368A1 (en) * 2011-01-26 2023-03-08 GlaxoSmithKline Biologicals S.A. Rsv immunization regimen
WO2012158613A1 (en) * 2011-05-13 2012-11-22 Novartis Ag Pre-fusion rsv f antigens
BR112014000227A8 (pt) 2011-07-06 2018-03-06 Novartis Ag emulsões óleo-em-água que contêm ácidos nucleicos
SG10201605537XA (en) * 2011-07-06 2016-09-29 Novartis Ag Liposomes having useful n:p ratio for delivery of rna molecules
CA2841047A1 (en) * 2011-07-06 2013-01-10 Novartis Ag Immunogenic compositions and uses thereof
ES2656050T3 (es) * 2011-07-06 2018-02-22 Glaxosmithkline Biologicals Sa Composiciones de combinación inmunogénica y usos de las mismas
RU2649133C2 (ru) * 2011-07-06 2018-03-29 Новартис Аг Катионные эмульсии масло-в-воде
TR201900264T4 (tr) * 2011-08-31 2019-02-21 Glaxosmithkline Biologicals Sa İmmünojen şifreleyici rna'nın verilmesi için pegile edilmiş lipozomlar.
WO2013055905A1 (en) * 2011-10-11 2013-04-18 Novartis Ag Recombinant self-replicating polycistronic rna molecules
WO2013054199A2 (en) * 2011-10-12 2013-04-18 Novartis Ag Cmv antigens and uses thereof
US9504747B2 (en) * 2013-03-08 2016-11-29 Novartis Ag Lipids and lipid compositions for the delivery of active agents

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2008033966A2 (en) * 2006-09-12 2008-03-20 Alphavax, Inc. Alphavirus replicon particles matched to protein antigens as immunological adjuvants
CN102149405A (zh) * 2008-07-11 2011-08-10 米迪缪尼股份有限公司 流感血凝素和神经氨酸酶变体
CA2766907A1 (en) * 2009-07-06 2011-01-13 Novartis Ag Self replicating rna molecules and uses thereof
WO2012006369A2 (en) * 2010-07-06 2012-01-12 Novartis Ag Immunisation of large mammals with low doses of rna
WO2012006369A3 (en) * 2010-07-06 2012-08-23 Novartis Ag Immunisation of large mammals with low doses of rna

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
仇华吉等: "RNA复制子疫苗", 《中国生物工程杂志》 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105664149A (zh) * 2016-02-24 2016-06-15 华东理工大学 一种多抗原流感通用疫苗及其制备方法
CN113164584A (zh) * 2018-08-17 2021-07-23 葛兰素史密丝克莱恩生物有限公司 免疫原性组合物及其用途

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