DE60036952T2 - Influenzavirus-impfstoffzusammensetzung zur nasalen anwendung - Google Patents

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Description

  • Diese Erfindung betrifft neue nicht-lebende Split-Influenzavirus-Impfstoffformulierungen, Verfahren zu ihrer Herstellung und ihre Verwendung in der Prophylaxe oder der Therapie. Insbesondere betrifft die Erfindung Impfstoffe für die Verabreichung über die Schleimhaut, insbesondere für die nasale Verabreichung. Insbesondere betrifft die Erfindung die Verwendung von nicht-lebenden Split-Influenzaimpfstoffen, die in einer Einzeldosis intranasal verabreicht werden können, um eine ausreichende Immunantwort zu erreichen, damit Voraussetzungen des Regulierers erfüllt werden.
  • Influenzavirus ist eins der allgegenwärtigsten Viren, die auf der Erde vorkommen, das sowohl Menschen als auch Vieh befüllt. Die ökonomische Bedeutung von Influenza ist signifikant.
  • Der Influenzavirus ist ein umhüllter RNA-Virus mit einer Partikelgröße von ca. 125 nm im Durchmesser. Es besteht im Grunde genommen aus einem inneren Nukleokapsid oder Kern aus Ribonukleinsäure (RNA), die mit einem Nukleoprotein assoziiert ist, umgeben von einer viralen Hülle mit einer Lipid-Doppelschichtstruktur und äußeren Glycoproteinen. Die innere Schicht der viralen Hülle ist hauptsächlich aus Matrixproteinen und die äußere Schicht hauptsächlich aus Wirt-abgeleiteten Lipidmaterial zusammengesetzt. Die Oberflächen-Glycoproteine Neuraminidase (NA) und Hämagglutinin (HA) erscheinen als 10 bis 12 nm lange Spitzen auf der Oberfläche der Partikel. Es sind diese Oberflächenproteine, insbesondere das Hämagglutinin, das die antigene Spezifität der Influenza-Subtypen bestimmt.
  • Typische Influenzaepidemien verursachen Zunahmen in dem Auftreten von Pneumonie und Erkrankung des unteren Atemtrakts, wie durch zunehmende Raten an Krankenhausaufenthalten und Sterblichkeit belegt. Die Älteren und solche mit zugrundeliegenden chronischen Erkrankungen sind höchstwahrscheinlich die, die solche Komplikationen erfahren, jedoch können Neugeborene ebenfalls eine schwerwiegende Erkrankung erleiden. Diese Gruppen bedürfen daher besonders geschützt zu werden.
  • Zur Zeit verfügbare Influenzaimpfstoffe sind entweder inaktivierte oder lebend-abgeschwächte Influenzaimpfstoffe. Inaktivierte Influenzaimpfstoffe sind aus drei Antigen-Zubereitungstypen zusammengesetzt: inaktivierte ganze Viren, Sub-Virione, wobei aufgereinigte Viruspartikel mit Tensiden oder anderen Reagentien zum Solubilisieren der Lipidhülle zerstört werden (sogenannter "Split"-Impfstoff) oder aufgereinigtes HA und NA (Proteinimpfstoff). Diese inaktivierten Impfstoffe werden intramuskulär (i. m.) verabreicht.
  • Influenzaimpfstoffe jeglicher Art sind normalerweise trivalente Impfstoffe. Sie enthalten im allgemeinen Antigene, die von zwei Influenza A-Virusstämmen und einem Influenza B-Stamm abgeleitet sind. Eine standardmäßige 0,5 ml-injizierbare Dosis enthält in den meisten Fällen 15 μg an Hämagglutinin-Antigenbestandteil von jedem Stamm, wie durch eine einfache radiale Immundiffusion (single radial immunodiffusion, SRD) bestimmt (J. M. Wood et al.: An improved single radial immunodiffusion technique for the assay of influenza haemagglutinin antigen: adaption for potency determination of inactivated whole virus and subunit vaccines. J. Biol. Stand. 5 (1977) 237–247; J. M. Wood et al., International collaborative study of single radial diffusion and immunoelectrophoresis techniques for the assay of haemagglutinin antigen of influenza virus, J. Biol. Stand. 9 (1981) 317–330).
  • Die Influenzavirusstämme, die jede Saison in einen Influenzaimpfstoff zugeführt werden, werden durch die Weltgesundheitsorganisation in Zusammenarbeit mit nationalen Gesundheitsbehörden und Impfstoffherstellern bestimmt.
  • Gegenwärtige Bemühungen zur Kontrolle der Krankheitsziffer und der Sterblichkeit, die mit jährlichen Influenzaepidemien assoziiert ist, basieren auf der Verwendung von intramuskulär verabreichten inaktivierten Influenzaimpfstoffen. Die Wirksamkeit dieser Impfstoffe im Verhindern von Atemwegserkrankungen und Influenza-Komplikationen reichen von 75% in gesunden Erwachsenen bis weniger als 50% in Älteren.
  • Wie viele Pathogene befallen Influenzaviren schleimabsondernde Oberflächen, anfänglich im oberen Atmungstrakt. Die Schleimhautimmunität stellt die erste Verteidigungslinie für den Wirt dar und ist eine Hauptkomponente der Immunantwort in den Nasengängen und in den Luftwegen des unteren Atmungstrakts. Obwohl die zur Zeit verwendeten injizierbaren Influenzaimpfstoffe Serum-HA-spezifische IgGs in der Mehrheit der gesunden Individuen stimuliert, erfolgt ein signifikanter Anstieg des HA- spezifischen nasalen IgA-Antikörper in nur einer Minderheit von geimpften Subjekten. Verbesserte Influenzaimpfstoffe mit besserer Immunogenität und klinischer Wirksamkeit benötigen das Abzielen sowohl lokaler als auch systemischer Antikörperantworten.
  • Experimentelle intranasale Aussetzung von Menschen mit inaktivierten Influenzaimpfstoffen reicht bis in die 1940er zurück (siehe Übersicht in Eyles et al. 2000 BioDrugs 12(1): 35–59). Obwohl es ein Wiederaufleben des Interesses an der Verwendung von inaktivierten Viren für IN-Immunisierung in den 1960iger und 70iger Jahren gab, wurde die meiste Aufmerksamkeit auf dem intranasalen Gebiet auf den lebend-abgeschwächten Ansatz gelenkt.
  • Intranasal verabreichte lebend-abgeschwächte Influenzaimpfstoffe, zum Beispiel Kälte-adaptierte Impfstoffe, bieten eine verbesserte Schleimhautimmunität mit vielversprechenden Ergebnissen, insbesondere bei Kindern. Jedoch hat es dieser Ansatz bisher verfehlt, eine weltweite Akzeptanz zu erlangen.
  • Daher sind die meisten der kommerziell erhältlichen Influenzaimpfstoffe entweder Split- oder Untereinheit-injizierbare Impfstoffe. Diese Impfstoffe werden durch Zerstören des Viruspartikels, im allgemeinen mit einem organischen Lösungsmittel oder einem Detergens, und Auftrennung oder Aufreinigung der viralen Proteine in variierenden Ausmaßen hergestellt. Split-Impfstoffe werden durch Fragmentieren eines ganzen Influenzavirus, entweder infektiös oder inaktiviert, mit solubilisierenden Konzentrationen an organischen Lösungsmitteln oder Detergentien und anschließender Entfernung des Solubilisierungsmittels und einiges oder das meiste des viralen Lipidmaterials hergestellt. Split-Impfstoffe enthalten im allgemeinen kontaminierendes Matrix-Protein und Nukleoprotein und manchmal Lipid sowie Proteine der Membranhülle. Split-Impfstoffe werden normalerweise das meiste oder alle der Strukturproteine des Virus enthalten, obwohl nicht notwendigerweise in gleichen Maße wie dieses im gesamten Virus vorkommt. Untereinheit-Impfstoffe bestehen auf der anderen Seite im wesentlichen aus hochaufgereinigten viralen Oberflächenproteinen, Hämagglutinin und Neuraminidase, die die Oberflächenproteine sind, die für das Auslösen der gewünschten Virus-neutralisierenden Antikörper nach Impfung verantwortlich sind.
  • Vor kurzem sind weitere hochaufgereinigte, besser charakterisierte Split-Influenzaimpfstoffe mit Adjuvantien kombiniert worden, in einem Versuch, die Immunogenität in Erwachsenen und älteren Menschen zu verbessern. Trotz signifikanter Zunahmen in den Immunantworten in Mäusen haben sich eine Anzahl von Ansätzen, die eine neue Generation von Adjuvantien verwenden, sich als im Menschen geeignet erwiesen.
  • Standards werden international angewendet, um die Effizient von Influenzaimpfstoffen zu messen. Die offiziellen Kriterien der Europäischen Union für einen wirksamen Impfstoff gegen Influenza sind in der nachfolgenden Tabelle aufgeführt. Theoretischerweise, um die Voraussetzungen der Europäischen Union zu erfüllen, muß ein Influenzaimpfstoff nur eins der in der Tabelle aufgeführten Kriterien für alle im Impfstoff enthaltenen Influenzastämme erfüllen. Jedoch werden in der Praxis mindestens zwei der drei Kriterien für alle Stämme zu erfüllen sein, insbesondere für einen neuen Impfstoff wie einem neuen intranasalen Impfstoff. Unter gewissen Umständen können zwei Kriterien ausreichend sein. Es kann zum Beispiel annehmbar sein, daß zwei der drei Kriterien durch alle Stämme erfüllt werden, während das dritte Kriterium durch einige jedoch nicht alle Stämme (z. B. zwei der drei Stämme) erfüllt wird. Die Voraussetzungen sind für Populationen erwachsener Menschen (18–60 Jahre) verschiedenen von denen der Populationen älterer Menschen (> 60 Jahre.
    18–60 Jahre > 60 Jahre
    Serokonversionsrate* > 40% > 30%
    Konversionsfaktor** > 2,5 > 2,0
    Protektionsrate*** > 70% > 60%
    • * Die Serokonversionsrate ist definiert als der Prozentsatz von Impfstoffen, die mindestens eine 4-fache Zunahme in den Titern der Serum-Hämagglutinin-Inhibierung (HI) nach Impfung für jeden Impfstoffstamm haben.
    • ** Der Konversionsfaktor ist definiert als der x-fache Anstieg in dem geometrischen Mittelwerttiter (GMTs) der Serum-HI nach Impfung für jeden Impfstoffstamm.
    • *** Die Protektionsrate ist definiert als der Prozentsatz der Impfstoffe mit einem Serum HI-Titer gleich oder größer als 1:40 nach Impfung (für jeden Impfstoffstamm) und wird normalerweise als anzeigender Schutz akzeptiert.
  • Damit ein intranasaler Influenzaimpfstoff kommerziell nützlich ist, wird dieser nicht nur diese Standards erfüllen müssen, jedoch wird er in der Praxis ebenfalls mindestens so effizient sein müssen wie die zur Zeit verfügbaren injizierbaren Impfstoffe. Er wird ebenfalls im Hinblick auf die Antigenmenge und die benötige Anzahl an Verabreichungen kommerziell realisierbar sein müssen.
  • Die auf einem inaktivierten Virus basierenden intranasalen Influenzaimpfstoffe, die über die letzten Jahrzehnte untersucht worden sind, haben diese Kriterien nicht erfüllt.
  • Fulk et al. 1969 (J. Immunol. 102, 1102–5) verglich die intranasale Verabreichung (Nasentropfen plus Zerstäubung) von abgetötetem Influenzavirus mit der subkutanen (s. c.)-Verabreichung in älteren Patienten. Während 56% der Patienten, die eine s. c.-Verabreichung erhielten, einen 4-fachen Anstieg in den Antikörpertitern (HI) aufwiesen, wurde der korrespondierende Anstieg in nur 25% derer beobachtet, die eine intranasale Verabreichung erhielten. Zwei intranasale Verabreichungen resultierten in einer 75%igen Serokonversion.
  • Gluck et al. 1999 (J. Virol. 73, 7788–6) zeigte, daß zwei nacheinanderfolgende intranasale Animpfungen, die durch ein Spray verabreicht wurden, das wirksame Schleimhautadjuvantien (hitzelabiles Toxin, HLT von E. coli) enthielt, notwendig waren, um eine Serokonversion (4-facher Anstieg in der humoralen Antikörperantwort) zu induzieren, die mit einer intramuskulären Verabreichung vergleichbar ist. Eine einzelne intranasale Verabreichung von 15 μg HA pro Stamm in Gegenwart eines Adjuvans, oder sogar zwei Verabreichungen in Abwesenheit eines Adjuvans waren nicht in der Lage, eine gleichwertige Serokonversion bereitzustellen. Das Influenzaantigen war in der Form von Virosomen, die in Lipid-Doppelschichten rekonstituiert waren, die unter Verwendung von Phosphatidylcholin und Proteinen der Virusoberfläche, die von Ei-abstammendem Influenzavirus extrahiert wurden, hergestellt wurden.
  • Das Konzept der Verwendung zweier oder mehrerer intranasaler Verabreichungen, um zu versuchen höhere Level der Serokonversion zu erreichen, ist ebenfalls von anderen Forschern angewendet worden. Petrescu et al. (1979, Rev. Rom. Med.-Virol. 30, 109–115) verabreichte inaktivierten Virus (1000 internationale Einheiten pro Impfdosis) zweimal über einen Zeitraum von zwei Wochen intranasal. Oh et al. (1992, Vaccine 10, 506–11) verabreichte Split-Impfstoff in der Form eines nasalen Sprays 4-mal bei wöchentlichen Intervallen, 15 μg HA pro Stamm bei jeder Verabreichung (0,25 ml pro Nasenloch bei jeder Gelegenheit). Kuno-Sakai et al. (1994, Vaccine 12, 1303–1310) verabreichte ein inaktiviertes Impfstoffaerosol, dreifach der Stärke des kommerziell erhältlichen Split-Influenzas, zweimal in einem Intervall von einer Woche.
  • Die Dokumente WO 96/33738 und RU 2086232 offenbaren inaktivierte Influenzazusammensetzungen, die für die intranasale Verabreichung geeignet sein können.
  • Vor kurzem verabreichte Muszkat et al. (2000 Vaccine 18, 1696–9) zwei intranasale Immunisierungen mit ganzem inaktiviertem Influenzavirus (20 μg eines A-Stamms und eines B-Stamms und 40 μg eines anderen A-Stamms pro Dosis) an ältere Patienten und beobachtete eine niedrige systemische Serokonversion für die intranasale Verabreichung gegenüber einer intramuskulären Injektion einer Standarddosis eines kommerziellen inaktivierten Split-Influenzaimpfstoffs.
  • Daher zeigt die Literatur, die 1969 bis 2000 umspannt, daß, obwohl die intranasale Impfung mit inaktiviertem Influenzaimpfstoff ausgiebig untersucht worden ist, keine Gruppe in der Lage war, eine systemische Serokonversion gleichwertig mit einer intramuskulären oder subkutanen Injektion durch nasale Verabreichung einer einzelnen Dosis des Impfstoffs zu erreichen. Des weiteren, um einen Effekt mit mehreren Verabreichungen des Impfstoffs im Zeitablauf zu erreichen, sind die Dosen des Antigens beträchtlich größer gewesen, als die konventionelle Standarddosis von 15 μg HA pro Stamm für jeden Impfling. Tatsächlich weisen die Daten auf einen Bedarf für mehrere Verabreichungen, und vorzugsweise in Gegenwart von starken Immunstimulantien wie E. coli-HLT.
  • Kimura et al. (1988, Acta Paediatr. Jpn. 30, 601–3) zeigte, daß die Verabreichung von zwei Dosen an inaktiviertem Influenzavirus durch Zerstäuber genauso effektiv war, wie eine einzelne s. c.-Verabreichung, jedoch war die Verabreichung der zwei Dosen durch ein intranasales Spray weit weniger effektiv. Das Zerstäuben erzeugt eine sehr feine Gischt, die die Lungen erreicht. Daher gibt es ebenfalls ein Indiz in den veröffentlichten klinischen Versuchen, daß ein nasales Spray nicht effektiv sein kann, und daß die Zerstäubung besser sein könnte.
  • Die Literatur zeigt ferner den Bedarf für wirksame Adjuvantien, im speziellen wirksame Immunstimulantien, in intranasalen Impfstoffen.
  • Gluck et al. (oben zitiert) zeigte zum Beispiel, daß die intranasale Verabreichung eines Influenzaimpfstoffs in Abwesenheit eines Immunstimulans signifikant weniger effizient ist als in Gegenwart eines Immunstimulans. Die Autoren zeigten, daß gar zwei intranasale Verabreichungen des Impfstoffs, dem das Immunstimulans fehlt, nicht in der Lage waren, die gleiche Serokonversion zu induzieren, die durch subkutane Verabreichung erreicht wird.
  • Hashigucci et al. 1996 (Vaccine 14, 113–9) zeigte, daß zwei vier Wochen auseinanderliegende intranasale Verabreichungen eines Split-Influenzaimpfstoffes, mit einem Gemisch aus E. coli-hitzelabilen Toxin und seiner B-Untereinheit (LTB) als Adjuvans, in einer Serokonversionsrate von 50% resultierte. In Abwesenheit des Adjuvans wurde nur 31% Serokonversion erhalten. Typischerweise resultiert eine s. c.-Verabreichung in 75–90% Serokonversion.
  • Daher zeigt die Literatur eindeutig, daß, um eine gleichwertige systemische Serokonversion zu der mit konventionellen Influenzaimpfstoffen erhaltenen zu erreichen, mehr als eine Verabreichung notwendig ist, und daß der Impfstoff zusätzlich ein Toxin als Adjuvans enthalten sollte.
  • Es wurde nun ermittelt, daß nicht-lebendes Split-Influenzavirus-Antigen in einem kommerziell realisierbaren Influenzaimpfstoff verwendet werden kann. Insbesondere stimuliert eine einzelne Verabreichung einer intranasalen Influenzavirus-Impfstoffzubereitung eine systemische Immunität auf einem schützenden Niveau. Des weiteren erfüllt diese die internationalen Kriterien für einen effektiven Influenzaimpfstoff. Insbesondere kann die intranasale Verabreichung einer nicht-lebenden Split-Influenzavirus-Antigenzubereitung eine systemische Serokonversion (4-facher Anstieg in Anti-HA-Titer) erzeugen, die zu der durch s. c.-Verabreichung desselben Impfstoffs erhaltenen gleichwertig ist. Überraschenderweise kann das Influenza-Antigen in einer signifikant niedrigeren Dosis pro Impfling bereitgestellt werden als dies im Stand der Technik angezeigt ist.
  • Eine einzelne nasale Verabreichung einer Standarddosis des inaktivierten Split-Influenzavirus, die in einer Serokonversion resultiert, die zu der durch Injektion erhaltenen gleichwertig ist, ist zuvor nicht berichtet worden.
  • Die Erfindung stellt zum ersten Mal eine einzelne Verabreichung eines Split-Influenzaimpfstoffs für die nasale Übertragung bereit. Dieser Impfstoff erfüllt mindestens zwei der gesamten EU-Kriterien für Influenzaimpfstoffe, wie in der Tabelle zuvor dargelegt, für den oder alle im Impfstoff vertretenen Stämme von Influenza, so daß der Impfstoff in Europa als ein kommerzieller Einzeldosis-Impfstoff genehmigbar ist. Besonders bevorzugt werden mindestens zwei Kriterien für alle Stämme erfüllt und das dritte Kriterium wird durch alle Stämme oder mindestens durch alle außer einem der Stämme erfüllt. Am meisten bevorzugt erfüllen alle Stämme alle der drei Kriterien.
  • Daher stellt die Erfindung in einem Aspekt die Verwendung einer nicht-lebenden Split-Influenzavirus-Antigenzubereitung bei der Herstellung einer Impfstoffformulierung für eine nasale Einzeldosisimpfung gegen Influenza bereit, worin die Einzeldosisimpfung einen Effekt wie in Anspruch 1 beansprucht erreicht. Der Impfstoff kann in einem Einzeldosisformat oder einem Bi-Dosisformat (im allgemeinen eine Unterdosis für jedes Nasenloch) verabreicht werden.
  • Die Erfindung stellt in einem anderen Aspekt die Verwendung einer Niedrigdosis eines nicht-lebenden Split-Influenzavirus-Antigenmaterials bei der Herstellung eines Schleimhautimpfstoffs für die Immunisierung gegen Influenza bereit.
  • Vorzugsweise enthält die nicht-lebende Split-Influenzavirus-Antigenzubereitung mindestens ein Tensid, das insbesondere ein nicht-ionisches Tensid sein kann. Vorzugsweise ist das nicht-ionische Tensid mindestens ein Tensid, das aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus den Octyl- oder Nonylphenoxypolyoxyethanolen (zum Beispiel aus der kommerziell erhältlichen TritonTM-Reihe), Polyoxyethylensorbitanester (TweenTM-Reihe) und Polyoxyethylenether oder -ester der allgemeinen Formel (I): HO(CH2CH2O)n-A-R (I)worin n 1 bis 50 ist, A eine Bindung oder -C(O)- ist, R C1-50-Alkyl oder Phenyl-C1-50-alkyl ist, und Kombinationen aus zwei oder mehreren daraus.
  • Bevorzugte Tenside, die innerhalb der Formel (I) liegen, sind Moleküle, in denen n 4–24 ist, besonders bevorzugt 6–12 und am meisten bevorzugt 9; die R-Komponente C1-50 ist, vorzugsweise C4-20-Alkyl und am meisten bevorzugt C12-Alkyl.
  • Octylphenoxypolyoxyethanole und Polyoxyethylensorbitanester sind in "Surfactant systems" Hrsg.: Attwood and Florence (1983, Chapman und Hall) beschrieben. Octylphenoxypolyoxyethanole (die Octoxynole), einschließlich t-Octylphenoxypolyethoxyethanol (Triton X-100TM) sind ebenfalls im Merck Index-Eintrag 6858 (Seite 1162, 12. Ausgabe, Merck & Co. Inc., Whitehouse Station, N. J., USA; ISBN 0911910-12-3) beschrieben. Die Polyoxyethylensorbitanester, einschließlich Polyoxyethylensorbitanmonooleat (Tween 80TM), sind im Merck Index-Eintrag 7742 (Seite 1308, 12. Ausgabe, Merck & Co. Inc., Whitehouse Station, N. J., USA; ISBN 0911910-12-3) beschrieben. Beide können unter Verwendung von darin beschriebener Verfahren hergestellt werden oder von kommerziellen Quellen wie Sigma Inc. erworben werden.
  • Insbesonders bevorzugte nicht-ionische Tenside, einschließlich Triton X-45, t-Octylphenoxypolyethoxyethanol (Triton X-100), Triton X-102, Triton X-114, Triton X-165, Triton X-205, Triton X-305, Triton N-57, Triton N-101, Triton N-128, Breij 35, Polyoxyethylen-9-laurylether (Laureth 9) und Polyoxyethylen-9-stearylether (Steareth 9), Triton X-100 und Laureth 9 sind besonders bevorzugt. Ebenfalls besonders bevorzugt ist der Polyoxyethylensorbitanester Polyoxyethylensorbitanmonooleat (Tween 80TM).
  • Weitere geeignete Polyoxyethylenether der allgemeinen Formel (I) werden aus der folgenden Gruppe ausgewählt: Polyoxyethylen-8-stearylether, Polyoxyethylen-4-laurylether, Polyoxyethylen-35-laurylether und Polyoxyethylen-23-laurylether.
  • Alternative Bezeichnungen oder Namen für Polyoxyethylenlaurylether sind in der CAS-Eintragung offenbart. Die CAS-Eintragungs-Nr. von Polyoxyethylen-9-laurylether ist: 9002-92-0. Polyoxyethylenether wie Polyoxyethylenlaurylether sind im Merck-Index beschrieben (12. Auflage: Eintrag 7717, Merck & Co., Inc., Whitehouse Station, N. J., USA; ISBN 0911910-12-3). Laureth 9 wird durch Umsetzen von Ethylenoxid mit Dodecylalkohol gebildet und hat einen Durchschnitt von 9 Ethylenoxid-Einheiten.
  • Das Verhältnis der Länge des Polyoxyethylen-Teils zu der Länge der Alkyl-Kette im Tensid (d. h. das Verhältnis von n:Alkyl-Kettenlänge) beeinflußt die Löslichkeit dieser Tensidklasse in einem wäßrigen Medium. Daher können die Tenside der vorliegenden Erfindung in Lösung sein oder können partikuläre Strukturen wie Mizellen oder Vesikel bilden. Als eine Lösung sind die Tenside der vorliegenden Erfindung sicher, einfach sterilisierbar, einfach zu verabreichen und können in einer einfachen Weise ohne die GMP- und QC-Fragen, die mit der Bildung von gleichförmigen partikulären Strukturen assoziiert sind, hergestellt werden. Einige Polyoxyethylenether wie Laureth 9 sind in der Lage, nicht-vesikuläre Lösungen zu bilden. Jedoch ist Polyoxyethylen-8-palmitoylether (C18E8) in der Lage, Vesikel zu bilden. Entsprechend können Vesikel von Polyoxyethylen-8-palmitoylether in Kombination mit mindestens einem zusätzlichen nicht-ionischen Tensid in den Formulierungen der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden.
  • Vorzugsweise hat der in den Formulierungen der vorliegenden Erfindung verwendete Polyoxyethylenether hämolytische Aktivität. Die hämolytische Aktivität eines Polyoxyethylenethers kann in vitro mit Verweis auf den folgenden Test gemessen werden, und wird als die höchste Konzentration des Tensids ausgedrückt, die das Lysieren von roten Blutzellen nicht bewirkt:
    • 1. Frisches Blut von Meerschweinchen wird mit Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS) 3-mal in einer Arbeitsplatzzentrifuge gewaschen. Nach Resuspendieren auf das anfängliche Volumen wird das Blut ferner 10-fach in PBS verdünnt.
    • 2. 50 μl dieser Blutsuspension wird zu 800 μl von PBS, enthaltend Zweifach-Verdünnungen des Detergens, hinzugegeben.
    • 3. Nach 8 Stunden wird die Hämolyse visuell oder durch Messen der optischen Dichte des Überstands beurteilt. Die Gegenwart eines roten Überstands, der Licht bei 570 nm absorbiert, zeigt die Gegenwart der Hämolyse an.
    • 4. Die Resultate werden als die Konzentration der ersten Detergensverdünnung ausgedrückt, bei der keine Hämolyse mehr folgte.
  • Innerhalb der inhärenten experimentellen Variabilität solch eines biologischen Tests haben die Polyoxyethylenether oder Tenside der allgemeinen Formel (I) der vorliegenden Erfindung vorzugsweise eine hämolytische Aktivität von ungefähr zwischen 0,5–0,0001 besonders bevorzugt zwischen 0,05–0,0001%, noch mehr bevorzugt zwischen 0,005–0,0001% und am meisten bevorzugt zwischen 0,003–0,0004%. Idealerweise sollten die Polyoxyethylenether oder -ester eine hämolytische Aktivität haben, die zu der von entweder Polyoxyethylen-9-laurylether oder Polyoxyethylen-8-stearylether gleich ist (d. h. innerhalb eines 10-fachen Unterschieds).
  • Zwei oder mehrere nicht-ionische Tenside aus den unterschiedlichen Gruppen der beschriebenen Tenside können in den hier beschriebenen Impfstoffformulierungen vorliegen. Insbesondere wird eine Kombination aus einem Polyoxyethylensorbitanester wie Polyoxyethylensorbitanmonooleat (Tween 80TM) und einem Octoxynol wie t-Octylphenoxypolyethoxyethanol (Triton X-100TM) bevorzugt. Eine andere besonders bevorzugte Kombination von nicht-ionischen Tensiden umfaßt Laureth 9 zusammen mit einem Polyoxyethylensorbitanester oder einem Octoxynol oder beiden.
  • Vorzugsweise liegt das oder jedes nicht-ionische Tensid in der endgültigen Impfstoffformulierung in einer Konzentration von zwischen 0,001 bis 20%, besonders bevorzugt 0,01 bis 10% und am meisten bevorzugt bis zu ca. 2% (G/V) vor. Wo ein oder zwei Tenside vorliegen, liegen diese im allgemeinen in der endgültigen Formulierung in einer Konzentration von jeweils bis zu ca. 2 typischerweise in einer Konzentration von jeweils bis zu ca. 0,6% vor. Ein oder mehrere zusätzliche Tenside können vorliegen, im allgemeinen bis zu einer Konzentration von jeweils ca. 1% und typischerweise in Spuren von jeweils bis zu ca. 0,2% oder 0,1 Jedes Gemisch von Tensiden kann in den erfindungsgemäßen Impfstoffformulierungen vorliegen.
  • Nicht-ionische Tenside wie solche zuvor beschriebenen haben bevorzugte Konzentrationen in der endgültigen Impfstoffzusammensetzung wie folgt: Polyoxyethylensorbitanester wie Tween 80TM: 0,01 bis 1%, am meisten bevorzugt ca. 0,1% (G/V); Octyl- oder Nonylphenoxypolyoxyethanole wie Triton X-100TM oder andere Detergentien aus der Triton-Reihe: 0,001 bis 0,1%, am meisten bevorzugt 0,005 bis 0,02% (G/V); Polyoxyethylenether der allgemeinen Formel (I) wie Laureth 9: 0,1 bis 20%, vorzugsweise 0,1 bis 10% und am meisten bevorzugt 0,1 bis 1% oder ca. 0,5% (G/V).
  • Für bestimmte Impfstoffformulierungen können andere Impfstoffkomponenten in der Formulierung eingeschlossen sein. Als solche können die Formulierungen der vorliegenden Erfindung ebenfalls eine Gallensäure oder ein Derivat davon, insbesondere in der Form eines Salzes umfassen. Diese schließen Derivate der Cholsäure und Salze davon ein, insbesondere Natriumsalze der Cholsäure oder Cholsäure-Derivate. Beispiele für Gallensäuren und Derivate davon schließen Cholsäure, Desoxycholsäure, Chenodesoxycholsäure, Lithocholsäure, Ursodesoxycholsäure, Hyodesoxycholsäure und Derivate wie Glyco-, Tauro-, Amidopropyl-1-proansulfon-, Amidopropyl-2-hydroxy-1-propansulfonsäure-Derivate der zuvor erwähnten Gallensäuren oder N,N-Bis-(3D-gluconamidpropyl)desoxycholamid ein. Ein besonders bevorzugtes Beispiel ist Natriumdesoxycholat (NaDOC), das in der endgültigen Impfstoffdosis vorliegen kann.
  • Vorzugsweise werden die Formulierungen der vorliegenden Erfindung in der Form einer wäßrigen Lösung oder einer Suspension in einer nicht-vesikulären Form sein. Solche Formulierungen sind leicht reproduzierbar herzustellen und ebenfalls zu sterilisieren (Endfiltration durch eine 450- oder 220-nm-Porenmembran) und sind einfach über die nasale Schleimhaut in der Form eines Sprays ohne Degradation der komplexen physikalischen Struktur des Adjuvans zu verabreichen.
  • Die nicht-lebenden Influenza-Antigenzubereitung zur Verwendung in der Erfindung ist eine Split-Viruszubereitung.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform umfaßt die Impfstoffformulierung eine Split-Influenzavirus-Zubereitung in Kombination mit einem oder mehreren nicht-ionischen Tensiden. Das eine oder die mehreren nicht-ionischen Tenside können vom Verfahren zurückbleiben, durch das die Split-Influenza-Antigenzubereitung hergestellt wird, und/oder können zu der Antigenzubereitung später zugegeben werden. Es wird angenommen, daß das Split-Influenza-Antigenmaterial in Gegenwart eines nicht-ionischen Tensids stabilisiert werden kann, daher wird es verständlich sein, daß die Erfindung nicht von diesem zwangsläufigen Fall abhängt.
  • Die Erfindung stellt in einem anderen Aspekt die Verwendung einer nicht-lebenden Split-Influenzvirus-Antigenzubereitung bei der Herstellung eines intranasalen Einzeldosis-Influenzaimpfstoffs ohne ein zusätzliches Immunstimulans bereit. Im Zusammenhang dieser Erfindung ist ein Immunstimulans eine Substanz, die in der Lage ist, Zellen des Immunsystems direkt zu stimulieren, im Gegensatz zum reinen indirekten Stimulieren durch zum Beispiel Wirken als ein Träger eines Antigens, das selbst einen stimulierenden Effekt hat, wenn mit dem Träger kombiniert.
  • In einem alternativen Aspekt der vorliegenden Erfindung umfaßt die Formulierung ferner Adjuvantien oder Immunstimulantien, einschließlich Cholera-Toxin und seine B-Untereinheit, enttoxifiziertes Lipid A aus jeglicher Quelle, nicht-toxische Derivat des Lipid A, einschließlich solche in US 4,912,094 und GB 2,220,211 beschrieben, einschließlich nicht-toxischen Derivaten von Monophosphoryl-Lipid A und Diphosphoryl-Lipid A, wie 3-Des-O-acyliertes Monophosphoryl-Lipid A (3D-MPL) und 3-Des-O-acyliertes Diphosphoryl-Lipid A, Saponinen wie Quil A (von der Borke des südamerikanischen Baums Quillaja Saponaria Molina abstammend) und Fraktionen daraus, einschließlich QS21 und QS17 ( US 5,057,540 ; C. R. Kensil, Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Syst., 1996, 12 (1–2): 1–55; EP 0 362 279 B1 ; Kensil et al. (1991, J. Immunology Bd. 146, 431–437; WO 99/10008 ) und das Oligonukleotid-Adjuvanssystem, das ein unmethyliertes CpG-Dinukleotid enthält (wie in WO 96/02555 beschrieben).
  • In einer bevorzugten Ausführungsform dieses Aspekts der Erfindung umfaßt die Formulierung ein nicht-toxisches Lipid A-Derivat, das ausgewählt ist aus 3D-MPL und nicht-toxischen Derivaten von Diphosphoryl-Lipid A, insbesondere 3D-MPL. Besonders bevorzugt umfaßt die Formulierung 3D-MPL zusammen mit einem Polyoxyethylenether oder -ester der allgemeinen Formel (I), wie zuvor definiert, insbesondere Laureth 9.
  • Daher stellt die Erfindung ferner einen Impfstoff bereit, der eine Kombination aus 3D-MPL und Laureth 9 und eine Influenzavirus-Antigenzubereitung umfaßt, insbesondere eine Split-Antigenzubereitung. Dieser Impfstoff ist insbesondere, auch wenn nicht ausschließlich, für die Verabreichung über die Schleimhaut geeignet, einschließlich der hier beschriebenen intranasalen Verabreichung.
  • Zusätzliche Komponenten, die vorzugsweise in der Formulierung gemäß dieses Aspekts der Erfindung vorliegen, schließen ferner nicht-ionische Detergentien wie die Octoxynole und Polyoxyethylenester, wie hier beschrieben, insbesondere t-Octylphenoxypolyethoxyethanol (Triton X-100) und Polyoxyethylensorbitanmonooleat (Tween 80), und Gallensäuren oder Cholsäure-Derivate, wie hier beschrieben, insbesondere Natriumdesoxycholat oder Taurodesoxycholat, ein. Daher umfaßt eine besonders bevorzugte Formulierung 3D-MPL, Laureth 9, Triton X-100, Tween 80 und Natriumdesoxycholat, die mit einer Split-Influenzavirus-Antigenzubereitung kombiniert werden können, um einen Impfstoff bereitzustellen, der für die Verabreichung über die Schleimhaut oder intranasal geeignet ist.
  • Die Erfindung stellt ebenfalls ein Verfahren zum Herstellen eines Impfstoffs bereit, das das Mischen von 3D-MPL, Laureth und einer Split-Influenzavirus-Antigenzubereitung umfaßt, wie zum Beispiel eine Split-Antigenzubereitung, die in einem herkömmlichen intramuskulären Influenzimpfstoff eingesetzt wird.
  • In einem weiteren Aspekt stellt die Erfindung ein pharmazeutisches Kit bereit, das eine intranasale Sprühvorrichtung und eine Einzeldosis eines nicht-lebenden Split-Influenzavirus-Impfstoffs umfaßt, der eine Immunantwort erzeugt, die wenigstens zwei der Kriterien, die in Anspruch 1 dargelegt sind, für den oder alle im Impfstoff vorliegenden Stämme von Influenza erreicht.
  • Die niedrige Dosis von Hämagglutinin gemäß der Erfindung ist vorzugsweise eine Hämagglutinin-Dosis, die zu der Dosis in gegenwärtigen kommerziellen Influenzaimpfstoffen vergleichbar ist. Daher ist die bevorzugte niedrige Dosis vorzugsweise nicht mehr als ca. 30 μg, besonders bevorzugt nicht mehr als ca. 15 μg an Hämagglutinin pro Influenzastamm. Dies gleicht normalerweise irgendwo zwischen 0,1 und 2 μg/kg Körpergewicht. Vorzugsweise, jedoch nicht notwendigerweise, werden die Impfstoffe der Erfindung mit niedriger Dosis als ein Einzeldosisimpfstoff verabreicht, zum Beispiel in zwei Unterdosen, eine für jedes Nasenloch.
  • Vorteilhafterweise wird eine Impfstoffdosis gemäß der Erfindung in einem kleineren Volumen als die herkömmlichen injizierten Split-Influenzaimpfstoffe bereitgestellt, die im allgemeinen 0,5 oder 1 ml pro Dosis sind. Die Dosen mit niedrigem Volumen gemäß der Erfindung sind vorzugsweise unterhalb 500 μl, besonders bevorzugt unterhalb 300 μl und am meisten bevorzugt nicht mehr als 200 μl und weniger pro Dosis. Wenn zwei Unterdosen gegeben werden, ist das bevorzugte Volumen pro Unterdosis die Hälfte des zuvor genannten gesamten Dosisvolumens.
  • Daher ist eine bevorzugte Impfstoffdosis gemäß der Erfindung eine Dosis mit einer niedrigen Antigendosis in einem niedrigen Volumen, z. B. ca. 15 μg oder ca. 7,5 μg HA (pro Stamm) in einem Volumen von ca. 200 μl.
  • Die Erfindung offenbart ebenfalls ein Verfahren für die Prophylaxe einer Influenzainfektion oder einer Erkrankung in einem Subjekt, wobei das Verfahren das Verabreichen eines nicht-lebenden Influenza-Einzeldosisimpfstoffs über eine Schleimhautoberfläche an das Subjekt umfaßt.
  • Die Erfindung offenbart ferner ein Verfahren zur Prophylaxe einer Influenzainfektion oder einer Erkrankung in einem Subjekt, wobei das Verfahren das Verabreichen einer niedrigen Dosis eines nicht-lebenden Influenzavirus-Impfstoffs über eine Schleimhautoberfläche an das Subjekt umfaßt.
  • Vorzugsweise wird der Impfstoff intranasal verabreicht.
  • Am meisten bevorzugt wird der Impfstoff lokal über den nasopharyngialen Bereich verabreicht, vorzugsweise ohne in die Lungen inhaliert zu werden. Es ist wünschenswert eine intranasale Übertragungsvorrichtung zu verwenden, die die Impfstoffformulierung zu dem nasopharygialen Bereich überträgt ohne oder im wesentlichen ohne des Eintritts in die Lungen.
  • Bevorzugte Vorrichtungen für die intranasale Verabreichung der erfindungsgemäßen Impfstoffe sind Sprühvorrichtungen. Geeignete kommerziell erhältliche nasale Sprühvorrichtungen schließen AccusprayTM (Becton Dickinson) ein. Zerstäuber erzeugen eine sehr feine Gischt, die einfach über die Lungen inhaliert werden kann und daher die Nasenschleimhaut nicht effizient erreicht. Zerstäuber sind daher nicht bevorzugt.
  • Bevorzugte Sprühvorrichtungen für die intranasale Verwendung sind Vorrichtungen, bei denen die Leistungsfähigkeit der Vorrichtung nicht vom durch den Verwender ausgeübten Druck abhängt. Diese Vorrichtungen sind als Austragvorrichtungen bekannt. Eine Flüssigkeit wird durch die Düse nur dann freigesetzt, wenn ein Grenzdruck angewendet wird. Diese Vorrichtungen machen es einfacher eine Gischt mit einer regulären Tröpfchengröße zu erreichen. Austragvorrichtungen, die für die Verwendung mit der vorliegenden Erfindung geeignet sind, sind fachbekannt und sind zum Beispiel in WO 91/13281 , EP 311 863 B und EP 516 636 beschrieben. Solche Vorrichtungen sind kommerziell von Pfeiffer GmbH erhältlich und werden ebenfalls in R. Bommer, Pharmaceutical Technology Europe, September 1999 beschrieben.
  • Bevorzugte intranasale Vorrichtungen erzeugen Tröpfchen (gemessen unter Verwendung von Wasser als die Flüssigkeit) in einem Bereich von 1 bis 200 μm, vorzugsweise 10 bis 120 μm. Unterhalb von 10 μm besteht ein Risiko der Inhalation, so daß es deshalb wünschenswert ist, nicht mehr als ca. 5% der Tröpfchen unterhalb von 10 μm zu haben. Tröpfchen oberhalb von 120 μm breiten sich nicht so wie kleinere Tröpfchen aus, daher ist es wünschenswert, nicht mehr als ca. 5% der Tröpfchen zu haben, die 120 μm überschreiten.
  • Bi-Dosis-Übertragung ist ein weiteres bevorzugtes Merkmal eines intranasalen Übertragungssystems zur Verwendung mit den erfindungsgemäßen Impfstoffen. Bi-Dosis-Vorrichtungen enthalten zwei Unterdosen einer einzelnen Impfstoffdosis, eine Unterdosis für die Verabreichung über jedes Nasenloch. Im allgemeinen liegen die zwei Unterdosen in einer einzelnen Kammer vor und die Beschaffenheit der Vorrichtung ermöglicht effiziente Übertragung jeweils einer einzelnen Unterdosis. Alternativ kann eine Einzeldosisvorrichtung für die Verabreichung der erfindungsgemäßen Impfstoffe verwendet werden.
  • Die Erfindung stellt in einem weiteren Aspekt ein pharmazeutisches Kit bereit, das eine wie hier beschriebene intranasale Verabreichungsvorrichtung umfaßt, die eine erfindungsgemäße Impfstoffformulierung enthält.
  • Die Erfindung ist nicht notwendigerweise auf Sprühübertragung der flüssigen Formulierung beschränkt. Erfindungsgemäße Impfstoffe können in anderen Formen zum Beispiel als ein Pulver verabreicht werden.
  • Der erfindungsgemäße Influenzaimpfstoff ist vorzugsweise ein multivalenter Influenzaimpfstoff, der zwei oder mehrer Influenzastämme umfaßt. Am meisten bevorzugt ist er ein trivalenter Impfstoff, der drei Stämme umfaßt. Herkömmliche Influenzaimpfstoffe umfassen drei Influenzastämme, zwei A-Stämme und einen B-Star. Jedoch sind monovalente Impfstoffe, die zum Beispiel in einer Pandemiesituation nützlich sein können, nicht von der Erfindung ausgeschlossen. Ein monovalenter, pandemischer Influenzaimpfstoff wird höchstwahrscheinlich Influenzaantigen von einem einzelnen A-Stamm enthalten.
  • Die nicht-lebenden Split-Influenzavirus-Zubereitungen können von der herkömmlichen embryonalen Eimethode herstammen, oder sie können von jeder der neuen Generation von Methoden unter Verwendung von Gewebekultur zum Wachstum des Virus herstammen. Geeignete Zellsubstrate zum Wachsen des Virus schließen zum Beispiel Nierenzellen des Hundes wie MDCK oder Zellen eines Klons von MDCK, MDCK-ähnliche Zellen, Nierenzellen des Affen wie AGMK-Zellen, einschließlich Vero-Zellen, oder jeden anderen Säugetierzelltyp, der für die Herstellung eines Influenzavirus für Impfstoffzwecke geeignet ist, ein. Geeignete Zellsubstrate schließen ebenfalls humane Zellen ein, z. B. MRC-5-Zellen. Geeignete Zellsubstrate sind nicht auf Zelllinien beschränkt; zum Beispiel sind primäre Zellen wie Fibroblasten des Hühnerembryos ebenfalls eingeschlossen.
  • Die Influenzavirus-Antigenzubereitung kann durch jede einer Anzahl von kommerziell anwendbaren Verfahren hergestellt werden, zum Beispiel das Split-Influenza-Verfahren, beschrieben in Patent Nr. DD 300 833 und DD 211 444 . Traditionellerweise wurde Split-Influenza unter Verwendung einer Lösungsmittel/Detergens-Behandlung hergestellt, wie zum Beispiel Tri-n-butylphosphat oder Diethylether in Kombination mit TweenTM (ebenfalls bekannt als "Tween-Ether"-Splitting) und dieses Verfahren wird immer noch in einigen Herstellungsanlagen verwendet. Andere Spaltmittel, die nur eingesetzt werden, schließen Detergentien oder proteolytische Enzyme oder Gallensalze ein, zum Beispiel Natriumdesoxycholat, wie beschrieben in Patent-Nr. DD 155 875 . Detergentien, die als Spaltmittel verwendet werden können, schließen kationische Detergentien, z. B. Cetyltrimethylammoniumbromid (CTAB), andere ionische Detergentien, z. B. Laurylsulfat, Taurodesoxycholat, oder nicht-ionische Detergentien wie die zuvor beschriebenen, einschließlich Triton X-100 (zum Beispiel in einem Verfahren, das in Lina et al., 2000, Biologicals 28, 95–103 beschrieben ist) und Triton N-101, oder Kombinationen von zwei oder mehr Detergentien ein.
  • Weitere geeignete Spaltmittel, die zum Herstellen der Split-Influenzavirus-Zubereitung verwendet werden können, schließen folgende ein:
    • 1. Gallensäuren und Derivate davon, einschließlich: Cholsäure, Desoxycholsäure, Chenodesoxycholsäure, Lithocholsäureursodesoxycholsäure, Hyodesoxycholsäure und Derivate wie Glyko-, Tauro-, Amidopropyl-1-propansulfon-, Amidopropyl-2-hydroxy-1-propansulfonsäure-Derivate von den zuvor erwähnten Gallensäuren, oder N,N-Bis-(3D-Glucoamidopropyl)desoxycholamid. Ein besonderes Beispiel ist Natriumdesoxycholat (NaDOC), das in Spurenmengen in der endgültigen Impfstoffdosis vorliegen kann.
    • 2. Alkylglycoside oder Alkylthioglycoside, bei denen die Alkyl-Kette zwischen C6 bis C18, typischerweise zwischen C8 und C14 ist, der Zuckerrest jedwede Pentose, Hexose oder Kombinationen daraus mit unterschiedlichen Verknüpfungen ist wie 1 → 6, 1 → 5, 1 → 4, 1 → 3, 1–2. Die Alkyl-Kette kann gesättigt, ungesättigt und/oder verzweigt sein.
    • 3. Derivate von 2, bei denen ein oder mehrere Hydroxyl-Gruppen, vorzugsweise die 6 Hydroxyl-Gruppe modifiziert ist/sind, wie Ester, Ethoxylate, Sulfate, Ether, Carbonate, Sulfosuccinate, Isethionate, Ethercarboxylate, quaternären Ammonium-Verbindungen.
    • 4. Acylzucker, bei denen die Acyl-Kette zwischen C6 und C18, typischerweise zwischen C8 und C12 ist, der Zuckerrest jedwede Pentose, Hexose oder Kombinationen daraus mit unterschiedlichen Verknüpfungen ist wie 1 → 6, 1 → 5, 1 → 4, 1 → 3, 1–2. Die Acyl-Kette kann gesättigt oder ungesättigt und/oder verzweigt sein, cyclisch oder nicht-cyclisch, mit oder ohne einem oder mehreren Heteroatomen z. B. N, S, P oder O.
    • 5. Sulfobetaine der Struktur R-N,N-(R1,R2)-3-Amino-1-propansulfonat, bei denen R jede Alkyl-Kette oder Arylalkyl-Kette zwischen C6 und C18, typischerweise zwischen C8 und C16 ist. Die Alkyl-Kette R kann gesättigt, ungesättigt und/oder verzweigt sein. R1 und R2 sind vorzugsweise Alkyl-Ketten zwischen C1 und C4, typischerweise C1, oder R1 und R2 bilden zusammen mit dem Stickstoffatom einen heterocyclischen Ring.
    • 6. Betaine der Struktur R-N,N-(R1,R2)-Glycin, bei denen R jede Alkyl-Kette zwischen C6 und C18, typischerweise zwischen C8 und C16 ist. Die Alkyl-Kette kann gesättigt, ungesättigt und/oder verzweigt sein. R1 und R2 sind vorzugsweise Alkyl-Ketten zwischen C1 und C4, typischerweise C1, oder R1 und R2 können zusammen mit dem Stickstoff einen Heterocyclyl-Ring bilden.
    • 7. N,N-Dialkyl-glucamide der Struktur R-(N-R1)-Glucamid, bei denen R jede Alkyl-Kette zwischen C6 und C18, typischerweise zwischen C8 und C12 ist. Die Alkyl-Kette kann gesättigt, ungesättigt und/oder verzweigt oder cyclisch sein. R1 und R2 sind Alkyl-Ketten zwischen C1 und C6, typischerweise zwischen C1. Der Zuckerrest kann mit Pentose oder Hexose modifiziert sein.
    • 8. Quaternäre Ammonium-Verbindungen der Struktur R, -N+(-R1, -R2, -R3), bei denen R jede Alkyl-Kette zwischen C6 und C20, typischerweise C20 ist. Die Alkyl-Kette kann gesättigt, ungesättigt und/oder verzweigt sein. R1, R2 und R3 sind vorzugsweise Alkyl-Ketten zwischen C1 und C4, typischerweise C1, oder R1 und R2 können zusammen mit dem Stickstoff einen heterocyclischen Ring bilden. Ein besonders Beispiel ist Cetyltrimethylammoniumbromid (CTAB).
  • Das Herstellungsverfahren für einen Split-Impfstoff wird eine Anzahl von unterschiedlichen Filtrations- und/oder anderen Trennungsschritten wie Ultrazentrifugation-, Ultrafiltrations-, zonale Zentrifugations- und Chromatographie (z. B. Ionenaustausch)-Schritten in einer Vielzahl von Kombinationen und gegebenenfalls einen Inaktivierungsschritt z. B. mit Formaldehyd oder β-Propiolacton oder UV, der vor oder nach dem Splitting durchgeführt werden kann, einschließen. Das Splittingverfahren kann als eine Charge, fortführendes oder halbfortführendes Verfahren durchgeführt werden.
  • Vorzugsweise liegt ein Gallensalz wie Natriumdesoxycholat in Spurenmengen in einer Split-Impfstoffformulierung gemäß der Erfindung vor, vorzugsweise in einer Konzentration nicht größer als 0,05%, oder nicht größer als ca. 0,01%, besonders bevorzugt in ca. 0,0045% (G/V).
  • Bevorzugte Split-Influenzavirus-Antigenzubereitungen gemäß der Erfindung umfassen eine Restmenge von Tween 80 und/oder Triton X-100, die von dem Herstellungsverfahren zurückgeblieben sind, obwohl diese zugegeben werden können oder ihre Konzentration nach Herstellung des Split-Antigens eingestellt werden können. Vorzugsweise werden beide Tween 80 und Triton X-100 vorliegen. Die bevorzugten Bereiche der Endkonzentrationen dieser nicht-ionischen Tenside in der Impfstoffdosis sind:
    Tween 80: 0,01 bis 1%, besonders bevorzugt ca. 0,1% (V/V)
    Triton X-100: 0,001 bis 0,1 (% G/V), besonders bevorzugt 0,005 bis 0,02% (G/V).
  • Das Vorliegen der Kombination dieser zwei Tenside in niedrigen Konzentrationen wurde befunden als die Stabilität des Antigens in Lösung zu fördern. Es ist möglich, daß diese verbesserte Stabilität das Antigen nasal immunogener macht als dies für vorherige Formulierungen der Fall war. Solch eine Verbesserung könnte aus einer Überhandnahme von kleinen Antigenaggregaten oder der Verbesserung der nativen Konformation des Antigens herrühren. Es wird einzusehen sein, daß die Erfindung nicht von der Richtigkeit dieser theoretischen Erklärung abhängt.
  • Es gibt ebenfalls Belege, die zeigen, daß im Fall einer Split-Influenzavirus-Zubereitung das Vorliegen von Fragmenten des ganzen Influenzavirus, assoziiert mit den viralen Proteinen oder diese viralen Proteine enthaltend, insbesondere HA, die Zubereitung des Antigens bewahren kann und zum Induzieren einer starken Immunantwort beitragen kann. Daher ist der Split-Influenzavirus das Antigen der Wahl zur Verwendung in den verschiedenen Aspekten der vorliegenden Erfindung.
  • In einer besonderen Ausführungsform enthält die bevorzugte Split-Viruszubereitung ebenfalls Laureth 9, vorzugsweise im Bereich von 0,1 bis 20%, besonders bevorzugt 0,1 bis 10% und am meisten bevorzugt 0,1 bis 1% (G/V).
  • Die erfindungsgemäßen Impfstoffe enthalten im allgemeinen nicht mehr als 25% (G/V) an Detergens oder Tensid, vorzugsweise weniger als 15% und am meisten bevorzugt nicht mehr als ca. 2%.
  • Die Erfindung stellt in einem anderen Aspekt ein Verfahren zum Herstellen eines Einzeldosis-Influenzaimpfstoffs für die nasale Anwendung bereit, wobei das Verfahren folgendes umfaßt:
    • (i) Bereitstellen einer Split-Influenzavirus-Zubereitung, die im wesentlichen wie für einen herkömmlich injizierbaren (z. B. intramuskulär) Influenzaimpfstoff hergestellt wurde und wenigstens ein nicht-ionisches Tensid umfaßt;
    • (ii) optionales Einstellen der Konzentration des Hämagglutinins und/oder der Konzentration des nicht-ionischen Tensids in der Zubereitung;
    • (iii) Füllen einer intranasalen Übertragungsvorrichtung mit einer Impfstoffdosis der Split-Influenzazubereitung, wobei die Dosis ein geeignetes Volumen für die intranasale Verabreichung ist, gegebenenfalls in einem Bi-Dosisformat, und wobei die Einzeldosisanwendung eine Immunantwort erzeugt, die wenigstens zwei der Kriterien, wie in Anspruch 1 dargelegt, für den oder alle im Impfstoff vorliegenden Influenzastämme erreicht.
  • Ein weiterer optionaler Schritt in dem Verfahren gemäß dieses Aspekts der Erfindung schließt die Zugabe eines Absorptions-steigernden Tensids wie Laureth 9 und/oder die Zugabe eines Adjuvans wie ein nicht-toxisches Lipid A-Derivat, insbesondere 3D-MPL, ein.
  • Verfahren zum Herstellen herkömmlicher injizierter inaktivierter Influenzaimpfstoffe sind wohlbekannt und in der Literatur beschrieben. Solche Verfahren können für das Herstellen eines Einzeldosis-Schleimhaut-Impfstoffs zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung modifiziert werden, zum Beispiel durch den Einschluß eines Aufkonzentrationsschritts vor der endgültigen Sterilfiltration des Impfstoffs, da intranasale Impfstoffe vorteilhafterweise ein kleineres Volumen der Impfstoffformulierung einsetzen als injizierte Impfstoffe. Oder das Verfahren kann durch den Einschluß eines Schritts zum Einstellen der Konzentration der anderen Komponenten z. B. nicht-ionischer Tenside auf ein geeignetes% (G/V) für einen erfindungsgemäßen intranasalen Impfstoff modifiziert werden. Jedoch kann der aktive Bestandteil des Impfstoffs, d. h. das Influenzaantigen, im wesentlichen dasselbe für den herkömmlichen intramuskulären Impfstoff und den erfindungsgemäßen intranasalen Einzeldosis-Impfstoff sein.
  • Die Erfindung wird nun in den nachfolgenden nicht-beschränkenden Beispielen weiter beschrieben.
  • Beispiel 1 – Herstellen eines Split-Influenzaimpfstoffs
  • Monovalenter Split-Impfstoff wurde gemäß dem folgenden Verfahren hergestellt.
  • Herstellen des Virus-Inokulums
  • Am Tag des Animpfens von embryonierten Eiern wird ein frisches Inokulum durch Mischen der Arbeitsstammcharge mit einer Phosphatgepufferten Kochsalzlösung, die Gentamycinsulfat bei 0,5 mg/ml und Hydrocortison bei 25 μg/ml enthält (Virusstamm-abhängig), hergestellt. Das Virusinokulum wird bei 2–8°C belassen.
  • Animpfen der embryonierten Eier
  • 9 bis 11 Tage alte embryonierte Eier werden für die Virusreplikation verwendet. Schalen werden dekontaminiert. Die Eier werden mit 0,2 ml des Virusinokulums angeimpft. Die angeimpften Eier werden bei der entsprechenden Temperatur (Virusstamm-abhängig) für 48 bis 96 Stunden inkubiert. Am Ende des Inkubationszeitraums werden die Embryos durch Abkühlen abgetötet, die Eier für 12–60 Stunden bei 2–8°C gelagert.
  • Ernste
  • Die Allantois-Flüssigkeit der gekühlten embryonierten Eier wird geerntet. Normalerweise werden 8 bis 10 ml der rohen Allantois-Flüssigkeit pro Ei gesammelt. Zu der rohen monovalenten Virusmasse wird 0,100 mg/ml Thiomersal gegebenenfalls hinzugegeben.
  • Aufkonzentration und Aufreinigung des gesamten Virus aus Allantois-Flüssigkeit
  • 1. Klärung
  • Die geerntete Allantois-Flüssigkeit wird durch moderate Geschwindigkeitzentrifugation (Bereich: 4000–14000 g) geklärt.
  • 2. Absorptionsschritt
  • Um ein CaHPO4-Gel im geklärten Viruspool zu erhalten, werden 0,5 mol/l Na2HPO4- und 0,5 mol/l CaCl2-Lösungen hinzugegeben, um unabhängig vom Virusstamm eine Endkonzentration des CaHPO4 von 1,5 g bis 3,5 g CaHPO4/l zu erreichen. Nach Ablagerung für mindestens 8 Stunden wird der Überstand entfernt und das Influenzavirus-enthaltende Sediment durch Zugabe einer 0,26 mol/EDTA-Na2-Lösung, abhängig von der verwendeten Menge an CaHPO4, resolubilisiert.
  • 3. Filtration
  • Das resuspendierte Sediment wird über eine 6 μm Filtermembran filtriert.
  • 4. Saccharosegradient-Zentrifugation
  • Der Influenzavirus wird durch isopyknische Zentrifugation in einem linearen Saccharosegradienten (0,55% (G/V)), 100 μg/ml Thiomersal enthaltend, aufkonzentriert. Die Flußrate ist 8–15 l/Stunde.
  • Am Ende der Zentrifugation wird der Inhalt des Rotors durch vier unterschiedliche Fraktionen wiedergewonnen (die Saccharose wird in einem Refraktometer gemessen):
    – Fraktion 1 55–52% Saccharose
    – Fraktion 2 ungefähr 52–38% Saccharose
    – Fraktion 3 38–20% Saccharose*
    – Fraktion 4 20–0% Saccharose
    • * Virusstamm-abhängig: Fraktion 3 kann auf 15% Saccharose reduziert werden.
  • Für die weitere Impfstoffherstellung werden nur Fraktion 2 und 3 verwendet.
  • Fraktion 3 wird durch Diafiltration mit Phosphatpuffer gewaschen, um den Saccharose-Gehalt auf unter ca. 6% zu reduzieren. Der Influenzavirus, der in dieser verdünnten Fraktion vorliegt, wird pelletiert, um lösliche Verunreinigungen zu entfernen.
  • Das Pellet wird resuspendiert und ausgiebig gemischt, um eine homogene Suspension zu erhalten. Fraktion 2 und das resuspendierte Pellet der Fraktion 3 werden vereinigt und Phosphatpuffer hinzugegeben, um ein Volumen von ungefähr 40 l zu erhalten. Dieses Produkt ist das Konzentrat des monovalenten ganzen Virus.
  • 5. Saccharosegradient-Zentrifugation mit Natriumdesoxycholat
  • Das Konzentrat des monovalenten ganzen Influenzaviruses wird auf eine ENI-Mark II-Ultrazentrifuge angewendet. Der K3-Rotor enthält einen linearen Saccharosegradienten (0,55% (G/V)), worin ein Natriumdesoxycholat-Gradient zusätzlich überdeckt ist. Tween 80 liegt während des Splittings bis zu 0,1% (G/V) vor. Die höchste Natriumdesoxycholat-Konzentration ist 0,7–1,5% (G/V) und ist Stamm-abhängig. Die Flußrate ist 8–15 l/Stunde.
  • Am Ende der Zentrifugation wird der Inhalt des Rotors durch drei unterschiedliche Fraktionen wiedergewonnen (die Saccharose wird in einem Refraktometer gemessen). Fraktion 2 wird für das Weiterverarbeiten verwendet. Der Saccharose-Gehalt für die Fraktionsbegrenzungen (47–18%) variiert entsprechend der Stämme und wird nach Evaluierung fixiert:
  • 6. Sterilfiltration
  • Die Split-Virus-Fraktion wird über Filtermembranen filtriert, mit einer 0,02 μm-Membran abschließend. Phosphatpuffer, 0,025% (G/V) Tween 80 enthaltend, wird zum Verdünnen verwendet. Das Endvolumen der filtrierten Fraktion 2 ist 5-mal das des ursprünglichen Fraktionsvolumens.
  • 7. Inaktivierung
  • Das filtrierte monovalente Material wird bei 22 ± 2°C für höchstens 84 Stunden inkubiert (abhängig von den Virusstämmen, kann diese Inkubation gekürzt werden). Phosphatpuffer, 0,025% Tween 80 enthaltend, wird dann hinzugegeben, um den Gesamtproteingehalt runter auf maximal 250 μg/ml zu reduzieren. Formaldehyd wird zur Endkonzentration von 50 μg/ml hinzugegeben und die Aktivierung erfolgt bei 20°C ± 2°C für mindestens 72 Stunden.
  • 8. Ultrafiltration
  • Das inaktivierte Split-Virusmaterial wird mindestens auf das 2-fache in einer Ultrafiltrationseinheit, ausgestattet mit Celluloseacetat-Membranen mit 20 kDa MWCO, aufkonzentriert. Das Material wird anschließend mit Phosphatpuffer, 0,025% (G/V) Tween 80 enthaltend, gefolgt von Phosphat-gepufferter Salzlösung, 0,01% (G/V) Tween enthaltend, gewaschen.
  • 9. Endgültige Sterilfiltration
  • Das Material nach Ultrafiltration wird durch Filtermembranen filtriert, mit einer 0,2 μm-Membran abschließend. Die Endkonzentration von Hämagglutinin, gemessen durch SRD (ein von WHO empfohlenes Verfahren), sollte 450 μg/ml überschreiten.
  • 10. Lagerung
  • Die monovalente Endmasse wird für höchstens 18 Monate bei 2–8°C gelagert.
  • Reinheit
  • Die Reinheit wurde durch O.D.-Abtasten von Coomassie-gefärbten Polyacrylamidgelen bestimmt. Die Spitzen wurden manuell bestimmt. Probenergebnisse sind in Tabelle 1 gegeben: Tabelle 1
    Virale Proteine (HA, NP, M)% Andere virale und
    H3N2 HA-Dimer HA1 + 2 NP M Wirtszellabstammende Proteine%
    A/Syd/5/97 10,34 22,34 25,16 37,33 4,83
    A/Nan933/95 8,17 15,8 40,09 30,62 5,32
    B
    B/Har/7/94 5,712 24,07 15,64 50 4,58
    B/Yam/166/98 0,68 27,62 21,48 46,02 4,2
    H1N1
    A/Tex/36/91 33,42 24,46 34,33 7,79
    A/Bei/262/95 32,73 35,72 27,06 4,49
    H2N2
    A/sing/1/57 2,8 39,7 21,78 32,12 3,6
    • ' = 100% minus aller nicht-identifizierter Spitzen
  • Beispiel 2 – Herstellung von Impfstoffdosen aus einem Massenimpfstoff
  • Der endgültige Impfstoff wird durch Formulieren eines trivalenten Impfstoffs aus der monovalenten Masse mit der nach Bedarf eingestellten Tensidkonzentrationen hergestellt.
  • Wasser für Injektion, PBS (pH 7,4), 10-fach konzentriert, Tween 80 und Triton X-100 werden gemischt, um die benötigten Endkonzentrationen zu erhalten (PBS 1-mal konzentriert, Tween 80 0,15% und Triton X-100 0,02%). Die drei folgenden inaktivierten Split-Virionen werden unter 10-minütigem Rühren zwischendrin hinzugegeben:
    30 μg HA A/Beijing/262/95 (H1N1)
    30 μg HA A/Sydney/5/97 (H3N2)
    30 μg HA B/Harbin/7/94
  • Nach 15 Minuten Rühren wird der pH auf 7,2 ± 0,2 eingestellt.
  • Das Dosisvolumen ist 200 μl.
  • In dem mit Laureth 9 formulierten Impfstoff wird das Laureth 9 vor der pH-Einstellung hinzugegeben, um eine Endkonzentration von 0,5% (G/V) zu erhalten.
  • Beispiel 3 – Verwendete Verfahren zum Messen von Antikörperantworten
  • 1. Detektion von spezifischen Anti-Influenza- und Gesamt-IgA in humanen Nasensekretionen durch ELISA
  • Sammelverfahren für humane Nasensekretionen
  • Zwei Dochte werden gegen die innere Nasenmuschel (eines für jedes Nasenloch) des Freiwilligen angewendet. Die Dochte werden in der Nase für 1 Minute belassen, bevor sie in 2 ml von 0,9% NaCl, 1% BSA und 0,1% Natriumazid (Konservierungspuffer) plaziert werden. Alle Proben werden über einen Zeitraum von 2 Stunden auf Eis belassen. Die Dochte werden dann gepreßt, um die Antikörper zu gewinnen. Nach Zentrifugation (10 min, 2000 g, 4°C) werden die Flüssigkeiten aller Proben gesammelt, aliquotiert und bis zum Tag der Untersuchung bei –20°C eingefroren. Die Pellets werden in 400 μl von physiologischem Wasser suspendiert und mikroskopisch auf Blutzellenkontamination untersucht. Nach Sammeln unter Verwendung nasaler Dochte und Behandlung der humanen Nasensekretionen wird die Detektion der gesamten und spezifischen Anti-Influenza-IgAs mittels zweier unterschiedlicher ELISAs realisiert:
  • "Capture"-ELISA zum Detektieren der Gesamt-IgAs
  • Gesamt-IgAs werden mit polyklonalem Anti-Mensch-IgA-affinitätsaufgereinigten Ig, immobilisiert auf Mikrotiterplatten, eingefangen und anschließend unter Verwendung eines anderen polyklonalen Anti-Mensch-IgA-affinitätsaufgereinigten Ig, Peroxidase-verknüpft, detektiert.
  • Ein aufgereinigtes humanes sIgA wird als ein Standard verwendet, um die Quantifizierung von sIgA in den gesammelten Nasensekretionen zu ermöglichen.
  • Drei Referenzen von aufgereinigten humanem sIgA werden als niedrige, mittlere und hohe Referenzen verwendet.
  • "Direkt"-ELISA für die Detektierung von spezifischen Anti-Influenza-IgAs
  • Drei unterschiedliche ELISAs werde durchgeführt, ein für jeden in der Impfstoffformulierung vorliegenden Influenzastamms.
  • Spezifisches Anti-Influenza-IgA wird mit Split-inaktivierten Influenzaantigenen, die auf Mikrotiterplatten geschichtet sind, eingefangen und anschließend unter Verwendung des gleichen anderen polyklonalen Anti-Mensch-IgA-affinitätsaufgereinigten Igs, wie der für den Gesamt-IgA-ELISA verwendeten an Peroxidase verknüpft, detektiert.
  • Reagentien
  • Biologische Reagentien
    • – Ziege-Anti-Mensch-IgA, affinitätsaufgereinigtes Ig (Sigma I-0884).
    • – Aufgereinigtes humanes sekretorisches IgA (ICN-Cappel 55905) Standard für die Gesamt-IgA-Quantifizierung).
    • – Humanes sekretorisches IgA (Colostrum) (Biogenesis 5111–5504) (Referenz Bio für Total-IgA) verdünnt um niedrige, mittlere und hohe Referenzen zu erhalten.
    • – Aufgereinigtes humanes IgA (Sigma I-1010) (Referenz Sig für Gesamt-IgA).
    • – Negative Referenz für spezifischen Ani-Influenza-ELISA (Pool von Nasensekretionen mit undetektierbaren Antworten gegen die drei Stämme; Ausschluß = 0,6 CD450 nm).
    • – Positive niedrige Referenz für spezifischen Anti-Influenza-ELISA (Pool von Nasensekretionen mit niedrigen detektierbaren Antworten gegen die drei Stämme).
    • – Positive mittlere Referenz für spezifischen Anti-Influenza-ELISA (Pool von Nasensekretionen mit mittleren detektierbaren Antworten für die drei Stämme; Ausschluß = 0,6 CD).
    • – Ziege-Anti-Mensch-IgA-Serum, affinitätsaufgereinigt, HRP-konjugiert (ICN 674221).
    • – Split-inaktiviertes Ei-abstammendes Antigen A/Beijing/262/95 H1N1.
    • – Split-inaktiviertes Ei-abstammendes Antigen A/Sydney/5/97 H3N2.
    • – Split-inaktiviertes Ei-abstammendes Antigen B/Harbin/7/94.
  • Reagenszubereitung
    • – Sättigungspuffer (PBS, 0,1% Tween 20, 1% BSA, 4% NCS).
    • – NaCl T20 (NaCl 9 g/l, Tween 20 0,05%).
  • Verfahren
  • Detektion des humanen Gesamt-IgA
    • – Gebe 100 μl/Vertiefung eines polyklonalen Ziege-Anti-Mensch-IgAs bei 1 μg/ml in DPBS und inkubiere über Nacht bei 4°C.
    • – Gebe 200 μl/Vertiefung des Sättigungspuffers und inkubiere für 1 Stunde bei 37°C.
    • – Gebe in die erste Reihe: 100 μl/Vertiefung Zweifach-Verdünnungen des Standard-IgAs in Sättigungspuffer, ausgehend von 250 ng/ml runter auf 0,12 ng/ml.
    • – Gebe in die anderen Reihen: 100 μl/Vertiefung von Zweifach-Verdünnungen der Proben (Nasenflüssigkeiten) in Sättigungspuffer, ausgehend von 1/100 bis runter auf 1/102400, gebe 100 μl des Sättigungspuffers in die Spalte 12 und inkubiere für 2 Stunden bei 22°C.
    • – Wasche die Platten 4-mal mit NaCl T20.
    • – Gebe 100 μl/Vertiefung eines Peroxidase-konjugierten Ziege-Anti-Mensch-IgAs, verdünnt in Sättigungspuffer bei 1/10000, und inkubiere für 1 l/2 Stunden bei 22°C.
    • – Wasche die Platten 4-mal mit NaCl T20.
    • – Gebe 100 μl/Vertiefung von TMB (Tetramethylbenzidin) und inkubiere bei Raumtemperatur für 10 Minuten in Dunkelheit.
    • – Terminiere die Reaktion durch Zugabe von 100 μl H2SO4 (0,4 N)/Vertiefung.
    • – Messe die Absorption (OD) jeder Platte unter Verwendung eines Spektralphotometers bei 450 nm mit einer Referenz bei 630 nm.
  • Detektion eines spezifischen Anti-Influenza-IgAs
    • – Gebe 100 μl/Vertiefung jedes Stamms von Influenzavirus bei 1 μg/ml in DPBS und inkubiere über Nacht bei 4°C.
    • – Gebe 200 μl/Vertiefung des Sättigungspuffers und inkubiere für 1 Stunde bei 37°C.
    • – Gebe 100 μl/Vertiefung von Zweifach-Verdünnungen der Proben in Sättigungspuffer, ausgehend von 1/5 bis runter auf 1/640, und inkubiere die Platten für 2 Stunden bei 22°C.
    • – Wasche die Platten 4-mal in NaCl T20.
    • – Gebe 100 μl/Vertiefung des Peroxidase-konjugierten Ziege-Anti-Mensch-IgAs, verdünnt in Sättigungspuffer bei 1/10000, und inkubiere für 1 l/2 Stunden bei 22°C.
    • – Wasche die Platten 4-mal mit NaCl T20.
    • – Gebe 100 μl/Vertiefung von TMB (Tetramethylbenzidin) und inkubiere bei Raumtemperatur für 10 Minuten bei Dunkelheit.
    • – Terminiere die Reaktion durch Zugabe von 100 μl H2SO4 (0,4 N)/Vertiefung.
    • – Messe die Absorption (OD) jeder Platte unter Verwendung eines Spektralphotometers bei 450 nm mit einer Referenz bei 630 nm.
  • Resultate – Expression und Berechnungen
  • Gesamt IgA-Expression
  • Die Resultate werden als μg des Gesamt-IgAs in 1 ml der Nasenflüssigkeiten unter Verwendung eines Softmaxpro-Programms ausgedrückt.
  • Expression des spezifischen Anti-Influenza-IgAs
  • Die Resultate werden als Endpunkt-Einheitstiter, die als die Umkehrfunktion der letzten Verdünnung berechnet werden, ausgedrückt, was ein OD450 nm oberhalb des Ausschlusses (OD450 nm = 0,6) ergibt.
  • Der Ausschlußwert wird definiert als die höchste optische Dichte der negativen Referenz (siehe Validierungsprotokoll) bei einer Verdünnung von 1/5. Die Begrenzung der Detektion, die dem Endpunkteinheitstiter bei dem Ausschluß entspricht, kann daher als 5 Endpunkteinheiten berechnet werden. Proben mit einem Titer < 5 Endpunkteinheiten werden als negativ erachtet und Proben mit einem Titer > 5 Endpunkteinheiten werden als positiv erachtet.
  • Das Endergebnis einer Probe wird wie folgt ausgedrückt:
    Normalisierung der spezifischen Antwort durch Berechnung des Verhältnisses zwischen der spezifischen Antwort und der Gesamt-IgA-Konzentration: Endpunkteinheit/μg Total-IgA (in der Literatur das am häufigsten verwendete Berechnungsverfahren).
  • 2. Hämagglutination-Inhibierungs(HAI)-Aktivität von Influenzaspezifischen Serumantikörpern
  • Seren (50 μl) werden mit 200 μl RDE (Rezeptor-zerstörendes Enzym) für 16 Stunde bei 37°C behandelt. Die Reaktion wird mit 150 μl von 2,5% Na-Citrat terminiert und die Seren für 30 Minuten bei 56°C inaktiviert. Eine 1:10-Verdünnung wird durch Zugabe von 100 μl PBS hergestellt. Dann wird eine 2-fache Verdünnungsreihe in den Platten mit 96 Vertiefungen (V-Boden) durch Verdünnen von 25 μl Serum (1:10) mit 25 μl PBS hergestellt. 25 μl der Referenzantigene werden zu jeder Vertiefung bei einer Konzentration von 4 hämagglutinierenden Einheiten pro 25 μl gegeben. Antigen- und Antiserumverdünnung werden unter Verwendung eines Mikrotiterplattenschüttlers gemischt und für 60 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. 50 μl rote Blutzellen (RBC) des Huhns (0,5%) werden dann hinzugegeben und den RBCs wird erlaubt, für eine Stunde bei Raumtemperatur sich abzulagern. Der HAI-Titer entspricht der Umkehrfunktion der letzten Serumverdünnung, die die Virus-induzierte Hämagglutinierung vollständig inhibiert.
  • Beispiel 4 – Ein Vergleich der Immunogenität eines intranasalen Split-Influenzaimpfstoffs mit der eines lizenzierten herkömmlichen Stammimpfstoff (FluarixTM) in gesunden erwachsenen Probanden
  • In der Studie verwendete Formulierungen
  • Zwei Formulierungen (A, B) der Ei-abstammenden Split-Influenzaantigene wurden beurteilt. A ist eine intranasale Formulierung und B ist die FluarixTm/α-Rix®, die intramuskulär gegeben wird. Die Formulierungen enthielten drei inaktivierte Split-Virionen-Antigene, die von den von der WHO empfohlenen Stämmen der Saison 1998/1999 hergestellt wurden.
  • Die Vorrichtung, die für die Verabreichung der Impfstoffe verwendet wurde, war die AccusprayTM intranasale Spritze von Becton Dickinson. Die Vorrichtung funktioniert auf einer ähnlichen Basis wie eine herkömmliche Spritze, jedoch hat sie eine spezielle Spitze, die spirale Kanäle enthält, was in der Erzeugung einer Gischt resultiert, wenn ein gleichmäßiger Druck auf das Druckstück angewendet wird. Die Vorrichtung wurde mit 200 μl der Impfstoffformulierung befüllt und 100 μl der Formulierung A wurde in jedes Nasenloch gesprüht.
  • Zusammensetzung der Formulierungen
  • Die intranasale Formulierung (A) enthielt die folgenden inaktivierten Split-Virionen:
    • 1. 30 μg HA A/Beijing/262/95 (H1N1)
    • 2. 30 μg HA A/Sydney/5/97 (H3N2)
    • 3. 30 μg HA von B/Harbin/7/94
    und Phosphat-gepufferte Salzlösung, pH 7,4 ± 0,1, 0,1% Tween 80, 0,015% Triton X-100, 0,0045% Na-Desoxycholat und Thiomersal unterhalb 35 μg/ml.
  • Das Volumen der Einzeldosis war 200 μl (100 μl-Unterdosen für jedes Nasenloch).
  • Der Komparator FluarixTM/α-Rix® ist der kommerzielle inaktivierte trivalente Split-Influenzaimpfstoff von SmithKline Beecham Biologicals. Die 500 μl-Dosis wurde intramuskulär verabreicht.
  • Diese Dosis enthält:
    15 μg HA der drei zuvor genannten Stämme, Tween 70 zwischen 500 und 1000 μg pro ml (0,05%–0,1%), Triton X-100 zwischen 50 und 170 μg/ml (0,005%–0,017%), Natriumdesoxycholat höchstens 100 μg/ml, Thiomersal 100 μg/ml und Phosphat-gepufferte Salzlösung, pH zwischen 6,8 und 7,5.
  • Immunogenitätstudie
  • Eine offene, kontrollierte und randomisierte Studie beurteilt die Immunogenität eines intranasalen Split-Influenzaimpfstoffs, formuliert mit Tween 80 und Triton X-100, im Vergleich zu dem herkömmlichen Stammimpfstoff (d. h. FluarixTM). 20 gesunde erwachsene Probanden (Alter 18–40 Jahre) erhielten eine Dosis an FluarixTM und 10 Probanden erhielten eine Dosis des intranasalen Influenzaimpfstoffs. Die intranasale Formulierung (200 μl) enthielt die folgenden inaktivierten Virionen: 30 μg von Hämagglutinin A/Beijing/262/95 (H1N1), 30 μg von Hämagglutinin A/Sydney/5/97 (H3N2), 30 μg von Hämagglutinin B/Harbin/7/94 mit Phosphat-gepufferter Salzlösung (pH 7,4 ± 0,1), Tween 80 (0,1%), Triton X-100 (0,015%), Natriumdesoxycholat (0,0045%) und Thiomersal (< 35 μg/ml).
  • Es gab einen 8-Tage-Anschlußzeitraum zum Bewerten lokaler und allgemeiner Symptome und beide Impfstoffe waren wohltoleriert in bezug auf Sicherheit und Reaktogenität. Keine ernsthaften nachteiligen Ereignisse die Impfung betreffend wurden berichtet.
  • Die Immunogenität der Impfstoffe wurde durch Beurteilen der Titer der Serum-Hämagglutin-Inhibierung (HI) untersucht, um die Serokonversionsrate (definiert als der Prozentsatz der Impfstoffe, die mindestens einen 4-fachen Anstieg in dem Serum-HI-Titern am Tag 21 im Vergleich zu Tag 0 für jeden Impfstoffstamm haben), Konversionsfaktor (definiert als der x-fache Anstieg im geometrischer mittlerer Titer (GMTs) der Serum HI am Tag 21 im Vergleich zu Tag 0 für jeden Impfstoffstamm) und die Seroprotektionsrate (definiert als der Prozentsatz der Impfstoffe mit einem Serum HI-Titer > 40 nach Impfung (für jeden Impfstoffstamm) der als schutzanzeigend akzeptiert ist). Zusätzlich wurde die Schleimhaut-IgA-Antikörperantwort durch Enzymgekoppelten Immunabsorptionstest (Enzyme Linked Immunosorbent Assay, ELISA) beurteilt.
  • HI-Seropositivität-, Serokoversions- und Seroprotektionsraten 21 Tage nach einer Dosis von FluarixTM oder der intranasalen Formulierung sind in Tabelle 2 gezeigt. Der Koversionsfaktor ist in Tabelle 2a gezeigt. Tabelle 2 HI-Seropositivitäts-, Serokonversions- und Seroprotektionsraten 21 Tage nach Dosis 1
    Stamm Gruppe Zeit N Seropositivität Seroprotektion Serokonversion
    n % n % n %
    A/Beijing Intranasaler Impfstoff plus Tween 80 und Triton X100 Tag 0 20 4 20,0 0 0,0
    Tag 21 20 17 85,0 15 75,0 15 75,0
    FluarixTM Tag 0 19 4 21,1 3 15,8
    Tag 21 19 19 100,0 18 94,7 19 100,0
    A/Sydney Intranasaler Impfstoff plus Tween 80 und Triton X100 Tag 0 20 13 65,0 3 15,0
    Tag 21 20 20 100,0 19 95,0 15 75,0
    FluarixTM Tag 0 19 14 73,7 1 5,3
    Tag 21 19 19 100,0 18 94,7 16 84,2
    B/Harbin Intranasaler Impfstoff plus Tween 80 und Triton X100 Tag 0 20 10 50,0 7 35,0
    Tag 21 20 20 100,0 18 90,0 14 70,0
    FluarixTM Tag 0 19 17 89,5 11 57,9
    Tag 21 19 19 100, 19 100,0 15 78,9
    • Seropositivität (n,%): Anzahl und Prozentsatz der Probanden mit Titer ≥ 10
    • Seroprotektion (n,%): Anzahl und Prozentsatz der Probanden mit Titern ≥ 40
    • Serokonversion (n,%): Anzahl und Prozentsatz der Probanden mit mindestens einem 4-fachen Anstieg in den Titern vom Tag 0 bis Tag 21.
  • In allen Fällen war der Konversionsfaktor (x-facher Anstieg im Serum HI-GMT nach Impfung) größer als 2,5, das Niveau, das für einen erfolgreichen Influenzaimpfstoff notwendig ist.
  • Der Prozentsatz an Probanden mit einem zweifachen oder einem vierfachen Anstieg im spezifischen/totalen Schleimhaut-IgA-Körper-Verhältnis zwischen Tag 21 und Tag 0 (1 Dosis) ist in Tabelle 3 gezeigt. Tabelle 3 Prozentsätze der Probanden mit einem 2-fachen oder einem 4-fachen Anstieg im spezifischen/total-IgA-Verhältnis zwischen Tag 21 und Tag 0 (1 Dosis).
    Stamm Gruppe N 2-facher Anstieg (%) 4-facher Anstieg (%)
    A/Beijing Tween & Triton 20 55,0 30,0
    FluarixTM 19 52,6 26,3
    A/Sydney Tween & Triton 20 65,0 45,0
    FluarixTM 19 47,4 5,3
    B/Harbin Tween & Triton 20 40,0 30,0
    FluarixTM 19 26,3 5,3
  • Zusammenfassung
  • Die Immunogenitätsergebisse, zuvor tabellisiert, zeigen, daß die intranasale Formulierung Niveaus der Seropositivität, Serokonversion und Seroprotektion erzeugt, die zu denen durch den herkömmlichen Stammimpfstoff (FluarixTM) erzeugten 21 Tage nach einer Dosis ähnlich sind. Die intranasale Formulierung erzeugte eine bessere Schleimhaut-IgA-Antwort nach einer Dosis als der herkömmliche Stammimpfstoff (FluarixTM)
  • Beispiel 5 – Ein Vergleich der Immunogenität eines intranasalen Split-Influenzaimpfstoff s, formuliert mit Laureth 9, Triton X-100 und Tween 80, mit der Immunogenität eines lizenzierten herkömmlichen Stammimpfstoffs (FluarixTM) in gesunden erwachsenen Probanden.
  • Eine intranasale Formulierung der Ei-abstammenden Split-Influenzaantigene, formuliert mit Laureth 9, Triton X-100 und Tween 80 (A) wurde beurteilt und mit FluarixTM/α-Rix® (B) verglichen. Die Formulierungen enthielten drei inaktivierte Split-Virion-Antigene, hergestellt aus den von der WHO empfohlenen Stämmen der Saison 1998/1999. Die Vorrichtung, die für die Verabreichung der Impfstoffe verwendet wurde, war die AccusprayTM Intranasalspritze von Becton Dickinson. Diese Vorrichtung arbeitet auf einer ähnlichen Basis wie eine herkömmliche Spritze, jedoch hat sie eine spezielle Spitze, die spirale Kanäle enthält, was in der Erzeugung einer Gischt resultiert, wenn gleichmäßiger Druck auf das Druckstück angewendet wird. 100 μl der Formulierung wurde in jedes Nasenloch gesprüht.
  • Zusammensetzung der Formulierung
  • Die intranasale Formulierung (A) enthielt die folgenden inaktivierten Split-Vironen:
    • 1. 30 μg HA A/Beijing/262/95 (H1N1)
    • 2. 30 μg HA A/Sydney/5/97 (H3N2)
    • 3. 30 μg HA von B/Barbin/7/94
    und Phosphat-gepufferte Salzlösung, pH 7,4 ± 0,1, 0,1% Tween 80, 0,015% Triton X-100, 0,0045% Natriumdesoxycholat und Thiomersal unterhalb 35 μg/ml.
  • Das Volumen der einen Dosis war 200 μl (100 μl-Unterdosen für jedes Nasenloch).
  • Die Formulierung A wurde mit Laureth 9 formuliert, um eine Endkonzentration von 0,5% (G/V) zu erhalten.
  • Der Komparator FluarixTM/α-Rix® (B) ist ein kommerzieller inaktivierter trivalenter Split-Influenzaimpfstoff von SmithKline Beecham Biologicals, der intramuskulär in einer Dosis von 500 μl verabreicht wird.
  • Immunogenitätsstudie
  • Eine offene, kontrollierte und randomisierte Studie beurteilte die Immunogenität eines intranasalen Split-Influenzaimpfstoffs, formuliert mit Laureth 9 und angereichert mit Tween 80 und Triton X-100, im Vergleich zum herkömmlichen Stammimpfstoff (d. h. FluarixTM). 20 gesunde erwachsene Probanden (Alter 18–40 Jahre) erhielten eine Dosis an FluarixTM und 10 Probanden erhielten eine Dosis (zwei Unterdosen, eine pro Nasenloch) des intranasalen Influenzaimpfstoffs.
  • Es gab einen 8-Tage-Anschlußzeitraum zum Bewerten lokaler und allgemeiner Symptome und beide Impfstoffe waren wohltoleriert in bezug auf Sicherheit und Reakogenität. Keine ernsthaften nachteiligen Ereignisse die Impfung betreffend wurden berichtet.
  • Die Immunogenität der Impfstoffe wurde durch Beurteilen der Titer der Serum-Hämagglutin-Inhibierung (HI) untersucht, um die Serokonversionsrate (definiert als der Prozentsatz der Impfstoffe, die mindestens einen 4-fachen Anstieg in dem Serum-HI-Titern am Tag 21 im Vergleich zu Tag 0 für jeden Impfstoffstamm haben), Konversionsfaktor (definiert als der x-fache Anstieg im geometrischer mittlerer Titer (GMT) des Serum HI am Tag 21 im Vergleich zu Tag 0 für jeden Impfstoffstamm) und die Seroprotektionsrate (definiert als der Prozentsatz der Impfstoffe mit einem Serum HI-Titer ≥ 40 nach Impfung (für jeden Impfstoffstamm) der als schutzanzeigend akzeptiert ist). Zusätzlich wurde die Schleimhaut-IgA-Antikörperantwort durch Enzymgekoppelten Immunabsorptionstest (Enzyme Linked Immunosorbent Assay, ELISA) beurteilt.
  • HI-Seropositivität-, Serokoversions- und Seroprotektionsraten 21 Tage nach einer Dosis an FluarixTM oder der intranasalen Formulierung sind in Tabelle 4 gezeigt. Tabelle 4: HI-Seropositivitäts-, Serokonversions- und Seroprotektionsraten 21 Tag nach Dosis 1
    Stamm Gruppe Zeit N Seroposiversion Seroprotektion Serokontivität
    n % n % n %
    A/Beijing Intranasaler Impfstoff plus Laureth 9 Tag 0 20 5 25,0 1 5,0
    Tag 21 20 19 95,0 10 50,0 15 75,0
    FluarixTM Tag 0 19 4 21,1 3 15,8
    Tag 21 19 19 100,0 18 94,7 19 100,0
    A/Sydney Intranasaler Impfstoff plus Laureth 9 Tag 0 20 16 80,0 4 20,0
    Tag 21 20 20 100,0 19 95,0 15 75,0
    FluarixTM Tag 0 19 14 73,7 1 5,3
    Tag 21 19 19 100,0 18 94,7 16 84,2
    B/Harbin Intranasaler Impfstoff plus Laureth 9 Tag 0 20 18 90,0 11 55,0
    Tag 21 20 20 100,0 19 95,0 12 60,0
    FluarixTM Tag 0 19 17 89,5 11 57,9
    Tag 21 19 19 100,0 19 100,0 15 78,9
    • Seropositivität (n,%): Anzahl und Prozentsatz der Probanden mit Titer ≥ 10
    • Seroprotektion (n,%): Anzahl und Prozentsatz der Probanden mit Titern ≥ 40
    • Serokonversion (n,%): Anzahl und Prozentsatz der Probanden mit mindestens einem 4-fachen Anstieg in den Titern vom Tag 0 bis Tag 21.
  • In allen Fällen war der Konversionsfaktor (x-facher Anstieg im Serum HI-GMT nach Impfung) größer als 2,5, das Niveau, das für einen erfolgreichen Influenzaimpfstoff notwendig ist.
  • Der Prozentsatz an Probanden mit einem zweifachen oder einem vierfachen Anstieg im spezifischen/totalen Schleimhaut-IgA-Körper-Verhältnis zwischen Tag 21 und Tag 0 (1 Dosis) ist in Tabelle 5 gezeigt. Tabelle 5 Prozentsatz der Probanden mit einem 2-fachen oder einem 4-fachen Anstieg in dem spezifischen/total-IgA-Verhältnis zwischen Tag 21 und Tag 0 (1 Dosis).
    Stamm Gruppe N 2-facher Anstieg (%) 4-facher Anstieg (%)
    A/Beijing Laureth 9 20 55,0 20,0
    FluarixTM 19 52,6 26,3
    A/Sydney Laureth 9 20 55,0 55,0
    FluarixTM 19 47,4 5,3
    B/Harbin Laureth 9 20 15,0 20,0
    FluarixTM 19 26,3 5,3
  • Zusammenfassung
  • Die Immunogenitätsergebisse, zuvor tabellisiert, zeigen, daß die intranasale Formulierung Niveaus der Seropositivität, Serokonversion und Seroprotektion erzeugt, die zu denen durch den herkömmlichen Stammimpfstoff (FluarixTM) erzeugten 21 Tage nach einer Dosis ähnlich sind. Die intranasale Formulierung erzeugte eine bessere Schleimhaut-IgA-Antwort nach einer Dosis als der herkömmliche Stammimpfstoff (FluarixTM).
  • Beispiel 6 – Evaluierung eines intranasalen Influenzaimpfstoffs mit und ohne Laureth 9 + 3D-MPL in "geprimten" Mäusen
    • 6.1. In einem ersten Experiment wurden Mäuse mit Kandidatenformulierungen "geprimt", die die gleichen Influenzastämme enthielten wie die, die für ihr "Priming" verwendet wurden.
  • Experimentelles Verfahren
  • Weibliche Balb/c-Mäuse (8 Wochen alt) wurden intranasal am Tag 0 mit β-Propiolacton-inaktivierten Ei-abstammenden trivalenten ganzen Influenzavirus A/Beijing/262/95, A/Sydney/5/97 und B/Harbin/7/94; 5 μg HA/Stamm) "geprimt" um so das natürliche "Priming" nachzuahmen, das im Menschen erfolgt.
  • Nach 28 Tagen wurden Mäuse (10 Tiere pro Gruppe) intranasal mit den folgenden trivalenten Impfstoffformulierungen geimpft, die die gleichen Stämme enthielten, wie die, die für das "Priming" verwendet wurden:
    Gruppe Weg (Verfahren) Trivalente Split-Antigene Zusätzliche Reagentien?
    Blanko 1 Intranasal (Tröpfchen) 3,0 μg HA/Stamm nein
    Blanko 2 Intranasal (Tröpfchen) 1,5 μg HA/Stamm nein
    L9 Intranasal (Tröpfchen) 1,5 μg HA/Stamm 0,5% Laureth 9
    L9 + MPL Intranasal (Tröpfchen) 0,75 μg HA/Stamm 0,5% Laureth 9 + 5 μg MPL
    Parenteral Intramuskulär (Injektion) 1,5 μg HA/Stamm nein
  • Intranasale Impfstoffformulierungen, die an Mäuse verabreicht werden, sind denen gleich, die in Beispiel 7 an Menschen verabreicht werden, mit der Ausnahme, daß die verabreichte Dosis für Mäuse 1/10 der Dosis für Menschen entspricht.
  • Serumproben wurden am Tag 42 genommen und auf Hämagglutinierung-Inhibierung(HI)-Antikörper getestet. Nach Tötung (Tag 42) wurden Nasenwäschen durchgeführt und durch ELISA auf IgA-Antikörpertiter getestet.
  • Spezifische IgA-Antikörper wurden als Endpunkttiter (EPT) gemessen und die Resultate wurden als spezifischer IgA-EPT pro μg Gesamt-IgA ausgedrückt, um jeden Unterschied aufgrund der Probenentnahme auszuschließen.
  • Resultate
  • Die erste Aufgabe der Untersuchung war es zu bestätigen, daß intranasale Impfstoffformulierungen in der Lage sind, Serum-HI-Titer hervorzurufen, die nicht signifikant anders zu denen sind, die aus einer parenteralen Verabreichung resultieren. 1 zeigt die HI-Titer, die im Serum am Tag 42 (d. h. 14 Tage nach Impfung) mit verschiedenen Impfstoffen beobachtet wurden.
  • Statistische Analyse (Tukey-HSD-statistischer Vergleichstest) wurde auf dem beobachteten HI-Titer angewendet, um die intranasalen Impfstoffe mit dem parenteralen Impfstoff zu vergleichen. Die HI-Titer, die mit Blanko 1- und 2-Gruppen beobachtet wurden, waren für zwei der drei Influenzastämme (A/H1N1 und B-Stämme) signifikant anders (p < 0,05) im Vergleich zu denen, die durch den parenteralen Impfstoff induziert wurden. Die Titer des Anti-A/H3N2-Stamms waren nicht signifikant anders. Die L9-Formulierung war genauso immunogen wie der parenterale Impfstoff für zwei aus drei Stämmen (A/H3N2 und B-Stämme). Demgegenüber erzeugte der L9 + MPL-formulierte Impfstoff HI-Antikörper gegen die drei Influenzastämme mit Titern, die sich von denen nicht signifikant unterschieden, die mit dem parenteralen Impfstoff beobachtet wurden.
  • Die zweite Aufgabe war zu bestimmen, ob die nasale IgA-Antwort auf die intranasale Impfung vorteilhafter waren gegenüber der in intramuskulär "geboosteten" Tieren beobachteten. 2 stellt die nasale IgA-Antwort, aufgezeichnet 14 Tage nach der "Booster"-Impfung (Tag 42) dar.
  • Es gab keine signifikanten Unterschiede zwischen den Antworten, die durch jedwede der intranasalen Formulierungen induziert wurden. Die intranasale Verabreichung rufte zwei- bis vierfach höhere Antworten aus gegenüber dem parenteralen Weg. Schließlich war der Impfstoff, formuliert mit L9 + MPL, in der Lage, die Probenniveaus der Antworten im Vergleich zu den anderen intranasalen Impfstoffen aufrechtzuerhalten, jedoch mit einer niedrigeren Antigendosis.
  • Schlußfolgerungen
  • Die mit L9 + MPL formulierten trivalenten Split-Influenzaantigene (0,75 μg HA + 0,5% Laureth 9 + 5 μg MPL) waren die immunogenste intranasale Impfstoffformulierung in bezug auf die HI-Antikörperantwort.
  • Alle nasal übertragenen Impfstoffe, die getestet wurden, waren wirksamer im Induzieren lokaler IgA-Antikörper als der parenteral verabreichte Impfstoff. Die L9 + MPL-Formulierung induzierte eine ähnliche Antwort wie die anderen Formulierungen, jedoch mit einem reduzierten Antigengehalt.
    • 6.2 In einem zweiten Experiment wurden Mäuse intranasal mit Stämmen immunisiert, die zu denen für das "Priming" verwendete verschieden waren. Der Antigen-Drift ist für alljährliche Epidemien verantwortlich. Die Stämme, die jedes Jahr in dem Influenzaimpfstoff eingeschlossen werden, sind solche, die kürzlich gefunden wurden; noch andere Stämme, mehr oder weniger verwandt, können ebenfalls auf dem Gebiet gefunden werden. Als Konsequenz wird der beste Kandidaten-Influenzaimpfstoff einen Schutz gegen einen breiten Bereich von Stämmen zu induzieren haben, um effizient zu sein. Daher war es interessant zu untersuchen, in welchem Ausmaß eine gegebene intranasale Formulierung in der Lage war, eine Immunantwort nach einem "Priming" mit Stämmen hervorzurufen, die homolog zu denen sind, die im Impfstoff enthalten sind.
  • Experimentelles Verfahren
  • Weibliche Balb/c-Mäuse (8 Wochen alt) wurden intranasal am Tag 0 mit β-Propiolacton inaktiviertem Ei-abstammenden trivalenten ganzen Influenzavirus (A/Johannesburg/82/96 H1N1, A/Johannesburg/33/94 H3N2 und B/Panama/45/90: 5 μg HA/Stamm) "geprimt" um das natürliche "Priming" nachzuahmen, das bei Menschen erfolgt.
  • Nach 28 Tagen wurden die Mäuse (10 Tiere pro Gruppe) intranasal mit den folgenden trivalenten Impfstoffformulierungen geimpft (enthaltend A/Beijing/262/95 H1N1, A/Sydney/5/97 H2N2 und B/Harbin/7/94 als heterologe Stämme).
    Gruppe Weg (Verfahren) Trivalente Split-Antigene Zusätzliche Reagentien?
    Blanko 1 Intranasal (Tröpfchen) 3,0 μg HA/Stamm nein
    Blanko 2 Intranasal (Tröpfchen) 1,5 μg HA/Stamm nein
    L9 Intranasal (Tröpfchen) 1,5 μg HA/Stamm 0,5% Laureth 9
    L9 + MPL Intranasal (Tröpfchen) 0,75 μg HA/Stamm 0,5% Laureth 9 + 5 μg MPL
    Parenteral Intramuskulär (Injektion) 1,5 μg HA/Stamm nein
  • Die Mengen an trivalenten Split-Virionen, die in verschiedenen intranasalen Impfstoffformulierungen enthalten sind, die an Mäusen getestet werden, entsprechen erneut 1/10 der Dosis, die in Beispiel 7 an freiwilligen Menschen verabreicht werden.
  • Serumproben wurden am Tag 42 gesammelt und auf Hämagglutinierungs-Inhibierung(HI)-Antikörper getestet. Nach Tötung (Tag 42) wurden Nasenwäschen durchgeführt und durch ELISA auf IgA-Antikörpertiter getestet. Spezifische IgA-Antikörper wurden als Endpunkttiter (EPT) gemessen und die Resultate wurden als spezifischer IgA-EPT pro μg Gesamt-IgA ausgedrückt, um jeden Unterschied aufgrund der Probenentnahme auszuschließen.
  • Resultate
  • Die erste Aufgabe der Untersuchung war zu bestimmten, ob die intranasale Impfstoffformulierungen in der Lage waren, Serum-HI-Antworten gegen Impfstoffantigene hervorzurufen, wenn heterosubtypische Stämme für das "Priming" verwendet werden. 3 zeigt die HI-Titer, die im Serum beobachtet wurden, 14 Tage nach Impfung (Tag 42) mit verschiedenen Impfstoffformulierungen.
  • Alle intranasalen Formulierungen mit L9 oder L9 + MPL waren in der Lage, Immunantworten gegen die drei Influenzastämme gerichtet zu induzieren, die vergleichbar mit denen waren, die durch eine parenterale Verabreichung des Blankoimpfstoffs hervorgerufen wurden. Statistische Analyse (Tukey-HSD-statistischer Vergleichstest) bestätigte, daß Antworten, die durch alle intranasalen Formulierungen hervorgerufen wurden, nicht signifikante (p > 0,05) anders waren als Antworten der parenteralen Verabreichung. Innerhalb der intranasalen Formulierungen wurden keine statistischen Unterschiede beobachtet. Dennoch waren die L9 + MPL- und L9-Formulierungen im allgemeinen immunogener, wobei die ersten die Hälfte des Antigengehalts der letzteren enthielt (0,75 μg gegenüber 1,5 μg HA).
  • Die zweite Aufgabe war zu bestimmen, ob (1) die nasale spezifische IgA-Antwort auf heterologe Stämme nach intranasaler Impfung meßbar waren und, ob (2) diese Antwort vorteilhafter gegenüber der war, die in intramuskulär geimpften Tieren beobachtet wurde. 4 stellt die nasale spezifische anti-heterologe IgA-Antwort dar, die 14 Tage nach Impfung (Tag 42) aufgenommen wurde.
  • Die Kriterien der zweiten Aufgabe wurden beide erfüllt. Alle intranasalen Formulierungen reduzierten IgA-Antworten gegen die zwei heterologen Stämme, die 3- bis 8-fach höher waren als solche, die beobachtet wurden, wenn eine Blankoimpfung intramuskulär injiziert wurde. Die Amplitude der IgA-Antworten war nicht signifikant verschieden innerhalb der intranasalen Formulierung.
  • Die Stärke der Antworten, die mit der heterologen Impfung beobachtet wurden, erreichten den gleichen Bereich wie für homologe Impfung (siehe 2). Erneut war der L9 + MPL-formulierte Impfstoff in der Lage, die gleiche Amplitude der Antwort aufrechtzuerhalten, mit einer niedrigeren Dosis an Antigen (0,75 μg HA) im Vergleich zu den Blanko- oder L9-Formulierungen (3 und 1,5 μg HA).
  • Schlußfolgerungen
  • Intranasale Verabreichung des trivalenten Split-Influenzaimpfstoffs, mit oder ohne Absorptions-steigernden Tensid oder Hilfsstoffzugabe, war in der Lage, heterosubtypische Antworten sowohl in bezug auf Serum-HI-Antikörper als auch auf für die Impfstoff-Influenzastämme spezifischen intranasalen IgAs.
  • Obwohl die Unterschiede zwischen Gruppe nicht statistisch signifikant waren, induzieren Impfstoffe, bei denen die trivalenten Split-Virionen mit L9 oder L9 + MPL formuliert waren, induzierten im allgemeinen eine wirksamere Systemik als auch eine lokale Immunantwort. Zusätzlich induzierte der mit L9 + MPL formulierte Impfstoff das gleiche Immuntestniveau im Vergleich zu dem L9-haltigen Impfstoff, jedoch mit einer niedrigeren Antigendosierung.
  • Beispiel 7 – Evaluierung eines intranasal verabreichten Ei-abstammenden trivalenten Split-Virionen-Influenzaimpfstoff mit oder ohne Laureth 9 oder Laureth 9 + 3D-MPL, verabreicht gemäß eines Eindosis-Schemas im Vergleich zu einem intramuskulär verabreichten trivalenten Split-Virionen-Influenzaimpfstoffs in gesunden Erwachsenen im Alter von 18–40 Jahren.
  • In dieser Untersuchung werden die lokalen Schleimhaut- und systemischen Immunantworten auf die Impfstoffe in ca. 120 gesunden männlichen und weiblichen Probanden beurteilt.
  • Zusammensetzung der Kandidatenimpfstoffe
  • 5 Formulierungen der Ei-abstammenden Split-Influenzaantigene wurden in dieser Untersuchung beurteilt. Die Kandidatenimpfstoffe werden intranasal verabreicht. Zusätzlich wird FluarixTM, ein intramuskulär verabreichter inaktiverter Split-Virion-Influenzaimpfstoff von SmithKline Beecham Biologicals, als ein Komparator verwendet.
  • Die intranasalen Kandidatenimpfstoffe enthalten die drei inaktivierten Split-Virionen-Antigene, die in der Formulierung von FluarixTM verwendet werden. Die Stämme sind die, die durch die WHO für die Saison 2000 für die südliche Halbkugel vorgeschlagen worden sind. Eine allgemeine Beschreibung der verschiedenen Formulierungen ist in Tabelle 6 dargelegt.
    Tabelle 6: Allgemeine Beschreibung der Impfstoffe Verabreichung Antigen pro Dosis (μg HA/Stamm) Zusätzliches Reagens
    intranasal 30 μg nein
    intranasal 15 μg nein
    intranasal 15 μg Laureth 9
    intranasal 7,5 μg Laureth 9
    intranasal 7,5 μg Laureth-9 + 3D-MPL
    intramuskulär 15 μg nein
  • Intranasale trivalente Split-Influenzaimpfstoffe ohne L9 oder MPL (30 μg-Dosis und 15 μg-Dosis)
  • Das Volumen einer Dosis ist 0,2 ml. Tabelle 7:
    Komponente Menge pro Dosis*
    Inaktivierte Split-Virione
    – A/New Caledonia/20/99 (H1N1) 30 oder 15 μg HA
    – A/Sydney/5/97 (H3N2) 30 oder 15 μg HA
    – B/Yamanashi/166/98 30 oder 15 μg HA
    Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung
    (pH 7,0–7,4)
    – Wasserfreies dibasisches Natriumphosphat 8,10 mM
    – Monobasisches Kaliumphosphat 1,47 mM
    – Kaliumchlorid 2,70 mM
    – Natriumchlorid 137 mM
    Triton X100 0,02%
    Tween 80 0,15%
    Wasser für Injektion q. s. ad 0,2 ml
    Rückständiges Thiomersal > 2 μg
    • * Jedes Intranasalfläschchen enthält einen 20%igen Volumenüberschuß.
  • Intranasale trivalente Split-Influenzaimpfstoffe formuliert mit L9 (15 μg-Dosis und 7,5 μg-Dosis)
  • Das Volumen einer Dosis ist 0,2 ml. Die Formulierung ist wie in Tabelle 7 gezeigt und schließt ferner 1 mg an Laureth 9 pro Dosis zusammen mit einer 15 oder 7,5 μg-Dosis an HA pro Stamm ein. Laureth 9 ist von Kreussler, Deutschland, erhältlich.
  • Intranasaler Split-Influenzaimpfstoff, formuliert mit L9 + 3D-MPL (7,5 μg-Dosis)
  • Das Volumen einer Dosis ist 0,2 ml. Die Formulierung ist wie in Tabelle 7 gezeigt und schließt ferner 1 mg an Laureth 9 und 50 μg an 3D-MPL pro Dosis zusammen mit einer Dosis von 7,5 μg HA pro Stamm ein.
  • Der kommerzielle inaktivierte trivalente FluarixTM-Split-Influenzaimpfstoff, verwendet als Komperator
  • FluarixTM 2000 (südliche Hemisphäre) wird als Komperator verwendet. Dieser 0,5 ml-Dosisimpfstoff wird intramuskulär verabreicht.
  • Eine Dosis enthält 15 μg Hämagglutinin von jedem Influenzavirusstamm (A/New Caldeonia/20/99 (H1N1) – A/Sydney/5/97 (H2N2) – B/Yamanashi/166/98) und 50 μg an Thiomersal als Konservierungsmittel pro Dosis.
  • Formulierung der trivalenten Split-Influenza-Kandidatenimpfstoffe
  • 1. Aufkonzentration der drei inaktivierten Split-Virionen
  • Vor Formulierung der endgültigen Kandidatenimpfstoffe wurden drei inaktivierte Split-Virionen separat durch tangentiale Flußfiltration auf 1000 bis 1500 μg an HA pro ml aufkonzentriert. Membrankassetten, ausgestattet mit einer Cellulosetriacetat-Membran mit einem Ausschluß von 10 kDa, wurden verwendet.
  • 2. Formulierung der trivalenten Split-Influenzaimpfstoffe
  • Das Formulierungsflußdiagramm ist nachfolgend dargestellt:
    Figure 00410001
  • Für die Laureth 9-haltigen Formulierungen wird Laureth 9 auf 0,5% kurz vor der pH-Einstellung hinzugegeben und Rühren wird bei Raumtemperatur für 15 Minuten fortgeführt.
  • Für die Laureth 9 + 3D-MPL-haltigen Formulierungen wird 250 μg/ml 3D-MPL kurz vor der Zugabe von Laureth 9 hinzugegeben und die Formulierung für 15 Minuten, bevor das Laureth 9 hinzugegeben wird, gerührt.
  • Abfüllen der trivalenten Split-Influenza-Kandidatenimpfstoffe
  • Die Endmassen werden aseptisch in Typ-1 (Ph. Eur.)-Glasfläschchen von Pfeiffer (Deutschland) gefüllt. Sofort nach Abfüllen werden die Fläschchen mit einem Gummistopfen geschlossen. Alle Arbeitsgänge werden in einem aseptischen Raum (laminares Flußsystem) durchgeführt.
  • Nach Abfüllen und Schließen werden die verstopften Fläschchen in einen Plastikloben eingeführt und in eine sprühende Düsenvorrichtung zum Erzeugen einer Gischt montiert. Diese Vorrichtung ermöglicht die Verabreichung von zwei Gischten von 100 μl.
  • Resultate
  • Für alle Probanden wird die folgende Analyse durchgeführt:
    • 1. An den Tagen 0, 21 und 42: Schleimhaut-IgA (lokale Immunantwort)-ELISA-Titer, separat gegen jeden der drei im Impfstoff vertretenen Stämmen von Influenza getestet.
    • 2. An Tagen 0, 21 und 42: Serum-Hämagglutinierungs-Inhibierung(HI)-Antikörpertiter, separat gegen jeden der drei Influenzastämme getestet.
  • Abgeleitet von diesen:
    • 1. Serum HI-Antikörper-GMTs (mit 95% Vertrauensbereich) zu allen Zeitpunkten.
    • 2. Für HI: Serokonversionsraten am Tag 21.
    • 3. Für HI: Konversionsfaktoren am Tag 21.
    • 4. Für HI: Protektionsraten an Tagen 21 und 42.
    • 5. Für IgA alleine: Prozentsatz der Probanden, die einen 2-fachen und 4-fachen Anstieg in den IgA-Titern vom Tag 0 bis Tag 21 und Tag 0 bis Tag 42 haben.

Claims (25)

  1. Verwendung einer nicht-lebenden Split-Influenzavirus-Antigenzubereitung bei der Herstellung einer Impfstoffformulierung für eine intranasale Einzeldosisimpfung gegen Influenza, worin die Einzeldosisimpfung wenigstens zwei der folgenden Kriterien für den oder alle im Impfstoff vorkommenden Stämme von Influenza erreicht: (i) eine Serokonversionsrate von größer als oder gleich 40% für eine Population erwachsener Menschen (18–60 Jahre) oder 30% in einer Population älterer Menschen (> 60 Jahre); (ii) eine Seroprotektionsrate von größer als oder gleich 70% für eine Population erwachsener Menschen (18–60 Jahre) oder 60% in einer Population älterer Menschen (> 60 Jahre); und (iii) ein Konversionsfaktor von größer als oder gleich 2,5 für eine Population erwachsener Menschen (18–60 Jahre) oder 2,0 in einer Population älterer Menschen (> 60 Jahre).
  2. Verwendung gemäß Anspruch 1, worin alle drei der Kriterien der Europäischen Union, wie in Anspruch 1 dargelegt, für den oder alle im Impfstoff vertretenen Stämme von Influenza erfüllt sind.
  3. Verwendung gemäß Anspruch 1 oder 2, worin die Formulierung wenigstens ein Tensid umfaßt.
  4. Verwendung gemäß Anspruch 3, worin das Tensid wenigstens ein nicht-ionisches Tensid ist, das aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus folgenden besteht: Octylphenoxypolyethoxyethanole (zum Beispiel aus der kommerziell erhältlichen TritonTM-Reihe), Polyoxyethylensorbitanester (TweenTM-Reihe) und Polyoxyethylenether oder -ester der allgemeinen Formel (I): HO(CH2CH2O)n-A-R (I)worin n 1 bis 50 ist, A eine Bindung oder -C(O)- ist, R C1-50-Alkyl oder Phenyl-C1-50-alkyl ist, und Kombinationen aus zwei oder mehreren daraus.
  5. Verwendung gemäß Anspruch 4, worin das nicht-ionische Tensid wenigstens ein Tensid ist, das aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus t-Octylphenoxypolyethoxyethanol (Triton X-100), Polyoxyethylensorbitan monooleat (Tween 80) und Laureth 9 besteht, oder eine Kombination von zwei oder mehreren daraus ist.
  6. Verwendung gemäß Anspruch 5, worin der Impfstoff eine Kombination von zwei der drei nicht-ionischen Tenside umfaßt, nämlich Polyoxyethylensorbitanmonooleat (Tween 80) und t-Octylphenoxypolyethoxyethanol (Triton X-100).
  7. Verwendung gemäß Anspruch 6, worin der Impfstoff eine Kombination von allen der drei nicht-ionischen Tenside umfaßt.
  8. Verwendung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 7, worin der Impfstoff ferner eine Gallensäure oder Cholsäure oder ein Derivat davon, wie Natriumdesoxycholat, umfaßt.
  9. Verwendung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 8, worin jede Dosis der Impfstoffformulierung eine niedrige Dosis an Hämagglutinin enthält.
  10. Verwendung gemäß Anspruch 9, worin der Hämagglutinin-Gehalt pro Influenzastamm 30 μg oder weniger pro Dosis ist.
  11. Verwendung gemäß Anspruch 10, worin der Hämagglutinin-Gehalt pro Influenzastamm 15 μg oder weniger pro Dosis ist.
  12. Verwendung gemäß Anspruch 11, worin der Hämagglutinin-Gehalt 7,5 μg oder weniger an Hämagglutinin pro Virusstamm pro Impfstoffdosis ist.
  13. Verwendung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 12, worin die Impfstoffformulierung in einem Volumen pro Dosis ist, das weniger als 500 μl ist.
  14. Verwendung gemäß Anspruch 13, worin das Volumen pro Dosis weniger als 300 μl oder nicht mehr als 200 μl pro Dosis ist.
  15. Verwendung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 14, worin der Impfstoff in einem Bi-Dosisformat von zwei Unterdosen zugeführt wird.
  16. Verwendung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 15, worin der Impfstoff kein zugegebenes Immunstimulans enthält.
  17. Verwendung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 16, worin der Impfstoff ferner ein nicht-toxisches Derivat von Lipid A umfaßt, das vorzugsweise ausgewählt ist aus nicht-toxischen Derivaten von Monophosphoryl-Lipid A oder Diphosphoryl-Lipid A.
  18. Verwendung gemäß Anspruch 17, worin der Impfstoff 3-des-O-acyliertes Monophosphoryl-Lipid A (3D-MPL) umfaßt.
  19. Verwendung gemäß Anspruch 18, worin der Impfstoff 3-des-O-acyliertes Monophosphoryl-Lipid A (3D-MPL) und Laureth 9 umfaßt.
  20. Pharmazeutisches Kit, das eine intranasale Zuführungsvorrichtung und einen Einzeldosisimpfstoff umfaßt, der eine nicht-lebende Split- Influenzavirus-Antigenzubereitung ohne ein zugegebenes Immunstimulans umfaßt, wobei der Impfstoff eine Immunantwort erzeugt, die wenigstens zwei der Kriterien, die in Anspruch 1 dargelegt sind, für den oder alle im Impfstoff vorliegenden Stämme von Influenza erreicht.
  21. Pharmazeutisches Kit, das eine intranasale Zuführungsvorrichtung und einen Einzeldosis-Split-Influenza-Impfstoff umfaßt, der eine Immunantwort erzeugt, die wenigstens zwei der Kriterien, die in Anspruch 1 dargelegt sind, für den oder alle im Impfstoff vorliegenden Stämme von Influenza erreicht.
  22. Pharmazeutisches Kit, das eine intranasale Zuführungsvorrichtung und einen Einzeldosisimpfstoff umfaßt, der eine niedrige HA-Dosis einer nicht-lebenden Split-Influenzavirus-Antigenzubereitung umfaßt, die eine Immunantwort erzeugt, die wenigstens zwei der Kriterien, die in Anspruch 1 dargelegt sind, für den oder alle im Impfstoff vorliegenden Stämme von Influenza erreicht.
  23. Pharmazeutisches Kit gemäß einem der Ansprüche 20 bis 22, worin die Vorrichtung eine Vorrichtung zur Bi-Dosiszuführung für die Zuführung von zwei Unterdosen in einer einzelnen Verabreichung ist.
  24. Pharmazeutisches Kit gemäß einem der Ansprüche 20 bis 23, worin die Vorrichtung eine intranasale Sprühvorrichtung ist.
  25. Verfahren zur Herstellung eines Einzeldosis-Influenzaimpfstoffs für die nasale Anwendung, wobei das Verfahren folgendes umfaßt: (i) Bereitstellen einer Split-Influenzavirus-Zubereitung, die im wesentlichen wie für einen herkömmlich injizierten Influenzaimpfstoff hergestellt wurde und wenigstens ein nicht-ionisches Tensid umfaßt; (ii) optionales Einstellen der Konzentration des Hämagglutinins und/oder der Konzentration des nicht-ionischen Tensids in der Zubereitung; (iii) Befüllen einer intranasalen Zuführungsvorrichtung mit einer Impfstoffdosis der Split-Influenzavirus-Zubereitung, wobei die Dosis ein geeignetes Volumen für die intranasale Verabreichung, gegebenenfalls in einem Bi-Dosisformat, ist, und wobei die Einzeldosisanwendung eine Immunantwort erzeugt, die wenigstens zwei der Kriterien, wie in Anspruch 1 dargelegt, für den oder alle im Impfstoff vorliegenden Influenzastämme erreicht.
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