ES2293923T3 - Vacuna intranasal contra el virus influenza. - Google Patents

Vacuna intranasal contra el virus influenza. Download PDF

Info

Publication number
ES2293923T3
ES2293923T3 ES00967781T ES00967781T ES2293923T3 ES 2293923 T3 ES2293923 T3 ES 2293923T3 ES 00967781 T ES00967781 T ES 00967781T ES 00967781 T ES00967781 T ES 00967781T ES 2293923 T3 ES2293923 T3 ES 2293923T3
Authority
ES
Spain
Prior art keywords
vaccine
dose
use according
fragmented
intranasal
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Lifetime
Application number
ES00967781T
Other languages
English (en)
Inventor
Martin Smithkline Beecham Biologicals S.A. Friede
Veronique SmithKline Beecham Bio. s.a HENDERICKX
Philippe SmithKline Beecham Bio. s.a. HERMAND
Moncef Mohamed SmithKline Beecham Bio. s.a SLAOUI
Stefan G.J. Smithkline Beecham Bio. S.A. Thoelen
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
GlaxoSmithKline Biologicals SA
Original Assignee
GlaxoSmithKline Biologicals SA
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from GBGB9922703.5A external-priority patent/GB9922703D0/en
Priority claimed from GBGB9922700.1A external-priority patent/GB9922700D0/en
Priority claimed from GB0016686A external-priority patent/GB0016686D0/en
Application filed by GlaxoSmithKline Biologicals SA filed Critical GlaxoSmithKline Biologicals SA
Application granted granted Critical
Publication of ES2293923T3 publication Critical patent/ES2293923T3/es
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Lifetime legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/39—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the immunostimulating additives, e.g. chemical adjuvants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A61K39/145—Orthomyxoviridae, e.g. influenza virus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
    • A61K47/26—Carbohydrates, e.g. sugar alcohols, amino sugars, nucleic acids, mono-, di- or oligo-saccharides; Derivatives thereof, e.g. polysorbates, sorbitan fatty acid esters or glycyrrhizin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/30—Macromolecular organic or inorganic compounds, e.g. inorganic polyphosphates
    • A61K47/34—Macromolecular compounds obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyesters, polyamino acids, polysiloxanes, polyphosphazines, copolymers of polyalkylene glycol or poloxamers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0043—Nose
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/16—Antivirals for RNA viruses for influenza or rhinoviruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/525—Virus
    • A61K2039/5252—Virus inactivated (killed)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/54—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the route of administration
    • A61K2039/541—Mucosal route
    • A61K2039/543—Mucosal route intranasal
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A61K2039/55555—Liposomes; Vesicles, e.g. nanoparticles; Spheres, e.g. nanospheres; Polymers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A61K2039/55572—Lipopolysaccharides; Lipid A; Monophosphoryl lipid A
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A61K2039/55577—Saponins; Quil A; QS21; ISCOMS
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/58—Medicinal preparations containing antigens or antibodies raising an immune response against a target which is not the antigen used for immunisation
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/70—Multivalent vaccine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16111—Influenzavirus A, i.e. influenza A virus
    • C12N2760/16134—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16211—Influenzavirus B, i.e. influenza B virus
    • C12N2760/16234—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Inorganic Chemistry (AREA)
  • Otolaryngology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Oil, Petroleum & Natural Gas (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)

Abstract

El uso de una preparación de antígeno del virus influenza fragmentado muerto en la fabricación de una formulación de vacuna para una vacunación intranasal de una dosis contra la gripe, en el que la vacunación de una dosis logra al menos dos de los siguientes criterios para la o todas las cepas de virus influenza presentes en la vacuna: (i) una tasa de seroconversión superior o igual al 40% para una población adulta humana (18-60 años) o al 30% en una población anciana humana (> 60 años); (ii) una tasa de seroprotección superior o igual al 70% para una población adulta humana (18-60 años) o al 60% en una población anciana humana (> 60 años); y (iii) un factor de conversión superior o igual a 2, 5 para una población adulta humana (18-60 años) o a 2, 0 en una población anciana humana (> 60 años).

Description

Vacuna intranasal contra el virus influenza.
Esta invención se refiere a formulaciones novedosas de vacuna contra el virus influenza fragmentado muerto, procedimientos para prepararlas y su uso en la profilaxis o tratamiento. En particular, la invención se refiere a vacunas para la administración a la mucosa, más particularmente para la administración nasal. Más particularmente, la invención se refiere al uso de vacunas contra la gripe fragmentadas muertas que pueden administrarse por vía intranasal en una única dosis para lograr una respuesta inmunitaria suficiente para cumplir con los requisitos normativos.
El virus influenza es uno de los virus más ubicuos presentes en el mundo, que afecta tanto a seres humanos como al ganado. El impacto económico de la gripe es significativo.
El virus influenza es un virus con envuelta de ARN con un tamaño de partícula de aproximadamente 125 nm de diámetro. Está constituido básicamente por un núcleo o nucleocápside interna de ácido ribonucleico (ARN) asociado con nucleoproteína, rodeado por una envuelta viral con una estructura de bicapa lipídica y glucoproteínas externas. La capa interna de la envuelta viral está compuesta predominantemente por proteínas de la matriz y la capa externa mayoritariamente por el material lipídico derivado del huésped. Las glucoproteínas de superficie neuraminidasa (NA) y hemaglutinina (HA) aparecen como espículas, de 10 a 12 nm de longitud, en la superficie de las partículas. Son estas proteínas de superficie, particularmente la hemaglutinina, las que determinan la especificidad antigénica de los subtipos de la gripe.
Las epidemias de gripe típicas provocan aumentos en la incidencia de neumonía y enfermedad de las vías respiratorias bajas tal como se atestigua mediante un aumento de las tasas de hospitalización o la mortalidad. Los ancianos o aquellas personas con enfermedades crónicas subyacentes son los que más posibilidades tienen de experimentar tales complicaciones, pero los lactantes de corta edad también pueden padecer enfermedad grave. Por tanto, estos grupos en particular necesitan protegerse.
Las vacunas contra la gripe disponibles actualmente son vacunas contra la gripe inactivadas o bien atenuadas vivas. Las vacunas contra la gripe inactivadas están compuestas por tres tipos de preparación de antígeno: virus entero inactivado, sub-viriones en los que partículas de virus purificadas se rompen con detergentes u otros reactivos para solubilizar la envuelta lipídica (denominadas vacuna "fragmentada") o HA y NA purificadas (vacuna de subunidades). Estas vacunas inactivadas se administran por vía intramuscular (i.m.).
Las vacunas contra la gripe, de todas las clases, son habitualmente vacunas trivalentes. Generalmente contienen antígenos derivados de dos cepas de virus influenza A y una cepa de virus influenza B. Una dosis inyectable convencional de 0,5 ml contiene en la mayoría de los casos 15 \mug de componente de antígeno hemaglutinina de cada cepa, según se mide mediante inmunodifusión radial simple (SRD) (J. M. Wood et al.: An improved single radial immunodiffusion technique for the assay of influenza haemagglutinin antigen: adaptation for potency determination of inactivated whole virus and subunit vaccines. J. Biol. Stand. 5 (1977) 237-247; J. M. Wood et al., International collaborative study of single radial diffusion and immunoelectrophoresis techniques for the assay of haemagglutinin antigen of virus influenza. J. Biol. Stand. 9 (1981) 317-330).
Las cepas del virus influenza que deben incorporarse en una vacuna contra la gripe cada temporada se determinan por la Organización Mundial de la Salud en colaboración con las autoridades sanitarias nacionales y fabricantes de vacunas.
Los esfuerzos actuales para controlar la morbimortalidad asociada con las epidemias anuales de gripe se basan en el uso de vacunas contra la gripe inactivadas administradas por vía intramuscular. La eficacia de tales vacunas para prevenir enfermedades respiratorias y complicaciones producidas por la gripe oscila entre el 75% en adultos sanos y menos del 50% en los ancianos.
Los virus influenza, al igual que muchos patógenos, invaden las superficies mucosas, inicialmente en el tracto respiratorio superior. La inmunidad mucosa constituye la primera línea de defensa para el huésped y es un componente principal de la respuesta inmunitaria en las fosas nasales y en las vías respiratorias del tracto respiratorio inferior. Aunque las vacunas contra la gripe inyectables actualmente usadas estimulan IgG sérica específica de HA en la mayoría de los individuos sanos, sólo se produce un aumento significativo de anticuerpo IgA nasal específica de HA en una minoría de los sujetos vacunados. Las vacunas contra la gripe mejoradas con una mejor inmunogenicidad y eficacia clínica necesitan dirigirse a respuestas de anticuerpos tanto locales como sistémicos.
La exposición experimental intranasal de seres humanos a vacunas contra la gripe inactivadas se remontan a los años 1940 (véase la revisión en Eyles et al. 2000 BioDrugs 13 (1): 35-59). Aunque hubo un resurgir del interés sobre el uso de virus inactivados para la inmunización i.n. en los años 1960 y 70, la mayor parte de la atención en el campo intranasal se ha dirigido al enfoque atenuado vivo.
Administradas por vía intranasal, las vacunas contra la gripe atenuadas vivas, por ejemplo vacunas adaptadas al frío, ofrecen una inmunidad mucosa mejorada, con resultados prometedores particularmente en los niños. Sin embargo, hasta ahora este enfoque no ha conseguido una aceptación mundial.
Por tanto, la mayor parte de las vacunas contra la gripe disponibles comercialmente son vacunas fragmentadas o bien inyectables de subunidades. Estas vacunas se preparan rompiendo la partícula viral, generalmente con un disolvente orgánico o un detergente, y separando o purificando las proteínas virales en diversos grados. Las vacunas fragmentadas se preparan mediante fragmentación de virus influenza entero, infeccioso o bien inactivado, con concentraciones solubilizantes de disolventes orgánicos o detergentes y posterior eliminación del agente de solubilización y cierta cantidad o la mayor parte del material lipídico viral. Las vacunas fragmentadas contienen generalmente proteína de la matriz y nucleoproteína y algunas veces lípidos contaminantes, así como proteínas de envuelta de membrana. Las vacunas fragmentadas contienen habitualmente la mayor parte de, o todas, las proteínas estructurales virales aunque no necesariamente en las mismas proporciones en las que se producen en el virus entero. Por otra parte, las vacunas de subunidades están constituidas esencialmente por las proteínas de la superficie viral altamente purificadas, hemaglutinina y neuraminidasa, que son las proteínas de superficie responsables de provocar los anticuerpos neutralizantes frente al virus deseados al vacunarse.
Más recientemente, se han combinado vacunas contra la gripe fragmentadas mejor caracterizadas, más altamente purificadas, con adyuvantes en un intento por mejorar la inmunogenicidad en adultos y personas ancianas. A pesar de los aumentos significativos en las respuestas inmunitarias en ratones, varios enfoques que usan adyuvantes de nueva generación no han demostrado que sea posible confirmarlo en el hombre.
Se aplican normas mundialmente para medir la eficacia de las vacunas contra la gripe. Los criterios oficiales de la Unión Europea para una vacuna contra la gripe eficaz se exponen en la tabla siguiente. Teóricamente, para cumplir con los requisitos de la Unión Europea, una vacuna contra la gripe sólo tiene que cumplir uno de los criterios en la tabla, para todas las cepas de virus influenza incluidas en la vacuna. Sin embargo, en la práctica es necesario cumplir al menos dos o los tres criterios para todas las cepas, particularmente para una nueva vacuna tal como una nueva vacuna intranasal. En algunas circunstancias, dos criterios pueden ser suficientes. Por ejemplo, puede ser aceptable cumplir dos de los tres criterios por todas las cepas mientras que el tercer criterio se cumple por algunas pero no todas las cepas (por ejemplo dos de tres cepas). Los requisitos son diferentes para poblaciones adultas (18-60 años) y poblaciones ancianas (> 60 años).
\vskip1.000000\baselineskip
1
Para que la vacuna intranasal contra la gripe sea comercialmente útil no sólo es necesario que cumpla estas normas, sino que en la práctica también será necesario que sea al menos tan eficaz como las vacunas inyectables disponibles actualmente. También será necesario que sea comercialmente viable en cuanto a la cantidad de antígeno y el número de administraciones requeridas.
Las vacunas intranasales contra la gripe basadas en virus inactivado que se han estudiado durante las últimas décadas no han cumplido estos criterios.
Fulk et al. 1969 (J. Immunol. 102, 1102-5) compararon la administración intranasal (gotas nasales más nebulización) de virus influenza muerto con la administración subcutánea (s.c.) en pacientes ancianos. Mientras que el 56% de los pacientes que recibieron la administración s.c. mostraron un aumento de 4 veces en los títulos de anticuerpos (HI), el aumento correspondiente sólo se observó en el 25% de aquéllos que recibieron una administración intranasal. Dos administraciones intranasales dieron como resultado una seroconversión del 75%.
Gluck et al. 1999 (J. Virol. 73, 7780-6) demostraron que se requirieron dos inoculaciones intranasales consecutivas administradas mediante una pulverización que contenía potentes adyuvantes mucosos (toxina termolábil de E. Coli, HLT) para inducir la seroconversión (aumento de 4 veces en la respuesta humoral de anticuerpos) comparable a una administración intramuscular. Una única administración intranasal de 15 \mug de HA por cepa en presencia de adyuvante, o incluso dos administraciones en ausencia de adyuvante no pudieron proporcionar una seroconversión equivalente. El antígeno del virus influenza estaba en forma de virosomas, bicapas lipídicas reconstituidas producidas usando fosfatidilcolina y proteínas de superficie virales extraídas de virus influenza derivado de huevos.
El concepto de usar dos o más administraciones intranasales con el fin de intentar lograr niveles superiores de seroconversión también se ha usado por otros investigadores. Petrescu et al. (1979. Rev. Rom. Med-Virol. 30, 109-115) administraron virus inactivado (1000 unidades internacionales por dosis de vacunación) por vía intranasal dos veces a lo largo de un periodo de dos semanas. Oh et al. (1992 Vaccine 10, 506-11) administraron una vacuna fragmentada en forma de pulverización nasal cuatro veces a intervalos semanales, 15 \mug de HA por cepa en cada administración (0,25 ml por orificio nasal en cada ocasión). Kuno-Sakai et al. (1994. Vaccine 12,1303-1310) administraron, dos veces en un intervalo de 1 semana, vacuna inactivada en aerosol con tres veces la concentración de virus influenza fragmentado comercialmente disponible.
Los documentos WO 96/33738 y RU 2 086 232 dan a conocer composiciones de virus influenza inactivado que pueden ser adecuadas para la administración intranasal.
Recientemente, Muszkat et al. (2000 Vaccine 18, 1696-9) administraron dos inmunizaciones intranasales con virus de la gripe inactivado entero (20 \mug de una cepa A y una B cepa y 40 \mug de otra cepa A, por dosis) pacientes ancianos y observaron la menor seroconversión sistémica para la administración intranasal que para la inyección intramuscular de una dosis convencional de una vacuna contra la gripe fragmentada inactivada dividida.
Por tanto, la bibliografía que abarca de 1969 a 2000 muestra que aunque la vacunación intranasal con vacuna contra la gripe inactivada se ha investigado ampliamente, ningún grupo ha podido lograr una seroconversión sistémica equivalente a la inyección intramuscular o subcutánea administrando una única dosis de vacuna por vía nasal. Además, con el fin de lograr un efecto con múltiples administraciones de vacuna a lo largo del tiempo, las dosis de antígeno usadas han sido considerablemente superiores a la dosis convencional habitual de 15 \mug de HA por cepa para cada persona vacunada. De hecho los datos apuntan hacia una necesidad de múltiples administraciones, y preferiblemente en presencia de fuertes inmunoestimulantes tales como HLT de E. coli.
Kimura et al. (1988. Acta Paediatr Jpn. 30, 601-3) demostraron que la administración de dos dosis de virus influenza inactivado mediante un nebulizador era eficaz como administración s.c. única, pero la administración de las dos dosis mediante pulverización intranasal era mucho menos eficaz. La nebulización genera una pulverización muy fina que alcanza los pulmones. Por tanto, también hay una indicación en los ensayos clínicos publicados de que una pulverización nasal puede no ser eficaz, y que la nebulización puede ser mejor.
La bibliografía indica además la necesidad de adyuvantes potentes, más específicamente inmunoestimulantes potentes en vacunas intranasales.
Por ejemplo, Gluck et al. (citado anteriormente) demostraron que la administración intranasal de vacuna contra la gripe en ausencia de un inmunoestimulante es significativamente menos eficaz que en presencia de un inmunoestimulante. Los autores muestran que incluso dos administraciones intranasales de vacuna que carece de inmunoestimulante no pueden inducir la misma seroconversión lograda por la administración subcutánea.
Hashigucci et al. 1996 (Vaccine 14, 113-9) demostraron que dos administraciones intranasales, separadas cuatro semanas, de una vacuna contra la gripe fragmentada con una mezcla de toxina termolábil de E. coli y su subunidad B (LTB) como adyuvante dio como resultado una tasa de seroconversión del 50%. En ausencia de adyuvante sólo se obtuvo una seroconversión del 31%. Normalmente la administración s.c. da como resultado una seroconversión del 75-90%.
Por tanto, la bibliografía indica claramente que con el fin de lograr una seroconversión sistémica equivalente a la obtenida con las vacunas contra la gripe convencionales, se requiere más de una administración, y además la vacuna debe tener como adyuvante una toxina.
Ahora se ha descubierto que puede usarse antígeno del virus influenza fragmentado muerto en una vacuna intranasal contra la gripe comercialmente viable. En particular, una única administración de una preparación de vacuna contra el virus influenza estimula la inmunidad sistémica a un nivel de protección. Además, esto cumple los criterios internacionales para una vacuna contra la gripe eficaz. Más específicamente, la administración intranasal de una preparación de antígeno del virus influenza muerto puede producir una seroconversión sistémica (aumento de 4 veces de los títulos anti-HA) equivalente a la obtenida mediante la administración s.c. de la misma vacuna. Sorprendentemente, el antígeno del virus influenza puede proporcionarse en una dosis significativamente inferior por persona vacunada de lo indicado en la técnica anterior.
Anteriormente, no se ha notificado una única administración nasal de dosis convencional de virus influenza fragmentado inactivado que dé como resultado una seroconversión equivalente a la obtenida mediante inyección.
La invención proporciona por primera vez una vacuna contra la gripe fragmentada de administración única para la administración intranasal. La vacuna cumple al menos dos o todos los criterios de la UE para vacunas contra la gripe según lo expuesto en la tabla anteriormente en el presente documento para la o todas las cepas de virus influenza representadas en la vacuna, de tal manera que la vacuna puede aprobarse en Europa como una vacuna comercial de una dosis. Más preferiblemente, se cumplen al menos dos criterios para todas las cepas y el tercer criterio se cumple por todas las cepas o al menos por todas salvo una de las cepas. Lo más preferiblemente, todas las cepas cumplen los tres criterios.
Por tanto, la invención proporciona en un aspecto el uso de una preparación de antígeno del virus influenza fragmentado muerto en la fabricación de una formulación de vacuna para una vacunación nasal de una dosis contra la gripe en el que la vacunación de una dosis logra un efecto según la reivindicación 1. La vacuna puede administrarse en un formato de monodosis o un formato de bidosis (generalmente una subdosis para cada orificio nasal).
La invención proporciona en otro aspecto el uso de una dosis baja de material antígeno del virus influenza fragmentado muerto en la fabricación de una vacuna mucosa para la inmunización frente a la gripe.
Preferiblemente, la preparación de antígeno del virus influenza fragmentado muerto contiene al menos un tensioactivo que puede ser en particular un tensioactivo no iónico. Preferiblemente, el tensioactivo no iónico es al menos un tensioactivo seleccionado del grupo constituido por octil- o nonilfenoxipolioxietanoles (por ejemplo la serie Triton^{TM} comercialmente disponible), ésteres de polioxietilenosorbitano (serie Tween^{TM}) y ésteres o éteres de polioxietileno de fórmula general (I):
(I)HO(CH_{2}CH_{2}O)_{n}-A-R
en la que n es 1-50, A es un enlace o -C(O)-, R es alquilo C_{1-50} o fenilalquilo C_{1-50}; y combinaciones de dos o más de éstos.
Los tensioactivos preferidos que se encuentran dentro de la fórmula (I) son moléculas en las que n es 4-24, más preferiblemente 6-12, y lo más preferiblemente 9; el componente R es C_{1-50}, preferiblemente alquilo C_{4}-C_{20} y lo más preferiblemente alquilo C_{12}.
Los octilfenoxipolioxietanoles y ésteres de polioxietilenosorbitano se describen en "Surfactant systems" Eds: Attwood and Florence (1983, Chapman and Hall). También se describen los octilfenoxipolioxietanoles (los octoxinoles), incluyendo t-octilfenoxipolietoxietanol (Triton X-100^{TM}) en la entrada 6858 del Merck Index (página 1162. 12ª edición, Merck & Co. Inc., Whitehouse Station. N.J., EE.UU.; ISBN 0911910-12-3). Los ésteres de polioxietilenosorbitano, incluyendo monooleato de polioxietilenosorbitano (Tween 80^{TM}) se describen en la entrada 7742 del Merck Index (página 1308, 12ª edición, Merck & Co. Inc., Whitehouse Station, N.J., EE.UU.; ISBN 0911910-12-3). Ambos pueden fabricarse usando procedimientos descritos en los mismos, o adquirirse de fuentes comerciales tales como Sigma Inc.
Los tensioactivos no iónicos particularmente preferidos incluyen Triton X-45, t-octilfenoxipolietoxietanol (Triton X-100), Triton X-102, Triton X-114, Triton X-165, Triton X-205, Triton X-305, Triton N-57, Triton N-101, Triton N-128, Breij 35, lauril éter de polioxietileno 9 (Laureth 9) y estearil éter de polioxietileno 9 (Steareth 9). Se prefieren particularmente Triton X-100 y Laureth 9. También se prefiere particularmente el éster de polioxietilenosorbitano, monooleato de polioxietilenosorbitano (Tween 80^{TM}).
Otros éteres de polioxietileno adecuados de fórmula general (I) se seleccionan del siguiente grupo: estearil éter de polioxietileno 8, lauril éter de polioxietileno 4, lauril éter de polioxietileno 35 y lauril éter de polioxietileno 23.
En el registro CAS se dan a conocer nombres o términos alternativos para el lauril éter de polioxietileno. El número de registro CAS de lauril éter de polioxietileno 9 es: 9002-92-0. Los éteres de polioxietileno tales como lauril éter de polioxietileno se dan a conocer en el Merck index (12ª ed.: entrada 7717, Merck & Co. Inc., Whitehouse Station, N.J., EE.UU.; ISBN 0911910-12-3). El Laureth 9 se forma haciendo reaccionar óxido de etileno con alcohol dodecílico, y tiene un promedio de nueve unidades de óxido de etileno.
La proporción de la longitud de la sección de polioxietileno a la longitud de la cadena de alquilo en el tensioactivo (es decir, la proporción de n:longitud de la cadena de alquilo), afecta a la solubilidad de esta clase de tensioactivo en un medio acuoso. Por tanto, los tensioactivos de la presente invención pueden estar en disolución o pueden formar estructuras particuladas tales como micelas o vesículas. Como disolución, los tensioactivos de la presente invención son seguros, fácilmente esterilizables, fáciles de administrar y pueden fabricarse de una manera sencilla sin los problemas de BPF y CC asociados con la formación de estructuras particuladas uniformes. Algunos éteres de polioxietileno, tales como Laureth 9, pueden formar disoluciones no vesiculares. Sin embargo, el palmitoil éter de polioxietileno 8 (C_{18}E_{8}) puede formar vesículas. En consecuencia, las vesículas de palmitoil éter de polioxietileno 8 en combinación con al menos otro tensioactivo no iónico, pueden emplearse en las formulaciones de la presente invención.
Preferiblemente, el éter de polioxietileno usado en las formulaciones de la presente invención tiene actividad hemolítica. La actividad hemolítica de un éter de polioxietileno puede medirse in vitro, con referencia al siguiente ensayo, y es tal como se expresa como la mayor concentración del tensioactivo que no consigue provocar la lisis de los glóbulos rojos:
1. Se lava sangre fresca de cobayas con solución salina tamponada con fosfato (PBS) 3 veces en una centrifuga de mesa. Tras la resuspensión hasta el volumen original, se diluye adicionalmente la sangre 10 veces con PBS.
2. Se añaden 50 \mul de esta suspensión de sangre a 800 \mul de PBS que contienen diluciones de dos veces de detergente.
3. Tras 8 horas, se evalúa la hemólisis visualmente o mediante la medición de la densidad óptica del sobrenadante. La presencia de un sobrenadante rojo que absorbe luz a 570 nm indica la presencia de hemólisis.
4. Los resultados se expresan como la concentración de la primera dilución con detergente a la que ya no se produce hemólisis.
\vskip1.000000\baselineskip
Dentro de la variabilidad experimental inherente de un ensayo biológico de este tipo, los éteres de polioxietileno, o tensioactivos de fórmula general (I), de la presente invención tienen preferiblemente una actividad hemolítica, de aproximadamente entre el 0,5-0,0001%, más preferiblemente entre el 0,05-0,0001%, aún más preferiblemente entre el 0,005-0,0001% y lo más preferiblemente entre el 0,003-0,0004%. De manera ideal, dichos ésteres o éteres de polioxietileno deben tener una actividad hemolítica similar (es decir, dentro de una diferencia de diez veces) a la de laurel éter de polioxietileno 9 o bien estearil éter de polioxietileno 8.
Dos o más tensioactivos no iónicos de los diferentes grupos de tensioactivos descritos pueden estar presentes en la formulación de vacuna descrita en el presente documento. En particular, se prefiere una combinación de un éster de polioxietilenosorbitano tal como monooleato de polioxietilenosorbitano (Tween 80^{TM}) y un octoxinol tal como t-octilfenoxipolietoxietanol (Triton) X-100^{TM}. Otra combinación particularmente preferida de tensioactivos no iónicos comprende Laureth 9 más un éster de polioxietilenosorbitano o un octoxinol o ambos.
Preferiblemente el o cada tensioactivo no iónico está presente en la formulación de vacuna final a una concentración de entre el 0,001% y el 20%, más preferiblemente del 0,01% al 10% y lo más preferiblemente hasta aproximadamente el 2% (p/v). Cuando están presentes uno o dos tensioactivos, generalmente están presentes en la formulación final a una concentración de hasta aproximadamente el 2% cada uno, normalmente a una concentración de hasta aproximadamente el 0,6% cada uno. Pueden estar presentes uno o más de otros tensioactivos, generalmente hasta una concentración de aproximadamente el 1% cada uno y normalmente en trazas de hasta aproximadamente el 0,2% o el 0,1% cada uno. Puede estar presente cualquier mezcla de tensioactivos en las formulaciones de vacuna según la invención.
Los tensioactivos no iónicos tales como los tratados anteriormente tienen concentraciones preferidas en la composición de vacuna final tal como sigue: ésteres de polioxietilenosorbitano tales como Tween 80^{TM}: del 0,01% al 1%, lo más preferiblemente de aproximadamente el 0,1% (p/v); octil- o nonilfenoxipolioxietanoles tales como Triton X-100^{TM} u otros detergentes en la serie Triton: del 0,001% al 0,1%, lo más preferiblemente del 0,005% al 0,02% (p/v); éteres de polioxietileno de fórmula general (1) tales como Laureth 9: del 0,1% al 20%, preferiblemente del 0,1% al 10% y lo más preferiblemente del 0,1% al 1% o de aproximadamente el 0,5% (p/v).
Para ciertas formulaciones de vacuna, pueden incluirse otros componentes de vacuna en la formulación. Como tales, las formulaciones de la presente invención también pueden comprender un ácido biliar o un derivado del mismo, en particular en forma de una sal. Éstos incluyen derivados de ácido cólico y sales del mismo, en particular sales de sodio del ácido cólico o derivados del ácido cólico. Los ejemplos de ácidos biliares y derivados de los mismos incluyen ácido cólico, ácido desoxicólico, ácido quenodesoxicólico, ácido litocólico, ácido ursodesoxicólico, ácido hiodesoxicólico y derivados tales como derivados glico-, tauro-, amidopropil-1-propanosulfónico-, amidopropil-2-hidroxi-1-propanosulfónico de los ácidos biliares mencionados anteriormente, o N,N-bis(3-D-gluconoamidopropil)desoxicolamida. Un ejemplo particularmente preferido es el desoxicolato de sodio (NaDOC) que puede estar presente en la dosis de vacuna final.
Preferiblemente, las formulaciones de la presente invención están en la forma de una disolución acuosa o una suspensión de formas no vesiculares. Tales formulaciones son fáciles de fabricar de manera reproducible, y también de esterilizar (filtración terminal a través de una membrana de poros de 450 nm o 220 nm) y son fáciles de administrar a la mucosa nasal en forma de una pulverización sin degradación de la compleja estructura física del adyuvante.
La preparación de antígeno del virus de la gripe muerto para su uso en la invención es una preparación de virus fragmentado.
En una realización preferida, la formulación de vacuna comprende una preparación de virus de la gripe fragmentado en combinación con uno o más tensioactivos no iónicos. El uno o más tensioactivos no iónicos pueden ser residuales del procedimiento mediante el cual se produce la preparación de antígeno del virus de la gripe fragmentado, y/o añadirse a la preparación de antígeno posteriormente. Se cree que el material de antígeno del virus de la gripe fragmentado puede estabilizarse en presencia de un tensioactivo no iónico, aunque se entenderá que la invención no depende de que éste sea necesariamente el caso.
La invención proporciona en otro aspecto el uso de una preparación de antígeno del virus influenza fragmentado muerto, en la fabricación de una vacuna intranasal contra la gripe de una dosis sin un inmunoestimulante añadido. En el contexto de esta invención, un inmunoestimulante es una sustancia que puede estimular directamente células en el sistema inmunitario, en oposición a estimular sólo de manera indirecta, por ejemplo, actuando como vehículo para un antígeno que tiene en sí mismo un efecto estimulante cuando está en combinación con el vehículo.
En un aspecto alternativo de la presente invención, la formulación comprende además adyuvantes o inmunoestimulantes incluyendo toxina del cólera y su subunidad B, lípido A destoxificado procedente de cualquier fuente, derivados no tóxicos de lípido A incluyendo los descritos en los documentos US 4.912.094 y GB 2.220.211, incluyendo derivados no tóxicos de monofosforil y difosforil-lípido A tales como monofosforil-lípido A 3-des-O-acilado (3D-MPL) y difosforil-lípido A 3-des-O-acilado, saponinas tales como Quil A (derivada de la corteza del árbol sudamericano Quillaja Saponaria Molina), y fracciones de los mismos, incluyendo QS21 y QS17 (documento US 5.057.540; Kensil, C. R., Crit Rev Ther Drug Carrier Syst, 1996, 12 (1-2): 1-55; documento EP 0 362 279 B1; Kensil et al. (1991. J. Immunology vol. 146, 431-437; documento WO 99/10008) y el sistema de adyuvantes de oligonucleótidos que contiene un dinucleótido CpG no metilado (según lo descrito en el documento WO 96/02555).
En una realización preferida de este aspecto de la invención, la formulación comprende un derivado de lípido A no tóxico seleccionado de 3D-MPL y derivados no tóxicos de difosforil-lípido A, particularmente 3D-MPL. Más preferiblemente, la formulación comprende 3D-MPL junto con un éster o éter de polioxietileno de fórmula general (I) tal como se definió anteriormente en el presente documento, en particular Laureth 9.
Por tanto, la invención proporciona además una vacuna que comprende una combinación de 3D-MPL y Laureth 9, y una preparación de antígeno del virus influenza, particularmente una preparación de antígeno fragmentado. Esta vacuna es adecuada en particular, aunque no exclusivamente, para la administración mucosa incluyendo la administración intranasal según lo descrito en el presente documento.
Otros componentes que están preferiblemente presentes en la formulación según este aspecto de la invención incluyen otros detergentes no iónicos tales como los octoxinoles y ésteres de polioxietileno según lo descrito en el presente documento, particularmente t-octilfenoxipolietoxietanol (Triton X-100) y monooleato de polioxietilenosorbitano (Tween 80): y sales biliares o derivados de ácido cólico según lo descrito en el presente documento, en particular taurodesoxicolato o desoxicolato de sodio. Por tanto, una formulación particularmente preferida comprende 3D-MPL, Laureth 9, Triton X-100, Tween 80 y desoxicolato de sodio, que pueden combinarse con una preparación de antígeno del virus influenza fragmentado para proporcionar una vacuna adecuada para la aplicación mucosa o intranasal.
La invención también proporciona un procedimiento para fabricar una vacuna que comprende mezclar 3D-MPL, Laureth 9 y una preparación de antígeno del virus influenza fragmentado tal como una preparación de antígeno fragmentado empleada en una vacuna contra la gripe intramuscular convencional.
En otro aspecto, la invención proporciona un kit farmacéutico que comprende un dispositivo de pulverización intranasal y una vacuna contra el virus influenza fragmentado muerto de una dosis que genera una respuesta inmunitaria que logra al menos dos de los criterios según lo expuesto en la reivindicación 1 para la o todas las cepas de virus influenza presentes en la vacuna. Preferiblemente, el dispositivo es un dispositivo de administración de bidosis para dos subdosis de vacuna.
La dosis baja de hemaglutinina según la invención es preferiblemente una dosis de hemaglutinina comparable a la dosis de las vacunas contra la gripe comerciales actuales. Por tanto, la dosis baja preferida es preferiblemente no superior a aproximadamente 30 \mug, más preferiblemente no superior a 15 \mug de hemaglutinina por cepa de virus influenza. Esto equivale normalmente a alrededor de entre 0,1 \mug/kg de peso corporal y 2 \mug/kg de peso corporal. De manera preferible, pero no necesariamente, las vacunas de dosis baja de la invención se administran como una vacuna de una dosis, por ejemplo, en dos subdosis, una para cada orificio nasal.
Ventajosamente, una dosis de vacuna según la invención se proporciona en un volumen menor a las vacunas contra la gripe fragmentadas inyectadas convencionales, que son generalmente de 0,5 ml o 1 ml por dosis. Las dosis de volumen pequeño según la invención son preferiblemente inferiores a 500 \mul, más preferiblemente inferiores a 300 \mul y lo más preferiblemente de no superiores a aproximadamente 200 \mul o menos por dosis. Cuando se administran dos subdosis, el volumen preferido por subdosis es la mitad de los volúmenes de dosis totales mencionados anteriormente.
Por tanto, una dosis de vacuna preferida según la invención es una dosis con una dosis baja de antígeno en un volumen pequeño, por ejemplo de aproximadamente 15 \mug o de aproximadamente 7,5 \mug de HA (por cepa) en un volumen de aproximadamente 200 \mul.
La invención también da a conocer un procedimiento para la profilaxis de la enfermedad o infección por influenza en un sujeto, procedimiento que comprende administrar al sujeto una vacuna contra la gripe muerta de una dosis a través de una superficie mucosa.
\global\parskip0.900000\baselineskip
La invención da a conocer además un procedimiento para la profilaxis de enfermedad o infección por influenza en un sujeto, procedimiento que comprende administrar al sujeto una dosis baja de una vacuna contra la gripe muerta a través de una superficie mucosa.
Preferiblemente, la vacuna se administra por vía intranasal.
Lo más preferiblemente, la vacuna se administra localmente a la zona nasofaríngea, preferiblemente sin inhalarse hacia el interior de los pulmones. Es deseable utilizar un dispositivo de administración intranasal que administra la formulación de vacuna a la zona nasofaríngea, sin entrar o sin entrar sustancialmente en los pulmones.
Los dispositivos preferidos para la administración intranasal de la vacunas según la invención son dispositivos de pulverización. Los dispositivos de pulverización nasal disponibles comercialmente adecuados incluyen Accuspray^{TM} (Becton Dickinson). Los nebulizadores producen una pulverización muy fina que puede inhalarse fácilmente hacia el interior de los pulmones y por tanto no alcanza eficazmente la mucosa nasal. Por tanto, no se prefieren los nebulizadores.
Los dispositivos de pulverización preferidos para uso intranasal son dispositivos para los que el rendimiento del dispositivo no depende de la presión aplicada por el usuario. Estos dispositivos se conocen como dispositivos con umbral de presión. Se libera líquido de la boquilla sólo cuando se aplica una presión umbral. Estos dispositivos hacen más fácil lograr una pulverización con un tamaño de gota regular. Los dispositivos con umbral de presión adecuados para su uso en la presente invención se conocen en la técnica y se describen por ejemplo en los documentos WO 91/13281 y EP 311 863 B y EP 516 636. Tales dispositivos están disponibles comercialmente de Pfeiffer GmbH y también se describen en Bommer, R. Pharmaceutical Technology Europe, sept. de 1999.
Los dispositivos intranasales preferidos producen gotas (medidas usando agua como líquido) en el intervalo de 1 \mum a 200 \mum, preferiblemente de 10 \mum a 120 \mum. Por debajo de 10 \mum, hay riesgo de inhalación, por tanto es deseable tener no más de aproximadamente el 5% de las gotas inferiores a 10 \mum. Las gotas por encima de 120 \mum no se expanden tan bien como las gotas más pequeñas, de manera que es deseable tener no más de aproximadamente el 5% de gotas que superen los 120 \mum.
La administración de bidosis es otra característica preferida de un sistema de administración intranasal para su uso con la vacunas según la invención. Los dispositivos de bidosis contienen dos subdosis de una única dosis de vacuna, una subdosis para la administración a cada orificio nasal. Generalmente, las dos subdosis están presentes en una única cámara y la construcción del dispositivo permite la administración eficaz de una única subdosis cada vez. Como alternativa, puede usarse un dispositivo de monodosis para administrar las vacunas según la invención.
La invención proporciona en otro aspecto un kit farmacéutico que comprende un dispositivo de administración intranasal según lo descrito en el presente documento que contiene una formulación de vacuna según la invención.
La invención no se limita necesariamente a la administración mediante pulverización de formulaciones líquidas. Las vacunas según la invención pueden administrarse en otras formas, por ejemplo, como un polvo.
La vacuna contra la gripe según la invención es preferiblemente una vacuna contra la gripe multivalente que comprende dos o más cepas de virus influenza. Lo más preferiblemente es una vacuna trivalente que comprende tres cepas. Las vacunas contra la gripe convencionales comprenden tres cepas de virus influenza, dos cepas A y una cepa B. Sin embargo, las vacunas monovalentes, que pueden ser útiles por ejemplo en una situación de pandemia, no se excluyen de la invención. Una vacuna contra la gripe pandémica, monovalente, contendrá lo más probablemente antígeno del virus influenza de una única cepa A.
Las preparaciones de virus influenza fragmentado muerto pueden derivarse del procedimiento de huevo embrionado convencional, o pueden derivarse de cualquiera de los procedimientos de nueva generación que usan el cultivo tisular para hacer crecer el virus. Los sustratos celulares adecuados para hacer crecer el virus incluyen, por ejemplo, células de riñón de perro tales como MDCK o células de un clon de MDCK, células similares a MDCK, células de riñón de mono tales como células AGMK incluyendo células Vero, o cualquier otro tipo de células de mamífero adecuado para la producción de virus influenza para fines de vacuna. Los sustratos celulares adecuados también incluyen células humanas, por ejemplo, células MRC-5. Los sustratos celulares adecuados no se limitan a líneas celulares; por ejemplo también se incluyen células primarias tales como fibroblastos de embrión de pollo.
La preparación de antígeno del virus influenza puede producirse mediante cualquiera de varios procedimientos aplicables comercialmente, por ejemplo el procedimiento de la gripe fragmentada descrito en las patentes números DD 300 833 y DD 211 444. Tradicionalmente, la gripe fragmentada se producía usando un tratamiento con disolvente /
detergente, tal como fosfato de tri-n-butilo, o dietil éter en combinación con Tween^{TM} (conocido como fragmentación de "Tween-éter") y este procedimiento todavía se usa en algunas instalaciones de producción. Otros agentes de fragmentación empleados ahora incluyen detergentes o enzimas proteolíticas o sales biliares, por ejemplo desoxicolato de sodio según lo descrito en la patente número DD 155 875. Los detergentes que pueden usarse como agentes de fragmentación incluyen detergentes catiónicos, por ejemplo, bromuro de cetiltrimetilamonio (CTAB), otros detergentes iónicos, por ejemplo, laurilsulfato, taurodesoxicolato, o detergentes no iónicos tales como los descritos anteriormente incluyendo Triton X-100 (por ejemplo, en un procedimiento descrito en Lina et al, 2000, Biologicals 28, 95-103) y Triton N-101, o combinaciones de dos cualesquiera o más detergentes.
Otros agentes de fragmentación adecuados que pueden usarse para producir preparaciones del virus de la gripe fragmentado incluyen:
1. Ácidos biliares y derivados de los mismos incluyendo: ácido cólico, ácido desoxicólico, ácido quenodesoxicólico, ácido litocólico, ácido ursodesoxicólico, ácido hiodesoxicólico y derivados tales como derivados glico-, tauro-, amidopropil-1-propanosulfónico-, amidopropil-2-hidroxi-1-propanosulfónico de los ácidos biliares mencionados anteriormente, o N,N-bis(3-D-gluconoamidopropil)desoxicolamida. Un ejemplo particular es desoxicolato de sodio (NaDOC) que puede estar presente en cantidades traza en la dosis de vacuna final.
2. Alquilglucósidos o alquiltioglucósidos, en los que la cadena de alquilo es entre C6-C18, normalmente entre C8 y C14, el resto de azúcar es cualquier pentosa o hexosa o combinaciones de las mismas con diferentes uniones, tales como 1->6, 1->5, 1->4, 1->3, 1-2. La cadena de alquilo puede estar saturada, insaturada y/o ramificada.
3. Derivados de los 2 de los anteriores, en los que uno o más grupos hidroxilo, preferiblemente el grupo 6-hidroxilo está(n) modificado(s), tales como ésteres, etoxilatos, sulfatos, éteres, carbonatos, sulfosuccinatos, isetionatos, etercarboxilatos, compuestos de amonio cuaternario.
4. Acil-azúcares en los que la cadena de acilo es entre C6 y C18, normalmente entre C8 y C12, el resto de azúcar es cualquier pentosa o hexosa o combinaciones de los mismos con diferentes uniones, tales como 1->6, 1->5, 1->4, 1->3, 1-2. La cadena de acilo puede estar saturada o insaturada y/o ramificada, ser cíclica o no cíclica, con o sin uno o más heteroátomos, por ejemplo, N, S, P u O.
5. Sulfobetaínas de la estructura R-N,N-(R1,R2)-3-amino-1-propanosulfonato, en las que R es cualquier cadena de alquilo o cadena de arilalquilo entre C6 y C18, normalmente entre C8 y C16. La cadena de alquilo R puede estar saturada, insaturada y/o ramificada. R1 y R2 son preferiblemente cadenas de alquilo entre C1 y C4, normalmente C1, o R1, R2 pueden formar un anillo heterocíclico junto con el nitrógeno.
6. Betaínas de la estructura R-N,N-(R1,R2)-glicina, en las que R es cualquier cadena de alquilo entre C6 y C18, normalmente entre C8 y C16. La cadena de alquilo puede estar saturada, insaturada y/o ramificada. R1 y R2 son preferiblemente cadenas de alquilo entre C1 y C4, normalmente C1, o R1 y R2 pueden formar un anillo heterocíclico junto con el nitrógeno.
7. N,N-dialquil-glucamidas, de la estructura R-(N-R1)-glucamida, en las que R es cualquier cadena de alquilo entre C6 y C18, normalmente entre C8 y C12. La cadena de alquilo puede estar saturada, insaturada y/o ramificada o ser cíclica. R1 y R2 son cadenas de alquilo entre C1 y C6, normalmente C1. El resto de azúcar puede estar modificado con pentosas o hexosas.
8. Compuestos de amonio cuaternario de la estructura R-N^{+}(-R1,-R2,-R3), en la que R es cualquier cadena de alquilo entre C6 y C20, normalmente C20. La cadena de alquilo puede estar saturada, insaturada y/o ramificada. R1, R2 y R3 son preferiblemente cadenas de alquilo entre C1 y C4, normalmente C1, o R1, R2 pueden formar un anillo heterocíclico junto con el nitrógeno. Un ejemplo particular es bromuro de cetiltrimetilamonio (CTAB).
El procedimiento de preparación para una vacuna fragmentada incluirá varias etapas de filtración y/u otra separación diferentes tales como etapas de ultracentrifugación, ultrafiltración, centrifugación zonal y cromatografía (por ejemplo de intercambio iónico) en una variedad de combinaciones, y opcionalmente una etapa de inactivación, por ejemplo, con formaldehído o \beta-propiolactona o U.V. que puede llevarse a cabo antes o después de la fragmentación. El procedimiento de fragmentación puede llevarse a cabo como un procedimiento discontinuo, continuo o semicontinuo.
Preferiblemente, una sal biliar tal como desoxicolato de sodio está presente en cantidades traza en una formulación de vacuna fragmentada según la invención, preferiblemente a una concentración no superior al 0,05%, o no superior a aproximadamente el 0,01%, más preferiblemente a aproximadamente el 0,0045% (p/v).
Las preparaciones de antígeno de vacuna contra la gripe fragmentado preferidas según la invención comprenden una cantidad residual de Tween 80 y/o Triton X-100 restante procedente del procedimiento de producción, aunque pueden añadirse éstos o ajustarse sus concentraciones tras la preparación del antígeno fragmentado. Preferiblemente, están presentes tanto Tween 80 como Triton X-100. Los intervalos preferidos para las concentraciones finales de estos tensioactivos no iónicos en la dosis de vacuna son:
Tween 80: del 0,01% al 1%, más preferiblemente de aproximadamente el 0,1% (v/v)
Triton X-100: del 0,001% al 0,1 (% p/v), más preferiblemente del 0,005% al 0,02% (p/v).
\vskip1.000000\baselineskip
Se encontró que la presencia de la combinación de estos dos tensioactivos, en bajas concentraciones, promovía la estabilidad del antígeno en disolución. Es posible que esta estabilidad potenciada volviese al antígeno más inmunogénico por vía nasal de lo que habían sido las formulaciones anteriores. Una potenciación de este tipo podría surgir de una prevalencia de agregados pequeños de antígeno o la potenciación de la conformación nativa del antígeno. Se apreciará que la invención no depende de que esta explicación teórica sea correcta.
También hay evidencias que muestran que en el caso de una preparación de virus influenza fragmentado, la presencia de fragmentos del virus influenza entero asociados con las proteínas virales o que contienen las proteínas virales, en particular HA, puede conservar la presentación del antígeno y pueden contribuir a inducir una fuerte respuesta inmunitaria. Por tanto, el virus influenza fragmentado es el antígeno de elección para su uso en los diversos aspectos de la presente invención.
En una realización particular, la preparación de virus fragmentado preferida también contiene Laureth 9, preferiblemente en el intervalo del 0,1% al 20%, más preferiblemente del 0,1% al 10% y lo más preferiblemente del 0,1% al 1% (p/v).
La vacunas según la invención contienen generalmente no más del 25% (p/v) de detergente o tensioactivo, preferiblemente menos del 15% y lo más preferiblemente no más de aproximadamente el 2%.
La invención proporciona en otro aspecto un procedimiento de fabricación de una vacuna contra la gripe de una dosis para la aplicación nasal, procedimiento que comprende:
(i) proporcionar una preparación de virus influenza fragmentado producida esencialmente tal como para una vacuna contra la gripe convencional inyectada (por ejemplo, intramuscular) y que comprende al menos un tensioactivo no iónico;
(ii) ajustar opcionalmente la concentración de la hemaglutinina y/o la concentración de tensioactivo no iónico en la preparación;
(iii) llenar un dispositivo de administración intranasal con una dosis de vacuna de la preparación de virus influenza fragmentado, siendo dicha dosis un volumen adecuado para la administración intranasal, opcionalmente en un formato de bidosis, y aplicación de una dosis que genera una respuesta inmunitaria que logra al menos dos de los criterios según lo expuesto en la reivindicación 1 para la o todas las cepas de virus influenza presentes en la vacuna.
\vskip1.000000\baselineskip
Otra etapa opcional en el procedimiento según este aspecto de la invención incluye la adición de un tensioactivo potenciador de la absorción tal como Laureth 9, y/o la adición de un adyuvante tal como un derivado de lípido A no tóxico, especialmente 3D-MPL.
Los procedimientos para producir vacunas contra la gripe inactivadas inyectadas convencionales se conocen bien y se describen en la bibliografía. Tales procedimientos pueden modificarse para producir una vacuna mucosa de una dosis para su uso en la presente invención, por ejemplo, mediante la inclusión de una etapa de concentración previa a la filtración estéril final de la vacuna, ya que las vacunas intranasales emplean ventajosamente un volumen menor de formulación de vacuna que las vacunas inyectadas. O el procedimiento puede modificarse mediante la inclusión de una etapa para ajustar la concentración de otros componentes, por ejemplo, tensioactivos no iónicos, hasta un % (p/v) adecuado para una vacuna intranasal según la invención. Sin embargo, el principio activo de la vacuna, es decir el antígeno del virus influenza, puede ser esencialmente el mismo para la vacuna intramuscular convencional y las vacunas intranasales de una dosis según la invención.
La invención se describirá ahora adicionalmente en los siguientes ejemplos no limitantes.
Ejemplo 1 Preparación de vacuna contra la gripe fragmentada
Se preparó vacuna fragmentada monovalente según el siguiente procedimiento.
Preparación de inóculo viral
En día de la inoculación de huevos embrionados, se prepara un inóculo reciente mezclando el lote de siembra de trabajo con una solución salina tamponada con fosfato que contiene sulfato de gentamicina a 0,5 mg/ml e hidrocortisona a 25 \mug/ml (dependiendo de la cepa del virus). Se conserva el inóculo de virus a 2-8ºC.
Inoculación de huevos embrionados
Se usan huevos embrionados de nueve a once días de edad para la replicación viral. Se descontaminan las cáscaras. Se inocula a los huevos 0,2 ml del inóculo viral. Se incuban los huevos inoculados a la temperatura apropiada (dependiendo de la cepa del virus) durante 48 a 96 horas. Al final del periodo de incubación, se destruyen los embriones mediante enfriamiento y se almacenan los huevos durante 12-60 horas a 2-8ºC.
Recogida
Se recoge el líquido alantoideo de los huevos embrionados enfriados. Normalmente, se recogen de 8 ml a 10 ml de líquido alantoideo bruto por huevo. Al total de virus monovalente bruto, se añade opcionalmente tiomersal 0,100 mg/ml.
Concentración y purificación de virus entero procedente de líquido alantoideo 1. Aclaramiento
Se aclara el líquido alantoideo recogido mediante centrifugación a velocidad moderada (intervalo: 4000 - 14000 g).
2. Etapa de adsorción
Para obtener un gel de CaHPO_{4} en la reserva de virus aclarado, se añaden disoluciones de Na_{2}HPO_{4} 0,5 mol/l y CaCl_{2} 0,5 mol/l para alcanzar una concentración final de CaHPO_{4} de 1,5 g a 3,5 g de CaHPO_{4}/litro dependiendo de la cepa del virus.
\global\parskip1.000000\baselineskip
Tras la sedimentación durante al menos 8 horas, se elimina el sobrenadante y resolubilizarse el sedimento que contiene el virus influenza mediante la adición de una disolución de EDTA-Na 0,26 mol/l, dependiendo de la cantidad de CaHPO_{4} usado.
3. Filtración
Se filtra el sedimento resuspendido sobre una membrana filtrante de 6 \mum.
4. Centrifugación en gradiente de sacarosa
Se concentra el virus influenza mediante centrifugación isopícnica en un gradiente lineal de sacarosa (al 0,55% (p/v)) que contiene tiomersal 100 \mug/ml. El caudal es de 8 - 15 litros/hora.
Al final de la centrifugación, se recupera el contenido del rotor mediante cuatro fracciones diferentes (la sacarosa se mide en un refractómetro):
- fracción 1 el 55-52% de sacarosa
- fracción 2 aproximadamente el 52-38% de sacarosa
- fracción 3 el 38-20% de sacarosa*
- fracción 4 el 20-0% de sacarosa
* dependiendo de la cepa del virus: la fracción 3 puede reducirse hasta el 15% de sacarosa.
Para la otra preparación de vacuna, sólo se usan las fracciones 2 y 3.
Se lava la fracción 3 mediante diafiltración con tampón fosfato con el fin de reducir el contenido en sacarosa hasta aproximadamente inferior al 6%. Se sedimenta el virus influenza presente en esta fracción diluida para eliminar contaminantes solubles.
Se resuspende el sedimento y se mezcla vigorosamente para obtener una suspensión homogénea. Se combinan la fracción 2 y el sedimento resuspendido de la fracción 3 y se añade tampón fosfato para obtener un volumen de aproximadamente 40 litros. Este producto es el concentrado de virus entero monovalente.
5. Centrifugación en gradiente de sacarosa con desoxicolato de sodio
Se aplica el concentrado de virus influenza entero monovalente a una ultracentrífuga ENI-Mark II. El rotor K3 contiene un gradiente lineal de sacarosa (al 0,55% (p/v)) en el que se sobrepone adicionalmente un gradiente de desoxicolato de sodio. Tween 80 está presente durante la fragmentación hasta el 0,1% (p/v). La concentración máxima de desoxicolato de sodio es del 0,7-1,5% (p/v) y depende de la cepa. El caudal es de 8 - 15 litros/hora.
Al final de la centrifugación, se recupera el contenido del rotor mediante tres fracciones diferentes (se mide la sacarosa en un refractómetro). La fracción 2 se usa para el tratamiento adicional. El contenido en sacarosa para los límites de fracción (47-18%) varía según las cepas y se fija tras la evaluación.
6. Filtración estéril
Se filtra la fracción de virus fragmentado sobre membranas filtrantes que terminan con una membrana de 0,2 \mum. Se usa tampón fosfato que contiene Tween 80 al 0,025% (p/v) para la dilución. El volumen final de la fracción 2 filtrada es 5 veces el volumen de fracción original.
7. Inactivación
Se incuba el material monovalente filtrado a 22ºC \pm 2ºC durante 84 horas como máximo (dependiendo de las cepas del virus, esta incubación puede acortarse). Entonces se añade tampón fosfato que contiene Tween 80 al 0,025% con el fin de reducir el contenido en proteína total hasta un máximo de 250 \mug/ml. Se añade formaldehído hasta una concentración final de 50 \mug/ml y la inactivación tiene lugar a 20ºC \pm 2ºC durante al menos 72 horas.
8. Ultrafiltración
Se concentra el material de virus fragmentado inactivado al menos 2 veces en una unidad de ultrafiltración, equipada con membranas de acetato de celulosa con MWCO de 20 kDa. Posteriormente se lava el material con tampón fosfato que contiene Tween 80 al 0,025% (p/v) y va seguido por solución salina tamponada con fosfato que contiene Tween al 0,01% (p/v).
9. Filtración estéril final
Se filtra el material tras la ultrafiltración sobre membranas filtrantes que terminan con una membrana de 0,2 \mum. La concentración final de hemaglutinina, medida mediante SRD (procedimiento recomendado por la OMS) debe superar los 450 \mug/ml.
10. Almacenamiento
Se almacena el volumen total final monovalente a 2 - 8ºC durante un máximo de 18 meses.
Pureza
Se determinó la pureza mediante exploración de D.O. de geles de poliacrilamida teñidos con Coomassie. Se determinaron los picos manualmente. Se facilitan resultados de muestras en la tabla 1:
\vskip1.000000\baselineskip
TABLA I
2 
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 2 Preparación de dosis de vacuna a partir de vacuna a granel
Se prepara la vacuna final formulando una vacuna trivalente a partir del volumen total monovalente con las concentraciones de detergente ajustadas según se requiera.
Se mezclan agua para inyección, PBS pH 7,4 concentrado 10 veces, Tween 80 y Triton X-100 para obtener las concentraciones finales requeridas (PBS concentrado 1 vez, Tween 80 al 0,15% y Triton X-100 al 0,02%). Se añaden los tres viriones fragmentados inactivados siguientes con 10 minutos de agitación entre ellos:
30 \mug de HA A/Beijing/262/95 (H1N1)
30 \mug de HA A/Sydney/5/97 (H3N2)
30 \mug de HA B/Harbin/7/94
Tras 15 minutos de agitación, se ajusta el pH hasta 7,2 +/- 0,2.
El volumen de dosis es de 200 \mul.
En la vacuna formulada con Laureth 9, se añade el Laureth 9 antes del ajuste del pH para obtener una concentración final del 0,5% (p/v).
Ejemplo 3 Procedimientos usados para medir las respuestas de anticuerpos 1. Detección de IgA específica anti-gripe y total en secreciones nasales humanas mediante ELISA Procedimiento de recogida para secreciones nasales humanas
Se aplican dos mechas contra el cornete inferior (uno en cada orificio nasal) del voluntario. Se dejan las mechas en la nariz durante 1 minuto antes de ponerse en 2 ml de NaCl al 0,9%, BSA al 1% y azida de sodio al 0,1% (tampón conservante). Se dejan todas las muestras durante un periodo de 2 horas en hielo. Entonces se presionan las mechas para recuperar los anticuerpos. Tras la centrifugación (10 minutos, 2000 g, 4ºC) se recogen los líquidos de todas las muestras, se preparan alícuotas y se congelan a -20ºC hasta la fecha de la prueba. Se suspenden los sedimentos en 400 \mul de agua fisiológica y se observan al microscopio para determinar la contaminación de glóbulos rojos.
Tras la recogida usando mechas nasales y el tratamiento de las secreciones nasales humanas, se realiza la detección de IgA específica anti-gripe y total con dos ELISA diferentes:
\vskip1.000000\baselineskip
ELISA de captura para la detección de IgA total
Se captura IgA total con Ig purificada mediante afinidad policlonal anti-IgA humana, inmovilizada sobre placas de microtitulación y posteriormente se detecta usando una Ig purificada mediante afinidad policlonal anti-IgA humana diferente, acoplada a peroxidasa.
Se usa una sIgA humana purificada como patrón para permitir la cuantificación de sIgA en las secreciones nasales recogidas.
Se usan 3 referencias de sIgA humana purificada como referencias baja, media y alta en este ensayo.
\vskip1.000000\baselineskip
ELISA directo para la detección de IgA específica anti-gripe
Se realizan tres ELISA diferentes, uno con cada cepa de gripe presente en la formulación de vacuna.
Se capturan IgA específicas anti-gripe con antígenos de la gripe inactivados fragmentados recubiertos sobre placas de microtitulación y posteriormente se detectan usando la misma Ig purificada mediante afinidad policlonal anti-IgA humana diferente, acoplada a peroxidasa que la usada para el ELISA de IgA total.
\vskip1.000000\baselineskip
Reactivos Reactivos biológicos
- Ig purificada mediante afinidad de cabra anti-IgA humana (Sigma 1-0884)
- IgA secretora humana purificada (ICN-Cappel 55905) (patrón para la cuantificación de IgA total)
- IgA secretora humana (Colostrum) (Biogenesis 5111-5504) (referencia Bio para la IgA total), diluida para obtener referencias baja, media y alta
- IgA humana purificada (Sigma I-1010) (referencia Sig para la IgA total)
- Referencia negativa para el ELISA específico anti-gripe (reserva de secreciones nasales con respuestas no detectables frente a las 3 cepas; punto de corte = 0,6 DO_{450nm})
- Referencia positiva baja para ELISA específico anti-gripe (reserva de secreciones nasales con respuestas detectables bajas frente a las 3 cepas)
- Referencia positiva media para ELISA específico anti-gripe (reserva de secreciones nasales con respuestas detectables medias frente a las 3 cepas; punto de corte = 0,6 DO)
- Anticuerpo de cabra purificado mediante afinidad en suero anti-IgA humana conjugado con HRP (ICN 674221)
- Antígeno A/Beijing/262/95 H1N1 derivado de huevo inactivado fragmentado
- Antígeno A/Sydney/5/97 H3N2 derivado de huevo inactivado fragmentado
- Antígeno B/Harbin/7/94 derivado de huevo inactivado fragmentado
\vskip1.000000\baselineskip
Preparación de reactivos
- Tampón de saturación (PBS, Tween 20 al 0,1%, BSA al 1%, NCS al 4%)
- NaCl T20 (NaCl 9 g/l, Tween 20 al 0,05%)
\vskip1.000000\baselineskip
Procedimiento Detección de IgA humana total
- Añadir 100 \mul/pocillo de anticuerpo policlonal de cabra anti-IgA humana a 1 \mug/ml en DPBS e incubar durante la noche a 4ºC.
- Añadir 200 \mul/pocillo de tampón de saturación e incubar durante 1 hora a 37ºC.
- Añadir en la primera fila: 100 \mul/pocillo de diluciones de dos veces de la IgA patrón en tampón de saturación partiendo de 250 ng/ml hasta 0,12 ng/ml.
- Añadir en las otras filas: 100 \mul/pocillo de diluciones de dos veces de las muestras (líquidos nasales) en tampón de saturación partiendo de 1/100 hasta 1/102400, añadir 100 \mul de tampón de saturación en la columna 12 e incubar durante 2 horas a 22ºC.
- Lavar las placas cuatro veces en NaCl T20.
- Añadir 100 \mul/pocillo de anticuerpo de cabra anti-IgA humana conjugado con peroxidasa diluido en tampón de saturación a 1/10000 e incubar durante 1 hora y media a 22ºC.
- Lavar las placas cuatro veces en NaCl T20.
- Añadir 100 \mul/pocillo de TMB (tetrametilbencidina) e incubar a temperatura ambiente durante 10 min. en la oscuridad.
- Detener la reacción añadiendo 100 \mul/pocillo de H_{2}SO_{4} 0,4 N.
- Medir la absorbancia (DO) de cada placa usando un espectrofotómetro a 450 nm con una referencia a 630 nm.
\vskip1.000000\baselineskip
Detección de IgA específica anti-gripe
- Añadir 100 \mul/pocillo de cada cepa de virus de la gripe a 1 \mug/ml en DPBS e incubar durante la noche a 4ºC.
- Añadir 200 \mul/pocillo de tampón de saturación e incubar durante 1 hora a 37ºC.
- Añadir 100 \mul/pocillo de diluciones de dos veces de las muestras en tampón de saturación partiendo de 1/5 hasta 1/640 e incubar las placas durante 2 horas a 22ºC.
- Lavar las placas cuatro veces en NaCl T20.
- Añadir 100 \mul/pocillo de anticuerpo de cabra anti-IgA humana conjugado con peroxidasa en tampón de saturación a 1/10000 e incubar durante media hora a 22ºC.
- Lavar las placas cuatro veces en NaCl T20.
- Añadir 100 \mul/pocillo de TMB (tetrametilbencidina) e incubar a temperatura ambiente durante 10 min. en la oscuridad.
- Detener la reacción añadiendo 100 \mul/pocillo de H_{2}SO_{4} 0,4 N.
- Medir la absorbancia (DO) de cada placa usando un espectrofotómetro a 450 nm con una referencia a 630 nm.
\vskip1.000000\baselineskip
Resultados - expresión y cálculos Expresión de IgA total
Los resultados se expresan como \mug de IgA total en 1 ml de líquidos nasales, usando un programa Softmaxpro.
\vskip1.000000\baselineskip
Expresión de IgA específica anti-gripe
Los resultados se expresan como título unitario de criterio de valoración, que se calculan como la inversa de la última dilución que da una DO_{450nm} superior al punto de corte (DO_{450nm} = 0,6).
El valor del punto de corte se define como la mayor densidad óptica de la referencia negativa (véase el protocolo de validación) a una dilución de 1/5. Por tanto, puede calcularse el límite de detección correspondiente al título unitario del criterio de valoración en el punto de corte como 5 unidades de criterio de valoración. Las muestras con un título \leq 5 unidades de criterio de valoración se considerarán negativas y las muestras con un título > 5 unidades de criterio de valoración se considerarán positivas.
Los resultados finales de una muestra se expresan tal como sigue:
Normalización de la respuesta específica calculando la proporción entre la respuesta específica y la concentración de IgA total: unidad de criterio de valoración/\mug de IgA total (procedimiento de cálculo más comúnmente usado en la bibliografía).
\vskip1.000000\baselineskip
2. Actividad de inhibición de hemaglutinación (HAI) de Ac séricos específicos frente a la gripe
Se tratan los sueros (50 \mul) con 200 \mul de RDE (enzima destructora de receptores) durante 16 horas a 37ºC. Se detiene la reacción con 150 \mul de citrato de Na al 2,5% y se inactivan los sueros a 56ºC durante 30 min. Se prepara una dilución 1:10 añadiendo 100 \mul de PBS. Después se prepara una serie de dilución de 2 veces en placas de 96 pocillos (fondo en V) diluyendo 25 \mul de suero (1:10) con 25 \mul de PBS. Se añaden 25 \mul de los antígenos de referencia a cada pocillo a una concentración de 4 unidades de hemaglutinación por 25 \mul. Se mezclan el antígeno y la dilución antisuero usando un agitador de placas de microtitulación y se incuban durante 60 minutos a temperatura ambiente. Entonces se añaden 50 \mul de glóbulos rojos (RBC) de pollo (al 0,5%) y se dejan sedimentar los RBC durante 1 hora a TA. El título de HAI corresponde a la inversa de la última dilución de suero que inhibe completamente la hemaglutinación inducida por virus.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 4 Una comparación de la inmunogenicidad de una vacuna intranasal contra la gripe fragmentada con la de una vacuna parenteral convencional autorizada (Fluarix^{TM}) en sujetos adultos sanos Formulaciones usadas en el estudio
Se evaluaron dos formulaciones (A, B) de antígenos del virus influenza fragmentados derivados de huevos. A es una formulación intranasal y B es Fluarix^{TM}/\alpha-Rix® administrada por vía intramuscular. Las formulaciones contienen tres antígenos de virión fragmentado inactivado preparados a partir de las cepas recomendadas por la OMS de la temporada 1998/1999.
El dispositivo usado para la administración de la vacunas fue la jeringuilla intranasal Accuspray^{TM} de Becton Dickinson. El dispositivo funciona de manera similar a una jeringuilla convencional, pero tiene una punta especial que contiene canales en espiral que dan como resultado la producción de una pulverización cuando se ejerce una presión uniforme sobre el émbolo. Se llenó el dispositivo con 200 \mul de formulación de vacuna, y se pulverizaron 100 \mul de la formulación A en cada orificio nasal.
\vskip1.000000\baselineskip
Composición de las formulaciones
La formulación intranasal (A) contenía los siguientes viriones fragmentados inactivados:
1. 30 \mug de HA A/beijing/262/95 (H1N1)
2. 30 \mug de HA A/Sydney/5/97 (H3N2)
3. 30 \mug de HA B/Harbin/7/94
y solución salina tamponada con fosfato, pH 7,4 \pm 0,1, Tween 80 al 0,1%, Triton X-100 al 0,015%, desoxicolato de Na al 0,0045% y tiomersal por debajo de 35 \mug/ml.
\vskip1.000000\baselineskip
El volumen de una dosis fue de 200 \mul (subdosis de 100 \mul para cada orificio nasal).
El producto de comparación Fluarix^{TM}/\alpha-Rix® es la vacuna contra la gripe fragmentada trivalente inactivada comercial de SmithKline Beecham Biologicals. Se administró la dosis de 500 \mul por vía intramuscular.
Esta dosis contiene:
15 \mug de HA de las tres cepas mencionadas anteriormente, Tween 80 entre 500 y 1000 \mug por ml (al 0,05%-0,1%), Triton X-100 entre 50 y 170 \mug/ml (al 0,005%-0,017%), desoxicolato de sodio a un máximo de 100 \mug/ml, tiomersal 100 \mug/ml y solución salina tamponada con fosfato, pH entre 6,8 y 7,5.
\vskip1.000000\baselineskip
Estudio de inmunogenicidad
Un estudio abierto, controlado y aleatorizado evaluó la inmunogenicidad de una vacuna intranasal contra la gripe fragmentada formulada con Tween 80 y Triton X-100 en comparación con la vacuna parenteral convencional (es decir Fluarix^{TM}). Veinte sujetos adultos sanos (de 18-40 años de edad) recibieron una dosis de Fluarix^{TM} y diez sujetos recibieron una dosis de la vacuna intranasal contra la gripe. La formulación intranasal (200 \mul) contenía los siguientes viriones inactivados: 30 \mug de hemaglutinina A/Beijing/262/95 (H1N1), 30 \mug de hemaglutinina A/Sydney/5/97 (H3N2), 30 \mug de hemaglutinina B/Harbin/7/94 con solución salina tamponada con fosfato (pH 7,4 \pm 0,1), Tween 80 (al 0,1%), Triton X-100 (al 0,015%), desoxicolato de sodio (al 0,0045%) y tiomersal (< 35 \mug/ml).
Hubo un periodo de seguimiento de ocho días para los síntomas locales y generales solicitados y ambas vacunas se toleraron bien con respecto a la seguridad y a la reactogenicidad. No se notificaron acontecimientos adversos graves relacionados con la vacunación.
Se examinó la inmunogenicidad de la vacunas evaluando los títulos de inhibición de la hemaglutinación (HI) en suero para determinar la tasa de seroconversión (definida como el porcentaje de personas vacunadas que tienen un aumento de al menos 4 veces de los títulos de HI en suero el día 21 en comparación con el día 0, para cada cepa de vacuna), el factor de conversión (definido como el aumento en veces de la media geométrica de los títulos (GMT) de HI en suero el día 21 en comparación con el día 0, para cada cepa de vacuna) y la tasa de seroprotección (definida como el porcentaje de personas vacunadas con un título de HI en suero \geq 40 tras la vacunación (para cada cepa de vacuna) que se acepta como que indica protección). Además, se evaluó la respuesta de anticuerpo IgA mucoso mediante ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA).
Las tasas de seropositividad de HI, seroconversión y de seroprotección veintiún días después de una dosis de Fluarix^{TM} o la formulación intranasal pueden verse en la tabla 2. El factor de conversión puede verse a partir de la tabla 2a.
TABLA 2
3 
\vskip1.000000\baselineskip
En todos los casos, el factor de conversión (aumento en veces de GMT de HI en suero tras la vacunación) fue superior a 2,5, el nivel requerido para una vacuna contra la gripe satisfactoria.
El porcentaje de sujetos con un aumento de dos veces o de cuatro veces en la proporción de anticuerpo IgA mucosa específica/total entre el día 21 y el día 0 (1 dosis) puede observarse en la tabla 3.
TABLA 3
5 
\vskip1.000000\baselineskip
Resumen
Los resultados de inmunogenicidad presentados en forma de tabla anteriormente muestran que la formulación intranasal produjo niveles similares de seropositividad, seroconversión y seroprotección a los producidos por la vacuna parenteral convencional (Fluarix^{TM}) veintiún días después de una dosis. La formulación intranasal produjo una mejor respuesta de IgA mucosa tras una dosis que la vacuna parenteral convencional (Fluarix^{TM}).
Ejemplo 5 Una comparación de la inmunogenicidad de una vacuna intranasal contra la gripe fragmentada formulada con Laureth 9, Triton X-100 y Tween 80, con la inmunogenicidad de una vacuna parenteral convencional autorizada (Fluarix^{TM}) en sujetos adultos sanos
Se evaluó una formulación intranasal de antígenos del virus influenza fragmentados derivados de huevos, formulada con Laureth 9, Triton X-100 y Tween 80 (A) y se comparó con Fluarix^{TM}/\alpha-Rix® (B). Las formulaciones contenían tres antígenos de virión fragmentado inactivado preparados a partir de las cepas recomendadas por la OMS de la temporada 1998/1999. El dispositivo usado para la administración de la vacunas fue la jeringuilla intranasal Accuspray^{TM} de Becton Dickinson. El dispositivo funciona de manera similar a una jeringuilla convencional, pero tiene una punta especial que contiene canales en espiral que dan como resultado la producción de una pulverización cuando se ejerce presión uniforme sobre el émbolo. Se pulverizaron 100 \mul de la formulación en cada orificio nasal.
Composición de la formulación
La formulación intranasal (A) contenía los siguientes viriones fragmentados inactivados:
1. 30 \mug de HA A/beijing/262/95 (H1N1)
2. 30 \mug de HA A/Sydney/5/97 (H3N2)
3. 30 \mug de HA de B/Harbin/7/94
y solución salina tamponada con fosfato pH 7,4 \pm 0,1, Tween 80 al 0,1%, Triton X-100 al 0,015%, desoxicolato de sodio al 0,0045% y tiomersal por debajo de 35 \mug/ml.
El volumen de una dosis fue de 200 \mul (subdosis de 100 \mul para cada orificio nasal). La formulación A se formuló con Laureth 9 para obtener una concentración final del 0,5% (p/v).
El compuesto de comparación Fluarix^{TM}/\alpha-Rix® (B) es la vacuna contra la gripe fragmentada trivalente inactivada comercial de SmithKlineBeecham Biologicals, que se administra por vía intramuscular en una dosis de 500 \mul.
Estudio de inmunogenicidad
Un estudio abierto, controlado y aleatorizado evaluó la inmunogenicidad de una vacuna intranasal contra la gripe fragmentada formulada con Laureth 9 complementada con Tween 80 y Triton X-100 en comparación con la vacuna parenteral convencional (es decir Fluarix^{TM}). Veinte sujetos adultos sanos (de 18-40 años de edad) recibieron una dosis de Fluarix^{TM} y diez sujetos recibieron una dosis (dos subdosis, una por orificio nasal) de la vacuna intranasal contra la gripe.
Hubo un periodo de seguimiento de ocho días para determinar síntomas locales y generales solicitados y ambas vacunas se toleraron bien con respecto a la seguridad y reactogenicidad. No se notificaron acontecimientos adversos graves relacionados con la vacunación.
Se examinó la inmunogenicidad de las vacunas evaluando los títulos de inhibición de la hemaglutinación (HI) en suero para determinar la tasa de seroconversión (definida como el porcentaje de personas vacunadas que tienen un aumento de al menos 4 veces en los títulos de HI en suero el día 21 en comparación con el día 0, para cada cepa de vacuna), factor de conversión (definido como el aumento en veces de las medias geométricas de los títulos (GMT) de HI en suero el día 21 en comparación con el día 0, para cada cepa de vacuna) y tasa de seroprotección (definida como el porcentaje de personas vacunadas con un título de HI en suero \geq 40 tras la vacunación (para cada cepa de vacuna) que se acepta como que indica protección). Además, se evaluó la respuesta de anticuerpo IgA mucosa mediante ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA).
Las tasas de seropositividad de HI, seroconversión y seroprotección veintiún días después de una dosis de Fluarix^{TM} o la formulación intranasal pueden verse en la tabla 4.
\vskip1.000000\baselineskip
TABLA 4 Tasas de seropositividad de HI, seroconversión y seroprotección a los 21 días tras 1 dosis
6
En todos los casos, el factor de conversión (aumento en veces de la GMT de HI en suero tras la vacunación) fue superior a 2,5, el nivel requerido para una vacuna contra la gripe satisfactoria.
El porcentaje de sujetos con un aumento de dos veces o de cuatro veces en la proporción de anticuerpo IgA mucosa específica/total entre el día 21 y el día 0 (1 dosis) puede verse en la tabla 5.
\vskip1.000000\baselineskip
TABLA 5 Porcentajes de sujetos con un aumento de dos veces o de cuatro veces en la proporción de IgA específica/total entre el día 21 y el día 0 (1 dosis) 
\vskip1.000000\baselineskip
8 
\vskip1.000000\baselineskip
Resumen
Los resultados de inmunogenicidad presentados en forma de tabla anteriormente muestran que la formulación intranasal produjo niveles similares de seropositividad, seroconversión y seroprotección a los de la vacuna parenteral convencional (Fluarix^{TM}) veintiún días después de una dosis. La formulación intranasal produjo generalmente una mejor respuesta de IgA mucosa tras una dosis que la vacuna parenteral convencional (Fluarix^{TM}).
Ejemplo 6 Evaluación de una vacuna intranasal contra la gripe con y sin Laureth 9 + 3D-MPL en ratones sensibilizados
6.1. En un primer experimento, se vacunaron ratones con formulaciones candidatas que contenían las mismas cepas de virus influenza que las usadas para su sensibilización.
Procedimiento experimental
Se "sensibilizaron" ratones Balb/c hembra (8 semanas de edad) por vía intranasal el día 0 con virus influenza entero trivalente derivado de huevos inactivado por \beta-propiolactona A/Beijing/262/95, A/Sydney/5/97 y B Harbin/7/94; 5 \mug de HA/cepa) de manera que se imita la sensibilización natural que se produce en los seres humanos.
Tras 28 días, se vacunaron por vía intranasal los ratones (10 animales por grupo) con las siguientes formulaciones de vacuna trivalente que contenían las mismas cepas que las usadas para la sensibilización:
10
11
Las formulaciones de vacuna intranasal administradas a los ratones son similares a las que se administran a seres humanos en el ejemplo 7 excepto porque la dosis administrada para los ratones corresponde 1/10 de la dosis para seres humanos.
Se recogieron muestras de suero el día 42 y se sometieron a prueba para determinar los anticuerpos de inhibición de la hemaglutinación (HI). Tras el sacrificio (día 42), se realizaron lavados nasales y se sometieron a prueba para determinar los títulos de anticuerpo IgA mediante ELISA. Se midieron los anticuerpos IgA específica como títulos de criterio de valoración (EPT) y se expresaron los resultados como EPT de IgA específica por \mug de IgA total con el fin de excluir cualquier diferencia debida al procedimiento de toma de muestras.
Resultados
El primer objetivo del estudio fe confirmar que las formulaciones de vacuna intranasal podían provocar títulos de HI en suero no significativamente diferentes de los resultantes de la administración parenteral. La figura 1 muestra los títulos de HI observados en el suero el día 42 (es decir, 14 días tras la vacunación) con las diversas vacunas.
Se realizó un análisis estadístico (ensayo comparativo estadístico Tukey-HSD) con los títulos de HI observados con el fin de comparar las vacunas intranasales con la vacuna parenteral. Los títulos de HI observados con los grupos sola 1 y 2 fueron significativamente diferentes (p < 0,05) de los inducidos por la vacuna parenteral para dos de las tres cepas de la gripe (cepas A/H1N1 y B). Los títulos anti-cepa A/H3N2 no fueron significativamente diferentes. La formulación L9 fue tan inmunogénica como la vacuna parenteral para dos de las tres cepas (cepas A/H3N2 y B). En cambio, la vacuna formulada con L9 + MPL provocó anticuerpos de HI frente a las tres cepas de la gripe con títulos que no difirieron significativamente de los observados con la vacuna parenteral.
El segundo objetivo fue determinar si la respuesta de IgA nasal frente a la vacunación intranasal era o no superior a la observada en animales con refuerzo por vía intramuscular. La figura 2 presenta la respuesta de IgA nasal registrada 14 días tras la vacunación de refuerzo (día 42).
No hubo diferencias significativas entre las respuestas inducidas por cualquiera de las formulaciones intranasales. La administración intranasal provocó respuestas de dos a cuatro veces superiores en comparación con la vía parenteral. Finalmente, la vacuna formulada con L9 + MPL pudo mantener el mismo nivel de respuesta en comparación con las otras vacunas intranasales pero con una dosis de antígeno inferior.
Conclusiones
Los antígenos del virus influenza fragmentados trivalentes formulados con L9 + MPL (0,75 \mug de HA + Laureth 9 al 0,5% + 5 \mug de MPL) fueron la formulación de vacuna intranasal más inmunogénica en cuanto a la respuesta de anticuerpos de HI.
Todas las vacunas administradas por vía nasal sometidas a prueba fueron más potentes en la inducción de anticuerpos IgA locales que la vacuna administrada por vía parenteral. La formulación de L9 + MPL indujo una respuesta similar a las otras formulaciones pero con un contenido en antígeno reducido.
6.2 En un segundo experimento, se inmunizaron ratones por vía intranasal con cepas que fueron diferentes a las usadas para la sensibilización.
La deriva antigénica es responsable de las epidemias anuales. Las cepas incluidas todos los años en la vacuna contra la gripe son las encontradas más comúnmente, aunque también pueden encontrarse otras cepas en el campo, más o menos relacionadas. Como consecuencia, la mejor vacuna contra la gripe candidata tendrá que inducir protección frente a una amplia gama de cepas para ser eficaz. Por tanto, resultó interesante investigar hasta qué grado podía una formulación intranasal dada provocar una respuesta inmunitaria tras una "sensibilización" con cepas heterólogas a las contenidas en la vacuna.
Procedimiento experimental
Se "sensibilizaron" ratones Balb/c hembra (de 8 semanas de edad) por vía intranasal en el día 0 con virus influenza entero trivalente derivado de huevos inactivado por \beta-propiolactona (A/Johannesburg/82/96 H1N1, A/Johannesburg/
33/94 H3N2 y B/Panama/45/90; 5 \mug de HA/cepa) para imitar la sensibilización natural que se produce en seres humanos.
Tras 28 días, se vacunaron los ratones (10 animales por grupo) por vía intranasal con las siguientes formulaciones de vacuna trivalente (que contenían A/Beijing/262/95 H1N1, A/Sydney/5/97 H3N2 y B/Harbin/7/94 como cepas heterólogas).
\vskip1.000000\baselineskip
12 
\vskip1.000000\baselineskip
Las cantidades de viriones fragmentados trivalentes contenidos en las diversas formulaciones de vacuna intranasal que iban a someterse a prueba en ratones correspondían de nuevo a 1/10 de las dosis administradas a voluntarios humanos en el ejemplo 7.
Se recogieron muestras de suero el día 42 y se sometieron a prueba para detectar anticuerpos de inhibición de la hemaglutinación (HI). Tras el sacrificio (día 42), se realizaron lavados nasales y se sometieron a prueba para determinar los títulos de anticuerpos IgA mediante ELISA. Se midieron los anticuerpos de IgA específica como títulos de criterio de valoración (EPT) y se expresaron los resultados como EPT de IgA específica por \mug de IgA total con el fin de excluir cualquier diferencia debida al procedimiento de toma de muestras.
Resultados
El primer objetivo del estudio fue determinar si las formulaciones de vacuna intranasal podían provocar respuestas de HI en suero frente a antígenos de vacuna cuando se usan cepas de heterosubtipos para la sensibilización. La figura 3 muestra los títulos de HI observados en el suero 14 días tras la vacunación (día 42) con las diversas formulaciones de vacuna.
Todas las formulaciones intranasales con L9 o L9 + MPL pudieron inducir respuestas inmunitarias dirigidas frente a las tres cepas de virus influenza, que eran comparables a las provocadas por la administración parenteral de la vacuna sola. El análisis estadístico (ensayo comparativo estadístico Tukey-HSD) confirmó que las respuestas provocadas por todas las formulaciones intranasales fueron no significativamente (p > 0,05) diferentes de las respuestas de la administración parenteral. Dentro de las formulaciones intranasales, no se observaron diferencias estadísticas. Sin embargo, las formulaciones de L9 + MPL y L9 fueron generalmente más inmunogénicas, conteniendo la primera la mitad del contenido en antígeno de la segunda (0,75 \mug frente a 1,5 \mug de HA).
El segundo objetivo fue determinar (1) si podía medirse una respuesta de IgA específica nasal frente a cepas heterólogas tras la vacunación intranasal y (2) si esta respuesta era superior a la observada en animales vacunados por vía intramuscular. La figura 4 representa la respuesta de IgA específica nasal anti-heteróloga registrada 14 días tras la vacunación (día 42).
Se cumplieron ambos criterios del segundo objetivo. Todas las formulaciones intranasales indujeron respuestas de IgA frente a las tres cepas heterólogas que fueron de tres a ocho veces superiores a las observadas cuando se inyectó vacuna sola por vía intramuscular. La amplitud de las respuestas de IgA no fue significativamente diferente dentro de las formulaciones intranasales.
La magnitud de las respuestas observadas con la vacunación heteróloga alcanzó el mismo intervalo que para la vacunación homóloga (véase la figura 2). De nuevo aquí, la vacuna formulada con L9 + MPL pudo mantener la misma amplitud de respuesta con una dosis de antígeno menor (0,75 \mug de HA) en comparación con las formulaciones solas o con L9 (3 y 1,5 \mug de HA).
Conclusión
La administración intranasal de vacuna contra la gripe fragmentada trivalente, con o sin adyuvante o tensioactivo potenciador de la absorción, pudo inducir respuestas a heterosubtipos tanto en cuanto al anticuerpo de HI en suero como a IgA intranasal específica para cepas de vacuna contra la gripe.
Aunque las diferencias entre los grupos no fueron estadísticamente significativas, las vacunas en las que los viriones fragmentados trivalentes se formulan con L9 o L9 + MPL inducen generalmente una respuesta inmunitaria más potente sistémica así como local. Además, en comparación con la vacuna que contiene L9, la vacuna formulada con L9 + MPL indujo el mismo nivel de inmunidad pero con una dosificación de antígeno menor.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 7 Evaluación de una vacuna contra la gripe de virión fragmentada trivalente derivada de huevo administrada por vía intranasal con o sin Laureth 9 o Laureth 9 + 3D-MPL administrada según un programa de una dosis, en comparación con una vacuna contra la gripe de virión fragmentada trivalente administrado por vía intramuscular en adultos sanos de 18-40 años de edad
En este estudio se evalúan las respuestas inmunitarias sistémicas y mucosas locales frente a las vacunas en aproximadamente 120 sujetos varones y hembras sanos.
\vskip1.000000\baselineskip
Composición de las vacunas candidatas
En este estudio se evalúan cinco formulaciones de los antígenos del virus influenza fragmentados derivados de huevos. Las vacunas candidatas se administran por vía intranasal. Además, se usa Fluarix^{TM} de SmithKline Beecham Biologicals (vacuna contra la gripe de virión fragmentada inactivada administrada por vía muscular) como producto de comparación.
Las vacunas intranasales candidatas contienen los tres antígenos de virión fragmentados inactivados usados en la formulación de Fluarix^{TM}. Las cepas son las que ha recomendado la OMS para la temporada 2000 en el hemisferio sur. Se presenta una descripción general de las diversas formulaciones en la tabla 6.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
TABLA 6 Descripción general de la vacunas 
\vskip1.000000\baselineskip
13 
\newpage
Vacunas intranasales contra la gripe fragmentadas trivalentes sin L9 ni MPL (dosis de 30 \mug y dosis de 15 \mug)
El volumen de una dosis es 0,2 ml.
TABLA 7
14
Vacunas intranasales contra la gripe fragmentadas trivalentes formuladas con L9 (dosis de 15 \mug y dosis de 7,5 \mug)
El volumen de una dosis es 0,2 ml. La formulación es según lo mostrado en la tabla 7, incluyendo además 1 mg de Laureth 9 por dosis, junto con una dosis de 15 ó 7,5 \mug de HA por cepa. El Laureth 9 se obtiene de Kreussler, Alemania.
\vskip1.000000\baselineskip
Vacuna intranasal contra la gripe fragmentada trivalente formulada con L9 + 3D-MPL (dosis de 7,5 \mug)
El volumen de una dosis es 0,2 ml. La formulación es según lo mostrado en la tabla 7, incluyendo además 1 mg de Laureth 9 y 50 \mug de 3D-MPL por dosis, junto con una dosis de 7,5 \mug de HA por cepa.
\vskip1.000000\baselineskip
La vacuna contra la gripe fragmentada trivalente inactivado comercial Fluarix^{TM} usada como producto de comparación
Se usa Fluarix^{TM} 2000 (hemisferio sur), como producto de comparación. Esta vacuna de una dosis de 0,5 ml se administra por vía intramuscular.
Una dosis contiene 15 \mug de hemaglutinina de cada cepa del virus influenza (A/New Caledonia/20/99 (H1N1) -A/Sydney/5/97 (H3N2) -B/Yamanashi/166/98) y 50 \mug de tiomersal como conservante por dosis.
\vskip1.000000\baselineskip
Formulación de las vacunas candidatas contra la gripe fragmentadas trivalentes 1. Concentración de los tres viriones fragmentados inactivados
Antes de la formulación de las vacunas candidatas finales, se concentraron por separado los tres viriones fragmentados inactivados mediante filtración en flujo tangencial hasta 1000 \mug a 1500 \mug de HA por ml. Se usaron casetes de membrana equipados con una membrana de triacetato de celulosa con un punto de corte de 10 kDa.
2. Formulación de las vacunas contra la gripe fragmentadas trivalentes
El diagrama de flujo de la formulación se presenta a continuación:
100
Para las formulaciones que contienen Laureth 9, se añade Laureth-9 hasta el 0,5% inmediatamente antes del ajuste del pH y se continúa la agitación a temperatura ambiente durante 15 minutos.
Para las formulaciones que contienen Laureth 9 + 3D-MPL, se añade 3D-MPL 250 \mug/ml inmediatamente antes de la adición del Laureth 9 y se agita la formulación durante 15 minutos antes de añadir Laureth 9.
\vskip1.000000\baselineskip
Llenado de la vacunas candidatas contra la gripe fragmentadas trivalentes
Se llenan asépticamente viales de vidrio de tipo 1 (Farm. Eur.) de Pfeiffer (Alemania) con las reservas a granel finales. Inmediatamente tras el llenado, se cierran esos viales con un tapón de goma. Todas las operaciones se realizan en una sala aséptica (sistema de flujo laminar).
Tras el llenado y el cierre, se insertan los viales tapados en un émbolo de plástico y se montan en un dispositivo con boquilla de pulverización para la generación de una pulverización. Este dispositivo permite la administración de dos pulverizaciones de 100 \mul.
Resultados
Para todos los sujetos, se lleva a cabo el siguiente análisis:
1. En los días 0, 21 y 42: títulos mediante ELISA de IgA mucosa (respuesta inmunitaria local) ELISA, sometidos a prueba por separado frente a cada una de las tres cepas de virus influenza representadas en la vacuna.
2. En los días 0, 21 y 42: títulos de anticuerpo de inhibición de la hemaglutinación (HI) en suero, sometidos a prueba por separado frente a cada una de las tres cepas de virus influenza.
\vskip1.000000\baselineskip
De esto se derivan:
1. Las GMT de anticuerpo de HI en suero (con intervalos de confianza al 95%) en todos los puntos de tiempo.
2. Para HI: tasas de seroconversión en el día 21.
3. Para HI: factores de conversión en el día 21.
4. Para HI: tasas de protección en los días 21 y 42.
5. Sólo para IgA: porcentaje de sujetos que tienen un aumento de 2 veces y de 4 veces en los títulos de IgA desde el día 0 hasta el día 21 y del día 0 al día 42.

Claims (25)

1. El uso de una preparación de antígeno del virus influenza fragmentado muerto en la fabricación de una formulación de vacuna para una vacunación intranasal de una dosis contra la gripe, en el que la vacunación de una dosis logra al menos dos de los siguientes criterios para la o todas las cepas de virus influenza presentes en la vacuna:
(i)
una tasa de seroconversión superior o igual al 40% para una población adulta humana (18-60 años) o al 30% en una población anciana humana (> 60 años);
(ii)
una tasa de seroprotección superior o igual al 70% para una población adulta humana (18-60 años) o al 60% en una población anciana humana (> 60 años); y
(iii)
un factor de conversión superior o igual a 2,5 para una población adulta humana (18-60 años) o a 2,0 en una población anciana humana (> 60 años).
2. El uso según la reivindicación 1, en el que se cumplen los tres criterios de la Unión Europea según lo expuesto en la reivindicación 1 para la o todas las cepas de virus influenza representadas en la vacuna.
3. El uso según la reivindicación 1 ó 2, en el que la formulación comprende al menos un tensioactivo.
4. El uso según la reivindicación 3, en el que el tensioactivo es al menos un tensioactivo no iónico seleccionado del grupo que consiste en los octilfenoxipolietoxietanoles (por ejemplo de la serie Triton^{TM} disponible comercialmente), ésteres de polioxietilenosorbitano (serie Tween^{TM}) y ésteres o éteres de polioxietileno de fórmula general (I):
(I)HO(CH_{2}CH_{2}O)_{n}-A-R
en la que n es 1-50, A es un enlace o -C(O)-, R es alquilo C_{1-50} o fenilalquilo C_{1-50}, y combinaciones de dos o más de éstos.
5. El uso según la reivindicación 4, en el que el tensioactivo no iónico es al menos un tensioactivo seleccionado del grupo constituido por t-octilfenoxipolietoxietanol (Triton X-100), monooleato de polioxietilenosorbitano (Tween 80) y Laureth 9, o una combinación de dos o más de éstos.
6. El uso según la reivindicación 5, en el que la vacuna comprende una combinación de dos de los tres tensioactivos no iónicos, concretamente monooleato de polioxietilenosorbitano (Tween 80) y t-octilfenoxipolietoxietanol (Triton X-100).
7. El uso según la reivindicación 6, en el que la vacuna comprende una combinación de los tres tensioactivos no iónicos.
8. El uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que la vacuna comprende además un ácido biliar o ácido cólico, o derivado de los mismos tal como desoxicolato de sodio.
9. El uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que cada dosis de la formulación de vacuna contiene una dosis baja de hemaglutinina.
10. El uso según la reivindicación 9, en el que el contenido en hemaglutinina por cepa de virus influenza es de 30 \mug o menos por dosis.
11. El uso según la reivindicación 10, en el que el contenido en hemaglutinina por cepa de virus influenza es de 15 \mug o menos por dosis.
12. El uso según la reivindicación 11, en el que el contenido en hemaglutinina es de 7,5 \mug o menos de hemaglutinina por cepa de virus por dosis de vacuna.
13. El uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en el que la formulación de vacuna está en un volumen por dosis que es inferior a 500 \mul.
14. El uso según la reivindicación 13, en el que el volumen por dosis es inferior a 300 \mul o no superior a 200 \mul por dosis.
15. El uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, en el que la vacuna se administra en un formato de bidosis de dos subdosis.
16. El uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, en el que la vacuna no contiene un inmunoestimulante añadido.
17. El uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16, en el que la vacuna comprende además un derivado no tóxico de lípido A, preferiblemente seleccionado de derivados no tóxicos de monofosforil-lípido A y difosforil-lípido A.
18. El uso según la reivindicación 17, en el que la vacuna comprende monofosforil-lípido A 3-des-O-acilado (3D-MPL).
19. El uso según la reivindicación 18, en el que la vacuna comprende monofosforil-lípido A 3-des-O-acilado (3D-MPL) y Laureth 9.
20. Un kit farmacéutico que comprende un dispositivo de administración intranasal y una vacuna de una dosis que comprende una preparación de antígeno del virus influencia fragmentado muerto sin un inmunoestimulante añadido, que genera una respuesta inmunitaria que logra al menos dos de los criterios según lo expuesto en la reivindicación 1 para la o todas las cepas de virus influenza presentes en la vacuna.
21. Un kit farmacéutico que comprende un dispositivo de administración intranasal y una vacuna contra la gripe fragmentada de una dosis que genera una respuesta inmunitaria que logra al menos dos de los criterios según lo expuesto en la reivindicación 1 para la o todas las cepas de virus influenza presentes en la vacuna.
22. Un kit farmacéutico que comprende un dispositivo de administración intranasal y una vacuna de una dosis que comprende una dosis baja de HA de una preparación de antígeno del virus influenza fragmentado muerto que genera una respuesta inmunitaria que logra al menos dos de los criterios según lo expuesto en la reivindicación 1 para la o todas las cepas de virus influenza presentes en la vacuna.
23. El kit farmacéutico según una cualquiera de las reivindicaciones 20 a 22, en el que el dispositivo es un dispositivo de administración de bidosis para administrar dos subdosis en una única administración.
24. El kit farmacéutico según una cualquiera de las reivindicaciones 20 a 23, en el que el dispositivo es un dispositivo de pulverización intranasal.
25. Un procedimiento de fabricación de una vacuna contra la gripe de una dosis para la aplicación nasal, procedimiento que comprende:
(i)
proporcionar una preparación de virus influenza fragmentado producida esencialmente tal como para una vacuna contra la gripe inyectada convencional y que comprende al menos un tensioactivo no iónico;
(ii)
ajustar opcionalmente la concentración de hemaglutinina y/o la concentración de tensioactivo no iónico en la preparación;
(iii)
llenar un dispositivo de administración intranasal con una dosis de vacuna de la preparación de virus influenza fragmentado, siendo dicha dosis un volumen adecuado para la administración intranasal, opcionalmente en un formato de bidosis, y cuya aplicación de una dosis genera una respuesta inmunitaria que logra al menos dos de los criterios según lo expuesto en la reivindicación 1 para la o todas las cepas de virus influenza presentes en la vacuna.
ES00967781T 1999-09-24 2000-09-22 Vacuna intranasal contra el virus influenza. Expired - Lifetime ES2293923T3 (es)

Applications Claiming Priority (6)

Application Number Priority Date Filing Date Title
GB9922703 1999-09-24
GBGB9922703.5A GB9922703D0 (en) 1999-09-24 1999-09-24 Vaccine
GB9922700 1999-09-24
GBGB9922700.1A GB9922700D0 (en) 1999-09-24 1999-09-24 Vaccine
GB0016686 2000-07-06
GB0016686A GB0016686D0 (en) 2000-07-06 2000-07-06 Novel vaccine

Publications (1)

Publication Number Publication Date
ES2293923T3 true ES2293923T3 (es) 2008-04-01

Family

ID=27255796

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES00967781T Expired - Lifetime ES2293923T3 (es) 1999-09-24 2000-09-22 Vacuna intranasal contra el virus influenza.

Country Status (23)

Country Link
US (2) US20050201946A1 (es)
EP (2) EP1214054B1 (es)
JP (1) JP4763197B2 (es)
KR (1) KR20020038771A (es)
CN (1) CN1391463A (es)
AR (2) AR025750A1 (es)
AT (1) ATE376825T1 (es)
AU (1) AU764368B2 (es)
BR (1) BR0014281A (es)
CA (1) CA2383105C (es)
CO (1) CO5280082A1 (es)
CZ (1) CZ20021044A3 (es)
DE (1) DE60036952T2 (es)
ES (1) ES2293923T3 (es)
HU (1) HUP0202846A3 (es)
IL (1) IL148673A0 (es)
MX (1) MXPA02003069A (es)
MY (1) MY126588A (es)
NO (1) NO20021431L (es)
NZ (1) NZ517903A (es)
PL (1) PL355287A1 (es)
TR (1) TR200200776T2 (es)
WO (1) WO2001021151A1 (es)

Families Citing this family (85)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB9923176D0 (en) * 1999-09-30 1999-12-01 Smithkline Beecham Biolog Novel composition
GB0024089D0 (en) * 2000-10-02 2000-11-15 Smithkline Beecham Biolog Novel compounds
US20040071734A1 (en) 2001-02-23 2004-04-15 Nathalie Garcon Novel vaccine
TWI228420B (en) * 2001-05-30 2005-03-01 Smithkline Beecham Pharma Gmbh Novel vaccine composition
CA2559371C (en) 2004-03-09 2014-07-08 Chiron Corporation Influenza virus vaccines
EP1909830B1 (en) * 2005-08-02 2011-09-28 Novartis Vaccines and Diagnostics S.r.l. Reducing interference between oil-containing adjuvants and surfactant-containing antigens
CN104474543A (zh) 2005-11-01 2015-04-01 诺华疫苗和诊断有限两合公司 经由β-丙内酯处理的残留细胞DNA水平降低的细胞衍生病毒疫苗
US11707520B2 (en) 2005-11-03 2023-07-25 Seqirus UK Limited Adjuvanted vaccines with non-virion antigens prepared from influenza viruses grown in cell culture
KR20080069232A (ko) 2005-11-04 2008-07-25 노바티스 백신즈 앤드 다이아그노스틱스 에스.알.엘. 스플리트 인플루엔자 백신에 대한 보조제로서 유리 수성상계면활성제를 갖는 에멀젼
EP2368572B1 (en) 2005-11-04 2020-03-04 Seqirus UK Limited Adjuvanted vaccines with non-virion antigens prepared from influenza viruses grown in cell culture
NZ568211A (en) 2005-11-04 2011-11-25 Novartis Vaccines & Diagnostic Influenza vaccines including combinations of particulate adjuvants and immunopotentiators
NZ592713A (en) 2005-11-04 2012-12-21 Novartis Vaccines & Diagnostic Adjuvanted influenza vaccines including a cytokine-inducing agents other than an agonist of Toll-Like Receptor 9
KR20110110853A (ko) 2006-01-27 2011-10-07 노파르티스 파르마 아게 적혈구응집소 및 기질 단백질을 함유한 인플루엔자 백신
US8535683B2 (en) 2006-03-22 2013-09-17 Abbott Biologicals B.V. Intranasal or inhalational administration of virosomes
US20080038294A1 (en) * 2006-03-22 2008-02-14 Kersten Alexander J Intranasal or inhalational administration of virosomes
US20100068223A1 (en) 2006-03-24 2010-03-18 Hanno Scheffczik Storage of Influenza Vaccines Without Refrigeration
GB0614460D0 (en) 2006-07-20 2006-08-30 Novartis Ag Vaccines
CA3016948A1 (en) 2006-09-11 2008-03-20 Seqirus UK Limited Making influenza virus vaccines without using eggs
CN101015691B (zh) * 2006-11-14 2010-08-25 中国医学科学院医学生物学研究所 重组噬菌体流感疫苗
PL2121011T3 (pl) 2006-12-06 2014-10-31 Novartis Ag Szczepionki zawierające antygeny czterech szczepów wirusa grypy
EA201070066A1 (ru) 2007-06-27 2010-06-30 Новартис Аг Вакцины против гриппа с низким содержанием добавок
GB0810305D0 (en) 2008-06-05 2008-07-09 Novartis Ag Influenza vaccination
WO2009081172A1 (en) 2007-12-24 2009-07-02 Novartis Ag Assays for adsorbed influenza vaccines
US8506966B2 (en) 2008-02-22 2013-08-13 Novartis Ag Adjuvanted influenza vaccines for pediatric use
EP2268309B1 (en) 2008-03-18 2015-01-21 Novartis AG Improvements in preparation of influenza virus vaccine antigens
AU2009255776A1 (en) * 2008-06-02 2009-12-10 Ge Healthcare Bio-Sciences Ab Method for virus detection
EP2361304A2 (en) 2008-11-05 2011-08-31 GlaxoSmithKline Biologicals S.A. Novel method
CU20080215A7 (es) 2008-11-19 2012-06-21 Inst Finlay Vacunas unitemporales
WO2010092477A1 (en) 2009-02-10 2010-08-19 Novartis Ag Influenza vaccines with increased amounts of h3 antigen
CA2752039A1 (en) 2009-02-10 2010-08-19 Novartis Ag Influenza vaccine regimens for pandemic-associated strains
EA201500910A1 (ru) 2009-02-10 2016-04-29 Новартис Аг Вакцины против гриппа со сниженным количеством сквалена
JP2012521786A (ja) 2009-03-30 2012-09-20 モウント シナイ スクール オフ メディシネ インフルエンザウイルスワクチン及びその使用
DE102010018462A1 (de) 2009-04-27 2011-04-07 Novartis Ag Impfstoffe zum Schutz gegen Influenza
CN102597246B (zh) 2009-05-21 2014-02-26 诺华股份有限公司 使用非内源pol I启动子的反向遗传
AU2010254136B2 (en) 2009-05-26 2016-09-29 Mount Sinai School Of Medicine Monoclonal antibodies against influenza virus generated by cyclical administration and uses thereof
JP5716297B2 (ja) 2009-06-25 2015-05-13 Jnc株式会社 クロマトグラフィー用充填剤、その製造方法、およびそれを用いたウイルス用ワクチンの製造方法
WO2011005772A1 (en) 2009-07-06 2011-01-13 Variation Biotechnologies, Inc. Methods for preparing vesicles and formulations produced therefrom
BR112012000826B1 (pt) 2009-07-06 2022-07-26 Variation Biotechnologies Inc Método para a preparação de vesículas
EP2459722B1 (en) 2009-07-31 2017-09-06 Seqirus UK Limited Reverse genetics systems
CN102695523A (zh) 2009-09-10 2012-09-26 诺华有限公司 针对呼吸道疾病的组合疫苗
CA2778332A1 (en) 2009-10-20 2011-04-28 Novartis Ag Improved reverse genetics methods for virus rescue
GB0918830D0 (en) 2009-10-27 2009-12-09 Glaxosmithkline Biolog Niederl Process
JP2013520172A (ja) * 2010-02-18 2013-06-06 モウント シナイ スクール オフ メディシネ インフルエンザウイルス疾患の予防及び治療で用いるためのワクチン
US9708373B2 (en) 2010-03-30 2017-07-18 Icahn School Of Medicine At Mount Sinai Influenza virus vaccine and uses thereof
CN102946727B (zh) 2010-05-06 2015-08-19 诺华有限公司 微生物灭活的有机过氧化物化合物
CA2800150C (en) 2010-05-21 2018-09-04 Novartis Ag Influenza virus reassortment method
DK2575872T3 (da) 2010-06-01 2020-10-19 Seqirus Uk Ltd Koncentrering af influenzavaccineantigener uden frysetørring
AU2011262312B2 (en) 2010-06-01 2015-05-28 Novartis Ag Concentration and lyophilization of influenza vaccine antigens
WO2011154976A2 (en) 2010-06-08 2011-12-15 Panacea Biotec Limited Improved influenza vaccine
AU2011276223C1 (en) 2010-07-06 2016-05-12 Variation Biotechnologies, Inc. Compositions and methods for treating influenza
CN101899101B (zh) * 2010-07-21 2012-07-25 中国检验检疫科学研究院 一种用于流感病毒亚单位疫苗研究的合成多肽
CA2808965C (en) 2010-08-20 2020-01-07 Novartis Ag Soluble needle arrays for delivery of influenza vaccines
EP2663288B1 (en) 2011-01-13 2022-12-21 Variation Biotechnologies Inc. Methods for preparing vesicles and formulations produced therefrom
BR112013017939B1 (pt) 2011-01-13 2022-11-16 Variation Biotechnologies Inc Composição imunogênica liofilizada termoestável, uso e método para preparação da mesma
EA201490659A1 (ru) 2011-09-20 2014-11-28 Маунт Синай Скул Оф Медсин Вакцины против вируса гриппа и их применения
GB201216121D0 (en) 2012-09-10 2012-10-24 Novartis Ag Sample quantification by disc centrifugation
EP2780350B1 (en) 2011-11-18 2019-03-06 Variation Biotechnologies Inc. Synthetic derivatives of mpl and uses thereof
EP2802353A4 (en) 2012-01-12 2015-12-02 Variation Biotechnologies Inc COMPOSITIONS AND METHOD FOR THE TREATMENT OF VIRUS INFECTIONS
US20150079077A1 (en) 2012-01-27 2015-03-19 Variation Biotechnologies, Inc. Methods and compositions for therapeutic agents
WO2013087945A2 (en) 2012-03-02 2013-06-20 Novartis Ag Influenza virus reassortment
CA2866465A1 (en) 2012-03-06 2013-09-12 Crucell Holland B.V. Improved vaccination against influenza
JP2015526062A (ja) 2012-06-04 2015-09-10 ノバルティス アーゲー 改善された安全性試験
GB201218195D0 (en) 2012-10-10 2012-11-21 Istituto Zooprofilattico Sperimentale Delle Venezie Composition
WO2014086732A2 (en) 2012-12-03 2014-06-12 Novartis Ag Influenza virus reassortment
UY34506A (es) * 2012-12-10 2014-06-30 Fernando Amaury Ferreira Chiesa Adyuvante de vacunación, preparación y vacunas que lo contienen
JP2016508133A (ja) 2012-12-18 2016-03-17 アイカーン スクール オブ メディシン アット マウント サイナイ インフルエンザウイルスワクチン及びその使用
JP2016506416A (ja) 2013-01-10 2016-03-03 ノバルティス アーゲー インフルエンザウイルス免疫原性組成物およびその使用
MX2015011529A (es) 2013-03-13 2016-02-05 Novartis Ag Reordenamiento del virus de infuenza b.
WO2014159960A1 (en) 2013-03-14 2014-10-02 Icahn School Of Medicine At Mount Sinai Antibodies against influenza virus hemagglutinin and uses thereof
US20140335116A1 (en) 2013-05-10 2014-11-13 Novartis Ag Avoiding narcolepsy risk in influenza vaccines
DE202013005100U1 (de) 2013-06-05 2013-08-26 Novartis Ag Influenza Virus Reassortierung
DE202013005130U1 (de) 2013-06-05 2013-09-10 Novartis Ag Influenza Virus Reassortierung
WO2014195920A2 (en) 2013-06-06 2014-12-11 Novartis Ag Influenza virus reassortment
JP6373376B2 (ja) 2013-11-15 2018-08-15 ノバルティス アーゲー 残留細胞培養不純物の除去
CA2974699A1 (en) 2015-01-23 2016-07-28 Icahn School Of Medicine At Mount Sinai Influenza virus vaccination regimens
JP2018524323A (ja) 2015-06-26 2018-08-30 セキラス ユーケー リミテッド 抗原がマッチしたインフルエンザワクチン
EP3764098B1 (en) 2015-07-07 2022-11-16 Seqirus UK Limited Influenza potency assays
CN105342982B (zh) * 2015-11-19 2018-08-28 上海现代药物制剂工程研究中心有限公司 经鼻给药的流感疫苗免疫制剂及其制备方法
WO2017218624A1 (en) 2016-06-15 2017-12-21 Icahn School Of Medicine At Mount Sinai Influenza virus hemagglutinin proteins and uses thereof
CA3058652A1 (en) 2017-04-07 2018-10-11 Icahn School Of Medicine At Mount Sinai Anti-influenza b virus neuraminidase antibodies and uses thereof
SG11202108766RA (en) * 2019-02-15 2021-09-29 Serum Inst Of India Pvt Ltd Live attenuated influenza vaccine composition and process for preparation thereof
MX2021010194A (es) 2019-02-25 2022-01-24 Seqirus Uk Ltd Vacunas contra la influenza multivalentes adyuvantadas.
EP4054630A2 (en) 2019-11-07 2022-09-14 Seqirus UK Limited Compositions and methods for producing a viral vaccine with reduced particle size
JP2023502650A (ja) 2019-11-18 2023-01-25 セキラス ピーティーワイ リミテッド 遺伝子再集合インフルエンザウイルスを産生するための方法
CN113599513A (zh) * 2020-10-23 2021-11-05 青岛大学 一种适用于咽喉部接种的新型冠状病毒疫苗的制备方法及接种方法

Family Cites Families (20)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3627873A (en) * 1967-06-09 1971-12-14 Arden Wesley Moyer Influenza vaccine with reduced pyrogenicity
US3874381A (en) * 1974-05-28 1975-04-01 Smithkline Corp Dual nozzle intranasal delivery device
SE8205892D0 (sv) * 1982-10-18 1982-10-18 Bror Morein Immunogent membranproteinkomplex, sett for framstellning och anvendning derav som immunstimulerande medel och sasom vaccin
CA1291036C (en) * 1986-04-23 1991-10-22 Edwin I. Stoltz Nasal administration of drugs
NZ230747A (en) * 1988-09-30 1992-05-26 Bror Morein Immunomodulating matrix comprising a complex of at least one lipid and at least one saponin; certain glycosylated triterpenoid saponins derived from quillaja saponaria molina
DK17093D0 (da) * 1993-02-15 1993-02-15 Lyfjathroun H F Farmaceutisk praeparat til topisk administrering af antigener og/eller vacciner til pattedyr via slimhinder
JPH08506592A (ja) * 1993-02-19 1996-07-16 スミスクライン・ビーチャム・コーポレイション ３−ｏ−脱アシル化モノホスホリル脂質Ａ含有のインフルエンザワクチン組成物
US5437267A (en) * 1993-08-03 1995-08-01 Weinstein; Allan Device for delivering aerosol to the nasal membranes and method of use
US5976552A (en) * 1995-04-28 1999-11-02 Protein Sciences Corporation Virus vaccines
RU2086232C1 (ru) * 1994-06-03 1997-08-10 Уфимский научно-исследовательский институт вакцин и сывороток им.И.И.Мечникова Средство для интраназальной профилактики гриппа
US5653987A (en) * 1995-05-16 1997-08-05 Modi; Pankaj Liquid formulations for proteinic pharmaceuticals
TW570803B (en) * 1997-04-09 2004-01-11 Duphar Int Res Influenza vaccine
JP2002511423A (ja) * 1998-04-09 2002-04-16 スミスクライン ビーチャム バイオロジカルズ ソシエテ アノニム ワクチン
AT407958B (de) * 1999-02-11 2001-07-25 Immuno Ag Inaktivierte influenza-virus-vakzine zur nasalen oder oralen applikation
US6506803B1 (en) * 1999-04-28 2003-01-14 Regents Of The University Of Michigan Methods of preventing and treating microbial infections
US7767197B2 (en) * 2000-06-22 2010-08-03 Endo Pharmaceuticals Colorado LLC Delivery vehicle composition and methods for delivering antigens and other drugs
US20040071734A1 (en) * 2001-02-23 2004-04-15 Nathalie Garcon Novel vaccine
US20040096463A1 (en) * 2001-02-23 2004-05-20 Nathalie Garcon Novel vaccine
TWI228420B (en) * 2001-05-30 2005-03-01 Smithkline Beecham Pharma Gmbh Novel vaccine composition
US20090028903A1 (en) * 2005-03-23 2009-01-29 Glaxosmithkline Biologicals, S.A. Novel use

Also Published As

Publication number Publication date
NZ517903A (en) 2003-10-31
US20050201946A1 (en) 2005-09-15
CN1391463A (zh) 2003-01-15
EP1878424A3 (en) 2008-04-09
TR200200776T2 (tr) 2002-06-21
PL355287A1 (en) 2004-04-05
EP1214054B1 (en) 2007-10-31
AR025750A1 (es) 2002-12-11
MXPA02003069A (es) 2002-09-30
ATE376825T1 (de) 2007-11-15
CA2383105C (en) 2010-01-26
IL148673A0 (en) 2002-09-12
KR20020038771A (ko) 2002-05-23
JP2003509451A (ja) 2003-03-11
JP4763197B2 (ja) 2011-08-31
BR0014281A (pt) 2002-05-21
EP1214054A1 (en) 2002-06-19
HUP0202846A3 (en) 2003-12-29
EP1878424A2 (en) 2008-01-16
CZ20021044A3 (cs) 2002-08-14
NO20021431D0 (no) 2002-03-21
CO5280082A1 (es) 2003-05-30
HUP0202846A2 (hu) 2002-12-28
AU764368B2 (en) 2003-08-14
MY126588A (en) 2006-10-31
CA2383105A1 (en) 2001-03-29
AR032597A1 (es) 2003-11-19
US20090155309A1 (en) 2009-06-18
DE60036952T2 (de) 2008-08-07
DE60036952D1 (de) 2007-12-13
NO20021431L (no) 2002-04-24
AU7782500A (en) 2001-04-24
WO2001021151A1 (en) 2001-03-29

Similar Documents

Publication Publication Date Title
ES2293923T3 (es) Vacuna intranasal contra el virus influenza.
JP6211555B2 (ja) 新規なワクチン
JP2003509451A5 (es)
JP4074582B2 (ja) 新規なワクチン
US20040096463A1 (en) Novel vaccine
JP2004520144A (ja) 新規ワクチン
CN107296792A (zh) 囊泡及由其产生之制剂的制备方法
ES2361981T3 (es) Formulaciones de vacunas de la gripe para administración intradérmica.
ZA200202269B (en) Intranasal influenza virus vaccine.
ES2358900T3 (es) Composiciones que comprenden complejos de antígenos, procedimiento para su preparación así como precedimientos de utilización de los complejos de antígenos para la vacunación.