CN102695523A - 针对呼吸道疾病的组合疫苗 - Google Patents

Abstract

将流感、肺炎球菌和/或RSV疫苗作为组合疫苗给予，同时维持免疫效力。该组合简化了针对这两种下呼吸道感染的免疫接种。肺炎球菌疫苗理想上包括至少一种肺炎球菌多肽。

Description

针对呼吸道疾病的组合疫苗

本申请要求2009年9月10日提交的美国临时申请61/241,264和2009年9月11日提交的美国临时申请61/241,485的权益，这两项申请的全部内容通过引用纳入本文。

技术领域

本发明属于针对下和/或上呼吸道疾病的免疫接种领域。

背景技术

已知同时对对象施用不同的呼吸道疫苗，例如同时施用肺炎球菌疫苗和流感病毒疫苗(例如参考文献1-4)。也已知将两种或更多疫苗作为组合物施用的组合疫苗，例如参考文献5组合了(偶联或未偶联的)肺炎球菌糖和呼吸道合胞病毒(RSV)抗原，还推测可加入许多其它抗原，例如流感病毒抗原。文献6公开了RSV的融合(F)、附着(G)和基质(M)蛋白与流感疫苗的组合。文献7公开了基于施用质粒的针对甲型流感病毒和RSV的组合疫苗。

本发明的一个目的是简化针对下和/或上呼吸道疾病的免疫接种。

发明内容

虽然参考文献1-4(和很多其它文献)已经同时施用了独立的流感和肺炎球菌疫苗，本发明人发现这类疫苗可作为组合疫苗施用，同时仍保留其免疫效力。虽然参考文献5包括了RSV抗原，本发明人提供了一种不必要包含RSV组分的流感和肺炎球菌疫苗组合。另外，与参考文献5相反，发明人优选包括肺炎球菌蛋白抗原，而不是仅依赖于肺炎球菌糖抗原。而且，纳入肺炎球菌免疫原(包括蛋白和/或糖组分)可改善参考文献6和7的疫苗。这些发现意味着可简化和改良针对这些不同下呼吸道感染的免疫接种。

组合流感和肺炎球菌疫苗并非无关紧要。虽然现有肺炎球菌疫苗(例如PREVNAR^TM和SYNFLORIX^TM产品)具有固定的组成，而且常年随时施用，流感疫苗组成随季节变化，在冬季开始时施用。因此，这两种疫苗先天不相容，但是发明人证明组合是可行的。

因此，本发明提供了一种包含流感病毒免疫原和肺炎球菌免疫原的免疫原性组合物。这些组合物适用于同时针对流感病毒和肺炎球菌的免疫接种。肺炎球菌免疫原通常包含至少一种肺炎球菌多肽。所述组合物可包含RSV免疫原，但在一些实施方式中组合物不包括RSV免疫原。

本发明还提供了一种免疫原性组合物，其包含(i)包含至少一种肺炎球菌多肽的肺炎球菌免疫原和(ii)流感病毒免疫原和/或RSV免疫原。在一些实施方式中，所述组合物不包括RSV免疫原，在一些实施方式中所述组合物不包括流感病毒免疫原，但在一些实施方式中它包括两种RSV免疫原和流感病毒免疫原。

本发明还提供了制备免疫原性组合物的方法，包括步骤：混合流感病毒免疫原和肺炎球菌免疫原。肺炎球菌免疫原通常包含至少一种肺炎球菌多肽。所述免疫原性组合物可以是不包括RSV免疫原的组合物。

本发明还提供了制备免疫原性组合物的方法，包括步骤：将包含至少一种肺炎球菌多肽的肺炎球菌免疫原和RSV免疫原与流感病毒免疫原中的一种或两种混合。当所述组合物包含所有3种肺炎球菌免疫原、RSV免疫原和流感病毒免疫原时，这些组分可以任意顺序混合。

本发明的这些方法可提供具有0.5ml单位剂量体积的组合物。

本发明的组合物还适用于针对B族链球菌(无乳链球菌(Streptococcusagalactiae)；GBS)的其它免疫接种。因此，在一些实施方式中，所述组合物还包括GBS免疫原，例如流感、肺炎球菌和GBS免疫原(含或不含RSV免疫原)的组合。本发明的方法包括步骤：混合GBS免疫原与(i)流感病毒免疫原，(ii)肺炎球菌免疫原，(iii)RSV免疫原，和/或(iv)流感病毒免疫原、肺炎球菌免疫原和RSV免疫原中的任意1、2、或3种的混合物。

流感病毒免疫原

流感病毒免疫原可以采用各种形式。流感疫苗通常基于活病毒或灭活的病毒，本发明优选使用灭活病毒作为流感免疫原。灭活病毒可基于全病毒颗粒、裂解病毒颗粒或纯化的表面抗原(包括血凝素，通常也包括神经氨酸酶)。可用于本发明的另一类流感病毒免疫原是病毒体。本发明还可用重组血凝素和/或神经氨酸酶糖蛋白作为流感病毒免疫原。另一种有用的流感病毒免疫原类型是M2基质蛋白。本发明可使用活的减毒疫苗，但通常仅和活的减毒RSV疫苗联用。

为了制备灭活的病毒免疫原，灭活病毒的化学方法包括用有效量的以下一种或多种试剂处理：去污剂、甲醛、β-丙内酯、亚甲基蓝、亚甲蓝、补骨脂素、羧基富勒烯(C60)、二元乙基胺、乙酰基乙烯亚胺或其组合。本领域已知病毒灭活的非化学方法，例如UV射线或γ射线辐射。

可通过各种方法由含病毒液体收获病毒颗粒。例如，纯化方法可包括用含有去污剂以破坏病毒颗粒的线性蔗糖梯度溶液进行区带离心。任选稀释后，可通过渗滤纯化抗原。

用去污剂处理纯化的病毒颗粒获得裂解病毒颗粒，产生亚病毒颗粒制剂，包括“吐温-醚”裂解法。裂解流感病毒的方法是本领域熟知的，例如参见参考文献8-13等。一般使用破坏浓度的裂解剂破坏或片段化全病毒来裂解病毒，无论该病毒有无感染性。这种破坏导致病毒蛋白的完全或部分溶解，改变病毒的完整性。优选的裂解剂是非离子型和离子型(例如阳离子)表面活性剂，如乙醚、脱氧胆酸盐、三正丁基磷酸、TergitolNP9、烷基糖苷、烷基硫苷、酰基糖、磺基甜菜碱、甜菜碱、聚氧乙烯烷基醚、N，N-二烷基-葡糖酰胺、Hecameg、烷基苯氧基-聚乙氧基乙醇、季铵化合物、肌氨酰、CTAB(溴化十六烷基三甲铵，例如塞塔隆(Cetavlon)、三正丁基磷酸酯、十四烷基三甲铵盐、lipofectin(脂质体转染试剂)、lipofectamine(脂质体转染胺试剂)和DOTMA、辛基-或壬基苯氧基聚氧乙醇(如曲通表面活性剂，如曲通X100或曲通N101)、聚氧乙烯去水山梨糖醇酯(吐温表面活性剂，例如聚山梨醇酯80)、聚氧乙烯醚、聚氧乙烯酯等。一种有用的裂解方法利用脱氧胆酸钠和甲醛的连续作用，并且裂解可在病毒颗粒初始纯化期间(例如在蔗糖密度梯度溶液中)进行。因此，裂解过程可包括：澄清含病毒颗粒的物质(以去除非病毒颗粒物质)，浓缩收获的病毒颗粒(例如使用吸附方法，如CaHPO₄吸附)，从非病毒颗粒材料分离全病毒颗粒，用裂解剂在密度梯度离心步骤中裂解病毒颗粒(例如，用含有裂解剂如脱氧胆酸钠的蔗糖梯度)，然后过滤(例如超滤)以去除不需要的物质。可将裂解的病毒颗粒重悬于磷酸钠缓冲的等渗氯化钠溶液中。BEGRIVAC^TM、FLUARIX^TM、FLUZONE^TM和FLUSHIELD^TM产品是裂解疫苗。

纯化的表面抗原包含流感表面抗原血凝素，一般还包含神经氨酸酶。其可通过从流感病毒颗粒纯化这些糖蛋白获得。制备这些蛋白质纯化形式的方法是本领域熟知的。FLUVIRIN^TM、AGRIPPAL^TM和INFLUVAC^TM产品是亚基疫苗。

另一种有用的流感抗原是病毒体[14](即无核酸病毒样脂质体颗粒)，例如在INFLEXAL V^TM和INVAVAC^TM产品中。病毒体可通过用去污剂溶解流感病毒，然后去除核衣壳和重建含病毒糖蛋白的膜来制备。另一种制备病毒体的方法包括将病毒膜糖蛋白加入至过量磷脂，得到膜中具有病毒蛋白质的脂质体。

作为从流感病毒颗粒衍生物质中制备流感疫苗的替代方法，也已知在异源重组宿主中表达蛋白。例如，可在昆虫细胞中用杆状病毒载体[15，16]中表达HA，神经氨酸酶也可以[17]。纯化的重组血凝素和/或神经氨酸酶糖蛋白可用作本发明的免疫原。这些重组抗原可以是全长，或可包含全长蛋白的表位，例如包含HA胞外域。

另一种有用的流感病毒免疫原类型是M2基质蛋白。已知用M2胞外域(M2e；长20-25个氨基酸)针对流感免疫。M2e可与乙肝病毒核心抗原(HBc)等蛋白融合，提供在其表面呈递M2抗原的免疫原性颗粒。与GCN4等蛋白融合还可提供寡聚M2e。本发明可用这样的重组M2e融合蛋白。

当流感病毒免疫原包含血凝素时，可包含多于一种血凝素。循环流感病毒的血凝素随时间改变，因此每季的疫苗免疫原都要保持更新。因此，流感病毒免疫原可以是多价的，例如包含至少一种甲型流感病毒血凝素和至少一种乙型流感病毒血凝素，包括至少两种不同的甲型流感病毒血凝素，包括至少两种不同的乙型流感病毒血凝素等。例如，一种组合物可包含来自两种甲型流感毒株(H1N1和H3N2)和一种乙型流感毒株的血凝素。当包含来自不同亚型(例如H1和H3)的两种甲型流感病毒血凝素时，如果含有神经氨酸酶，则理想上也包含两种不同的神经氨酸酶亚型(例如N1和N2)。然而在一些实施方式中，尽管所含血凝素亚型不同，但包含相同的神经氨酸酶亚型(例如H1N1和H5N1的组合)。

在其它实施方式中，含血凝素的流感病毒免疫原可以是单价的，即仅包含一种流感病毒株的血凝素。这样的单价免疫原通常来自甲型流感病毒，例如来自H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15或H16亚型中任意一种。单价免疫原对于流行毒株特别有效，包括对疫苗受体和一般人群首次免疫的毒株，例如H2、H5、H7或H9亚型的甲型流感病毒株。

更通常，流感病毒免疫原可包括血凝素，其来自：(i)血凝素亚型H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15和/或H16的甲型流感病毒的一种或多种(例如1、2、3、4、5或更多种)毒株；和/或(ii)乙型流感病毒的一种或多种(例如1、2、3、4、5或更多种)毒株。当包含一种以上乙型流感病毒血凝素时，包括各来自B/Victoria/2/87样毒株和B/Yamagata/16/88样毒株的血凝素有效。通常可从抗原性区分这两类毒株，但氨基酸序列的不同也可以区分这两种谱系，例如B/Yamagata/16/88样毒株常常(但并非总是)具有氨基酸残基164缺失(相对′Lee40′HA序列进行编号)的HA蛋白[18]。

用于本发明的合适流感病毒免疫原的具体实施方式包括但不限于包括血凝素的免疫原，其来自：(i)H1N1甲型流感病毒、H3N2甲型流感病毒、和乙型流感病毒的三价组合；(ii)单价H5N1甲型流感病毒；(iii)H1N1甲型流感病毒、H3N2甲型流感病毒、B/Victoria/2/87样乙型流感病毒和B/Yamagata/16/88样乙型流感病毒的四价组合；(iv)H1N1甲型流感病毒、H3N2甲型流感病毒、H5N1甲型流感病毒和乙型流感病毒的四价组合。

血凝素(HA)是现有灭活流感疫苗中的主要流感病毒免疫原，全都含有HA，且参照一般由SRID测定的HA水平来标准化疫苗剂量。现有的疫苗一般含有约15μgHA/毒株，但也可使用更低的剂量，例如用于儿童或大流行情况下，或者是使用佐剂时。分数剂量如1/2(即7.5μg HA/毒株)、1/4和1/8[19，20]以及较高剂量(如3x或9x剂量[21，22])已有应用。因此，疫苗可包含0.1-150μg HA/流感毒株，优选0.1-50μg，例如0.1-20μg、0.1-15μg、0.1-10μg、0.1-7.5μg、0.5-5μg等。具体剂量包括例如，约45、约30、约15、约10、约7.5、约5、约3.8、约1.9、约1.5μg等/毒株。疫苗中优选包含质量基本相同的每种毒株的HA，例如每种毒株的HA质量在每种毒株平均HA质量的10％之内，优选平均值的5％之内。

流感病毒免疫原中的血凝素可以是野生型病毒中发现的天然HA，或经修饰HA。例如，已知修饰HA以去除能在禽类动物中引起高致病性病毒的决定簇(如HA1/HA2切割位点周围的超碱性区域)。

流感病毒免疫原中的血凝素理想上相对含Sia(α2，3)Gal末端二糖的寡糖，更优选结合含Sia(α2，6)Gal末端二糖的寡糖。人流感病毒结合具有Sia(α2.6)Gal末端二糖(经α-2，6连接至半乳糖的唾液酸)的受体寡糖，而卵和Vero细胞具有含Sia(α2，3)Gal末端二糖的受体寡糖。人流感病毒在细胞如MDCK中的生长提供了血凝素选择压力，从而维持了天然的Sia(α2，6)Gal结合，这点与卵传代不同。为了确定病毒是否相对含Sia(α2，3)Gal末端二糖的寡糖，更优选结合含Sia(α2，6)Gal末端二糖的寡糖，可利用各种分析试验。例如，参考文献23描述了测定流感病毒受体-结合活性的固相酶联试验，对亲合常数进行灵敏性和定量测定。参考文献24采用固相试验，该试验评估病毒与两种不同的唾液酸糖蛋白的结合(卵类粘蛋白，具有Sia(α2，3)Gal决定簇；和猪α2巨球蛋白，具有Sia(α2，6)Gal决定簇)，也描述了评价针对两种受体类似物：游离唾液酸(Neu5Ac)和3′-唾液酸乳糖(Neu5Acα2-3Galβ1-4Glc)的病毒结合试验。参考文献25报道的试验采用能够清楚区分α2，3或α2，6连接受体偏好的聚糖阵列。参考文献26报道的试验基于经酶促修饰包含Sia(α2，6)Gal或Sia(α2，3)Gal的人红细胞的凝集。根据试验类型，可利用病毒本身直接进行试验，或者可利用从病毒纯化的血凝素间接进行试验。

在一些实施方式中，血凝素(和其它存在于流感病毒免疫原中的流感病毒糖蛋白)具有与鸡蛋衍生病毒不同的糖基化模式。因此，所述糖蛋白包含鸡蛋中未见的糖形。

当从流感病毒颗粒制备流感病毒免疫原时，可在合适底物中生产。目前用于培养流感病毒的底物包括卵和细胞培养物。目前培养流感病毒的标准方法采用无特异病原(SPF)鸡胚蛋，由乱内容物(尿囊液)纯化病毒颗粒。然而，另外也已经在动物细胞培养物上培养病毒，出于速度和患者变态反应的原因，优选这种培养方法。

对于这种细胞培养法，通常在哺乳动物来源的细胞系中培养病毒。合适的哺乳动物细胞来源包括但不限于：仓鼠，牛，灵长类(包括人和猴)及犬细胞，但不优选使用灵长类细胞。可使用各种细胞类型，例如肾细胞、成纤维细胞、视网膜细胞、肺细胞等。合适仓鼠细胞的例子是名为BHK21或HKCC的细胞系。合适的猴细胞是例如，非洲绿猴细胞，例如肾细胞，如Vero细胞系[27-29]。合适的犬细胞是(例如)肾细胞，例如CLDK和MDCK细胞系。

因此，合适的细胞系包括但不限于：MDCK、CHO、CLDK、HKCC、293T、BHK、Vero、MRC5、PER.C6[30]、FRhL2、WI-38等。合适的细胞系可由各种来源获得，例如美国典型细胞培养物保藏中心(ATCC)[31]、Coriell细胞库[32]、或欧洲细胞培养物保藏中心(ECACC)。例如，ATCC提供各种不同Vero细胞，目录号为CCL81、CCL81.2、CRL1586和CRL-1587；并提供MDCK细胞，目录号为CCL34。PER.C6可获自ECACC，保藏号为96022940。

最优选的细胞系是具有哺乳动物类型糖基化的细胞系。作为哺乳动物细胞系的次优选，病毒也可禽细胞系上生长[例如参考文献33-35]，包括衍生自鸭(例如鸭视网膜)或母鸡。禽细胞系的例子包括禽胚胎干细胞[33，36]和鸭视网膜细胞[34]。合适的禽胚胎干细胞包括衍生自鸡胚胎干细胞的Ebx细胞系、EB45、EB14和EB14-074[37]。也可利用鸡胚成纤维细胞(CEF)。然而，与使用禽类细胞相比，使用哺乳动物细胞系意味着该疫苗可能不含禽类DNA和卵蛋白质(如卵清蛋白和卵类粘蛋白)，从而降低变应原性。

用于培养流感病毒的最优选的细胞系是来自马-达二氏犬肾的MDCK细胞系[38-41]。原始MDCK细胞系可以是来自ATCC的CCL34，但也可利用该细胞系的衍生细胞系。例如，参考文献38公开了适合悬浮培养的MDCK细胞系(′MDCK33016′，保藏号DSM ACC 2219)。类似的，参考文献42公开了在无血清培养中悬浮培养的MDCK衍生细胞系(′B-702′，保藏号FERM BP-7449)。参考文献43公开了非致瘤性MDCK细胞，包括′MDCK-S′(ATCC PTA-6500)、′MDCK-SF101′(ATCCPTA-6501)、′MDCK-SF102′(ATCC PTA-6502)和′MDCK-SF103′(PTA-6503)。参考文献44公开了非常容易感染的MDCK细胞系，包括‘MDCK.5F1’细胞(ATCC CRL12042)。可使用任何这些MDCK细胞系。

可以在贴壁或悬浮培养的细胞中培养病毒。也可使用微载体培养。在一些实施方式中，细胞可能因而适合悬浮培养。

优选在无血清培养基和/或无蛋白培养基中培养细胞系。在本发明中，没有人或动物血清来源添加剂的培养基称为无血清培养基。生长于此类培养物中的细胞自身天然包含蛋白质，但是无蛋白质培养基应理解为在其中细胞的倍增发生于没有蛋白质、生长因子、其它蛋白质添加剂和非血清蛋白质的条件下，但是可以任选包含病毒生长必须的蛋白质，如胰蛋白酶或其它蛋白酶。

在病毒复制过程中，支持流感病毒复制的细胞系优选在37℃以下[45](如30-36℃，或约30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃)培养。

在培养细胞中增殖流感病毒的方法通常包括以下步骤：用待培养毒株接种体接种培养的细胞；将感染细胞培养所需时间以增殖病毒，如由病毒效价或抗原表达所测定(例如，在接种后培养24至168小时)；收集增殖的病毒。用1∶500-1∶1，优选1∶100-1∶5，更优选1∶50-1∶10的病毒(由PFU或TCID50测定)：细胞比接种培养的细胞。在细胞悬液中加入病毒，或将病毒加到单层细胞上，病毒在25-40℃，优选28-37℃吸附到细胞上至少60分钟，但通常短于300分钟，优选在90-240分钟之间。可通过冻融或酶作用除去感染的细胞培养物(例如单层)，以提高收获的培养物上清中的病毒含量。然后，可灭活或冷冻储存收获的液体。可以约0.0001-10、优选0.002-5、更优选0.001-2的感染复数(″m.o.i.″)感染培养的细胞。更优选以约0.01的m.o.i.感染细胞。可以在感染后30-60小时收获感染的细胞。优选在感染后34-48小时收获细胞。更优选在感染后38-40小时收获细胞。通常在细胞培养期间加入蛋白酶(一般是胰蛋白酶)，以释放病毒，所述蛋白酶可以在培养过程的任何合适阶段加入，例如接种前、接种同时或接种后[45]。

在优选实施方式中，尤其是使用MDCK细胞时，来自主工作细胞库中的细胞系传代不超过40次群体倍增水平。

病毒接种体和病毒培养物优选不含(即经测试且得到阴性污染结果)单纯疱疹病毒、呼吸道合胞病毒、副流感病毒3、SARS冠状病毒、腺病毒、鼻病毒、呼肠孤病毒、多瘤病毒、双RNA病毒、环病毒和/或细小病毒[46]。特别优选不存在单纯疱疹病毒。

用细胞系培养病毒时，标准实践是最大程度减少最终疫苗中残留的细胞系DNA的含量，以最大程度降低该DNA的致癌活性。因此，用培养物培养的流感病毒制备的组合物优选含有每剂量低于10ng(优选低于1ng，更优选低于100pg)残留的宿主细胞DNA，但可能存在痕量宿主细胞DNA。优选每15μg血凝素中宿主细胞DNA含量＜10ng(如＜1ng、＜100pg)的疫苗，以及每0.25ml体积中宿主细胞DNA含量＜10ng(如＜1ng、＜100pg)的疫苗。更优选每50μg血凝素中宿主细胞DNA含量＜10ng(如＜1ng、＜100pg)的疫苗，以及每0.5ml体积中宿主细胞DNA含量＜10ng(如＜1ng、＜100pg)的疫苗。

任何残留宿主细胞DNA的平均长度优选小于500bp，例如小于400bp、小于300bp、小于200bp、小于100bp等。

在疫苗制备过程中可采用标准纯化方法，如层析法等去除污染的DNA。可通过核酸酶处理，例如用DNA酶来改进对残留宿主细胞DNA的去除效果。参考文献47和48公开了一种减少宿主细胞DNA污染的便捷方法，该方法包括两步处理，先使用可在病毒生长期间采用的DNA酶(如Benzonase)处理，然后使用可在病毒颗粒破坏期间采用的阳离子去污剂(如CTAB)处理。也可采用β-丙内酯处理来去除。

现在，残留宿主细胞DNA的测定是生物制品的常规管理要求，它在技术人员的普通能力范围内。用于测定DNA的实验一般是已验证的实验[49，50]。可通过数学和可量化术语来描述验证实验的性能特征，并鉴定可能的误差来源。通常测试该实验的某些特征，如精确性、准确性、特异性。一旦校正(例如用已知标准量的宿主细胞DNA校正)并检测了某个实验，则可按常规进行定量DNA测定。可采用三种主要的DNA定量技术：杂交方法，如Southern印迹或狭线印迹[51]；免疫测定方法，如Threshold^TM系统[52]；和定量PCR[53]。本领域技术人员熟悉这些方法，但各方法的准确特征，例如杂交探针的选择、引物的选择和/或用于扩增的引物等可能取决于所研究的宿主细胞。来自分子设备公司(Molecular Devices)的Threshold^TM系统是皮克水平总DNA的定量实验，已用于监测生物药品中污染DNA的水平[52]。典型实验包括生物素化ssDNA结合蛋白、脲酶偶联的抗ssDNA抗体和DNA之间以非序列特异性方式形成反应复合物。购自生产商的完整总DNA测定试剂盒(Total DNA Assay Kit)中包含所有实验组分。多个商业生产商均提供用以检测残留宿主细胞DNA的定量PCR实验，例如AppTec^TM实验室服务公司(AppTec^TM Laboratory Services)、BioReliance^TM公司奥西科技公司(AltheaTechnologies)等。对测定人病毒疫苗的宿主细胞DNA污染的化学发光杂交实验和总DNA Threshold^TM系统的比较可参见参考文献54。

制备免疫原的流感病毒可以是野生型毒株，或更通常为重配毒株。可通过反向遗传学技术获得重配病毒。反向遗传学技术[例如55-59]能实现体外用表达构建体例如质粒制备具有所需基因组区段的流感病毒。通常，它们包括表达(a)例如，由polI启动子编码所需病毒RNA分子的DNA分子，和(b)例如，由polII启动子编码病毒蛋白的DNA分子，以便在细胞中表达两种类型的DNA，从而组装成完整的感染性病毒颗粒。DNA优选提供所有病毒RNA和蛋白质，但也可能用辅助病毒提供一些RNA和蛋白质。优选采用不同质粒产生各病毒RNA的质粒方法[60-62]，这些方法也包括使用质粒表达所有或一些(例如仅PB1、PB2、PA和NP蛋白)病毒蛋白，一些方法中至多使用12种质粒。为了降低所需的质粒数量，有一种方法[63]将多个RNA聚合酶I转录盒(用于合成病毒RNA)合并到同一质粒(如编码1、2、3、4、5、6、7或所有8种流感A vRNA节段的序列)上，并且将多个蛋白编码区与RNA聚合酶II启动子合并到另一个质粒(如编码1、2、3、4、5、6、7或所有8种流感A mRNA转录物的序列)上。参考文献63方法的优选方面包括：(a)在单一质粒上的PB1、PB2和PA mRNA编码区域；和(b)在单一质粒上的所有8种vRNA编码区段。可能使用polI和polII双启动子由一个模板同时编码病毒RNA和可表达的mRNA[64，65]。

因此，病毒可包含来自A/PR/8/34病毒(一般是来自A/PR/8/34的6个节段，HA和N节段来自疫苗毒株，即6∶2再造毒株)的一个或多个RNA区段，特别是当病毒在卵中生长时。也可包含来自A/WSN/33病毒，或用于产生疫苗制剂的重配病毒的任何其它病毒株的一个或多个RNA区段。本发明通常提供保护抵御能够在人之间传播的毒株，因此该毒株的基因组通常包含在哺乳动物(如人)流感病毒中起源的至少一个RNA区段。它可包含在禽流感病毒中起源的NS区段。

肺炎球菌免疫原

肺炎球菌免疫原可采用各种形式。例如，它可以包含来自肺炎球菌的荚膜糖和/或多肽。在优选实施方式中，肺炎球菌免疫原包含至少一种肺炎球菌多肽。

目前的肺炎球菌疫苗是基于荚膜糖，其与载体蛋白偶联或为未偶联形式。肺炎球菌免疫原可包含一种或多种这类荚膜糖，但在一些实施方式中肺炎球菌不包含肺炎球菌荚膜糖。当存在时，糖可以是多糖，其大小是在细菌纯化该糖时形成，或者可以是这种多糖片段化产生的寡糖。例如，在7价PREVNAR^TM产品中，6种糖是完整多糖，而一种(18C血清型)是寡糖。

一种肺炎球菌免疫原可包含来自以下一种或多种肺炎球菌血清型的荚膜糖：1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F和/或33F。免疫原可包含来自多种血清型，例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或更多种不同血清型的糖。本领域已知7价、9价、10价、11价和13价偶联物组合，也了解23价非偶联组合，任意这些组合都可用于本发明。例如，7价组合(例如PREVNAR^TM产品)可包含来自血清型4、6B、9V、14、18C、19F和23F的糖。10价组合(例如SYNFLORIX^TM产品)可包含来自血清型1、4、5、6B、7F、9V、14、18C、19F和23F的糖。11价组合还可包含来自血清型3的糖。可将12价组合加入所述10价混合物中：血清型6A和19A；6A和22F；19A和22F；6A和15B；19A和15B；r 22F和15B；可将13价组合物加入所述11价混合物中：血清型19A和22F；8和12F；8和15B；8和19A；8和22F；12F和15B；12F和19A；12F和22F；15B和19A；15B和22F等等。一种有用的13价组合包含来自血清型1、3、4、5、6B、7F、9V、14、18C、19F和23F的糖。当使用一种以上的血清型时，包括血清型1、5和14中的一种、两种或三种是有用的。

如果用荚膜糖作为肺炎球菌免疫原，优选其与载体蛋白偶联。载体可以是肺炎球菌抗原，例如RrgB、spr0057、spr0096和spr2021等，或肺炎球菌溶血素[66]或其无毒衍生物[67]，或肺炎球菌表面蛋白PspA[68]。在其它实施方式中，尽管载体不是肺炎球菌抗原，其可以是例如细菌毒素或类毒素。通常载体蛋白是白喉或破伤风类毒素，或其突变物。可使用CRM₁₉₇白喉毒素突变体[69]，它是PREVNAR^TM产品中的载体。其他合适的载体蛋白包括，脑膜炎奈瑟球菌(N.meningitidis)外膜蛋白复合体[70]、合成肽[71、72]、热激蛋白[73，74]、百日咳蛋白[75，76]、细胞因子[77]、淋巴因子[77]、激素[77]、生长因子[77]、含有各种病原体衍生抗原的多种人CD4⁺T细胞表位的人造蛋白[78]如N19[79]、流感嗜血杆菌(H.influenzae)的D蛋白[80-82]、铁摄取蛋白[83]、艰难梭菌(C.difficile)的毒素A或B[84]、重组金黄色葡萄球菌(P.aeruginosa)胞外蛋白A(rEPA)[85]等等。

当组合物包含一种以上偶联物时，每种偶联物可使用相同的载体蛋白或不同的载体蛋白。参考文献86描述了在多价肺炎球菌偶联疫苗中使用不同载体蛋白的潜在优点。

在一些实施方式中，一种偶联物可携带来自多种血清型的糖[87]。然而，每种偶联物通常包含来自一种血清型的糖。

偶联物可包含过量载体(w/w)或过量糖(w/w)。在一些实施方式中，偶联物可包含相同重量的载体和糖。

载体分子可直接与载体共价偶联，或通过接头偶联。可通过(例如)糖和载体之间的还原性胺化(如参考文献88和89所述)，实现与蛋白质的直接连接。首先需要通过，例如氧化激活糖。可用任何已知方法，如参考文献90和91所述的方法通过接头基团进行连接。优选的连接类型是己二酸接头，其形成可通过偶联游离-NH₂基团(如通过胺化引入葡聚糖中)与己二酸(例如，利用二酰亚胺活化)，然后将蛋白质偶联于所得的糖-己二酸中间体[92，93]。另一种优选连接形式是羰基接头，其形成可通过糖CDI的游离羟基的反应[94，95]，然后与蛋白质反应形成氨基甲酸酯连接。其它接头包括β-丙酰胺基[96]、硝基苯基-乙基胺[97]、卤代酰基卤化物[98]、配糖键[99]、6-氨基己酸[100]、ADH[101]、C₄-C₁₂部分[102]等。也采用碳二亚胺缩合反应[103]。

肺炎球菌免疫原可包含以下一种或多种肺炎球菌多肽：(1)spr0057抗原；(2)spr0565抗原；(3)spr1098抗原；(4)spr1416抗原；(5)spr1418抗原；(6)spr0867抗原；(7)spr1431抗原；(8)spr1739抗原；(9)spr2021抗原；(10)spr0096抗原；(11)spr1707抗原；(12)spr1875抗原；(13)spr0884抗原；和/或(14)RrgB抗原。类似的，肺炎球菌免疫原可包含以下一种或多种肺炎球菌多肽：(1)ClpP；(2)LytA；(3)PhtA；(4)PhtB；(5)PhtD；(6)PhtE；(7)ZmpB；(8)CbpD；(9)CbpG；(10)PvaA；(11)CPL1；(12)PspC；(13)PspA；(14)PsaA；(15)PrtA；(16)Sp133；(17)PiaA；(18)PiuA；(19)CbiO；和/或(20)30S核糖体蛋白S8。这些抗原可以单独多肽存在，或以融合多肽存在，例如spr0057-spr0096融合或spr0096-spr2021融合，spr0565-PhtD融合，RrgB-spr0057融合等。

参考文献104中将原始′spr0057′序列标注为′β-N-乙酰基-己糖胺酶前体′(参见GI：15902101)。出于参比目的，R6菌株中发现的全长spr0057的氨基酸序列在本文中列为SEQ ID NO：23。本发明所用的优选spr0057多肽包含氨基酸序列：(a)与SEQID NO：23具有60％或更高的相同性(例如60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，99.5％或更高)；和/或(b)包含SEQ IDNO：23至少‘n’个连续氨基酸的片段，其中’n’是7或更多(例如8，10，12，14，16，18，20，25，30，35，40，50，60，70，80，90，100，150，200，250或更多)。这些spr0057蛋白包括SEQ ID NO：23的变体。(b)的优选片段包含来自SEQ ID NO：23的表位。其他优选片段缺少SEQ ID NO：23C末端的一个或多个氨基酸(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多个)和/或SEQ ID NO：23N末端的一个或多个氨基酸(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多个)，而保留SEQ ID NO：23的至少一个表位。其它片段略去一个或多个蛋白质结构域。一个合适的片段是SEQ ID NO：38，其省略了天然前导肽和分选酶识别序列。另一个合适的片段是SEQ ID NO：24，其具有N末端和C末端截短。SEQ ID NO：27是SEQ ID NO：24基于不同野生型菌株的变体，且是本发明采用的有效spr0057序列。

参考文献104中将原始′spr0565′序列标注为′β-半乳糖苷酶前体′(参见GI：15902609)。出于参比目的，R6菌株中发现的全长spr0565的氨基酸序列在本文中列为SEQ ID NO：25。本发明所用的优选spr0565多肽包含氨基酸序列：(a)与SEQ ID NO：25具有60％或更高的相同性(例如60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，99.5％或更高)；和/或(b)包含SEQ ID NO：25至少‘n’个连续氨基酸的片段，其中’n’是7或更多(例如8，10，12，14，16，18，20，25，30，35，40，50，60，70，80，90，100，150，200，250或更多)。这些spr0565蛋白包括SEQ ID NO：25的变体(例如SEQ ID NO：45；见下文)。(b)的优选片段包含来自SEQ ID NO：25的表位。其他优选片段缺少SEQ IDNO：25C末端的一个或多个氨基酸(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多个)和/或SEQ ID NO：25N末端的一个或多个氨基酸(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多个)，而保留SEQ ID NO：25的至少一个表位。其它片段略去一个或多个蛋白质结构域。一个合适的片段是SEQ ID NO：42，其省略了天然前导肽和分选酶识别序列。其它合适的片段是SEQ ID NO：43和44。spr0565的这些缩短形式特别有用，因为天然多肽太长(＞2000个氨基酸)。spr0565的变体形式是本文的SEQ ID NO：45。参考文献105中报道将此种变体形式(其中的SEQ ID NO：178)用于免疫。因此有用的spr0565多肽可包含的氨基酸序列为：(a)与SEQ ID NO：45具有60％或更高的相同性(例如60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，99.5％或更高)；和/或(b)包含SEQ ID NO：45至少‘n’个连续氨基酸的片段，其中’n’是7或更多(例如8，10，12，14，16，18，20，25，30，35，40，50，60，70，80，90，100，150，200，250或更多)。这些多肽包括SEQ ID NO：45的变体。(b)的优选片段包含来自SEQ ID NO：45的表位。45.其他优选片段缺少SEQ ID NO：45C末端的一个或多个氨基酸(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多个)和/或SEQ ID NO：45N末端的一个或多个氨基酸(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多个)，而保留SEQ ID NO：45的至少一个表位。其它片段略去一个或多个蛋白质结构域。参考文献105的表1中鉴定了SEQ ID NO：45的免疫原性片段。

参考文献104中将原始′spr1098′序列标注为′分选酶′(参见GI：15903141)。出于参比目的，R6菌株中发现的全长spr1098的氨基酸序列在本文中列为SEQ ID NO：26。本发明所用的优选spr1098多肽包含氨基酸序列：(a)与SEQ ID NO：26具有60％或更高的相同性(例如60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，99.5％或更高)；和/或(b)包含SEQ ID NO：26至少‘n’个连续氨基酸的片段，其中’n’是7或更多(例如8，10，12，14，16，18，20，25，30，35，40，50，60，70，80，90，100，150，200，250或更多)。这些spr1098蛋白包括SEQ ID NO：26的变体。(b)的优选片段包含来自SEQ ID NO：26的表位。其他优选片段缺少SEQ ID NO：26C末端的一个或多个氨基酸(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多个)和/或SEQ ID NO：26N末端的一个或多个氨基酸(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多个)，而保留SEQID NO：26的至少一个表位。其它片段略去一个或多个蛋白质结构域。一个合适的片段是SEQ ID NO：46，其省略了天然前导肽序列。

参考文献104中将原始′spr1416′序列标注为′假拟蛋白′(参见GI：15903459)。出于参比目的，R6菌株中发现的全长spr1416的氨基酸序列在本文中列为SEQ ID NO：28。本发明所用的优选spr1416多肽包含氨基酸序列：(a)与SEQ ID NO：28具有60％或更高的相同性(例如60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，99.5％或更高)；和/或(b)包含SEQ ID NO：28至少‘n’个连续氨基酸的片段，其中’n’是7或更多(例如8，10，12，14，16，18，20，25，30，35，40，50，60，70，80，90，100，150，200，250或更多)。这些spr1416蛋白包括SEQ ID NO：28的变体。(b)的优选片段包含来自SEQ ID NO：28的表位。其他优选片段缺少SEQ ID NO：28C末端的一个或多个氨基酸(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多个)和/或SEQ ID NO：28N末端的一个或多个氨基酸(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多个)，而保留SEQID NO：28的至少一个表位。其它片段略去一个或多个蛋白质结构域。

参考文献104中的原始′spr1418′序列标注为′假拟蛋白′(参见GI：15903461)。出于参比目的，R6菌株中发现的全长spr1418的氨基酸序列在本文中列为SEQ ID NO：29。本发明所用的优选spr1418多肽包含氨基酸序列：(a)与SEQ ID NO：29具有60％或更高的相同性(例如60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，99.5％或更高)；和/或(b)包含SEQ ID NO：29至少‘n’个连续氨基酸的片段，其中’n’是7或更多(例如8，10，12，14，16，18，20，25，30，35，40，50，60，70，80，90，100，150，200，250或更多)。这些spr1418蛋白包括SEQ ID NO：29的变体。(b)的优选片段包含来自SEQ ID NO：29的表位。其他优选片段缺少SEQ ID NO：29C末端的一个或多个氨基酸(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多个)和/或SEQ ID NO：29N末端的一个或多个氨基酸(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多个)，而保留SEQID NO：29的至少一个表位。其它片段略去一个或多个蛋白质结构域。

参考文献104中将原始′spr0867′序列标注为′内切-β-N-乙酰氨基葡糖苷酶′(参见GI：15902911)。出于参比目的，R6菌株中发现的全长spr0867的氨基酸序列在本文中列为SEQ ID NO：30。本发明所用的优选spr0867多肽包含氨基酸序列：(a)与SEQ ID NO：30具有60％或更高的相同性(例如60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，99.5％或更高)；和/或(b)包含SEQ ID NO：30至少‘n’个连续氨基酸的片段，其中’n’是7或更多(例如8，10，12，14，16，18，20，25，30，35，40，50，60，70，80，90，100，150，200，250或更多)。这些spr0867蛋白包括SEQ ID NO：30的变体。(b)的优选片段包含来自SEQ ID NO：30的表位。其他优选片段缺少SEQ ID NO：30C末端的一个或多个氨基酸(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多个)和/或SEQ ID NO：30N末端的一个或多个氨基酸(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多个)，而保留SEQ ID NO：30的至少一个表位。其它片段略去一个或多个蛋白质结构域。一个合适的片段是SEQ ID NO：48，其省略了天然前导肽序列。

参考文献104中将原始′spr1431′序列标注为′1，4-β-N-乙酰溶菌酶′(参见GI：15903474)。它也称为‘LytC’，参考文献126中报道了它的免疫应用。出于参比目的，R6菌株中发现的全长spr1431的氨基酸序列在本文中列为SEQ ID NO：31。本发明所用的优选spr1431多肽包含氨基酸序列：(a)与SEQ ID NO：31具有60％或更高的相同性(例如60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，99.5％或更高)；和/或(b)包含SEQ ID NO：31至少‘n’个连续氨基酸的片段，其中’n’是7或更多(例如8，10，12，14，16，18，20，25，30，35，40，50，60，70，80，90，100，150，200，250或更多)。这些spr1431蛋白包括SEQ ID NO：31的变体。(b)的优选片段包含来自SEQ ID NO：31的表位。其他优选片段缺少SEQ ID NO：31C末端的一个或多个氨基酸(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多个)和/或SEQ ID NO：31N末端的一个或多个氨基酸(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多个)，而保留SEQID NO：31的至少一个表位。其它片段略去一个或多个蛋白质结构域。一个合适的片段是SEQ ID NO：49，其省略了天然前导肽序列。

′spr1739′多肽是肺炎球菌溶血素(例如，参见GI：15903781)。出于参比目的，R6菌株中发现的全长spr1739的氨基酸序列在本文中列为SEQ ID NO：32。本发明所用的优选spr1739多肽包含氨基酸序列：(a)与SEQ ID NO：32具有60％或更高的相同性(例如60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，99.5％或更高)；和/或(b)包含SEQ ID NO：32至少‘n’个连续氨基酸的片段，其中’n’是7或更多(例如8，10，12，14，16，18，20，25，30，35，40，50，60，70，80，90，100，150，200，250或更多)。这些spr1739蛋白包括SEQ ID NO：32的变体。(b)的优选片段包含来自SEQ ID NO：32的表位。其他优选片段缺少SEQ ID NO：32C末端的一个或多个氨基酸(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多个)和/或SEQ ID NO：32N末端的一个或多个氨基酸(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多个)，而保留SEQ ID NO：32的至少一个表位。其它片段略去一个或多个蛋白质结构域。本领域已知用于疫苗接种应用的肺炎球菌溶血素的突变形式[67，106-111]，这些突变形式可用于本发明。可通过C末端截短实现解毒(例如见参考文献112)，例如除去34个氨基酸、45个氨基酸、7个氨基酸[113]等。其它突变(根据SEQ ID NO：32编号)包括Pro325→Leu(例如SEQ ID NO：50)和/或Trp433→Phe(例如SEQ ID NO：51)。可将这些突变与C末端截短联用，例如以便将Pro325→Leu突变与7聚体截短组合(如SEQ ID NO：52)。

参考文献104中将原始′spr2021′序列标注为′全身应激蛋白GSP-781′(参见GI：15904062)。出于参比目的，R6菌株中发现的全长spr2021的氨基酸序列在本文中列为SEQ ID NO：33。本发明所用的优选spr2021多肽包含氨基酸序列：(a)与SEQ ID NO：33具有60％或更高的相同性(例如60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，99.5％或更高)；和/或(b)包含SEQ ID NO：33至少‘n’个连续氨基酸的片段，其中’n’是7或更多(例如8，10，12，14，16，18，20，25，30，35，40，50，60，70，80，90，100，150，200，250或更多)。这些spr2021蛋白包括SEQ ID NO：33的变体。(b)的优选片段包含来自SEQ ID NO：33的表位。其他优选片段缺少SEQ ID NO：33C末端的一个或多个氨基酸(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多个)和/或SEQ ID NO：33N末端的一个或多个氨基酸(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多个)，而保留SEQ ID NO：33的至少一个表位。其它片段略去一个或多个蛋白质结构域。一个合适的片段是SEQ ID NO：53，其省略了天然前导肽序列。参考文献105将spr2021标注为与GbpB具有同源性的分泌型45kDa蛋白，还公开了它作为免疫原的应用(其中的SEQ ID NO：243；SP2216)。参考文献105的表1中鉴定了spr2021的免疫原性片段(第73页)。另一个有用的spr2021片段公开于参考文献114的SEQ ID NO：1(本文中SEQ ID NO：33的氨基酸28-278)。

参考文献104中将原始′spr0096′序列标注为′假拟蛋白′(参见GI：15902140)。出于参比目的，R6菌株中发现的全长spr0096的氨基酸序列在本文中列为SEQ ID NO：34。本发明所用的优选spr0096多肽包含的氨基酸序列为：(a)与SEQ ID NO：34具有60％或更高的相同性(例如60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，99.5％或更高)；和/或(b)包含SEQ ID NO：34至少‘n’个连续氨基酸的片段，其中’n’是7或更多(例如8，10，12，14，16，18，20，25，30，35，40，50，60，70，80，90，100，150，200，250或更多)。这些spr0096蛋白包括SEQ ID NO：34的变体(例如SEQ ID NO：40).(b)的优选片段包含来自SEQID NO：34的表位。其他优选片段缺少SEQ ID NO：34C末端的一个或多个氨基酸(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多个)和/或SEQ ID NO：34N末端的一个或多个氨基酸(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多个)，而保留SEQ ID NO：34的至少一个表位。其它片段缺少一个或多个蛋白质结构域。spr0096的一种变体形式(其中在相对于SEQ ID NO：34的C末端有插入)是本文所述的SEQ ID NO：54。参考文献105中报道将此种变体形式(其中的SEQ IDNO：150)用于免疫，其中它被称为LysM结构域蛋白。因此，本发明所用的spr0096可包含氨基酸序列：(a)与SEQ ID NO：54具有60％或更高的相同性(例如60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，99.5％或更高)；和/或(b)包含SEQ ID NO：54至少‘n’个连续氨基酸的片段，其中’n’是7或更多(例如8，10，12，14，16，18，20，25，30，35，40，50，60，70，80，90，100，150，200，250或更多)。这些多肽包括SEQ ID NO：54的变体。(b)的优选片段包含来自SEQ ID NO：54的表位。其他优选片段缺少SEQ ID NO：54C末端的一个或多个氨基酸(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多个)和/或SEQ ID NO：54N末端的一个或多个氨基酸(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多个)，而保留SEQ ID NO：54的至少一个表位。其它片段略去一个或多个蛋白质结构域。参考文献105的表1中鉴定了SEQ ID NO：54的免疫原性片段。spr0096多肽可以二聚体如同源二聚体的形式使用。

参考文献104中将原始′spr1707′序列标注为′ABC转运蛋白底物结合蛋白-寡肽转运′(参见GI：15903749)。出于参比目的，R6菌株中发现的全长spr1707的氨基酸序列在本文中列为SEQ ID NO：36。本发明所用的优选spr1707多肽包含氨基酸序列：(a)与SEQ ID NO：36具有60％或更高的相同性(例如60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，99.5％或更高)；和/或(b)包含SEQ ID NO：36至少‘n’个连续氨基酸的片段，其中’n’是7或更多(例如8，10，12，14，16，18，20，25，30，35，40，50，60，70，80，90，100，150，200，250或更多)。这些spr1707蛋白包括SEQ ID NO：36的变体(例如SEQ IDNO：100；见下文)。(b)的优选片段包含来自SEQ ID NO：36的表位。其他优选片段缺少SEQ ID NO：36C末端的一个或多个氨基酸(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多个)和/或SEQ ID NO：36N末端的一个或多个氨基酸(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多个)，而保留SEQ ID NO：36的至少一个表位。其它片段略去一个或多个蛋白质结构域。spr1707的变体形式(与SEQ ID NO：36差4个氨基酸)是本文的SEQ ID NO：55。SEQ ID NO：55的免疫接种用途如参考文献105报导(其中的SEQ ID NO：220)。因此，本发明所用的spr1707多肽可包含氨基酸序列：(a)与SEQ ID NO：55具有60％或更高的相同性(例如60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，99.5％或更高)；和/或(b)包含SEQ ID NO：55至少‘n’个连续氨基酸的片段，其中’n’是7或更多(例如8，10，12，14，16，18，20，25，30，35，40，50，60，70，80，90，100，150，200，250或更多)。这些多肽包括SEQ ID NO：55的变体。55.(b)的优选片段包含来自SEQ ID NO：55的表位。其他优选片段缺少SEQ ID NO：55C末端的一个或多个氨基酸(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多个)和/或SEQ ID NO：55N末端的一个或多个氨基酸(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多个)，而保留SEQ ID NO：55的至少一个表位。其它片段略去一个或多个蛋白质结构域。参考文献105的表1中鉴定了SEQ ID NO：55的免疫原性片段。

参考文献104中将原始′spr1875′序列标注为′假拟蛋白′(参见GI：15903916)。出于参比目的，R6菌株中发现的全长spr1875的氨基酸序列在本文中列为SEQ ID NO：35。本发明所用的优选spr1875多肽包含氨基酸序列：(a)与SEQ ID NO：35具有60％或更高的相同性(例如60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，99.5％或更高)；和/或(b)包含SEQ ID NO：35至少‘n’个连续氨基酸的片段，其中’n’是7或更多(例如8，10，12，14，16，18，20，25，30，35，40，50，60，70，80，90，100，150，200，250或更多)。这些spr1875蛋白包括SEQ ID NO：35的变体。(b)的优选片段包含来自SEQ ID NO：35的表位。其他优选片段缺少SEQ ID NO：35C末端的一个或多个氨基酸(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多个)和/或SEQ ID NO：35N末端的一个或多个氨基酸(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多个)，而保留SEQID NO：35的至少一个表位。其它片段略去一个或多个蛋白质结构域。

′spr0884′蛋白是肽酰脯氨酰异构酶，也称为蛋白酶成熟蛋白。出于参比目的，全长spr0884的氨基酸序列是本文所述的SEQ ID NO：37。本发明所用的优选spr0884多肽包含氨基酸序列：(a)与SEQ ID NO：37具有60％或更高的相同性(例如60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，99.5％或更高)；和/或(b)包含SEQ ID NO：37至少‘n’个连续氨基酸的片段，其中’n’是7或更多(例如8，10，12，14，16，18，20，25，30，35，40，50，60，70，80，90，100，150，200，250或更多)。这些spr0884蛋白包括SEQ ID NO：37的变体。(b)的优选片段包含来自SEQ ID NO：37的表位。其他优选片段缺少SEQ IDNO：37C末端的一个或多个氨基酸(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多个)和/或SEQ ID NO：37N末端的一个或多个氨基酸(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多个)，而保留SEQ ID NO：37的至少一个表位。其它片段略去一个或多个蛋白质结构域。一个合适的片段是SEQ ID NO：56，其省略了天然前导肽序列。参考文献115报道了spr0884的免疫应用。

ClpP是ATP依赖性Clp蛋白酶的蛋白水解亚基。出于参比目的，全长ClpP的氨基酸序列是本文所述的SEQ ID NO：58。在R6基因组中，ClpP是spr0656[104]。本发明所用的优选ClpP多肽包含氨基酸序列：(a)与SEQ ID NO：58具有60％或更高的相同性(例如60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，99.5％或更高)；和/或(b)包含SEQ ID NO：58至少‘n’个连续氨基酸的片段，其中’n’是7或更多(例如8，10，12，14，16，18，20，25，30，35，40，50，60，70，80，90，100，150，200，250或更多)。这些ClpP蛋白包括SEQ ID NO：58的变体。(b)的优选片段包含来自SEQ ID NO：58的表位。其他优选片段缺少SEQ ID NO：58C末端的一个或多个氨基酸(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多个)和/或SEQ ID NO：58N末端的一个或多个氨基酸(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多个)，而保留SEQ ID NO：58的至少一个表位。其它片段略去一个或多个蛋白质结构域。参考文献116和117报道了ClpP的免疫应用。它优选与PspA和PsaA和/或PspC联用[116]。

LytA是N-乙酰基胞壁酰-L-丙氨酸酰胺酶(自溶素)。出于参比目的，全长LytA的氨基酸序列是本文所述的SEQ ID NO：59。在R6基因组中，LytA是spr1754[104]。本发明所用的优选LytA多肽包含氨基酸序列：(a)与SEQ ID NO：59具有60％或更高的相同性(例如60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，99.5％或更高)；和/或(b)包含SEQ ID NO：59至少‘n’个连续氨基酸的片段，其中’n’是7或更多(例如8，10，12，14，16，18，20，25，30，35，40，50，60，70，80，90，100，150，200，250或更多)。这些LytA蛋白包括SEQ ID NO：59的变体(例如GI：18568354)。(b)的优选片段包含来自SEQ ID NO：59的表位。其他优选片段缺少SEQ ID NO：59C末端的一个或多个氨基酸(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多个)和/或SEQ ID NO：59N末端的一个或多个氨基酸(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多个)，而保留SEQ ID NO：59的至少一个表位。其它片段略去一个或多个蛋白质结构域。参考文献118报道了LytA的免疫应用，特别是以含有与异源混杂性T辅助细胞表位融合的LytA胆碱结合域的形式。

PhtA是肺炎球菌组氨酸三联体蛋白A。出于参比目的，全长PhtA前体的氨基酸序列是本文所述的SEQ ID NO：60。在R6基因组中，PhtA是spr1061[104]。本发明所用的优选PhtA多肽包含氨基酸序列：(a)与SEQ ID NO：60具有60％或更高的相同性(例如60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，99.5％或更高)；和/或(b)包含SEQ ID NO：60至少‘n’个连续氨基酸的片段，其中’n’是7或更多(例如8，10，12，14，16，18，20，25，30，35，40，50，60，70，80，90，100，150，200，250或更多)。这些PhtA蛋白包括SEQ ID NO：60的变体。(b)的优选片段包含来自SEQ ID NO：60的表位。其他优选片段缺少SEQ ID NO：60C末端的一个或多个氨基酸(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多个)和/或SEQ ID NO：60N末端的一个或多个氨基酸(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多个)，而保留SEQ ID NO：60的至少一个表位。其它片段略去一个或多个蛋白质结构域。参考文献119和120报道了PhtA的免疫应用。

PhtB是肺炎球菌组氨酸三联体蛋白B。出于参比目的，全长PhtB前体的氨基酸序列是本文所述的SEQ ID NO：61。残基578处的Xaa可以是赖氨酸。本发明所用的优选PhtB多肽包含氨基酸序列：(a)与SEQ ID NO：61具有60％或更高的相同性(例如60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，99.5％或更高)；和/或(b)包含SEQ ID NO：61至少‘n’个连续氨基酸的片段，其中’n’是7或更多(例如8，10，12，14，16，18，20，25，30，35，40，50，60，70，80，90，100，150，200，250或更多)。这些PhtB蛋白包括SEQID NO：61的变体。(b)的优选片段包含来自SEQ ID NO：61的表位。其他优选片段缺少SEQ ID NO：61C末端的一个或多个氨基酸(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多个)和/或SEQ ID NO：61N末端的一个或多个氨基酸(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多个)，而保留SEQ ID NO：61的至少一个表位。其它片段略去一个或多个蛋白质结构域。参考文献119、120和121报道了PhtB的免疫应用。

PhtD是肺炎球菌组氨酸三联体蛋白D。出于参比目的，全长PhtD前体的氨基酸序列是本文所述的SEQ ID NO：62。在R6基因组中，PhtD是spr0907[104]。本发明所用的优选PhtD多肽包含氨基酸序列：(a)与SEQ ID NO：62具有60％或更高的相同性(例如60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，99.5％或更高)；和/或(b)包含SEQ ID NO：62至少‘n’个连续氨基酸的片段，其中’n’是7或更多(例如8，10，12，14，16，18，20，25，30，35，40，50，60，70，80，90，100，150，200，250或更多)。这些PhtD蛋白包括SEQ ID NO：62的变体。(b)的优选片段包含来自SEQ ID NO：62的表位。其他优选片段缺少SEQ ID NO：62C末端的一个或多个氨基酸(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多个)和/或SEQ ID NO：62N末端的一个或多个氨基酸(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多个)，而保留SEQ ID NO：62的至少一个表位。其它片段略去一个或多个蛋白质结构域。参考文献119、120和122报道了PhtD的免疫应用。

PhtE是肺炎球菌组氨酸三联体蛋白E。出于参比目的，全长PhtE前体的氨基酸序列是本文所述的SEQ ID NO：63。在R6基因组中，PhtE是spr0908[104]。本发明所用的优选PhtE多肽包含氨基酸序列：(a)与SEQ ID NO：63具有60％或更高的相同性(例如60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，99.5％或更高)；和/或(b)包含SEQ ID NO：63至少‘n’个连续氨基酸的片段，其中’n’是7或更多(例如8，10，12，14，16，18，20，25，30，35，40，50，60，70，80，90，100，150，200，250或更多)。这些PhtE蛋白包括SEQ ID NO：63的变体。(b)的优选片段包含来自SEQ ID NO：63的表位。其他优选片段缺少SEQ ID NO：63C末端的一个或多个氨基酸(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多个)和/或SEQ ID NO：63N末端的一个或多个氨基酸(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多个)，而保留SEQ ID NO：63的至少一个表位。其它片段略去一个或多个蛋白质结构域。参考文献119和120报道了PhtE的免疫应用。

ZmpB是锌金属蛋白酶。出于参比目的，全长ZmpB的氨基酸序列是本文所述的SEQ ID NO：64。在R6基因组中，ZmpB是spr0581[104]。本发明所用的优选ZmpB多肽包含氨基酸序列：(a)与SEQ ID NO：64具有60％或更高的相同性(例如60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，99.5％或更高)；和/或(b)包含SEQ ID NO：64至少‘n’个连续氨基酸的片段，其中’n’是7或更多(例如8，10，12，14，16，18，20，25，30，35，40，50，60，70，80，90，100，150，200，250或更多)。这些ZmpB蛋白包括SEQ ID NO：64的变体。(b)的优选片段包含来自SEQ ID NO：64的表位。其他优选片段缺少SEQ IDNO：64C末端的一个或多个氨基酸(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多个)和/或SEQ ID NO：64N末端的一个或多个氨基酸(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多个)，而保留SEQ ID NO：64的至少一个表位。其它片段略去一个或多个蛋白质结构域。

CbpD是胆碱结合蛋白D。出于参比目的，全长CbpD前体的氨基酸序列是本文所述的SEQ ID N0：65。在R6基因组中，CbpD是spr2006[104]。本发明所用的优选CbpD多肽包含氨基酸序列：(a)与SEQ ID NO：65具有60％或更高的相同性(例如60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，99.5％或更高)；和/或(b)包含SEQ ID NO：65至少‘n’个连续氨基酸的片段，其中’n’是7或更多(例如8，10，12，14，16，18，20，25，30，35，40，50，60，70，80，90，100，150，200，250或更多)。这些CbpD蛋白包括SEQ ID NO：65的变体(例如SEQ ID NO：57；见下文)。(b)的优选片段包含来自SEQ ID NO：65的表位。其他优选片段缺少SEQ ID NO：65C末端的一个或多个氨基酸(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多个)和/或SEQ ID NO：65N末端的一个或多个氨基酸(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多个)，而保留SEQ ID NO：65的至少一个表位。其它片段缺少一个或多个蛋白质结构域。参考文献126报道了CbpD的免疫应用。SEQ ID NO：65的一个变体是本文中的SEQ IDNO：57。SEQ ID NO：57的免疫接种用途如参考文献105所报导(其中的SEQ IDNO：241)。因此，本发明所用的CbpD多肽可包含氨基酸序列：(a)与SEQ ID NO：57具有60％或更高的相同性(例如60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，99.5％或更高)；和/或(b)包含SEQ ID NO：57至少‘n’个连续氨基酸的片段，其中’n’是7或更多(例如8，10，12，14，16，18，20，25，30，35，40，50，60，70，80，90，100，150，200，250或更多)。这些CbpD蛋白包括SEQ ID NO：57的变体。(b)的优选片段包含来自SEQ ID NO：57的表位。其他优选片段缺少SEQ ID NO：57C末端的一个或多个氨基酸(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多个)和/或SEQ ID NO：57N末端的一个或多个氨基酸(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多个)，而保留SEQID NO：57的至少一个表位。其它片段略去一个或多个蛋白质结构域。参考文献105的表1中鉴定了SEQ ID NO：57的免疫原性片段。

CbpG是胆碱结合蛋白G。出于参比目的，全长CbpG的氨基酸序列是本文所述的SEQ ID NO：47。在R6基因组中，CbpG是spr0350[104]。本发明所用的优选CbpG多肽包含氨基酸序列：(a)与SEQ ID NO：47具有60％或更高的相同性(例如60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，99.5％或更高)；和/或(b)包含SEQ ID NO：47至少‘n’个连续氨基酸的片段，其中’n’是7或更多(例如8，10，12，14，16，18，20，25，30，35，40，50，60，70，80，90，100，150，200，250或更多)。这些CbpG蛋白包括SEQ ID NO：47的变体。(b)的优选片段包含来自SEQ ID NO：47的表位。其他优选片段缺少SEQ IDNO：47C末端的一个或多个氨基酸(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多个)和/或SEQ ID NO：47N末端的一个或多个氨基酸(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多个)，而保留SEQ ID NO：47的至少一个表位。其它片段略去一个或多个蛋白质结构域。参考文献126报道了CbpG的免疫应用。

PvaA(肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)肺炎球菌疫苗抗原A)也称为sp101。出于参比目的，全长PvaA的氨基酸序列是本文所述的SEQ ID NO：41。在R6基因组中，PvaA是spr0930[104]。本发明所用的优选PvaA多肽包含氨基酸序列：(a)与SEQ ID NO：41具有60％或更高的相同性(例如60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，99.5％或更高)；和/或(b)包含SEQ ID NO：41至少‘n’个连续氨基酸的片段，其中’n’是7或更多(例如8，10，12，14，16，18，20，25，30，35，40，50，60，70，80，90，100，150，200，250或更多)。这些PvaA蛋白包括SEQ ID NO：41的变体。(b)的优选片段包含来自SEQ ID NO：41的表位。其他优选片段缺少SEQ ID NO：41C末端的一个或多个氨基酸(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多个)和/或SEQID NO：41N末端的一个或多个氨基酸(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多个)，而保留SEQ ID NO：41的至少一个表位。其它片段略去一个或多个蛋白质结构域。参考文献123和124报道了PvaA的免疫应用。

CPL1是肺炎球菌噬菌体CP1溶菌酶。出于参比目的，全长CPL1的氨基酸序列是本文所述的SEQ ID NO：39。本发明所用的优选CPL1多肽包含氨基酸序列：(a)与SEQ ID NO：39具有60％或更高的相同性(例如60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，99.5％或更高)；和/或(b)包含SEQ ID NO：39至少‘n’个连续氨基酸的片段，其中’n’是7或更多(例如8，10，12，14，16，18，20，25，30，35，40，50，60，70，80，90，100，150，200，250或更多)。这些CPL1蛋白包括SEQ ID NO：39的变体。(b)的优选片段包含来自SEQID NO：39的表位。其他优选片段缺少SEQ ID NO：39C末端的一个或多个氨基酸(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多个)和/或SEQ ID NO：39N末端的一个或多个氨基酸(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多个)，而保留SEQ ID NO：39的至少一个表位。其它片段略去一个或多个蛋白质结构域。参考文献118报道了CPL1的免疫应用，特别是以含有与异源混杂性T辅助细胞表位融合的CPL1胆碱结合域的形式。

PspC是肺炎球菌表面蛋白C[125]，也称为胆碱结合蛋白A(CbpA)。参考文献123和126报道了它的免疫应用。在R6菌株中它是spr1995，出于参比目的，全长spr1995的氨基酸序列是本文的SEQ ID NO：22。本发明所用的优选PspC多肽包含氨基酸序列：(a)与SEQ ID NO：22具有60％或更高的相同性(例如60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，99.5％或更高)；和/或(b)包含SEQ ID NO：22至少‘n’个连续氨基酸的片段，其中’n’是7或更多(例如8，10，12，14，16，18，20，25，30，35，40，50，60，70，80，90，100，150，200，250或更多)。这些spr1995蛋白包括SEQ ID NO：22的变体(例如SEQ ID NO：20；见下文)。(b)的优选片段包含来自SEQ ID NO：22的表位。其他优选片段缺少SEQ ID NO：22C末端的一个或多个氨基酸(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多个)和/或SEQ ID NO：22N末端的一个或多个氨基酸(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多个)，而保留SEQ ID NO：22的至少一个表位。其它片段略去一个或多个蛋白质结构域。

一种PspC变体称为‘Hic’。它类似于PspC，如参考文献127图1所示，该参考文献中报道它能结合因子H(fH)。出于参比目的，全长Hic的氨基酸序列是本文所述的SEQ ID NO：20。除了PspC多肽，Hic蛋白可用于本发明或替代PspC多肽。本发明所用的优选Hic多肽包含氨基酸序列：(a)与SEQ ID NO：20具有60％或更高的相同性(例如60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，99.5％或更高)；和/或(b)包含SEQ ID NO：20至少‘n’个连续氨基酸的片段，其中’n’是7或更多(例如8，10，12，14，16，18，20，25，30，35，40，50，60，70，80，90，100，150，200，250或更多)。这些Hic蛋白包括SEQ ID NO：20的变体。(b)的优选片段包含来自SEQ ID NO：20的表位。其他优选片段缺少SEQ ID NO：20C末端的一个或多个氨基酸(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多个)和/或SEQ ID NO：20N末端的一个或多个氨基酸(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多个)，而保留SEQ ID NO：20的至少一个表位。其它片段略去一个或多个蛋白质结构域。PspC和/或Hic宜与PspA和/或PsaA联用。

PspA是肺炎球菌表面蛋白A。出于参比目的，全长PspA的氨基酸序列是本文所述的SEQ ID NO：18。在R6基因组中，PspA是spr0121[104]。本发明所用的优选PspA多肽包含氨基酸序列：(a)与SEQ ID NO：18具有60％或更高的相同性(例如60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，99.5％或更高)；和/或(b)包含SEQ ID NO：18至少‘n’个连续氨基酸的片段，其中’n’是7或更多(例如8，10，12，14，16，18，20，25，30，35，40，50，60，70，80，90，100，150，200，250或更多)。这些PspA蛋白包括SEQ ID NO：18的变体。(b)的优选片段包含来自SEQ ID NO：18的表位。其他优选片段缺少SEQID NO：18C末端的一个或多个氨基酸(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多个)和/或SEQ ID NO：18N末端的一个或多个氨基酸(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多个)，而保留SEQ ID NO：18的至少一个表位。其它片段略去一个或多个蛋白质结构域。参考文献128报道了PspA的免疫应用等。它宜与PspC联合给予。

PsaA是肺炎球菌表面粘附素。出于参比目的，全长PsaA的氨基酸序列是本文所述的SEQ ID NO：16。本发明所用的优选PsaA多肽包含氨基酸序列：(a)与SEQID NO：16具有60％或更高的相同性(例如60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，99.5％或更高)；和/或(b)包含SEQ IDNO：16至少‘n’个连续氨基酸的片段，其中’n’是7或更多(例如8，10，12，14，16，18，20，25，30，35，40，50，60，70，80，90，100，150，200，250或更多)。这些PsaA蛋白包括SEQ ID NO：16的变体。(b)的优选片段包含来自SEQ ID NO：16的表位。其他优选片段缺少SEQ ID NO：16C末端的一个或多个氨基酸(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多个)和/或SEQ ID NO：16N末端的一个或多个氨基酸(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多个)，而保留SEQ ID NO：16的至少一个表位。其它片段略去一个或多个蛋白质结构域。一个有用的PsaA片段公开于参考文献114的SEQ ID NO：3(对应于本文中SEQ ID NO：16的氨基酸21-309)。参考文献129报道了PsaA的免疫应用。它可与PspA和/或PspC联用。

PrtA是细胞壁相关丝氨酸蛋白酶。它也称为sp128和sp130，属于枯草杆菌蛋白酶样丝氨酸蛋白酶。出于参比目的，全长PrtA前体的氨基酸序列是本文所述的SEQ ID NO：14。在R6基因组中，PrtA是spr0561[104]。本发明所用的优选PrtA多肽包含氨基酸序列：(a)与SEQ ID NO：14具有60％或更高的相同性(例如60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，99.5％或更高)；和/或(b)包含SEQ ID NO：14至少‘n’个连续氨基酸的片段，其中’n’是7或更多(例如8，10，12，14，16，18，20，25，30，35，40，50，60，70，80，90，100，150，200，250或更多)。这些PrtA蛋白包括SEQ ID NO：14的变体。(b)的优选片段包含来自SEQ ID NO：14的表位。其他优选片段缺少SEQ ID NO：14C末端的一个或多个氨基酸(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多个)和/或SEQ ID NO：14N末端的一个或多个氨基酸(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多个)，而保留SEQ ID NO：14的至少一个表位。其它片段略去一个或多个蛋白质结构域。参考文献130和131，以及参考文献123报道了PrtA的免疫应用。

Sp133是保守性肺炎球菌抗原。出于参比目的，全长Sp133的氨基酸序列是本文所述的SEQ ID NO：12。在R6基因组中，Sp133是spr0931[104]。本发明所用的优选Sp133多肽包含氨基酸序列：(a)与SEQ ID NO：12具有60％或更高的相同性(例如60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，99.5％或更高)；和/或(b)包含SEQ ID NO：12至少‘n’个连续氨基酸的片段，其中’n’是7或更多(例如8，10，12，14，16，18，20，25，30，35，40，50，60，70，80，90，100，150，200，250或更多)。这些Sp133蛋白包括SEQ ID NO：12的变体。(b)的优选片段包含来自SEQ ID NO：12的表位。其他优选片段缺少SEQID NO：12C末端的一个或多个氨基酸(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多个)和/或SEQ ID NO：12N末端的一个或多个氨基酸(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多个)，而保留SEQ ID NO：12的至少一个表位。其它片段缺少一个或多个蛋白质结构域。参考文献132报道了Sp133的免疫应用。

PiaA是参与肺炎球菌铁获取的膜通透酶。出于参比目的，全长PiaA的氨基酸序列是本文所述的SEQ ID NO：10。在R6基因组中，PiaA是spr0935[104]。本发明所用的优选PiaA多肽包含氨基酸序列：(a)与SEQ ID NO：10具有60％或更高的相同性(例如60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，99.5％或更高)；和/或(b)包含SEQ ID NO：10至少‘n’个连续氨基酸的片段，其中’n’是7或更多(例如8，10，12，14，16，18，20，25，30，35，40，50，60，70，80，90，100，150，200，250或更多)。这些PiaA蛋白包括SEQID NO：10的变体。(b)的优选片段包含来自SEQ ID NO：10的表位。其他优选片段缺少SEQ ID NO：10C末端的一个或多个氨基酸(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多个)和/或SEQ ID NO：10N末端的一个或多个氨基酸(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多个)，而保留SEQ ID NO：10的至少一个表位。其它片段略去一个或多个蛋白质结构域。参考文献133、134和135报道了PiaA的免疫应用，特别是与PiuA联用。

PiuA是用于转运三价铁的ABC转运蛋白底物结合蛋白。它也称为FatB。出于参比目的，全长PiuA的氨基酸序列是本文所述的SEQ ID NO：9。在R6基因组中，PiuA是spr1687[104]。本发明所用的优选PiuA多肽包含氨基酸序列：(a)与SEQ ID NO：9具有60％或更高的相同性(例如60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，99.5％或更高)；和/或(b)包含SEQ ID NO：9至少‘n’个连续氨基酸的片段，其中’n’是7或更多(例如8，10，12，14，16，18，20，25，30，35，40，50，60，70，80，90，100，150，200，250或更多)。这些PiuA蛋白包括SEQ ID NO：9的变体。(b)的优选片段包含来自SEQ IDNO：9的表位。其他优选片段缺少SEQ ID NO：9C末端的一个或多个氨基酸(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多个)和/或SEQ ID NO：9N末端的一个或多个氨基酸(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多个)，而保留SEQ ID NO：9的至少一个表位。其它片段略去一个或多个蛋白质结构域。参考文献133-135报道了PiuA的免疫应用，特别是与PiaA联用。

CbiO标注为钴转运蛋白ATP-结合亚基。出于参比目的，全长CbiO的氨基酸序列是本文所述的SEQ ID NO：8。在R6基因组中，CbiO是spr2025[104]。参考文献136(其中的′ID2′)报道了CbiO的免疫应用。本发明所用的优选CbiO多肽包含氨基酸序列：(a)与SEQ ID NO：8具有60％或更高的相同性(例如60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，99.5％或更高)；和/或(b)包含SEQ ID NO：8至少‘n’个连续氨基酸的片段，其中’n’是7或更多(例如8，10，12，14，16，18，20，25，30，35，40，50，60，70，80，90，100，150，200，250或更多)。这些CbiO蛋白包括SEQ ID NO：8的变体。(b)的优选片段包含来自SEQ ID NO：8的表位。其他优选片段缺少SEQ ID NO：8C末端的一个或多个氨基酸(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多个)和/或SEQ ID NO：8N末端的一个或多个氨基酸(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多个)，而保留SEQ ID NO：8的至少一个表位。其它片段略去一个或多个蛋白质结构域。

出于参比目的，30S核糖体蛋白S8的氨基酸序列是本文所述的SEQ ID NO：7。在R6基因组中，S8亚基是spr0203[104]。本发明所用的优选S8多肽包含氨基酸序列：(a)与SEQ ID NO：7具有60％或更高的相同性(例如60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，99.5％或更高)；和/或(b)包含SEQ ID NO：7至少‘n’个连续氨基酸的片段，其中’n’是7或更多(例如8，10，12，14，16，18，20，25，30，35，40，50，60，70，80，90，100，150，200，250或更多)。这些S8蛋白包括SEQ ID NO：7的变体。(b)的优选片段包含来自SEQ ID NO：7的表位。其他优选片段缺少SEQ ID NO：7C末端的一个或多个氨基酸(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多个)和/或SEQ ID NO：7N末端的一个或多个氨基酸(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多个)，而保留SEQ ID NO：7的至少一个表位。其它片段略去一个或多个蛋白质结构域。

肺炎链球菌具有称为菌毛-1(pilus-1)的菌毛，其由14kb的岛(PI-1)编码，该岛具有编码以下成分的七种基因：RlrA转录调节蛋白，三种包含LPXTG型细胞壁分选信号的菌毛亚基，和三种分选酶。RrgB是形成结构骨架的主要亚基[137-140]。RrgB亚基可用作本发明的肺炎球菌免疫原。其具有至少三个分化支。三个分化支的参比氨基酸序列是本文的SEQ ID NO：1、2和3。分化支在其N末端和C末端非常保守，但之间的部分有差异。已发现针对特定RrgB分化支产生的血清对表达该分化支的肺炎球菌有活性，但对表达其它两种分化支之一的菌株无活性，即分化支内有交叉保护，但支间没有交叉保护。因此，肺炎球菌免疫原可包含至少两种不同的RrgB分化支。这些可作为单独的多肽存在于免疫原性组合物内或融合成一条多肽链。

因此，肺炎球菌免疫原可包含以下一种、两种或三种：

(a)包含第一氨基酸序列的第一多肽，其中第一氨基酸序列包含的氨基酸序列(i)与SEQ ID NO：1具有至少a％的序列相同性，和/或(ii)由SEQ ID NO：1的至少x个连续氨基酸片段组成；

(b)包含第二氨基酸序列的第二多肽，其中第二氨基酸序列包含的氨基酸序列(i)与SEQ ID NO：2具有至少b％的序列相同性，和/或(ii)由SEQ ID NO：2的至少y个连续氨基酸片段组成；和/或

(c)包含第三氨基酸序列的第三多肽，其中第三氨基酸序列包含的氨基酸序列(i)与SEQ ID NO：3具有至少c％的序列相同性，和/或(ii)由SEQ ID NO：3的至少z个连续氨基酸片段组成。

a值是至少75，例如80、85、90、92、94、95、96、97、98、99或更大。b值是至少75，例如80、85、90、92、94、95、96、97、98、99或更大。c值是至少75，例如80、85、90、92、94、95、96、97、98、99或更大。a、b、和c值可以相同或不同。在一些实施方式中，a、b和c是相同的。通常a、b和c至少是90，例如至少95。

x值至少为7，例如8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、120、140、160、180、200、225、250)。y值至少为7，例如8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、120、140、160、180、200、225、250)。z值至少为7，例如8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、120、140、160、180、200、225、250)。x、y、和z值可以相同或不同。在一些实施方式中，x、y和z是相同的。

片段优选包含来自各SEQ ID NO：序列的表位。其他有用片段缺少各SEQ ID NO：C末端的一个或多个氨基酸(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多个)和/或各SEQ ID NO：N末端的一个或多个氨基酸(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多个)，而保留其至少一个表位。N末端截短20-25个氨基酸是便利的，例如除去SEQ ID NO：1-3任一的氨基酸1-23。SEQ ID NO：1的一个合适片段是SEQ ID NO：4。SEQ ID NO：2的一个合适片段是SEQ ID NO：5。SEQ ID NO：3的一个合适片段是SEQ ID NO：6。

SEQ ID NO：1的至少x个连续氨基酸的片段不应该还存在于SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3内。类似的，SEQ ID NO：2的至少y个连续氨基酸的片段不应该还存在于SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3内。类似的，SEQ ID NO：3的至少z个连续氨基酸的片段不应该还存在于SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2内。因此，在一些实施方式中：SEQ ID NO：1的一个片段优选来自SEQ ID NO：1的氨基酸31-614；SEQ ID NO：2的一个片段优选来自SEQ ID NO：2的氨基酸31-593；而SEQ ID NO：3的一个片段优选来自SEQ ID NO：3的氨基酸31-603；在一些实施方式中，当来自SEQ ID NO：1-3之一的片段作为连续序列与其它两个SEQ ID NO比对时，所述片段与其它两条SEQID NO中每一条之间的相同性小于75％，例如小于60％，小于50％，小于40％，小于30％。

包含第一氨基酸序列的多肽在给予对象时，能引起包含抗体的抗体应答，该抗体与具有氨基酸序列SEQ ID NO：1的野生型肺炎球菌蛋白(菌株TIGR4)结合。在一些实施方式中，这些抗体不结合具有氨基酸序列SEQ ID NO：2的野生型肺炎球菌蛋白，或具有氨基酸序列SEQ ID NO：3的野生型肺炎球菌蛋白。

包含第二氨基酸序列的多肽在给予对象时，能引起包含抗体的抗体应答，该抗体与具有氨基酸序列SEQ ID NO：2的野生型肺炎球菌蛋白(菌株芬兰^6B-12)结合。在一些实施方式中，这些抗体不结合具有氨基酸序列SEQ ID NO：1的野生型肺炎球菌蛋白，或具有氨基酸序列SEQ ID NO：3的野生型肺炎球菌蛋白。

包含第三氨基酸序列的多肽在给予对象时，能引起包含抗体的抗体应答，该抗体与具有氨基酸序列SEQ ID NO：3的野生型肺炎球菌蛋白(菌株台湾^23F-15)结合。在一些实施方式中，这些抗体不结合具有氨基酸序列SEQ ID NO：1的野生型肺炎球菌蛋白，或具有氨基酸序列SEQ ID NO：2的野生型肺炎球菌蛋白。

虽然第一、第二和第三氨基酸序列可能共有某些序列，但总体上它们具有不同的氨基酸序列。

当发明仅使用两种RrgB分化支时，组合物或多肽可同时包含：(a)如上定义的第一氨基酸序列；和(b)如上定义的第二氨基酸序列。在另一个实施方式中，所述组合物同时包含：(a)如上定义的第一氨基酸序列；和(b)如上定义的第三氨基酸序列。在另一个实施方式中，所述组合物同时包含：(a)如上定义的第二氨基酸序列；和(b)如上定义的第三氨基酸序列。

用于本发明的RrgB氨基酸序列与SEQ ID NO：1、2或3相比，包括一个或多个(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10等)保守氨基酸置换，即用另一个具有相关侧链的氨基酸置换一个氨基酸。遗传编码的氨基酸通常分为四个家族：(1)酸性，即天冬氨酸、谷氨酸；(2)碱性，即赖氨酸、精氨酸、组氨酸；(3)非极性，即丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸；和(4)极性不带电，即甘氨酸、天冬酰胺、谷胺酰胺、半胱氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸。有时将苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸一起分类为芳族氨基酸。通常，这些家族中的单个氨基酸的替换不会对生物活性产生重要影响。相对参比序列，该多肽可具有一个或多个(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10等)单个氨基酸的缺失。相对参比序列，该多肽也可包含一个或多个(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个等)插入(如各1、2、3、4或5个氨基酸)。

用于本发明的肺炎球菌免疫原可包括一种以上的这类多肽。例如，免疫原可以是：(a)spr0057、spr0096和spr2021的混合物；(b)spr0057、spr0565和spr2021的混合物；(c)spr0057、spr0096和spr0560的混合物；(d)spr0057、spr0096、spr0565和spr2021的混合物；(e)spr1418、spr0884和spr0096的混合物；(f)spr1418、spr0884和spr2021的混合物；(g)spr1418、spr0884、spr0096和spr2021的混合物；(h)spr0884、spr1416和spr0057的混合物；(h)spr0884、spr1416和spr0096的混合物；(h)spr0884、spr1416、spr0057和spr0096的混合物；或(i)spr1418、spr1431和spr0565的混合物。任意这些混合物(a)-(i)还可包含一种或多种RrgB分化支。

不同多肽(包含不同RrgB分化支)不需要作为单独多肽存在，而可作为融合多肽链表达。有用的融合蛋白包括选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO：11；SEQ IDNO：13；SEQ ID NO：15；SEQ ID NO：17；SEQ ID NO：19；SEQ ID NO：21。优选包含SEQ ID NO：15的氨基酸1-1793的多肽。

RSV免疫原

本发明可使用各种RSV免疫原。这些通常包含病毒F、G和M(融合、附着和基质)抗原或其片段中的1种、2种或3种。

参考文献141公开了包含一种或多种G蛋白或其片段的亚基疫苗，并描述了它们可用于引起保护性免疫，而不引起免疫病理学反应。

参考文献142公开了基于G蛋白或其片段的疫苗，其与支持肽偶联。基于G蛋白的疫苗可包封在微球内[143]。

参考文献144公开了包含三种F、G和M抗原的有用免疫原，当使用不含铝盐佐剂的组合物时，得到了最佳结果。参考文献6也公开了RSV抗原的F/G/M三联体。

另一种方法使用包含RSV表位的病毒样颗粒(VLP)或衣壳粒[145]。VLP可基于嵌合乳头瘤病毒L1多肽。

活的减毒RSV疫苗也是已知的(例如见参考文献146)，且如果用于本发明，它们与活的减毒流感疫苗(例如FLUMIST^TM产品)联合最有用。

GBS免疫原

GBS免疫原可包含荚膜糖和/或GBS蛋白。典型的蛋白包括参考文献147-150中公开的蛋白。文献151讨论了基于偶联荚膜糖的疫苗。当包含偶联糖时，优选包括来自一种或多种GBS血清型Ia、Ib、II、III、IV和/或V的糖。有用的GBS免疫原可包含“GBS80”蛋白(SEQ ID NO：67)或其免疫原性片段。

优选的免疫原

用于本发明的优选流感免疫原是灭活的病毒衍生免疫原，理想上是裂解病毒疫苗或纯化的流感病毒表面抗原疫苗。理想上病毒在卵或在MDCK细胞培养物上生长。包含来自两种甲型流感病毒株(H1N1和H3N2)和一种乙型流感病毒株的血凝素的流感免疫原是有用的。所述流感免疫原可辅助有例如含亚微米液滴的水包油乳液佐剂。

另一种用于本发明的优选流感免疫原是灭活的病毒衍生免疫原，理想上是裂解病毒疫苗或纯化的流感病毒表面抗原疫苗，含有来自两种甲型流感毒株(H1N1和H3N2)以及两种乙型流感毒株(a B/Victoria/2/87样乙型流感病毒和B/Yamagata/16/88样乙型流感病毒)的血凝素。所述流感免疫原中可辅助有含亚微米液滴的水包油乳液佐剂。该佐剂化4价组合对6个月以下的婴儿特别有用。

参考文献152公开了优选的肺炎球菌免疫原(“Pneumo-3”)，其包含抗原“SP2216-1”(文献152中的SEQ ID NO：1；本文所述的SEQ ID NO：68)，“SP 1732-3”(文献152中的SEQ ID NO：2；本文所述的SEQ ID NO：69)以及可任选的PsaA(文献152中的SEQ ID NO：3；本文中的SEQ ID NO：70)。可用包含这些SEQ ID NO的免疫原性片段的多肽替换实际公开的SEQ ID NO，例如包含来自各SEQ ID NO68和69的至少一个免疫原性片段。

另一种优选肺炎球菌免疫原同时包含spr0096和spr2021抗原，具体是一种同时包含spr0096和spr2021的融合蛋白，例如包含SEQ ID NO：66。

另一种优选肺炎球菌免疫原包含三种不同RrgB分化支中的每一种。因此，它可包含(a)第一氨基酸序列，所含氨基酸序列(i)与SFQ ID NO：1具有至少a％的序列相同性和/或(ii)由SEQ ID NO：1的至少x个连续氨基酸片段组成；(b)第二氨基酸序列，所含氨基酸序列(i)与SEQ ID NO：2具有至少b％的序列相同性和/或(ii)由SEQ ID NO：2的至少y个连续氨基酸片段组成；和(c)第三氨基酸序列，所含氨基酸序列(i)与SEQ ID NO：3具有至少c％的序列相同性和/或(ii)由SEQ ID NO：3的至少z个连续氨基酸片段组成。(a)、(b)、和(c)的序列理想地是与例如SEQ IDNO：11，13，15，17，19和21中所示相同的多肽链的部分(“RrgB三重融合蛋白”)。

可能的肺炎球菌免疫原(优选还包括至少一种肺炎球菌多肽)是7价或10价或13价偶联疫苗。

免疫原性组合物

本发明提供了可用作疫苗的免疫原性组合物。这些疫苗可以是预防性(即预防感染)或治疗性(即治疗感染)疫苗，但一般是预防性疫苗。

因此，组合物可以是药学上可接受的。除肺炎球菌和流感免疫原外，它们通常还包含其它组分，例如它们一般包含一种或多种药物载体和/或赋形剂。对这类组分的充分讨论参见参考文献228。

组合物通常以水性形式给予哺乳动物。然而在给药前，该组合物可以是非水性形式。例如，虽然一些疫苗制备成水性形式后以水性形式填装、分销和给药，但其他疫苗在制备过程中冻干，并在使用时重建成水性形式。因此，本发明组合物可以干燥，例如冻干制剂。

所述组合物可含有防腐剂，如硫柳汞或2-苯氧乙醇。然而，疫苗优选应基本不含(即小于5μg/ml)含汞物质，如不含硫柳汞。更优选无汞的疫苗。特别优选不含防腐剂的疫苗。

为了控制张度，优选包含生理性盐如钠盐。优选氯化钠(NaCl)，它的浓度可以是1-20mg/ml，例如约10±2mg/ml NaCl。可以存在的其它盐包括氯化钾、磷酸二氢钾、无水磷酸氢二钠、氯化镁、氯化钙等。

组合物的渗透压通常为200mOsm/kg-400mOsm/kg，优选为240-360mOsm/kg，更优选为290-310mOsm/kg。

组合物可含有一种或多种缓冲剂。常用缓冲剂包括：磷酸盐缓冲剂；Tris缓冲剂；硼酸盐缓冲剂；琥珀酸盐缓冲剂；组氨酸缓冲剂(特别是具有氢氧化铝佐剂)；或柠檬酸盐缓冲剂。包含的缓冲剂范围一般是5-20mM。

组合物的pH通常为5.0-8.1，更常为6.0-8.0，例如6.5-7.5，或者7.0-7.8。

所述组合物优选无菌。该组合物优选无热原，如每剂量含有＜1EU(内毒素单位，标准量度)，优选每剂量＜0.1EU。该组合物优选不含谷蛋白。

该组合物可含有一次免疫的物质，或者可含有多次免疫的物质(即‘多剂量’药盒)。多剂量配置优选含有防腐剂。作为多剂量组合物中包含防腐剂的替代方案(或补充方案)，所述组合物可包含在装有无菌接头以取出物质的容器中。

人疫苗通常以约0.5ml的单位剂量体积施用，但可将一半剂量(即约0.25ml)给予儿童。

本发明免疫原性组合物也可包含一种或多种免疫调节剂。优选地，一种或多种免疫调节剂包括一种或多种佐剂。可用于本发明组合物的佐剂包括但不限于：

A.含矿物质的组合物

本发明中适合用作佐剂的含有矿物质的组合物包括矿物盐，例如铝盐和钙盐。本发明包括矿物盐，如氢氧化物(例如羟基氧化物)、磷酸盐(例如，羟基磷酸盐、正磷酸盐)、硫酸盐等[例如，见参考文献156的第8、9章]，或不同无机化合物的混合物，其中的化合物可采取任何合适形式(例如凝胶、晶体、无定形等)，优选具有吸附性。也可将含有矿物质的组合物制成金属盐的颗粒。

称为″氢氧化铝″的佐剂一般是羟基氧化铝盐，其通常至少部分为晶体。可采用红外(IR)光谱将式AlO(OH)代表的羟基氧化铝与其它铝化合物如氢氧化铝Al(OH)₃区别开，具体区别是1070cm^-1处存在吸收带和3090-3100cm^-1处存在强肩[参考文献156的第9章]。半峰高处衍射带的宽度(WHH)反映了氢氧化铝佐剂的结晶程度，结晶不佳的颗粒因晶体尺寸较小而显示更强的谱线增宽。表面积随WHH的增加而增加，WHH值较大的佐剂显示吸附抗原的能力较强。氢氧化铝佐剂通常呈纤维形态(例如，如电子透射显微图中所见)。氢氧化铝佐剂的pI通常约11，即在生理pH下佐剂本身具有表面正电荷。据报道，pH 7.4时氢氧化铝佐剂的吸附容量为1.8-2.6毫克蛋白质/毫克Al⁺⁺⁺。

称为″磷酸铝″的佐剂一般是羟基磷酸铝，也常常含有少量硫酸盐(即羟基磷酸硫酸铝)。可通过沉淀获得这些佐剂，沉淀期间的反应条件和浓度影响磷酸根取代所述盐中羟基的程度。羟基磷酸盐的PO₄/Al摩尔比通常为0.3-1.2。羟基磷酸盐因存在羟基而有别于严格的AlPO₄。例如，3164cm^-1处的IR谱带(例如在200℃)表明存在结构性羟基[文献156的第9章]。

磷酸铝佐剂的PO₄/Al³⁺摩尔比通常为0.3-1.2，优选为0.8-1.2，更优选为0.95±0.1。磷酸铝通常是无定形的，尤其是羟基磷酸盐。典型的佐剂是PO₄/Al摩尔比为0.84-0.92的无定形的羟基磷酸铝，包含0.6mg Al³⁺/ml。磷酸铝通常是颗粒(如在透射电子显微图上观察到的板状形态)。抗原吸附后颗粒直径一般是0.5-20μm(如约5-10μm)。据报道，pH 7.4时磷酸铝佐剂的吸附容量为0.7-1.5毫克蛋白质/毫克Al⁺⁺⁺。

磷酸铝的零电点(PZC)与磷酸对羟基的取代程度逆相关，这种取代程度变化可能取决于用于沉淀制备盐的反应条件和反应物浓度。也通过改变溶液中游离磷酸根离子的浓度(更多磷酸根＝更多酸性PZC)或加入缓冲剂如组氨酸缓冲剂(使PZC碱性更强)改变PZC。本发明所用的磷酸铝的PZC通常为4.0-7.0，更优选为5.0-6.5，例如约为5.7。

用于制备本发明组合物的铝盐悬浮液可以，但不一定含有缓冲液(如磷酸盐或组氨酸或Tris缓冲液)。该悬浮液优选无菌且无热原。悬浮液可含有游离的水合磷酸根离子，如存在浓度为1.0-20mM，优选5-15mM，更优选约10mM。该悬浮液也可含有氯化钠。

在一个实施方式中，佐剂组分包括氢氧化铝和磷酸铝的混合物。在这种情况下，磷酸铝多于氢氧化铝，例如重量比为至少2∶1，例如，≥5∶1、≥6∶1、≥7∶1、≥8∶1、≥9∶1等。

已知的PREVNAR^TM和SYNFLORIX^TM疫苗都包含磷酸铝佐剂。这种佐剂对于流感疫苗不是理想的，而且可能更适合肺炎球菌糖抗原而不是蛋白质抗原。因此，在一些组合物同时包含流感病毒免疫原和肺炎球菌蛋白免疫原的实施方式中，组合物可不含磷酸铝佐剂。如果存在磷酸铝佐剂，它可以联合第二佐剂，例如3dMPL或水包油乳液。因此可避免包含磷酸铝盐作为唯一的佐剂。

给予患者的组合物中Al⁺⁺⁺的浓度优选小于10mg/ml，例如＜5mg/ml、＜4mg/ml、＜3mg/ml、＜2mg/ml、＜1mg/ml等。优选范围是0.3-1mg/ml。优选最大值是0.85mg/剂。

B.油乳剂

适用作本发明的佐剂的油乳剂组合物包括鲨烯-水乳剂，例如MF59[参考文献156的第10章；另见参考文献153](5％鲨烯、0.5％吐温80、和0.5％司盘85，用微流化床配制成亚微米颗粒)。也可以使用完全弗氏佐剂(CFA)和不完全弗氏佐剂(IFA)。

已知各种水包油乳剂，它们通常包括至少一种油和至少一种表面活性剂，所述油和表面活性剂是可生物降解(可代谢)和生物相容的。乳剂中的油滴直径通常小于5μm，乳剂宜包含具有亚微米直径的油滴，通过微流化床实现这种小尺寸以提供稳定乳剂。优选尺寸小于220nm的液滴，因为其可进行过滤灭菌。

本发明可使用的油诸如动物油(如鱼油)或植物油。植物油的来源包括坚果、种籽和谷物。最常见的花生油、大豆油、椰子油和橄榄油是坚果油的代表例子。也可使用获自(例如)霍霍巴豆的霍霍巴油。种籽油包括红花油、棉花籽油、葵花籽油、芝麻籽油等。在谷物油中，最常见的是玉米油，但也可以使用其它谷类的油，如小麦、燕麦、黑麦、稻、画眉草、黑小麦等。可从坚果和种籽油开始，通过水解、分离和酯化合适物质制备甘油和1，2-丙二醇的6-10碳脂肪酸酯，其不是种籽油中天然产生。来自哺乳动物乳汁的脂肪和油类是可代谢的，因此可以用于实施本发明。获得动物来源纯油所必需的分离、纯化、皂化和其它方法的过程为本领域熟知。大多数鱼类含有容易回收的可代谢油。例如，鳕鱼肝油、鲨鱼肝油和诸如鲸蜡的鲸油是可以用于本发明的几种鱼油的代表例子。通过生化途径用5-碳异戊二烯单位合成许多支链油，其总称为萜类。鲨鱼肝油含有称为鲨烯的支链不饱和萜类化合物，即2，6，10，15，19，23-六甲基-2，6，10，14，18，22-二十四碳六烯。其它优选油是生育酚(见下)。包含鲨烯的水包油乳液是特别优选的。可以使用油的混合物。

表面活性剂可以按其‘HLB’(亲水/亲脂平衡)分类。本发明优选的表面活性剂的HLB为至少10，优选至少15，更优选至少16。可以与本发明一起使用的表面活性剂包括但不限于：聚氧乙烯去水山梨糖醇酯表面活性剂(通常称为吐温)，特别是聚山梨酯20和聚山梨酯80；以商品名DOWF AX^TM出售的环氧乙烷(EO)、环氧丙烷(PO)和/或环氧丁烷(BO)的共聚物，如直链EP/PO嵌段共聚物；重复的乙氧基(氧-1，2-乙二基)数量不同的辛苯聚醇，特别感兴趣的是辛苯聚醇9(曲通(Triton)X-100，或叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇)；(辛基苯氧基)聚乙氧基乙醇(IGEPAL CA-630/NP-40)；磷脂如磷脂酰胆碱(卵磷脂)；衍生自十二烷醇、十六烷醇、十八烷醇和油醇的聚氧乙烯脂肪醚(称为苄泽表面活性剂)，如三乙二醇单月桂基醚(苄泽30)；以及去水山梨糖醇酯(总称为司盘)，如去水山梨糖醇三油酸酯(司盘85)和去水山梨糖醇单月桂酸酯。乳液中包含的优选表面活性剂是吐温80(聚氧乙烯脱水山梨糖醇单油酸酯)、司盘85(脱水山梨糖醇三油酸酯)、卵磷脂和曲通X-100。如上所述，诸如吐温80等去污剂可提供下文实施例所见的热稳定性。

可使用表面活性剂的混合物，如吐温80/司盘85混合物。聚氧乙烯去水山梨糖醇酯如聚氧乙烯去水山梨糖醇单油酸酯(吐温80)和辛苯聚醇如叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇(曲通X-100)的组合也适合。另一种有用的组合包含月桂醇聚醚-9和聚氧乙烯去水山梨糖醇酯和/或辛苯聚醇。

优选的表面活性剂的含量(重量％)为：聚氧乙烯去水山梨糖醇酯(如吐温80)0.01-1％，具体是约0.1％；辛基-或壬基-苯氧基聚氧乙醇(如曲通X100或曲通系列的其它去污剂)0.001-0.1％，具体是0.005-0.02％；聚氧乙烯醚(如月桂醇聚醚9)0.1-20％，优选0.1-10％，具体是0.1-1％或约0.5％。

本发明所用的具体水包油乳液佐剂包括但不限于：

·角鲨烯、吐温80和司盘85的亚微米乳液。所述乳液的体积组成可以是约5％角鲨烯、约0.5％聚山梨酯80和约0.5％司盘85。以重量计，这些比例为4.3％鲨烯、0.5％聚山梨酯80和0.48％司盘85。这种佐剂称为‘MF59’[153-155]，参考文献156的第10章和参考文献157的第12章更详细地描述了该佐剂。MF59乳液宜包含柠檬酸根离子，如10mM柠檬酸钠缓冲液。

·包含鲨烯、α-生育酚和聚山梨酯80的乳液。这些乳液可含有2-10％鲨烯、2-10％生育酚和0.3-3％吐温80，鲨烯∶生育酚的重量比优选≤1(例如0.90)，因为这能使乳液更稳定。鲨烯和吐温80的体积比可以约为5∶2，或者重量比约为11∶5。可通过以下方法制备一种这样的乳液：将吐温80溶解于PBS产生2％溶液，然后将90ml该溶液与5g DL-α-生育酚和5ml角鲨烯的混合物混合，然后使该混合物微流体化。得到的乳液可含有(如)平均直径为100-250nm，优选约180nm的亚微米油滴。

·鲨烯、生育酚和曲通去污剂(如曲通X-100)的乳液。该乳液也可包含3d-MPL(见下)。所述乳液可包含磷酸盐缓冲液。

·含有聚山梨酯(如聚山梨酯80)、曲通去污剂(如曲通X-100)和生育酚(如琥珀酸α-生育酚)。该乳液可包含这三种组分，其质量比约为75∶11∶10(如750μg/ml聚山梨酯80、110μg/ml曲通X-100和100μg/ml琥珀酸α-生育酚)，这些浓度应包括抗原中这些组分的贡献。所述乳液还可包含鲨烯。该乳液也可包含3d-MPL(见下)。所述水相可包含磷酸盐缓冲液。

·鲨烷、聚山梨酯80和泊洛沙姆401(“普流罗尼克^TM L121”)的乳液。所述乳液可用pH 7.4的磷酸盐缓冲盐水配制。该乳液是一种有用的胞壁酰二肽递送载体，且已与含苏氨酰基-MDP的“SAF-1”佐剂[158](0.05-1％Thr-MDP、5％鲨烯、2.5％普流罗尼克L121和0.2％聚山梨酸酯80)一起使用。也可不与Thr-MDP一起使用，例如用“AF”佐剂[159](5％鲨烯、1.25％普流罗尼克L121和0.2％聚山梨酸酯80)。优选微流体化。

·含有鲨烯、水溶剂、聚氧乙烯烷基醚亲水性非离子型表面活性剂(如聚氧乙烯(12)十六十八醚)和疏水性非离子型表面活性剂(如去水山梨糖醇酯或二缩甘露醇酯，如去水山梨糖醇单油酸酯或‘司盘80’)的乳液。该乳液优选为热可逆的和/或其中至少90％油滴(以体积计)的尺寸小于200nm[160]。该乳液也可含有以下一种或多种物质：糖醇；低温保护剂(例如，糖，如十二烷基麦芽苷和/或蔗糖)；和/或烷基聚糖苷。这类乳液可冻干。

·含有0.5-50％油、0.1-10％磷脂和0.05-5％非离子型表面活性剂的乳液。如参考文献161所述，优选的磷脂组分是磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇、磷脂酰甘油、磷脂酸、鞘磷脂和心磷脂。优选亚微米液滴尺寸。

·不可代谢油(如轻质矿物油)和至少一种表面活性剂(如卵磷脂、吐温80或司盘80)的亚微米水包油乳液。可包含添加剂，例如QuilA皂苷、胆固醇、皂苷-亲脂体偶联物(如通过葡糖醛酸的羧基将脂族胺加到脱酰基皂苷上而产生的GPI-0100，如参考文献162所述)、二甲基双十八烷基溴化铵和/或N，N-双十八烷基-N，N-双(2-羟乙基)丙二胺。

·包含矿物油、非离子亲脂性乙氧基化脂肪醇和非离子亲水性表面活性剂(例如，乙氧基化脂肪醇和/或聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物)的乳液[163]。

·包含矿物油、非离子亲水性乙氧基化脂肪醇和非离子亲脂性表面活性剂(例如，乙氧基化脂肪醇和/或聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物)的乳液[163]。

·皂苷(如QuilA或QS21)和固醇(如胆固醇)结合成螺旋胶束的乳液[164]。

用水包油乳液作为本发明的佐剂特别适用于儿童。这些佐剂可提供针对流感病毒的高且持续至少6个月的抗体效价，引发的免疫应答针对循环流感病毒株的漂移变体具有交叉反应性[165]。6个月以下的婴儿目前比任何年龄组的流感住院率都高，因此该年龄组需要有效预防。

通常在传递给病人时混合组合物中的抗原和佐剂。可以在生产时将该乳液与抗原混合，或在递送时临时混合。因此，在包装或出售的疫苗中该佐剂和抗原可分开保存，使用时配制成最终制剂。所述抗原通常是水性形式，从而最终通过混合两种液体制备疫苗。所述两种液体的混合体积比可变(例如5∶1-1∶5)，但通常约为1∶1。

C.皂苷制剂[参考文献156的第22章]

皂苷制剂也可以用作本发明的佐剂。皂苷是在许多植物种类的树皮、叶、茎干、根甚至花中发现的甾醇糖苷和三萜糖苷的异质群体。已广泛研究了作为佐剂的来自皂皮树(Quillaia saponaria Molina)树皮的皂苷。皂苷也可获自丽花菝葜(Smilacornata)(墨西哥菝葜)、满天星(Gypsophilla paniculata)(婚纱花)和肥皂草(Saponaria officianalis)(皂根)。皂苷佐剂制剂包括纯化制剂如QS21，以及脂质制剂如ISCOM。QS21以商标Stimulon^TM出售。

已采用HPLC和RP-HPLC纯化皂苷组合物。已鉴定了用这些技术纯化的特定组分，包括QS7、QS17、QS18、QS21、QH-A、QH-B和QH-C。所述皂苷优选QS21。制备QS21的方法参见参考文献166。皂苷制剂也可包含甾醇，如胆固醇[167]。

皂苷和胆固醇的组合可用于形成称为免疫刺激复合物(ISCOM)的独特颗粒[参考文献156的第23章]。ISCOM通常还包含磷脂，如磷脂酰乙醇胺或磷脂酰胆碱。任何已知的皂苷均可以用于ISCOM中。ISCOM优选包含QuilA、QHA和QHC中的一种或多种。参考文献167-169中进一步描述了ISCOM。任选地，ISCOM可不含其它去污剂[170]。

开发基于皂苷的佐剂的综述可参见参考文献171和172。

D.细菌或微生物衍生物

适用于本发明的佐剂包括细菌或微生物衍生物，如肠细菌脂多糖(LPS)的无毒衍生物、脂质A衍生物、免疫刺激性寡核苷酸和ADP-核糖基化毒素及其脱毒衍生物。

LPS的无毒衍生物包括单磷酰脂质A(MPL)和3-O-脱酰基MPL(3dMPL)。3dMPL是3脱-O-酰基单磷酰脂质A与4、5或6酰化链的混合物。3脱-O-酰基单磷酰脂质A的优选“小颗粒”形式见参考文献173中所述。这种3dMPL“小颗粒”小到足以在过滤除菌时通过0.22μm膜[173]。其它无毒LPS衍生物包括单磷酰脂质A模拟物，如氨基烷基氨基葡萄糖苷磷酸盐衍生物，例如RC 529[174，175]。

脂质A衍生物包括大肠杆菌(Escherichia coli)的脂质A衍生物，如OM-174。(例如)参考文献176和177中描述了OM-174。

适合用作本发明佐剂的免疫刺激性寡核苷酸包括含CpG基序的核苷酸序列(含有通过磷酸键与鸟苷连接的非甲基化胞嘧啶的二核苷酸序列)。含回文或聚(dG)序列的双链RNA和寡核苷酸也显示具有免疫刺激作用。

CpG可以包含核苷酸修饰/类似物如硫代磷酸酯修饰，且可以是双链或单链。参考文献178、179和180公开了可能的类似物取代，例如用2’-脱氧-7-脱氮鸟苷取代鸟苷。参考文献181-186中进一步讨论了CpG寡核苷酸的佐剂作用。

CpG序列可导向TLR9，例如基序GTCGTT或TTCGTT[187]。CpG序列可特异性诱导Th1免疫应答，如CpG-A ODN，或更特异地诱导B细胞应答，如CpG-BODN。参考文献188-190中讨论了CpG-A和CpG-B ODN。优选CpG为CpG-A ODN。

CpG寡核苷酸优选构建成5’末端可被受体识别。任选将两个CpG寡核苷酸序列的3’端相连接形成“免疫聚体”。参见例如，参考文献187和191-193。

基于免疫刺激性寡核苷酸的特别有用的佐剂被称为IC-31^TM[194-196]。因此，本发明使用的佐剂可以包含(i)和(ii)的混合物：(i)含有至少一个(优选多个)CpI基序(即胞嘧啶与肌苷相连形成二核苷酸)的寡核苷酸(例如15-40个核苷酸)，和(ii)聚阳离子聚合物，如含有至少一个(优选多个)Lys-Arg-Lys三肽序列的寡肽(如5-20个氨基酸)。所述寡核苷酸可以是包含26聚体序列5′-(IC)₁₃-3′(SEQ IDNO：71)的脱氧核苷酸。聚阳离子聚合物可以是含有11聚体氨基酸序列KLKLLLLLKLK的肽(SEQ ID NO：72)。SEQ ID NO：71和72的组合提供了IC-31^TM佐剂。

细菌ADP-核糖基化毒素及其去毒衍生物可以用作本发明的佐剂。优选所述蛋白衍生自大肠杆菌(大肠杆菌不耐热肠毒素“LT”)、霍乱菌(“CT”)或百日咳菌(“PT”)。参考文献197中描述了将脱毒的ADP-核糖基化毒素用作粘膜佐剂，参考文献198中描述了将其用作胃肠道外佐剂。.所述毒素或类毒素优选全毒素形式，包含A和B亚基。A亚基优选含有脱毒突变；B亚基优选不突变。所述佐剂优选脱毒的LT突变体，如LT-K63、LT-R72和LT-G192。参考文献199-206中描述了将ADP-核糖基化毒素及其脱毒衍生物，具体是LT-K63和LT-R72用作佐剂。一种有用的CT突变体是CT-E29H[207]。氨基酸取代的数字基准优选是根据参考文献208中提出的ADP-核糖基化毒素的A和B亚基的比对，该参考文献通过引用全文纳入本文。

E.人免疫调节剂

适合用作本发明佐剂的人免疫调节剂包括细胞因子，如白介素(例如，IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-12[209]等)[210]、干扰素(例如干扰素-γ)、巨噬细胞集落刺激因子和肿瘤坏死因子。优选的免疫调节剂是IL-12。

F.生物粘着剂和粘膜粘着剂

生物粘着剂和粘膜粘着剂也可以用作本发明的佐剂。合适的生物粘着剂包括酯化透明质酸微球[211]或粘膜粘着剂如聚(丙烯酸)交联衍生物、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、多糖和羧甲基纤维素。壳聚糖及其衍生物也可用作本发明的佐剂[212]。

G.微粒

微粒也可以用作本发明的佐剂。微粒(即直径为～100nm-～150μm，更优选直径～200nm-～30μm，最优选直径～500nm-～10μm的颗粒)由生物可降解的无毒材料(例如，聚(α-羟酸)、聚羟基丁酸、聚原酸酯、聚酐、聚己内酯等)形成，优选聚(丙交酯乙交酯共聚物)，并任选经处理而具有带负电表面(例如用SDS处理)或带正电表面(例如用阳离子去污剂如CTAB处理)。

H.脂质体(参考文献156的第13和14章)。

适合用作佐剂的脂质体制剂的例子见参考文献213-215所述。

I.咪唑并喹诺酮化合物。

适合用作本发明佐剂的咪唑并喹诺酮化合物的例子包括咪喹莫特及其同系物(例如，″瑞喹莫德3M″)，见参考文献216和217所述。

本发明也可包含以上鉴定的一种或多种佐剂各方面的组合。例如，可将以下佐剂组合物用于本发明：(1)皂苷和水包油乳剂[218]；(2)皂苷(如QS21)+无毒LPS衍生物(如3dMPL)[219]；(3)皂苷(如QS21)+无毒LPS衍生物(如3dMPL)+胆固醇；(4)皂苷(如QS21)+3dMPL+IL12(任选+固醇)[220]；(5)3dMPL与(例如)QS21和/或水包油乳剂的组合[221]；(6)SAF，含有10％鲨烯、0.4％吐温80^TM、5％普朗尼克-嵌段聚合物L121和thr-MDP，或微流体化成为亚微米乳液或涡旋振荡产生粒度较大的乳液。(7)Ribi^TM佐剂系统(RAS)(瑞比免疫化学公司(Ribi Immunochem))，含有2％鲨烯、0.2％吐温80和一种或多种细菌细胞壁组分，所述组分选自单磷酰脂质A(MPL)、海藻糖二霉菌酸酯(TDM)或细胞壁骨架(CWS)，优选MPL+CWS(Detox^TM)；和(8)一种或多种矿物盐(如铝盐)+LPS的无毒衍生物(如3dMPL)。

用作免疫刺激剂的其它物质可参见参考文献156的第7章。

可用氢氧化铝佐剂，抗原一般吸附在该盐上。还优选包含鲨烯，具有亚微米油滴的水包油乳液，尤其是在年长者中。有用的佐剂组合包括Th1和Th2佐剂的组合，如CpG和铝盐，或雷西莫特和铝盐。可以使用铝盐和3dMPL的组合。

用作疫苗的免疫原性组合物包含免疫有效量的肺炎球菌和流感免疫原，以及需要的任何其它组分。“免疫有效量”指在一次剂量或系列剂量的一部分中给予个体的对治疗或预防有效的量。该量根据待治疗个体的健康和身体状况、年龄、待治疗个体的分类群(例如，非人灵长类、灵长类等)、个体免疫系统合成抗体的能力、所需的保护程度、疫苗配方、治疗医生对医学情况的评估和其它相关因素而变化。预计所述量将落入可通过常规试验测定的相对较宽范围内。可从批准的人肺炎球菌和流感疫苗获得剂量指导。

肺炎球菌和流感感染可影响机体的各个部分，因此可将本发明组合物制备成各种形式。例如，可将所述组合物制备为液体溶液或悬浮液形式的注射剂。也可制备适合在注射前溶解或悬浮于液体运载体的固体形式(如冻干组合物或喷雾冻干组合物)。可制备所述组合物用于局部给药，例如油膏、乳膏或粉剂。该组合物可制备用于口服给药，如作为片剂或胶囊，喷雾剂，或糖浆剂(任选调味)。可将所述组合物制备用于肺部给药，例如采用细粉或喷雾的吸入剂。可将所述组合物制备为栓剂或阴道栓。所述组合物可以制备用于鼻部、耳部或眼部给药，例如作为滴剂。然而，通常组合物可以是适合肌肉内注射的可注射液体，它是目前灭活流感疫苗和肺炎球菌疫苗的给药途径，通常单位剂量体积为0.5ml。

由于流感疫苗是根据季节制备而肺炎球菌疫苗不是，将药盒分成组分可在使用时组合以提供本发明的免疫原性组合物较为方便。这种配置使得例如肺炎球菌或RSV疫苗能在流感季节之间保存。因此，本发明提供了一种药盒，其含有(i)含有流感病毒免疫原的第一药盒组分，和(ii)含有肺炎球菌免疫原的第二药盒组分。混合两种药盒组分得到本发明的组合物。第二种药盒组分可以是干燥形式，可用流感病毒免疫原重建，以提供本发明的组合物。如果第一和第二组分都是液体形式，其免疫原应比所需的最终浓度更浓，从而其混合能互相稀释到最终剂量浓度。例如，可以双倍浓度提供两种液体免疫原，因此1∶1(体积)混合获得所需的最终浓度。

提供这样的药盒时，它可包含两个小瓶，或可包含一个预填充针筒和一个小瓶，使用时针筒中的内含物在注射前活化小瓶中的内含物。其他配置也可行。

当两种免疫原以药盒形式存在时，其中一种或两种都可包含佐剂。然而在其它实施方式中，药盒包括含佐剂的第三药组分，其中第三种组分可与未佐剂化的第一和第二组分组合，提供最终的佐剂化组合物。在一个有用的药盒中，流感免疫原经佐剂化、(例如配有水包油乳液佐剂)，而肺炎球菌免疫原未佐剂化，因此其混合提供了本发明的佐剂化组合物。在另一个有用的药盒中，流感免疫原未佐剂化，而肺炎球菌免疫原经佐剂化，因此其混合提供了本发明佐剂化的组合物。在另一个有用的药盒中，流感免疫原和肺炎球菌免疫原都是佐剂化的，但配有不同佐剂。

治疗方法和所述疫苗给予

本发明还提供了使哺乳动物产生免疫应答的方法，包括给予有效量的本发明免疫原性组合物的步骤。所述免疫应答优选为保护性，并优选涉及抗体和/或细胞介导免疫。该方法可以引起增强的应答。

本发明还提供了流感病毒免疫原和肺炎球菌免疫原用作组合药物，例如用于使哺乳动物产生免疫应答。肺炎链球菌免疫原通常包含至少一种肺炎链球菌多肽。药物还可包含RSV免疫原，但在一些实施方式中药物不包括RSV免疫原。

本发明还提供(i)含有至少一种肺炎球菌多肽的肺炎球菌免疫原，和(ii)流感病毒免疫原和/或RSV免疫原，用作组合药物，例如用于在哺乳动物中引起免疫应答。

本发明还提供了流感病毒免疫原和肺炎球菌免疫原在制备组合药物中的应用，用于使哺乳动物产生免疫应答。肺炎链球菌免疫原通常包含至少一种肺炎球菌多肽。药物还可包含RSV免疫原，但在一些实施方式中药物不包括RSV免疫原。

本发明还提供使用(i)含有至少一种肺炎球菌多肽的肺炎球菌免疫原，和(ii)流感病毒免疫原和/或RSV免疫原，用于制备组合药物以在哺乳动物中引起免疫应答。

借助这些应用和方法在哺乳动物中产生免疫应答，能保护该哺乳动物抵抗肺炎球菌和流感。因此，组合物可用于自动免疫，以抵抗(a)肺炎链球菌(S.pneumoniae)引起的侵袭性疾病(例如包括菌血症、败血症、脑膜炎、菌血性肺炎、和/或急性中耳炎)，和(b)流感病毒疾病和/或感染，特别是甲型和乙型流感病毒导致的。因此，综合而说所述组合可有效抵抗多种下呼吸道疾病。

本发明还提供了一种预填充本发明免疫原性组合物的递送装置。合适的递送装置包括预装填针筒。

所述哺乳动物优选人。当疫苗用于预防性用途时，人优选为儿童(如幼童或婴儿)或青少年；当疫苗用于治疗用途时，人优选为青少年或成人。准备给予儿童的疫苗也可给予成年人，例如用以评估安全性、剂量、免疫原性等。可用按照本发明制备的疫苗治疗儿童和成年人。因此，人患者可以小于1岁、小于5岁、1-5岁、5-15岁、15-55岁或至少55岁。优选接受疫苗的病人是年长者(例如≥50岁，≥60岁，和优选≥65岁)。疫苗不仅适用于这些年龄组，而是可在人群中更广泛使用，包括幼儿(例如5岁以下)，住院病人，医务工作者，部队和军人，孕妇，慢性病患者，或免疫缺陷病人。

一种检验治疗性处理功效的方式包括在给予本发明组合物后监测肺炎球菌或流感感染。一种检验预防性处理功效的方法涉及测试标准试验中的接种后血清。例如，为了检查抗肺炎球菌免疫力，可在调理吞噬杀伤实验(OPKA)中测试血清，其调理肺炎球菌的能力指示了保护效力。另一种检查预防性抗肺炎球菌处理功效的方法涉及在肺炎球菌感染的动物模型例如豚鼠或小鼠中进行免疫后攻击。参考文献222中描述了一种此类模型。为了检查抗流感免疫力，可用标准体外测试，例如测试血凝素滴度或微量中和滴度。本发明的优选组合物应满足每种流感毒株的成年人功效CPMP标准中的1条、2条或3条，即使它们是给予儿童的。这些标准是：(1)≥70％血清保护；(2)≥40％血清转化或显著增加；和/或(3)GMT增加≥2.5倍。在老年人(＞60岁)中，这些标准是：(1)≥60％血清保护；(2)≥30％血清转化；和/或(3)GMT增加≥2倍。这些标准基于至少50位患者的开放标记研究。

本发明的组合物可适用于减少就医的发热性疾病，急性中耳炎，和/或下呼吸道感染(包括肺炎)。

本发明的组合物通常直接给予患者。可通过胃肠道外注射(如皮下、腹膜内、静脉内、肌肉内或组织间隙)，或通过粘膜如经直肠、口腔(如片剂、喷雾)、阴道、局部、透皮或经皮、鼻内、眼、耳、肺或其它粘膜途径完成直接递送。肌肉内给药是如上所述典型的。

本发明可用于引起全身和/或粘膜免疫，优选引起增强的全身和/或粘膜免疫。

可以通过单剂量方案或多剂量方案给予剂量。多剂量可以用于初次免疫方案和/或加强免疫方案。在多剂量方案中，可通过相同或不同途径给予各种剂量，例如采用胃肠道外初次免疫和粘膜加强免疫、粘膜初次免疫和胃肠道外加强免疫等。一般以至少1周(例如约2周、约3周、约4周、约6周、约8周、约10周、约12周、约16周等)的间隔给予多个剂量。本发明的免疫原性组合物可以每年、每2年、每3年等给予同一病人。

一种使用本发明组合物的方法(例如用于15岁以下儿童或55岁以上的长者)是施用本文所述的组合疫苗(例如含有肺炎球菌和流感免疫原)，然后在随后的季节中施用未组合的流感疫苗(例如正常三价季节性流感疫苗)。本发明提供了接种病人的方法，包括：(i)施用本发明的免疫原性组合物，其中组合物包含流感病毒免疫原，然后在至少3个月后，(ii)施用免疫原性组合物，其中流感病毒免疫原是唯一的免疫原性组分。本发明还提供了免疫病人的方法，包括对病人施用将流感病毒免疫原作为唯一免疫原性组分的免疫原性组合物，其中病人先前已用包含流感病毒免疫原的本发明的免疫原性组合物接种。

可将本发明产生的疫苗与其它疫苗基本上同时(在健康护理专业人员或疫苗接种中心的同一用药咨询或就访期间)给予患者，例如与麻疹疫苗、腮腺炎疫苗、风疹疫苗、MMR疫苗、水痘疫苗、MMRV疫苗、白喉疫苗、破伤风疫苗、百日咳疫苗、DTP疫苗、偶联的乙型流感嗜血杆菌疫苗、脊髓灰质炎病毒灭活疫苗、乙型肝炎病毒疫苗、脑膜炎球菌偶联疫苗(如四价A-C-W135-Y疫苗)、呼吸道合胞病毒疫苗等基本上同时给药。

一种使用本发明组合物的方法(例如在一岁以下儿童中)是隔两个月例如在2、4、6月龄时施用，共3剂。这些免疫可与其它儿童疫苗同时提供，例如与含DTP的疫苗(例如含DTaP的疫苗)同时提供。因此，与儿童中典型使用的三价流感疫苗不同，本发明的组合物可根据年龄方案使用，而不是按照季节方案。这种给药方案对于含肺炎球菌多肽，来自各H1N1甲型流感病毒、H3N2甲型流感病毒、B/Victoria/2/87样乙型流感病毒和B/Yamagata/16/88样乙型流感病毒的血凝素，以及水包油乳液佐剂的疫苗特别有用。

多肽

可以多种方式制备本发明所用多肽(例如作为肺炎球菌免疫原的一部分)，例如化学合成(全部或部分)，用蛋白酶消化较长多肽，由RNA翻译，由细胞培养物纯化(如通过重组表达)，由生物体本身制备(如细菌培养后，或直接获自患者)等。产生长度＜40个氨基酸的肽的优选方法包括体外化学合成[223，224]。尤其优选固相肽合成，例如基于tBoc或Fmoc[225]化学的方法。也可部分或完全利用酶促合成[226]。作为化学合成的替代方式，可利用生物合成，例如，可通过翻译产生多肽。这一过程可以在体外或体内进行。生物学方法通常仅限于产生基于L-氨基酸的多肽，但可通过操作翻译机(如氨基酰基tRNA分子的翻译机)引入D-氨基酸(或其它非天然氨基酸，如碘化酪氨酸或甲基苯丙氨酸、叠氮基高丙氨酸等)[227]。然而，包含D-氨基酸时，优选使用化学合成。多肽的C末端和/或N末端上可能有共价修饰。

多肽可采取各种形式(如天然、非糖基化、脂化、非脂化、磷酸化、非磷酸化、肉豆蔻酰化、非肉豆蔻酰化、单体、多聚体、颗粒、变性等)。

多肽优选的提供形式是纯化或基本纯化，即基本不含其它多肽(如不含天然产生的多肽)、特别是不含其它肺炎球菌或宿主细胞多肽，多肽一般为至少约50％纯(以重量计)，通常至少约90％纯，即组成中少于约50％，更优选少于约10％(如5％或以下)是其它表达的多肽。

术语“多肽”指任何长度的氨基酸聚合物。所述聚合物可以是线性或支链聚合物，可以包含经修饰的氨基酸，可以被非氨基酸打断。该术语也包括天然或通过人工介入修饰的氨基酸聚合物；例如，二硫键形成、糖基化、脂化、乙酰化、磷酸化或任何其它操作或修饰，如与标记组分偶联。该定义也包括，例如，含有一个或多个氨基酸类似物(包括例如，非天然氨基酸等)以及本领域已知其它修饰的多肽。多肽可以以单链或结合链的形式产生。多肽可以是天然或非天然糖基化的(即该多肽的糖基化模式不同于相应天然产生多肽的糖基化模式)。

虽然可以在链球菌(Streptococcus)中表达所述多肽，但本发明通常使用异源宿主进行重组表达。异源宿主可以是原核(例如细菌)或真核生物。通常可以是大肠杆菌(E.coli)，其他合适的宿主包括枯草杆菌(Bacillus subtilis)、霍乱弧菌(Vibriocholerae)、伤寒沙门菌(Salmonella typhi)、鼠伤寒沙门菌(Salmonella typhimurium)、乳酰胺奈瑟菌(Neisseria lactamica)、灰色奈瑟菌(Neisseria cinerea)、分枝杆菌(Mycobacteria)(例如结核分支杆菌(M.tuberculosis))、酵母等。

概述

除非另有说明，本发明的实施将采用常规的化学、生物化学、分子生物学、免疫学和药理学方法，这些方法在所述领域技术范围内。这些技术在文献中已有充分描述。见例如参考文献228-235等。

上文使用“GI”编号。GI号码，或者“基因信息识别号”(GenInfo Identifier)是NCBI将序列加入其数据库时，连续对每一序列记录指定的一串数字。GI编号与序列记录登录号没有相似之处。序列更新(如纠正或加入更多注释或信息)后，将接受新GI编号。因此与给定GI编号相关的序列是不变的。

当本发明涉及“表位”时，该表位可以是B细胞表位和/或T细胞表位。可凭经验鉴定此类表位(如使用PEPSCAN[236，237]或相似方法)，或可对其进行预测(如使用詹姆森-沃尔夫抗原性指数(Jameson-Wolf antigenic index)[238]、基于矩阵的方法[239]、MAPITOPE[240]、TEPITOPE[241，242]、神经网络[243]、OptiMer和EpiMer[244，245]、ADEPT[246]、T位点[247]、亲水性[248]、抗原性指数[249]或250-254等参考文献中公开的方法)。表位是抗体或T细胞受体的抗原结合位点识别并结合的抗原的某部分，它们也称作“抗原决定簇”。

术语“包含”涵盖“包括”以及“由……组成”，例如，“包含”X的组合物可以仅由X组成或可以包括其它物质，例如X+Y。

术语“基本上”不排除“完全”，如“基本上不含”Y的组合物可能完全不含Y。必要时，术语“基本上”可从本发明定义中省略。

与数值x相关的术语“约”是可选的并表示例如x±10％。

除非另有说明，包括混合两种或多种组分的步骤的过程不要求任何特定的混合顺序。因此，组分可以任何顺序混合。在有三种组分时，可将两种组分相互合并，然后可将合并的组分再与第三种组分混合等。

抗体通常对于其靶标是特异性的。因此，其对靶标的亲和性高于无关对照蛋白，例如牛血清白蛋白。

两个氨基酸序列间的序列相同性百分数表示进行比对时所比较的两条序列中相同氨基酸的百分数。利用本领域所知软件程序，例如参考文献255的7.7.18部分所描述的软件程序，可进行比对并确定同源性百分数或序列相同性百分数。.优选通过史密斯-沃特曼(Smith-Waterman)同源性搜索算法进行比对，该算法使用仿射缺口搜索，其中缺口开放罚分为12，缺口延伸罚分为2，BLOSUM矩阵计为62。参考文献256中公开了史密斯-沃特曼同源性搜索算法。.

附图简要说明

图1显示了使用11个小鼠测试组的血清获得的50％中和滴度。每组有两个数据柱，代表针对A/H1N1(左)和A/H3N2(右)的MN滴度。所述11组从左至右为：RrgB-321+MF59；RrgB-213+MF59；单独流感；流感+MF59；RrgB-321+流感/MF59；RrgB-213+流感/MF59；单独MF59；流感+氢氧化铝；RrgB-321+流感/氢氧化铝；RrgB-213+流感/氢氧化铝；缓冲液。

图2显示了图1中同样的11个测试组的HI滴度(GMT，log-2尺度)。每组有三个数据柱，代表针对A/H1N1(左)、A/H3N2(中)或B(右)的MN滴度。

图3显示了用所示血清稀释度的OPKA结果(％杀伤)。线条显示了1/12稀释的6组数据，由上至下为：○Prevnar对照；△抗-6B对照；◇RrgB-321+MF59；△RrgB-321+流感+MF59；□RrgB-321+流感+氢氧化铝；和△单独流感。

具体实施方式

初步实验

在第0、14和28日接种每组8只的6周龄BalB/c小鼠。肌肉内施用组合物。然后用肺炎球菌TIGR4菌株鼻内攻击小鼠，评估体内保护(死亡率)和体外保护(调理吞噬杀伤实验)。在攻击前对小鼠采血，评估流感血清转换。

第一个实验使用11组小鼠，其接受肺炎球菌免疫原(20μg“RrgB三重融合”蛋白，和/或150μg‘Pneumo-3’组合，其中每种多肽50μg)，流感免疫原(Agrippal^TM或Fluad^TM产品，浓度为0.1μg/株)，或两者的混合物。所述组合物配有氢氧化铝佐剂，还有一个对照组仅接受佐剂。所述11组接受如下免疫原：

1.RrgB三重融合+佐剂

2.Pneumo-3+佐剂

3.Agrippal^TM+佐剂

4.RrgB三重融合+Pneumo-3+Agrippal^TM+佐剂

5.RrgB三重融合+Pneumo-3+佐剂

6.Pneumo-3+Agrippal^TM+佐剂

7.RrgB+Agrippal^TM+佐剂

8.佐剂

9.Agrippal^TM

10.Fluad^TM

11.RrgB三重融合+Pneumo-3+Fluad^TM

第二个实验使用8组小鼠，其接受肺炎球菌免疫原、流感免疫原或两者的混合物。所述组合物配有MF59佐剂。所述8组为：

1.RrgB三重融合+MF59

2.Pneumo-3+MF59

3.Fluad^TM

4.RrgB三重融合+Pneumo-3+Fluad^TM+MF59

5.RrgB三重融合+Pneumo-3+MF59

6.Pneumo-3+Fluad^TM+MF59

7.RrgB三重融合+Fluad^TM+MF59

8.MF59

组合疫苗的功能性免疫实验

将称作‘213’(SEQ ID NO：21)或‘321’(SEQ ID NO：15)的两种不同RrgB三重融合与三价季节性流感疫苗混合，用或不用MF59或氢氧化铝佐剂化。这些组合用于免疫小鼠。

用不同的RrgB三重融合和流感疫苗组合肌肉内免疫小鼠。用流感血凝素抑制(HI)和微量中和(MN)实验，以及调理吞噬杀伤实验(OPKA)评估免疫小鼠的血清。总共有11组。在第0日，小鼠接受RrgB三重融合(20μg)之一，其配有MF59或氢氧化铝佐剂。对照小鼠单独接受MF59或缓冲液。在第14日，小鼠接受加入或未加入MF59或氢氧化铝佐剂的RrgB三重融合物(20μg)，以及加入或不加入0.1μg流感疫苗。对照小鼠单独接受缓冲液，或流感疫苗，其中未配有或配有MF59或氢氧化铝佐剂。在第28日，小鼠再次接受与第14日相同的组合物。

对于MN实验，MDCK细胞以20,000细胞/孔的浓度接种在96孔板上。翌日，小鼠血清连续稀释在96孔板中，与固定量的流感病毒(每株300TCID50/孔)在37℃孵育1小时。然后在胰蛋白酶(1∶250最终)的存在下将血清/病毒混合物加入贴壁的MDCK细胞中，37℃孵育。过夜孵育后，用基于ELISA的实验鉴定感染的细胞。用PFA 2％固定MDCK细胞，渗透化，并用各病毒特异性FITC偶联的抗M/NP抗体标记。孵育1小时后，用POD偶联的抗-FITC抗体对培养的细胞进行染色。1小时后，加入POD底物，评估450nm处的吸光度。吸光强度与感染细胞数成正比。每个样品稀释度获得的数据内插到4-参数拟合曲线中，MN滴度表示成感染减少50％所需的血清稀释度的倒数。

对于HI实验，独立分析血清，结果表示成几何平均滴度(GMT)。根据标准程序用火鸡红血细胞进行HI实验。读取作为产生血凝素抑制的最后血清稀释度的滴度。滴度10指定为对于测试的第一稀释度(1∶20)产生负结果的血清。

对于OPKA实验，对6B血清型肺炎球菌用第42日血清所得数据进行测试。简单说，用热灭活小鼠抗血清的系列稀释物调理的细菌与幼兔补体和吞噬细胞(不同的人白血病祖细胞)在37℃混合1小时，然后接种在琼脂糖上。过夜孵育后，对存活菌落进行计数，结果表示成OPKA中相对于不含血清的对照被杀死的细菌百分数。

MN(图1)和HI(图2)的结果都显示MF59存在下的反应总体优于氢氧化铝。总的说，用流感疫苗和‘321’融合物的组合免疫的小鼠显示了与单用流感疫苗相当的HI和MN滴度，而用流感疫苗和’213’融合物的组合免疫的小鼠显示针对三种季节性毒株的HI和MN滴度显著下降。乙型流感病毒也观察到类似结果。

类似的，OPA实验(图3)显示针对组合疫苗产生的抗体与针对RrgB融合物单独产生的抗体具有类似的杀伤效力。另外，用加入MF59佐剂的含有’321’嵌合物的组合获得的抗血清杀伤力更强。

总的说，这些预临床数据表明，肺炎球菌多肽抗原和流感病毒抗原的组合可提供针对下呼吸道感染的有效免疫策略。使用水包油乳液佐剂提高效力指示此方法对于6个月以下的婴儿中特别有用[165]。

应理解，仅以举例的方式描述了本发明，可对之进行修改而仍在本发明的范围和精神内。

参考文献：

[1]Hilleman等.(1981)Rev Infect Dis 3 增刊：S31-42

[2]McCue(1981)J Fam Pract.13(2)：175-7.

[3]Honkanen(1996)Arch Intern Med.156(2)：205-8.

[4]US-2009/0208523.

[5]WO00/62801.

[6]WO00/35481.

[7]Talaat等(2001)Vaccine 20：538-44.

[8]WO02/28422.

[9]WO02/067983.

[10]WO02/074336.

[11]WO02/21151.

[12]WO02/091998.

[13]WO2005/113756.

[14]Huckriede等(2003)Methods Enzymol 373：74-91.

[15]WO96/37624.

[16]WO98/46262.

[17]WO98/18861.

[18]GenBank序列GI：325176.

[19]WO02/22992.

[20]Hehme等，(2004)Virus Res.103(1-2)：163-71.

[21]Treanor等，(1996)J Infect Dis 173(1467).

[22]Keitel等，(1996)Clin Diagn Lab Immunol 3：507-10

[23]Gambaryan和Matrosovich(1992)J Virol Methods 39(1-2)：111-23.

[24]Mastrosovich等(1999)J virol 73：1146-55.

[25]Altschul等，(2006)J.Biol.Chem.355：1143-2561。

[26]Couceiro & Baum(1994)Mem Inst Oswaldo Cruz 89(4)：587-91

[27]Kistner等，(1998)Vaccine 16：960-8.

[28]Kistner等，(1999)Dev Biol Stand 98：101-110.

[29]Bruhl等，(2000)Vaccine 19：1149-58.

[30]Pau等，(2001)Vaccine 19：2716-21.

[31]http://www.atcc.org/

[32]http://locus.umdnj.edu/

[33]WO03/076601

[34]WO2005/042728.

[35]WO03/043415.

[36]WO01/85938.

[37]WO2006/108846.

[38]WO97/37000.

[39]Brands等，(1999)Dev Biol Stand 98：93-100.

[40]Halperin等，(2002)Vaccine 20：1240-7

[41]Tree等，(2001)Vaccine 19：3444-50.

[42]EP-A-1260581(WO01/64846).

[43]WO2006/071563.

[44]WO2005/113758.

[45]WO97/37001.

[46]WO2006/027698.

[47]EP B 0870508.

[48]US 5948410

[49]Lundblad(2001)Biotechnology and Applied Biochemistry 34：195-197.

[50]Guidance for Industry：Bioanalytical Method Validation(《工业指南：生物统计学方法认证》)美国健康和人类服务部食品药品管理局，兽医(CVM)药物评估和研究(CDER)中心，2001年5月

[51]Ji等，(2002)Biotechniques.32：1162-7.

[52]Briggs(1991)J Parenter Sci Technol 45：7-12.

[53]Lahijani等，(1998)Hum Gene Ther.9：1173-80.

[54]Loksteff等，(2001)Biologicals.29：123-32.

[55]Hoffmann等，(2002)Vaccine 20：3165-3170.

[56]Subbarao等，(2003)Virology 305：192-200.

[57]Liu等，(2003)Virology 314：580-590.

[58]Ozaki等，(2004)J Virol 78：1851-1857.

[59]Webby等，(2004)Lancet 363：1099-1103.

[60]WO00/60050.

[61]WO01/04333.

[62]US 6649372.

[63]Neumann等，(2005)Proc Natl Acad Sci USA 102：16825-9

[64]WO01/83794.

[65]Hoffmann等，(2000)Virology 267(2)：310-7.

[66]Kuo等，(1995)Infect Immun 63：2706-13.

[67]Michon等，(1998)Vaccine 16：1732-41.

[68]WO02/091998.

[69]Research Disclosure(《研究披露》)，453077(2002年1月)

[70]EP-A-0372501.

[71]EP-A-0378881.

[72]EP-A 0427347.

[73]WO93/17712

[74]WO94/03208.

[75]WO98/58668.

[76]EP A 0471177.

[77]WO91/01146

[78]Falugi等，(2001)Eur J Immunol 31：3816-3824.

[79]Baraldo等(2004)Infect Immun 72(8)：4884-7.

[80]EP-A-0594610.

[81]Ruan等，(1990)J Immunol 145：3379-3384.

[82]WO00/56360.

[83]WO01/72337.

[84]WO00/61761.

[85]WO00/33882.

[86]WO2007/071707

[87]WO98/42130.

[88]美国专利4,761,283.

[89]美国专利4,356,170.

[90]美国专利4,882,317.

[91]美国专利4,695,624.

[92]Mol.Immunol.，1985，22，907-919

[93]EP-A-0208375

[94]Bethell G.S.等，J.Biol.Chem.，1979，254，2572-4

[95]Hearn M.T.W.，J.Chromatogr.，1981，218，509-18

[96]WO00/10599.

[97]Gever等，Med.Microbiol.Immunol，165：171-288(1979).

[98]美国专利4,057,685.

[99]美国专利4,673,574；4,761,283；4,808,700.

[100]美国专利4,459,286.

[101]美国专利4,965,338.

[102]美国专利4,663,160.

[103]WO2007/000343.

[104]Hoskins等，(2001)J.Bacteriol.183：5709-5717.

[105]WO2004/092209.

[106]Kirkham等(2006)Infect Immun 74(1)：586-93.

[107]WO2005/108580.

[108]Berry等(1999)Infect Immun 67(2)：981-5.

[109]US6716432.

[110]WO90/06951

[111]WO99/03884.

[112]Baba等，(2002)Infect Immun 70：107-113.

[113]US-7217791

[114]WO2008/061953

[115]WO01/12219.

[116]Cao等，(2007)Vaccine 17：29514996.

[117]WO2005/063283

[118]W02003/104272.

[119]WO00/37105.

[120]Adamou等(2001)Infect Immun.69(2)：949-58.

[121]Ogunniyi等(2007)Infect Immun.75(1)：350-7.

[122]WO98/18930.

[123]WO02/22168.

[124]Wizemann等(2001)Infect Immun.69(1593)：-8

[125]WO99/53940.

[126]WO02/22167.

[127]WO02/08426.

[128]Briles等(2000)J Infect Dis 182：1694-8.

[129]Talkington等，(1996)Microb Pathog.21(1)：17-22.

[130]WO00/76540.

[131]Bethe等，(2001)FEMS Microbiol Lett.205(1)：99-104.

[132]WO01/81380.

[133]Brown等(2001)Infect Immun 69：6702-6.

[134]Whalan等，(2005)FEMS Immunol Med Microbiol 43：73-80

[135]Jomaa等(2006)Vaccine 24(24)：5133-9

[136]WO00/06738.

[137]Barocchi等(2006)PNAS USA 103：2857

[138]Bagnoli等，(2008)J Bacteriol 190(15)：5480-92.

[139]WO2007/116322.

[140]LeMieux等(2006)Infect Immun 74：2453-6.

[141]WO2005/007189

[142]WO2006/018527

[143]WO2005/110627.

[144]Langley等(2009)Vaccine doi：10.1016/j.vaccine.2009.09.130

[145]WO2009/055491

[146]Schickli等，(2009)Hum Vaccin.2009年9月28；5(9)

[147]WO2008/084072.

[148]WO2008/020335.

[149]WO2005/152448.

[150]WO2009/101403.

[151]Edwards(2008)Hum Vaccin.4(6)：444-8

[152]WO2008/061953

[153]WO96/14837.

[154]Podda & Del Giudice(2003)Expert Rev Vaccines 2：197-203

[155]Podda(2001)Vaccine 19：2673-2680.

[156]Vaccine Design：The Subunit and Adjuvant Approach(《疫苗设计：亚基和佐剂法》，Powell和Newman编)普莱努出版社(Plenum Press)1995(ISBN0-306-44867-X).

[157]Vaccine Adjuvants：Preparation Methods and Research Protocols(《疫苗佐剂：制备方法和研究方案》)(Volume 42 of Methods in Molecular Medicine series)(《分子医学方法丛书》第42卷))ISBN：1-59259-083-7.0’Hagan编

[158]Allison & Byars(1992)Res Immunol 143：519-25.

[159]Hariharan等，(1995)Cancer Res 55：3486-9.

[160]US 2007/014805.

[161]WO95/11700.

[162]美国专利6,080,725.

[163]WO2006/113373.

[164]WO2005/097181.

[165]Vesikari等，(2009)Pediatr Infect Dis J 28：563-71.

[166]US 5,057,540

[167]WO96/33739.

[168]EP A 0109942.

[169]WO96/11711.

[170]WO00/07621

[171]Barr等，(1998)Advanced Drug Delivery Reviews 32：247 271

[172]Sjolanderet等，(1998)Advanced Drug Delivery Reviews 32：321，338

[173]EP A 0689454.

[174]Johnson等，(1999)Bioorg Med Chem Lett 9：2273-2278。

[175]Evans等(2003)Expert Rev Vaccines 2：295-229.

[176]Meraldi等(2003)Vaccine 21：2485-2491.

[177]Pajak等(2003)Vaccine 21：836-842.

[178]Kandimalla等，(2003)Nucleic Acids Research 31：2393-2400.

[179]WO02/26757.

[180]WO99/62923.

[181]Krieg(2003)Nature Medicine 9：831-835.

[182]McCluskie等，(2002)FEMS Immunology and Medical Microbiology32：179-185.

[183]WO98/40100.

[184]US 6,207,646

[185]US 6,239,116

[186]US 6,429,199

[187]Kandimalla等，(2003)Biochemical Society Transactions 31(第3部分)：654-658.

[188]Blackwell等(2003)J Immunol 170：4061-4068.

[189]Krieg(2002)Trends Immunol 23：64-65.

[190]WO01/95935.

[191]Kandimalla等，(2003)BBRC 306：948-953

[192]Bhagat等，(2003)BBRC 300：853-861

[193]WO03/035836.

[194]Schellack等(2006)Vaccine 20：5361-72.

[195]Lingnau等(2007)Expert Rev Vaccines 2：295-6.

[196]WO2004/084938.

[197]WO95/17211.

[198]WO98/42375.

[199]Beignon等(2002)Infect Immun 70：3012-3019.

[200]Pizza等，(2001)Vaccine 19：2534-2541.

[201]Pizza等，(2000)Int JMed Microbiol 290：455-461

[202]Scharton-Kersten等(2000)Infect Immun 68：5306-5313.

[203]Ryan等(1999)Infect Immun 67：6270-6280.

[204]Partidos等，(1999)Immunol Lett 67：209-216.

[205]Peppoloni等(2003)Expert Rev Vaccines 2：295-293.

[206]Pizza等，(2002)Vaccine 85：263-270.

[207]Tebbey等(2000)Vaccine 18：2723-34

[208]Domenighini等，(1995)Mol Microbiol 15：1165-1167.

[209]WO99/40936.

[210]WO99/44636.

[211]Singh等(2001)J Cont Release 70：267-276.

[212]WO99/27960.

[213]US 6,090,406

[214]US 5,916,588

[215]EP A 0626169.

[216]Stanley(2002)Clin Exp Dermatol 27：571-577.

[217]Jones(2003)Curr Opin Investig Drugs 4：214-218.

[218]WO99/11241.

[219]WO94/00153.

[220]WO98/57659.

[221]欧洲专利申请0835318，0735898和0761231

[222]Zwijnenburg等(2001)J Infect Dis 183：1143-8.

[223]Bodanszky(1993)Principles of Peptide Synthesis(《肽合成原理》)(ISBN：0387564314).

[224]Fields等，(1997)Meth Enzymol 289：Solid-Phase Peptide Synthesis(《固相肽合成》)ISBN：0121821900.

[225]Chan & White(2000)Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis(《Fmoc固相肽合成》).ISBN：0199637245.

[226]Kullmann(1987)Enzymatic Peptide Synthesis(《酶多肽合成》).ISBN：0849368413.

[227]Ibba(1996)Biotechnol Genet Eng Rev 13：197-216.

[228]Gennaro(2000)Remington：The Science and Practice of Pharmacy(《雷明顿：药物科学和实践》)，第20版，ISBN：0683306472.

[229]Methods In Enzymology(《酶学方法》，S.Colowick和N.Kaplan编，学术出版社(Academic Press，Inc.))

[230]Handbook of Experimental Immunology(《实验免疫学手册》)，卷I-IV(D.M.Weir和C.C.Blackwell编，1986，布莱克威尔科学出版公司(BlackwellScientific Publications))

[231]Sambrook等，(2001)Molecular Cloning：A Laboratory Manual(《分子克隆：实验室手册》)，第3版，(冷泉湾实验室出版社(Cold Spring Harbor LaboratoryPress))。

[232]Handbook of Surface and Colloidal Chemistry(《表面和胶体化学手册》，Birdi，K.S.编，CRC出版社(CRC Press)，1997)

[233]Ausubel等，(编)(2002)Short protocols in molecular biology(《精编分子生物学实验指南》)，第5版(Current Protocols《实验室指南》)

[234]Molecular Biology Techniques：An Intensive Laboratory Course(《分子生物学技术：强化实验室课程》，Ream等编，1998，学术出版社)

[235]PCR(Introduction to Biotechniques Series)(《PCR(生物技术入门系列)，第2版(Newton和Graham编，1997，施普林格出版公司(Springer Verlag))

[236]Geysen等(1984)PNAS USA 81：3998

[237]Carter(1994)Methods Mol Biol 36：207-23.

[238]Jameson，BA等1988，CABIOS 4(1)：181-186.

[239]Raddrizzani & Hammer(2000)Brief Bioinform 1(2)：179-89

[240]Bublil等，(2007)Proteins 68(1)：294-304.

[241]De Lalla等(1999)J Virol 163：1725-29

[242]Kwok等，(2001)Trends Immunol 22：583-88.

[243]Brusic等，(1998)Bioinformatics 14(2)：121-30

[244]Meister等，(1995)Vaccine 13(6)：581-91.

[245]Roberts等，(1996)AIDS Res Hum Retroviruses 12(7)：593-610.

[246]Maksyutov & Zagrebelnaya(1993)Comput Appl Biosci 9(3)：291-7.

[247]Feller & de la Cruz(1991)Nature 349(6311)：720-1.

[248]Hopp(1993)Peptide Research 6：183-190.

[249]Welling等，(1995)FEBS Lett.188：215-218.

[250]Davenport等，(1995)Immunogenetics 42：392-297.

[251]Tsurui & Takahashi(2007)J Pharmacol Sci.105(4)：299-316.

[252]Tong等，(2007)Brief Bioinform.8(2)：96-108.

[253]Schirle等，(2001)J Immunol Methods.257(1-2)：1-16.

[254]Chen等，(2007)Amino Acids 33(3)：423-8.

[255]Current Protocols in Molecular Biology(《精编分子生物学实验指南》，F.M.Ausubel等编，1987)增刊30

[256]Smith & Waterman(1981)Adv.Appl.Math.2：482-489

Claims (15)

1.一种免疫原性组合物，包含(a)流感病毒免疫原和肺炎球菌免疫原，(b)RSV免疫原和肺炎球菌免疫原，或(c)流感病毒免疫原、RSV免疫原和肺炎球菌免疫原，其中肺炎球菌免疫原含有至少一种肺炎球菌多肽。

2.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述组合物包括佐剂。

3.如权利要求2所述的组合物，其特征在于，所述佐剂包括水包油乳液。

4.如前述权利要求中任一项所述的组合物，其特征在于，所述组合物包括B型链球菌免疫原。

5.如前述权利要求中任一项所述的组合物，其特征在于，所述组合物具有0.5ml的单位剂量体积。

6.如前述权利要求中任一项所述的组合物，其特征在于，所述流感病毒免疫原包含来自H1N1甲型流感病毒、H3N2甲型流感病毒、B/Victoria/2/87样乙型流感病毒和B/Yamagata/16/88样乙型流感病毒的血凝素。

7.一种制备权利要求1所述的免疫原性组合物的方法，所述方法包括步骤：混合流感病毒免疫原、肺炎球菌免疫原和/或RSV免疫原中的两种或多种，其中肺炎球菌免疫原包含肺炎球菌多肽。

8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述方法包括混合GBS免疫原的步骤。

9.如权利要求7或8所述的方法，其特征在于，所述方法提供单位剂量体积为0.5ml的组合物。

10.一种药盒，所述药盒包含(i)含有流感病毒免疫原的第一药盒组分，和(ii)含有肺炎球菌免疫原的第二药盒组分，其中肺炎球菌免疫原包含至少一种肺炎球菌多肽。

11.如权利要求10所述的药盒，其特征在于，第二药盒组分是以干燥形式。

12.如权利要求10或11所述的药盒，其特征在于，第一药盒组分包括佐剂。

13.如前述权利要求中任一项所述的组合物或方法或药盒，其特征在于，所述流感病毒免疫原是裂解病毒疫苗或纯化的流感病毒表面抗原疫苗，包含来自两种甲型流感病毒株(H1N1和H3N2)和一种乙型流感毒株的血凝素。

14.如前述权利要求中任一项所述的组合物或方法或药盒，其特征在于，所述肺炎球菌免疫原包含：(a)第一氨基酸序列，所含氨基酸序列(i)与SEQ ID NO：1具有至少75％的序列相同性和/或(ii)由SEQ ID NO：1的至少7个连续氨基酸的片段组成；(b)第二氨基酸序列，所含氨基酸序列(i)与SEQ ID NO：2具有至少75％的序列相同性和/或(ii)由SEQ ID NO：2的至少7个连续氨基酸的片段组成；和(c)第三氨基酸序列，所含氨基酸序列(i)与SEQ ID NO：3具有至少75％的序列相同性和/或(ii)由SEQ ID NO：3的至少7个连续氨基酸的片段组成。

15.一种在哺乳动物中引起免疫反应的方法，所述方法包括步骤：(a)对哺乳动物施用有效量的权利要求1-6中任一项所述的免疫原性组合物，或(b)混合权利要求10-12中任一项所述药盒的第一和第二组分，并对哺乳动物施用单位剂量的混合内容物。

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