KR100619350B1

KR100619350B1 - 변형 면역성 뉴멀리신 백신조성물

Info

Publication number: KR100619350B1
Application number: KR1020007000844A
Authority: KR
Inventors: 콘체이카오 미네티; 프랜시스 미숑; 제프리케이. 풀렌; 메리엘렌 폴비노-보드나르; 슈-메이 리양; 조제프 와이. 타이
Original assignee: 박스터 헬쓰케어 에스.에이.
Priority date: 1997-07-21
Filing date: 1998-07-21
Publication date: 2006-09-05
Also published as: EP0998557A2; CA2297374A1; JP2001510031A; US20010014332A1; US20050070695A1; HUP0002475A3; WO1999003884A2; US6764686B2; NO20000257L; KR20010022271A; NO20000257D0; AU740956B2; HUP0002475A2; WO1999003884A3; AU8407898A

Abstract

본 발명은 뉴멀리신의 면역원성 성질을 보유하는 한편 천연 뉴멀리신과 비교하여 용혈활성이 검출되지않을 정도로 작거나 감소된 변형 뉴멀리신 폴리펩티드에 관계한다. 또한 본 발명은 이러한 원하는 특성을 지닌 새로운 뉴멀리신 변형체를 생성하는 방법에도 관계한다. 그밖에 또한 본 발명은 무독성, 변형 뉴멀리신이 스트렙토코쿠스 뉴모니아에 대한 예방면역성을 자극하는 백신을 포함한 약제학적 조성물로서 유용한 면역성 조성물을 제공한다. 백신은 박테리아성 다당류에 변형 뉴멀리신이 결합된 조성물이거나 혹은 약화된 바이러스성 벡터에 포함된 것일 수 있다. 그밖에도, 본 발명은 또한 무독성, 변형 뉴멀리신 유독소를 사용하여 치료대상자에서 스트렙토코쿠스 뉴모니아에 대한 항체를 자극시키고 그후 이것을 분리하여 2차대상자에게 전달하여 결국 2차대상자에서 스트렙토코쿠스 뉴모니아 예방효과를 제공하는 방법에도 관계한다.

Description

변형 면역성 뉴멀리신 백신조성물{MODIFIED IMMUNOGENIC PNEUMOLYSIN COMPOSITIONS AS VACCINES}

본 발명은 백신 더 구체적으로, 뉴멀리신 변형체의 제조방법 및 이것을 스트렙토코쿠스 뉴모니아(Streptococcus pneumoniae)를 포함한 세균에 의해 유발된 감염에 대한 포유동물의 면역화를 위한 조성물의 제조에 사용하는 것에 관련된다.

스트렙토코쿠스 뉴모니아는 세균성폐렴, 균혈증, 뇌막염 및 중이염의 주요 원인균인 것으로 알려졌다 (Baltimore et al. in Bacterial infections of humans: Epidemiology and control Evans and Brachman eds., Plenum Press, New York, 1989 pp.525-546; Schuchat et al. N. Engl. J. Med. 1997, 337, 970-976). 적절한 항생제요법을 이용해도 폐렴성감염으로 미국에서 매년 40,000여명정도가 사망하는 것으로 추산되었다 (Fedson et al. Archives of Internal Medicine 1994, 154, 2531-2535; Fiebach et al. Archives of Internal Medicine 1994, 154, 2545-2557). 덧붙여서, 폐렴구균은 페니실린 및 기타 항생제에 대한 내성이 증가하여, 폐렴감염을 예방할 효과적인 백신의 개발이 공공보건에 중대한 문제가 되고 있다 (Farr et al. Archives of Internal Medicine 1995, 155, 2336-2340). 현재 23가 페렴구균 캡슐형 다당류 백신은 2세미만 유아에게는 무효하므로 (Douglas et al. J Infect Dis 1983, 148, 131-137; Leinonen et al. Pediatric Infectious Disease Journal 1986, 5,39-44), 이 연령층에서 주로 나타나는 중이염을 예방하기 위해 다수 그룹에서 다가성 결합백신이 개발되고 있다.

뉴멀리신(PLY)은 술피드릴활성 세포용해독소로서 모든 종류의 스트렙토코쿠스 뉴모니아로부터 생성되며 (Kanclerski et al., J Clin Microbiol 1987, 25, 222-225) 페렴 감염의 주요 발병인자로 밝혀졌다 (Boulnois Journal of General Microbiology 1992, 138, 249-259). S. pneumoniae의 유전조작된 PLY-음성 돌연변이균주는 생쥐실험에서 발병력이 훨씬 떨어지는 것으로 나타났다 (Berry et al. Microb Pathog 1992, 12, 87-93; Berry et al. Infection and Immunity 1989, 57, 2037-2042). 폐동맥 내피 및 외피세포에 대한 PLY 의 세포독성은 체외실험으로 충분히 확인되었다 (Rubins et al. Infection and Immunity 1992, 60, 1740-1746). 또한 PLY 는 폐렴구균 수막염의 기니아픽 모델에서 청각손실 및 와우관손상의 주요 원인이 될 수 있는 것으로 밝혀졌다 (Winter et al. Infection and Immunity 1997, 65, 4411-4418).

1985년부터 개발도상국에서는 매년 5세미만의 아동 중 5백만여명이 S. pneumoniae 로 인한 폐렴으로 사망했다 (Lancet, 1985, Sep 28 2(8457):699-701). S.pneumoniae 는 다수의 발병인자를 통해 초기감염을 일으키고 이것을 위험한 질병으로 발전시킨다. 다양한 혈청타입 S.pneumoniae로 인한 전신 감염을 예방하기위해 유아 및 성인은 안전하고 효과적이며 장기적인 면역성을 일으킬 수 있는, 적절한 교차반응성 백신을 이용하여 면역성을 부여할 필요가 있다.

아동의 폐렴구균 증식 및 감염에 관한 연구에서, 폐렴구균 혈청타입 6, 14, 19 및 23이 가장 많이 또한 가장 빈번하게 유아의 감염 특히 중이염의 감염을 일으키는 것으로 보고되었다 (Gray et al. J. Infect. Dis. 1988. 158. 948-955). 덧붙여서, 최근에는 이들 동일한 균주가 페니실린 내성의 임상분리물 중에 가장 자주 등장하고 있는 것으로 발견되었다 (Nesin et al. J. Infect. Dis., 1998, 177, 707-713). 상술한 혈청타입을 포함한 4가 폐렴구균 결합백신을 맞은 영유아를 상대로한 임상연구에서 백신관련 균주의 보유가 감소하는 것을 확인하였다. (Dagan et al. Infect. Dis. J. 1997, 16, 1060-1064).

거의 모든 S.pneumoniae의 분리물이 올리고당의 반복으로된 외부캡슐을 나타낸다. 다양한 당류순열로 인한 캡슐형 다당류내 항원차이는 다양한 S.pneumoniae 혈청타입을 표시하는 홀마크이다. 혈청타입 특이적 캡슐형 다당류는 폐렴구균의 발병에 대한 주요기여자이다. 기존의 항폐렴구균 백신은 현재 확인된 84개의 혈청학적 유별형 중에서 선택된 23개의 캡슐형 다당류로 조제된다. 불행히도, 이들 백신은 모든 사람들 특히 아시아인들에게는 큰 효과가 없다. 기존백신의 두번째 단점은 다당류 자체가 특히 영유아 및 노령층에 있어서 면역성이 적다는 점이다.

S.pneumoniae에 의해 발현된 폴리펩티드는 특히 중요한 병원체 역할을 한다. 이 개체의 발병에 영향을 미치는 폴리펩티드로는 뉴멀리신, 오토리신, 뉴라미니다제, 페렴구균 표면 폴리펩티드A(PspA), 37kDa 폴리펩티드, 접착분자, 히알루로니다제, 또한 IgA1 프로테아제 등이 있다.

실제로, 모든 혈청타입 S.pneumoniae는 주요 발병인자중 하나인 뉴멀리신을 생성한다. 각종 S.pneumoniae 혈청타입에 의한 발현 때문에 독성변화가 가능하다는 전제하에서 뉴멀리신은 폐렴구균 감염에 대한 예방백신에 사용할 수 있는 기본대상이 된다.

뉴멀리신은 분자량 약 53kD의 세포내 세균성 폴리펩티드이다 (Kanclerski et al. 1987 J.Clin.Microbiol. 25:222-225). 이것은 티올활성 헤몰리신종의 하나이며 진핵세포에 다양한 영향을 미친다. 뉴멀리신은 진핵세포막의 콜레스테롤분자에 결합하여 올리고머를 형성하고, 또한 막통과공을 생성하는 것으로 알려졌다. 또한 호흡폭발, 화학주성 및 다형핵백혈구의 식균기능 모두가 침입성 폐렴구균을 제거하는데 중요한 것이며 뉴멀리신의 존재하에 크게 줄어드는 것으로 나타났다.

뉴멀리신은 세포용해 및 세포독성 영향을 모두 유발하며 보체 활성경로에 의해 염증반응을 자극할 수 있다. 보체에 의한 비특이적 활성화는 보체 폴리펩티드상실을 유발하고 또한 비특이적염증을 일으킨다. 실험동물의 폐속에 뉴멀리신을 접종하면 폐렴과 유사한 증세가 나타난다. 그러나, 뉴멀리신에 의한 사전-면역화는 폐렴구균 접종 시 실험동물에 대해 보호성을 갖는다 (Paton et al.(1983) Infect. Immun. 40:548-552)

뉴멀리신에의해 면역된 개체의 예방반응을 유도하기 위한 면역활성 및 능력 때문에, 백신의 한 성분으로서 뉴멀리신을 사용하는 것을 제안하였다 (PCT/AU89/00539). 그러나, 뉴멀리신을 인체용백신에 포함시키기전에 이 독소를 변형시켜 보호 항체를 생산하는 능력을 유지하면서 실질적으로 무독성화시켜야 한다.

독성활성이 없어진 변형 뉴멀리신은 관련 티올함유 폴리펩티드와 유사한 기능을 갖는 것으로 생각되는 뉴멀리신의 아미노산부위 확인에 기초하여 발생한 것으로 보고되었다 (WO 90/06951). 보고된 돌연변이는 폴리펩티드의 C-말단부에만 나타나며 표적화 돌연변이기술을 이용해서 생성되었다. N-말단부위의 특이아미노산을 포함하는 다른 돌연변이가 용혈활성을 감소시키는 것으로 보고되었다. 용혈활성의 가장 상당한 감소는 위치156에서 히스티딘 변형 결과일 수 있는 것으로 나타났다 (Hill et al. (1994), Infection and Immunity, 62, 757-758). 치환된 뉴멀리신이 적절히 리폴드되었는지를 알 수 있는 데이터는 없다. 단일 돌연변이 Thr-172→Ile 가 용혈활성이 감소된 뉴멀리신에 관여될 수 있는 것으로 보고되었다. 그러나, 변칙적인 전기이동성 결과 단백질이 부적절하게 폴드되어 있음이 나타났다 (Lock et al. Microb. Pathog. (1996)21, 71-83).

본 발명은 무작위 PCR 돌연변이화를 이용한 안정한 유전변형의 실질적으로 비독성인 면역뉴멀리신 폴리펩티드를 생성 및 동정하는 새로운 방법을 제공한다. 백신의 면역원으로 사용되거나 혹은 S. pneumoniae나 기타 세균감염에 대한 다당류 결합백신을 위한 면역담체 폴리펩티드로 사용될 수 있는 변형 뉴멀리신(뉴멀리소이드)도 역시 제공된다. 이 발명의 변형 뉴멀리신 폴리펩티드는 독소의 독성작용이 없거나 크게 감소되고 천연독소에 의해 유도된 물질과 교차반응하는 항체를 유도한다.

본 발명은 또한 변형 뉴멀리신 코딩핵산 서열, 이들을 함유한 벡터, 또한 본 발명의 핵산 분자를 발현할 수 있는 형질전환 숙주세포에도 관계한다.

본 발명의 또다른 구현은 변형 뉴멀리신이 세균다당류와 공유결합하여 결합체를 형성하는 다당류-폴리펩티드 결합분자이다. 이러한 결합분자는 변형 뉴멀리신에 결합된 세균성 다당류에 대항할 T 세포 의존성 면역반응을 유도할 면역원으로 유용하다.

본 발명은 다시또 면역반응을 유도할 본 발명의 변형 뉴멀리신 폴리펩티드를 함유하는 약제학적 조성물에 관계한다.

또한 변형 뉴멀리신 폴리펩티드에 대한 반응성 항체의 생성을 유도하는 방법에도 관계한다. 이러한 항체는 능동 및 수동면역성을 모두 유도할 수 있다. 본 발명의 변형 뉴멀리신은 또한 반응성항체의 발견 및 분리에도 관계한다.

따라서 본 발명의 한가지 목적은 천연독소분자에 결합하는 항체의 생성요인이 되는 에피토프(항원결정기)를 보유하는 한편 독성이 크게 감소하거나 없는 유전적으로 안정한 변형 S.pneumoniae 뉴멀리신 폴리펩티드를 제공하는 것이다.

또다른 목적은 유전변형 뉴멀리신(뉴멀리소이드)의 생성방법을 제공하는 것이다.

또한 민감한 동물에 전달되는 경우 S. pneumoniae에 대한 예방면역을 유도하고 또한 항체를 유발할 수 있는 변형 뉴멀리신 폴리펩티드를 포함하는 백신조제물을 제공하는 것도 본 발명의 또다른 목적이다. 이러한 백신은 뉴멀리소이드 자체에 기초하거나 혹은 본 발명의 변형 뉴멀리신 폴리펩티드에 공유결합된 하나 이상의 세균성 다당류를 포함하는 결합체에 기초한다.

도 1은 [서열 1]에 기재된 제14형 뉴멀리신의 야생형 핵산 서열을 보여준다.

도 2는 [서열 2]에 기재된 제14형 뉴멀리신의 비제한적인 핵산변형체를 보여준다. 용혈활성을 경감시키는 핵산 치환의 예가 뒤따르는 잔기 위치는 하기이다; 181,C; 443,A; 583,A 또는 G. 또한 용혈활성을 경감시키는 것으로 나타나지않은 핵산 치환의 예가 뒤따르는 잔기 위치는 하기이다; 50,G; 54,T; 98,C; 122,G; 134,C; 137,C; 187,T; 196,T; 248,C; 276,C; 302,C; 305,G; 351,T; 380,A; 382,C; 459,C; 514,G; 558,C; 566,G; 717,A; 764,G; 770,G; 1038,T; 1138,A; 1212,A; 1296,T; 1386,G; 1395,A.

도 3은 [서열 3]에 기재된 제14형 뉴멀리신의 아미노산 서열을 보여준다.

도 4는 [서열 4]에 기재된 제14형 뉴멀리신의 비제한적인 아미노산변형체를 보여준다. 용혈활성을 경감시키는 아미노산 치환의 예가 뒤따르는 잔기 위치는 하기이다; 61,Pro; 148,Lys; 195,Ile 또는 Val; 243, Arg, Val, Glu 또는 Ser; 286,Asp; 446,Ser. 또한 용혈활성을 경감시키는 것으로 나타나지않은 아미노산 치환의 예가 뒤따르는 잔기 위치는 하기이다; 17,Arg; 18,Asn; 33,Thr; 41,Gly; 45,Ala; 46,Thr; 63,Ser; 66,Tyr; 83,Ser; 101,Thr; 102,Gly; 127,Glu; 128,His; 153,Met; 172,Ala; 189,Arg; 239,Arg; 255,Gly; 257,Gly.

도 5는 야생형 뉴멀리신 핵산 서열을 함유한 플라스미드pNV-19의 지도이다. pNV 시리즈의 플라스미드는 변형 뉴멀리신 핵산 서열로 복제하여 pET-24a로부터 유도된 것이다.

도 6은 특이변형 뉴멀리신 폴리펩티드 pNVJ1, pNVJ45, pNVJ20, pNVJ22, pNVJ56, pNV103, pNV207, pNV111, pNV211에서 핵산 및 아미노산 치환의 위치를 보여주는 다이어그램이다.

도 7은 IPTG 유도에 따른 재조합 뉴멀리신의 발현을 보여주는 SDS-PAGE이다.

도 8은 생쥐에 대한 1가 혹은 4가 폐렴구균 뉴멀리소이드 백신을 2회 주사한 후의 다당류-특이IgG의 다당류 약량반응의 비교결과를 보여준다.

도 9는 생쥐에 대한 뉴멀리소이드 혹은 파상풍유독소 담체에 각각 결합된 4가 페렴구균 백신을 2회 주사한 후의 다당류-특이IgG의 비교결과를 보여준다.

도 10은 생쥐에게 1가 및 4가 폐렴구균 다당류-뉴멀리신백신을 2회 주사한 후 유도된 뉴멀리소이드-특이IgG를 보여준다.

도 11은 생쥐에게 4가 폐렴구균 PS-뉴멀리소이드 및 PS-파상풍유독소 결합백신을 2회 주사한 후 유발된 다당류-특이옵소닌식세포활성을 보여준다.

도 12는 생쥐에게 1가 및 4가 페렴구균결합물을 3회 주사한 후 유발된 항용혈 뉴멀리소이드-특이활성을 보여준다.

도 13은 용혈억제작용을 분석한 결과를 보여준다. 해당 돌연변이체를 사전접종한 경우의 야생형 뉴멀리신의 용혈역가를 나타낸다. 그래프의 막대는 해당 돌연변이체로 사전처리된 적혈구에 대해 검사했을 때 야생형에 대한 최종 용혈역가를 나타낸다.

도 14는 가용성 야생형 PLY, (A) PLYD 돌연변이체 pNV207, 또한 (B) PLYD 돌연변이체 pNV103 를 이용하여 야생형 PLY에 대한 토끼의 다클론항체와 또한 야생형 PLY 단백질 간의 경합 억제 ELISA 연구결과를 보여준다.

도 15는 야생형 뉴멀리신 및 돌연변이체의 형광스펙트럼을 보여준다. 야생형 뉴멀리신 및 선별된 돌연변이체의 형광방출스펙트럼을 여기파장 290nm 및 단색측정기 슬릿 2nm을 갖는 10mM의 인산나트륨(pH 7.5)에서 기록하였다.

는 pNV207,

는 pNV111,

는 pNV211, +는 pNV103, 또한

는 야생형을 나타낸다.

도 16은 (A)가 돌연변이체 뉴멀리신 pNV207(상부표)과 제14형 CPS 결합돌연변이체 뉴멀리신 pNV207(하부표)의 먼거리UV CD 스펙트럼이고; (B)가 돌연변이체 뉴멀리신 pNV207(상부표)과 제14형 CPS 결합돌연변이체 뉴멀리신 pNV207(하부표)의 근거리UV CD 스펙트럼이다.

도 17은 (A)가 생쥐에 대한 4가 폐렴구균 뉴멀리소이드 pNV207 결합백신과 다당류-특이IgG반응의 시간에 따른 결과이고; (B)가 생쥐에 대한 4가 폐렴구균 TT 결합백신과 다당류-특이IgG반응의 시간에 따른 결과이며; (C)가 생쥐에 대한 1가 폐렴구균 뉴멀리소이드 pNV207 결합백신과 다당류-특이IgG반응의 시간에 따른 결과를 나타낸다.

뉴멀리신은 사실상 모든 공지된 S.pneumoniae 균주에서 발견된다. 이것은 광범위하게 분포되어 다양한 S.pneumoniae 혈청종류 간에 사실상 교차예방효과를 얻는 능력을 제공한다. 본 발명은 유독소 작용을 하고(뉴멀리소이드) 따라서 항체유도 및 S.pneumoniae 대항 백신에 사용하기에 유용한 유전변형 뉴멀리신 폴리펩티드를 제공한다. 변형 뉴멀리신을 코딩하는 핵산 서열, 벡터, 및 변형 뉴멀리신을 코딩하는 핵산을 포함하는 벡터에 의해 형질전환된 숙주세포 또한 본 발명을 구현한 실시형태이다.

적어도 하나의 아미노산이 치환된 본 발명의 변형 뉴멀리신 폴리펩티드는 면역성있고 야생형 뉴멀리신과 교차반응할 항체를 유발하기에 충분한 에피토프를 보유한다. 그밖에도, 상술한 변형 폴리펩티드의 독성이 크게 감소하여 심각한 부작용없이 포유동물에게 투여할 수 있게된다.

본 발명의 한 실시형태에 따르면, 다당류에 공유결합하여 결합체를 형성할 특이변형 뉴멀리신 폴리펩티드가 제공된다. 본 발명의 변형 뉴멀리신 폴리펩티드를 다양한 다당류에 결합시키면 광범위한 혈청학적 병원균에 대한 항체를 생성할 수 있는 조성물이 제공된다. 특정한 세균에서 캡슐형 다당류를 선택하면 본 발명에 따라 수막염구균, 폐렴구균, 헤모필루스 인플루엔자 b형 및 스트렙토코쿠스B군, 기타 다른 세균들에 대한 면역효과를 얻을 수 있다.

본 발명의 또다른 실시형태에서 뉴멀리신게놈의 유전변형은 무작위 돌연변이화 기술을 이용하여 실행된다.

A. 변형 뉴멀리신의 생성 및 동정 방법

본 발명의 유전변형된 뉴멀리신 폴리펩티드는 종래의 재조합방법에 따라 제조한다 (Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press and Ausubel et al. Eds., 1997, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc.). 뉴멀리신 폴리펩티드의 소수 변형물이 아미노산 및 핵산 서열의 높은 보존율을 나타낸다는 사실이 보고되었고 (Mitchell et al., 1990, Nucleic Acid Res. 18:4010) 본원에 참고로 도입되며, 이 기록에 따르면 뉴멀리신 제1형 S.pneumoniae의 위치153에 있는 이소로이신이 제2형에서는 메티오닌으로 치환된 것으로 나타났다. 또한 역시 위치153에 이소로이신을 갖춘 제14형의 경우 위치380에 아스파트산이 아닌 아스파라긴을 가지고 있다. 이러한 변형체는 적어도 하나의 에피토프가 보존된 변형 뉴멀리신을 제공하는 본 발명의 핵산 및 아미노산 조성물내에서 다른 치환 중에 포함되기도 한다.

본 발명에 있어서 야생형과 비교할 때 용혈반응이 감소되거나 없고 또한 천연 혹은 야생형 뉴멀리신과 교차반응할 항체를 생성할 다수의 에피토프를 보유하는 변형 뉴멀리신 폴리펩티드가 제공된다. 상기의 폴리펩티드는 1차로 무작위 돌연변이를 뉴멀리신 코딩유전자에 삽입하고 그후 발현된 폴리펩티드 생성물을 독성작용의 감소나 상실에 대하여 스크리닝처리하여 동정한다.

1. 뉴멀리신 변형방법

S.pneumoniae 감염의 면역화작용에 유리한 사실상 면역성이 있고 독성은 거의 없거나 전혀없는 뉴멀리신을 제조 및 동정하는 새로운 스크리닝시스템도 본 발명에 의해 제공된다.

이 방법은 다음 2가지 단계를 포함한다 : (1) 무작위 돌연변이화 단계 및 (2) 선별단계이다.

무작위 돌연변이화는 뉴멀리신속에 돌연변이를 도입하는 적절한 방법 중 하나이다. 표준 돌연변이화 방법이 여기에 적합하다. 한가지 실시형태에서, 무작위 PCR을 실행하여 무작위로 제14형 뉴멀리신유전체속에 뉴클레오티드변형물을 제공한다. 후속으로 선별단계를 통해 원하는 변형물을 동정한다. 이 방법은 임의의 개별 뉴멀리신 유전자에 응용가능하다. 바람직하게는, 올리고뉴클레오티드 프로브를 생성할 수 있는 충분한 크기의 핵산 서열이 동정된다. 비제한적인 뉴멀리신 유전자의 예로서 제2형 및 제14형 뉴멀리신 코딩유전자를 들 수 있다. 제14형을 코딩하는 뉴클레오티드 서열이 도1에 나와있다.

PCR 혹은 핵산증폭방법에 대하여는 미국특허 4,183,195, 4,965,188 및 5,176,995 등의 내용을 참조한다. 일반적으로, PCR 은 하나 이상의 특이핵산 서열을 증폭하는 방법이며 각 서열은 2개의 상보쇄로 구성된다. PCR은 각 사슬을 상보적 올리고뉴클레오티드 프라이머와 혼성화시켜야한다. 이 핵산은 하기의 프라이머를 이용하여 상보쇄를 합성하기위한 주형이다. 각 핵산사슬에 대해 상보적인 각 프라이머의 연장물이 그후 합성된다. 그후, 연장물을 주형으로부터 분리하여 단일쇄 분자를 형성한다. 마지막으로, 단일쇄 분자는 다시 두번째 단계에서 생성된 각 단일쇄 분자에 대해 연장물이 합성되는 조건하에서 첫단계의 프라이머로 처리한다. 이들 단계는 최초 핵산을 최적으로 증폭하여 생성물을 합성할 때까지 반복할 수 있다.

PCR 돌연변이반응은 "비정합" 뉴클레오티드를 성장중인 사슬에 삽입하는 것이 관여되며, 실수율이 큰 통상의 PCR 중합효소에 의해 촉진될 수 있다. 무작위 돌연변이를 일으키는 다른 공지방법으로서 화학적 돌연변이화 등을 이용할 수도 있다 (Eichenleub, R. 1979, J. Bacteriol. 138:559-566). 별도로, 돌연변이화 단계는, 하나 혹은 양쪽 프라이머가 무작위 뉴클레오티드열을 포함하지만 한편으로는 한쪽 또는 양쪽 프라이머의 일부가 상보적이어서 적어도 하나의 공지된 뉴멀리신서열에 "연결"되는 "준-무작위" 단계를 이용하는 PCR에 의해 달성되기도 한다.

여기서의 용어 "프라이머"는 정제된 제한소화물에서 자연발생되거나 합성되는 올리고뉴클레오티드로서 핵산사슬에 상보적인 프라이머 연장물의 합성을 유발시키는 조건하에 있을 때, 즉 적절한 온도 및 pH에서 DNA중합효소 등의 유도제와 뉴클레오티드의 존재하에서 핵산합성의 개시점으로 작용할 수 있다. 프라이머는 바람직하게 최대의 증폭효율을 위해 단일쇄화되며 또는 별도로 2중쇄화되기도 한다. 2중쇄화될 경우 프라이머는 증폭물을 제조하는데 이용되기전 1차로 사슬 분리처리된다. 바람직하게는, 프라이머가 올리고데옥시리보뉴클레오티드이며 유도제의 존재하에서 연장물의 합성을 개시할 수 있도록 충분히 길어야한다. 프라이머의 정확한 길이는 온도, 프라이머 기원 및 이용방법 등의 다양한 변수에 따라 달라진다. 프라이머는 통상 10개 혹은 그이상의 뉴클레오티드를 함유한다.

합성 올리고뉴클레오티드 프라이머는 예컨대, 인산3에스테르 및 인산2에스테르법 (Narang, S.A. et al., 1979, Meth. Enzymol. 68:90; Brown E.L., et al., 1979, Meth. Enzymol. 68:109) 혹은 이의 자동화 실시형태 등 적절한 방법을 이용하여 제조할 수 있다. 이 자동화 실시형태 중에서, 디에틸포스포라미디트를 출발물질로 사용하며 또한 공지방법 (Beaucauge et al., 1981, Tetrahedron Let. 22:1859-1962)대로 합성하기도 한다. 변형 고체 지지물 상에서 올리고뉴클레오티드를 합성하는 한가지 방법은 미국특허 4,458,066의 내용을 참조한다.

또한 생물학적인 기원으로부터 분리된 프라이머를 사용할 수도 있다. 이러한 한가지 예로서 뉴멀리신서열에 대해 혼성화되기 충분히 상보적인 뉴멀리신 코딩 대형 핵산 분자의 제한 엔도뉴클레아제 소화물이 있다. 뉴클레오티드 치환을 화학합성중에 프라이머속에 삽입하기도 한다

본 발명의 뉴클레오티드서열은 특별히 변형 뉴멀리신 폴리펩티드를 코딩하는 분자내의 단일돌연변이에 국한되지 않는다. 천연 뉴멀리신 폴리펩티드 (도2 참조) 의 면역성을 유지하면서, 다른 한편으로 하나 이상의 독성특징을 경감하거나 제거할 수 있다면 다중돌연변이 역시 가능하다. 따라서 다중변형이 단일 폴리펩티드분자에 속할 수 있다 (도4 참조). 다중변형은 독성 천연 서열로 역행하는 경향을 감소시킬 수 있으므로 유리하다. 그러나, 바람직한 본 발명의 실시형태는 단일 아미노산 치환을 생성할 핵산 서열내의 단일돌연변이이다.

변형 뉴멀리신을 코딩할 무작위 혹은 준-무작위 PCR 생성물은 공지된 표준클론화 기술에 의해 적절한 발현벡터속에서 클로닝된다.

한 실시형태에서, 벡터는 적어도 하나의 가능한 클로닝 위치, 최소 하나의 항체선별표시유전자, 전사 촉진자 (promoter) 및 복제 기원을 포함한다. 벡터는 다양한 융합숙주세포에서 증식하여 고도로 발현된다. 바람직한 숙주는 E.coli, B.subtilis 같은 세균이나 혹은 S.cerevisiae 등의 이스트를 포함한다. 포유동물의 세포 같이 이스트를 제외한 다른 진핵세포를 사용할 수도 있다. 클로닝 플라스미드벡터/숙주세포의 조합은 임의의 상용성 벡터와 숙주세포일 수 있다. 변형 뉴멀리신의 발현을 지원한다면 임의의 적절한 발현벡터와 숙주세포가 허용될 수 있다. 클로닝 및 발현을 위한 표준프로토콜을 공지된 바와 같이 사용할 수 있다 (Ausubel, F.M. et al., eds., 1997, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc.)

2. 변형 뉴멀리신의 스크리닝

변형 뉴멀리신 뉴클레오티드서열을 적절한 판독프레임내의 벡터에 결합시키고 이것을 숙주세포로 형질전환한 뒤, 독성이 없거나 감소한 변형 뉴멀리신 폴리펩티드를 발현하는 세포복제물을 동정하기위해 스크리닝처리한다.

무작위 돌연변이된 뉴멀리신 폴리펩티드를 발현하는 적절한 형질전환숙주를 동정하는 방법도 본 발명에서 제공한다. 바람직한 변형 뉴멀리신 폴리펩티드는 천연뉴멀리신과 비교할 때 크기등 구조적성질이 유사하다. 따라서, SDS-PAGE 및 겔투과형 크로마토그래피 같이 폴리펩티드의 크기를 분석하는 선별방법을 이용할 수 있다. 변형 뉴멀리신을 발현하는 형질전환숙주는 SDS-PAGE를 이용하여 숙주에 의해 발현되는 단백질을 분석하고 또한 동일한 벡터와 함께 형질전환되었으나 뉴멀리신 혹은 변형 뉴멀리신을 코딩할 핵산 서열은 함유하지않은 숙주 ("표준숙주")로부터 얻은 SDS-PAGE겔에 상기의 겔(크로마토그래피의 겔)을 비교하여 확인한다. 뉴멀리소이드 발현 형질전환숙주는 SDS-PAGE로 검사했을 때 새로운 띠를 형성하며 뉴멀리소이드에 상응하는 대형띠를 형성할 형질전환숙주가 대상체로 선별될 수 있다. 이들 클론으로부터 발현된 변형 뉴멀리신 폴리펩티드는 다시 세포추출물내 용혈활성에 대하여 스크리닝처리되면 용혈활성이 감소된 변형 뉴멀리신 폴리펩티드를 동정할 수 있다. 무변형 혹은 아직 독성이 있는 변형된 활성뉴멀리신을 생성할 형질전환숙주는 이 단순스크리닝 단계에서 제거될 수 있다.

또한 이와 별도로, 변형 뉴멀리신은 특별히 국한되지는 않으나, SDS-PAGE 및 그뒤의 전기블롯팅(electroblotting) 혹은 웨스턴블롯팅 분석법을 이용하거나, 전체세포추출물의 점 블롯팅 또는 가용성 분획의 제한된 단백분해법 등의 공지방법에 따라 확인될 수 있으며 다시 SDS-PAGE나 웨스턴블롯팅으로 소화물을 분석한다.

뉴멀리신 정제 및 분리방법을 선택할 때 고려하는 변수는 변형 뉴멀리신이 가용성 단백질 상태로 존재하거나 혹은 봉입체에서 불용화되는지의 여부를 포함한다. 비록 규정은 아니지만, 뉴멀리신의 폴드성질에 영향을 미치는 돌연변이는 봉입체에 축적되는 경향을 선호시킨다.

세포추출물의 가용성 분획내 동정되는 변형 뉴멀리신은 특별히 제한되지는 않으나 핵산침전법, 염분별법 혹은 이온교환 크로마토그래피 혹은 소수성 상호반응 크로마토그래피 등의 포획절차를 포함한 종래의 정제방법으로 분리 및 정제할 수 있다. 겔투과 크로마토그래피는 특히 상술한 크로마토그래피법 중 하나의 후속 가공단계로서 사용하기도한다. 이와 별도로, 재조합 변형 뉴멀리신은 친화성 크로마토그래피 혹은 티올함유 단백질 분리방법이나 당해분야의 기술자에게 알려진 기타의 공지방법으로 분리할 수 있다 (Current Protocols in Protein Science, 1995, John Wiley & Sons).

또한 별도로, 봉입체에서 유도된 변형 뉴멀리신은 핵산 및 기타 세균성세포벽 오염물 제거를 위해 봉입체를 수회 세척하여 분리하기도한다. 이 방법은 특별히 제한되지는 않으나 규정완충액 혹은 규정완충액과 세제첨가물을 써서 펠릿을 세척하는 것도 포함한다. 단백질은 세척된 봉입체를 요소나 구아니딘 HCl 용해후 겔여과 크로마토그래피 처리하여 변성조건하에서 정제할 수 있다. 이 방법은 단백질 재폴드처리전 시행할 수 있다. 그러나 재폴드 뒤 이온교환 크로마토그래피를 실행하면 재폴드처리 및 정제된 단백질을 최대수율로 수득할 수 있는 것으로 나타났다.

천연 뉴멀리신은 기준으로 이용하며 상술한 절차에 따라 수득할 수 있다. 천연 대응체의 용혈활성 및 이동이나 용출프로파일 등은 가용성 분획이나 봉입체 분획으로부터 변형 뉴멀리신의 분리를 위한 기준으로 사용할수 있다.

적절한 변형 뉴멀리신 폴리펩티드를 발현할 클론의 바람직한 선택기준은 (1) 변형 뉴멀리신 발현; (2) 전장 또는 거의 전장 발현(천연 뉴멀리신의 경우 약 53,000 분자량에 기초하여); (3) 가용성 분획 중의 뉴멀리소이드 존재; (4) 저용혈활성; 또한 (5) 고수율의 발현폴리펩티드 중 적어도 하나 이상을 포함한다.

스크리닝 프로토콜에 상술한 기준 전체가 포함되면 유용한 변형 뉴멀리신 폴리펩티드를 발현할 가장 효율적이고 바람직한 클론을 동정할 수 있으나, 비록 덜 효율적인 클론이라도 전장이 아닌 일부만 포함하지만 천연 뉴멀리신과 교차반응하는 항체의 생성을 유도하고 또한/또는 다당류 폴리펩티드 결합분자내에서 담체폴리펩티드 기능을 하기에 충분한 본 발명에 사용하기 적합한 변형 뉴멀리신을 생성할 수 있다.

상술한 바람직한 클론을 동정하기에 적절한 방법은 크기 및 용혈활성도를 포함한 발현단백질의 특성을 직접분석하는 것이나, 그밖에도 천연 뉴멀리신에 대한 항체와의 교차반응성 혹은 핵산프로브에 대한 혼성화 등을 검출하는 기타의 방법도 역시 사용될 수 있다. 한가지 실시형태에서, 변형 뉴멀리신 핵산 서열을 함유한 플라스미드와 함께 형질전환된 숙주세포 클론의 초기동정은 공지의 표준 혼성화 분석을 통해 실행될 수 있다. 변형 뉴멀리신 유전자의 프로브는 천연 뉴멀리신 핵산 서열이나 증폭프라이머 혹은 증폭된 서열의 존재를 가리키는 다른 프라이머를 포함한다. 바람직하게는, 상기한 혼성화 프로브는 30 내지 40개의 뉴클레오티드길이, 더 바람직하게는 10 내지 20개의 뉴클레오티드길이를 갖는다. 프로브는 변경된 염기를 함유하는 서열에 혼성화될 수 있어야 하므로, 엄격성은 비교적 낮아야 한다.

바람직한 혼성화 방법은 블롯 혼성화이다. (Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press). 프로브는 DNA 또는 RNA이며 쉽게 통용되고 당분야에 공지된 다양한 라벨링기술로 검출할 수 있다. 이러한 방법으로서 특별히 제한되지는 않으나 방사선라벨화, 디곡시게닌라벨화, 또한 비오틴라벨화 등이 있다. 널리 공지된 DNA라벨화 방법은 DNA중합효소, 클레노우효소 혹은 폴리뉴클레오티드 키나아제를 이용한 ³²P이다. 또한, 이외에도 화학성분을 피리미딘과 퓨린고리에 부착하는 방법 (Dale, R.N.K. et al., 1973, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 70:2238-42), 화학발광성에 의한 검출방법 (Barton, S.K. et al. 1992, J.Am. Chem. Soc. 114:8736-40), 또한 비오티닐화 핵산 프로브를 활용하는 방법 (Johnson, T.K. et al., 1983, Anal. Biochem. 133:125-131; Erickson, P.F. et al. 1982, J.Immunol. Methods 51:241-49; Matthaei, F.S. et al. 1986, Anal. Biochem. 157:123-28), 또한 시중제품을 이용한 형광성에 의한 검출방법 등을 포함하는 공지의 비방사성 신호증폭기술이 있다. 비방사성 라벨화기구 역시 시판하고 있다.

스크리닝기술은 저용혈활성에 대하여 공지방법에 따른 뉴멀리소이드발현 세포의 검사도 포함한다 (Bernheimer, A. 1988, Meth. Enzymol. 165:213-217). 마이크로분석법은 96-웰 U형 저면의 마이크로적정판에서 실행되며 상술한 바와 같이 측정했을 때 뉴멀리신(천연 혹은 변형) 발현이 양성으로 나타난 군집으로부터 증식된 배양분취물을 이용한다. 분취물은 추출하여 폴리펩티드함량에 대해 정규화한다. 추출물은 또한 원심분리하고 그 결과로 나온 펠릿세포편 및 상청액을 각각 따로 분석하였다. 또한 상청액내의 뉴멀리소이드 발현 확인은 가용화 분획에서 얻을 수 있는 것으로 나타났다.

세포용해물의 분취액을 수득하여 원심분리로 펠릿화하고 상청액 혹은 펠릿의 작용효과를 분석한다. 작용효과에 대해 펠릿을 스크리닝할 때는 변성물 즉, 요소에 의한 가용화, 뒤이어 가용종에 대해 상술한 바와 같이 수행되는 일련의 희석이 수반된다. 이 방법을 사용하면 단백질이 재폴드화되고 또한 존재하는 작용효과를 검출할 수 있다.

작용효과가 음성이면 재폴드화된 비활성 폴리펩티드 혹은 부적절하게 재폴드화된 폴리펩티드가 나온다. 이러한 두가지 조건을 구별하려면 2차 스크리닝절차를 이용한다. 작용효과-음성 클론이 변성되어 재폴드화한 후에 이온교환 크로마토그래피 칼럼상에 공급된다. 야생형 뉴멀리신과 유사한 용출패턴을 가진 돌연변이물을 겔여과 크로마토그래피로 분석하고 또한 야생형 뉴멀리신과 유사한 스톡스반경을 가진 단량체형 종류를 선별한다.

선별된 클론(들)의 변형 뉴멀리신을 코딩하는 삽입된 핵산 서열은 통상의 방법에 의해 서열분석되어 이에 상응한 아미노산 서열이 유도된다.

B. 변형 뉴멀리신 폴리펩티드

1. 용혈활성의 감소

본 발명의 변형 뉴멀리신 폴리펩티드는 비용혈성 혹은 사실상 비용혈성인 폴리펩티드이며 아직까지 천연 폴리펩티드에 대한 항체에 결합될 적어도 하나의 에피토프를 유지한다. 이러한 용혈활성은 뉴멀리신독성과 관계가 있으므로, 변형 뉴멀리신은 천연 뉴멀리신보다 덜 독성을 가진 것으로 예측된다. 본 발명의 변형 뉴멀리신 폴리펩티드는 특히 바람직하게는 N-말단에서 시작되는 처음 257개 아미노산 중에 S.pneumoniae 제14형 야생형 뉴멀리신(도 3)에 대응된 적어도 하나의 돌연변이를 함유한다. 1개 정도의 아미노산변형이 요구되며 이결과 용혈분석에서 측정했을 때 독성이 거의 없거나 적은 변형 뉴멀리신 폴리펩티드를 얻을 수 있다. 따라서, 하나 혹은 그이상의 위치61, 148 및 195의 치환에 의해 용혈활성이 감소한 폴리펩티드를 얻게된다. 아미노산위치61, 148 및 195에서의 바람직한 치환은 하기 표1에서 보는 바와 같다.

표 1

	아미노산 위치
	61	148	195
야생형	Ser	Met	Phe
치환	Pro	Lys	Ile/Val

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상기의 아미노산이 아닌 다른 아미노산이 이들 위치에 치환된 경우 즉, 중성pH에서 유사한 전하를 갖는 것들도 본 발명의 범위에 속한다. 따라서, 위치61의 세린은 히드록시프롤린; 148의 메티오닌은 아르기닌이나 히스티딘; 195의 페닐알라닌은 로이신, 글리신 혹은 알라닌으로 치환되는 것도 제한없이 가능한 치환의 예가된다.

단일치환이 용혈활성 완화에 충분하기는 하나, 이러한 감소효과는 단일 폴리펩티드 중 특정군의 아미노산 치환에 의해서도 달성할 수 있다. 예를들어, 위치33, 46, 83, 239 및 257의 아미노산을 하나의 단일폴리펩티드에서 함께 치환하는 경우 용혈활성의 감소와 함께 뉴멀리신특성을 가진 폴리펩티드를 생성할 수 있다. 바람직한 치환은 표2에서 보는 바와 같다.

표 2

	아미노산 위치
	33	46	83	239	257
야생형	Ile	Ile	Leu	Ser	Asp
치환	Thr	Thr	Ser	Arg	Gly

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단일치환에 있어서, 상기 치환과 또다른 아미노산들도 상술한 바와 유사한 전하를 갖는 경우 역시 치환될 수 있으며 비제한적인 예로서, 세린 및 트레오닌은 서로치환가능하고 또한 위에서 설명한 것처럼 다른 중성의 아미노산이 위치257의 Asp 대신 치환되기도 한다.

용혈활성의 감소나 제거에 효과적인 상술한 치환 이외에도, 천연 뉴멀리신에 결합하는 항체와 결합할 수 있는 적어도 하나의 에피토프가 존재한다는 전제하에서 다른 치환도 생성될 수 있다. 치환가능하나 단독으로는 용혈활성을 감소시킬 수 없는 비제한적인 아미노산 잔기의 예를들면, 위치17, 18, 33, 41, 45, 46, 63, 66, 83, 101, 102, 127, 128, 172, 189, 239, 255 및 257의 아미노산이 있다. 이들위치에 치환되는 물질은 역시 비제한적으로 표3에 나타낸 것을 들 수 있다. 이들 위치는 용혈활성 감소와 무관하므로 크기나 전하에 큰 관계없이 더 자유롭게 치환될 수 있을 것으로 예측된다.

표 3

	아미노산 위치
	17	18	33	41	45	46	63	66	83
야생형	Lys	Lys	Ile	Asp	Val	Ile	Thr	Asn	Leu
치환	Arg	Asn	Thr	Gly	Ala	Thr	Ser	Tyr	Ser
	아미노산 위치
	101	102	127	128	172	189	239	255	257
야생형	Ile	Asp	Val	Asn	Thr	Gln	Ser	Lys	Asp
치환	Thr	Gly	Glu	His	Ala	Arg	Arg	Gly	Gly

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상술한 아미노산 치환에 국한되지않고 본 발명의 방법에 따라 동정된 다른 변형 뉴멀리신 폴리펩티드 역시 본 발명의 범위에 속하는 것으로 이해된다.

천연 뉴멀리신 서열의 단일위치 돌연변이는 이 뉴멀리신 폴리펩티드의 항원특성이 단일위치 변형에 의해 유지되기 쉬우므로 바람직하다. 이와 별도로, 다중돌연변이의 조합을 사용할 수도 있다.

그러나, 다중돌연변이는 가끔 예측불허인 경우도 있다. 즉 돌연변이는 공동상승적으로 작용하여 작용을 없애거나 혹은 폴드시 보상메카니즘을 수반하기도 한다. 이러한 이유 때문에, 단일위치 돌연변이가 유리하다고 판단된다.

스크리닝은 사실상 전장의 변형 뉴멀리신 폴리펩티드를 동정하는 것에 기초하나, 성숙 뉴멀리신에 결합된 항체에 의해 인지되는 적어도 하나의 에피토프가 보유된다는 전제하에서 상기 변형 뉴멀리신 폴리펩티드의 단편 및 절단형도 포함할 수 있다. 또한, 이러한 단편 및 절단형이 T 세포 의존형 면역반응을 일으킬 수 있는 다당류-폴리펩티드 결합물을 생성하기 충분한 크기인 것이 바람직하다.

본 발명의 뉴멀리소이드 단백질의 용혈활성은 뉴멀리소이드가 실제사용되는 방식에 따라 광범위하다. 예를들어, 용혈활성이 작은 뉴멀리소이드의 결합은 상기의 작용을 수용가능한 수준까지 더욱 감소시킬 수 있다. 다시말해서, 뉴멀리소이드를 다른 성분에 결합되지 않은채 개체에 도입하거나 개열시킬 경우 가능한 최소검출레벨에 근접한 정도까지 용혈활성을 감소시키는 것이 바람직하다. 이 목적을 위해, 용혈 작용 수준은 약 0.2% 내지 약 0.5% 더 바람직하게는 약 0.2% 수준이 적당하다. 어느정도의 용혈활성을 허용하는 경우 혹은 이것이 예컨대, 다당류에 대한 결합 등에 의해 감소할 경우, 약 0.5% 내지 약 25% 혹은 바람직하게 약 1% 내지 약 10% 정도로 더 큰 용혈 작용 수준도 수용가능하다.

2. 단백질 구조

과거의 연구결과에서 PLY 의 C-말단은 세포결합위치를 포함하는 것으로 보고되었다 (Owen et al. 1994, FEMS Microbiol. Let. 121, 217-221). 본 발명의 돌연변이연구는 올리고머반응 영역을 포함한다고 보고된 N-말단에 초점을 맞추었다. 농도의존방식으로 야생형 용혈활성을 없앤 특정 돌연변이물과 적혈구를 사전배양하면 이들 돌연변이물이 실제로 세포결합영역에 대하여 야생형 대응물과 경합할 수 있는 것으로 나타났다. 돌연변이물은 야생형 효과를 저해하므로, 이들은 야생형 뉴멀리신의 구조특성을 유지할 것이다. 돌연변이물 특히 pNV103 및 pNV207의 경우에서 세포결합영역의 보존은 이들 돌연변이물이 ELISA 억제분석에서 알수 있듯이 야생형 분자의 면역학적성질을 나타내므로 매우 중요하다. 더욱이, 이들 돌연변이물에 대응되는 항체는 야생형 대응물의 용혈활성을 중화시킬 수 있는 능력을 가지며 이것은 이들이 자연구조에 유사한 구조를 가졌음을 나타내는 증거이다.

야생형 뉴멀리신과 선별된 돌연변이물의 구조적 성질과 통합성은 원형이색성 및 형광분광학에 따라 분석하였다. 이러한 기술은 단백질의 2차 및 3차 구조에 대한 정량 및 정성분석정보를 모두 제공하는 특별한 장점이 있다. 야생형 뉴멀리신은 현재의 연구에서 선별된 모든 돌연변이물의 원거리 UV CD 스펙트럼의 현저한 특성인 β-시이트 구조 함량이 크다는 특징이 있다. 스펙트럼 형태와 탈회선의 분석이 구조적 및 기능적으로 천연 폐렴구균 뉴멀리신과 동등한 대장균의 가용성 분획으로부터 정제된 재조합 뉴멀리신에 대한 과거의 연구와 일치하고 있다 (Mitchell et al. 1989, Biochem. Biophys. Acta 1007, 67-72). 마찬가지로, 근거리 UV CD 및 형광스펙트럼은 290nm에서 여기될 때 ~345nm에서 최대방출함에 따라 입증된 바와 같이, 측쇄가 일부 용매에 노출된 Trp 잔기를 함유하는 자연구조와 일치하고 있다 (Morgan et al., 1993 Biochem. J. 296, 671-674). ~280nm에서 최소타원 및 ~290nm에서 최대타원 형태로 나타나는 특수한 근거리 UV CD 스펙트럼은 이것과 (Morgan et al., 1993) 또한 다른 시토리신 즉 퍼프린고리신 (Nakamura et al., 1995, Biochemistry 34, 6513-6520)의 지문을 보여준다. 이와같이, 이들 특징적인 분광지문은 특히 백신대상물의 성분으로 선별된 돌연변이물에 대하여 뱃치-뱃치 일관성의 후속평가를 위해 유용한 기본선 측정값을 표시한다.

C. 변형 뉴멀리신 코딩 핵산 분자

본 발명의 변형 뉴멀리신 폴리펩티드는 바람직하게는 변형 폴리펩티드를 코딩할 핵산 분자를 핵산 분자에 의해 형질전환된 숙주세균내에서 발현시켜 합성한다. 따라서, 이 발명은 또한 상기한 변형 뉴멀리신을 코딩할 DNA 및 RNA를 포함하여, 핵산 분자를 포함한다.

폴리펩티드를 코딩하는 DNA는 다양한 벡터를 이용하여 역시 다양한 숙주세포내에 재조합 폴리펩티드를 발현할 수 있다. 숙주세포는 원핵세포 혹은 진핵세포이다. 천연 야생형 뉴멀리신을 위한 DNA는 스트렙토코쿠스 뉴모니아 등 자연기원에서 수득하거나 인공합성한다. 야생형 DNA는 그 뒤 상술한 바와 같이 변형될 출발물질로 이용하여 본 발명의 변형 뉴멀리신 폴리펩티드를 코딩할 DNA를 수득할 수 있다. 목표한 변형 뉴멀리신 폴리펩티드를 코딩한 것으로 확인되면, 이 폴리펩티드를 코딩한 DNA는 발현될 다양한 벡터속에서 클로닝된다. 이와 별도로, 상기의 폴리펩티드를 코딩할 유전자를 전체 혹은 일부 합성할 수도 있다.

구현된 한 실시형태에서, 본 발명은 변형 뉴멀리신 폴리펩티드를 코딩할 유전자를 포함하는 벡터에 의해 형질전환되는 세균속에서 변형 뉴멀리신 폴리펩티드를 발현하는 방법에 관계하며 이렇게 생성된 폴리펩티드는 형질전환세균내 발현된 총 단백질의 약 2% 이상을 차지하게된다. 또다른 한 실시형태에서, 발현된 변형 뉴멀리신 폴리펩티드는 대장균내 발현된 총 단백질의 약 40% 이상을 차지한다.

클로닝 벡터는 염색체, 비염색체 및 합성 DNA 서열의 분절을 포함한다. 원핵세포 벡터의 비제한적인 예를 들면, 대장균 유래 플라스미드, 즉 colE1, pCR1, pBR322, pMB9 및 RP5 를 포함한다. 원핵세포벡터는 또한 M13, fd 및 기타 다른 필라멘트형 단일쇄 DNA파지 등 파지DNA의 유도체도 포함한다.

변형 뉴멀리신 폴리펩티드는 직접 혹은 융합 구조로 발현될 수 있다. 2가지 비제한적인 융합 구조의 예를 들면, 종래의 방법대로 분리 및 정제할 수 있는 티오융합물과 His-Tag을 들 수 있다. 세균 특히, 대장균내 단백질을 발현하는 벡터도 공지되어 있다. 이러한 벡터는 비제한적으로 pK233 (혹은 플라스미드의 tac종류), pT7, 또한 람다pSKF를 포함한다. 융합 단백질을 발현하는 벡터의 예는 Dieckmann 및 Tzagoloff(1985, J. Biol. Chem. 260:1513-1520)이 발표한 PATH벡터를 포함한다. 이들 벡터는 안트라닐산염 합성물(TrpE) 을 코딩하는 DNA서열 뒤에 카르복시말단에 있는 폴리링커를 함유한다. 2가지 비제한적인 융합 구조예는 종래방법에 의해 분리 및 정제될수 있는 티오융합물 및 His-Tag 이다. 다른 발현벡터체계는 베타-갈락토시다제(pEX); 말토오스 결합단백질(pMAL); 또한 글루타티온 S-전달효소(pGST)를 기초한 것이다. (1988 Gene 67:31 및 1990 Peptide Research 3:167) (Ausubel et al., 상기참조).

이스트에 유용한 벡터도 사용할 수 있다. 적절한 예로서 YIp, YRp, YCP, YEp 및 YLp 플라스미드이다 (Ausubel, Id. 참조)

포유동물의 세포에 사용하는 적절한 벡터도 역시 공지되었다. 이러한 벡터는 SV-40, 아데노바이러스, 레트로바이러스-유도 DNA서열의 공지 유도체 및 플라스미드와 파지DNA의 복합물로부터 유도된 벡터를 포함한다. 진핵세포 발현벡터의 또다른 벡터는 보고되었다 (P.J. Southern and P. Berg 1982, J. Mol. Appln. Genet. 1:327-341; S.Subramani et al. 1981, Mol. Cell. Biol. 1:854-864; R.J. Kaufmann and P.A. Sharp 1982, J. Mol. Biol. 159: 601-621; R.J. Kaufmann and P.A. Sharp 1982, Mol. Cell. Biol. 159:601-664; S.I. Scahill et al. 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:4654-4659; G. Urlab and L.A. Chasin 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216-4220).

바람직한 벡터의 예로서 플라스미드를 들 수 있고, T7 유도형 촉진자를 함유한 플라스미드의 비제한적인 예를들면 발현 플라스미드 pET-17b, pET-11a, pET-24a-d(+) 및 pET-9a 등이 있으며 이들은 모두 노바겐사 제품이다 (565 Science Drive, Madison, Wis. 53711). 이들 플라스미드는 서열내 조작결합된 T7 촉진자, 선택적으로 lac 조작유전자, 리보좀 결합부위, 구조적 유전자 및 T7 종결유전자 서열이 삽입될 수 있는 제한부위 등을 포함한다. 노바겐사 카탈로그(1993) 36-43를 참조한다.

바람직한 발현숙주는 공지의 원핵세포 및 진핵세포를 포함한다. 적절한 원핵세포숙주는 대장균 BL21(DE 3), SG-936, HB101, W3110, X1776, X2282, DHI 또한 MRC1 등과 같은 대장균, 또한 슈도모나스 및 바실러스 서브틸리스 같은 바실러스류, 또한 스트렙토마이세스 등을 포함한다. 적절한 진핵세포는 사카로마이세스 같은 이스트와 기타 균류, 벌레, COS 및 CHO세포같은 동물세포, 인간세포 또한 식물세포의 조직배양에서 얻은 것들을 포함한다.

바람직한 실시형태에서, 대장균 균주 BL21(DE3)를 사용한다. 상술한 플라스미드는 이 균주로 형질전환된다.

적절한 벡터를 이용하여 형질전환한 대장균의 선별은 무형질전환세포에 대해 독성을 갖는 선별배지내에서 성장되는 표준선별 프로토콜을 이용하여 달성할 수 있다. 예를들어, 대장균은 선별작용제 즉, 대장균이 민감한 임의의 β-락탐, 즉 암피실린 등을 포함한 배지내에서 성장한다. pET 발현벡터는 형질전환 개체에 대한 항생제 내성을 부여할 선별성 표시자를 제공한다.

고발현율의 변형 뉴멀리신 폴리펩티드는 대장균에 독성이 있을 수 있다. 놀랍게도, 본 발명은 대장균에서 총 세포단백질의 적어도 40% 수준으로 발현되는 변형 뉴멀리신 폴리펩티드를 선별할 수 있게해준다.

또다른 뉴클레오티드 돌연변이는 특히 번역된 아미노산이 선별클론의 서열에 기초하에 예측할 때 확인된 아미노산과 같은 종류일 경우 선별과정에서 동정되지 않았다. 덧붙여서, 특히 동정된 폴리펩티드가 다른 아미노산 치환을 표시할 경우에 보존형 아미노산을 코딩하는 뉴클레오티드 변화가 형성되기도 한다. 보존형 아미노산 치환은 공지되었으며 "유사"아미노산의 치환을 나타낸다. 특별한 제한은 없으나 극성, 소수성, 크기 및 측쇄구조 등을 고려한다.

본 발명의 변형 뉴멀리신 폴리펩티드는 무독성 혹은 사실상 무독성인 폴리펩티드이고 아직까지 천연 뉴멀리신에 대한 항체에 결합하는 적어도 하나의 에피토프를 보유한다. 본 발명의 변형 뉴멀리신은 특히 N-말단에 처음 257개 아미노산 중에서 야생형 뉴멀리신에 대해 적어도 하나의 돌연변이를 함유한다. 변형 뉴멀리신은 야생형 뉴멀리신의 잔기 위치 17, 18, 33, 41, 45, 46, 61, 63, 66, 83, 101, 102, 127, 128, 148, 172, 189, 195, 239, 243, 255, 257, 286 또는 446 중 하나 또는 그 이상에서 존재하는 아미노산을 교체하거나, 제거하거나 혹은 블록화한 형태로 변형된다. 상술한 바와 같이, 참조로 도입되는 PCT WO 90/06951 에 개시된 잔기 위치 367, 379, 384, 385, 397, 428, 433, 434 혹은 435에서의 추가 변형이 기타 공지된 변형 뉴멀리신 폴리펩티드로부터 도입될 수 있다. 여기서 발표된 본 발명의 아미노산 치환 이외에도, 뉴멀리신에 관해 보고된 다른 아미노산 치환 (Hill et al., 1994, Infection and Immunity 62, 757-758) 역시 여기서 기술된 방법에 의해 측정되는 뉴멀리신의 재폴드처리를 가능하게한다는 전제하에서 본 발명에 이용될 수 있다. Hill et al.은 4가지의 N-말단부위 돌연변이 즉, Arg-31→ Cys, Leu-75→ Phe, Val-127→ Gly 또한 His-156→ Tyr 을 발표하였으며 이들은 각각 용혈율이 75%, 100%, 75% 및 2% 이었다. 또한 4개의 C-말단부위 돌연변이 즉, Ala-432→ Val, Trp-433→ Arg, Trp-436→ Arg 또한 Val-468→ Leu 을 발표하였으며 이들은 각각 용혈율이 100%, <1%, 50% 및 100% 이었다. 그러나, 이들중 어느 돌연변이가 부적절하게 재폴드된 뉴멀리소이드가 된다면 사용하지 않는 것이 바람직하다. 뉴멀리신의 바람직한 변형은 잔기 위치 61, 148 혹은 195에 있는 것이며 특히 바람직한 것은 위치195에 있는 것이다. 또한, 위치33, 46, 83, 239 및 257에 있는 변형의 조합도 바람직하다.

당분야에 공지된 위치지정 돌연변이화의 임의 방법을 이용하여 천연 뉴멀리신서열속에 특별한 변화를 일으킬 수 있다. 바람직한 한 실시형태에서, PCR은 서열내 원하는 뉴클레오티드 치환(들)을 코딩하는 올리고뉴클레오티드 증폭 프라이머를 이용하여 실행할 수 있다.

별도로, 변형뉴멀리소이드 폴리펩티드는 화학합성으로 형성하기도 한다 (Kent et al. Adv. Exp. Med. Biol., 1995, 362, 425-438). 이러한 합성방법을 이용하여 뉴멀리소이드의 전체 혹은 일부를 제조할 수도 있다. 부분합성의 경우, 합성펩티드는 본원에 개시되거나 공지된 방법에 의해 제조된 적절한 뉴멀리소이드 펩티드의 일부에 공유결합하여 반-합성 뉴멀리소이드를 생성할 수 있다.

D. 백신 및 항체 조제물

본 발명은 또한 백신 및 항체조제물에 관계한다. 본 발명에 따르면, 상술된 발현된 변형 뉴멀리신이나 이들의 유도체 혹은 단편을 면역원으로 사용하여 뉴멀리신에 대해 작용하는 항체를 제조할 수 있다.

1. 항체

상술한 폴리펩티드 발현을 위한 재조합기술은 본 발명의 핵산 서열에 기초한 본 발명의 변형 뉴멀리신 폴리펩티드를 다량 제조하기 위해 제공된다. 이는 변형 뉴멀리신 폴리펩티드에 대한 항체의 생성을 촉진한다. 그러나, 폴리펩티드는 또한 화학합성법 혹은 이의 조합에 의해 합성할 수도 있다고 이해된다.

한 실시형태에서, 변형 뉴멀리신 폴리펩티드에 대한 항체는 임의 공지방법에 따라 생성한다. 한가지 접근에 따르면, 항체는 분리된 변형 뉴멀리신 폴리펩티드 조제물이나 그의 유도체 혹은 단편을 숙주동물에 주입하여 생성할 수 있다. 숙주동물은 비제한적인 예로서 쥐, 생쥐, 토끼, 인간이외의 영장류 혹은 인간 등이 있다. 면역학적 반응은 공지의 보조제를 사용하면 더 증가할 수 있다.

변형 뉴멀리신 폴리펩티드에 대한 모노클로날항체를 임의 공지방법으로 제조할 수도 있다. 한가지 방법에 따르면, 연속 하이브리도마 세포주의 배양이 이용된다 (Kohler and Milstein 1975, Nature 256:495-497). 변형 뉴멀리신 폴리펩티드에 대한 모노클로날항체는 역시 임의 공지방법에 따라 제조된 인간 모노클로날항체 혹은 키메라 모노클로날항체 등이 있다. 한가지 접근에 따르면, 키메라 모노클로날항체는 인간 구축물 영역에 결합된 인간외(예, 생쥐) 항원결합영역을 가지도록 발생된다 (Takeda et al. 1985, Nature 314:452).

변형 뉴멀리신 폴리펩티드에 대한 항체는 비제한적인 예로서 면역흡착 혹은 면역친화성 크로마토그래피 혹은 기타의 크로마토그래피법 (예, HPLC, 겔여과형 또는 이온교환형)을 포함한 임의 공지방법에 의해 정제된다. 항체는 또한 혈청, 플라스마 또는 세포배양배지로부터 나온 면역글로부린 분획으로 정제되기도 한다.

본 발명의 항체분자는 무상(intact) 면역글로부린분자, 사실상의 무상 면역글로부린분자 혹은 Fab 단편 등 항원결합부위를 함유하는 면역글로부린분자의 일부 등이다.

변형 뉴멀리신 폴리펩티드에 대한 항체의 단편은 임의 공지방법에 따라 생성된다 (Campbell 1985, Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Vol. 13, Burdon, et al., (eds.), Elsevier Science Publishers, Amsterdam).

2. 결합체분자

본 발명의 변형 뉴멀리신 폴리펩티드는 단독 혹은 또다른 면역원분자인 다당류 등에 결합된 상태로 이용되어 S.pneumoniae 에 대한 항체반응을 유발한다. 다른 면역원분자는 S.pneumoniae 혹은 면역반응을 일으키기위해 필요한 다양한 감염작용제로부터 유도된다. 바람직하게, 변형 뉴멀리신이 결합된 다른 면역원분자는 병원성세균으로부터 나온 캡슐형 혹은 비캡슐형 다당류이다. 이러한 세균으로는: 헤모필러스 인플루엔자b형; 수막염구균 A군, B군 혹은 C군; B형, Ia, Ib, II, III, V 및 VIII형군을 포함하는 각종 혈청타입의 B군 혹은 A군 스트렙토코쿠스; 또한 다양한 혈청타입 S.pneumoniae 제1형-23형 등을 포함한다. S.pneumoniae 혈청타입 제3, 4, 6b, 9v, 14, 18c, 19f 및 23형이 가장 바람직하다. 뉴멀리소이드 결합에 이용할 상기 다당류도 자체변형되어 고유에피토프에 대한 교차반응성을 감소시키거나 더욱 효율적으로 만들 수 있다. B군 수막염구균 다당류에 대한 변형에 관하여 Jennings et al. 미국특허 4,727,136 및 5,576,002 또한 국제출원공개 W096/40239에 대응하는 미국출원 08/484,569을 참조한다.

임의의 결합방식이 변형 뉴멀리신 폴리펩티드와 다당류성분을 결합시키는데 이용된다. 말단 알데히드기를 (시스-인접 히드록실기의 산화반응을 통해) 다당류속에 삽입하고 알데히드기를 환원아민화반응으로 폴리펩티드 아미노기에 결합시키는 미국특허 4,356,170 에 기재된 방법이 바람직하다. 이에 따라 다당류와 변형 뉴멀리신 폴리펩티드는 -CH₂-NH-폴리펩티드쇄를 통해 연결한다.

그러나, 본 발명의 결합백신은 환원아민화반응을 통해서 수득된 것에 특별히 국한되지 않는다. 따라서, 백신은 아딥프산 디히드라지드 스페이서를 이용하여 다당류와 변형 뉴멀리신 폴리펩티드를 결합시켜서 제조하기도 한다 (Schneerson, R. et al. 1980, J.Exp. Med. 1952:361-476, 미국특허 4,644,059). 혹은 Merck에서 개발한 2 원 스페이서 기술(Marburg, S. et al. 1986, J.Am. Chem. Soc. 108:5282-5287 참조)이나 가능할 경우 환원말단 방법학에 따라 제조하기도 한다.

본 발명에 따라 제조된 결합분자는 적어도 하나의 다당류성분에 결합된 본 발명의 하나 이상의 변형 뉴멀리신을 포함한다. 따라서 본 발명은 폴리펩티드가 적어도 2곳의 위치에서 다당류에 연결되어 교차연결 결합체를 생성하는 결합분자를 형성할 수 있는 능력을 제공한다.

본 발명의 백신은 능동 혹은 수동면역성을 제공한다. 능동면역성 제공백신은 정제된 본 발명의 변형 뉴멀리신 폴리펩티드를 포함한다. 바람직하게는 이 백신의 폴리펩티드가 표1에서 나타낸 야생형 뉴멀리신 아미노산 서열에 있는 하기 아미노산 치환의 적어도 하나를 포함한다.

본 발명의 한 실시형태에서, 본 발명의 변형 뉴멀리신 폴리펩티드에 대한 항체를 치료 혹은 예방차원의 약제물로 사용하여 한 숙주개체에서 다른 개체로 면역성을 전달할 수 있다 (즉, S.pneumoniae에 대한 개체의 면역반응을 증가시켜 AIDS환자를 포함한 면역저하 또는 면역결핍환자에게 대응력을 제공한다). 수동적인 항체전달은 이미 공지되었으며 임의의 기존의 방법에 따라 달성된다. 한가지 방법에 따르면, 본 발명의 변형 뉴멀리신 폴리펩티드나 이의 결합체에 대한 항체를 면역적격 (immunocompetent) 숙주("공여체") 동물에서 생성하여 수득하고 이것을 수여체에게 주입시키는 것이다. 예를들어 공여자인 인간에게서 상기한 변형 뉴멀리신 폴리펩티드나 이의 결합체에 대한 항체를 생성하고, 이것을 치료가 필요한 인간 수여자에게 치료 또는 예방효과적인 양만큼 주입하면 상기 공여자가 결합체로 면역화되어 있을 경우 뉴멀리신 독소에 대한 내성 뿐만 아니라, S.pneumoniae와 또한 다당류성분에 의해 생성될 항체와 결합하는 다른 세균에 대해서도 저항력을 갖게된다.

E. 약제학적 조성물

본 발명의 약제학적 조성물은 변형 뉴멀리신 폴리펩티드, 이것을 포함하는 결합분자 혹은 상기 변형 뉴멀리신 폴리펩티드 조성물 중 하나에 의해 유도될 항체를 포함한 조성물 등을 모두 포함한다. 이들 약제학적 조성물은 특히 백신으로 유용하다.

수동면역성의 유도를 위해, 이 약제학적 조성물은 상술한 폴리클로날항체나 모노클로날항체 혹은 이들의 유도체나 단편 등을 포함할 수 있다. 항체, 단편 혹은 유도체의 양은 표준임상방법에서 정해진 치료 혹은 예방효과량이 된다.

본 발명의 약제학적 조제물은 당해분야의 공지방법에 따라 개체에 투여한다. 피부내, 복강내, 정맥내, 피하, 근육내, 경구 혹은 비강경로를 통해 투여되나 이에 국한되는 것은 아니다.

본 발명의 조성물은 백신에 적합한 당분야에 공지된 통상의 표준담체, 완충액 혹은 보존제 등도 포함하며 이들의 비제한적인 예로서 생리학적 염수나 기타의 주사액 등 적절한 약제학적으로 허용가능한 담체를 들 수 있다. 백신용 통상적 첨가제도 존재하며 예를들면 락토오스나 솔비톨같은 안정화제, 또한 인산알루미늄, 수산화물 혹은 황산염 및 스테아릴티로신 등의 면역반응 증강보조제도 존재한다. 본 발명에 따라 제조된 백신은 또한 다수의 감염작용제에 대한 면역반응을 일으킬 수 있는 다가 백신의 성분으로 사용할 수도 있다.

본 발명의 백신은 면역반응의 일부로서 항체의 생성을 유도하기에 적절한 양만큼 투여한다. 투여량은 백신수여 대상자의 신체크기, 무게 혹은 연령에 따라 조정할 수 있다. 항체반응은 항체역가 혹은 항생제의 약효를 분석하여 관찰하고 또한 필요시 면역반응을 개선하기 위해 더 자극시킬 수도 있다. 통상 1회 투약량은 약 0.1 내지 10㎍/kg 이다.

F. 진단키트

또다른 바람직한 실시형태에서, 본 발명의 변형 뉴멀리신 폴리펩티드나 이의 유도체 혹은 단편을 사용하여 뉴멀리신 독소의 공급을 차단하고 S.pneumoniae에 대한 항체의 존재를 표시할 수 있는 더 안전한 진단 키트를 제조할 수 있다. 이러한 항체의 존재는 병원균에 대한 사전노출을 표시하며 또한 대상체가 감염내성을 가진 것으로 예측할 수 있다. 항체반응은 임의의 통상의 방법으로 확인가능하며 예를들면 ELISA분석법을 이용한다. 이 사전지식은 불필요한 백신투여를 피할 수 있으므로 중요하다. 진단기구는 본 발명의 변형 뉴멀리신 폴리펩티드나 이의 유도체 혹은 단편 중 적어도 하나와 또한 변형 폴리펩티드나 이의 유도체 혹은 단편이 뉴멀리신에 대한 항체를 함유한 시료와 혼합되었을 때 항체반응을 검출할 수 있도록 해주는 적절한 항체반응검출시약을 포함한다.

별도로, 진단기구는 또한 고형지지물 혹은 자기구슬이나 플라스틱매트릭스와 또한 본 발명의 변형 뉴멀리신 폴리펩티드나 이의 유도체 혹은 단편중 적어도 하나를 추가로 포함할 수 있다.

경우에 따라서, 상기의 폴리펩티드나 이의 유도체 혹은 단편을 라벨표시할 수도 있다. 표시제는 통상의 것이다. 예를들어 표시제의 비제한적인 예로서 방사성, 화학발광성, 생물학적발광성, 발광성 혹은 편리한 분석을 위한 기타의 확인가능한 "표식"을 제공하는 것이 있다. 체액이나 조직시료(혈액, 혈청, 타액 등)를 수거하여 정제한 후 진단키트에 넣는다. 뉴멀리신 폴리펩티드, 이의 유도체(뉴멀리소이드)나 단편은 정제되거나 정제되지않은 형태이며 또한 분자칵테일로 구성되기도 한다. 시료내 항체는 뉴멀리신과 반응하거나 하지않는다.

고형매트릭스는 공지의 것이며 비제한적인 예로서, 폴리스티렌, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리카보네이트, 혹은 기타의 고형플라스틱재가 포함되고 이들을 시험관, 구슬형, 소형입자, 딥스틱형, 플레이트형 등으로 만들어 이용한다. 기타의 매트릭스로서 비제한적인 예를 들면, 막, 96-웰 마이크로타이터 플레이트, 시험관 및 에펜도르프관 등이 있다. 일반적으로, 이러한 매트릭스는 리간드결합제를 부착할 수 있는 면 혹은 자체적으로 리간드 부착부위를 제공할 수 있는 면을 포함한다.

기타 본 발명에 관련한 모든 공보, 특허 및 문헌은 본원에 참고로서 전문이 포함된다. 다음의 실시예는 본 발명을 구체적으로 설명하기 위한 것으로서 본 발명의 범위를 제한하는 것은 전혀 아니다. 당해분야의 기술자라면 본 발명의 범위내에서 다른변경도 가능함을 쉽게 이해할 것이다.

[실시예]

재료와 방법

세균균주 및 플라스미드.

스트렙토코쿠스 뉴모니아 제14혈청타입 (ATCC, Rockville, MD)을 본 연구에서 유전체 (genome) DNA 분리를 위해 사용하였다. 대장균 균주 DH5α(Life Technologies, Gaithersburg, MD)는 초기 클로닝 및 플라스미드 DNA의 제조에 사용되었다. 대장균 균주 BL21(DE3)ΔompA 는 단백질발현에 이용되며 BL21(BE3) (Novagen) 으로부터 유도한 것이다 (미국특허 5,439,808 참조). S.pneumoniae 는 7.5% CO₂ 하에서 흔들지않고 하룻밤동안 토드-히윗(TH) 브로스에 넣어 증식시켰다. 대장균 균주는 필요에따라 카르베니실린(50-100㎍/ml) 혹은 카나마이신(50㎍/ml)를 충전한 루리아-베르타니(LB)브로스에 넣어 증식시켰다. 플라스미드 벡터 pUC-19 및/또는 pBluescript II SK+ (스트라타겐)을 사용하여 서열분석 대상 단편을 클로닝했고 플라스미드 pET-17b 및 pET-24a (노바겐)을 사용하여 발현대상 단편을 클로닝했다.

SDS-PAGE.

단백질시료를 다음과 같이 제조했다: 배양물로부터 1.5ml 분획을 수거하여 원심분리해서 세포를 수득했다. 세포는 150㎕의 단백질 로딩 완충액에 넣어 재현탁한 후 5분간 끓여 세포를 용해시켰다. 세포조각을 원심분리로 제거한 후 상청액의 10㎕을 저분자량표준(Bio-Rad)에 따라 8-16% 구배의 트리스-글리신 "람니 (Laemmli)" 폴리아크릴아미드겔(Novex)를 통해 전기영동했다. 이와 별도로, 용혈활성분석을 위해 조정제 추출물을 제조하여 이것을 단백질 로딩 완충액으로 1:1 비율로 희석하고 10-15㎕을 겔에 넣었다. 단백질띠를 쿠마씨블루 염색법으로 육안관찰했다.

[실시예1]

뉴멀리신의 발현

원하는 유전자를 함유한 pET-17b 혹은 pET-24a로 형질전환시킨 대장균 균주 BL21(DE3) Δompa 는 0.4% 글루코스 및 100㎍/ml의 카르베니실린(pET-17b 구조물) 혹은 50㎍/ml의 카나마이신(pET-24a 구조물)이 보충된 LB에서 30℃에서 약한호기상태로 증식하였다. OD₆₀₀가 0.6에 도달하면, IPTG는 0.4mM(pET-17b 구조물) 및 1mM(pET-24a 구조물)의 최종농도로 첨가하고 세포는 스크리닝을 위해 다시 2시간동안 배양하거나 혹은 더 큰 규모의 배양을 위해 5시간동안 인큐베이션했다. 뉴멀리신농도를 분석하기위해 1.5ml의 분취물을 유도전 및 유도후 각 시점에서 분리하여 SDS-PAGE로 검사했다.

[실시예2]

스트렙토코쿠스 뉴모니아 제14혈청타입에 관한 뉴멀리신유전자의 클로닝

유전체DNA를 약 0.5g의 스트렙토코쿠스 뉴모니아 제14혈청타입으로부터 상술한 방법에 따라 분리했다. 이 DNA는 표준PCR반응에서 2개의 뉴멀리신-특이 올리고뉴클레오티드의 주형으로 작용한다. 이 올리고뉴클레오티드는 상기 S.pneumoniae 제2혈청타입으로부터 나온 뉴멀리신 유전자의 5' 및 3' 접촉부위와 상보적이며, 또한 필요시 단편의 클로닝을 촉진하기 위한 XbaI제한부위를 포함하도록 설계되었다. 순행 올리고뉴클레오티드의 서열은 [서열 5]에 기재된 바와 같고 또한 역행 올리고뉴클레오티드의 서열은 [서열 6]에 기재된 바와 같다. PCR반응조건은 다음과 같다: 200ng S.pneumoniae 제14형 유전체 DNA, 각 1μM인 상술한 2개의 올리고뉴클레오티드 프라이머, 200μM의 각 dNTP, PCR 반응완충액 (10mM 트리스HCl, 50mM KCl, pH8.3), 1.5mM MgCl₃, 또한 2.5유닛의 Taq 중합효소, 또한 총 100㎕의 나머지를 형성하는 QS의 dH₂O.

이 반응혼합물을 1분간 95℃, 2분간 50℃, 또한 1.5분간 72℃에서 총 25회 반응시킨다. 주기가 끝나면, 반응혼합물을 1.0%의 아가로스겔에 붓고 재료를 2시간동안 전기영동시킨 후 1.7kb의 밴드를 제거하여 DNA를 GeneClean^R(Bio 101)을 이용하여 회수했다. 이 DNA는 XbaI로 소화시키고, 다시 정제한 후 T4 DNA 리가제를 이용하여 XbaI-소화 pUC-19에 결찰시켰다. 결찰혼합물을 사용하여 적격 대장균 DH5α을 형질전환시켰다. 재조합 플라스미드를 동정하여 서열분석했다; 대부분은 뉴멀리신 코딩유전자와 일치하는 DNA서열을 갖는 것으로 나타났다.

[실시예3]

대장균의 뉴멀리신유전자 발현

성숙 뉴멀리신단백질을 발현할 수 있는 플라스미드는 전장 뉴멀리신유전자(pST20, pST85, 혹은 제14형 유전체DNA)를 함유한 DNA를 뉴멀리신 코딩부위를 분리하기 위해 고안된 네스트된 올리고뉴클레오티드로 증폭시켜 구축했다. 순행 올리고뉴클레오티드는 NdeI 위치를 함유하도록 고안되고 코딩부위의 5'말단에 출발코돈을 위치시킨다. 이 프라이머는 [서열 7]에 기재된 바와 같다. 역행 올리고뉴클레오티드는 XhoI 위치를 함유하도록 고안되고 [서열 8]에 기재된 바와 같다. 이 방법에 따르면 pET-17b 나 pET-24a 중 어느 것의 NdeI 및 XhoI 위치에 성숙한 뉴멀리신을 코딩하는 단편의 클로닝이 가능하다. 표준 PCR은 전체 뉴멀리신 유전자(제1형, 2형 및 14형)와 상술한 2개의 올리고뉴클레오티드가 들어있는 주형을 이용하여 실행한다. 이 PCR 반응으로 1.0% 아가로스겔에서 분석했을 때 1.6kb 생성물을 수득했다. PCR반응으로 수득한 DNA는 제한효소 NdeI 및 XhoI로 정제 및 소화된 겔이었다. 1.6kb의 생성물을 다시 겔정제하고 T4 DNA리가아제를 이용하여 NdeI- 및 XhoI-소화된 pET-17b 혹은 pET-24a에 결찰시켰다. 이 결찰혼합물을 사용하여 다시 적격 대장균 DH5α을 형질전환시켰다. 1.6kb 삽입물이 들어있는 군집을 다시 분석용으로 선택했다. DH5α클론으로부터 나온 DNA를 제한지도작성으로 분석하고 선택된 플라스미드의 클로닝접점을 서열분석했다. 분석후, DH5α클론으로부터 수득한 DNA을 이용하여 대장균 BL21(DE3)ΔompA를 형질전환시켰다. 형질전환된 세균을 100㎍/ml의 카르베니실린 혹은 pET-24a 플라스미드를 이용할 경우 50㎍/ml의 카나마이신이 함유된 LB-아가에서 선별했다. 통상, 수개의 클론을 스크리닝하여 성숙뉴멀리신 단백질을 생성하는 이들의 능력을 확인한다.

[실시예4]

변형 뉴멀리신의 생성을 위한 무작위 돌연변이

아미노산 잔기1-257를 함유하는 뉴멀리신을 코딩할 유전자의 일부를 상술한 기술의 변형방식을 통해 무작위 돌연변이화에 이용했다. (Cadwell, R.C. 및 Joyce, G.F. 1994, PCR Methods Appl. 3:pS136-40; Cadwell, R.C. 및 Joyce, G.F. 1992, PCR Methods Appl. 2:28-33). [서열 9]에 기재된 서열을 갖고 한편 pET-24a 플라스미드의 T7 촉진자 부위(도1a 참조)에 상보적인 올리고뉴클레오티드와 또한 [서열 10]에 기재된 서열을 갖고 1250bp 주변에 있는 뉴멀리신유전자 부위(도1 참조)에 상보적인 올리고뉴클레오티드를 이용하여 돌연변이될 유전자의 부위를 확인했다. 무작위 돌연변이화 PCR 반응조건은 다음과 같다: 정제된 플라스미드 pNV-19.2(100ng), 0.2mM dGTP, 0.2mM dATP, 1mM dCTP, 또한 1mM dTTP의 각 불균형 dNTP 농축물 1μM에서의 상술한 2개의 올리고뉴클레오티드 프라이머, PCR 반응완충액(19mM 트리스-HCl, 50mM KCl, pH8,3), 8.0mM MgCl₂, 0.5mM MnCl₂, 6유닛 Taq 중합효소, 또한 총100㎕ 의 나머지인 QS의 dH₂O.

이 반응혼합물을 1분간 95℃, 2분간 40℃, 또한 3분간 72℃에서 총 40회 반응시킨다. PCR반응이 끝나면, 단편들을 페놀/클로로포름로 추출하고 에탄올로 침전시켰다. 다시 이들 단편을 NdeI 와 HindIII로 소화시키고 겔정제한 후 pNV-19.2에 결찰시키고 동일한 효소로 소화시켰다. 단편을 결찰 및 적격 BL21(DE3) 대장균에 형질전환시켰다.

[실시예5]

독성효과가 없는 변형 뉴멀리신을 발현할 변형 뉴멀리신의 선택

실시예4에서 설명된 형질전환의 결과로 다수의 군집(약 10⁴ )이 나타났으며 400개를 무작위 선별평가하였다. 이 실시예에서 설명한 새로운 스크리닝법으로 다음 특성의 변형 뉴멀리신 폴리펩티드를 발현한 군집을 확인했다: (1) 용혈활성 없음, (2) 사실상 전장, (3) 부분적으로 가용성, 또한 (4) 봉입체로부터 분리된 때 단량체이며 재폴드가능함. 이 스크리닝법에는 다음단계가 관여된다:

(a) 저용혈활성의 여부를 검사한다;

마이크로-용혈분석으로 클론을 평가했다. 용혈활성-분석은 U-바닥형 마이크로타이터 플레이트에서 TBS (트리스완충염수, pH7.4)를 배양액으로 사용하여 실시했다. 사전배양기간은 1mM DTT로 5분간 실시되며 2배씩 연속 희석하고 시료를 양의 적혈구(Cappel)가 같은 완충액속에 재현탁된 동일 부피의 1% 현탁액으로 배양했다. 이 반응은 시간의 함수로서 실온에서 실행했고 (반응역학 연구), 또한 적혈구 용해 정도를 육안으로 관찰했다. 각 클론은 0-5로 평가치를 매겼다. 0은 용혈활성이 없는 것이고 4-5는 야생형 수준이상으로 큰 용혈활성 정도를 나타낸다. 0,1,2로 평가된 200개의 클론을 선별하여 다른 특성을 대상으로 다시 스크리닝햇다.

(b) 전장 뉴멀리신 폴리펩티드의 발현을 검사한다:

폴리펩티드 발현분석은 96-웰 포맷에서 실행했다. 저용혈활성의 군집을 분자량 약 53,000달톤의 강한띠 존재여부에 대해 SDS-PAGE로 평가했다. 전장 뉴멀리신의 분자량은 약 53kD 이었다. 200개 중 58개는 양성으로 나타났다. 이들 클론을 다음의 선별을 위해 수집했다.

(c) 가용성 분획 중의 변형 뉴멀리신 폴리펩티드 발현을 검사한다:

가용성 분획 및 봉입체 양측에서 발현된 변형 뉴멀리신 폴리펩티드는 더 쉽게 재폴드될 수 있다. 용혈효과가 없거나 감소된 돌연변이 뉴멀리신서열을 가진 플라스미드를 갖는 2h IPTG유발 대장균 세포로부터 얻은 10ml의 배양물을 수집하여 1.5ml의 TEN완충액에 넣어 재현탁했다; 세포는 상청액이 브래드포드 단백질분석시 고함량 단백질을 함유하는 것으로 나타날 때까지 (성공적인 용해를 시사함) 연속의 동결/해동/초음파처리 절차를 통해 용해시킨다. 용해된 세포현탁물을 원심분리하고(14,000 rpm/10분) 펠릿과 상청액의 양쪽 분취물을 SDS-PAGE로 분석한다. 가용성 분획의 분취물은 용혈활성에 대해 검사하고 용혈역가를 결정하여 초기 스크리닝단계에서 실행된 반응역학적 정성분석연구에서 측정된 상기 작용효과의 감소를 확인한다. 클론은 용혈활성이 거의 없는 가용성, 변형 뉴멀리신 폴리펩티드가 함유된 것으로 나타났다.

(d) 고수율의 재폴드형 및 모노머 변형 뉴멀리신 폴리펩티드;

가용성 뉴멀리신을 함유한 클론을 스크리닝절차의 후속단계를 위해 선별하며, 이것은 상청액을 흡입배출하고,및 펠릿을 TEN완충액으로 2회 세척하고 또한 TEN완충액내에 제조된 8M 요소 5ml에 상기 펠릿을 가용화시키는 단계로 구성된다. 2분간 초음파처리한 후 요소액을 신속하게 원심분리하여 응집물을 제거하고 다시 45ml의 재폴드용액에 대해 4℃에서 계속 교반하며 점적했다. 재폴드용액은 다시 완충액A (25mM 트리스.HCl, pH8.0) 로 사전평형화된 2ml DEAE-세파로스-FF 칼럼에 로딩하였다. 칼럼을 완충액A로 세척하고 결합된 단백질을 0 내지 1M 농도구배의 NaCl로 용출시킨다. 적절히 재폴드된 뉴멀리신 돌연변이물은 야생형에 대해 관측된 것과 유사하게 13 내지 20% 완충액B (25mM 트리스.HCl, 1M NaCl, pH8.0)사이에서 단일피크로 용출된다. 단백질 피크를 다시 수퍼로스12 칼럼상에서 HPLC로 분석하며 용출시간, 응집물/모노머 비율, 또한 용혈활성 등을 평가한다 (표4 참조). 선별된 돌연변이(들)은 야생형과 유사한 스톡스 반경의 단일 모노머종으로 존재한다. 모노머 변형 폴리펩티드 수율이 큰 5개의 클론(pNVJ1, pNVJ20, pNVJ22, pNVJ45, pNVJ56)를 핵산 서열분석을 포함한 추가분석을 위해 선별했다. 이들 클론의 아미노산 및 핵산 치환은 표5A와 6에 표시한 바와 같다. 명세서 및 청구범위에 걸쳐, 이들을 코딩하는 벡터의 이름이 단백질의 명칭이 된다.

표 4.

야생형(pNV19) 및 돌연변이 뉴멀리신 폴리펩티드의 비교

단백질	순수모노머(mg/L)	HPLC(용출시간)	용혈활성(U/mg)	활성 (% 야생형)
pNV19	63	20.1	10⁶	100
pNV111	92	19.3	2,555(9)¹	0.25
pNVJ22	86	20.7	2,440(9)	0.24
pNVJ20	90	19.8	1,961(6)	0.20
pNVJ1	66	20.2	1,536(2)	0.15
pNVJ45	86	18.7	1,360(5)	0.14
pNVJ56	104	19.8	2,000(2)	0.20
pNV211	n.d.	20	1800(2)	0.18
pNV207	100	20.5	800(2)	0.08
pNV103	104.7	20	950(2)	0.10
¹괄호안의 숫자는 실험횟수를 말함.

표 5A: 야생형(pNV19) 뉴멀리신 및 변형 형태의 아미노산 서열

표 5B. 변형 뉴멀리신 폴리펩티드의 아미노산 서열

단백질	돌연변이	용혈 활성
pNV19	야생형	100%
pNV21	446 P 에서 S 로	25%
pNV46	286 E 에서 D 로	12%
pNV22	243 G 에서 R 로, 446 P 에서 S 로	<1%
pNV38	243 G 에서 V 로	<1%
pNV39	243 G 에서 E 로	<1%
pNV40	243 G 에서 S 로	<1%
pNV20	243 G 에서 R 로	<1%

표 6. 용혈 활성이 현저히 감소된 결과를 가져오는 야생형(pNV19)뉴멀리신 유전자에 대한 핵산 치환.

[실시예6]

단일 돌연변이를 가진 뉴멀리신 유전자의 위치지정 돌연변이

특정 펩티드에서 단일 혹은 다중 돌연변이가 용혈활성 손실에 관여하는지의 여부를 분석하기 위해(표4 참조), 올리고뉴클레오티드 지정 돌연변이화를 이용하여 각 돌연변이를 야생형 대립유전자에 단일위치 돌연변이로서 도입하였다. 표7은 이들 특정 돌연변이를 도입하기 위해 사용되는 올리고뉴클레오티드를 나타낸다. 원하는 돌연변이를 가진 폴리펩티드를 동정하여 이들의 핵산 서열을 확인하였다. 이들 위치지정 폴리펩티드중에서 단일 염기변화로 용혈활성이 손실된 다음의 폴리펩티드를 확인했다 (표5A 참조): 핵산 서열 103은 위치583에서 야생형 T에서 변형 G로의 단일염기변화를 포함한다 (195-Phe →Val); 핵산 서열 207은 위치583에서 야생형 T에서 변형 A로의 단일염기변화를 포함한다 (195-Phe →Ile); 핵산 서열 111은 위치443에서 야생형 T에서 변형 A로의 단일염기변화를 포함한다 (148-Met →Lys); 핵산 서열 211은 위치181에서 야생형 T에서 변형 C로의 단일염기변화를 포함한다 (61-Ser →Pro).

표5B의 폴리펩티드는 재폴드 수율이 좋지않으며 따라서, 이들의 용혈활성 감소가 설명된다. 위치243, 286 및 446에서의 뉴멀리신 폴리펩티드에 도입된 단일 돌연변이물 또는 위치243 및 446에서 도입된 복합 치환은 봉입체로서 불용성 분획에서만 발견되는 종류를 생성하였다. 이들 돌연변이물의 재폴드처리를 시도하면 대부분 응집된 형태의 종류가 수득된다.
표 7

삭제

변형 뉴멀리신 서열

돌연변이 AA# 프라이머 서열

위치

443 148 (순행)

[서열 11] 에 기재된 서열

Met-Lys (역행)

[서열 12] 에 기재된 서열

583 195 (순행)

[서열 13] 에 기재된 서열

Phe-Ile (역행)

[서열 14] 에 기재된 서열

583 195 (순행)

[서열 15] 에 기재된 서열

Phe-Val (역행)

[서열 16] 에 기재된 서열

181 61 (순행)

[서열 17] 에 기재된 서열

Ser-Pro (역행)

[서열 18] 에 기재된 서열

[실시예7]

변형 폴리펩티드의 발현과 정제

이들 단일돌연변이 유전자는 개별적으로 발현벡터 (pET-24a) 속에 클로닝되어 대장균에서 변형 폴리펩티드를 과잉발현하였다. 발현율은 ~40%이다. 재조합 변형 뉴멀리신을 정제하기 위해 새로운 정제 및 재폴드방법을 개발하였다.

발현벡터 pNV19를 갖는 대장균에서 발현된 뉴멀리신은 세포를 TEN 완충액 (50mM 트리스-HCl, 100mM NaCl, 10mM EDTA pH 8.0)내에 재현탁 및 용해시키고 8,000psi의 압력하에서 공기식 세포파괴기 (Stansted Fluid Power Ltd.) 를 이용하여 봉입체로부터 분리하였다. 세포용해물은 13,000rpm에서 4℃의 온도로 20분간 원심분리하였고; 펠릿과 상청액을 각각 가용성 및 응집성 뉴멀리신의 분리를 위해 보관하였다. 봉입체는 TEN 완충액으로 3회 세척한 후 -70℃에서 저장했다. 정제 및 후속 재폴드처리는 봉입체를 8M 요소액 (TEN완충액에서 새로 제조된)에 가용화시키고 그 뒤 PEG의 도움으로 재폴드처리하여 달성했다. 8M 요소(200㎍/ml)내의 폴리펩티드액은 20μM의 PEG8,000과 25mM 트리스-HCl, pH8.0을 혼합하여된 재폴드처리액에 4℃에서 일정교반하면서 점적첨가하여 10배로 희석하였다. 시료는 나누어 25mM 트리스-HCl, pH8.0에서 평형화시킨 DEAE-세파로스 고속유동 이온교환컬럼(Pharmacia) 에 로딩하였다. 0-1M 농도구배의 NaCl을 붓고 하기와 같이 또한 SDS-PAGE에 의해 용혈활성을 측정하여 뉴멀리신 함유 분획을 확인했다. 정제된 분획은 아미콘 농축기와 PM30막을 이용하여 농축시켰다. 정제된 폴리펩티드 분취물의 용혈활성을 검사하고 SDS-PAGE와 또한 수퍼로스 12컬럼을 이용한 크기분리 크로마토그래피법에 따라 분석했다.

용혈활성 분석은 TBS(트리스완충염수, pH 7.4)를 배양완충액으로 사용하는 U-바닥형 마이크로타이터 플레이트에서 실행했다. 1mM DTT로 5분간 사전배양한 후 정규화한 단백질로 2배씩 연속 희석을 수행하고 시료는 동일완충액에 재현탁된, 세척된 양의 적혈구의 1% 현탁물(총부피 200㎕) (Cappel)로 배양했다. 반응은 37℃에서 30분간 실행했고 적혈구 용해량은 U-형 플레이트를 회전에 의해 침전시켜 상청액을 편평바닥형 플레이트에 전달하고 헤모글로빈방출량을 450nm에서 측정하여 분광학적으로 관측하였다. 종말점은 50%의 용해가 일어날 때의 농도로 설정하였으며 저장성 용해된 0.5% 세포현탁물과 비교한 값에 기초하였다 (표4 및 5B를 참조).

변형 뉴멀리신 폴리펩티드의 또다른 분석법은 변형 폴리펩티드의 용혈억제력 분석을 실행하는 것이다. 이 분석법은 변형 뉴멀리신 폴리펩티드로 적혈구를 사전배양하고 사전처리된 적혈구에 대한 야생형 뉴멀리신의 용혈역가를 평가하여 돌연변이 단백질이 야생형 단백질의 용혈활성을 감소시키거나 없애는 능력을 측정하는 것이다. 이 분석법에 따른 결과를 4가지 변형 폴리펩티드에 대하여 표8에서 나타냈으며 이에관한 상세설명은 실시예11에서 보는 바와 같다.

표 8.

뉴멀리신 돌연변이에 의한 뉴멀리신의 용혈억제력 분석.

명칭	돌연변이	종말점(*)
pNV19	야생형	512
pNV103	Phe¹⁹⁵ Val	64
pNV111	Met¹⁴⁸ Lys	128
pNV207	Phe¹⁹⁵Ile	32
pNV211	Ser⁶¹ Pro	512
(*) 해당 돌연변이의 존재하 야생형 뉴멀리신 조제물의 용혈역가 역수

선별된 단일위치 뉴멀리신 돌연변이의 항원형 교차반응성은 토끼(n=2)에 대해 표9의 돌연변이 단백질을 각각 종래의 면역방법으로 면역시켜 측정했다. 토끼의 면역화: 뉴질랜드산 화이트래빗(Covance, Denvers, PA)는 2-3kg의 무게로서 각각 Freund's 완전보조제에 유화처리한(부피/부피) 100㎍의 야생형 혹은 돌연변이 뉴멀리신을 피하주사했다. Freund's 불완전보조제와 혼합된 추가량의 백신을 동일한 경로로 초기투여후 21일째 및 42일째에 투여했다. 0일, 21일, 42일 및 52일에 혈청을 수거했다. 혈청에 대해 야생형 뉴멀리신에 대한 항체의 존재여부를 검사했다. 제14형 뉴멀리신에 대한 풀링된 혈청(n=2)의 항원역가는 ELISA로 측정했다. 간단히, 야생형 뉴멀리신을 플레이트에 코팅하고 항돌연변이성 뉴멀리신 혈청 각각의 연속 희석액과 배양했다. 변형 뉴멀리신 폴리펩티드에 의해 유발된 항체에 대하여 야생형 뉴멀리신이 다량 결합한 것을 표9에서 볼 수 있다.

삭제

표 9.

제14형 뉴멀리신에 대한 돌연변이 뉴멀리신 토끼 항혈청의 반응성 및 용혈중화역가.

명칭	돌연변이	역가	항체중화역가
pNV19	야생형	892,647	256
pNV211	Ser⁶¹ Pro	432,100	128
pNV111	Met¹⁴⁸ Lys	296,113	128
pNV103	Phe¹⁹⁵ Val	2,505,208	512
pNV207	Phe¹⁹⁵ Ile	402,426	128
PBS	-	-	8

표9에서 보는 바와 같이, 상기 폴리펩티드 각각의 항혈청은 ELISA로 측정했을 때 이들이 야생형 뉴멀리신과 강한 교차반응성을 나타내는 것 이외에도, 용혈억제분석시 측정했을 때 상당히 큰 중화, 항용혈 역가를 가진다.

[실시예8]

다당류의 뉴멀리소이드 결합체 제조방법

PnC 제14형 다당류 (ATCC Lot #2016107) (390mg)을 16ml의 0.5N NaOH 에 용해하고 이 용액을 70℃에서 3시간동안 가열하였다. 용액냉각후, 1.93ml의 빙초산을 첨가하여 pH4로 만들었다. 3ml의 5%(w/v) NaNO₂를 첨가한후, 반응혼합물을 4℃에서 2시간동안 지속교반했다. 시료는 그후 탈염수로 50ml가 되도록 희석하고 이 pH값은 다시 0.5N NaOH을 넣어 7로 조정했다. 과량의 시약은 탈염수로 투석여과하여 스펙트럼/Por 분자다공막관(MWCOL:3,500)을 통해 투석하고 나머지는 동결건조하였다. 탈아민화된 제14형 다당류는 PBS를 용출제로 이용하는 수퍼덱스G-200(Pharmacia)컬럼상에서 분자체에 의해 걸러졌다. 수퍼로스 12컬럼(Pharmacia)를 이용한 크로마토그래피/다각형 레이저광산란법을 통해 측정했을 때 5000 내지 15,000 분자량인 칼럼 용출 분획을 풀링하고 탈염수로 스펙트라/Por 분자다공막관(MWCOL 3,500)을 통해 투석하여 동결건조하였다.

결합체 제조방법.

PnCPS 각각은 1차로 먼저 탈중합처리되고 관능성 알데히드를 메타과요오드산나트륨으로 산화반응시켜 단편화된 CPS 에 도입하였다. 산화처리후, 과량의 과요오드산염은 에틸렌글리콜로 제거하고 산화된 다당류는 탈염수에 대해 투석한 뒤 동결건조했다.

0.2M 인산염완충액(pH8) 중 5mg/ml의 농도의 변형 뉴멀리신 폴리펩티드를 2.5당량(중량)의 PnC 14 다당류단편 및 2당량(중량)의 재결정화된 소듐 시아노보로히드라이드와 함께 혼합하였다. 반응혼합물은 37℃에서 24시간동안 배양했다. 0.01% 티메로살 함유 PBS액을 용출물로 사용한 수퍼덱스G200 (Pharmacia)컬럼을 통과시켜 유리 분획으로부터 결합체를 정제하였다. 칼럼에서 용출하는 분획을 워터즈 R403 시차굴절측정계상에서 또한 UV 분광계를 이용하여 280nm에서 관찰하였다. 결합체가 함유된 분획을 풀링하고, 0.22㎛ 마이크로포어막에 통과시켜 멸균여과한 후 4℃에서 저장했다. 폴리펩티드와 탄수화물 함량은 브래드포드 및 듀보이스방법으로 각각 측정했다. 그결과로 나온 결합체내 다당류함량은 약 30% 이었다.

파상풍 유독소 결합체를 대조군으로 사용하며 이것 역시 상술한 바와 같이 또한 다음과 같이 제조하였다: 파상풍 유독소(Serum Statens Institute)를 1차로 분자체컬럼(수퍼덱스 G-200, Pharmacia)에 통과시켜 모노머형의 유독소를 수득했다. 결합시키기 위해, 12mg의 모노머와 36mg의 PnC 14 다당류 단편을 pH7.2의 0.2M 인산염완충액 600㎕에 용해했다. 재결정처리된 소듐 시아노보로히드라이드(24mg)을 이 용액에 첨가한 후 다시 37℃에서 3일간 배양했다. 결합체를 상술한 바와 같이 정제했다. 결합체의 다당류 함량은 25-30% 정도의 범위이다. (표10 참조).

표 10.

파상풍-유독소 및 변형 뉴멀리신 제14형 결합체의 조성

담체 폴리펩티드	PS 의 근사분자량(MW)	폴리펩티드 (mg/ml)	PS (mg/ml)	결합체내 PS (%)
pNV103 #195 Phe-Val	9,000	0.170	0.079	32%
pNV207 #195 Phe-Ile	9,000	0.117	0.048	29%
pNV111 #148 Met-Lys	9,000	0,145	0.062	30%
pNV19 야생형	9,000	0.115	0.049	30%
파상풍Tm	9,000	0.245	0.098	28%

[실시예9]

변형 뉴멀리신 결합체의 면역화

Charles River Laboratories에서 구한 20 CD1 암컷생쥐군(생후 6-8주)를 0.01% 티메로살이 함유된 PBS 1ml 당 1mg 알루미늄원소의 농도로서 알루미늄(수산화알루미늄, Superfos, Denmark)에 흡착된 실시예8의 결합 다당류 2㎍를 피하주사하여 (S.C.) 면역시켰다. 0일, 28일 및 49일에 각각 백신을 투여하였다. 0일, 42일 및 59일에 각각 혈청을 수거하여 -70℃에서 저장했다.

ELISA.

마이크로타이터 플레이트(Nunc Polysorb ELISA 플레이트)는 PBS 중 100㎕의 제14형 다당류단편(MW ca: 10,000)/HSA결합체(2.5㎍/ml)를 첨가하여 감작시켰다. 플레이트를 밀봉하고 37℃에서 1시간동안 배양했다. 플레이트를 0.05% 트윈20(PBS-T) 이 함유된 PBS로 세척한 후 실온에서 1시간동안 PBS 중 0.5%(w/v) BSA 으로 블록처리했다. 웰에는 PBS-T플레이트의 100㎕ 씩의 2배 연속 희석액, 100㎕의 페록시다제 라벨화 염소 항-마우스 IgG(H+L) (Kirkegaard and Perry Laboratories) 을 충전하였고, 다시 PBS-T로 5회 세척했다. 마지막으로, 50㎕의 TMB 페록시다제 기질(Kirkegaard and Perry Laboratories)를 각 웰에 첨가하고 그 뒤 실온에서 10분간 플레이트를 배양한 후 1M H₃PO₄ 50㎕를 첨가하여 반응을 중단시켰다. 플레이트는 650nm이 기준파장인 몰레큘러 디바이스 아멕스 마이크로플레이트 판독기를 이용하여 450nm에서 판독하였다.

억제 ELISA 분석.

마이크로타이터 플레이트(NUNC Polysorp) 를 PBS (50mM인산나트륨, 150mM NaCl, pH7.4) 중 PLY(각 웰당 20ng/100㎕)로 1시간동안 37℃에서 피복하였다. 플레이트를 PBS + 0.05% 트윈20(PBST)로 세척한 후, 플레이트를 다시 150㎕의 PBS + 0.1% BSA로 후피복하고 재세척한 후 사용전까지 4℃에서 보관했다.

하이퍼이뮨 토끼 항-PLY는 PBST으로 희석되고 PLY피복 플레이트에 첨가하여 실온에서 1시간동안 배양했다. 세척후, 제조자의 지시에 따라 PBS 트윈에 희석된 100㎕의 염소 항-토끼 Ig-HRP 결합체 (KPL)를 각 웰에 첨가했다. 플레이트를 실온에서 1시간동안 배양한 후 다시 세척했다. 100㎕의 TMB 마이크로웰 기질(KPL)을 각 웰에 첨가했다. 반응은 TMB 1-성분 중단액(KPL)을 첨가하여 10분후 중단시키고 OD_450nm를 즉시 읽었다. 최대신호의 1/2 에 해당하는 희석액을 억제 연구를 위해 선택했다. PLYD 돌연변이체와 대조군인 PLY는 최종혼합물이 최대활성의 1/2을 갖는 희석액을 함유하고 또한 피복된 마이크로타이터 플레이트에 2 개씩 즉시 적용되도록, 희석시킨 토끼 항혈청을 함유하는 PBST내 3배희석된 성분에 연속 희석되었다. 플레이트는 실온으로 1시간동안 배양한 후 처리했다. 억제제가 없는 상태에서 희석 항혈청을 이용하여 얻어진 최대신호의 백분율로 억제율을 결정하였다.

결합체 항혈청의 옵소닌활성

PnC 제14형 결합체에 대한 생쥐 항혈청의 옵소닌활성은 인간 전골수구 백혈병 HL-60세포주(ATCC #CCL240)을 이용하는 시험관 내 옵소닌식세포 사멸분석에서 검사했다. (표11 참조). 요약하면, 200cfu의 PnC 제14형(12-8-95 CB) 세포를 동일부피의 연속 희석항체와 혼합한 후 5% CO₂ 배양기내에서 흔들면서 37℃의 온도로 15분간 배양했다. 90mM 디메틸포름아미드의 존재하에서 5일동안 배양한 HL-60세포(5 x 10⁵) 및 어린 토끼 보체를 혼합물에 첨가하고 그 뒤 흔들면서 1시간동안 37℃ 에서 배양했다. 분취물은 정량적배양을 위해 분리하여 초컬릿한천에 접종했다. 50%의 생박테리아에 대응하는 항체희석치를 외삽법으로 계산하여 역가를 결정하였다.
표 11.

삭제

PnC 제14형 다당류결합체의 면역성

담체 폴리펩티드	일별 ELISA 역가			일별 Op+ 역가	야생형 뉴멀리신에 대한 일별 ELISA 역가
	0	42	59	59	59
파상풍 유독소	<50	287,000	170,000	28,000	<50
pNV103 #195 Phe-Val	<50	209,000	178,000	18,000	124,000
pNV207 #195 Phe-Ile	<50	175,000	149,000	31,000	111,000
pNV111 #148 Met-Lys	<50	137,000	127,000	10,500	84,000
pNV19 야생형	<50	275,000	241,000	29,000	124,000
PBS	<50	<50	<50	<100
* PnC 제14형 다당류-특이항체 역가 + 옵소닌 식세포 역가

상기 표11에서 보는 바와 같이, 변형 뉴멀리신 결합체는 모두 보체 존재하에서 옵소닌식세포 활성을 갖는 항체를 발생시켰다. 강한 IgG 항-PS반응과 함께 상술한 결합체에 의해 면역화된 생쥐는 뉴멀리소이드담체에 대하여 결합체화 야생형 뉴멀리신에 대해 얻어진 바와 동일한 정도로 매우 큰 IgG 반응을 일으켰다.

삭제

[실시예10]

4가 6B/14/19F/23F 뉴멀리소이드 백신의 제조

결합체의 제조.

다당류 가수분해를 다음처럼 실시했다: 제6B형 PS는 60℃에서 3시간45분간 0.1N HCl로 탈중합시켰다; 제14형은 60℃에서 7시간동안 0.1N HCl로 탈중합시켰다; 제19F형은 70℃에서 2시간20분간 pH4.1의 10mM NaOAc 완충액으로 탈중합시켰다; 또한 제23F형은 100℃에서 30분간 0.2M 아세트산용액에서 탈중합시켰다.

산화된 제6B형 PS는 다음과 같이 제조하였다: 부분 탈중합된 PS(35mg)를 1750ml의 탈염수에 용해한 후 실온에서 2시간동안 어두운 곳에서 10mM NaIO₄ 250ml로 처리했다. 과량의 NaIO₄ 는 에틸렌글리콜로 제거하며 광범위한 투석후 산화된 PS를 동결건조했다. 산화된 제14형 PS는 제6B형과 마찬가지의 방법으로 제조했다. 산화된제19F형은 다음과 같이 제조하였다: 탈중합된 PS(50mg)를 pH7.5의 0.2M 인산나트륨완충액(5ml)에 용해한 후 4℃에서 하룻밤동안 어두운 곳에서 100mM NaIO₄ 41ml로 처리했다. 과량의 NaIO₄ 는 에틸렌글리콜로 제거하며 광범위한 투석후 산화된 제19F형 PS를 동결건조했다. 산화된 제23F형은 다음과 같이 제조하였다: 부분 탈중합된 PS(68mg)를 3.4ml의 3mM NaIO₄ 용액으로 어두운곳에서 1시간동안 실온에서 용해시켰다. 과량의 NaIO₄ 는 에틸렌글리콜 첨가로 제거하며 광범위한 투석후 산화된 PS를 동결건조했다.

산화된 PS는 각각 개별적으로 위치195의 아미노산 Phe 잔기가 Ile로 교체되는 재조합 뉴멀리소이드 돌연변이체 207에 결합되었다. 요약하면, 0.2M 인산염나트륨 완충액 중 단백질 (5mg/ml) 과 산화된 PS 를 PS/단백질비 약 2.5:1 의 중량비로서 실온하에 혼합하고 소듐 시아노보로히드라이드(2당량 중량)을 여기에 첨가했다. 결합혼합물을 37℃에서 2일간 배양했다. 결합체화 PS의 잔유 알데히드를 과량의 NaBH₄로 환원시킨 후, 결합체는 보존제로서 0.01% 티메로살을 함유한 PBS로 용출되는 수퍼덱스200PG (Pharmacia)컬럼을 통과시켜 반응혼합물로부터 정제분리되며 단, 결합체를 Q 세파로스 고속컬럼상에 로딩하고 0.5M NaCl 구배를 이용하여 pH7.5의 10mM 트리스-HCl로 용출되는 제23형 결합체의 경우는 제외된다. 결합체에 대응하는 분획을 모아 단백질과 탄수화물 함량에 대해 실시예8에서 설명한 바와 같이 분석하였다. (표12 참조).

표 12.

뉴멀리소이드 결합체의 조성

폐렴구균 혈청형	PS의 근사 MW	폴리펩티드 (mg/ml)	PS (mg/ml)	결합체내 PS (%)
6B	41,000	0.24	0.14	37
14	41,000	0.13	0.08	38
19F	10,000	0.46	0.14	23
23F	90,000	0.44	0.06	12

[실시예11]

뉴멀리소이드 4가백신의 면역화

생쥐의 면역화.

생후6주 내지 8주의 암컷 비근교계 CD-1생쥐 (Charles River, Raleigh)를 1가 혹은 4가 백신으로 면역화시켰다. 스트렙토코쿠스 뉴모니아 다당류 제6B형, 14형, 19형 및 제23형은 1mg/ml 1 알럼 중 파상풍 유독소 혹은 뉴멀리신 돌연변이체에 결합되었다 (0.5㎍ PS/0.2ml 내지 2㎍ PS/0.2ml). 백신을 0일, 28일 및 49일에 각각 피하주사하고 혈액시료를 0일, 14일, 28일, 38일 및 59일에 각각 취하였다. 다당류와 담체단백질에 대한 ELISA 역가는 HSA-PS 결합체 및 야생형 뉴멀리신을 사용하여 각각 측정하였다 (도 8, 9 및 10 참조). 혈청의 옵소닌 활성은 실시예9에서와 같이 HL-60 세포주를 이용하여 식세포분석에서 측정하였다 (도11 참조).

용혈분석.

일부 변형된 Paton et al.(1993) Infect. Immun. 40:548의 방법에 따라 뉴멀리신 활성을 평가했다. 요약하면, 표준 U-바닥형 마이크로타이터 플레이트에서 야생형 및 돌연변이체 뉴멀리신 단백질을 TBS(15mM트리스, 0.15M NaCl, pH7.5)와 보조인자인 1mM DTT 중에서 2배씩 연속 희석하여 최종 100㎕의 부피로 만들었다. TBS 중 1% 양 적혈구현탁액 100㎕을 첨가하고 37℃에서 30분간 반응을 실행하였다. 용해되지않은 세포를 회전에 의해 침전시킨 후, 마이크로타이터 플레이트 판독기를 이용하여 405nm에서 상청액 중 적혈구용해량을 관찰하였다. 저장성 용해된 0.5% 세포 현탁액을 기초하여 분석의 종말점을 적혈구의 50%가 용해된 웰로 취하였다.

뮤린 항혈청의 용혈억제력 분석.

일부 변형된 Paton et al.(1993) Infect. Immun. 40:548의 방법에 따라 용혈활성 억제력을 분석했다. 희석전, 생쥐의 항혈청을 클로로포름으로 2회 처리하여 콜레스테롤을 제거했다. 50㎕의 생쥐 항혈청을 2배씩 연속 희석하고 4HU(용혈유닛)의 독소원료액을 50㎕ 첨가했다. 독소의 용혈 활성을 중화반응 분석직전에 평가했다. 37℃에서 15분간 배양하여 혈청항체를 뉴멀리신에 결합시킨 후, 100㎕의 양 적혈구(TBS 중 1%) (ICN, Costa Mesa, CA) 를 각 웰에 첨가했다. 플레이트는 37℃에서 30분간 배양하고 용해되지않은 세포는 원심분리로 펠릿화했다. 상청액에 방출된 적혈구 용해량을 마이크로타이터 플레이트 판독기로 405nm에서 관찰했다. 항체 역가를 용혈 완전억제를 가져온 혈청의 최고 희석치로 취했다 (도12).

변형 뉴멀리신에 의한 용혈억제력 분석

변형 뉴멀리신 폴리펩티드는 적혈구와 사전배양된 때의 야생형 뉴멀리신의 용혈활성을 억제하는 능력에 대해 시험할 수 있다. 적혈구 현탁액(3ml)을 10분간 1㎕(1mg/ml)의 변형 뉴멀리신 폴리펩티드 각각과 배양하고 현탁액을 야생형 뉴멀리신의 연속 희석물을 함유한 마이크로타이터 플레이트의 웰에 첨가했다. 플레이트는 37℃에서 30분간 배양하고 용혈역가를 정상 적혈구로 실행한 대조배양과 비교하였다. 선별된 돌연변이체는 적혈구와 사전배양시 야생형 용혈활성의 다양한 억제율을 보여주어 (도13), 이들 돌연변이체가 결합위치에서 야생형과 경합할 수 있으나 막에 삽입되어 용해채널을 형성하기는 불가능함을 시사하였다. 돌연변이체 pNV103 및 pNV207은 가장 효과적인 억제제를 나타내며 pNV111가 그 다음이다. 돌연변이체 pNV211은 억제 특성을 현저히 나타내지않는다. PLYD 돌연변이체의 구조통합성 및 동일성은 또한 이들의 항원성 대부분이 천연PLY과 비교할 때 도14에서 보는 바와 같이 그대로 유지된다는 사실에서 확증할 수 있다.

원형이색성(CD) 분광측정

유리 야생형 및 돌연변이체 뉴멀리신과 각각의 결합체의 2차 및 3차 구조를 원거리UV(180 내지 250nm) 및 근거리UV(250 내지 350nm) 영역에서 각각 원형이색성(CD) 분광측정으로 평가했다. 단백질 농축원액을 10mM NaPO₄ (pH8.0)으로된 완충액체계에 대해 투석하였다. 1.0mg/ml 단백질을 함유하는 시료의 스펙트럼은 스캔속도 5nm/분 및 평균 반응시간 1초의 JASCO 모델710 원형이색성 분광극성계(JASCO, Easton, MD)에서 0.1nm파장간격으로 기록했다. 최소 4연속스캔을 축적하고 그 평균스펙트럼을 저장했다. 시료의 온도는 각각 원거리 및 근거리 UV내의 워터재킷을 씌운 0.01cm 및 1.0cm 의 경로길이 셀을 사용하여 25℃로 유지하였다.

형광 분광측정

형광측정은 SLM AMINCO-Bowman 8100 시리즈 2 분광형광계에서 실행되었다. 10mM NaPO₄(pH7.5) 중 100㎍/ml 단백질을 포함하는 시료의 형광스펙트럼은 290nm 의 여기파장 및 2nm의 슬릿폭을 이용하여 300 내지 500nm 범위에서 기록했다. 온도안정성은 25℃로 온도를 맞춘 워터재킷을 씌운 1.0cm 석영 큐벳을 사용하여 유지했다.

야생형 뉴멀리신과 선별된 돌연변이체의 형광스펙트럼은 이들 단백질이 천연 폴드 구조를 취하는 실험조건하에서 비교했다. 도15에서 증명된 바와 같이, 전체 단백질의 형광스펙트럼은 ∼345nm에서 최대방출강도를 갖고 야생형과 비교할 때 돌연변이 단백질에 대해 관찰된 것보다 다소 높은 크기를 갖는 것을 특징으로한다. 전체적으로, 이 결과는 단백질 전체가 대다수의 Trp 잔기가 용매에 노출되는 것을 특징으로 하는 자연구조임을 나타낸다. 이러한 결과는, 페르프린골리신에 대해 미리 관찰되었으며, 사이토리신의 C-말단에서 Trp-풍부한 세포결합영역의 존재와 일치하는 것이다.

원형이색성으로 분석된 뉴멀리신(PLY), 뉴멀리소이드(PLYD) 또한 CPS-PLYD 결합체의 기본 구조 및 면역적 특징.

대장균에 과다발현되고 또한 봉입체로부터 재폴드된 PLY는 고함량 β-시이트의 전형적인 원거리 UV CD 스펙트럼을 나타내며 또한 단일점 돌연변이 PLYD의 현저한 변화가 없는 ~215nm (Minetti et al. Bilphys. J., 1998, 74, A233)에서는 거의 관찰되지않았다. 마찬가지로, PnCPS와 PLY나 PLYD의 화학적결합은 단백질의 전체 2차구조에 영향을 미치지않는다 (도 16A). 티로실 및 트립토파닐 잔기의 단백질내 상대적 비대칭성으로 인해 유발된 근거리 UV CD 스펙트럼 (도 16B) 역시 유리형 대 결합체 단백질에서 평가되었으며 야생형 유리 단백질을 모방하는 고차원구조를 보여준다. 그러나 결합체는 이들 복합체의 표면에 다당류가 존재하는 결과에 따른 근거리 UV CD 프로파일의 부수적인 변화를 나타내며 특히 각 결합체에서 특정 Tyr신호 (280nm에 최소중심을 가진 음성 타원형)와의 간섭이 감소한다. PLYD 돌연변이체의 구조통합성 및 동일성은 또한 도 14에서 보는 바와 같이 천연 PLY와 비교할 때 이들의 항원성을 대부분 유지하는 것에서 확증할 수 있다.

분광측정법은 단백질의 통합성을 평가하는데 효과적이다. 특히, 담체로 단백질을 사용하는 결합체 백신의 경우, 이 방법은 기능적 및 면역학적 기술과 더불어 뱃치-뱃치 변화 및 백신효과의 분자기초 관찰을 용이하게 할 수 있다 (Crane et al. Eur. J. Biochem. 1997. 246, 320-327; Jones et al. Dev. Biol. Stand. 1996, 87. 143-151). 돌연변이는 단백질을 무독성을 만들지만, 모계분자와 유사하게 천연 구조로 재폴드하는 능력은 유지하고 있다. 진폭과 교차점 모두에서 보이듯이, 유리 돌연변이체 단백질 (pNV207) 과 대응하는 Pn 제14형 결합체의 거의 중복되는 원거리 UV CD 스펙트럼은 이 거대분자 복합체 내에서 단백질의 2 차 구조가 본래의 형태를 유지하는 것을 시사한다. 이 결과는 결합 후 2차구조내 작은 변형이 현저한 다른 다당류 단백질 결합체에 대해 수행된 기존의 연구와는 대조적인 것이다 (Crane et al., Eur. J. Biochem. 1997, 246, 320-327).

결합위치에 근접한 티로실잔기는 280nm 근처의 근거리 UV CD 스펙트럼내에서 발견되는 차이로 알 수 있듯이 다당류의 존재 때문에 교란된다. 그러나, 트립토파닐 피크는 290nm에서 나타나며 결합에 의해 영향받지않은 상태로 남아서, Tyr 함유부위가 환원형 아민화 절차에서 영향받지 않음을 가리킨다.

혈청학적 결과와 함께 분광학적 결과는 PLYD-CPS 결합체가 폐렴구균형 질환의 예방을 위한 적절한 백신대상체임을 나타내는 탁월한 증거를 제공해준다.

경시적 면역성 연구.

4가 PLYD-PnCPS에 대한 경시적 면역성 연구를 수행하였으며 그 결과는 도17a와 같다. 0일, 28일 및 49일에 3 회 주사한 동물로부터 0일, 14일, 28일, 38일 및 59일에 혈액시료를 얻었다. 각각의 투여물에는 각 종류의 0.5㎍의 PnCPS가 함유되었다. 이에 대한 PnCPS-특이 IgG 반응은 2차주사후 시간에 따라 피크까지 증가했으며 (역가범위는 20,000 내지 50,000) 또한 그 뒤 평형에 도달하였다. 2차주사후 현저히 큰 추가자극효과가 나타났다.

도17b에서는 4가 TT 결합체의 PnCPS-특이 IgG 반응의 시간경과에 따른 변화를 보여준다. PLYD 복합백신과 유사하게 동물에 대해 동일한 절차와 약량의 백신을 사용하여 유사한 면역처리를 했다. 다시 제23F형 의 경우만 역가를 현저히 낮춘것(ca: 5,000)을 제외하고, 각 다당류에 대한 IgG 반응은 각각의 주사후 유사한 역가크기(최종역가 50,000 내지 200,000)로 증가하였다. 역시 2차주사후 각 종류에 대해 추가자극효과도 관찰되었으며 제23형만 훨씬 작은 효과를 나타낸 것만 예외였다.

상술한 PLYD-PnCPS 복합백신과 비교하여, 1가 PLYD-PnCPS 결합체의 경시적 면역성을 도17c에서 보여준다. 동물에는 동일한 0.5㎍의 PnCPS 약량을 투여하고 상술한 것과 유사한 면역과정을 거쳤다. 이러한 1가 결합체에서 PnCPS 에 대한 IgG 반응의 시간변화는, 시간변화곡선이 완만하게 나타나고 또한 다른 3가지 종류보다 항체역가의 크기차수가 낮은 제23형 PnCPS의 경우를 제외하고, 복합물에 대해 관찰된 것과 거의 동일하였다.

사전실험결과에서 4개의 폐렴구균 균주로부터 유도된 다당류(6, 14, 19 및 23)와 또한 PLYD로 구성된 결합체가 동물에 고면역성을 제공하고 또한 TT 4가 결합체에 의해 얻어진 것에 상당하는 PnCPS-특이항체역가를 일으킴을 보여준다. 또한, PLYD 4가 결합체는 야생형 PLY의 용혈 활성을 중화하는 고레벨 PLY-특이 IgG 항체를 생성할 수 있었다. 폐렴구균성 실험 수막염 모델에서 청각상실 및 와우각손상에 있어서 PLY의 뚜렷한 병원성역할에 대해 최근 발표된 보고서에 따르면, PLYD 백신유도항체는 중이염에 관련된 합병증을 완화하거나 예방하기 위한 캡슐형 항체에 바람직한 보조물임이 뚜렷하다 (Winter et al. Infection and Immunity 1997, 65, 4411-4418).

[서열목록]

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생물명: 스트렙토코쿠스 뉴모니아(S. pneumoniae)

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토폴로지: 선형

분자의 타입: DNA

기원:

생물명: 스트렙토코쿠스 뉴모니아(S. pneumoniae)

[서열 13]

서열번호: 14

서열의 길이: 38

서열의 타입: 핵산

쇄의 수: 1본쇄

토폴로지: 선형

분자의 타입: DNA

기원:

생물명: 스트렙토코쿠스 뉴모니아(S. pneumoniae)

[서열 14]

서열번호: 15

서열의 길이: 39

서열의 타입: 핵산

쇄의 수: 1본쇄

토폴로지: 선형

분자의 타입: DNA

기원:

생물명: 스트렙토코쿠스 뉴모니아(S. pneumoniae)

[서열 15]

서열번호: 16

서열의 길이: 39

서열의 타입: 핵산

쇄의 수: 1본쇄

토폴로지: 선형

분자의 타입: DNA

기원:

생물명: 스트렙토코쿠스 뉴모니아(S. pneumoniae)

[서열 16]

서열번호: 17

서열의 길이: 39

서열의 타입: 핵산

쇄의 수: 1본쇄

토폴로지: 선형

분자의 타입: DNA

기원:

생물명: 스트렙토코쿠스 뉴모니아(S. pneumoniae)

[서열 17]

서열번호: 18

서열의 길이: 39

서열의 타입: 핵산

쇄의 수: 1본쇄

토폴로지: 선형

분자의 타입: DNA

기원:

생물명: 스트렙토코쿠스 뉴모니아(S. pneumoniae)

[서열 18]

Claims

삭제
[서열 3] 의 아미노산 서열을 가지는 야생형 뉴멀리신 폴리펩티드에 하나 이상의 아미노산 치환을 가지는 변형 뉴멀리신 폴리펩티드에 있어서,

하나 이상의 아미노산 치환은 위치 61, 148 및 195 로 이루어진 군으로부터 선택되는 위치에서 일어나거나, 또는 둘 이상의 아미노산 치환이 일어나는 경우 상기 치환은 위치 17, 18, 33, 41, 45, 46, 61, 63, 66, 83, 101, 102, 128, 148, 189, 195, 239, 243, 255 및 257 로 이루어진 군으로부터 선택되는 위치에서 일어나며, 상기 변형 뉴멀리신 폴리펩티드는 가용성으로, 야생형 뉴멀리신과 교차반응하는 항체를 생성시키며, 약화된 용혈활성을 가지는 것을 특징으로 하는 변형 뉴멀리신 폴리펩티드.
제 2 항에 있어서,

상기 용혈활성은 야생형 뉴멀리신의 용혈활성과 비교하여 0.2% 내지 25% 인 것을 특징으로 하는 변형 뉴멀리신 폴리펩티드.
제 2 항에 있어서,

[서열 3] 의 아미노산 서열 중에 잔기 위치 61, 148 또는 195 에서 하나 이상의 아미노산 치환을 가지거나, 또는 [서열 3] 의 아미노산 서열 중에 잔기 위치 33, 46, 83, 239 및 257 에 아미노산 치환들을 가지는 것을 특징으로 하는 변형 뉴멀리신 폴리펩티드.
제 2 항에 있어서,

상기 치환된 아미노산이 위치 61 에서는 프롤린이나 히드록시프롤린으로 구성된 군에서 선택되고; 위치 148 에서는 라이신, 아르기닌 혹은 히스티딘으로 구성된 군에서 선택되고; 또한 위치 195 에서는 로이신, 글리신, 알라닌, 이소로이신 혹은 발린으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 변형 뉴멀리신 폴리펩티드.
제 2 항에 있어서,

상기 치환된 아미노산이 위치 33, 46 및 83 에서는 세린, 트레오닌, 아스파라긴, 글루타민, 티로신 혹은 시스틴으로 구성된 군에서 선택되고; 위치 239 에서는 라이신, 아르기닌 혹은 히스티딘으로 구성된 군에서 선택되고; 또한 위치 255 에서는 로이신, 글리신, 알라닌, 이소로이신 혹은 발린으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 변형 뉴멀리신 폴리펩티드.
[서열 3] 의 아미노산 서열을 가지며, 위치 17 은 Arg, 위치 18 은 Asn, 위치 61 은 Pro, 위치 66 은 Tyr, 및 위치 101 은 Thr 인 것을 특징으로 하는 변형 뉴멀리신 폴리펩티드.
[서열 3] 의 아미노산 서열을 가지며, 위치 63 은 Ser, 위치 127 은 Glu, 위치 128 은 His, 및 위치 148 은 Lys 인 것을 특징으로 하는 변형 뉴멀리신 폴리펩티드.
[서열 3] 의 아미노산 서열을 가지며, 위치 33 은 Thr, 위치 46 은 Thr, 위치 83 은 Ser, 위치 239 는 Arg, 및 위치 257 은 Gly 인 것을 특징으로 하는 변형 뉴멀리신 폴리펩티드.
[서열 3] 의 아미노산 서열을 가지며, 위치 41 은 Gly, 위치 172 는 Ala, 위치 195 는 Ile, 및 위치 255 는 Gly 인 것을 특징으로 하는 변형 뉴멀리신 폴리펩티드.
[서열 3] 의 아미노산 서열을 가지며, 위치 45 는 Ala, 위치 102 는 Gly, 위치 189 는 Arg, 및 위치 195 는 Val 인 것을 특징으로 하는 변형 뉴멀리신 폴리펩티드.
[서열 3] 의 아미노산 서열을 가지며, 위치 195 는 Val 인 것을 특징으로 하는 변형 뉴멀리신 폴리펩티드.
[서열 3] 의 아미노산 서열을 가지며, 위치 195 는 Ile 인 것을 특징으로 하는 변형 뉴멀리신 폴리펩티드.
[서열 3] 의 아미노산 서열을 가지며, 위치 148 은 Lys 인 것을 특징으로 하는 변형 뉴멀리신 폴리펩티드.
[서열 3] 의 아미노산 서열을 가지며, 위치 61 은 Pro 인 것을 특징으로 하는 변형 뉴멀리신 폴리펩티드.
제 2 항 내지 제 15 항 중 어느 한 항에 따른 변형 뉴멀리신 폴리펩티드를 코딩하는 서열을 가지는 재조합 핵산 분자.
[서열 1] 에 기재된 뉴멀리신 핵산 서열을 가지며,

상기 핵산 서열은

A-50→G, G-54→T, T-181→C, A-196→T 및 T-302→C;

A-122→G, A-514→G, T-583→A 및 A-764→G;

A-187→T, T-380→A, A-382→C 및 T-443→A;

T-98→C, T-137→C, T-248→C, T-717→A 및 A-770→G; 또는

T-134→C, A-305→G, A-566→G 및 T-583→G 로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 뉴클레오티드 치환을 가지는 것을 특징으로 하는 재조합 핵산 분자.
[서열 1] 의 서열을 가지는 재조합 핵산 분자에 있어서, T-583→G 의 핵산 치환을 더 가지는 것을 특징으로 하는 재조합 핵산 분자.
[서열 1] 의 서열을 가지는 재조합 핵산 분자에 있어서, T-583→A 의 핵산 치환을 더 가지는 것을 특징으로 하는 재조합 핵산 분자.
[서열 1] 의 서열을 가지는 재조합 핵산 분자에 있어서, T-443→A 의 핵산 치환을 더 가지는 것을 특징으로 하는 재조합 핵산 분자.
[서열 1] 의 서열을 가지는 재조합 핵산 분자에 있어서, T-181→C 의 핵산 치환을 더 가지는 것을 특징으로 하는 재조합 핵산 분자.
제 16 항에 있어서,

플라스미드, 코스미드, 박테리오파지 혹은 이스트 인공염색체와 같은 벡터에 함유되어 있는 것을 특징으로 하는 재조합 핵산 분자.
제 16 항의 핵산 분자를 포함하는 미생물.
제 23 항에 있어서,

상기 미생물은 박테리아, 이스트, 포유동물 세포 혹은 곤충 세포로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 미생물.
제 23 항에 있어서,

상기 미생물이 대장균 (E. coli) 인 것을 특징으로 하는 미생물.
제 2 항 내지 제 15 항 중 어느 한 항에 있어서,

상기 폴리펩티드가 박테리아성 다당류와 결합되며, 상기 박테리아성 다당류는 헤모필루스 인플루엔자 b형; 수막염구균 A군, B군 혹은 C군; B군 스트렙토코쿠스 제Ia형, Ib형, II형, III형, V형 혹은 VIII형 및 폐렴구균으로 구성된 군에서 선택된 박테리아로부터 유래하는 것을 특징으로 하는 변형 뉴멀리신 폴리펩티드.
삭제
제 2 항 내지 제 15 항의 폴리펩티드 하나 이상과 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 백신.
제 28 항에 있어서,

상기 폴리펩티드가 박테리아성 다당류에 결합되며, 상기 박테리아성 다당류는 헤모필루스 인플루엔자 b형; 수막염구균 A군, B군 혹은 C군; A군 스트렙토코쿠스 혹은 B군 스트렙토코쿠스 혈청타입 제Ia형, Ib형, II형, III형, V형 혹은 VIII형; 또는 스트렙토코쿠스 뉴모니아의 혈청타입 1-23 중의 하나 이상으로 구성된 군에서 선택된 것을 특징으로 하는 백신.
삭제
제 28 항에 있어서,

보체의 존재하에서 변형 뉴멀리신을 포함하는 면역분자에 대한 항체에 박테리아를 접촉시키는 것을 포함하는, 박테리아를 제거하는데 사용되는 것을 특징으로 하는 백신.
제 31 항에 있어서,

상기 면역분자는 다당류-폴리펩티드 결합체이며, 상기 다당류는 박테리아성 캡슐형 다당류인 것을 특징으로 하는 백신.
제 28 항에 있어서,

포유동물에게 투여하는 것을 포함하는, 포유동물을 면역화시키기 위해 사용되는 백신.
약화된 용혈활성을 가지며 또한 야생형 뉴멀리신과 교차반응하는 면역반응을 일으키기에 적합한, 제 2 항의 변형 뉴멀리신 폴리펩티드를 수득하는 방법에 있어서,

(a) 야생형 뉴멀리신을 코딩하는 핵산 분자를 무작위 돌연변이시켜 변형 뉴멀리신 폴리펩티드를 코딩하는 돌연변이된 핵산 분자를 생성하고, 돌연변이된 핵산 분자를 숙주세포에서 발현시키는 단계;

(b) 숙주세포에서 발현된 변형 폴리펩티드를 용혈활성에 대해 분석하는 단계; 및

(c) 천연 야생형 뉴멀리신과 사실상 유사한 분자량을 가지며 재폴드화될 수 있는 제 2 항의 변형 뉴멀리신 폴리펩티드를 동정하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 변형 뉴멀리신 폴리펩티드의 수득방법.