CZ2000106A3 - Modifikovaný pneumolysinový polypeptid mající zeslabenou hemolytickou aktivitu a způsob jeho přípravy - Google Patents

Abstract

Modifikované pneumolysinové polypeptidy, jejichž aminokyselinová sekvence je na obr., které si zachovávají imunogenní přirozenost pneumolysinu, ale mají redukovanou nebo nedetegovatelnou hemolytickou aktivitu ve srovnání s nativním pneumolysinem. Metoda pro tvorbu nových pneumolysinových variant s těmito žádanými charakteristickými vlastnostmi. Imunogenní prostředky použitelné jako farmaceutické prostředky, obsažené ve vakcínách, ve kterých je netoxický modifikovaný pneumolysin použit ke stimulaci ochranné imunity proti Streptococcus pneumoniae. Vakcíny mohou být prostředky, ve kterých je modifikovaný pneumolysin v konjugaci s bakteriálními polysacharidy nebo může být nesen oslabeným virovým vektorem. Metoda pro použití netoxického, modifikovaného pneumolysinového toxoidu ke stimulaci protilátek proti Streptococcus pneumoniae v ošetřených individuích, které jsou potom izolovány a transferovány do jiných individuí, čímž jim udělují ochranu proti Streptococcus pneumoniae.

Description

Modifikovaný pneumolysinový polypeptid mající zeslabenou hemolytickou aktivitu a způsob jeho přípravy.

OBLAST TECHNIKY

Tento vynález se týká vakcín a částečně metod produkce modifikovaných forem pneumolysinu a jejich využití v produkci prostředků pro imunizaci savců proti infekcím způsobených bakteriemi zahrnující Streptococcus pneumoniae.

DOSAVADNÍ STAV TECHNIKY

Streptococcus pneumoniae je hlavní původce bakteriální pneumonie, bakteriemií, meningitid a zánětů uší (Baltimore et al. in Bacterial infections of humans: Epidemiology and control Evans and Brachman eds, Plenům Press, New York, 1989 pp. 525-546; Schuchat et. al. N. Engl. J. Med. 1997, 337, 970-976). I přes vhodnou antibiotikovou terapii měly pneumokokální infekce doposud za následek odhadem asi 40 000 úmrtí za rok ve Spojených státech (Fedson et al. Archives of Intemal medicine 1994, 154, 2531-2535; Fiebach et al. Archives of Intemal Medicine 1994, 154, 2545-2557). Dále pneumokoky zaznamenaly zvýšení rezistence k penicilinu a jiným antibiotikům způsobenou vývojem efektivních vakcín k prevenci pneumokokových infekcí veřejnou vakcinací (Farr et al. Archives of Intemal Medicine 1995, 155, 2336-2340). Protože je běžná 23-valentní pneumokokální kapslová póly sacharidová vakcína efektivní pro děti mladší než dva roky (Douglas et al. J. Infect. Dis. 1983, 148, 131-137; Leinonen et al. Pediatrie Infectious Disease Journal 1986, 5, 39-44), četné skupiny vyvíjí multivalentní konjugované vakcíny k prevenci ušních zánětů, hlavní indikaci v této věkové skupině.

Pneumolysin (PLY), sulíýdryl-aktivovaný cytolytický toxin, je produkovaný všemi typy Streptococcus pneumoniae (Kanclerski et al. J. Clin. Microbiol. 1987, 25, 222-225) a je hlavním virulentním faktorem v pneumokokové infekci (Boulnois Journal of General Microbiology 1992, 138, 249-259). Geneticky zkonstruované PLY-negativní mutantní kmeny Streptococcus pneumoniae vykazovaly významně menší virulenci u myší (Berry et al. Microb. Pathog. 1992, 12, 87-93; Berry et al. Infection and Immunity 1989, 57, 2037-2042). Cytotoxicita PLY k plicním endotheliálním a epiteliálním buňkám je dobře demonstrovatelná in vitro (Rubins et al. Infection and Immmunity 1992, 60, 1740-1746). Dále mohou PLY být hlavní příčinou ztráty • · « · • · · · ·· · ···· ··· 4 9 9 ···« * · ··· * e · · ·· · • · · 9 · · · · · 3 · ···· ·· · 4 «· «· · · sluchu a poškození sluchového ústrojí u guineiských prasat, modelů pneumokokálních meningitid (Winter et al. Infection and Immunity 1997, 65, 4411-4418).

Jako v roce 1985 bylo ve vyspělých zemích ročně odhadnuto pět úmrtí na pneumonii způsobenou Streptoeoccus pneumoniae na pět miliónů dětí tohoto věku. Lancet (1985) Sep. 28 2 (8457) .699-701. Streptoeoccus pneumoniae má četné virulentní faktory ke stabilizaci počáteční infekce a k vyvolání invazní nemoci. K prevenci systémových infekcí způsobených různými sérovými typy Streptoeoccus pneumonia jsou potřebné imunizace dětí a dospělých vhodnými konjugovanými reaktivními vakcínami schopnými vyvolat ochrannou, efektivní a dlouhodobou imunitu.

V prospektivním studiu kolonizace a infekce u dětí bylo popsáno, že pneumokokální sérotypy 6, 14, 19 a 23 jsou nejčastěji přenášeny a jsou nejčastější příčinnou infekce u dětí, zejména zánětů uší (Gray et al. J. Infect. Dis., 1988, 158, 948-955). Dále bylo již dříve objeveno, že ty samé kmeny jsou častěji objevovány mezi k penicilinu rezistentními klinickými izoláty (Nesin et al. J. Infect. Dis., 1998, 177, 707-713). Klinické studie uskutečněné u malých dětí s tetravalentní pneumokokální konjugovanou vakcínou obsahující výše uvedené typy přinášejí zprávu o redukci přenosu k vakcině příbuzných kmenů (Dagan et al. Infect. Dis. J., 1997, 16, 1060-1064).

Téměř všechny izoláty Streptoeoccus pneumoniae mají vnější kapsulu tvořenou repetitivními oligosacharidy. Antigenní rozdíly v kapsulárních polysacharidech způsobené rozdílnými sacharidovými sekvencemi jsou předznačeny rozdílnými Streptoeoccus pneumoniae sérotypy. Sérotypově specifické kapsulární polysacharidy jsou hlavními nositeli virulence pneumokoků. Existující antipneumokokální vakcíny jsou vytvořeny z 23 kapsulárních polysacharidů vybraných z 84 sérologicky odlišných běžně známých typů. Bohužel tyto vakcíny nejsou efektivní u všech populací, speciálně tyto v Asii. Druhý nedostatek běžných vakcín je, že polysacharidy jsou sami o sobě špatnými imunogeny speciálně pro děti a postarší.

Polysacharidy exprimované Streptoeoccus pneumoniae hrají také významnou patogenní roly. Některými definovanými polypeptidy, u kterých bylo objeveno, že přispívají k virulenci tohoto organismu, jsou pneumolysin, autolysin, neuroamidasa, pneumokokální povrchový polypeptid A (PspA), 37 kDa polypeptid, adhesní molekuly, hyauronidasa a IgAl proteasa.

Skutečně všechny sérotypy Streptoeoccus pneumoniae produkují pneumolysin, jeden s hlavních virulentních faktorů. Tato exprese různými Streptoeoccus pneumoniae sérotypy dělá pneumolysin hlavním kandidátem k využití v ochranné vakcině proti pneumokokálním infekcím zapříčiněným jeho toxicitou, která může být změněna.

Pneumolysin je íntracelulární bakteriální polypeptid s molekulovou hmotností asi 53 kDa. (Kanclerski et al.(1987) J. Clin. Microbiol. 25: 222-225). Je členem rodiny thiolem aktivovaných • · ·· ·· * · 4 4 4 · • · · 4 4 4 * · · · · • · · 4 4 · 4 4 4 »

4 444 4 44« ·· 4

44 4444 4 4 4 4

4444 44 44 44 4« ♦ · hemolysinů a má různé efekty na eukaryotické buňky. Pneumolysin je známý navázáním na cholesterolové molekuly v eukaryotické membráně, formuje oligomery a tvoří transmembránové póry. Bylo také prokázáno, že jsou všechny, respirace, chemotaxické a fagocytické funkce polymorfonukleárních leukocytů krajně důležité pro odstranění pneumokokové invaze a jsou vážně paralyzovány přítomností pneumolysinu.

Pneumolysin způsobuje cytolytické a cytotoxické efekty a může stimulovat zánětlivé odezvy jako doplněk aktivované cesty. Nespecifická aktivace doplňků způsobuje vyčerpání doplňkových polypeptidů a tvoří nespecifické záněty.

Inokulace pneumolysinu do plic pokusných zvířat způsobuje pneumoniové symptomy. Avšak předcházející preimunizace pneumolysinem ochraňuje zvířata při napadení pneumokoky. Paton et al. (1983) Infect. Immun. 40: 548-552.

Protože pneumolysinová imunogení aktivita a funkce vyvolat ochrannou odpověď v individuích jím imunizovaných, bylo navrženo užití pneumolysinu jako složky vakcíny. Uvedeno v PCT/AU89/00539. Avšak před tím než může být pneumolysin zahrnut do vakcín pro lidské použití, musí být tento toxin modifikován tak, aby byl v podstatě netoxický a zachoval si schopnost vyvolat ochranné protilátky.

Modifikované pneumolysiny zbavené toxických aktivit jsou upraveny na základě identifikace aminokyseliných regionů pneumolysinu, a přesto mají podobnou funkci tvořit thiol obsahující polypeptidy. (WO 90/06951). Popsané mutace jsou výhradně na C-konci polypeptidu a jsou provedeny použitím náhodných mutagenních technik. Jiné mutace zahrnující určité specifické aminokyseliny na N-konci způsobují redukci hemolytické aktivity. Nej významnější popsaná možná redukce v hemolytické aktivitě je histidinová modifikace v poloze 156. Hill et al. (1994) Infection and Immunity, 62, 757-758. Žádná data ve věci substituovaných pneumolysinů neříkají jestli všechny byly důkladně zavinuty. Jednoduchá mutace Thr-172-Mle byla popsána jako možná pro pneumolysin s redukovanou hemolytickou aktivitou. Avšak anomální elektroforetická mobilita ukazuje, že protein je nesprávně zavinut. Uvedeno v Microb. Pathog. (1996) 21, 71-83.

PODSTATA VYNÁLEZU

Tento vynález poskytuje novou metodu pro tvorbu a identifikaci stabilních, geneticky modifikovaných, značně netoxických, imunogeních, pneumolysinových polypeptidů použitím náhodných PCR mutagenezí. Modifikované pneumolysiny (pneumolysoid), které mohou být využity jako imunogeny ve vakcině nebo mohou být využity jako imunogenitu nesoucí polypeptidy pro polysacharidové kombinované vakcíny proti S. pneumoniae nebo jiným bakteriálním infekcím jsou také poskytovány. Modifikované pneumolysinové polypeptidy tohoto vynálezu, zatímco vykazují značně redukovanou nebo úplně vyřazenou toxickou aktivitu toxinů, vyvolají protilátky, které reagují s polypeptidy nativního toxinu.

Tento vynález se také týká sekvencí nukleových kyselin kódujících modifikované pneumolysiny, vektorů nesoucích tyto sekvence, stejně tak jako transformovaných hostitelských buněk, které jsou schopné exprimovat molekuly nukleových kyselin tohoto vynálezu.

Jinými případy tohoto vynálezu jsou polysacharidové - polypeptidové konjugované molekuly, ve kterých je modifikovaný pneumolysin tohoto vynálezu kovalentně párován s bakteriálními polysacharidy ve formě konjugátů. Takové konjugované molekuly jsou užitečné jako imunogeny pro vyvolání na T-buňce závislé imunogenní odpovědi namířené proti bakteriálním polysacharidovým konjugátům s modifikovaným pneumolysinem.

Tento vynález také směřuje k farmaceutickým skladbám obsahujícím modifikované pneumolysinové polypeptidy tohoto vynálezu, které vyvolají imunitní odpověď.

Tento vynález se také týká metod vyvolání produkce protilátek reaktivních s modifikovanými pneumolysinovými polypeptidy. Takové protilátky mohou být užity k vyvolání pasivní a aktivní imunity. Modifikované pneumolysiny tohoto vynálezu mohou být také využity k identifikaci a izolaci reaktivních protilátek. Objektem tohoto vynálezu je tudíž poskytnout geneticky stabilní modifikované S.pneumoniae pneumolysinové polypeptidy, které jsou značně zeslabeny nebo zbaveny toxicity, zatímco stimulují epitopy, které způsobují produkci protilátek a také váží nativní toxinovou molekulu.

Objektem tohoto vynálezu je také poskytnout metodu pro tvorbu geneticky modifikovaných pneumolysinů (pneumolysoidů).

Objektem vynálezu je také poskytnout vakcínové preparáty skládající se z modifikovaného pneumolysinového polypeptidu, který může vyvolat protilátky a indukovat ochrannou imunitu proti ď. pneumoniae, když budou podány vnímavému savci. Takové vakcíny mohou být založeny na samotném pneumolysinu nebo na konjugátech, které se skládají z jednoho nebo více bakteriálních polysacharidů kovalentně se vážících na modifikovaný pneumolysinový polypeptid tohoto vynálezu.

Pneumolysin byl skutečně nalezen u všech známých kmenů S .pneumoniae. Jeho široké rozšíření poskytuje schopnost obdržet důkladnou ochranu společně s různými sérotypy 5. pneumoniae. Tento vynález poskytuje geneticky modifikované pneumolysinové polypeptidy, které působí jako toxoidy (pneumolysoidy) a jsou proto užitečné k vyvolání protilátek nebo pro použití ve vakcínách proti S .pneumoniae. Sekvence nukleových kyselin kódují modifikované pneumolysiny, vektory a hostitelské buňky transformované vektory nesoucími nukleové kyseliny kódující modifikované pneumolysiny jsou také předmětem tohoto vynálezu.

Modifikované pneumolysinové polypeptidy tohoto vynálezu, ve kterých je substituovaná nejméně jedna aminokyselina zajišťují u vhodných epitopů imunogenitu a vyvolávají protilátky, které jsou reaktivní s divokým typem pneumolysinu. Dále je toxicita takových modifikovaných polypeptidů významně redukována v umožnění podávání savcům bez značného rizika nebezpečí vlastního efektu.

Předmět tohoto vynálezu jsou specificky modifikované pneumolysinové polypeptidy, které jsou kovalentně vázány k polysacharidům za tvorby konjugátu.

Konjugací modifikovaných pneumolysinových polypeptidů tohoto vynálezu s různými polysacharidy poskytuje tento vynález skladby schopné vyvolat protilátky k širokému okruhu sérologicky odlišných patogenů. Výběrem kapsulárních polysacharidů ze specifické bakterie může tento vynález poskytovat imunizaci proti meningokokům, pneumokokům, heamofylům chřipky typu b a streptokoků skupiny B, stejně jako proti jiným bakteriím.

Dalším předmětem vynálezu jsou genetické modifikace v pneumolysinovém genomu vzniklé použitím technik náhodné mutagenese.

Geneticky modifikované pneumolysinové polypeptidy tohoto vynálezu jsou produkovány použitím konvenčních rekombinantních metod (Sambrook et al.(1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2^nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press and Ausubel et al. Eds.(1997) Current Protokols in Molekular Biology, John Wiley & Sons, lne.). Byla popsána minoritní varianta forem pneumolysinových polypeptidů, která ukazuje velký počet konzervativních sekvencí aminokyselin a nukleových kyselin. Uvedeno v příkladu Mitchell et al.(l990) Nucleic Acid Res. 18:4010, který je zahrnut v referencích a který informuje o tom, že isoleucin v pozici 153 pneumolysinového typu 1 S.pneumoniae je v typu 2 nahrazen methioninem.Typ 14, který také obsahuje isoleucin v poloze 153, má asparagin v poloze 380 běžněji než kyselinu asparágovou. Tyto varianty mohou být také zahrnuty mezi jiné substituce v aminokyselinových a nukleokyselinových skladbách tohoto vynálezu, který poskytuje modifikovaný pneumolysin, ve kterém je nejméně jeden epitop zachován.

Navrhované tímto vynálezem jsou modifikované pneumolysinové polypeptidy, které mají redukovanou nebo nemají hemolytickou aktivitu ve srovnání s divokým typem a zachovávají si dostatečný počet epitopů k produkci protilátek reaktivních s nativním divokým typem pneumolysinu. Identifikace takových polypeptidů je komplikovaná díky prvním náhodným mutacím do genu kódujícího pneumolysin a testování exprimovaných polypeptidových produktů na ztrátu nebo redukci aktivity související s toxicitou.

• · ♦ · «· « ·

Nový testovací systém použitelný pro tvorbu a identifikaci značně imunogeních, ale netoxických nebo minimálně toxických pneumolysinů použitelných k imunizaci proti S .pneumoniae infekcím, je navrhován tímto vynálezem.

Tyto metody zahrnují dva základní kroky: (1) náhodnou mutagenesi a (2) selekci.

Náhodné mutagenese jsou jednou s vhodných technik pro vnos mutací do pneumolysinu. Standardní mutagení metody jsou vhodné pro užití tímto vynálezem. Například náhodné PCR je provedeno tak, aby náhodně zařadilo nukleotidovou změnu do typu 14 pneumolysinového genomu. Následná selekce bude identifikovat vhodné změny. Tyto metody jsou aplikovatelné na všechny izolované pneumolysinové geny. Dosti nukleotidových sekvencí je identifikováno k produkci oligonukleotidových sond. Nelimitní příklady takových pneumolysinových genů jsou ty kódující pneumolysin typu 2 a 14. Nukleotidová sekvence kódující typ 14 je znázorněna na obr.l.

PCR nebo amplifikace nukleových kyselin je popsána v U.S. patent č. 4 183 195, 4 965 188 a 5 176 995, které jsou zahrnuty v referencích. Obecně je PCR metodou pro amplifikaci jedné nebo více specifických nukleových sekvencí, kde je každá sekvence složena ze dvou oddělených komplementárních vláken. PCR vyžaduje hybridizací všech vláken s komlementárními oligonukleotidovými primery. Tyto nukleotidové kyseliny jsou templáty pro syntézu komplementárních vláken za použití primerů, jak je popsáno v následujícím. Extensní produkt každého primeru je syntetizován komplementárně ke každému nukleokyselinovému vláknu. Dále jsou pak produkty extense odděleny od templátů, na kterých byly syntetizovány, a tvoří jednořetězcové molekuly. Nakonec na jednořetězcové molekuly opět nasednou primery prvního kroku za takových podmínek, že jsou produkty extense jsou syntetizovány na každé jednovláknové molekule, která je produktem druhého kroku. Tyto kroky mohou být upraveny pro optimální amplifikaci původní nukleové kyseliny a produktu syntézy.

PCR mutagenese zahrnuje inkorporaci špatných (mismath) nukleotidů do rostoucích vláken a může být oporou ve vysokém poměru chyb běžně používaných PCR polymeras. Jiné metody známé v technice pro tvorbu náhodných mutací, například chemická mutagenese, mohou být také tak užity (Eichenleub, R. (1979) J. Bacteriol. 138: 559-566). Alternativně může být mutagenní krok proveden pomocí polonáhodného (semi-random) procesu, ve kterém obsahuje jeden ze dvou primerů randomní série nukleotidů, ale část jednoho nebo obou primerů je komplementární aje „připevněna“ nejmémějednou známou pneumolysinovou sekvencí. „Primery“, termín zde používaný, jsou oligonukleotidy, přirozené produkty restrikčních endonukleas nebo syntetiky produkované, které jsou schopny působit jako iniciační bod syntézy nukleových kyselin, když jsou umístěny do vhodných podmínek, kterými je přítomnost

Ί nukleotidů a indukčních činidel jako je DNA polymerasa za vhodné teploty a pH, ve kterých je indukována syntéza primer extensního produktu, který je komplementární k nukleotidovým vláknům. Preferovány jsou priméry jednovláknové pro maximální účinnost amplifikace, ale mohou být někdy i dvouvláknové. Jestliže jsou dvouvláknové, musí být nejdříve odděleny před použitím k přípravě produktů amplifikace. Priméry jsou zejména oligodeoxyribonukleotidy, ale musí být dostatečně dlouhé pro základ syntézy extensních produktů za přítomnosti indukčích činidel. Přesné délky primerů budou záviset na spoustě faktorů, jako teplotě, zdroji primerů a použité metodě. Priméry se typicky skládají z deseti nebo více nukleotidů.

Syntetické oligonukleotidové priméry mohou být připraveny použitím všech vhodných metod, jako jsou například fosfotriesterové a fosfodiesterové metody (Narang, S.A. et al. (1979) Meth. Enzymol. 68:90; Brown E.L., et al.. (1979) Meth. Enzymol. 68:109) nebo automatizovanými metodami. V jednom takovém automatizovaném případě jsou diethylfosforamidáty užity jako startovací materiály a mohou být syntetizovány jak je popsáno v Beaucauge et al. (1981) Tetrahedron Let. 22: 1859-1962. Jedna metoda pro syntézu oligonukleotidů na modifikovaném pevném nosiči je uvedena v U.S.patent č. 4 458 066, který je zahrnut zde v referencích.

Možné je také použití primem, který byl izolován z biologického zdroje. Jedním takovým příkladem může být štěp velké nuklekyselinové molekuly kódující pneumolysin restrikčními endonukleasami, který je dostatečně komplementární k pneumolysinovým sekvencím. Nukleotidové substituce mohou být také vloženy do primerů během chemických syntéz.

Je pochopitelné, že nukleotidové sekvence tohoto vynálezu nemusí být limitovány jednou mutací ve všech daných molekulách kódujících modifikované pneumolysinové polypeptidy. Hromadné mutace jsou také možné, když si uchovají imunogenní charakter nativního pneumolysinového polypeptidu (obr.2), zatímco zeslabení nebo eliminace jedné nebo více mutací má toxický charakter. Hromadné modifikace mohou být obsaženy v jedné polypeptidové molekule (obr.4). Hromadné mutace mohou být užitečné, protože mohou redukovat pravděpodobnost reverse k toxické nativní sekvenci. Avšak preferovaným předmětem tohoto vynálezu jsou jednoduché mutace v nukleotidové sekvenci, jejichž výsledkem je substituce jedné aminokyseliny.

Náhodné nebo z části náhodné PCR produkty kódující modifikovaný pneumolysin mohou být klonovány do vhodného expresního vektoru použitím standardních klonovacích technik známých v technice.

Vektor obsahuje ve své podstatě nejméně jedno pozitivní klonovací místo, nejméně jeden gen pro antibiotikový selekční markér, transkripční promotor a počátek replikace. Vektor může být obsažen v různých kompatibilních hostitelských buňkách umožňujících vysoký stupeň exprese. Preferovanými hostitely mohou být bakterie jako E .coli, tí. subtilis nebo kvasinky jako • · · • ·

5. cerevisiae. Jiné eukaryotické buňky vedle kvasinek jako např. buňky savců mohou být také použity. Ke klonování vektorů do hostitelských buněk mohou být kombinovány všechny kompatibilní vektory a hostitelské buňky. Všechny vhodné expresní vektory a hostitelské buňky jsou vhodné k expresi modifikovaného pneumolysinu. Standardní protokol pro klonování a expresi může být použit jak je uvedeno v Ausubel, F:M: et al., eds. (1997) Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, lne., který je zahrnut v referencích.

Po ligaci modifikované pneumolysinové nukleotidové sekvence do vektoru v řádném čtecím rámci a transformaci do hostitelských buněk je prováděn test na identifikaci klonů exprimujících modifikovaný pneumolysinový polypeptid s redukovanou nebo s absencí toxicity.

Metoda identifikace vhodných transformovaných hostitelských buněk, které exprimují náhodně zmutovaný pneumolysinový polipeptid je popsána v tomto vynálezu. Preferované modifikované polypeptidy budou mít, když je porovnáme s nativním pneumolysinem, podobné znaky např. velikost. Z tohoto důvodu budou použity k analýze velikosti peptidu metody jako SDS-PAGE a gelová chromatografie. Modifikovaný pneumolysin exprimovaný transformovanou buňkou může být identifikován proteinovou analýzou hostitelských buněk použitím SDS-PAGE a srovnáním gelu s SDS-PAGE gelem hostitelské buňky, která byla transformována tím samým vektorem, který ale neobsahoval nukleotidovou sekvenci kódující pneumolysin nebo modifikovaný pneumolysin (standardní hostitel).

Transformovaný hostitel exprimující pneumolysoid bude produkovat nový fragment, když bude velký fragment z trasformovaného hostitele zkoušeného pomocí SDS-PAGE korespondovat s pneumolysinem, může se stát kandidátem k výběru. Modifikované pneumolysinové polypeptidy exprimované těmito klony mohou být testovány na hemolytickou aktivitu v buněčných extraktech k identifikaci modifikovaných pneumolysinových polypeptidů, které mají zeslabenou hemolytickou aktivitu. Transformované hostitelské buňky produkující nemodifikovaný nebo modifikovaný stále aktivní pneumolysin, který je toxický, mohou být eliminovány tímto jednoduchým testovacím krokem.

Alternativně může být modifikovaný pneumolysin identifikován jinými známými metodami běžně používanými (ale nelimitujícími) v technice jako jsou SDS-PAGE, následné elektroblotování nebo western blotová analýza nebo dot blot celých buněčných extraktů nebo limitovaná proteolýza rozpustné frakce a dále analýza produktů štěpení pomocí SDS-PAGE nebo western blot.

Zdaje modifikovaný pneumolysin prezentován jako rozpustný protein nebo zdaje akumulován ve formě inkluzí jsou faktory, které budou uváženy ve výběru metody pneumolysinové purifíkace a izolace. Ačkoli to není obecným pravidlem, vypadá to, že mutace, které ovlivňují sbalovací vlastnosti pneumolysinu podporují jeho akumulaci ve formě inkluzi.

Modifikovaný pneumolysin, který může být identifikován v rozpustné frakci buněčných extraktů může být izolován a purifikován konvenčními, ale nelimitujícími metodami purifíkace jako je precipitace nukleových kyselin, solná frakce nebo běžné procedury jako je iontovýměnná chromatografíe nebo hydrofobní interakční chromatografie. Gelová chromatografie může být použita částečně jako čistící krok následující za jednou z výše zmíněných chromatografických procedur. Alternativně může být rekombinantně modifikovaný pneumolysin izolován afinitní chromatografií nebo procedurami používanými pro izolaci proteinů obsahujících thiol, stejně tak jinými běžnými metodami známými technice (Current Protokols in Protein Science, 1995 John Wiley & Sons).

Alternativně může být modifikovaný pneumolysin získaný z inkluzních tělísek izolován následovným několikerým promytím inklusních tělísek pro odstranění nukleových kyselin a jiných kontaminantů z bakteriální buněčné stěny. Tato procedura může obsahovat, ale není to limitující, omytí peletu běžnými pufry nebo běžnými pufry s detergentními přísadami. Protein může být purifikován v denaturačních podmínkách rozpuštěním promytých inkluzi v močovině nebo v gvuanidinu HCL a následně gelovou filtrační chromatografií. Tato procedura může být skončena před proteinovým zavinutím. Avšak zavinutí následované iontovýměnnou chromatografiií reprezentuje preferovanou metodu k dosažení maximálních výtěžků zavinutého a purifíkovaného proteinu.

Nativní pneumolysin může být získán procedurou popsanou a použitou jako reference. Hemolytická aktivita a migrační nebo eluční profil nativního doplňku zde může být použita jako údaj pro izolaci modifikovaných pneumolysinu z rozpustných nebo inkluzních frakcí.

Preferovaná kritéria pro selekci klonů exprimujících vhodné modifikované pneumolysinové polypeptidy zahrnující jeden nebo více bodů: (1) exprese modifikovaného pneumolysinu; (2) úplná nebo téměř úplná exprese (základem je molekulová hmotnost okolo 53 000 pro nativní pneumolysin; (3) přítomnost pneumolysoidu v rozpustné frakci; (4) nízká hemolytická aktivita a (5) vysoký výtěžek exprimovaného polypeptidu.

Také zahrnutím všech těchto kritérií do testovacího protokolu budou identifikovány nejefektivnější a pravděpodobně vhodné klony k expresi vhodného modifikovaného pneumolysinového polypeptidu, méně výkonné klony mohou také produkovat modifikované pneumolysiny, které jsou vhodné pro použití v tomto vynálezu a zahrnující i některé ty, které nemají plnou délku, ale jsou dostatečně dlouhé k zajištění produkce protilátek reaktivních • · · · · , · j ί.; ; · · · · · • · · ·.·. ..II ······ ·· ·· ·. ..

s nativním pneumolysinem nebo mají funkci nosných polypeptidů v polysacharidových polypeptidových konjugovaných molekulách.

Preferovaná výše popsaná metoda pro identifikaci vhodných klonů také přímo zkouší charakteristiky exprimovaných proteinů jako je velikost a hemolytická aktivita, mohou být také použity jiné metody, jako detekce reaktivity s protilátkami namířenými proti nativnímu pneumolysinu nebo hybridizace s nukleokyselinovými sondami. V jednom případě může být počáteční identifikace klonů hostitelských buněk transformovaných plasmidy nesoucí nukleokyselinovou sekvenci modifikovaného pneumolysinu provedena použitím standardní hybridizaění analýzy jak je popsáno v metodách techniky. Sondy pro modifikované pneumolysinové geny zahrnují nukleotidové sekvence nativního pneumolysinu nebo amlifikované primery nebo jiné primery označující přítomnost amplifikovaných sekvencí. Takové hybridizaění sondy mají délku zejména 30 až 40 nukleotidů, lépe 10 až 20 nukleotidů. Nedostatek bude relativně malý, protože sondy mohou hybridizovat se sekvencemi obsahující alternativní báze.

Preferovanou metodou hybridizace je blot hybridizace. Uvedeno v Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, který je uveden zde v referencích, týkající se hybridizací v dalších detailech. Sondy mohou být DNA nebo RNA a mohou být označeny pro detekci všemi z mnoha známých značících technik pro odborníka dostupnými a známými. Tyto metody zahrnují radio-značící metodu, digoxigeninemznačící metodu a biotinem značící metodu. Velmi známou metodou je značeni DNA ' P používající DNA polymerasu, Klenowův enzym nebo polynukleotidkinasu. Dále jsou známé nereaktivní techniky pro signální amplifíkaci zahrnující metody pro připevnění chemických skupin k pyrimidinovým a purinovým kruhům (Dále, R.N.K. et al. (1973) Proč. Nati. Acad. Sci. USA 70:2238-42), metody které dovolují detekci pomocí chemoluminiscence (Bárto, S.K. et al. (1992) J. Am Chem. Soc. 1 14: 8736-40) a metody využívající biotinylované nukleokyselinové sondy (Johnson, TK. et al. (1983) Anal. Biochem. 133:125-131; Erixon, P.F. et al. (1982) J. Immunol. Methods 51:241-49; Matthaei, F.S. et al. (1986) Anal. Biohem. 157: 123-28) a metody, které dovolují detekci pomocí fluorescence použitím komerčně dostupných produktů. Neradioaktivně značící kity jsou také komerčně dostupné.

Testovací proces zahrnuje testování buněk exprimujících pneumolysoid na nízkou hemolytickou aktivitu pomocí metod známých v technice. (Bernheimer, A. (1988) Meth. Enzymol. 165: 213217). Mikrozkouška může být provedena na mikrotitrační destičce s 96 jamkami, které mají Udno, použitím části narostlé kultury z positivních kolonií určených pro expresi pneumolysinu (nativní nebo modifikovaný), jak je popsáno výše. Podíly mohou být extrahovány a • · normalizovány co se týče polypeptidového obsahu. Extrakty mohou být centrifugovány a výsledný buněčný pelet a supernatant analyzován odděleně. Identifikace pneumolysoidové exprese v supernatantu dále indikuje dostupnost rozpustné frakce.

Podíly buněčného lyzátu mohou být získány oddělením při centrifugaci a supernatant a pelet analyzovány na aktivitu. Testování pelet na aktivitu zahrnuje rozpuštění v denaturacním činidle např.v močovině s následným sériovým ředěním, která se chovají tak, jak je popsáno pro rozpustnou třídu. Použitím této procedury prodělá protein zavinutí a může být detegována přítomná aktivita.

Výsledky negativní aktivity implikují také neaktivní zavinutý polypeptid nebo nesprávně zavinutý polypeptid. K odlišení mezi těmito dvěma podmínkami může být použit sekundární testovací proces. Neaktivní klony jsou denaturovány a znovu zavinuty před vložením do iontovýměnné chromatografické kolony. Mutanty, které mají eluční patern podobný divokému typu pneumolysinu, mohou být analyzovány gelovou filtrační chromatografií, a manometrické druhy se Stokesovým poloměrem podobným divokému typu pneumolysinu jsou selektovány. Vložené nukleokyselinové sekvence kódující modifikovaný pneumolysin selektovaných klonů mohou být sekvenovány pomocí všech metod běžně používaných v technice a mohou být vyvozeny korespondující aminokyselinové sekvence.

Modifikované pneumolysinové polypeptidy tohoto vynálezu jsou nehemolytické polypeptidy nebo značně nehemolytické a mají stále zachovaný nejméně jeden epitop, který vyvolá protilátky proti nativnímu polypeptidu. Protože je taková hemolytická aktivita spojena s toxicitou pneumolysinu, modifikované pneumolysiny budou sami o sobě také méně toxické než nativní pneumolysin. Modifikovaný pneumolysinový polypeptid tohoto vynálezu obsahuje nejméně jednu mutaci vzhledem k S. pneumoniae typu 14 divokého typu pneumolysinu (obr.3), zejména mezi prvními 257 aminokyselinami od N-konce. Modifikace pouze jedné aminokyseliny je dostačující ke získání modifikovaných pneumolysinových polypeptidů, které mají malou nebo nevýznamnou toxicitu, která je určena hemolytickou zkouškou. Substituce v jedné nebo více polohách 61, 148 a 195 mohou dát polypeptidy mající redukovanou hemolytickou aktivitu. Preferované substituce aminokyselin 61, 148 a 195 jsou uvedeny v tabulce 1.

Tabulka 1:

Poloha aminokyseliny	61	148	195
Divoký typ	Ser	Met	Phe
Substituce	Pro	Lys	lle/Val

• · · · «··· «· ··

Substituce v těchto preferovaných pozicích aminokyselinami jinými než ty preferované například, které mají stejný náboj v neutrálním pH, jsou také v rámci tohoto vynálezu. Podle toho substituce šeřinu v 61. pozici hydroxyprolinem, methioninem v 148. pozici argininem nebo histidinem, phenylalaninem v pozici 195 leucinem, glycinem nebo alaninem jsou jiné nelimitující příklady možné substituce. Ačkoli mohou být jednoduché substituce dostatečnými zeslabovači hemolytické aktivity, taková redukce může také být uskutečněna substitucí v jednoduchém polypeptidu specifických skupin aminokyselin. Například kolektivní substituce aminokyselin v pozici 33, 46 83, 239 a 257 v jednoduchém polypeptidu produkuje polypeptidy mající charakteristiku pneumolysinu, ale redukovanou hemolytickou aktivitu. Preferované substituce jsou uvedeny v tabulce 2.

Tabulka 2

Poloha aminokyseliny	33	46	83	239	257
Divoký typ	Ile	Ile	Leu	Ser	Asp
Substituce	Thr	Thr	Ser	Arg	Gly

Na základě stejných úvah diskutovaných výše s dalším nelimitním příkladem, že serin a threonin mohou být substituovány navzájem, a že jiné neutrální aminokyseliny jako ty přednesené výše mohou substituovat Asp v poloze 257, mohou jiné aminokyseliny mimo ty, které jsou preferovány, také substituovat, co se týče jednoduché substituce.

Mělo by být jasné, že kromě těchto substitucí zveřejněných výše, které jsou efektivní pro redukci nebo eliminaci hemolytické aktivity, mohou být provedeny také jiné substituce poskytující to, že nejméně jeden epitopový pár vázané protilátky a nativního pneumolysinu je zajištěn. Nelimitující příklady aminokyselinových reziduí, které mohou být substituovány, ale které sami neredukují hemolytickou aktivitu jsou v pozicích 17, 18, 33, 41, 45, 46, 63, 66, 83, 101, 102, 127, 128, 172, 189, 239, 255 a 257. Nelimitující příklady substitucí jsou uvedeny v tabulce 3. Protože tato místa nejsou ztotožňovány se snížením hemolytické aktivity, předpokládá se, že tyto pozice mohou být více volně substituovány s menším ohledem k rozsahu a náboji.

• ·

Tabulka 3

Poloha aminokyseliny	17	18	33	41	45	46	63	66	83
Divoký typ	Lys	Lys	Ile	Asp	Val	Ile	Thr	Asn	Leu
Substituce	Arg	Asn	Thr	Gly	Ala	Thr	Ser	Tyr	Ser

Poloha aminokyseliny	101	102	127	128	172	189	239	255	257
Divoký typ	Ile	Asp	Val	Asn	Thr	Gin	Ser	Lys	Asp
Substituce	Thr	Gly	Glu	His	Ala	Arg	Arg	Gly	Gly

Je jasné, že aminokyselinové substituce výše popsané nejsou vyčerpávající, a že jiné modifikované pneumolysinové polypeptidy identifikované podle metod tohoto vynálezu jsou také v rozsahu platnosti.

Jednoduché bodové mutace nativní pneumolysinové sekvence jsou preferované, protože charakter protilátky k nativnímu pneumolysinovému polypeptidu je pravděpodobněji zachován jednobodovou modifikační formou. Alternativně může být použita kombinace vícebodových mutací.

Avšak vícebodové mutace jsou občas nepředvídatelné. Mutace mohou v některých případech způsobit synergické zrušení aktivity nebo mohou být zahrnuty v kompenzačním mechanismu během sbalovaní. Z tohoto důvodu jsou bodové mutace považovány za výhodné.

Ačkoli je testovací proces založen na identifikaci modifikovaných pneumolysinových polypeptidů, které jsou podstatně plné velikosti, tento vynález také obsahuje fragmenty a zkrácené formy modifikovaných pneumolysinových polypeptidů, kde je zachován nejméně jeden epitop rozpoznávaný protilátkou, která se váže k nativnímu pneumolysinu. Dále se upřednostňují takové fragmenty nebo zkrácené formy, které mají dostatečnou velikost k produkci polysacharidových-polypeptidových konjugátů, které produkují na T buňkách závislou imunitní odpověď.

Hemolytická aktivita pneumolysoidových proteinů tohoto vynálezu může měnit závislost v širokému rozsahu na tom, jak je pneumolysoid aktuálně používán. Například konjugace pneumolysoidu s redukovanou hemolytickou aktivitou může redukovat takové aktivity na akceptovatelnou úroveň. Kde je naopak pneumolysoid vnesen do individuí nekonjugovaný s jinou složkou nebo kde může být štěpen, bude vhodné mít hemolytickou aktivitu redukovanou na nejbližší možnou minimální detegovatelnou hladinu. Pro jsou takové návrhy přiměřené hladiny hemolytických aktivit mezi asi 0,2 % a asi 0,5 %, lépe asi 0,2 %. Kde může být • · · · • · · · ·

·· ·· • · » • · · ♦ · » • · · • · · 9 hemolytická aktivita tolerovaná nebo kde takové aktivity mohou být zeslabeny například konjugací s polysacharidem, může být vyšší hladina hemolytické aktivity akceptovatelná, např. od asi 0,5 % do asi 25 %, nebo lépe mezi asi 1 % a 10 %.

Dřívější studie informují, že C-konec PLY obsahuje k buňkám vázající se místo (Owen et al., 1994 FEMS Microbiol. Let. 121, 217-221). Studie mutagenezí tohoto vynálezu byly zaměřeny na N-konec, který jak je známo obsahuje oligomerizační doménu. Bylo objeveno, že preinkubace erythrocytů s jistými mutanty ruší divoké typy hemolytické aktivity v koncentraci závislé na způsobu indikace, a že tyto mutanty jsou vskutku schopné soutěžit s divokým typem protějšku o vazebné místo na buňce. Zatímco tyto mutanty inhibují aktivitu divokého typu, zachovávají si pravděpodobně strukturní rysy divokého typu pneumolysinu. Zachování buněčně vazebné domény v mutantních formách speciálně v případě pNV103 a pNV207 je důležité, zatímco tyto mutanty také exponují imunologickými vlastnostmi molekuly divokého typu, jak je dokázáno v ELISA inhibičních zkouškách. Mimoto k dodatečné evidenci jejich jakoby nativní struktury vlastní protilátky tvořené proti těmto mutantům schopnost neutralizace hemolytické aktivity protějšku divokého typu.

Strukturní rysy a integrita divokého typu pneumolysinu a selektovaných mutantů byla také zkoušena pomocí cirkulárního dichroismu a fluorescenční spektroskopie. Tyto techniky nabízí unikátní výhody v poskytování kvalitativní a kvantitativní informace o sekundární a terciární struktuře těchto proteinů. Divoký typ pneumolysinu je charakterizován vysokým obsahem β-sheet struktury, významného rysu v dalekých UV CD spektrech všech mutantů selektovaných v presentované studii. Tvar tohoto spektra a rozvinovací analýzy jsou v souladu s dřívějšími studiemi rekombinantních pneumolysinů purifikovaných z rozpustné frakce E. coli, která byla strukturně a funkčně ekvivalentní s nativním pneumokokálním pneumolysinem (Mitchell et al., 1989 Biochem. Biophys. Acta 1007, 67-72). Stejně tak blízká UV CD a fluorescenční spektra souhlasí s nativní strukturou obsahující Trp rezidua (Morgan et al., 1993 Biochem. J. 296, 671674), jejíž boční řetězce jsou částečně vystaveny rozpouštědlu, jak bylo dokázáno emisním maximem při 345 nm po excitaci při 290 nm. Unikátní blízká UV CD spektra charakterizovaná minimální elipticitou při 280 nm a maximální elipticitou při 290 nm popisují fingerprint těchto (Morgan et al., 1993) a jiných cytolysinů, jako je perfringolysin (Nakamura et al., 1995 Biochemistry 34, 6513-6520). Jako takový může tento charakteristický spektroskopický fingerprint reprezentovat vhodnou základní čáru měřeni pro následující určení dávkové konsistence, zvláště pro tyto mutanty selektované jako komponenty vakcínových kandidátů. Modifikované pneumolysinové polypeptidy tohoto vynálezu jsou syntetizovány zejména expresí nukleokyselinových molekul kódujících modifikované polypeptidy v hostitelském ·« ·· ·· ···· β · ·· *·*· · · · ··*· ··« · · · · · » · « · · ♦ · · ··· « · · • «· · · · · · » · · ··«· «· · · ·» · · «· mikroorganismu transformovaném molekulou nukleové kyseliny. Podle toho zahrnuje tento vynález také nukleokyselinové molekuly, DNA a RNA kódující modifikované pneumolysiny diskutované výše.

DNA kódující polypeptidy tohoto vynálezu mohou být využity k expresi rekombinantního polypeptidu v širokém spektru hostitelských buněk používajících široké spektrum vektorů. Hostitelské buňky mohou být prokaryotické nebo eukaryotické, DNA pro nativní divoký typ pneumolysinu může být získána z naturálních zdrojů takových jako Slreplococcus pneumoniae nebo alternativně syntetizována. Divoký typ DNA může být potom použit jako startovací materiál k modifikaci pro získání DNA kódující modifikované pneumolysinové polypeptidy tohoto vynálezu, jak je popsáno výše. Jednou identifikovaná DNA jako kódující vhodné modifikované pneumolysinové polypeptidy může být následně klonována do různých vektorů pro expresi. Jinak geny kódující takové peptidy mohou také být syntetizovány celé nebo z části.

V jednom případě se vynález týká metod exprese modifikovaného pneumolysinového polypeptidu v mikroorganismu, kde je mikroorganismus transformován vektorem nesoucím geny kódující modifikovaný pneumolysinový polypeptid, kde polypeptid takto produkovaný zaujímá více než asi 2 % totální proteinové exprese v transformovaném mikroorganismu. V už jiném případu je modifikovaný pneumolysinový polypeptid exprimován ve více než 40 % celkových proteinů exprimo váných v E .coli.

Klonovací vektor může obsahovat segmenty chromosomálních, nechromosomálních a syntetických DNA sekvencí. Nelimitní příklady nějakých vhodných prokaryotických vektorů zahrnují plasmidy z E. coli takové jako co/El, pCRl, pBR322, pMB9 a RP4. Prokaryotické vektory také zahrnují odvozeniny od fágové DNA jako je M13, fd a jiné vláknité jednořetězcové DNA fágy.

Modifikované pneumolysinové polypeptidy mohou být exprimovány přímo nebo jako fuzní konstrukty. Dva nelimitní příklady fuzních konstruktů jsou thiofusion a Hís-Tag, které mohou být izolovány a purifikovány pomocí konvenčních metod. Vektory pro expresi proteinů v bakterii, speciálně A. coli, jsou také známy. Takovými vektory jsou, ale nejsou limitující, pK233 (nebo všechny lete plasmidové rodiny), pT7 a lambda pSKF. Příklady vektorů exprimujících fúzní proteiny jsou PATH vektory popsané Dieckmann and Tzagoloff (1985) in J. Biol. Chem. 260: 1513-1520. Tyto vektory nesou DNA sekvence, které kódují anthranilátovou syntézu (TrpE) jsou následovány polylinkrem na C-konci. Dva nelimitní příklady fúzních konstruktů jsou thiofusion a His-Tag, které mohou být izolovány a purifikovány pomocí běžných metod. Jiné expresní vektorové systémy jsou založeny na beta-galaktosidase (pEX), maltosovém • · · · ·· ·· vazebném proteinu (pMAL) a glutation S-transferase (pGST). Popsáno Assubel et al. v Gene 67:31(1988) a Peptide Research 3:167 (1990).

Vektory použitelné v kvasinkách jsou také k dispozici. Vhodnými příklady jsou Yip, Yrp, YCP, YEp a YLp plasmidy. Popsáno Ausubel, Id.

Vhodné vektory pro použití v savčích buňkách jsou také známy. Takovými vektory jsou dobře známé deriváty SV-40, adenovirů, od retrovirů odvozené DNA sekvence a vektory odvozené kombinací plasmidů a fágové DNA. Přídatné vektory pro eukaryotické expresní vektory jsou popsány v (P.J. Southern and P. Berg (1982) J. Mol. Appln. Genet. 1:327-341; S. Subramani et al. (1981) Mol. Cel. Biol. 1:854-864; R.J. Kaufmann a P.A. Sharp (1982) J. Mol. Biol. 159:601621; R.J. Kaufmann a P.A. Sharp (1982) Mol. Cell. Biol. 159: 601-664; S.I, Scahill et al. (1983) Proč. Nati. Acad. Sci. USA 80: 4654-4659; G.Urlaub and L.A. Chasin (1980) Proč Nati. Acad. Sci. USA 77:4216-4220.

Příklady preferovaných vektorů jsou plasmidy a nějaké nelimitní příklady plasmidů obsahující T7 indukční promotor zahrnutující expresní plasmidy pET-17b, pET-lla, pET-24a-d(+) a pET9a, všechny, které jsou komerčně dostupné z Novagen (565 Science Drive, Madison, Wis. 53711). Tyto plasmidy obsahují v sekvenci platně daný T7 promotor, nepovinně lac promotor, ribosomální vazebné místo, restrikcní místa k umožnění vnosu strukturních genů a T7 terminátorovou sekvenci. Popsáno v Novagen katalog ,36-43 (1993).

Užitečnými expresními hostitely jsou dobře známé prokaryotické a eukaryotické buňky. Někteří vhodní prokaryotičtí hostitelé jsou například E. co//, jako je E. coli BL21 (DE3), E. co/i SG-936, E.co/i HB 101, E. co/i W3110, E. coli XI776, E. coli X2282, E. coli DH1 a E. coli MRCl, Pseudomonas a Bacillus, jako je Bacillus suhlilis a Strepfomyces. Vhodnými eukaryotickými buňkami jsou kvasinky jako Saccharomyces a jiné houby, hmyz, živočišné buňky takové, jako COS a CHO buňky, lidské buňky a rostlinné buňky v tkáňové kultuře. V nejlepším případě je použit E. coli kmen BL21 (DE3). Výše zmíněné plasmidy mohou být transformované do tohoto kmene.

Selekce E. coli transformované popsanými vektory může být dokonalá použitím standardních selekčních protokolů zahrnující růst v selekčním médiu, které je toxické k netransformovaným buňkám. Například E. coli se pěstuje v médiu obsahujícím selekční prvek, třeba jakýkoliv β-laktam, ke kterému je E. coli senzitivní, jako je ampicilin.

Expresní vektory pET poskytují selekční markéry, které vnesou antibiotikovou rezistenci do transformovaného organismu.

Vysoká hladina exprese modifikovaného pneumolysinového polypeptidu může být toxická pro E. coli. Překvapivě tento vynález bere v úvahu selekci modifikovaných pneumolysinových » · ··· ·· · · « · · • · · · · · ··· * · * • ·· · · · · ···· • · · · ·· ·· · · ·· · · polypeptidu, které mohou být exprimovány v E. coli do hladiny nejméně 40 % celkových buněčných proteinů.

Přídatné nukleotidové mutace mohou být vytvořeny tak, že nebyly identifikovány v selekčním procesu mimořádně tam, kde jsou translatované aminokyseliny stejné jako identifikované aminokyseliny předpověděné ze sekvence vybraného klonu. Dále mohou být nukleotidové změny provedeny se zakódovanou konservativní aminokyselinovou substitucí zejména tam, kde identifikované polypeptid vykazují jiné aminokyselinové substituce. Konservativní aminokyselinové substituce jsou známé v technice a representují substituce podobnými aninokyselinami. Úvahy počítají, ale nejsou limitovány s polaritou, hydrofobicitou, velikostí a postranní řetězcovou strukturou.

Modifikované pneumolysinové polypeptidy tohoto vynálezu jsou polypeptidy netoxické nebo značně netoxické, ale stále zachovávají nejméně jeden epitop vážící protilátky proti nativnímu pneumolysinu. Modifikovaný pneumolysin tohoto vynálezu obsahuje nejméně jednu mutaci vzhledem k divokému typu pneumolysinu, nejlépe mezi prvními 257 aminokyselinami N-konce. Modifikované pneumolysiny mohou být obměněny v tom, že přítomná aminokyselina v jednom nebo ve více než jednom reziduálním místě 17, 18, 33, 41, 45, 46, 61, 63, 66, 83, 101, 102, 127, 128, 148, 172, 189, 195, 239, 243, 255, 257, 286 nebo 446 divokého typu pneumolysinu je nahrazena, odstraněna nebo blokována. Jak bylo diskutováno výše mohou být přídatné modifikace inkorporovány z jiných známých pneumolysinových polypeptidů například modifikovaných v reziduálních místech 367, 379, 384, 385, 397, 428, 433, 434 nebo 435, které jsou objeveny v PDT WO 90/06951 a jsou zahrnuty zde v referencích. Kromě aminokyselinové substituce objevené v tomto vynálezu mohou být také jiné aminokyselinové substituce popsané (Hill et al. (1994) Infection and Immunity 62, 757-758) pro pneumolysin použity s tímto vynálezem za předpokladu, že umožňují sbalení pneumolysinu jak popisují metody zde popsané. Hill et al. popisuje čtyři N-koncové mutace, Arg-31 —> Cys, Leu-75—> Phe, Val-127—> Gly a His156—> Tyr tak, že výsledkem je 75 %, 100 %, 75 % a 2 % hemolytické aktivity. Také popisují čtyři C-koncové mutace, Ala-432—>Val, Trp-433^Arg. Trp-436—>Arg a Val-468-^Leu tak, že výsledkem je 100 %, <1 %, 50 % a 100 % hemolytické aktivity. Avšak jestliže všechny z těchto výsledků mutací nevhodně zavinují pneumolysoidy, pak nemohou být použity. Preferovanými modifikacemi pneumolysinu jsou ty v místech 61, 148 nebo 195 a nejpreferovanějším místem v reziduu je 195. Dále je také preferovány kombinace modifikací v místech 33, 46, 83, 239 a 257. Specifické změny mohou být vneseny do nativní pneumolysinové sekvence pomocí všech metod pro řízené mutageneze známé v technice. V preferovaném případě může být PCR provedena za • · použití oligonukleotidových amplifikačních primerů kódujících požadovanou nukleotidovou substituci(e) v jejich sekvenci.

Alternativně mohou být modifikované pneumolysoidové polypeptidy konstruovány chemickými syntézami. (Kent et al. Adv. Exp. Med. Biol., 1995, 362, 425-438). Takové syntézy mohou být použity k vytvoření všech částí pneumolysoidu. V případě jednotlivých syntéz mohou být syntetické peptidy kovalentně vázány na vhodnou část pneumolysoidového peptidu preparovanou pomocí metod známých v technice nebo učených na tomto místě a tvořit semisyntetický pneumolysoid.

Tento vynález je tak směřován k vakcíně a protilátkovým preparacím. Podle tohoto vynálezu mohou být exprimovaný, modifikovaný pneumolysin popsaný výše nebo jeho dariváty nebo fragmenty použity jako imunogeny ke tvorbě protilátek, které jsou reaktivní proti pneumolysinu. Rekombinantní techniky pro polypeptidovou expresi výše popsané, založené na nukleotidových sekvencích tohoto vynálezu, zajišťují produkci hojného množství modifikovaných pneumolysinových polypeptidů tohoto vynálezu. Tato usnadnňuje tvorbu protilátek reaktivních proti modifikovanému pneumolysinovému polypeptidu. Avšak by mělo být zřejmé, že polypeptidy mohou být také syntetizovány pomocí chemických metod nebo jejich kombinací.

V jiném případě mohou být protilátky namířené proti modifikovaným pneumolysinovým polypeptidům tvořeny pomocí všech technik, které jsou dobře známé v technice. Podle jednoho postoje mohou být protilátky tvořeny pomocí vpravení izolovaného modifikovaného pneumolysinového preparátu nebo jejich derivátů a fragmentů do hostitelského organismu. Hostitelským organismem může být, ale není to limitující, krysa, myš, králík, primát nebo člověk. Imunologické odpovědi mohou vzrůst použitím přídatných složek, které jsou známé v technice.

Monoklonální protilátky namířené proti modifikovanému pneumolysinovému polypeptidu mohou také být připraveny pomocí všech technik, které jsou dobře známé v technice. Podle jedné metody jsou použity kultury kontinuálních hybridomálních buněčných rodin (Kohler and Milstein (1975) Nátuře 256: 495-497). Monoklonální protilátky namířené proti modifikovanému pneumolysinovému peptidu mohou být lidské monoklonální protilátky nebo chimérní monoklonální protilátky vyráběné pomocí všech technik dobře známých v technice. Podle jedné cesty mohou být chimérické monoklonální protilátky tvořeny tak, že mají nelidské (např. myší) antigen vazebné domény kombinované s lidským konstantním regionem. (Takeda et al. (1985) Nátuře 314:452). Protilátky namířené proti modifikovanému pneumolysinovému polypeptidu mohou být purifikovány pomocí všech technik dobře známých v technice zahrnující, ale nelimitující, imunoabsorbční a imunoafinitní chromatografií nebo jiné chromatografické metody «

9 9 9 • · (např. HPLC, gelovou filtraci nebo iontoměniče). Protilátky mohou být také purifikovány jako imunoglobulinové frakce ze séra plasmy nebo buněčné kultury.

Protilátkové molekuly tohoto vynálezu mohou být nasáty imunoglobulinovýmí molekulami, podstatně nasáty imunoglobulinovýmí molekulami nebo částmi imunoglobulinové molekuly například Fab fragmentem s obsahem antigen vazebného místa.

Fragmenty protilátek namířené proti modifikovanému pneumolysinovému polypeptidu mohou být vyráběny pomocí všech technik, které jsou dobře známé v technice.

(Campbell (1985) Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Vol. 13, Burdon, et al. (eds.), Elsevier Science publishers, Amsterdam).

Modifikované pneumolysinové polypeptidy tohoto vynálezu mohou být použity k vyvolání protilátky jako odpovědi k S.pneumoniae v individuálních samotných nebo spojených s jinou imunogenní molekulou jako je polysacharid. Jiné imunogenni molekuly mohou být tvořeny z V pneumoniae nebo z různých infekčních činidel, proti kterým je vhodné vyvolat imunitní odpověď.

Jinou imunogenní molekulou, se kterou modifikovaný pneumolysin konjuguje, je zejména kapsulární nebo nekapsulární polysacharid z patogenní bakterie. Takovou bakterií je například Haemophilus influenzae typ b, meningokoková skupina A, B, nebo C; streptokoková skupina B nebo A různých sérotypů zahrnující skupinu B typů la, Ib, II, III, V a VIII; stejně tak různé sériotypy S. pneumoniae, zejména typy 1-23. S. pneumoniae sériotypy 3, 4, 6b, 9v, 14, 18c, 19f a 23 jsou nejvíce preferovány. Takové polysacharidy, které se používají ke konjugovaným pneumolysoidům, mohou být také modifikovány sami o sobě a dále být efektivnější nebo redukovat reaktivitu s endogenními epitopy. Popsáno například v Jennings et al. U.S.patent 4 727 136, 5 576 002 a U.S sériová čísla přihlášky 08/484 569, která jsou publikována jako mezinárodní aplikace WO 96/40239, která jsou zde zahrnuta v referencích pro modifikaci ke skupině B meningokokových polysacharidů.

Všechny způsoby konjugace mohou být zapojeny do konjugace polysacharidových komponent s modifikovaným pneumolysinovým polypeptidem. Preferované metody jsou popsány v U.S. patent č. 4 356 170, to je vnesením koncových aldehydových skupin (oxidace cz.s-sousední hydroxylové skupiny) do polysacharidů a spárováním aldehydových skupin do polypeptidových aminoskupin reduktivní aminací. Polysacharid a modifikované pneumolysinové polypeptidy jsou tímto spojeny -CH2-NH-polypeptidovou vazbou.

Mělo by být však jasné, že konjugované vakcíny tohoto vynálezu nejsou limitovány těmi produkovanými cestou reduktivní aminace. Pokud mohou být také vakcíny produkovány konjugací polysacharidů s modifikovaným pneumolysinovým polypeptidem, který používá ···· · · φ · φ · Φ • •Φ · · · ···* • Φ Φ·· * 9 · · ·· · • ΦΦ Φ Φ · · Φ···

ΦΦΦΦ ΦΦ · ♦ ΦΦ φφ ·· adipát dihydrazidový spacer, jak popisuje Schneerson, R., et al. (1980) J. Exp. Med. 1952: 361476 a U.S.patent č. 4 644 059. Alternativně může být použita technologie binárních spacerů vyvinutá Merck, jak popisuje Marburg, S et al. (1986) J. Am. Chem. Soc. 108: 5282-5287 nebo eventuálně redukční koncová metodologie.

Konjugované molekuly preparované podle tohoto vynálezu typicky obsahují nejméně jeden modifikovaný pneumolysinový polypeptid prezentovaného vynálezu, do kterého je zabudován nejméně jeden polysacharidový komponent. Takto tento vynález poskytuje schopnost produkovat konjugované molekuly, kde je polypeptid navázán k polysacharidů pomocí nejméně dvou míst k vytvoření překřížených konjugátu.

Vakcíny tohoto vynálezu mohou poskytovat pasivní nebo aktivní imunitu. Vakcíny pro poskytnutí aktivní imunity obsahují purifikovaný modifikovaný pneumolysinový polypeptid tohoto vynálezu. Zejména polypeptidy této vakcíny obsahují nejméně jednu z následujících aminokyselinových substitucí v divokém typu pneumolysinové aminokyselinové sekvence, jak je vidět v tabulce 1.

Jiným případem tohoto vynálezu mohou být protilátky namířené proti modifikovanému pneumolysinovému polypeptidu tohoto vynálezu užívané jako farmaceutické preparáty v terapeutických nebo profylaktických aplikacích k udělení imunity jiným individuím přenosem z hostitelských individuí (např. zvětšení individuální imunitní reakce proti 5. pneumoniae nebo poskytnutí reakce v imunitně kompromisních nebo imunitně vyčerpaných individuích jako jsou AIDS pacienti). Pasivní přenos protilátek je znám v technice a může být proveden pomocí všech známých metod. Podle jedné metody jsou protilátky namířené proti modifikovaným pneumolysinovým polypeptidům nebo jejich konjugátům tohoto vynálezu tvořeny v imunokompetentním hostitelském (donorovém) zvířeti, získány z hostitelského zvířete a transfuzí přeneseny do recipientního individua. Lidský donor může být například použit ke tvorbě protilátek reagujících proti modifikovanému pneumolysinovému plypeptidu nebo konjugátu tohoto vynálezu, protilátky vnesené v terapeuticky nebo v profylakticky efektivním množství transfuzí do lidského recipientu v přídadě nouze tímto udělí recipientu rezistenci ne pouze proti pneumolysinovému toxinu, ale proti 5. pneumoniae a bakteriím, které váží protilátky vyvolané polysacharidovými komponenty, pokud byl donor imunizován konjugáty.

Farmaceutické prostředky tohoto vynálezu mohou obsahovat modifikované pneumolysinové polypeptidy, konjugované molekuly obsahující modifikované polypeptidy nebo prostředky obsahující protilátky vyvolané jedním z modifikovaných pneumolysinových polypeptidových prostředků tohoto vynálezu. Tyto farmaceutické prostředky jsou částečně využitelné jako vakcíny.

K vyvolání pasivní imunity mohou být farmaceutické prostředky složeny z polyklonálních nebo monoklonálních protilátek nebo jejich derivátů a fragmentů jak je popsáno výše. Množství protilátek, fragmentů nebo derivátů budou terapeuticky nebo profylakticky efektivní množství určena standardními klinickými technikami.

Farmaceutické preparáty tohoto vynálezu mohou být vneseny do individuí pomocí metod známých v technice jako efektivní. Intradermální, intraperitoneální, intravenosní, subcutaneousní, intramasculární, orální a intranasální cesty jsou, ale ne pouze, cestami zavedení. Prostředky tohoto vynálezu mohou obsahovat standardní nosiče, pufry nebo konzervační prostředky známé v technice, které jsou vhodné pro vakcíny, takové jako všechny vhodné farmaceuticky akceptovatelné nosiče jako je fyziologický roztok nebo jiné injektabilní kapaliny, ale není to limitující. Aditiva obvyklá pro vakcíny mohou být také přítomny, například stabilizátory jako je laktosa nebo sorbitol a plniče k zlepšení imunitních odpovědí, jako je aluminium fosfát, hydroxid nebo sulfát a stearyltyrosin. Vakcíny produkované podle tohoto vynálezu mohou být také využity jako složky multivalentních vakcín, které vyvolají imunitní odpověď proti množství infekčních agens.

Vakcíny prezentovaného vynálezu jsou podávány v dostatečném množství k vyvolání produkce protilátek jako části imunitní odpovědi. Dávky mohou být přizpůsobeny na základě velikosti, váhy nebo věku individuálního příjemce vakcíny. Protilátková odpověď v individuu může být monitorována zkoušením titru protilátky nebo baktericidní aktivity a oživením, jestliže je nezbytné ke zlepšení odpovědi. Typicky je jedna dávka asi 0,1 až 10 pg/kg.

Jiný preferovaný příklad, modifikované pneumolysinové polypeptidy tohoto vynálezu nebo deriváty nebo jejich fragmenty mohou být užity k produkci bezpečnějších diagnostických kitů, které neobsahují pneumolysinový toxin, ale mohou stále indikovat přítomnost protilátek namířených proti S .pneumoniae. Přítomnost takových protilátek může indikovat prioritní expozici k patogenu a předpovídat individua, která mohou být rezistentní k infekci. Reakce protilátek může být identifikována pomocí všech metod popsaných v technice například ELISA zkouškou. Takové znalosti jsou důležité a mohou zabránit zbytečnému očkování. Diagnostické kity mohou obsahovat nejméně jeden modifikovaný pneumolysinový polypeptid tohoto vynálezu nebo deriváty nebo jejich fragmenty a vhodná činidla pro detekci protilátkové reakce, když se modifikované polypeptidy nebo deriváty nebo fragmenty smíchají se vzorkem obsahujícím protilátky namířené proti pneumolysinu.

Alternativně mohou diagnostické kity také obsahovat pevnou fázi nebo magnetickou kuličku nebo plastikovou matrix a nejméně jeden modifikovaný pneumolysinový polypeptid tohoto vynálezu nebo deriváty nebo jejich fragmenty.

• · <* · • · · · · · * ···· *·· ·« · «*»· • · *·· · · * · « * Β • · · ···· · · * · ···· · · · ♦ fr · * · « ·

V některých případech může být preferováno, že jsou polypeptidy nebo deriváty nebo fragmenty značeny. Značící činidla jsou dobře známá v technice. Značící činidla zahrnují nelimitující příklady jako radioaktivita, chemoluminiscence, bioluminiscence, luminiscence nebo jiné identifikační značky pro vhodné analýzy. Tělní tekutiny nebo tkáňové vzorky (např. krev, sérum, sliny) mohou být nahromaděny a čištěny a aplikovány na diagnostické kity. Pneumolysinové polypeptidy, deriváty (pneumolysoid) nebo fragmenty mohou být purifikované nebo nepurifikované a mohou být složeny ze směsice molekul. Protilátky těchto vzorků mohou nebo nemohou reagovat s pneumolysinem.

Pevné matrice známé v technice zahrnují vhodné nelimitní příklady jako je polystyren, polyethylen, polypropylen, polykarbonát nebo všechny plastické materiály v podobě zkumavek, kuliček, mikročástic, měřících tyčinek, plátů a podobně. Pevné matrice dále zahrnují nelimitní příklady jako jsou membrány, 96 jamkové mikrotitrační destičky, zkumavky a eppendorfky. Obecně takové matrice zahrnují všechny povrchy, kde může být uchycen ligand vazný agens nebo povrch, který poskytuje ligand vazné místo sám o sobě.

Všechny publikace, patenty a články zmíněné během specifikace jsou zahrnuty do referencí aplikace. Následující příklady jsou předkládány pro ilustraci prezentovaného vynálezu, ale nejsou omezením rozsahu vynálezu. Jedna dovednost v technice snadno připouští jiné obměny v rozsahu tohoto vynálezu.

PŘEHLED OBRÁZKŮ NA VÝKRESECH

Obr 1: Divoký typ nukleotidové sekvence pneumolysinu typu 14 (SEQ ID NO: 1).

Obr 2: Nelimitní nukleokyselinové variace pneumolysinu typu 14 (SEQ ID NO:2). Reziduální polohy následované příklady nukleotidových substitucí snižujících hemolytickou aktivitu jsou: 181, C; 443, A; 583, A nebo G. Reziduální polohy následované příklady nukleotidových substitucí s nepozorovaným snížením hemolytické aktivity jsou: 50, G; 54, T; 98, C; 122, G; 134, C; 137, C; 187, T; 196, T; 248, C; 276, C; 302, C; 305, G; 351, T; 380, A; 382, C; 459, C; 514, G, 558, C; 566, G; 717, A, 764, G, 770, G; 1038, T; 1138, A, 1212, A; 1296, T; 1386, G; 1395, A.

Obr 3: Aminokyselinová sekvence pneumolysinu typu 14 (SEG ID NO.3).

Obr 4: Nelimitní nukleokyselinové variace pneumolysinu typu 14 (SEQ ID NO:4). Reziduální polohy následované příklady aminokyselinových substitucí snižující hemolytickou aktivitu jsou: 61, Pro; 148, Lys; 195, Ile nebo Val; 243, Arg, Val, Glu nebo Ser; 286, Asp; 446, Ser. Reziduální polohy následované příklady aminokyselinových substitucí s nepozorovaným ·« snížením hemolytické aktivity jsou: 17, Arg; 18, Asn; 33, Thr; 41, Gly; 45, Ala; 46, Thr; 63, Ser; 66, Tyr; 83, Ser; 101, Thr; 102, Gly; 127, Glu; 128, His; 153, Met; 172, Ala; 189, Arg; 239, Arg; 255, Gly; 257, Gly.

Obr 5: Mapa plasmidu pNV-19 nesoucího nukleokyselinovou sekvenci pneumolysinu divokého typu. Plasmidové série pNV byly vytvořeny z pET-24 klonováním nukleokyselinové sekvence modifikovaného pneumolysinu.

Obr 6: Diagram ukazuje pozice substitucí v nukleových kyselinách a v aminokyselinách ve specifických modifikovaných pneumolysinových polypeptidech pNVJl, pNVJ20, pNVJ22, pNVJ56, pNV103, pNV207, pNVl 11, pNV211.

Obr 7: SDS-PAGE znázorňuje expresi rekombinantního pneumolysinu vyvolanou IPTG indukcí.

Obr 8: Srovnání reakce k polysacharidu specifického IgG na polysacharidovou dávku vyvolané po dvou vpraveních monovalentní nebo tetravalentní pneumokokální pneumolysoidové vakciny do myši.

Obr 9: Srovnání k polysacharidu specifickéch IgG doprovázejících dvě injekce teravalentních pneumokokálních vakcín, spojených do pneumolysoidových nebo tetanus toxoidových nosičů, do myši.

Obr 10: K pneumolysoidu specifické IgG vyvolané dvěmi injekcemi monovalentních a tetravalentních pneumokokálních polysacharid - pneumolysinových vakcín do myši.

Obr 11: K polysacharidu specifická opsonofagocytická aktivita vyvolaná dvěmi injekcemi tetravalentních pneumokokálních PS-pneumolysoidových a PS-tetanus toxoidových konjugovaných vakcín do myši.

Obr 12: Antihemolytická pneumolysoid specifická aktivita vyvolaná třemi injekcemi monovalentních a tetravalentních pneumokokálních konjugátů do myši.

Obr 13: Zkouška inhibice hemolýzy. Hemolytický titr divokého typu pneumolysinu po preinkubaci s indikovanými mutanty. Tabulková ukázka finálního hemolytického titru divokého typu testovaného na erythrocytech přeléčených značenými mutanty.

Obr 14: Kompetitivní inhibice ELISA studii mezi králičími polyklonálními protilátkami k divokému typu PLY a divokému typu PLY proteinu používající rozpustné divoké typy PLY, PLYD mutantu pNV207 (A) a PLYD mutantu pNV103 (B).

Obr 15: Fluorescenční spektra divokého typu pneumolysinu a mutantů. Fluorescenční emisní spektra divokého typu pneumolysinu a vybraných mutantů byly naměřeny v 10 mM sodium fosfátu (pH 7,5), excitační délce 290 nm za použití 2 nm monochromátorové štěrbiny.

» » ·»··

• · »· « · · · · * • · · · · · • · · · · * » · · · · · ·♦·· tr .»

O označuje pNV103, · označuje pNVlll, O označuje pNV211, + označuje pNV103 a □ označuje divoký typ.

Obr 16: (A) Daleká UV CD spektra mutantu pneumolysinu pNV207 (horní graf) a konjugovaný mutant pneumolysinu typu 14 CPS pNV207 (dolní graf), (B) blízká UV CD spektra mutantu pneumolysinu pNV207 (horní graf) a konjugovaný mutant pneumolysinu typu 14 CPS pNV207 (dolní graf).

Obr 17: (A) Tetravalentní pneumokokální pneumolysoidová pNV207 konjugovaná vakcína v myši: K polysacharidů specifický časem vyvolaný IgG; (B) tetravalentní pneumokokální TT konjugovaná vakcína v myši: K polysacharidů specifický časem vyvolaný IgG; (C) Monovalentní pneumokokální pneumolysoidová pNV207 konjugovaná vakcína v myši: K polysacharidů specifický časem vyvolaný IgG.

PŘÍKLADY PROVEDENÍ VYNÁLEZU

a) Materiál a metody:

Bakteriální kmeny a plasmidy.

Streplococcus pneumoniae sérotyp 14 (ATCC, Rockville, MD) byl použit v této studii k izolaci genomové DNA. E. coli kmen DH5a (Life Technologies, Gaithersburg MD) byl použit k počátečnímu klonování a produkci plasmidové DNA. E .coli kmen BL21 (DE3)AompA použitý k proteinové expresi byl vytvořen z BL21 (BE3) (Novagen) (uvedeno v U.S.patent č.

439 808 pro detail). Slreptococcus pneumoniae byl pěstován přes noc vTodd-Hewitt (TH) médium při 37 °C bez třepání v 7,5% CO2 . E. coli kmen byl pěstován v Luria-Bretani (LB) médium doplněném carbenicillinem (50-100 ng/ml) nebo kanamycinem (50 ng/ml), jak bylo třeba. Plasmidové vektory pUC-19 a pBluescript II SK+ (Stratagene) byly použity ke klonování fragmentů pro sekvenování a plasmidy pET-17b a pET-24a (Novagen) byly použity ke klonování fragmentů pro expresi.

SDS-PAGE.

Proteinové vzorky byly připraveny následovně: 1,5 ml frakce byly připraveny z kultur a buněk získaných centrifugací. Buňky byly resuspendovány v 150 μΐ proteinového nosného pufru a povařeny 5 min. k lysí buněk. Zbytky buněk byly odstraněny centrifugací a 10 μΐ každého supernatantu bylo elektroforeticky rozděleno v 8-16% gradientu Tris-glycin „Laemmli“ pofyakrylamidovém gelu (Novex) vedle standardů nízké molekulové hmotnosti (Bio-Rad). Alternativně surový extrakt připravený k analýze hemolytické aktivity byl zředěn 1:1 s proteinovým nosným pufrem a 10 až 15 μΐ bylo vneseno do gelu. Proteinové části byly vizualizovány obarvením Coomassie blue.

Příklad 1.

E. co/i kmen BL21 (DE3)AompA transformovaný pET-17b nebo pET-24a nesoucím požadované geny byl pěstován při běžné aeraci při 30 °C v LB médiu s 0,4% glukosou a 100 μΙ/ml carbenicillinu (pro pET-17b konstrukty) nebo 50 μΙ/ml kanamycinu (pro pET-24a konstrukty). Když ODeoo dosáhla 0,6; byl přidán IPTG ve finální koncentraci 0,4 mM (pro pET-17b konstrukty) a 1 mM (pro pET-24a konstrukty); a buňky byly podrobeny další 2 h inkubaci k testování; nebo 5 h pro vyšší stupeň produkce. Ke zkoušce pneumolysinové hladiny byla odebrána 1,5 ml množství před indukcí a v různém časových bodech po indukci a byly testovány SDS-PAGE.

Příklad 2.

Genomová DNA byla izolována z asi 0,5 g Streploccocus pneumoniae sérotypu 14 použitím metody popsané výše. Tato DNA slouží jako templát pro dva pneumolysin spcifické oligonukleotidy ve standardní PCR reakci. Oligonukleotidy byly zkonstruovány, aby byly komplementární s 5'a 3' koncovými regiony pneumolysinového genu z 5. pneumoniae sérotypu 2 a, aby obsahovaly Xha\ restrikční místa k usnadnění případného klonování fragmentů. Sekvence progresivního oligonukleotidu byla 5'AAC CTT GAT TGA TCT AGA TAA GGT ATT TAT GTT GG 3' (SEQ ID NO:5) a reverzní oligonukleotid měl sekvenci 5'TCT TTT TGT CTC TAG AAT TCT CCT CTC CTA GTC 3' (SEQ ID NO:6). PCR reakční podmínky byly následující: 200 ng genomové DNA S.pneumoniae typu 14, dva oligonukleotidové primery popsané výše každý v 1 μΜ množství, 200 μΜ dNTP, PCR reakční pufr, (10 mM Tris HCl, 50 mM KC1, pH 8,3), 1,5 mM MgCfs a 2,5 U Taq polymerasy a voda do totálního objemu 100 μΐ. Tato reakční směs byla podrobena 25 cyklům: 95 °C 1 min.; 50 C 2 min.; 72 °C 1,5 min. Po ukončení cyklické periody byla reakční směs loudována do 1% agarosového gelu a materiál byl podroben elektroforéze 2 h; po kterých byl 1,7 kb fragment odstraněn a DNA byla znovu získána použitím GeneClean (Bio 101).

Tato DNA byla podrobena restrikci A7?«I, přečištěna a ligována do ATwI restrikčního místa pUC19 použitím T4 DNA ligasy. Ligační směs byla použita k transformaci kompetentních buněk E. co/i DH5a. Rekombinantní plasmidy byly identifikovány a sekvenovány, většina z nich nesla v DNA sekvenci geny kódující pneumolysin.

• · · · • · ·

Příklad 3.

Plasmidy vhodné pro expresi zralého pneumolysinového proteinu byly zkonstruovány amplifíkaci DNA obsahující celý pneumolysinový gen (pST20, pST85 nebo typ 14 genomové DNA) pomocí oligonukleotidů umožňujících separaci pneumolysin kódujícího regionu. Progresivní oligonukleotidy byly charakterizovány přítomností Nde\ místa a instalováným startovacím kodonem na 5'konci kódujícího regionu. Tento primer má sekvenci 5'TAT TAG GAG GAG CAT ATG GCA AAT AAA GCA GTA AAT G 3' (SEQ ID NO:7). Reversní oligonukleotid byl charakterizován přítomností A7?ol místa a měl sekvenci 5' GGC CTC TTT TTG TCT CGA GCA TTC TCC TCT CCT AGT C 3' (SEQ ID NO:8). Tato strategie dovoluje klonování fragmentu kódujícího zralý pneumolysin do Nde\ a XhoX restrikčních míst pET-17b nebo pET-24a. Standardní PCR byla provedena použitím templátu obsahujícího pneumolysinové geny (typ 1, 2 a 14) a dvou oligonukleotidů popsaných výše. PCR reakce vyprodukovala 1,6 kb produkt; který byl analyzován v 1% agarosovém gelu. DNA získaná PCR reakcí byla v gelu purifíkována a štěpena restrikčními enzymy NdeX a XhoX. 1,6 kb produkt byl znovu gelem purifikován a ligován do NdeX a XhoX restrikčních míst pET-17b a pET-24a za použití T4 DNA ligasy. Tato ligační směs byla potom použita k transformaci kompetentních buněk E. coli DH5a. Kolonie obsahující 1,6 kb insert byly vybrány k další analýze. DNA z DH5ot klonů byla analyzována mapováním restrikčních míst a klonovací místa vybraných plasmidů byly sekvenovány. Po analýze byly DNA získané z DH5a klonů použity k transformaci E .coli kmen BL21 (DE3)ÁompA. Transformované bakterie byly selektovány na LB-agaru s obsahem 100 pg/ml carbenicillinu nebo 50 pg/ml kanamycinu, jestli používají pET-24a plasmid. Typicky bylo několik klonů testováno na schopnost produkovat zralý pneumolysinový protein.

Příklad 4.

Část genu kódujícího pneumolysin obsahující aminokyselinová rezidua 1 až 257 byla podrobena náhodné mutagenezí za použití modifikačních technik jak je popsáno v Cadwell, R.C. and Joyce, G.F. (1994) PCR Methods Appl. 3: pS 136-40; Cadwell, R.C. a Joyce, G.F. (1992) PCR Methods Appl. 2: 28-33. Oligonukleotid komplementární s T7 promotorovým regionem plasmidů pET-24a (Fig la) se sekvencí 5' ATT ACG CGA CTC ACT ATA GGG 3' (SEQ ID NO:9) a oligonukleotid komplementární k regionu pneumolysinového genu kolem 1250 bp (Fig 1) se sekvencí 5'ATT ACG AAC ATT CCC TTT AGG 3' (SEQ ID NO: 10) byly použity k určení genového regionu pro mutaci. Podmínky PCR reakce náhodné mutagenese byly následující: Purifikovaný plasmid pNV-19,2 (100 ng), dva oligonukleotidové primery popsané výše v 1 μΜ každé nestejné dNTP koncentrace, 0,2 mM dGTP, 0,2 mM dATP, 1 mM dCTP a ··« · V · ··♦, *· ··* · ··· · · · • ·· · · · · «··· ···* ·· ·· .· »· ..

mM dTTP, PCR reakční pufr (19 mM Tris-HCl, 50 mM KC1, pH 8,3), 8 mM MgCE, 0,5 mM MnCh, 6 jednotek Taq polymerasy a voda do 100 μΐ totálního objemu. Tato reační směs byla podrobena 40 cyklům: 95 °C 1 min., 40 °C 2 min. a 72 °C 3 min. Po PCR reakci byly fragmenty extrahovány fenol chloroformem a vysráženy ethanolem. Fragmenty byly následně štěpný Nde[ a ElindlW, purifikovány v gelu a ligovány do pNV-19,2; naštěpeny těmi samými enzymy. Fragmenty byly ligovány a následně transformovány do kompetentních buněk BL21 (DE3)

E .coli.

Příklad 5:

Transformace popsaná v příkladu 4 dává množství kolonií (asi 10⁴) a z nich 400 bylo náhodně selektováno ke zhodnocení. Nová testovací metoda popsaná v tomto příkladu byla použita k identifikaci kolonií exprimujících modifikované pneumolysinové polypeptidy s následující charakteristikou: 1) nehemolytická aktivita, 2) v plné délce, 3) částečně rozpustný a 4) monometrický a schopný znovu zavinutí, když je izolován z inklusních tělísek. Tato testovací metoda obsahuje následující kroky:

(a) Test výskytu nízké hemolytické aktivity: Mikrohemolytická zkouška byla použita k vyčíslení klonů. Zkoušky hemolytické aktivity byly vedeny v mikrotitračních destičkách s U-dnem použitím TBS (Tris-pufrovaný fyziologický roztok pH 7,4) jako inkubačního pufru. Pěti minutová preinkubační perioda s 1 mM DTT byla následována dvojnásobným sériovým ředěním a vzorky byly inkubovány s identickým objemem 1% suspense promytých ovčích erythrocytů (Cappel) resuspendovaných ve stejném pufru. Reakce byly provedeny za laboratorní teploty jako funkce času (kinetické studie), a stupeň erythrocytové lyse byl monitorován vizuální kontrolou. Každý klon podrobený zhodnocení byl ohodnocen známkou 0-5. Nula indikuje nehemolytickou aktivitu, zatímco 4 až 5 indikuje hemolytickou aktivitu na úrovni divokého typu nebo větší. Sto klonů se známkou 0, 1, 2 bylo vybráno a testováno znovu na jiné popsané vlastnosti.

(b) Test na expresi pneumolysinového polypeptidu v plné velikosti: Zkouška polypeptidové exprese byla vykonána v 96 jamkách. Kolonie s nízkou hemolytickou aktivitou byly zhodnoceny SDS-PAGE na přítomnost silného fragmentu majícího molekulovou hmotnost asi 53 000 Daltons. Pneumolysin plné velikosti má molekulovou hmotnost asi 53 kDa. V této zkoušce bylo 56 z 200 polypeptidů pozitivních. Tyto klony byly podrobeny další selekci.

(c) Test exprese modifikovaných pneumolysinových polypeptidů v rozpustné frakci: Modifikované pneumolysinové polypeptidy exprimované v rozpustné frakci a inklusních těliskách jsou pravděpodobněji schopné zavinutí. Získaných 10 ml kultury 2 h IPTG • · indukovaných E coli buněk nesousích plasmid obsahující mutantní pneumolysinovou sekvenci bez nebo s prokázanou redukovanou hemolytickou aktivitou bylo resuspendováno v

1,5 ml TEN pufru; buňky jsou lysovány postupnou procedurou zmrazení/roztavení/sonikace, dokud supernatant nevykazuje významnou hladinu proteinů, což se prokazuje Bradford proteinovou zkouškou, která je indikátorem úspěšné lyse. Lysovaná buněčná suspenze je centriíugována (14 000 rpm/10 min) a podíly peletu a supernatantu jsou analyzovány SDSPAGE. Podíl rozpustné frakce je testován na hemolytickou aktivitu a hemolytický titr potvrzuje redukovanou aktivitu pozorovanou v kinetické kvalitativní studii provedené v počáteční fázi testování. Klony, které byly nalezeny obsahují rozpustné modifikované pneumolysinové polypeptidy, které mají malou hemolytickou aktivitu.

(d) Vysoký výtěžek zavinutí schopných a monometrických modifikovaných pneumolysinových polypeptidů: Klony obsahující rozpustný pneumolysin jsou selektovány v dalších krocích testovací procedury, kterými jsou oddělení supernatantu, omytí peletu TEN pufrem (2x) a rozpuštění peletu v 5 ml 8 M močoviny v TEN pufru . Po 2 min. sonikaci je močovinový roztok rychle centrifugován pro odstranění agregátů a kapka na zkoušku přidána za stálého míchání do 45 ml převinovacího roztoku při 4 °C. Převinovací roztok je potom vnesen do 2 ml DEAE-Sepharose-FF kolony předem promyté Pufrem A (25 mM Tris.HCl, pH 8,0). Kolona je promytá Pufrem A a navázaný protein je eluován gradientem 0 až 1 M NaCI. Pravděpodobně zavinutý pneumolysinový mutant by měl být eluován jako jednoduchý pík v 13% až 20% Pufru B (25 mM Tris.HCl, 1 M NaCI, pH 8,0) podobně, jak je pozorováno u divokého typu. Proteinový pík je také analyzován HPLC v Seperose 12 koloně a eluční čas, agregát/monomerní poměr a hemolytická aktivita jsou zhodnoceny (tabulka 4). Selektované mutant(y) by měl být presentovány jednoduchými monomerními druhy se Stokesovými poloměry srovnatelnými s divokým typem. Pět klonů (pNVJl, pNVJ20, pNVJ22, pNVJ45, pNVJ56) s vysokými výtěžky monometrických modifikovaných polypeptidů byly selektovány pro pozdější analýzu nukleotidové sekvence. Amino a nukleokyselinové substituce těchto klonů jsou uvedeny v tabulkách 5A a 6. Během celé specifikace a nároků jsou proteiny dány jmény vektorů, které je kódují.

Tabulka 4. Srovnání divokého typu (pNV19) a mutantních pneumolysinových polypeptidů.

Protein	Purifikovaný monomer (mg/1)	HPLC (eluční čas)	Hemolytická aktivita (U/mg)	Aktivita (% divokého typu)
pNV19	63	20,1	Ϊ05	100
pNVl 11	92	19,3	2 555 (9)1	0,25
pNVJ22	86	20,7	2 440 (9)	0,24
pNVJ20	90	19,8	1 961 (6)	0,20
pNVJl	66	20,2	1 536 (2)	0,15
pNVJ45	86	18,7	1 360 (5)	0,14
pNVJ56	104	19,8	2 000 (2)	0,20
pNV211	n.d.	20	1800 (2)	0,18
pNV207	100	20,5	800 (2)	0,08
pNV103	104,7	20	950 (2)	0,10

¹ Číslo v závorce určuje počet experimentů « · * ·

ε <υ <2

Xd

Ο c

cd >

O

Xí s

'S o

ε cd □

ε ’ <Z o

ε <L>

C

Dσ?

>

Z cx o

cx >>

o

Xd

Ό

Xí

O >

o o

c o

>

Xd o

Z) o

z >>

Xd o

c <

<

z, cd

JD cd

H

1 ΓΊ 1 ra X	CL <Λ	1	1	i	O	1	1	1	1	1
X ΓΊ	Z
X		1	o	1	I	1	1	1	1	1
O\
CM	u-				00
„ ?	<u				H
X	X	1	1	1	<c	I	1	1	1	1
1	o
«3			ω			cd	cd	H)
x	cu	1	►—l	t	1	>	>	Η-1	1	>
o
VQ	c					00
x	o	1	1	1	1		,	1	,	1
CM r-			cd
w
X	H	1	<c	1	1	1	1	1	1	J
X
	4—> <D			Z					Z
			r-*!					>>
X	s	1	1		1	1	1	1		1
X
	c			Z
ra X	<	1	1	Hi	1	1	1	1	1	í
l~- CM ra	cd			_3
X	>	t	1	O	1	1	1	1	1	1
o
X	cx
x	<	1	1	1	1	o	1	1	1	1
5		t-
ra	<D	uc
X		H	1	1	i	1	1	l	1	1
X	3				u
ra	<1)				<u
X		J	1	I	X	1	1	1	1	1
\C	c	u-
2	Z	>>
X	<	H	1	1	1	1	l	1	1	I
'C	u			U,
	x:			<D
X	f—	1	1	X	1	l	1	1	1	1
\3	u.	o								o
ra	<u	u								u
X	<X)	CU	i	i	1	1	1	1	1	cu
•sC					u.
	a?				_c
X		1	I	1	ί-	1	1		1	l
£	4d					cd
X	>	1	1	1	1	<	1	1	1	1
—	a-		>.
X	<	1	o	1	1	1	1	1	1	i
£	o				l— xd
x	—	1	1	l	H	1	1	1	I	1
X	Z	c
*		Z
X		<	1	1	1	1	í	I	1	I
	CZ)	00 H
a	>-,
X	J	<	1	1	1	1	1	1	1	1
	o		J45	o CS	J22	J56	103	207	—	CS
	>		>	>	>	>	pNVJ	>	>	>
	z	z	Z	z	Z	Z	Z	z	z
	i-i·		CU	cu	O-	cu	CX	Q-	cx

Tabulka 5B. Aminokyselinové sekvence modifikovaných pneumolysinových polypeptidů.

Hemolytická aktivita	100%	OX co CH	12%	<1%	<1%	<1%	<1%	<1%
	cu	(Z)	Q	R, 446 P na S	>	UJ	CO	Cl
				C3	cd	cd	cd	03
<υ	ký 1	c	a	C	C	C	C	C
o cd	cu	ω	o	o	O	o	O
+—>	O	o	kO	co	co		CO	co
2		xt	00	xT	xT	xr	xT	xT
Xí	xr	CH	CH	CH	CH	CH	<N
c	o		o	co	00	Ολ	o	O
'53 +-»	f—<	CH	xr	CH	CO	CO	xr	CH
>	>	>	>	>	>	>	>
o u.	z	z	z	z	z	z	z	z
cu	cu	cx	cx	cx	cx	cx	cu	Q,

CN ce

4-» '>

JS cd o

o o

ε <υ

42!

O υ

□

X3

O

ΙΌ o

'4-* cd cd lΌ ε

o

Ό

JU

CZ) «•cd

C □

Ξ

CZ)

O £

□ o

c

O3

CL >7

O <D

O >

□ c

<υ sn □ cz)

O >

O c

”5

CZ)

O (D □

Z <5 cd cd

H

r- z	<		1	1	o	1	1	1	1	1
rr Ό r- Z	<	i	o	1	1			1	1	1
c— r- z	H	1	1	1	<	1	1		1	i
co oc X) z	E—	1	<	i	1	o	0	<	1	1
0 Ό V) Z	<			1	1	0	1	I	1
’Τ «ΖΊ Z	<	1	o	l	1		1	1
co 'T ττ Z	H	1	1	<	1	1			<
CS OC CO Z	<	1	1	0	1				1	1
oc co z	H	1	1	<	J	1	1	1	J	1
wo ro Z	<	1		1	1	o	J	l	l	1
CS ro Z	H	0	1	J	1	1	1	1	1	1
oc N- cs z	H	1	1	1	0	1	1	i	1	1
z	<	H	1	1	1	1	1	1	1	1
Γ- ΟΟ z	<	1	1	H	1	1	1	1	1	1
X z	H	0	1	l	1	1	1			υ
r— ro Z	E—		l	1	u	1	i	1	1	I
z	H		1	1	1	0	1	1	1	1
CS CS z	<	1	o	1	1	1	1	t	1	1
oc c> z	E—	1	1	1	CJ	1	1	1	1	1
T íTi Z	O	E—	1	1	1	1	1	1	I	1
K> z	<	O	1	1		1	1	1	l	1
	> Z ex	> 0-	^T > Q.	0 ΓΊ > z ex	(S (N > Z ex	\O un > Z ex	C<Y 0 > z ex	0 0 CM > Z cx	> z ex	CM > z ex

Příklad 6.

Pro analýzu, zda jednoduchá mutace nebo vícečetné mutace jsou vhodné pro ztrátu hemolytické aktivity ve specifických polypeptidech (tabulka 4), byla každá mutace vnesena do alely divokého typu jako jednobodová mutace používající oligonukleotidy řízené mutagenese. Tabulka 7 ukazuje oligonukleotidy použité k vnesení specifických mutací.

Tabulka 7. Modifikované pneumolysinové sekvence

Poloha mutace

Sekvence primeru

443 148 Přímá 'ggtcaggtcaataatgtcccagctagaaAgcagtatg 3' (SEQ ID NO: 11)

Met-Lys Reversní 'gctgtgagccgtgattttttcatactgcTttctagctg 3' (SEQ ID NO: 12)

583 195 Přímá 'gcagattcagattgttaatGttaagcagatttattata 3' (SEQ ID NO: 13)

583

181

Phe-lle Reversní 'atctgcttaaCattaacaatctgaatctgcttttcgcc 3' (SEQ ID NO: 14)

195 Přímá

5'cagattgttaatAttaagcagatttattatacagtcagc 3' (SEQ ID NO: 15)

Phe-Val Reversní 'aatctgcttaaTattaacaalctgaatctgcttttcgcc 3' (SEQ ID NO: 16)

Přímá acaagtgatattCctgtaacagctaccaacgacagtcgc 3' (SEQ ID NO: 17)

Ser-Pro Reversní 'agctgttacagGaatatcactlgtatttgtcgacaagct 3' (SEQ ID NO: 18)

Polypeptidy nesoucí požadované mutace byly identifikovány a jejich nukleotidové sekvence potvrzeny. Z těchto modifikovaných („site-directed“) polypeptidů byly identifikovány následující peptidy se změnou jedné base, jejíž výsledkem je ztráta hemolytické aktivity (tabulka 5A): Nukleotidová sekvence 103 obsahující změnu jedné base v poloze 583 z divokého typu T na modifikovaný G (195- Phe —>Val); nukleotidová sekvence 207 obsahující změnu jedné base v poloze 583 z divokého typu T na modifikovaný A (195- Phe —>Val); nukleotidová sekvence 111 obsahující změnu jedné base v poloze 443 z divokého typu T na modifikovaný A (148- Met • · · · · · —> Lys); nukleotidová sekvence 211 obsahující změnu jedné base v poloze 181 z divokého typu T na modifikovaný C (61- Ser —»Pro).

Polypeptidy zařazené v tabulce 5B. vykazují nízkou sbalovací aktivitu, vysvětlující jejich redukovanou hemolytickou aktivitu. Jednoduché mutace vnesené do pneumolysinového polypeptidu v polohách 243, 286 a 446 nebo kombinace substitucí vnesených v polohách 243 a 446 produkovaly druhy nalezené pouze v nerozpustné frakci a inklusních tělískách. Pokusu o sbalení těchto mutantů podléhají nejvíce agregované druhy.

Příklad 7.

Geny s jednoduchou mutací byly klonovány do expresních vektorů (pET-24a) individuálně k expresi modifikovaných polypeptidů v E.coli. Expresní hladina je asi 40 %. Nová purifikace a sbalovací proces byly vyvinuty k purifikaci těchto rekombinantních modifikovaných pneumolysinů.

Pneumolysin exprimovaný v E. coli buňkách nesousích expresní vektor pNV19 byl izolovaný z inklusních tělísek resuspendováním a lysí buněk v TEN pufru (50 mM Tris-HCl, 100 mM NaCI, 10 mM EDTA pH 8,0) se vzduchem poháněným buněčným rozrušovačem (Stansted Fluid Power Ltd.) za tlaku 8 000 psi. Buněčný lyzát byl centrifugován při 13 000 rpm při 4 °C 20 min., pelety a supernatant byly uchovány pro izolaci rozpuštěného nebo agregovaného pneumolysinu. lnklusní tělíska byla 3x promyta TEN pufrem a skladována při -70 °C. Purifikace a následného sbalení bylo docíleno rozpuštěním inklusních tělísek v 8 M roztoku močoviny (čerstvě připravený v TEN pufru), následovaným sbalením za pomoci PEG. Polypeptidový roztok v 8 M močovině (200 pg/ml) byl na zkoušku lOx zředěn přidáním kapky do sbalovacího roztoku skládajícího se z 20 μΜ PEG 8 000 v 25 mM Tris-HCl, pH 8,0 za stálého míchání při 4 °C. Vzorek byl zčeřen a nanesen do DEAE-Sepharose Fast Flow iontovýměnnné kolony (Pharmacia) ekvilibrované 25 mM Tris-HCl, pH 8,0. Byl aplikován gradient 0 až 1 M NaCI a frakce obsahující pneumolysin byly identifikovány detekcí hemolytické aktivity, jak je popsáno níže, a SDS-PAGE. Purifikované frakce byly zakoncentrovány použitím Amicon koncentrátoru a PM30 membrány. Podíly purifíkovaného polypeptidu byly testovány na hemolytickou aktivitu a analyzovány SDS-PAGE a rozsahem exklusivní chromatografie za použití Sepharose 12 kolony. Zkoušky hemolytické aktivity byly vedeny v mikrotitračních destičkách s U-dnem použitím TBS (Tris-pufrovaný fyziologický roztok pH 7,4) jako inkubačního pufru. Pěti minutová preinkubační perioda s 1 mM DTT byla následována dvojnásobným sériovým ředěním normalizovaných proteinů a vzorky byly inkubovány s identickým objemem 1% suspense promytých ovčích erythrocytů (Cappel) resuspendovaných ve stejném pufru. Reakce byly provedeny při 37 °C min., a stupeň erythrocytové lyse byl monitorován spektrofotometricky stočením U-destiček a převedením supematantu do destiček s rovným dnem a měřením množství uvolněného hemoglobinu při 450 nm. Koncový bod byla koncentrace, při které proběhlo 50 % lyse, což bylo zjištěno na základě srovnání s 0,5% buněčnou suspenzí, která byla lysována hypotonicky (tabulka 4 a 5B).

Jiné metody zkoušení modifikovaných pneumolysinových polypeptidů je provedeno hemolytickou inhibiční zkouškou modifikovaných polypeptidů. Tato zkouška sestává z určení schopnosti mutantních proteinů redukovat nebo eliminovat hemolytickou aktivitu divokého typu proteinu preinkubací erythrocytů s modifikovanými pneumolysinovými polypeptidy a zkoušením hemolytického titru divokého typu vůči erythrocytům. Výsledky z použití této zkoušky jsou uvedeny v tabulce 8 a procedura je detailně popsaná v příkladu 11.

Tabulka 8. Zkouška hemolytické inhibice pneumolysinu pneumolysinovými mutanty

Označení	Mutace	Koncový bod (*)
pNV19	divoký typ	512
pNV103	Phe195Val	64
pNVlll	Metl4SLys	128
pNV207	Phel95lle	32
pNV211	Ser6!Pro	512

(*) Reciproční hemolytický titr preparátu pneumolysinu divokého typu v přítomnosti uvedených mutantů

Antigenní reaktivita selektovaných jednobodových pneumolysinových mutantů byl určen imunizací králíků (n=2) s každým mutantním proteinem uvedeným v tabulce 9 konvenčními imunizačními procedurami.

Imunizace králíků: Novozélandští bílí králíci (Covance, Denvers, PA) vážící 2-3 kg byly imunizováni podkožně 100 pg divokého typu nebo mutantního pneumolysinu emulsifikovaného kompletní Freundovou přísadou (obj./obj ). Přídatné dávky vakcín smíchaných s nekompletní Freundovou přísadou byly poskytnuty tou samou cestou 21 až 42 dní po primární dávce. Séra byla testována na přítomnost protilátek proti divokému typu pneumolysinu. Antigenní titr celého séra (n=2) vzhledem k pneumolysinu typu 14 byl určen pomocí ELISA. V rychlosti byly destičky pokryty divokým typem pneumolysinu a inkubovány se sérií roztoků každého antimutantního • · pneumolysinového séra. Byla pozorována významná vaznost divokého typu pneumolysinu k protilátkám vyvolaným modifikovaným pneumolysinem jak ukazuje tabulka 9.

Tabulka 9. Reaktivita a hemolytický neutralizační titr pneumolysinového mutantu králičího antiséra k pneumolysinu typu 14 zjištěných ELISA.

Označení	Mutace	Titr	Protilátkový neutralizační titr
pNV19	Divoký typ	892 647	256
pNV211	Ser21 Pro	432 100	128
pNVlll	Metl4íiLys	296 113	128
pNV103	Phe'95Val	2 505 208	512
pNV207	Phel95Ile	402 426	128
PBS	-	-	8

Jak je vidět z tabulky 9, dále z jejich silné reaktivity s divokým typem pneumolysinu jak bylo naměřeno ELISA, mají antiséra ke každému z výše uvedených polypeptidů významné neutralizační a antihemolytické titry, jak bylo zjištěno hemolytickou inhibiční zkouškou.

Příklad 8.

Polysacharid PnC typu 14 (ATCC Lot #2016107) (390 mg) byl rozpuštěn v 16 ml 0,5 N NaOH a roztok byl zahříván na 70 °C po 3 h. Roztok byl ochlazen následným přidáním 1,93 ml ledové kyseliny octové, které přineslo pH 4. Po přidání 3 ml 5% hmotn. NaNO₂ byla reakční směs míchána při 4 “C 2 hodiny. Vzorek byl zředěn na 50 ml deionízovanou vodou a pH bylo upraveno na 7 s 0,5 N NaOH. Nadbytečná činidla byla dialyzována diafiltrací s Dl vodou přes Spectra/Por molekulorporesní membránu (MWC0L:3 500) a to, co bylo zadrženo bylo vysušeno zmrazením. Určený polysacharid typu 14 byl pak molekulárně separován použitím Superdex G200 (Pharmacia) kolony použitím PBS jako eluentu. Frakce eluované z kolony s molekulovou hmotností mezi 5 000 a 15 000, jak bylo určeno Chromatography/Multiangle Laser Light Scattering použitím Superose 12 kolony (Pharmacia), byly spojeny a dialyzovány proti DI vodě přes Spectra/Por molekulorporézní membránu (MWCOL 3 500) a zmražením vysušeny.

Každá PnCPS byla nejprve depolymerizována a funkční aldehydy byly vneseny do fragmentovaného CPS oxidací se sodium metaperjodátem. Po oxidačním procesu, byly přebytečné jodistany odstraněny pomocí ethylenglykolu a oxidované polysacharidy byly dialyzovány proti DI vodě a lyofilizovány.

• · • ·

Modifikované pneumolysinové polypeptidy v 0,2 M fosfátovém pufru (pH 8) v koncentraci 5 mg/ml byly smíchány 2,5 váhovými ekvivalenty PnC 14 póly sacharidového fragmentu a se 2 váhovými ekvivalenty překrystalizovaného kyanoborohydridu sodného.

Restrikční směsi byly inkubovány při 37 °C 24 h. Konjugáty byly potom purifikovány ze tří složek přepasážováním přes Superdex G200 (Pharmacia) kolonu použitím PBS s obsahem 0,01 % thimerosalu jako eluentu. Frakce eluované z kolony byly monitorovány na Waters R403 diferenciálním refraktometru a UV spektroskopem při 280 nm. Frakce obsahující konjugáty byly spojeny, filtrací sterilovány přes 0,22 pm milipórovou membránu a skladovány při 4 °C. Polypeptidový a uhlovodíkový obsah byl měřen Bradford nebo Dubois metodou. Polisacharidový obsah ve výsledných konjugátech byl asi 30 %.

Tetanus toxoid konjugáty pro použití jako kontroly byly také produkovány, jak je popsáno výše a jak v následujícím: Tetanus toxoid (Sérum Statens Institute) byl nejprve převeden přes molekulárně separační kolonu (Superdex G-200 Pharmacia) ke získání monomerní formy toxoidu. Pro konjugaci bylo rozpuštěno 12 mg monomeru a 36 mg Pne 14 polysacharidových fragmentů v 600 μΐ 0,2 M fosfátového pufru pH 7,2. Recyklovaný kyanoborohydrid sodný (24 mg) byl přidán posléze do roztoku, který byl inkubován při 37 °C po 3 dny. Konjugát byl purifikován, jak je popsáno výše. Konjugáty obsahují polysacharidy v 25 až 30 % (tabulka 10).

Tabulka 10. Skladby tetanus toxoidových a modifikovaných pneumolysinových typ 14 konjugátů.

Polypeptidový nosič	Přibližná M.hmtn. PS	Polypeptid (mg/ml)	PS (mg/ml)	%PS v konjugátu
pNV103 #195 Phe-Val	9 000	0,170	0,079	32%
pNV207 #195 Phe-lle	9 000	0,117	0,048	29%
pNVl 11 #148 Met-Lys	9 000	0,145	0,062	30%
pNV19 divoký typ	9 000	0,115	0,049	30%
Tetanus Tm	9 000	0,245	0,098	28%

• · · ·

Příklad 9.

Skupiny 20 CD1 myších samic (věk 6 až 8 týdnů) z Charles River Laboratories byly podkožně imunizovány (S.C.) 2 pg konjugovaných polysacharidů z Příkladu 8 adsorbovanými na hliníku (Aluminium hydroxide, Superfos, Denmark) v koncentraci 1 mg elementárního hliníku na ml PBS obsahujícího 0,01% thimerosal. Mys dostala vakcínu ve dnech 0, 28 a 49. Séra byla nashromážděna ve dnech 0, 42 a 59 a skladována při -70 °C.

ELISA. Mikrotitrační destičky (Nunc Polysorb ELISA plates) byly učiněny senzitivními přídavkem 100 pl polysacharidového fragmentu typu 14 (M.hmtn.10 000)/HSA konjugátu (2,5 pg/ml) v PSB. Destičky byly uzavřeny a inkubovány při 37 °C 1 h. Destičky byly omyty PSP s obsahem 0,05 % Tween 20 (PST-T) a blokovány 0,5% hmtn. BSA v PBS 1 hodinu za laboratorní teploty. Jamky v PBS-T destičkách byly potom zaplněny 100 pl sérií dvou roztoků, 100 pl peroxidasy značené kozími anti myšími IgG (H+L) (Kirkegaard and Perry Laboratories) a následně 5 krát omyty s PBS-T. Nakonec byla po přidání 50 pl TMB peroxidasového substrátu (Kirkegaard and Perry Laboratories) každé jamky a následné inkubaci destiček 10 minut za laboratorní teploty reakce zastavena přídavkem 50 pl ÍM H3PO4. Destičky byly čteny při 450 nm s Molecular Device Amex mikrotitrační čtečkou používající 650 nm jako referenční vlnovou délku.

Mikrotitrační destičky (NUNC Polysorp) byly pokryty PLY (20 ng v 100 pl každé jamky) v PBS (50 mM sodium fosfát, 150 mM NaCl, pH 7,4) na jednu hodinu při 37 °C. Po omytí s PBS +0,05% Tween 20 (PBST) byly destičky překryty 150 pl PBS + 0,1% BSA, znovu omyty a skladovány při 4 °C, dokud nebyly použity.

Anti-PLY hyperimunního králíka byl zředěn v PBST, přidán do PLY pokrytých destiček a inkubován za laboratorní teploty 1 h. Po omytí bylo podle manuálových instrukcí přidáno 100 pl ovčího antikráličího Ig-HRP konjugátu (KPL) rozpuštěného v PBSTween do každé jamky. Destičky byly inkubovány 1 hodinu za laboratorní teploty a poté znovu omyty. 100 pl TMB mikrotítračního substrátu (KPL) bylo přidáno do každé jamky. Reakce byly ukončena po 10 minutách přídavkem TMP jednosložkového stop roztoku (KLP) a okamžitě byla přečtena OD450 Roztok odpovídající 1/2 maximálního signálu byl vybrán pro další inhibiční studie. PLYD mutanty, stejně tak PLY a kontrola byly sériově třikrát zředěny v PBST obsahujícím králičí antisérum zředěné tak, že finální směs obsahovala roztok, který dával polovinu maximální aktivity a byl dvakrát aplikován okamžitě do pokrytých mikrotitračních destiček. Misky byly inkubovány za laboratorní teploty jednu hodinu a použity, lnhibice byla určena jako procento maximálního signálu, kterého bylo dosaženo zředěným antisérem za absence všech inhibitorů.

• · • ·

Opsonická schopnost myšího antiséra k PnC konjugátům typu 14 byla testována in vitro opsonofagocytickou zabíjecí zkouškou použitím lidského promyelocytického lukemiového HL60 buněčného rodu (ATCC #CCL240) (tabulka 11). Buňky 200 cfu PnC typ 14 (12-8-95 CB) byly rychle smíchány se stejným objemem sériově zředěných protilátek a inkubovány 15 minut za stálého třepání při 37 °C v 5% CO₂ inkubátoru. Doplněk z mláděte králíka a pěti denní HL-60 buněčná kultura (5 χ 10⁵) za přítomnosti 90 mM dimethylformaminu byly přidány ke směsi, která byla následně za stálého třepání inkubována při 37 °C 1 hodinu. Podíly byly odebrány pro kvantifikaci kultury a dány na čokoládový agar. Titry určené extrapolací protilátkového ředění odpovídají 50 % živých bakterií.

Tabulka 11. Imunogenicita PnC 14 polysacharidových konjugátu

Polypeptidový nosič	ELISA Titr ve dnech	Op+ titr ve dnech	ELISA titr k divokému typu pneumolysinu ve dnech
	0	42	59	59	59
Tetanus toxoid	<50	287 000	170 000	28 000	<50
pNV103 #195 Phe-Val	<50	209 000	178 000	18 000	124 000
pNV207 #195 Phe-lle	<50	175 000	149 000	31 000	111 000
pNVlll #148 Met-Lys	<50	137 000	127 000	10 500	84 000
pNV19 divoký typ	<50	275 000	241 000	29 000	124 000
PSB	<50	<50	<50	<100

*PnC 14 k polysacharidu specifický protilátkový titr +Opsonofagocytický titr

Jak můžete vidět v tabulce 11, všechny modifikované pneumolysinové konjugáty vyvolávají protilátky, které mají obsonofagocytickou aktivitu v přítomnosti doplňku. Myš imunizovaná všemi výše popsanými konjugáty zahájila vedle IgG anti PS odpovědi velmi silnou IgG odpověď proti pneumolysinovým nosičům v takové míře, že se postavila proti konjugátům divokého typu pneumolysinu.

• ·

Příklad 10.

Hydrolýza polysacharidů byla provedena následovně: Typ 6B PS byl depolymerizován 0,1 N HCI při 60°C 3 hodiny a 45 minut, typ 14 byl depolymerizován 0,1 NHC1 při 60 °C 7 hodin, typ 19F byl depolymerizován 10 mM NaOAc pufrem pH 4,1 při 70 °C 2 hodiny a 20 minut a typ 23F byl depolymerizován 0,2 M roztokem kyseliny octové při 100 °C 30 minut.

Oxidovaný 6B PS byl připraven následovně: Částečně depolymerizovaný PS (35 mg) byl rozpuštěn v 1750 ml DI vody a ošetřen 250 ml 10 mM NaIO4 ve tmě a 2 hodiny za laboratorní teploty. Nadbytečný NaIO4 byl odstraněn ethylenglykolem a po rozsáhlé dialýze byl oxidovaný PS lyofilizován. Oxidovaný 14 PS byl připraven jak je popsáno výše pro typ 6B. Oxidovaný 19F byl připraven následovně: 50 mg depolymerizovaného PS byl rozpuštěn v 0,2 M sodium fosfátovém pufru pH 7,5 (5 ml) a ošetřen 41 ml 100 mM NaIO4 při 4 °C přes noc ve tmě. Přebytečný NaIO4 byl odstraněn ethylen glykolem a po rozsáhlé dialýze byl 19F PS lyofilizován. Oxidovaný 23F byl připraven následovně: 68 mg částečně depolymerizovaného PS byl rozpuštěn v 3,4 ml 3 mM NaIO4 roztoku za laboratorní teploty ve tmě 1 hodinu. Přebytečný NaIO4 byl odstraněn přídavkem ethylen glykolu a po rozsáhlé dialýze byl oxidovaný PS lyofilizován do vysušení.

Oxidované PS byly párovány do rekombinantních pneumolysoidových mutantů 207 v aminokyselinovém Phe reziduu 195 byl přeměněn na Ile. Rychle oxidované PS a protein (5 mg/ml) v 0,2 M byly kombinovány v PS/proteinovém váhovém poměru asi 2:5:1 za laboratorní teploty a kyanoborohydrid sodný (2 váhové ekvivalenty) byl potom přidán. Konjugační směsi byly inkubovány při 37 °C 2 dny. Po redukci reziduálních aldehydů konjugovaných PS s přebytečným NaBH₄, byly konjugáty s výjimkou konjugátu typu 23, kde byly konjugáty vneseny do Q Sepharose Fast Flow kolony, a eluovány 10 mM Tris-HCl, pH 7,5 použitím gradientu 0,5 M NaCl, purifikovány z reakčních směsí pasážováním přes kolonu Superdex 200 PG (Pharmacia) a eluovány PBS s obsahem 0,01% thimerosalu jako konzervačního prostředku. Frakce odpovídající konjugátům byly spojeny a analyzovány na proteinový a uhlovodíkový obsah, jak je popsáno v příkladu 8 (tabulka 12).

» · • · • · · · · · · ··· ·· · ····

Tabulka 12. Skladby pneumolysoidových konjugátu

Pneumokokální sérotyp	Přibližná M.hmtn. PS	Polypeptid (mg/ml)	PS (mg/ml)	% PS v konjugátu
6B	41 000	0,24	0,14	37
14	41 000	0,13	0,08	38
19F	10 000	0,46	0,14	23
23F	90 000	0,44	0,06	12

Příklad 11.

Od 6 do 8 týdnů stará samice potomek myši CD-I (Charles River, Raleigh) byla imunizována monovalentní nebo tetravalentni vakcínou. Streptococcus pneumoniae polysacharidy typů 6B, 14, 19 a 23 byly konjugovány do tetanového toxoidu nebo pneumolysinového mutantu (0,5 pg PS/0,2 ml do 2 pg PS/0,2 ml) v 1 mg/ml ledku. Vakcíny byly zavedeny podkožně ve dnech 0, 28 a 49 a krevní vzorky byly sebrány ve dnech 0, 14, 28, 38 a 59. ELISA titry proti polysacharidům a nosný protein byly určeny použitím HSA-PS konjugátů a divokého typu pneumolysinu (obr. 8, 9 a 10). Opsonická aktivita séra byla určena fagolytickou zkouškou použitím HL-60 buněčné linie jak popisuje příklad 9 (obr.l 1).

Pneumolysinová aktivita byla s nějakými modifikacemi provedena podle Paton et al. (1993) Infect. Immun. 40:548. V standardních mikrotitračních destičkách s U-dnem byl divoký typ mutantních pneumolysinových proteinů rychle, sériově dva krát zředěn v TBS (15 mM Tris; 0,15 M NaCI; pH 7,5) plus 1 mM DTT jako kofaktor, ve finálním objemu 100 pl. Sto mikrolitrů 1% ovčí erythrocytové suspenze v TBS bylo přidáno k reakci provedené při 30 °C 30 minut. Po stočení nelysovaných buněk byl rozsah erhytrocytové lyse monitorován v supernatantu při 405 nm použitím mikrotitrační čtečky. Koncový bod zkoušky byl dán jamkou, ve které lysovalo 50 % erythrocytů, při základu 0,5 % buněčné suspenze hypotonicky lysované.

Inhibice hemolytické aktivity byla s nějakými obměnami testována podle Paton et al.(1993) Infect. Immun. 40:548. Před rozpuštěním byla myší antiséra ošetřena dvakrát chloroformem k eliminaci cholesterolu. Byly provedeny dvě sériová 50 pl roztoky myšího antiséra a bylo přidáno 50 pl zásobního roztoku toxinu v 4HU (hemolitické jednotky). Hemolytické aktivity toxinů byly okamžitě zkoušeny před neutralizační zkouškou. Po 15 min. inkubace při 37 °C k umožnění navázání protilátky na pneumolysin, bylo přidáno do každé jamky 100 pl ovčí červené krve (1% v TBS) (1CN, Costa Mesa, CA). Misky byly inkubovány 30 min při 37 °C a nelysované buňky byly centrifugací peletovány. Stupeň erythrocytové lyse, která proběhla v supernatantu byl • · * · • ·

monitorován použitím mikrotitrační čtečky. Protilátkové titry byly udány jako nejvyšší ředění séra, které dává kompletní inhibici hemolýzy (obr. 12).

Modifikované pneumolysinové polypeptidy mohou být testovány pro jejich schopnost inhibovat hemolytickou aktivitu divokého typu pneumolysinu, když jsou preinkubovány s erythrocyty. Suspense erythrocytů (3 ml) byla inkubována s 1 μΐ (1 mg/ml) každého modifikovaného pneumolysinového polypeptidu 10 min. a suspenze byla dána do jamek mikrotitrační destičky obsahujících sérii ředění divokého typu pneumolysinu. Destička byla inkubována při 37 °C 30 min. a hemolytický titr byl porovnán s kontrolní inkubací provedenou s normálními erythrocyty. Selektované mutanty uplatňující různé stupně inhibice hemolytické aktivity divokého typu po preinkubací s erythrocyty (obr. 13) nasvědčují tomu, že tyto mutanty jsou schopné soutěžit s divokým typem o vazebné místo, ale nejsou schopné se zařadit do membrán k formování lytických kanálků. Mutanty pNV103 a pNV207 reprezentují nej efektivnější inhibitory po pNVlll. Mutanty pNV211 zřejmě nevykazují takové inhibiční vlastnosti. Dalším potvrzením strukturální integrity a identity PLYD mutantů je, že valná část jejich antigenicity je zachována, jak ukazuje srovnání s nativním PLY (obr. 14).

Sekundární a terciární struktury volného divokého typu a mutantního pneumolysinu respektive konjugátu byly vyhodnoceny pomoci cirkulárního dichroismu (CD) spektroskopicky v dalekém UV (180 až 250 nm) a blízkém UV (250 až 350 nm). Koncentrovaný zásobní roztok proteinu byl důkladně dialyzován proti pufrovacímu systému obsahujícímu 10 mM NaPCE (pH 8,0). Spektra vzorků obsahujících 1,0 mg/ml proteinu byly zaznamenány při 0,1 nm intervalech vlnové délky na JASCO Model 710 spektropolarimetru pro cirkulární dichroimus (JASKO, Easton, MD) použitím skenovací rychlosti 5 nm/min a průměrná doba odpovědi 1 s. Byly nashromážděny minimálně čtyři pozorování a průměrné spekrum bylo uloženo. Teplota vzorků byla udržována při 25 °C ve vodní lázni použitím 0,01 cm a 1,0 cm kyvet v dalekém a blízkém UV.

Fluorescenční měření bylo provedeno na SLM AMINCO-Bowman 8100 série 2 spektrofotometru. Fluorescenční spektra vzorků obsahujících 100 pg/ml proteinu v 10 mM NaPCC (pH 7,5) byly zaznamenány v rozmezí 300 až 500 nm použitím excitační vlnové délky 290 nm a šířka štěrbiny 2 nm. Teplotní stabilita byla udržena ve vodní lázni za použití 1,0 cm křemenné kyvety při 25 °C.

Srovnání fluorescenčního spektra divokého typu pneumolysinu a selekčních mutantů bylo provedeno za experimentálních podmínek, ve kterých tyto proteiny zaujímaly nativní konformaci. Jak je uvedeno na obr. 15, fluorescenční spektra všech proteinů jsou charakterizovány maximální emisní intenzitou při 345 nm s poněkud vyššími amplitudami pozorovanými pro mutantní proteiny ve srovnání s divokým typem. Celkově vzato výsledky ukazují, že všechny proteiny jsou v nativní konformaci, která je charakterizována významným počtem Trp odhalených v rozpouštědle. Tyto výsledky byly dříve pozorovány pro perfringolysin a jsou v souladu s přítomností na Trp bohatých buněčných vazebných domén na C-konci těchto cytolysinů.

PLY exprimovaný v E. coli a znovu zavinutý z inklusních tělísek vykazující typickou charakteristiku v dalekém UV světle s vysokým obsahem β-struktur s minimem pozorovaným při 215 nm (Minetti et al. Biophys. J., 1998, 74 A233), který není významně změněn vjednobodově zmutovaném PLYD. Taktéž chemické konjugace PLY nebo PLYD s PnCPS nemají vliv na celkovou sekundární strukturu proteinů (obr. 16A). Blízké UV CD spektrum (obr. 16B), které vzniklo relativní asimetrií tyrosylových a triptofanylových reziduí v proteinu, bylo také posuzováno ve volném proteinu ve srovnání s konjugovaným proteinem a se známou vysoce uspořádanou strukturou podobnou volnému proteinu dvokého typu. Přítomnost malých změn v blízkém UV CD profilu jako výsledek přítomnosti polysacharidů na povrchu těchto komplexů interferuje částečně se specifickým Tyr sygnálem (např. negativní elipticita s minimem při 280 nm) je redukována v příslušném konjugátu. Dalším potvrzením strukturální integrity a identity PLYD mutantů je, že valná část jejich intigenicity je ve srovnání s nativním PLY zachována, jak ukazuje obr. 14.

Spektroskopické metody reprezentují silný nástroj ve vyhodnocení integrity proteinů. V některých případech konjugovaných vakcín, které využívají proteiny jako nosiče, mohou tyto metody v kombinací s funkčními a imunologickými technikami usnadnit monitorování dávkových variant stejně jako molekulární základ účinné vakcíny (Crane et al. Eur. J. Biochem. 1997, 246, 320-327; Jones et al. Dev. Biol. Stand. 1996, 87, 143-151). Mutanty poskytují netoxický protein, který si udržel schopnost sbalit se jako nativní struktura, aje k nerozeznání od rodičovské molekuly. V nejvzdálenějších UV CD možných spektrech volných mutantních proteinů (např. pNV207) a odpovídajícího Pn 14 konjugátu, jak je vidět v obou amplitudách a bodech překřížení, jsou náznaky, že sekundární struktura proteinu v makromolekulárním komplexu zůstala neporušena. Tyto výsledky jsou v rozporu s dřívějšími studiemi provedenými s jinými polysacharidovými proteinovými konjugáty, ve kterých byly po konjugaci zřejmé jasné změny sekundární struktury (Crane et al. Eur. J. Biochem. 1997, 246, 320-327).

Tyrosylová rezidua v blízkém sousedství konjugačních míst mohou být rozrušeny vložením polysacharidů, jak je dokázáno rozdíly pozorovanými v blízkém UV CD spektru v regionu kolem 280 nm.

Avšak další známkou, že Tyr obsahující regiony nejsou ovlivněny reduktivní aminační procedurou je, že tryptofanylový pík charakterizovaný při 290 nm zůstává konjugací neovlivněný.

Souhrnně vzato spektroskopie ve spojení se sérologickými výsledky poskytuje skvělý důkaz o tom, že PLYD-CPS konjugáty reprezentují vhodné vakcínové kandidáty k prevenci pneumokokálních nemocí.

Byla uskutečněna studie časového průběhu imunogenicity pro tetravalentní PLYD-PnCPS a je uvedena v obr. 17A. Zvířata přijaly tři injekce ve dnech 0, 28 a 49 a krevní vzorky byly získávány ve dnech 0, 14, 28, 38 a 59. Každá dávka obsahuje 0,5 μg PnCPS každého typu. K PnCPS specifická IgG odpověď každého typu vzroste časem na pík právě po druhé injekci (titry se pohybují mezi 20 000 a 50 000) a pak se stabilizuje.Významné přídatné efekty byly pozorovány po druhé injekci.

V obr. 17B je znázorněn časový průběh PnCPS-specifické imunitní odpovědi tetravalentních TT konjugátů. Podobně jako v případě PLYD kombinované vakcíny byly zvířata imunizovány použitím stejného rozvrhu a stejné vakcínové dávky. Odpověď IgG každého typu polysacharidů znovu vzroste po každé injekci s podobným významem (finální titry mezi 50 000 a 200 000) s výjimkou typu 23F, který dává významně nižší titr (asi 5 000). Vedlejší efekty byly také pozorovány pro každý typ po druhé injekci s výjimkou 23, u kterého jsou tyto efekty o moc menší.

Pro srovnání s výše uvedenými PLYD-PnCPS kombinovanými vakcínami je časový průběh imunogenicity monovalentních PLYD-PnCPS konjugátů uveden v obr. 17C. Zvířata obdržela stejné dávky 0,5 pg PnCPS a měla stejný imunizační rozvrh, jak je uvedeno výše. Časový průběh IgG odpovědi na PnCPS v těchto monovalentních konjugátech byl téměř identický jako ten pozorovaný pro kombinace s výjimkou typu 23 PnCPS, který stoupá po méně strmé časové křivce a má protilátkové titry a význam menší než tyto tři jiné typy.

Preklinické studie ukazují, že konjugáty stávající z polysacharidů odvozených ze čtyř pneumokokálních kmenů (6, 14, 19 a 23) a PLYD jsou imunogenické ve zvířatech a vyvolávají PnCPS-specifické protilátkové titry, které jsou dobře srovnatelné s těmi vyvolanými TT tetravalentními konjugáty. Dále jsou PLYD tetravalentní konjugáty schopny tvořit vysoké hladiny PLY-specifických IgG protilátek, které neutralizují hemolytickou aktivitu divokého typu PLY. Pro vyjasnění dříve publikované zprávy o zřejmé patogenní roly PLY ve ztrátě sluchu nebo poškození sluchového aparátu v pneumokokálním experimentálním meningitickém modelu je jasné, že PLYD vakcíny indukující protilátky budou použitelné jako doplněk ke kapsulárním • « · · protilátkám ke snížení nebo také k prevenci obávaných komplikací ve spojení s ušními záněty (Winter et al. Infection and Immunity 1997, 65, 4411-4418).

·* 0000 ·« 0· * · « <

♦ · 0 0 0 « » · · · a

MM 09 «·

SEKVENČNÍ LIST

Informace pro SEQ ID NO: 1:

(i) Sekvenční charakteristiky:

(A) Délka: 1413 (B) Typ: Nukleová kyselina (C) Typ vlákna: Dvojité (D) Typologie: Lineární (ii) Typ molekuly: cDNA (vi) Zdroj původu:

(A) Organismus: S. pneumoniae (xi) Sekvenční popis: SEQ ID NO:1:

atggcaaata aagcagtaaa tgactttata ctagctatga 40 attacgataa aaagaaactc ttgacccatc agggagaaag 80 tattgaaaat cgtttcatca aagagggtaa tcagctaccc 120 gatgagtttg ttgttatcga aagaaagaag cggagcttgt 160 cgacaaatac aagtgatatt tctgtaacag ctaccaacga 200 cagtcgcctc tatcctggag cacttctcgt agtggatgag 240 accttgttag agaataatcc cactcttctt gcggtcgatc 280 gtgctccgat gacttatagt attgatttgc ctggtttggc 320 aagtagcgat agctttctcc aagtggaaga tcccagcaat 360 tcaagtgttc gcggagcggt aaacgatttg ttggctaagt 400 ggcatcaaga ttatggtcag gtcaataatg tcccagctag 440 aatgcagtat gaaaaaatca cggctcacag catggaacaa 480 • · · · ···· ·· · ···· ··· · · · · # · · ·· ··· · · Λ · ·· ♦

	47	···· ·· ·· ··	• · · ·
ctcaaggtca	agtttggttc	tgactttgaa	aagacaggga	520
attctcttga	tattgatttt	aactctgtcc	attcaggcga	560
aaagcagatt	cagattgtta	attttaagca	gatttattat	600
acagtcagcg	tagacgctgt	taaaaatcca	ggagatgtgt	640
ttcaagatac	tgtaacggta	gaggatttaa	aacagagagg	680
aatttctgca	gagcgtcctt	tggtctatat	ttcgagtgtt	720
gcttatgggc	gccaagtcta	tctcaagttg	gaaaccacga	760
gtaagagtga	tgaagtagag	gctgcttttg	aagctttgat	800
aaaaggagtc	aaggtagctc	ctcagacaga	gtggaagcag	840
attttggaca	atacagaagt	gaaggcggtt	attttagggg	880
gcgacccaag	ttcgggtgcc	cgagttgtaa	caggcaaggt	920
ggatatggta	gaggacttga	ttcaagaagg	cagtcgcttt	960
acagcagatc	atccaggctt	gccgatttcc	tatacaactt	1000
cttttttacg	tgacaatgta	gttgcgacct	ttcaaaatag	1040
tacagactat	gttgagacta	aggttacagc	ttacagaaac	1080
ggagatttac	tgctggatca	tagtggtgcc	tatgttgccc	1120
aatattatat	tacttggaat	gaattatcct	atgatcatca	1160
aggtaaggaa	gtcttgactc	ctaaggcttg	ggacagaaat	1200
gggcaggatt	taacggctca	ctttaccact	agtattcctt	1240
taaaagggaa	tgttcgtaat	ctctctgtca	aaattagaga	1280
gtgtaccggg	cttgcttggg	aatggtggcg	tacggtttat	1320
gaaaaaaccg	atttgccact	agtgcgtaag	cggacgattt	1360
ctatttgggg	aacaactctc	tatccgcagg	tagaagataa	1400

• ·

Informace pro SEQ ID NO:2:

(i) Sekvenční charakteristiky:

(A) Délka: 1413 (B) Typ: Nukleová kyselina (C) Typ vlákna: Dvojité (D) Typologie: Lineární (ii) Typ molekuly: cDNA (vi) Zdroj původu:

(A) Organismus: S. pneumoniae (xi) Sekvenční popis: SEQ ID NO:2:

atggcaaata	aagcagtaaa	tgactttata	ctagctatga	40
attacgatan	aaanaaactc	ttgacccatc	agggagaaag	80
tattgaaaat	cgtttcanca	aagagggtaa	tcagctaccc	120
gntgagtttg	ttgntancga	aagaaagaag	cggagcttgt	160
cgacaaatac	aagtgatatt	nctgtancag	ctaccnacga	200
cagtcgcctc	tatcctggag	cacttctcgt	agtggatgag	240
accttgtnag	agaataatcc	cactcttctt	gcggtngatc	280
gtgctccgat	gacttatagt	antgntttgc	ctggtttggc	320
aagtagcgat	agctttctcc	aagtggaaga	ncccagcaat	360
tcaagtgttc	gcggagcggn	anacgatttg	ttggctaagt	400
ggcatcaaga	ttatggtcag	gtcaataatg	tcccagctag	440
aangcagtat	gaaaaaatna	cggctcacag	catggaacaa	480
ctcaaggtca	agtttggttc	tgactttgaa	aagncaggga	520
attctcttga	tattgatttt	aactctgtcc	attcaggnga	560

• * • · · ♦ • · · · ··*· ·· · ·«·· ···· ·· ·· · · · · · ·

aaagcngatt	cagattgtta	atnttaagca	gatttattat	600
acagtcagcg	tagacgctgt	taaaaatcca	ggagatgtgt	640
ttcaagatac	tgtaacggta	gaggatttaa	aacagagagg	680
aatttctgca	gagcgtcctt	tggtctatat	ttcgagngtt	720
gcttatgggc	gccaagtcta	tctcaagttg	gaaaccacga	760
gtangagtgn	tgaagtagag	gctgcttttg	aagctttgat	800
aaaaggagtc	aaggtagctc	ctcagacaga	gtggaagcag	840
attttggaca	atacagaagt	gaaggcggtt	attttagggg	880
gcgacccaag	ttcgggtgcc	cgagttgtaa	caggcaaggt	920
ggatatggta	gaggacttga	ttcaagaagg	cagtcgcttt	960
acagcagatc	atccaggctt	gccgatttcc	tatacaactt	1000
cttttttacg	tgacaatgta	gttgcgacct	ttcaaaanag	1040
tacagactat	gttgagacta	aggttacagc	ttacagaaac	1080
ggagatttac	tgctggatca	tagtggtgcc	tatgttgccc	1120
aatattatat	tacttggnat	gaattatcct	atgatcatca	1160
aggtaaggaa	gtcttgactc	ctaaggcttg	ggacagaaat	1200
gggcaggatt	tnacggctca	ctttaccact	agtattcctt	1240
taaaagggaa	tgttcgtaat	ctctctgtca	aaattagaga	1280
gtgtaccggg	cttgcntggg	aatggtggcg	tacggtttat	1320
gaaaaaaccg	atttgccact	agtgcgtaag	cggacgattt	1360
ctatttgggg	aacaactctc	tatccncagg	tagangataa	1400

ggtagaaaat gac

1413 • · ···· · ♦ · ···« ··· ·· · C * · *

Informace pro SEQ ID NO:3:

(i) Sekvenční charakteristiky:

(A) Délka: 417 (B) Typ: Aminokyselina (C) Typ vlákna: Neznámý (D) Typologie: Lineární (ii) Typ molekuly: Aminokyselina (vi) Zdroj původu:

(A)Organismus: S. pneumoniae (xi) Sekvenční popis: SEQ ID NO.3:

Met	Ala	Asn	Lys	Ala	Val	Asn	Asp	Phe	Ile	Leu	Ala
1				5					10
Met	Asn	Tyr	Asp	Lys	Lys	Lys	Leu	Leu	Thr	His	Gin
		15					20
Gly	Glu	Ser	Ile	Glu	Asn	Arg	Phe	Ile	Lys	Glu	Gly
25					30					35
Asn	Gin	Leu	Pro	Asp	Glu	Phe	Val	Val	Ile	Glu	Arg
			40					45
Lys	Lys	Arg	Ser	Leu	Ser	Thr	Asn	Thr	Ser	Asp	Ile
	50					55					60
Ser	Val	Thr	Ala	Thr	Asn	Asp	Ser	Arg	Leu	Tyr	Pro
				65					70
Gly	Ala	Leu	Leu	Val	Val	Asp	Glu	Thr	Leu	Leu	Glu
		75					80
Asn	Asn	Pro	Thr	Leu	Leu	Ala	Val	Asp	Arg	Ala	Pro
85					90					95
Met	Thr	Tyr	Ser	Ile	Asp	Leu	Pro	Gly	Leu	Ala	Ser
			100					105
Ser	Asp	Ser	Phe	Leu	Gin	Val	Glu	Asp	Pro	Ser	Asn
	110					115					120
Ser	Ser	Val	Arg	Gly	Ala	Val	Asn	Asp	Leu	Leu	Ala
				125					130
Lys	Trp	His	Gin	Asp	Tyr	Gly	Gin	Val	Asn	Asn	Val
		135					140
Pro	Ala	Arg	Met	Gin	Tyr	Glu	Lys	Ile	Thr	Ala	His
145					150					155
Ser	Met	Glu	Gin	Leu	Lys	Val	Lys	Phe	Gly	Ser	Asp
			160					165

• ·

Phe	Glu 170	Lys	Thr Gly Asn	Ser Leu Asp 175	Ile	Asp	Phe 180
Asn	Ser	Val	His	Ser	Gly	Glu	Lys	Gin	Ile	Gin	Ile
				185					190
Val	Asn	Phe	Lys	Gin	Ile	Tyr	Tyr	Thr	Val	Ser	Val
		195					200
Asp	Ala	Val	Lys	Asn	Pro	Gly	Asp	Val	Phe	Gin	Asp
205					210					215
Thr	Val	Thr	Val	Glu	Asp	Leu	Lys	Gin	Arg	Gly	Ile
			220					225
Ser	Ala	Glu	Arg	Pro	Leu	Val	Tyr	Ile	Ser	Ser	Val
	230					235					240
Ala	Tyr	Gly	Arg	Gin	Val	Tyr	Leu	Lys	Leu	Glu	Thr
				245					250
Thr	Ser	Lys	Ser	Asp	Glu	Val	Glu	Ala	Ala	Phe	Glu
		255					260
Ala	Leu	Ile	Lys	Gly	Val	Lys	Val	Ala	Pro	Gin	Thr
265					270					275
Glu	Trp	Lys	Gin	Ile	Leu	Asp	Asn	Thr	Glu	Val	Lys
			280					285
Ala	Val	Ile	Leu	Gly	Gly	Asp	Pro	Ser	Ser	Gly	Ala
	290					295					300
Arg	Val	Val	Thr	Gly	Lys	Val	Asp	Met	Val	Glu	Asp
				305					310
Leu	Ile	Gin	Glu	Gly	Ser	Arg	Phe	Thr	Ala	Asp	His
		315					320
Pro	Gly	Leu	Pro	Ile	Ser	Tyr	Thr	Thr	Ser	Phe	Leu
325					330					335
Arg	Asp	Asn	Val	Val	Ala	Thr	Phe	Gin	Asn	Ser	Thr
			340					345
Asp	Tyr	Val	Glu	Thr	Lys	Val	Thr	Ala	Tyr	Arg	Asn
	350					355					360
Gly	Asp	Leu	Leu	Leu	Asp	His	Ser	Gly	Ala	Tyr	Val
				365					370
Ala	Gin	Tyr	Tyr	Ile	Thr	Trp	Asn	Glu	Leu	Ser	Tyr
		375					380
Asp	His	Gin	Gly	Lys	Glu	Val	Leu	Thr	Pro	Lys	Ala
385					390					395
Trp	Asp	Arg	Asn	Gly	Gin	Asp	Leu	Thr	Ala	His	Phe
			400					405
Thr	Thr	Ser	Ile	Pro	Leu	Lys	Gly	Asn	Val	Arg	Asn
	410					415					420
Leu	Ser	Val	Lys	Ile	Arg	Glu	Cys	Thr	Gly	Leu	Ala
				425					430
Trp	Glu	Trp	Trp	Arg	Thr	Val	Tyr	Glu	Lys	Thr	Asp
		435					440

• ·

Leu Pro Leu Val Arg Lys Arg Thr Ile Ser Ile Trp 445 450 455

Gly Thr Thr Leu Tyr Pro Gin Val Glu Asp Lys Val

460 465

Glu Asn Asp 470

Informace pro SEQ ED NO:4:

(i) Sekvenční charakteristiky:

(A) Délka: 471 (B) Typ: Aminokyselina (C) Typ vlákna: Neznámý (D) Typologie: Lineární (ii) Typ molekuly: Aminokyselina (vi) Zdroj původu:

(A) Organismus: S. pneumoniae (xi) Sekvenční popis: SEQ ED NO:4:

Met	Ala	Asn	Lys	Ala	Val	Asn	Asp	Phe	Ile	Leu	Ala
1				5					10
Met	Asn	Tyr	Asp	Xaa	Xaa	Lys	Leu	Leu	Thr	His	Gin
		15					20
Gly	Glu	Ser	Ile	Glu	Asn	Arg	Phe	Xaa	Lys	Glu	Gly
25					30					35
Asn	Gin	Leu	Pro	Xaa	Glu	Phe	Val	Xaa	Xaa	Glu	Arg
			40					45
Lys	Lys	Arg	Ser	Leu	Ser	Thr	Asn	Thr	Ser	Asp	Ile
	50					55					60
Xaa	Val	Xaa	Ala	Thr	Xaa	Asp	Ser	Arg	Leu	Tyr	Pro
				65					70
Gly	Ala	Leu	Leu	Val	Val	Asp	Glu	Thr	Xaa	Leu	Glu
		75					80
Asn	Asn	Pro	Thr	Leu	Leu	Ala	Val	Asp	Arg	Ala	Pro
85					90					95
Met	Thr	Tyr	Ser	Xaa	Xaa	Leu	Pro	Gly	Leu	Ala	Ser
			100					105
Ser	Asp	Ser	Phe	Leu	Gin	Val	Glu	Asp	Pro	Ser	Asn
	110					115					120
Ser	Ser	Val	Arg	Gly	Ala	Xaa	Xaa	Asp	Leu	Leu	Ala
				125					130
Lys	Trp	His	Gin	Asp	Tyr	Gly	Gin	Val	Asn	Asn	Val
		135					140

Pro Ala Arg	Xaa	Gin Tyr Glu Lys	Xaa	Thr	Ala	His
145				<*	150				155
Ser	Met	Glu	Gin	Leu	Lys	Val	Lys	Phe	Gly	Ser	Asp
			160					165
Phe	Glu	Lys	Xaa	Gly	Asn	Ser	Leu	Asp	Ile	Asp	Phe
	170					175					180
Asn	Ser	Val	His	Ser	Gly	Glu	Lys	Xaa	Ile	Gin	Ile
				185					190
Val	Asn	Xaa	Lys	Gin	Ile	Tyr	Tyr	Thr	Val	Ser	Val
		195					200
Asp	Ala	Val	Lys	Asn	Pro	Gly	Asp	Val	Phe	Gin	Asp
205					210					215
Thr	Val	Thr	Val	Glu	Asp	Leu	Lys	Gin	Arg	Gly	Ile
			220					225
Ser	Ala	Glu	Arg	Pro	Leu	Val	Tyr	Ile	Ser	Xaa	Val
	230					235					240
Ala	Tyr	Xaa	Arg	Gin	Val	Tyr	Leu	Lys	Leu	Glu	Thr
				245					250
Thr	Ser	Xaa	Ser	Xaa	Glu	Val	Glu	Ala	Ala	Phe	Glu
		255					260
Ala	Leu	Ile	Lys	Gly	Val	Lys	Val	Ala	Pro	Gin	Thr
265					270					275
Glu	Trp	Lys	Gin	Ile	Leu	Asp	Asn	Thr	Xaa	Val	Lys
			280					285
Ala	Val	Ile	Leu	Gly	Gly	Asp	Pro	Ser	Ser	Gly	Ala
	290					295					300
Arg	Val	Val	Thr	Gly	Lys	Val	Asp	Met	Val	Glu	Asp
				305					310
Leu	Ile	Gin	Glu	Gly	Ser	Arg	Phe	Thr	Ala	Asp	His
		315					320
Pro	Gly	Leu	Pro	Ile	Ser	Tyr	Thr	Thr	Ser	Phe	Leu
325					330					335
Arg	Asp	Asn	Val	Val	Ala	Thr	Phe	Gin	Asn	Ser	Thr
			340					345
Asp	Tyr	Val	Glu	Thr	Lys	Val	Thr	Ala	Tyr	Arg	Asn
	350					355					360
Gly	Asp	Leu	Leu	Leu	Asp	His	Ser	Gly	Ala	Tyr	Val
				365					370
Ala	Gin	Tyr	Tyr	Ile	Thr	Trp	Xaa	Glu	Leu	Ser	Tyr
		375					380
Asp	His	Gin	Gly	Lys	Glu	Val	Leu	Thr	Pro	Lys	Ala
385					390					395
Trp	Asp	Arg	Asn	Gly	Gin	Asp	Leu	Thr	Ala	His	Phe
			400					405
Thr	Thr	Ser	Ile	Pro	Leu	Lys	Gly	Asn	Val	Arg	Asn
	410					415					420

• · · · · • · · ·

Leu	Ser	Val	Lys	Ile 425	Arg	Glu
Trp	Glu	Trp 435	Trp	Arg	Thr	Val
Leu 445	Xaa	Leu	Val	Arg	Lys 450	Arg
Gly Glu	Thr Asn 470	Thr Asp	Leu 460	Tyr	Pro	Gin

Cys	Thr	Gly 430	Leu	Ala
Tyr 440	Glu	Lys	Thr	Asp
Thr	Ile	Ser	Ile 455	Trp
Val	Glu 465	Asp	Lys	Val

Informace pro SEQ ID NO: 5:

(i) Sekvenční charakteristiky:

(A) Délka: 35 (B) Typ: Nukleová kyselina (C) Typ vlákna: Jednoduché (D) Typologie: Lineární (ii) Typ molekuly: DNA (vi) Zdroj původu:

(A) Organismus: S. pneumoniae (xi) Sekvenční popis: SEQ ID NO:5: aaccttgatt gatctagata aggtatttat gttgg

Informace pro SEQ ID NO:6:

(i) Sekvenční charakteristiky:

(A) Délka: 33 (B) Typ: Nukleová kyselina (C) Typ vlákna: Jednoduché (D) Typologie: Lineární (ii) Typ molekuly: DNA (vi) Zdroj původu:

(A) Organismus: S. pneumoniae (xi) Sekvenční popis: SEQ ID NO:6: tctttttgtc tctagaattc tcctctccta gtc

Informace pro SEQ ID NO:7:

(i) Sekvenční charakteristiky:

(E) Délka: 37 (F) Typ: Nukleová kyselina (G) Typ vlákna: Jednoduché (H) Typologie: Lineární (ii) Typ molekuly: DNA (vi) Zdroj původu:

(A)Organismus: 5. pneumoniae (xi) Sekvenční popis: SEQ ID NO:7: tattaggagg agcatatggc aaataaagca gtaaatg

Informace pro SEQ ID NO:8:

(i) Sekvenční charakteristiky:

(A) Délka: 37 (B) Typ: Nukleová kyselina (C) Typ vlákna: Jednoduché (D) Typologie: Lineární (ii) Typ molekuly: DNA (vi) Zdroj původu:

(A) Organismus: 5. pneumoniae (xi) Sekvenční popis: SEQ ID NO:8: ggcctctttt tgtctcgagc attctcctct cctagtc

Informace pro SEQ ID NO:9:

(i) Sekvenční charakteristiky:

(A) Délka: 21 (B) Typ: Nukleová kyselina (C) Typ vlákna: Jednoduché (D) Typologie: Lineární • « (ii) Typ molekuly: Nukleová kyselina (vi) Zdroj původu:

(A) Organismus: 5. pneumoniae (xi) Sekvenční popis: SEQ ID NO:9: attacgcgac tcactatagg g

Informace pro SEQ ID NO: 10:

(i) Sekvenční charakteristiky:

(A) Délka: 21 (B) Typ: Nukleová kyselina (C) Typ vlákna: Jednoduché (D) Typologie: Lineární (ii) Typ molekuly: DNA (vi) Zdroj původu:

(A) Organismus: 5. pneumoniae (xi) Sekvenční popis: SEQ ID NO: 10: attacgaaca ttccctttag g

Informace pro SEQ ID NO: 11:

(i) Sekvenční charakteristiky:

(A) Délka: 37 (B) Typ: Nukleová kyselina (C) Typ vlákna: Jednoduché (D) Typologie: Lineární (ii) Typ molekuly: DNA (vi) Zdroj původu:

(A) Organismus: A pneumoniae (xi) Sekvenční popis: SEQ ID NO: 11: ggtcaggtca ataatgtccc agctagaaag cagtatg • φ φ · • ·

Informace pro SEQ ID NO: 12:

(i) Sekvenční charakteristiky:

(A) Délka: 38 (B) Typ: Nukleová kyselina (C) Typ vlákna: Jednoduché (D) Typologie: Lineární (ii) Typ molekuly: DNA (vi) Zdroj původu:

(A) Organismus: 5. pneumoniae (xi) Sekvenční popis: SEQ ID NO: 12: gctgtgagcc gtgatttttt catactgctt tctagctg

Informace pro SEQ ID Ν 0:13:

(i) Sekvenční charakteristiky:

(A) Délka: 38 (B) Typ: Nukleová kyselina (C) Typ vlákna: Jednoduché (D) Typologie: Lineární (ii) Typ molekuly: DNA (vi) Zdroj původu:

(A) Organismus: S. pneumoniae (xi) Sekvenční popis: SEQ ID NO: 13: gcagattcag attgttaatg ttaagcagat ttattata

Informace pro SEQ ID NO: 14:

(i) Sekvenční charakteristiky:

(A) Délka: 38 (B) Typ: Nukleová kyselina (C) Typ vlákna: Jednoduché (D) Typologie: Lineární • · (ii) Typ molekuly: DNA (vi) Zdroj původu:

(A)Organismus: 5. pneumoniae (xi) Sekvenční popis: SEQ ID NO: 14: atctgcttaa cattaacaat ctgaatctgc ttttcgcc

Informace pro SEQ ID NO: 15:

(i) Sekvenční charakteristiky:

(A) Délka: 39 (B) Typ: Nukleová kyselina (C) Typ vlákna: Jednoduché (D) Typologie: Lineární (ii) Typ molekuly: DNA (vi) Zdroj původu:

(A) Organismus: 5. pneumoniae (xi) Sekvenční popis: SEQ ID NO: 15: cagattgtta atattaagca gatttattat acagtcagc

Informace pro SEQ ID NO: 16:

(i) Sekvenční charakteristiky:

(A) Délka: 39 (B) Typ: Nukleová kyselina (C) Typ vlákna: Jednoduché (D) Typologie: Lineární (ii) Typ molekuly: DNA (vi) Zdroj původu:

(A) Organismus: S. pneumoniae (xi) Sekvenční popis: SEQ ID NO.16: aatctgctta atattaacaa tctgaatctg cttttcgcc * · • · • · • «· · · · · · • ··· ···«

9 9 9 99 9 9 9 9 4 9 99

Informace pro SEQ ID NO: 17:

(i) Sekvenční charakteristiky:

(A) Délka: 39 (B) Typ: Nukleová kyselina (C) Typ vlákna: Jednoduché (D) Typologie: Lineární (ii) Typ molekuly: DNA (vi) Zdroj původu:

(A) Organismus: S. pneumoniae (xi) Sekvenční popis: SEQ ID NO: 17: acaagtgata ttcctgtaac agctaccaac gacagtcgc

Informace pro SEQ ID NO: 18:

(i) Sekvenční charakteristiky:

(A) Délka: 39 (B) Typ: Nukleová kyselina (C) Typ vlákna: Jednoduché (D) Typologie: Lineární (ii) Typ molekuly: DNA (vi) Zdroj původu:

(A) Organismus: 5. pneumoniae (xi) Sekvenční popis: SEQ ID NO: 18: agctgttaca ggaatatcac ttgtatttgt cgacaagct r · · · ·· ·· · · ·· ··

Pk looo-ioé

Zoltf

Claims (33)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Modifikovaný pneumolysinový polypeptid mající zeslabenou hemolytickou aktivitu vyznačující se tím, že byl získán:

   a) náhodnou mutací nukleokyselinové molekuly kódující divoký typ pneumolysinu, zmutované nukleokyselinové molekuly kódující modifikované pneumolysinové polypeptidy jsou exprimovány v hostitelských buňkách,

   b) zkouškou modifikovaného polypeptidu exprimovaného v hostitelských buňkách na hemolytickou aktivitu,

   c) identifikací dobře svinutých modifikovaných pneumolysinových polypeptidů majících značně podobnou molekulovou hmotnost jako nativní pneumolysin divokého typu.
2. 2. Modifikovaný pneumolysinový polypeptid mající zeslabenou hemolytickou aktivitu vyznačující se tím, že obsahuje aminokyselinové sekvence pneumolysinu typu 14, kde nejméně jedna aminokyselina v regionu obsahujícím aminokyselinové zbytky 1 až 257 je substituována, a kde nejméně jedna zmíňená substituce způsobuje zeslabení hemolytické aktivity modifikovaného pneumolysinového polypeptidu.

   Modifikovaný pneumolysinový polypeptid podle nároku 2 vyznačující se tím, že jeho hemolytická aktivita je menší než 25 % ve srovnání s divokým typem pneumolysinu.
3. 4. Modifikovaný pneumolysinový polypeptid podle nároku 2 vyznačující se tím, že obsahuje nejméně jednu aminokyselinovou substituci v aminokyselinové sekvenci Vzorce I v reziduálních pozicích 61, 148 nebo 195 nebo kombinace substitucí v reziduálních pozicích 33, 46, 83, 239 a 257.

   Vzorec I

   10 Met Ala Asn Lys Ala Val Asn Asp Phe Ile Leu Ala 15 10

   Met Asn Tyr Asp Lys Lys Lys Leu Leu Thr His Gin

   15 20

   Gly Glu Ser Ile Glu Asn Arg Phe Ile Lys Glu Gly

   15 25 30 35

   Asn Gin Leu Pro Asp Glu Phe Val Val Ile Glu Arg

   40 45

   Lys Lys Arg Ser Leu Ser Thr Asn Thr Ser Asp Ile 50 • v · * • v · • · » • » · · * · ·» • · · φ φ » φ ·

   20 Ser Val Thr Ala Thr Asn Asp Ser Arg Leu Tyr Pro 65 70

   Gly Ala Leu Leu Val Val Asp Glu Thr Leu Leu Glu 75 80

   Asn Asn Pro Thr Leu Leu Ala Val Asp Arg Ala Pro 25 85 90 95

   Met Thr Tyr Ser Ile Asp Leu Pro Gly Leu Ala Ser 100 105 _fSer Asp Ser Phe Leu Gin Val Glu Asp Pro Ser Asn 110 115 120

   Ser Ser Val Arg Gly Ala Val Asn Asp Leu Leu Ala 125 130 Lys Trp His Gin Asp Tyr Gly Gin Val Asn Asn Val 135 140 Pro Ala Arg Met Gin Tyr Glu Lys Ile Thr Ala His 145 150 155 Ser Met Glu Gin Leu Lys Val Lys Phe Gly Ser Asp 160 165 Phe Glu Lys Thr Gly Asn Ser Leu Asp Ile Asp Phe 170 175 180 Asn Ser Val His Ser Gly Glu Lys Gin Ile Gin Ile 185 190 Val Asn Phe Lys Gin Ile Tyr Tyr Thr Val Ser Val 195 200 Asp Ala Val Lys Asn Pro Gly Asp Val Phe Gin Asp 205 210 215 Thr Val Thr Val Glu Asp Leu Lys Gin Arg Gly Ile 220 225 Ser Ala Glu Arg Pro Leu Val Tyr Ile Ser Ser Val 230 235 240 Ala Tyr Gly Arg Gin Val Tyr Leu Lys Leu Glu Thr 245 250 Thr Ser Lys Ser Asp Glu Val Glu Ala Ala Phe Glu 255 260 Ala Leu Ile Lys Gly Val Lys Val Ala Pro Gin Thr 265 270 275 Glu Trp Lys Gin Ile Leu Asp Asn Thr Glu Val Lys

   280 285

   Ala Val Ile Leu Gly Gly Asp Pro Ser Ser Gly Ala • t »··· • ·, * * » * « • · · · » « · f · • » ♦ · • »· · »·

   290

   Arg Val Val Thr Gly Lys 305

   Leu Ile Gin Glu Gly Ser 315

   Pro Gly Leu Pro Ile Ser 325 330

   Arg Asp Asn Val Val Ala

   34 0

   Asp Tyr Val Glu Thr Lys 350

   Gly Asp Leu Leu Leu Asp 365

   Ala Gin Tyr Tyr Ile Thr 375

   Asp His Gin Gly Lys Glu 385 390

   Trp Asp Arg Asn Gly Gin

   400

   Thr Thr Ser Ile Pro Leu

   410

   Leu Ser Val Lys Ile Arg 425

   Trp Glu Trp Trp Arg Thr 435

   Leu Pro Leu Val Arg Lys 445 450

   Gly Thr Thr Leu Tyr Pro ' 460

   295 300

   Val Asp Met Val Glu Asp

   310

   Arg Phe Thr Ala Asp His 320

   Tyr Thr Thr Ser Phe Leu 335

   Thr Phe Gin Asn Ser Thr

   345

   Val Thr Ala Tyr Arg Asn 355 360

   His Ser Gly Ala Tyr Val

   370

   Trp Asn Glu Leu Ser Tyr 380

   Val Leu Thr Pro Lys Ala 395

   Asp Leu Thr Ala His Phe 405

   Lys Gly Asn Val Arg Asn 415 420

   Glu Cys Thr Gly Leu Ala

   430

   Val Tyr Glu Lys Thr Asp

   440

   Arg Thr Ile Ser Ile Trp 455

   Gin Val Glu Asp Lys Val 465

   Glu Asn Asp 470 • ♦ • · • · · ·
4. 5. Modifikovaný pneumolysin podle nároku 2 vyznačující se tím, že substituované aminokyseliny jsou vybrány ze skupiny mající prolin nebo hydroprolin v pozici 61; lysin, arginin nebo histidin v pozici 148 a leucin, glycin, alanin, isoleucin nebo valin v poloze 195.
5. 6. Modifikovaný pneumolysin podle nároku 2 vyznačující se tím, že substituované aminokyseliny jsou selektovány ze skupiny mající serin, threonin, asparagin, glutamin, tyrosin v polohách 33, 46 a 83; lysin, arginin nebo histidin v pozici 239 a leucin, glycin, alanin, isoleucin nebo valin v pozici 255.
6. 7. Modifikovaný pneumolysinový polypeptid pNVJ1.
7. 8. Modifikovaný pneumolysinový polypeptid pNV J20.
8. 9. Modifikovaný pneumolysinový polypeptid pNVJ22.
9. 10. Modifikovaný pneumolysinový polypeptid pNVJ45.
10. 11. Modifikovaný pneumolysinový polypeptid pNVJ56.
11. 12. Modifikovaný pneumolysinový polypeptid pNV103.
12. 13. Modifikovaný pneumolysinový polypeptid pNV207.
13. 14. Modifikovaný pneumolysinový polypeptid pNVl 11.
14. 15. Modifikovaný pneumolysinový polypeptid pNV211.
15. 16. Rekombinantní nukleokyselinová molekula obsahující sekvenci kódující modifikované pneumolysinové polypeptidy podle některého z nároků 1 až 15.
16. 17. Rekombinantní nukleokyselinová molekula obsahující následující pneumolysinové nukleotidové sekvence:

    • · • · · ♦ • · · • · « « · « • ·

    ATGGcAAATÁ AÁGČaGTAAA tGaCTTTATA ATTACGATAA AAAGAAACTC TTGACCCATC CTAGCTATGA AGGGAGAAAG TCAGCTACCC TATTGAAÁAT CGTTTCATCA AAGAGGGTAA 10 GATGAGTTTG TTGTTATCGA AAGAAAGAAG CGGAGCTTGT· CGACAAATAC AAGTGATATT TCTGTAACAG CTACCAACGA CAGTCGCCTC TATCCTGGAG CACTTCTCGT AGTGGATGAG ACCTTGTTAG AGAATAATCC CACTCTTCTT GCGGTCGATC GTGCTCCGAT GACTTATAGT ATTGATTTGC CTGGTTTGGC 15 AAGTAGCGAT AGCTTTCTCC •AAGTGGAAGA TCCCAGCAAT TCAAGTGTTC GCGGAGCGGT AAACGATTTG TTGGCTAAGT GGCATCAAGA TTATGGTCAG GTCAATAATG TCCCAGCTAG AATGCAGTAT GAAAAAATCA CGGCTCACAG CATGGAACAA CTCAAGGTCA AGTTTGGTTC TGACTTTGAA AAGACAGGGA · 20 ATTCTCTTGA TATTGATTTT AACTCTGTCC ATTCAGGCGA AAAGCAGATT CAGATTGTTA ATTTTAAGCA GATTTATTAT ACAGTCAGCG TAGACGCTGT TAAAAATCCA GGAGATGTGT TTCAAGATAC TGTAACGGTA GAGGATTTAA AACAGAGAGG AATTTCTGCA GAGCGTCCTT TGGTCTATAT TTCGAGTGTT 25 GCTTATGGGC GCCAAGTCTA TCTCAAGTTG GAAACCACGA GTAAGAGTGA TGAAGTAGAG GCTGCTTTTG AAGCTTTGAT (AAAAGGAGTC AAGGTAGCTC CTCAGACAGA GTGGAAGCAG. ATTTTGGACA ATACAGAAGT GAAGGCGGTT ATTTTAGGGG. GCGACCCAAG TTCGGGTGCC CGAGTTGTAA CAGGCAAGGT GGATATGGTA GAGGACTTGA TTCAAGAAGG CAGTCGCTTT - ACAGCAGATC ATCCAGGCTT GCCGATTTCC TATACAACTT 5 CTTTTTTACG TGACAATGTA GTTGCGACCT TTCAAAATAG TACAGACTAT GTTGAGACTA AGGTTACAGC TTACAGAAAC GGAGATTTAC TGCTGGATCA TAGTGGTGCC TATGTTGCCC AATATTATAT TACTTGGAAT GAATTATCCT ATGATCATCA AGGTAAGGAA GTCTTGACTC CTAAGGCTTG GGACAGAAAT 10 GGGCAGGATT TAACGGCTCA CTTTACCACT agtattcctt TAAAAGGGAA TGTTCGTAAT CTCTCTGTCA AAATTAGAGA GTGTACCGGG CTTGCTTGGG AATGGTGGCG TACGGTTTAT GAAAAAACCG ATTTGCCACT AGTGCGTAAG CGGACGATTT CTATTTGGGG AACAACTCTC TATCCGCAGG TAGAAGATAA 15 GGTAGAAAAT GAC

    8Q

    120

    160 '200 240

    280

    320

    360'

    400

    440

    480

    520

    560

    600

    640'

    68 0

    720

    760

    800

    840

    880

    920

    960

    1000

    1040

    1080

    1120

    1160

    1200

    1240

    1280

    1320

    1360

    1400

    1413 • · · · • · · · i · · • · · · · · a kde zmíněné nukleotidové sekvence obsahují jednu nebo více nukleotidových substitucí vybraných ze skupiny mající:

    A-50->G, G-54—>T, T-181->C, Α-196-/Γ a T-302^C nebo

    A-122—>G, A-514—»G, T-583-> A a A-764^G nebo

    Α-187-/Γ, T-380—>A, A-382-^C a T-443->A nebo

    T-98—>C, T-137—»C, T-248—>C, T-717^A a A-770->G nebo

    T-134-»C, A-305—>G, A-566^G a T-583->G.
17. 18. Rekombinantní nukleokyselinová molekula obsahující sekvenci na obr. 1 a také následující nukleokyselinovou sekvenci: T-583—>G.
18. 19. Rekombinantní nukleokyselinová molekula obsahující sekvenci na obr.l a také následující nukleokyselinovou sekvenci: T-583—>A.
19. 20. Rekombinantní nukleokyselinová molekula obsahující sekvenci na obr. 1 a také následující nukleokyselinovou sekvenci: T-443->A.
20. 21. Rekombinantní nukleokyselinová molekula obsahující sekvenci na obr. 1 a také následující nukleokyselinovou sekvenci: T-l81->C.
21. 22. Rekombinantní nukleokyselinová molekuly podle některého z nároků 16 až 21 obsažené ve vektoru jako plasmid, kosmid, bakteriofág nebo kvasinkový umělý chromosom.
22. 23. Mikroorganismy obsahující nukleokyselinovou molekulu podle některého z nároků 16 až 22.
23. 24. Mikroorganismy podle nároku 23 vybráné ze skupiny stávající z bakterií, kvasinek, savčích a hmyzích buněk.
24. 25. Mikroorganismy podle nároku 23, které jsou E. coli.
25. 26 Modifikované pneumolysinové polypeptidy podle některého z nároků 1 až 15, které jsou konjugovány s bakteriálními polysacharidy.
26. 27. Modifikované pneumolysinové konjugáty podle nároku 26 vyznačující se tím, že bakteriální polysacharidy jsou z bakterií vybraných ze skupiny obsahující Haemophilus influenzae typu b, meningokokální skupinu A, B, C; skupinu B streptokokových typů la, lb, II, III, V nebo Vil a pneumokoky.
27. 28. Vakcína obsahující nejméně jeden z polypeptidů podle nároků 1 až 15 a farmaceuticky akceptovatelný nosič.
28. 29. Vakcína podle nároku 28, ve které je peptid konjugovaný s bakteriálním polysacharidem.
29. 30. Vakcína podle nároku 29, ve které je bakteriální polysacharid vybrán ze skupiny skládající se z Heamophilus influenzae typu b; meningokokových skupin A, B nebo C; streptokokové skupiny A nebo skupiny B streptokokových sérotypů Ia, Ib, II, III, V nebo VII; nebo z jednoho nebo více sérotypů 1-23 5. pneumoniae.
30. 31. Způsob zabíjení baktérií vyznačující se tím, že dostává do kontaktu zmíněné bakterie s protilátkami k imunogenní molekule obsahující modifikovaný pneumolysin podle některých z nároků 1 až 15 za přítomnosti doplňku.
31. 32. Způsob podle nároku 31 vyznačující se tím, že imunogenní molekula je polysacharidovýpolypeptidový konjugát, a že polysacharidy jsou bakteriální kapsulární polysacharidy.
32. 33. Způsob imunizace savců vyznačující se tím, že jsou vakcíny podle některého z nároků 28 až 30 podány zmíněným zvířatům.
33. 34. Způsob získání modifikovaných pneumolysinových polypeptidů majících redukovanou hemolytickou aktivitu a jsou vhodné pro vyvolání imunogenní odpovědi, která je reaktivní s divokým typem pneumolysinu vyznačující se tím, že zahrnuje tyto kroky:

    a) náhodnou mutaci nukleokyselinové molekuly kódující divoký typ pneumolysinu produkující mutantní nukleokyselinové molekuly kódující modifikované pneumolysinové polypeptidy a expresi mutantních nukleokyselinových molekul v hostitelských buňkách;

    b) zkoušku hemolytické aktivity modifikovaných polypeptidů exprimovaných v hostitelských buňkách;

    c) identifikaci dobře svinutých modifikovaných pneumolysinových polypeptidů mající značně podobnou molekulovou hmotnost jako nativní pneumolysin divokého typu.