JP3245298B2 - 肺炎球菌表面プロテインaのエピトープ領域 - Google Patents

肺炎球菌表面プロテインaのエピトープ領域

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JP3245298B2 JP08073594A JP8073594A JP3245298B2 JP 3245298 B2 JP3245298 B2 JP 3245298B2 JP 08073594 A JP08073594 A JP 08073594A JP 8073594 A JP8073594 A JP 8073594A JP 3245298 B2 JP3245298 B2 JP 3245298B2
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Description

【発明の詳細な説明】
【0001】
【産業上の利用分野】本発明は、肺炎球菌(Strep
tococcus pneumoniae)の主要病原
性因子である肺炎球菌表面プロテインA(PspA)の
エピトープ領域の識別に関する。
【0002】
【従来の技術】肺炎球菌は、中耳炎、髄膜炎、菌血症お
よび肺炎の重要な原因菌である。抗生物質およびワクチ
ンの使用にもかかわらず、肺炎球菌感染症の罹患率は過
去25年間にほとんど低下しなかった。
【0003】肺炎球菌の免疫が肺炎球菌の多糖体莢膜に
対する特異的抗体によって媒介され得ることは一般に認
められている。しかし、新生児および幼児は多糖体抗原
に対して免疫応答ができず、同じ莢膜血清型が関与する
感染を繰り返し得る。
【0004】多数の被莢膜細菌に対して幼児を免疫する
ための一つのアプローチは、莢膜多糖体抗原をタンパク
質と抱合させてそれらを免疫原性にすることである。こ
のアプローチは、例えば、インフルエンザ菌b(Hae
mophilus influenzae (米国特
許4、496、534(Gordon)および米国特許
4、673、574(Anderson)を参照された
い)で成功している。しかし、肺炎球菌に関しては80
以上の莢膜血清型が知られており、そのうち23が疾患
の大半に関与しているものである。肺炎球菌多糖体−タ
ンパク質抱合体を成功させるためには、ほとんどの肺炎
球菌感染症に関与する莢膜型を充分に免疫原性にしなけ
ればなければならない。このアプローチは困難であるか
もしれない。なぜならば、現在入手可能なワクチンに含
まれる23の多糖体は、大人に用いられた場合でさえ
も、全てが充分に免疫原性ではないからである。さらに
そのようなワクチンの生産は、慣用される他の小児ワク
チンのいずれよりもおそらくずっと高価につくことが予
想される。
【0005】小児、それにまた高齢者を肺炎球菌感染か
ら防御するための別のアプローチとしては、防御的免疫
応答を誘発し得るタンパク質抗原を同定することが考え
られる。そのようなタンパク質はそれだけでワクチンと
して使用できるかもしれないし、好結果の多糖体−タン
パク質抱合体とともに、または多糖体の担体として用い
られるかもしれない。
【0006】McDanielら(I)(J.Exp.
Med.160:386−397、1984)には、肺
炎球菌上の細胞表面タンパク質を識別するハイブリドー
マ抗体の生産およびある被莢膜肺炎球菌株の感染からの
マウスの防御に関する記載がみられる。この表面タンパ
ク質抗原は、「肺炎球菌表面プロテインA」または略し
てPspAと呼ばれる。
【0007】McDanielら(II)(Micro
bial Pathogenesis 1:519−5
31、1986)には、PspAの特徴づけに関する研
究の記述がある。McDaniel(II)、McDa
niel(III)(J.Exp.Med.165:3
81−394、1987)、Waltmanら(Mic
rob.Pathog.8:61−69、1990)お
よびCrainら(Infect.Immun.58:
3293−3299、1990)の結果から、異なる菌
株のPspAはエピトープおよび見かけの分子量に関し
てかなりの相違をしばしば示すこともまた明かであっ
た。
【0008】McDanielら(III)には、X−
連鎖免疫不全(XID)マウスをPspA発現無莢膜肺
炎球菌で免疫した場合には続いての肺炎球菌による致死
的感染は防御されたが、PspAを欠失している同一肺
炎球菌で免疫した場合には防御されなかったことが開示
されている。
【0009】McDanielら(IV)(Infec
t.Immun.59:222−228、1991)に
は、莢膜型6Aおよび3の肺炎球菌株に対する防御を誘
導することができるPspAの組換え全長フラグメント
によるマウスの免疫に関する記述がある。
【0010】Crainら(上記)には、肺炎球菌株の
臨床および研究室分離株のPspAを100%(n=9
5)検出するウサギ抗血清に関する記述がある。Psp
Aに対する七つのモノクローナル抗体との反応で、57
の肺炎球菌分離株が31の異なるパターンの反応性を示
した。したがって、多数の血清学的に異なるPspAが
存在するが、PspA間には広範な交差反応がある。
【0011】PspAタンパク質型は、莢膜型には依存
しない。遺伝的突然変異または環境中での交換によっ
て、莢膜、PspAおよびおそらく多様な構造を有する
他の分子に関して著しく異なる菌株の大きなストックが
形成され得たものと考えられる。異なる菌株からのPs
pAの多様性はまた、67〜99kDの範囲である分子
量においても明かである。観察される相違は、安定して
継承されるものでタンパク質崩壊の結果ではない。
【0012】McDanielら(IV)(Infec
t.Immun.59:222−228、1991に記
述されているように、組換えλgt11クローンからの
部分精製PspAによる免疫によって、異なる莢膜およ
びPspA型を代表するいくつかの肺炎球菌株のチャレ
ンジに対する防御が誘導された。PspAを発現するク
ローンはこの文献にしたがって構築されたが、産生物は
不溶性で、細胞断片からの溶解後の分離は不可能であっ
た。
【0013】異なる肺炎球菌株間でタンパク質の構造は
異なるが、全てのPspA間で多くの交差反応が存在
し、これは単一のPspAまたは少なくとも少数のPs
pAで多数の肺炎球菌株に対する防御が誘導され得るに
充分な共通エピトープが存在している可能性があること
を示唆している。
【0014】とくに上記した公表文献に加えて、本発明
者および共同研究者は、PspAに関するさらなる詳細
を次のように発表している。
【0015】1. 第89回米国微生物学会年次総会要
旨集、p125、項D−257,1989年5月 2. 第90回米国微生物学会年次総会要旨集、p9
8、項D−106、1990年5月 3. 第3回連鎖球菌遺伝学に関する国際ASM学会要
旨集、p11、項12、1990年6月 4. Talkingtonら、Infect.Imm
un.59:1285−1289、1991 5. Yotherら(I)、J.Bacterio
l.174:601−609、1992 6. Yotherら(II)、J.Bacterio
l.174:610ー618、1992 7. McDanielら(V)、Microbiol
Pathogenesis、13:261−268 米国特許出願中の出願番号656、773および83
5、698(公開WO92/14488に対応)および
Yotherら(I)および(II)には、免疫原性不
完全型のPspAタンパク質を分泌する肺炎球菌の突然
変異株の調製および分泌タンパク質の分離および精製に
関する記述がある。不完全型のPspAは、免疫防御性
であってPspAの防御的エピトープを含むことが見出
だされた。ここでいうPspAタンパク質は生理学的溶
液に可溶性で、少なくとも機能的細胞膜アンカー領域を
欠いている。
【0016】以下の明細およびそれに付した図面におい
て、アミノ酸の表記には容認されている省略記号を用い
る。表1にそれら略号を示す。
【0017】
【表1】 表1 アミノ酸省略記号 A=Ala=アラニン M=Met=メチオニン C=Cys=システイン N=Asn=アスパラギン D=Asp=アスパラギン酸 P=Pro=プロリン E=Glu=グルタミン酸 Q=Gln=グルタミン F=Phe=フェニルアラニン R=Arg=アルギニン G=Gly=グリシン S=Ser=セリン H=His=ヒスチジン T=Thr=スレオニン I=Ile=イソロイシン V=Val=バリン K=Lys=リジン W=Try=トリプトファン L=Leu=ロイシン Y=Tyr=チロシン
【0018】
【発明が解決しようとする課題】本発明によって、防御
誘導エピトープを含むだけではなく他の肺炎球菌株から
の他のPspAとも充分な交差反応性を示す、肺炎球菌
のRx1株からのPspAの68個のアミノ酸からなる
領域が確認され、これはしたがって組換えPspAワク
チンに組み入れるためのPspA領域としての使用に適
している。
【0019】68個のアミノ酸配列は、Rx1PspA
タンパク質のアミノ酸残基192から260までの範囲
である。ここではとくにRx1PspAタンパク質の特
定の68個のアミノ酸配列を開示するが、Rx1Psp
Aタンパク質のこの配列に相同の他のいかなる肺炎球菌
種からのPspAタンパク質のいかなる領域も本発明の
範囲に含まれる。それには例えばD39およびR36A
株からのものがある。
【0020】したがって、ひとつには本発明は、肺炎球
菌のRx1株のPspAタンパク質のアミノ酸残基19
2から260までからなり、少なくともひとつの防御誘
導エピトープを含む単離PspAタンパク質フラグメン
トを提供する。
【0021】このタンパク質フラグメントは、Rx1株
のPspAタンパク質のアミノ酸残基192から260
までに対応するまたは相同するアミノ酸配列を含むもの
であればよく、したがって、これらアミノ酸配列を含む
ものよりも大きいフラグメントからなるものでもよい。
【0022】本発明のタンパク質フラグメントは、組換
えによって産生される該タンパク質フラグメントを含む
不完全なC末端欠落産生物でもよく、とくに天然のPs
pAタンパク質のαヘリックス領域のC末端約3分の1
を含む不完全C末端欠失産生物でもよい。
【0023】本発明はまた、肺炎球菌のRx1株のPs
pAタンパク質のアミノ酸残基192から260までに
含まれるタンパク質誘導エピトープのアミノ酸配列に対
応するアミノ酸配列からなる単離されたタンパク質フラ
グメントを含む。
【0024】
【課題を解決するための手段】上記の先の米国特許出願
およびYotherら(I)および(II)に記述され
ているように、Rx1株のpspA遺伝子は588個の
アミノ酸からなる65kDaの分子をコードする。ヌク
レオチド配列(配列番号:1)および派生するアミノ酸
配列(配列番号:2)は第3図から5図に示す通りであ
る。なお第3図、第4図および第5図は左上から右下に
それぞれの示している連鎖が連続しているものを示して
いる。分子のN末端側半分は電荷が高く、第2図に示さ
れるように、そのDNA配列からこの領域(288個の
アミノ酸)のαヘリックス螺旋状コイルタンパク質構造
が予想される。αヘリックスではないPspAのC末端
側半分は、プロリンに富む領域(83個のアミノ酸)お
よび高保存性の20個のアミノ酸反復配列を含む反復領
域、それにC末端に17個のアミノ酸のわずかに疎水性
の配列を含む。PspAは肺炎球菌にそのC末端半分に
よってアンカーされることが知られており、プロリンに
富む領域が分子を細胞壁にからませる役割を果たすよう
である。加えて、高荷電αヘリックス領域は細胞壁に始
まって、莢膜中に、あるいは莢膜を貫通して伸びている
ことが予想される。このモデルは、αヘリックス領域が
肺炎球菌表面上のPspAと反応するモノクローナル抗
体(MAb)によって識別される全ての表面露出エピト
ープを含むという観察によって支持される。
【0025】肺炎球菌のRx1株のPspAタンパク質
は、防御誘導エピトープの位置を決定するためのマッピ
ングされた。そのようなマッピングは、PspAタンパ
ク質に対する抗体およびPspAの組換えフラグメント
を用いることによって達成された。後の実施例で詳記す
るこのマッピング技術によって、PspAのαヘリック
ス領域のC末端3分の1に対応するアミノ酸配列、とく
にRx1PspAタンパク質のアミノ酸残基192から
260に、防御誘導エピトープが含まれることが同定確
認された。アミノ酸残基の192から260までのアミ
ノ酸配列は、αヘリックス配列のC末端3分の1であっ
て、細胞壁表面に近接していると考えられる。
【0026】残基192から260までの配列部分には
68個のアミノ酸しか含まれないことから、この大きさ
の個々のPspAタンパク質フラグメントは最適な抗原
性を示さないかもしれない。この問題は、いくつかの
spA遺伝子の適当な部分の遺伝子融合によって発現さ
れる異なるPspAのタンデムフラグメントを含む組換
えタンパク質を産生することによって解決される。
【0027】したがって、本発明のさらなる目的は、複
数の抱合した分子からなるPspAタンパク質フラグメ
ントを提供することであって、各分子は肺炎球菌のRx
1株のPspAのアミノ酸残基192〜260からな
り、少なくとも一つの防御誘導エピトープを含み、各分
子は肺炎球菌の異なる株に由来する。
【0028】そのようなタンデム分子は、継ぎ目部分で
正しい螺旋状コイル構造が維持され、免疫原性を有する
に充分な大きさで、さらに広範囲のPspAと交差反応
するすることができる一連の防御誘導エピトープが発現
され得るように操作構築することができる。代わりに、
組換えによって産生された個々のペプチドを化学的手法
によってコンジュゲートさせて複合分子を形成してもよ
い。
【0029】さらに別の方法としては、組換え融合産物
として、または化学的結合によって、例えば共有結合あ
るいはイオン結合などによって、PspAフラグメント
をより大きな担体タンパク質または細菌細胞とコンジュ
ゲートさせてもよい。
【0030】ここで提供されるタンパク質フラグメント
およびそのペプチド対応物は、肺炎球菌感染によって引
き起こされる疾患に対するワクチンの成分として有用で
ある。したがって、本発明のさらなる目的は、それの免
疫学的活性成分としてここに定義されるPspAタンパ
ク質フラグメントからなるワクチンを提供することにあ
る。
【0031】以下の実施例および図面においては、完全
なまたは不完全なpspA遺伝子配列を含む特定のプラ
スミド材料が参照として用いられている。次の表2はそ
れら材料の摘要である。
【0032】
【表2】 表2 プラスミド 同定 遺伝子産物 pKSD1014 全遺伝子 アミノ酸1〜588 pJY4284または pJY4285 5′末端領域 アミノ酸1〜115 pJY4310 5′末端領域 アミノ酸1〜192 pJY4306 5′末端領域 アミノ酸1〜260 pBC207 3′末端領域 アミノ酸119〜588 pBC100 3′末端領域 アミノ酸192〜588
【0033】
【実施例】
[実施例1]本実施例では、ここで用いられる細菌菌
株、プラスミドおよびハイブリドーマ抗体について説明
する。
【0034】以下の表3のように同定された肺炎球菌株
を、0.5%の酵母抽出液を加えたトッド・ヒュイット
液体培地中で37°で、または3%のヒツジ血液を含む
血液寒天プレート上でキャンドル・ジャー中で増殖させ
た。大腸菌(E.coli)株DH1(Hanaha
n、J.Mol.Biol.166:557)はLB培
地または最少E培地中で増殖させた。プラスミドには、
pUC18(Gene33:103)、pJY4163
(Yotherら(II))、およびpIN−III−
ompA(EMBO J.3:2437)が含まれる。
【0035】全ての抗体分泌ハイブリドーマ系は、非抗
体分泌骨髄腫細胞系P3−X63−Ag.8.653
(J.Immunol.123:1548)との融合に
よって得られた。用いられる特異的抗体は以下の表3の
ように同定される。抗PspAハイブリドーマ細胞系X
i64、Xi126およびXiR278は先にMcDa
nielら(I)およびCrainら(上記)に記述さ
れている。残りの細胞系は、CBA/NマウスをMcD
anielら(I)に記載の手法でλgtII中で発現
させた組換えD39PspAで免疫することによって調
製した。PspAに対する抗体を産生する細胞系は、マ
イクロ滴定プレートを加熱殺菌(60℃、30分)した
肺炎球菌株R36AまたはRx1でコートしたELIS
Aを用いてすべて同定した。これによってPspA上の
表面露出エピトープと反応するこれらMAb(モノクロ
ーナル抗体)が選択される。MAbの重鎖アイソタイプ
を、IgMおよびIgGマウス免疫グロブリンのμおよ
びγ重鎖に特異的なアフィニティ精製ヤギ抗体を用いて
ELISAを展開することによって決定した。MAbの
PspAに関する特異性は、イムノブロット分析によっ
て確認した。
【0036】表3のようにXiR1526、XiR3
5、XiR1224、XiR16、XiR1325およ
びXiR1323と同定された六つの新たに産生された
MAbの全てが、Rx1およびD39株のイムノブロッ
ト中で予想された大きさ(見かけの分子量84kDa)
のタンパク質を検出した。Rx1のPspA変異株であ
るWG44.1株(McDanielら(III)およ
びYotherら(II)を参照されたい)のイムノブ
ロット中ではいずれのMAbでも反応性は認められなか
った。
【0037】
【表3】 [実施例2]本実施例では、pspAの肺炎球菌株Rx
1からのポリメラーゼ連鎖反応(PCR)によるpsp
遺伝子の作製について説明する。
【0038】肺炎球菌株Rx1からのpspA遺伝子の
配列に基づいてPCRプライマーをデザインした(第3
〜5図参照)。5′プライマーはLSM3およびLSM
4であった。LSM3は28塩基長で塩基576から始
まり、LSM4は31塩基長で塩基792から始まり、
双方とも追加のBamHI部位を含んだ。3′pspA
プライマーは、33塩基長で塩基1990で始まり追加
SalI部位を含んだLSM2であった。。
【0039】プライマーのヌクレオチド配列は以下の通
りである。 LSM2 5'-GCGCGTCGACGGCTTAAACCCATTCACCATTGG-3'(配列
番号:3) LSM3 5'-CCGGATCCTGAGCCAGAGCAGTTGGCTG-3'(配列番
号:4) LSM4 5'-CCGGATCCGCTCAAAGAGATTGATGAGTCTG-3'(配列番
号:5) 約10ngのRx1肺炎球菌ゲノムDNAを5′および
3′プライマー対を用いて複製した。試料を最終濃度で
50mM KCl、10mMトリス−HCl(pH8.
3)、1.5mM MgCl2、0.001%ゼラチン、
0.5mMの各プライマーおよび200mMの各デオキ
シヌクレオシド三燐酸および2.5UのTagDNAポ
リメラーゼを含む全容量50μlに調製した。50μl
の鉱油を試料に載せてから、試料を94℃で2分間変性
させて、次いで94℃1分間、50℃で2分間および7
2℃で3分間のサイクルを10回繰り返し、さらに94
℃1分間、50℃2分間および72℃3分間のサイクル
を別に20回繰り返し処理した。この30サイクルを終
了した後、4℃に冷却する前に、試料を72℃でさらに
5分間保持した。 [実施例3]本実施例は、不完全PspA分子の発現に
ついて説明するものである。
【0040】大腸菌中のN末端フラグメントを発現して
同フラグメントを肺炎球菌から放出させる3′欠失ps
pAを、上記の米国特許出願番号835、698および
656、773(さらに上記のYotherら(II)
も参照されたい)に記述されたようにして構築した。
【0041】5′欠失pspA構造の発現のために分泌
ベクターpIN−III−ompAを用いた。複製され
pspAフラグメントをBamHIおよびSalIで
消化して、適当にBamHI/SalI消化pIN−I
II−ompAベクター中に連結させて、これによって
ompAリーダー配列に融合した挿入フラグメントをl
acプロモーターの枠内制御下に形成することができ
る。大腸菌DH1の形質転換体を、カザミノ酸(0.1
%)、グルコース(0.2%)およびチアミン(0.0
5mM)および50μg/mlのアンピシリンを添加し
た最少E培地上で選択した。
【0042】lac発現の誘導のために、細菌を660
nmで約0.6の最高密度になるまで37℃で最少E培
地中で増殖させて、IPTGを2mMの濃度にまで加え
た。細胞を37℃でさらに2時間インキュベートして、
集菌して、ペリプラズム内容物を浸透圧衝撃によって放
出させた。種々のプラスミドによって産生された不完全
pspAタンパク質のイムノブロットを第6図に示す。
【0043】これらの操作処理によって、3′欠失ps
pAとしてプラスミドpJY4284、pJY428
5、pJY4310およびpJY4306、そして5′
欠失pspAとしてプラスミドpBC207およびpB
C100が作製された。プラスミドpJY4284およ
びpJY4285は、564塩基対の挿入物を含み、こ
れはヌクレオチド1〜564であって、アミノ酸1〜1
15に対応する予想された13kDaのPspAのC末
端欠失産物をコードするものである。プラスミドpJY
4310は、795塩基対の挿入物を含み、これはヌク
レオチド1〜795であって、アミノ酸1〜192に対
応する予想された21kDaのC末端欠失産物をコード
するものである。しかし、pJY4306は、999塩
基対の挿入物を含み、これはヌクレオチド1〜999で
あって、アミノ酸1〜260に対応する予想された29
kDaのC末端欠失産物をコードするものであった。プ
ラスミドpBC100は、1199塩基対の挿入物を含
み、これはヌクレオチド792〜1990であって、ア
ミノ酸192〜588を含む予想された44kDaのP
spAのN末端欠失産物をコードするものであった。p
BC207は、1415塩基対の挿入物を含み、これは
ヌクレオチド576〜1990であって、アミノ酸11
9〜588を含む予想された52kDaのPspAのN
末端欠失産物をコードするものであった。
【0044】これらプラスミド中に含まれるpspA
伝子配列は、第2図に同定されるようなアミノ酸をコー
ドし、発現する。 [実施例4]本実施例は、イムノアッセイを実施するた
めの操作処理を説明するものである。
【0045】イムノブロット分析を、McDaniel
ら(IV)に記述にようにして行った。実施例3の記述
のようにして調製した不完全PspA分子またはPsp
Aを濃厚富化した肺炎球菌調製物(McDanielら
(II)に記載)を、10%ドデシル硫酸ナトリウムポ
リアクリルアミドゲル中で電気泳動して、ニトロセルロ
ース上で電気ブロットした。ブロットを実施例1の記述
のようにして調製したそれぞれのMAbと反応させた。
【0046】イムノブロットで観察された反応性を定量
的に確認するために、直接結合ELISA法を用いた。
この操作処理において、浸透圧衝撃調製物を全タンパク
質濃度3μg/mlに燐酸塩緩衝生理食塩水(PBS)
中で希釈して、100μlをイムロン(Immuln)
4マイクロ滴定プレートのウェルに加えた。1%ウシ血
清アルブミンPBS溶液でブロックした後、それぞれの
MAbの未分画組織培養上清を、7個のウェルの3倍連
続希釈を用いて二重に力価測定して、ヤギ抗マウス免疫
グロブリン−アルカリホスファターゼ抱合第二抗体およ
びアルカリホスファターゼ基質を用いてMcDanie
lら(IV)に記述の方法で展開した。プレートをダイ
ナテク(Dynatech)プレートリーダーで405
nmで読み、30%終点を各抗体と各調製物について算
出した。
【0047】MAbの防御能を試験するために、3匹の
CBA/Nマウスに103CFUのWU2またはD39
肺炎球菌(>100×LD50)を静脈注射する1時間前
に0.1mlの1/10希釈(約5〜30μg)の各ハ
イブリドーマ抗体を腹腔内注射した。防御能は、グルー
プ中の全マウスの死亡を阻止する能力によって判定し
た。防御されなかったマウスは全て、チャレンジ後48
時間内に肺炎球菌感染によって死んだ。 [実施例5]本実施例は、実施例1に記述のモノクロー
ナル抗体を用いるPspA上のエピトープのマッピング
について説明する。
【0048】実施例1に記述され表3に同定された六つ
の新規産生モノクローナル抗体を、先に記述のモノクロ
ーナル抗体Xi64、Xi126およびXiR278と
ともにPspA上のエピトープのマッピングに用いた。
【0049】各MAbが異なるエピトープを識別したか
どうかを決定するために、各MAbを表3に同定したよ
うな八つの追加の肺炎球菌株とSDS−PAGE分離タ
ンパク質のイムノブロット中で反応させた。七つの異な
るパターンの活性が観察された。XiR16、XiR3
5およびXiR1526の三つの抗体がRx1PspA
上に見出されるエピトープを識別するように見えたが、
他のいずれのPspAも識別するようには見えなかっ
た。したがって、これら三つの抗体がRx1PspAと
同じエピトープと全て反応する可能性が考えられた。
【0050】MAb Xi64およびXi126の双方
ともATCC101813、WU2およびRx1Psp
A上のエピトープとだけ強く反応するが、他の菌株のP
spAとは反応しなかった。しかし、PspAのより広
範のパネルの研究(McDanielら(III)およ
びCrainらに記述)から、Xi126およびXi6
4は異なる抗原決定基を識別することが知られている。
【0051】残りの四つの抗体はそれぞれ、PspAの
パネルと特徴的な反応性パターンを示した。したがっ
て、試験した九つ抗体はPspA上の少なくとも七つの
異なるエピトープを識別した。
【0052】明瞭ではない理由から、タイプ2株D39
は、PspAに対する抗体の防御効果への特異な抵抗能
を有するようであった(Mcdanielら(IV)。
McDanielら(I)に記述されているように、D
39株に対する受動的防御には、WU2株と比較して4
0倍以上の量のXil26が必要であった。六つの新規
に産生されたモノクローナル抗体のいずれもD39株に
対して防御能を示さなかった。これに対して、Rx1P
spAでマウスを免疫すると、A66、WU2およびE
F6796株(それぞれマウス病原性肺炎球菌の莢膜型
3、3および6A)に対する防御作用が誘導されるが、
これらは全てRx1およびD39とは異なるPspA型
を有する(McDanielら(IV)を参照された
い)。Rx1の25型PspAとWU2の1型PspA
との間の高い血清学的近似性(Crainら)から考え
て、WU2肺炎球菌をMAbで受動防御されていたマウ
スのチャレンジに用いた。WUPspAを結合すること
が観察された五つのMAbの全てが1000CFUのW
U2の感染に対する受動的防御能を示した。防御的抗体
は、IgM、IgG1、IgG2bおよびIgG2a重
鎖アイソタイプクラスに見出だされた。 [実施例6]本実施例は、実施例3で形成された組換え
不完全PspA分子を用いるPspAのエピトープのマ
ッピングについて説明するものである。
【0053】実施例3に記述のようにして調製された第
2図に示す五つの重複しているC末端またはN末端欠失
PspAフラグメントを、PspA上のエピトープのマ
ッピングに用いた。実施例5に記述したように、各マウ
スMAbによって検出されたエピトープの一般位置を、
五つのC末端欠失および二つのN末端欠失PspA分子
を用いて決定した。陽性のコントロールとして、各抗体
の反応性を全長PspAを発現するクローンpKSD1
014を用いて調べた。
【0054】上記したように、MAbの反応性を二つの
方法によって決定した。一つの方法では、フラグメント
とMAbとの間の反応性をそれらをSDS−PAGEに
よって分離した後にフラグメント調製物をイムノブロッ
ティングして評価した。第二の方法では、MAbの非変
性PspAフラグメントとの反応性を定量するために直
接ELISAを用いた。
【0055】観察された反応性およびそのような活性の
定量的結果を表4に示す。
【0056】
【表4】 エピトープの予想される位置を第1図に示す。
【0057】表4のデータから明らかなように、抗体の
うちの三つ、すなわちXi126およびXiR35およ
びXiR1526は三つのC末端欠失クローンの全てと
イムノブロット分析において強く反応し、これは三つ全
部によって検出されたエピトープを形成するために必要
な配列がPspAの最初の115個のアミノ酸配列内に
あることを示している。このマッピング位置は、それぞ
れ最初の119および191個のアミノ酸を欠失してい
るN末端欠失クローンのいずれともこれら抗体が反応で
きなかったことと合致する。
【0058】MAbXiR1224はイムノブロットに
よって最長のC末端欠失フラグメント(pJY430
6)と強く反応したが、より短い二つのC末端欠失フラ
グメントとは実質的により弱い反応を示した。この結果
は、抗体結合部位は最初の115個のアミノ酸配列中に
あるかもしれないが、アミノ酸192より先の残基がエ
ピトープの構造または安定性に重要である可能性がある
ことを示している。
【0059】イムノブロットによって、Xi64,Xi
R1325およびXiR278の三つの抗体の全てが最
長C末端欠失フラグメントおよびN末端欠失フラグメン
トの両方と反応することが示され、したがってそれらの
決定基がアミノ酸位置192と260の間に位置するこ
とがわかった。一般的な確証的結果は、天然分子を用い
るELISAで得られた。しかし、二、三の場合、ある
抗体についてイムノブロットでは不完全フラグメントと
の反応を示すにもかかわらず、ELISAでは全長Ps
pAを用いての反応が観察されても同じ不完全分子との
反応は観察されなかった。これらの観察結果は、全長P
spAおよび変性フラグメント中に存在する決定基の形
成をマスクしたり阻害するような生理学的条件下で不完
全フラグメントの構造が変化することによるのかもしれ
ない。
【0060】XiR216およびXiR1323の二つ
の抗体は、最初は奇異に見えた反応を示したが、これは
抗体によって検出されたエピトープが一つ以上のPsp
A部位にある可能性を示している。この予期しない結果
をかんがみて、不完全フラグメントの二組の調製物を用
いてアッセイを複数回繰り返した。追加のアッセイの結
果、これら二つのMAbに関するエピトープの二位置マ
ッピングが確認された。
【0061】イムノブロッティングによって、MAbX
iR16は二つの最長のC末端欠失フラグメントと強く
反応したが、最短のN末端欠失フラグメントとは反応し
なかった。したがって、検出されたエピトープは、N末
端から位置192までにあると考えられる。予期に反し
て、MAbXiR16はイムノブロットで最長のN末端
欠失フラグメント(残基119〜158)および最短の
C末端欠失フラグメント(残基1〜115)の双方と弱
く反応した。フラグメントが重複しないことから、そし
てフラグメントとの弱いイムノブロット反応性(ELI
SAによっては見られない反応性)が人為的結果でなけ
れば、MAbXiR16は両フラグメント上のエピトー
プを識別するに違いない。
【0062】MAbXiR1323の場合、イムノブロ
ットデータによると、検出されたエピトープは位置19
2と260との間に明確に位置づけされる。しかし、E
LISA分析では、XiR1323はC末端欠失フラグ
メントのpJY4310(アミノ酸残基1〜192)お
よび最短のN末端欠失フラグメントのpBC100(ア
ミノ酸残基192〜588)の双方と強いかつ再現性を
有する反応性を示した。奇異なことに、MAb1323
はイムノブロットによってpJY4306(アミノ酸残
基1〜260)と強く反応したにもかかわらず、MAb
XiR1323とpJY4306とのELISA反応は
観察されなかった。
【0063】これらの観察結果は、PspAの抗原決定
基に末端構造が影響することをさらに証明する。また、
天然のフラグメント上では、MAbXiR1323は位
置192の両側にあるエピトープを識別することを示
す。他のPspAにおけるエピトープの発現とRx1P
spAにおけるそれらの位置との関係は、抗体をそれら
のPspAにおける見かけのマップ位置によって列挙し
た表4に示されている。N末端〜位置116のエピトー
プを明らかに識別する五つの抗体(XiR16を含む)
が表4の左側に記載されている。C末端〜位置192の
エピトープを明らかに識別する四つの抗体が表4の右側
に記載されている。N末端〜位置192の五つのエピト
ープのうちの三つ(XiR1526、XiR35および
XiR16で識別されるもの)は試験した他の八つのP
spAのいずれにも見出だせなかった。一つのエピトー
プ(XiR1224によって識別される)は他の一つの
菌株によって弱く発現され、別のエピトープ(Xi12
6によって識別される)は他の二つの菌株上で発現され
た。これに対して、PspAのαヘリックス領域のC末
端3分の1に存在する四つのエピトープはそれぞれ2〜
6の他の菌株中に存在した。N末端〜位置192の領域
と較べてC末端〜位置192の領域の保存性は、カイ平
方および二サンプル順位検定の双方でP<0.05で有
意に大きいことが示された。マッピングの結果(表3)
および菌株分布の結果(表4)から、XiR35および
XiR1526を考え得る例外として、全ての抗体は異
なるPspA決定基を識別するに違いないことが明かで
ある。 [実施例7]本実施例には、実施例6で得られたマッピ
ングの結果の検討が含まれる。
【0064】実施例6に記述した結果は、PspAの防
御誘導エピトープが分子の表面露出αヘリックスの半分
のN末端側に限定されないことを明確に示している。事
実、肺炎球菌WU2に対して防御的な五つの抗体のうち
の四つがPspAのαヘリックス領域のC末端側3分の
1と反応した。αヘリックス領域のこの部分は細胞壁に
最も近接していると考えられる(Yotherら(I
I)を参照されたい)。
【0065】MAbの約半分がN末端〜アミノ酸115
で決定基を識別し、他の半分がC末端〜残基192でエ
ピトープを識別した。九つの抗体が加熱殺菌肺炎球菌の
全菌体表面上の天然PspAへの結合能によって選択さ
れたことから、それらが認識するエピトープの分布によ
って、位置115と192との間の決定基は免疫原性を
有していないかまたは肺炎球菌上に発現されたとき天然
分子上に露出していないかのいずれかであることが示唆
される。
【0066】奇異なことに、二つのMAb(XiR16
およびXiR1323)はPspA上の一つ以上の位置
のエピトープと反応する可能性があるように見えた。X
iR16に関するデータの大部分はエピトープがN末端
〜位置115にあることを示したが、弱いイムノブロッ
トパターンは反応性エピトープがC末端〜残基115に
も存在するかもしれないことを示唆している。XiR1
323の場合には、データの大部分がそのエピトープが
位置192〜260にあることを示した。しかし、EL
ISAアッセイは、残基1から192に伸びるC末端欠
失PspAフラグメントとの抗体の有意の反応性を示し
た。PspAのN末端側半分には広範な反復はないが、
螺旋状コイル部分に1回以上起きる二、三の短い反復配
列がある。それらの配列の一つはアミノ酸位置105、
133および147から始まるglu−glu−ala
−lysであり、別の一つは位置150および220か
ら始まるlys−ala−lys−leuである(第3
〜5図を参照されたい)。XiR1323の場合、抗体
は1〜192フラグメント上のエピトープと自然条件下
で反応し、変性条件下では反応しなかった。これは、こ
のエピトープが配座形態をとり、残基192と260と
の間で(自然および変性条件下のいずれでも)識別され
たエピトープと厳密に同一の配列ではないかもしれない
ことを示しているとも考えられる。
【0067】アミノ酸115と192との間のエピトー
プの露出の欠失を説明すると思われる一つのメカニズム
としては、αヘリックス配列のこの部分がそれ自身また
はPspAの他の部分に折り返されて簡単な螺旋状コイ
ル二量体よりもより複雑な螺旋状コイル構造を形成する
ことが考えられる。このようなことが起きるとすれば、
いかにしてPspA三次構造がときに離れたPspA構
造に依存し得るかが説明できる。このようなことが事実
起きているであろうという示唆は、不完全型のいくつか
が、全分子上で生理的条件下で検出されてSDS中で変
性後にフラグメント中に存在することが示された特定の
エピトープを、同条件下で発現しないという観察結果か
ら出てきたものである。
【0068】PspAワクチンにはいくつかの血清学的
に異なるPspAフラグメントが含まれる必要があるか
もしれないことから、交差防御的抗体を誘導する可能性
が最も高いそれぞれのPspAの部分のみをワクチンに
含ませることが望ましいと考えられる。ここにRx1P
spAについて提示した結果に基づけば、Rx1Psp
Aの残基192〜260に対応するPspA配列の部分
が組換えPspAワクチン中に含ませる最良のPspA
部分であると考えられる。PspAのこの部分のエピト
ープが他の菌株のPspAに存在する可能性は配列残基
1〜115部分にあるエピトープの3.5倍であり、調
べた九つの抗体のいずれもαヘリックス領域の真ん中の
3分の1と明確に反応しなかった。 [実施例8]本実施例は、PspAフラグメントによる
マウスの防御を示すものである。5匹のマウスを大腸菌
中でpBC207によって産生した精製フラグメントで
免疫し、別の5匹を大腸菌中でpBC100によって産
生した精製フラグメントで免疫した。ともに、フラグメ
ントをフロイントの完全アジュバントと混合して注射し
た。それぞれのフラグメントで免疫したマウスは全て、
WU2莢膜型3の肺炎球菌の100×LD50でのチャレ
ンジに抗して生存した。
【0069】さらに5匹のマウスに、アジュバント+非
PspA産生性大腸菌上での同等の調製物を注射した。
同投与量のWU2でチャレンジしたところ、全マウスが
死滅した。
【0070】本実施例で示したデータは、C末端からア
ミノ酸119までおよび192までのエピトープがそれ
ぞれ防御的免疫を誘導し得ることを結論として証明して
いる。この結果は、アミノ酸192から260までのP
spAの領域が防御誘導エピトープを含むという先の実
施例で見出だされた結果と一致している。 配列一覧 配列番号:1 pspA遺伝子のDNA配列(第3〜5
図) 配列番号:2 PspAタンパク質の論理的アミノ酸配
列(第3〜5図) 配列番号:3 PCRプライマーLSM2のヌクレオチ
ド配列 配列番号:4 PCRプライマーLSM3のヌクレオチ
ド配列 配列番号:5 PCRプライマーLSM4のヌクレオチ
ド配列
【0071】
【配列表】
(1)配列番号:1 (i)配列の特徴 (A)配列の長さ:2085塩基対 (B)配列の型:核酸 (C)鎖の数:二本鎖 (D)トポロジー:直鎖状 (ii)配列の型:タンパク質 (iii)仮定:ナシ (iv)アンチセンス:ナシ (vi)起源: (A)微生物:肺炎球菌 (B)菌株:Rx1 (vii)直接材料: (B)クローン:JY4313 (ix)特性: (A)名称/キー:イントロン (B)位置:1..2085 (ix)特性: (A)名称/キー:CDS (B)位置:接合点(127..1984) (xi)配列(配列番号:1)
【0072】
【表5】
【0073】
【表6】
【0074】
【表7】
【0075】(2)配列番号:2 (i)配列の特徴 (A)配列の長さ:619アミノ酸 (B)配列の型:アミノ酸 (D)トポロジー:直鎖状 (ii)分子型:タンパク質 (xi)配列(配列番号:2)
【0076】
【表8】
【0077】
【表9】
【0078】(3)配列番号:3 (i)配列の特徴 (A)配列の長さ:33塩基対 (B)配列の型:核酸 (C)鎖の数:一本鎖 (D)トポロジー:直鎖状 (ii)分子の型:DNA(ゲノム) (xi)配列(配列番号:3)
【0079】
【表10】
【0080】(4)配列番号:4 (i)配列の特徴 (A)配列の長さ:28塩基対 (B)配列の型:核酸 (C)鎖の数:一本鎖 (D)トポロジー:直鎖状 (ii)分子の型:DNA(ゲノム) (xi)配列(配列番号:4)
【0081】
【表11】
【0082】(5)配列番号:5 (i)配列の特徴 (A)配列の長さ:31塩基対 (B)配列の型:核酸 (C)鎖の数:一本鎖 (D)トポロジー:直鎖状 (ii)分子の型:DNA(ゲノム) (xi)配列(配列番号:5)
【0083】
【表12】
【図面の簡単な説明】
【図1】成熟PspAタンパク質の領域の図式的表示、
ならびに特定のモノクローナル抗体によって識別された
エピトープの一般位置の表示図である。
【図2】成熟PspAタンパク質の領域の図式的表示、
ならびに全長タンパク質(pKSD1014)をコード
する遺伝子配列、タンパク質のN末端部分の特定断片
(pJY4284またはpJY4285、pJY431
0、pJY4306)をコードする遺伝子配列およびタ
ンパク質のC末端領域の特定断片(pBC207、pB
C100)をコードする遺伝子配列をそれぞれ含む特定
のプラスミドを同定して示す図である。
【図3】肺炎球菌のRx1株のpspA遺伝子のDNA
配列および、それに基づいたPspAタンパク質のアミ
ノ酸配列の図の一部である。図3、図4および図5の順
に配列が連続する。
【図4】肺炎球菌のRx1株のpspA遺伝子のDNA
配列および、それに基づいたPspAタンパク質のアミ
ノ酸配列の図の一部である。図3、図4および図5の順
に配列が連続する。
【図5】肺炎球菌のRx1株のpspA遺伝子のDNA
配列および、それに基づいたPspAタンパク質のアミ
ノ酸配列の図の一部である。図3、図4および図5の順
に配列が連続する。
【図6】ここで同定されたプラスミドによって産生され
るPspAタンパク質遺伝子産物のイムノブロットの図
である。
フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 FI C12P 21/02 C12P 21/08 21/08 C12N 15/00 C (72)発明者 ラリー エス マクダニエル アメリカ合衆国 35210 アラバマ州 バーミンガム コーネル ドライヴ 5354 合議体 審判長 眞壽田 順啓 審判官 佐伯 裕子 審判官 田村 明照 (56)参考文献 国際公開92/14488(WO,A1) J.Bacteriology,Vo l.174,No.2,p.601〜609 (1992) (58)調査した分野(Int.Cl.7,DB名) C07K 14/315 ZNA A61K 39/09 ADZ A61K 39/395 R C07K 16/12 C12P 21/02 C C12N 15/00 C12P 21/08

Claims (1)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項1】 単離されたタンパク質を活性成分として
    含む肺炎球菌感染によって引き起こされる疾患に対する
    ワクチンであって、 該単離されたタンパク質が、肺炎球菌の表面プロテイン
    A(PspA)タンパク質またはPspAのアミノ酸残
    基192〜588を含むタンパク質フラグメントである
    ことを特徴とするワクチン。
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