JPH07126291A - 肺炎球菌表面プロテインａのエピトープ領域 - Google Patents
肺炎球菌表面プロテインａのエピトープ領域Info
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 本発明の目的は、防御誘導エピトープを含
み、交差反応をし、肺炎球菌感染によって起きる疾患に
対するワクチンに組み入れることができるＰｓｐＡタン
パク質フラグメントを提供することにある。諸修飾は本
発明の範囲に含むことができる。 【構成】 肺炎球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐ
ｎｅｕｍｏｎｉａｅ）のＲｘ１株のＰｓｐＡタンパク質
の領域に、他の肺炎球菌株のＰｓｐＡと交差反応する防
御誘導エピトープが含まれることが同定された。この領
域は、Ｒｘ１ＰｓｐＡ株のアミノ酸残基１９２から２６
０に広がる６８個のアミノ酸の配列からなる。
み、交差反応をし、肺炎球菌感染によって起きる疾患に
対するワクチンに組み入れることができるＰｓｐＡタン
パク質フラグメントを提供することにある。諸修飾は本
発明の範囲に含むことができる。 【構成】 肺炎球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐ
ｎｅｕｍｏｎｉａｅ）のＲｘ１株のＰｓｐＡタンパク質
の領域に、他の肺炎球菌株のＰｓｐＡと交差反応する防
御誘導エピトープが含まれることが同定された。この領
域は、Ｒｘ１ＰｓｐＡ株のアミノ酸残基１９２から２６
０に広がる６８個のアミノ酸の配列からなる。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、肺炎球菌（Ｓｔｒｅｐ
ｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）の主要病原
性因子である肺炎球菌表面プロテインＡ（ＰｓｐＡ）の
エピトープ領域の識別に関する。
ｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）の主要病原
性因子である肺炎球菌表面プロテインＡ（ＰｓｐＡ）の
エピトープ領域の識別に関する。
【０００２】
【従来の技術】肺炎球菌は、中耳炎、髄膜炎、菌血症お
よび肺炎の重要な原因菌である。抗生物質およびワクチ
ンの使用にもかかわらず、肺炎球菌感染症の罹患率は過
去２５年間にほとんど低下しなかった。
よび肺炎の重要な原因菌である。抗生物質およびワクチ
ンの使用にもかかわらず、肺炎球菌感染症の罹患率は過
去２５年間にほとんど低下しなかった。
【０００３】肺炎球菌の免疫が肺炎球菌の多糖体莢膜に
対する特異的抗体によって媒介され得ることは一般に認
められている。しかし、新生児および幼児は多糖体抗原
に対して免疫応答ができず、同じ莢膜血清型が関与する
感染を繰り返し得る。
対する特異的抗体によって媒介され得ることは一般に認
められている。しかし、新生児および幼児は多糖体抗原
に対して免疫応答ができず、同じ莢膜血清型が関与する
感染を繰り返し得る。
【０００４】多数の被莢膜細菌に対して幼児を免疫する
ための一つのアプローチは、莢膜多糖体抗原をタンパク
質と抱合させてそれらを免疫原性にすることである。こ
のアプローチは、例えば、インフルエンザ菌ｂ（Ｈａｅ
ｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ ｂ（米国特
許４、４９６、５３４（Ｇｏｒｄｏｎ）および米国特許
４、６７３、５７４（Ａｎｄｅｒｓｏｎ）を参照された
い）で成功している。しかし、肺炎球菌に関しては８０
以上の莢膜血清型が知られており、そのうち２３が疾患
の大半に関与しているものである。肺炎球菌多糖体−タ
ンパク質抱合体を成功させるためには、ほとんどの肺炎
球菌感染症に関与する莢膜型を充分に免疫原性にしなけ
ればなければならない。このアプローチは困難であるか
もしれない。なぜならば、現在入手可能なワクチンに含
まれる２３の多糖体は、大人に用いられた場合でさえ
も、全てが充分に免疫原性ではないからである。さらに
そのようなワクチンの生産は、慣用される他の小児ワク
チンのいずれよりもおそらくずっと高価につくことが予
想される。
ための一つのアプローチは、莢膜多糖体抗原をタンパク
質と抱合させてそれらを免疫原性にすることである。こ
のアプローチは、例えば、インフルエンザ菌ｂ（Ｈａｅ
ｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ ｂ（米国特
許４、４９６、５３４（Ｇｏｒｄｏｎ）および米国特許
４、６７３、５７４（Ａｎｄｅｒｓｏｎ）を参照された
い）で成功している。しかし、肺炎球菌に関しては８０
以上の莢膜血清型が知られており、そのうち２３が疾患
の大半に関与しているものである。肺炎球菌多糖体−タ
ンパク質抱合体を成功させるためには、ほとんどの肺炎
球菌感染症に関与する莢膜型を充分に免疫原性にしなけ
ればなければならない。このアプローチは困難であるか
もしれない。なぜならば、現在入手可能なワクチンに含
まれる２３の多糖体は、大人に用いられた場合でさえ
も、全てが充分に免疫原性ではないからである。さらに
そのようなワクチンの生産は、慣用される他の小児ワク
チンのいずれよりもおそらくずっと高価につくことが予
想される。
【０００５】小児、それにまた高齢者を肺炎球菌感染か
ら防御するための別のアプローチとしては、防御的免疫
応答を誘発し得るタンパク質抗原を同定することが考え
られる。そのようなタンパク質はそれだけでワクチンと
して使用できるかもしれないし、好結果の多糖体−タン
パク質抱合体とともに、または多糖体の担体として用い
られるかもしれない。
ら防御するための別のアプローチとしては、防御的免疫
応答を誘発し得るタンパク質抗原を同定することが考え
られる。そのようなタンパク質はそれだけでワクチンと
して使用できるかもしれないし、好結果の多糖体−タン
パク質抱合体とともに、または多糖体の担体として用い
られるかもしれない。
【０００６】ＭｃＤａｎｉｅｌら（Ｉ）（Ｊ．Ｅｘｐ．
Ｍｅｄ．１６０：３８６−３９７、１９８４）には、肺
炎球菌上の細胞表面タンパク質を識別するハイブリドー
マ抗体の生産およびある被莢膜肺炎球菌株の感染からの
マウスの防御に関する記載がみられる。この表面タンパ
ク質抗原は、「肺炎球菌表面プロテインＡ」または略し
てＰｓｐＡと呼ばれる。
Ｍｅｄ．１６０：３８６−３９７、１９８４）には、肺
炎球菌上の細胞表面タンパク質を識別するハイブリドー
マ抗体の生産およびある被莢膜肺炎球菌株の感染からの
マウスの防御に関する記載がみられる。この表面タンパ
ク質抗原は、「肺炎球菌表面プロテインＡ」または略し
てＰｓｐＡと呼ばれる。
【０００７】ＭｃＤａｎｉｅｌら（ＩＩ）（Ｍｉｃｒｏ
ｂｉａｌ Ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ １：５１９−５
３１、１９８６）には、ＰｓｐＡの特徴づけに関する研
究の記述がある。ＭｃＤａｎｉｅｌ（ＩＩ）、ＭｃＤａ
ｎｉｅｌ（ＩＩＩ）（Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６５：３
８１−３９４、１９８７）、Ｗａｌｔｍａｎら（Ｍｉｃ
ｒｏｂ．Ｐａｔｈｏｇ．８：６１−６９、１９９０）お
よびＣｒａｉｎら（Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．５８：
３２９３−３２９９、１９９０）の結果から、異なる菌
株のＰｓｐＡはエピトープおよび見かけの分子量に関し
てかなりの相違をしばしば示すこともまた明かであっ
た。
ｂｉａｌ Ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ １：５１９−５
３１、１９８６）には、ＰｓｐＡの特徴づけに関する研
究の記述がある。ＭｃＤａｎｉｅｌ（ＩＩ）、ＭｃＤａ
ｎｉｅｌ（ＩＩＩ）（Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６５：３
８１−３９４、１９８７）、Ｗａｌｔｍａｎら（Ｍｉｃ
ｒｏｂ．Ｐａｔｈｏｇ．８：６１−６９、１９９０）お
よびＣｒａｉｎら（Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．５８：
３２９３−３２９９、１９９０）の結果から、異なる菌
株のＰｓｐＡはエピトープおよび見かけの分子量に関し
てかなりの相違をしばしば示すこともまた明かであっ
た。
【０００８】ＭｃＤａｎｉｅｌら（ＩＩＩ）には、Ｘ−
連鎖免疫不全（ＸＩＤ）マウスをＰｓｐＡ発現無莢膜肺
炎球菌で免疫した場合には続いての肺炎球菌による致死
的感染は防御されたが、ＰｓｐＡを欠失している同一肺
炎球菌で免疫した場合には防御されなかったことが開示
されている。
連鎖免疫不全（ＸＩＤ）マウスをＰｓｐＡ発現無莢膜肺
炎球菌で免疫した場合には続いての肺炎球菌による致死
的感染は防御されたが、ＰｓｐＡを欠失している同一肺
炎球菌で免疫した場合には防御されなかったことが開示
されている。
【０００９】ＭｃＤａｎｉｅｌら（ＩＶ）（Ｉｎｆｅｃ
ｔ．Ｉｍｍｕｎ．５９：２２２−２２８、１９９１）に
は、莢膜型６Ａおよび３の肺炎球菌株に対する防御を誘
導することができるＰｓｐＡの組換え全長フラグメント
によるマウスの免疫に関する記述がある。
ｔ．Ｉｍｍｕｎ．５９：２２２−２２８、１９９１）に
は、莢膜型６Ａおよび３の肺炎球菌株に対する防御を誘
導することができるＰｓｐＡの組換え全長フラグメント
によるマウスの免疫に関する記述がある。
【００１０】Ｃｒａｉｎら（上記）には、肺炎球菌株の
臨床および研究室分離株のＰｓｐＡを１００％（ｎ＝９
５）検出するウサギ抗血清に関する記述がある。Ｐｓｐ
Ａに対する七つのモノクローナル抗体との反応で、５７
の肺炎球菌分離株が３１の異なるパターンの反応性を示
した。したがって、多数の血清学的に異なるＰｓｐＡが
存在するが、ＰｓｐＡ間には広範な交差反応がある。
臨床および研究室分離株のＰｓｐＡを１００％（ｎ＝９
５）検出するウサギ抗血清に関する記述がある。Ｐｓｐ
Ａに対する七つのモノクローナル抗体との反応で、５７
の肺炎球菌分離株が３１の異なるパターンの反応性を示
した。したがって、多数の血清学的に異なるＰｓｐＡが
存在するが、ＰｓｐＡ間には広範な交差反応がある。
【００１１】ＰｓｐＡタンパク質型は、莢膜型には依存
しない。遺伝的突然変異または環境中での交換によっ
て、莢膜、ＰｓｐＡおよびおそらく多様な構造を有する
他の分子に関して著しく異なる菌株の大きなストックが
形成され得たものと考えられる。異なる菌株からのＰｓ
ｐＡの多様性はまた、６７〜９９ｋＤの範囲である分子
量においても明かである。観察される相違は、安定して
継承されるものでタンパク質崩壊の結果ではない。
しない。遺伝的突然変異または環境中での交換によっ
て、莢膜、ＰｓｐＡおよびおそらく多様な構造を有する
他の分子に関して著しく異なる菌株の大きなストックが
形成され得たものと考えられる。異なる菌株からのＰｓ
ｐＡの多様性はまた、６７〜９９ｋＤの範囲である分子
量においても明かである。観察される相違は、安定して
継承されるものでタンパク質崩壊の結果ではない。
【００１２】ＭｃＤａｎｉｅｌら（ＩＶ）（Ｉｎｆｅｃ
ｔ．Ｉｍｍｕｎ．５９：２２２−２２８、１９９１に記
述されているように、組換えλｇｔ１１クローンからの
部分精製ＰｓｐＡによる免疫によって、異なる莢膜およ
びＰｓｐＡ型を代表するいくつかの肺炎球菌株のチャレ
ンジに対する防御が誘導された。ＰｓｐＡを発現するク
ローンはこの文献にしたがって構築されたが、産生物は
不溶性で、細胞断片からの溶解後の分離は不可能であっ
た。
ｔ．Ｉｍｍｕｎ．５９：２２２−２２８、１９９１に記
述されているように、組換えλｇｔ１１クローンからの
部分精製ＰｓｐＡによる免疫によって、異なる莢膜およ
びＰｓｐＡ型を代表するいくつかの肺炎球菌株のチャレ
ンジに対する防御が誘導された。ＰｓｐＡを発現するク
ローンはこの文献にしたがって構築されたが、産生物は
不溶性で、細胞断片からの溶解後の分離は不可能であっ
た。
【００１３】異なる肺炎球菌株間でタンパク質の構造は
異なるが、全てのＰｓｐＡ間で多くの交差反応が存在
し、これは単一のＰｓｐＡまたは少なくとも少数のＰｓ
ｐＡで多数の肺炎球菌株に対する防御が誘導され得るに
充分な共通エピトープが存在している可能性があること
を示唆している。
異なるが、全てのＰｓｐＡ間で多くの交差反応が存在
し、これは単一のＰｓｐＡまたは少なくとも少数のＰｓ
ｐＡで多数の肺炎球菌株に対する防御が誘導され得るに
充分な共通エピトープが存在している可能性があること
を示唆している。
【００１４】とくに上記した公表文献に加えて、本発明
者および共同研究者は、ＰｓｐＡに関するさらなる詳細
を次のように発表している。
者および共同研究者は、ＰｓｐＡに関するさらなる詳細
を次のように発表している。
【００１５】１． 第８９回米国微生物学会年次総会要
旨集、ｐ１２５、項Ｄ−２５７，１９８９年５月 ２． 第９０回米国微生物学会年次総会要旨集、ｐ９
８、項Ｄ−１０６、１９９０年５月 ３． 第３回連鎖球菌遺伝学に関する国際ＡＳＭ学会要
旨集、ｐ１１、項１２、１９９０年６月 ４． Ｔａｌｋｉｎｇｔｏｎら、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍ
ｕｎ．５９：１２８５−１２８９、１９９１ ５． Ｙｏｔｈｅｒら（Ｉ）、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏ
ｌ．１７４：６０１−６０９、１９９２ ６． Ｙｏｔｈｅｒら（ＩＩ）、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏ
ｌ．１７４：６１０ー６１８、１９９２ ７． ＭｃＤａｎｉｅｌら（Ｖ）、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ
Ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ、１３：２６１−２６８ 米国特許出願中の出願番号６５６、７７３および８３
５、６９８（公開ＷＯ９２／１４４８８に対応）および
Ｙｏｔｈｅｒら（Ｉ）および（ＩＩ）には、免疫原性不
完全型のＰｓｐＡタンパク質を分泌する肺炎球菌の突然
変異株の調製および分泌タンパク質の分離および精製に
関する記述がある。不完全型のＰｓｐＡは、免疫防御性
であってＰｓｐＡの防御的エピトープを含むことが見出
だされた。ここでいうＰｓｐＡタンパク質は生理学的溶
液に可溶性で、少なくとも機能的細胞膜アンカー領域を
欠いている。
旨集、ｐ１２５、項Ｄ−２５７，１９８９年５月 ２． 第９０回米国微生物学会年次総会要旨集、ｐ９
８、項Ｄ−１０６、１９９０年５月 ３． 第３回連鎖球菌遺伝学に関する国際ＡＳＭ学会要
旨集、ｐ１１、項１２、１９９０年６月 ４． Ｔａｌｋｉｎｇｔｏｎら、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍ
ｕｎ．５９：１２８５−１２８９、１９９１ ５． Ｙｏｔｈｅｒら（Ｉ）、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏ
ｌ．１７４：６０１−６０９、１９９２ ６． Ｙｏｔｈｅｒら（ＩＩ）、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏ
ｌ．１７４：６１０ー６１８、１９９２ ７． ＭｃＤａｎｉｅｌら（Ｖ）、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ
Ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ、１３：２６１−２６８ 米国特許出願中の出願番号６５６、７７３および８３
５、６９８（公開ＷＯ９２／１４４８８に対応）および
Ｙｏｔｈｅｒら（Ｉ）および（ＩＩ）には、免疫原性不
完全型のＰｓｐＡタンパク質を分泌する肺炎球菌の突然
変異株の調製および分泌タンパク質の分離および精製に
関する記述がある。不完全型のＰｓｐＡは、免疫防御性
であってＰｓｐＡの防御的エピトープを含むことが見出
だされた。ここでいうＰｓｐＡタンパク質は生理学的溶
液に可溶性で、少なくとも機能的細胞膜アンカー領域を
欠いている。
【００１６】以下の明細およびそれに付した図面におい
て、アミノ酸の表記には容認されている省略記号を用い
る。表１にそれら略号を示す。
て、アミノ酸の表記には容認されている省略記号を用い
る。表１にそれら略号を示す。
【００１７】
【表１】 表１ アミノ酸省略記号 Ａ＝Ａｌａ＝アラニン Ｍ＝Ｍｅｔ＝メチオニン Ｃ＝Ｃｙｓ＝システイン Ｎ＝Ａｓｎ＝アスパラギン Ｄ＝Ａｓｐ＝アスパラギン酸 Ｐ＝Ｐｒｏ＝プロリン Ｅ＝Ｇｌｕ＝グルタミン酸 Ｑ＝Ｇｌｎ＝グルタミン Ｆ＝Ｐｈｅ＝フェニルアラニン Ｒ＝Ａｒｇ＝アルギニン Ｇ＝Ｇｌｙ＝グリシン Ｓ＝Ｓｅｒ＝セリン Ｈ＝Ｈｉｓ＝ヒスチジン Ｔ＝Ｔｈｒ＝スレオニン Ｉ＝Ｉｌｅ＝イソロイシン Ｖ＝Ｖａｌ＝バリン Ｋ＝Ｌｙｓ＝リジン Ｗ＝Ｔｒｙ＝トリプトファン Ｌ＝Ｌｅｕ＝ロイシン Ｙ＝Ｔｙｒ＝チロシン
【００１８】
【発明が解決しようとする課題】本発明によって、防御
誘導エピトープを含むだけではなく他の肺炎球菌株から
の他のＰｓｐＡとも充分な交差反応性を示す、肺炎球菌
のＲｘ１株からのＰｓｐＡの６８個のアミノ酸からなる
領域が確認され、これはしたがって組換えＰｓｐＡワク
チンに組み入れるためのＰｓｐＡ領域としての使用に適
している。
誘導エピトープを含むだけではなく他の肺炎球菌株から
の他のＰｓｐＡとも充分な交差反応性を示す、肺炎球菌
のＲｘ１株からのＰｓｐＡの６８個のアミノ酸からなる
領域が確認され、これはしたがって組換えＰｓｐＡワク
チンに組み入れるためのＰｓｐＡ領域としての使用に適
している。
【００１９】６８個のアミノ酸配列は、Ｒｘ１ＰｓｐＡ
タンパク質のアミノ酸残基１９２から２６０までの範囲
である。ここではとくにＲｘ１ＰｓｐＡタンパク質の特
定の６８個のアミノ酸配列を開示するが、Ｒｘ１Ｐｓｐ
Ａタンパク質のこの配列に相同の他のいかなる肺炎球菌
種からのＰｓｐＡタンパク質のいかなる領域も本発明の
範囲に含まれる。それには例えばＤ３９およびＲ３６Ａ
株からのものがある。
タンパク質のアミノ酸残基１９２から２６０までの範囲
である。ここではとくにＲｘ１ＰｓｐＡタンパク質の特
定の６８個のアミノ酸配列を開示するが、Ｒｘ１Ｐｓｐ
Ａタンパク質のこの配列に相同の他のいかなる肺炎球菌
種からのＰｓｐＡタンパク質のいかなる領域も本発明の
範囲に含まれる。それには例えばＤ３９およびＲ３６Ａ
株からのものがある。
【００２０】したがって、ひとつには本発明は、肺炎球
菌のＲｘ１株のＰｓｐＡタンパク質のアミノ酸残基１９
２から２６０までからなり、少なくともひとつの防御誘
導エピトープを含む単離ＰｓｐＡタンパク質フラグメン
トを提供する。
菌のＲｘ１株のＰｓｐＡタンパク質のアミノ酸残基１９
２から２６０までからなり、少なくともひとつの防御誘
導エピトープを含む単離ＰｓｐＡタンパク質フラグメン
トを提供する。
【００２１】このタンパク質フラグメントは、Ｒｘ１株
のＰｓｐＡタンパク質のアミノ酸残基１９２から２６０
までに対応するまたは相同するアミノ酸配列を含むもの
であればよく、したがって、これらアミノ酸配列を含む
ものよりも大きいフラグメントからなるものでもよい。
のＰｓｐＡタンパク質のアミノ酸残基１９２から２６０
までに対応するまたは相同するアミノ酸配列を含むもの
であればよく、したがって、これらアミノ酸配列を含む
ものよりも大きいフラグメントからなるものでもよい。
【００２２】本発明のタンパク質フラグメントは、組換
えによって産生される該タンパク質フラグメントを含む
不完全なＣ末端欠落産生物でもよく、とくに天然のＰｓ
ｐＡタンパク質のαヘリックス領域のＣ末端約３分の１
を含む不完全Ｃ末端欠失産生物でもよい。
えによって産生される該タンパク質フラグメントを含む
不完全なＣ末端欠落産生物でもよく、とくに天然のＰｓ
ｐＡタンパク質のαヘリックス領域のＣ末端約３分の１
を含む不完全Ｃ末端欠失産生物でもよい。
【００２３】本発明はまた、肺炎球菌のＲｘ１株のＰｓ
ｐＡタンパク質のアミノ酸残基１９２から２６０までに
含まれるタンパク質誘導エピトープのアミノ酸配列に対
応するアミノ酸配列からなる単離されたタンパク質フラ
グメントを含む。
ｐＡタンパク質のアミノ酸残基１９２から２６０までに
含まれるタンパク質誘導エピトープのアミノ酸配列に対
応するアミノ酸配列からなる単離されたタンパク質フラ
グメントを含む。
【００２４】
【課題を解決するための手段】上記の先の米国特許出願
およびＹｏｔｈｅｒら（Ｉ）および（ＩＩ）に記述され
ているように、Ｒｘ１株のｐｓｐＡ遺伝子は５８８個の
アミノ酸からなる６５ｋＤａの分子をコードする。ヌク
レオチド配列（配列番号：１）および派生するアミノ酸
配列（配列番号：２）は第３図から５図に示す通りであ
る。なお第３図、第４図および第５図は左上から右下に
それぞれの示している連鎖が連続しているものを示して
いる。分子のＮ末端側半分は電荷が高く、第２図に示さ
れるように、そのＤＮＡ配列からこの領域（２８８個の
アミノ酸）のαヘリックス螺旋状コイルタンパク質構造
が予想される。αヘリックスではないＰｓｐＡのＣ末端
側半分は、プロリンに富む領域（８３個のアミノ酸）お
よび高保存性の２０個のアミノ酸反復配列を含む反復領
域、それにＣ末端に１７個のアミノ酸のわずかに疎水性
の配列を含む。ＰｓｐＡは肺炎球菌にそのＣ末端半分に
よってアンカーされることが知られており、プロリンに
富む領域が分子を細胞壁にからませる役割を果たすよう
である。加えて、高荷電αヘリックス領域は細胞壁に始
まって、莢膜中に、あるいは莢膜を貫通して伸びている
ことが予想される。このモデルは、αヘリックス領域が
肺炎球菌表面上のＰｓｐＡと反応するモノクローナル抗
体（ＭＡｂ）によって識別される全ての表面露出エピト
ープを含むという観察によって支持される。
およびＹｏｔｈｅｒら（Ｉ）および（ＩＩ）に記述され
ているように、Ｒｘ１株のｐｓｐＡ遺伝子は５８８個の
アミノ酸からなる６５ｋＤａの分子をコードする。ヌク
レオチド配列（配列番号：１）および派生するアミノ酸
配列（配列番号：２）は第３図から５図に示す通りであ
る。なお第３図、第４図および第５図は左上から右下に
それぞれの示している連鎖が連続しているものを示して
いる。分子のＮ末端側半分は電荷が高く、第２図に示さ
れるように、そのＤＮＡ配列からこの領域（２８８個の
アミノ酸）のαヘリックス螺旋状コイルタンパク質構造
が予想される。αヘリックスではないＰｓｐＡのＣ末端
側半分は、プロリンに富む領域（８３個のアミノ酸）お
よび高保存性の２０個のアミノ酸反復配列を含む反復領
域、それにＣ末端に１７個のアミノ酸のわずかに疎水性
の配列を含む。ＰｓｐＡは肺炎球菌にそのＣ末端半分に
よってアンカーされることが知られており、プロリンに
富む領域が分子を細胞壁にからませる役割を果たすよう
である。加えて、高荷電αヘリックス領域は細胞壁に始
まって、莢膜中に、あるいは莢膜を貫通して伸びている
ことが予想される。このモデルは、αヘリックス領域が
肺炎球菌表面上のＰｓｐＡと反応するモノクローナル抗
体（ＭＡｂ）によって識別される全ての表面露出エピト
ープを含むという観察によって支持される。
【００２５】肺炎球菌のＲｘ１株のＰｓｐＡタンパク質
は、防御誘導エピトープの位置を決定するためのマッピ
ングされた。そのようなマッピングは、ＰｓｐＡタンパ
ク質に対する抗体およびＰｓｐＡの組換えフラグメント
を用いることによって達成された。後の実施例で詳記す
るこのマッピング技術によって、ＰｓｐＡのαヘリック
ス領域のＣ末端３分の１に対応するアミノ酸配列、とく
にＲｘ１ＰｓｐＡタンパク質のアミノ酸残基１９２から
２６０に、防御誘導エピトープが含まれることが同定確
認された。アミノ酸残基の１９２から２６０までのアミ
ノ酸配列は、αヘリックス配列のＣ末端３分の１であっ
て、細胞壁表面に近接していると考えられる。
は、防御誘導エピトープの位置を決定するためのマッピ
ングされた。そのようなマッピングは、ＰｓｐＡタンパ
ク質に対する抗体およびＰｓｐＡの組換えフラグメント
を用いることによって達成された。後の実施例で詳記す
るこのマッピング技術によって、ＰｓｐＡのαヘリック
ス領域のＣ末端３分の１に対応するアミノ酸配列、とく
にＲｘ１ＰｓｐＡタンパク質のアミノ酸残基１９２から
２６０に、防御誘導エピトープが含まれることが同定確
認された。アミノ酸残基の１９２から２６０までのアミ
ノ酸配列は、αヘリックス配列のＣ末端３分の１であっ
て、細胞壁表面に近接していると考えられる。
【００２６】残基１９２から２６０までの配列部分には
６８個のアミノ酸しか含まれないことから、この大きさ
の個々のＰｓｐＡタンパク質フラグメントは最適な抗原
性を示さないかもしれない。この問題は、いくつかのｐ
ｓｐＡ遺伝子の適当な部分の遺伝子融合によって発現さ
れる異なるＰｓｐＡのタンデムフラグメントを含む組換
えタンパク質を産生することによって解決される。
６８個のアミノ酸しか含まれないことから、この大きさ
の個々のＰｓｐＡタンパク質フラグメントは最適な抗原
性を示さないかもしれない。この問題は、いくつかのｐ
ｓｐＡ遺伝子の適当な部分の遺伝子融合によって発現さ
れる異なるＰｓｐＡのタンデムフラグメントを含む組換
えタンパク質を産生することによって解決される。
【００２７】したがって、本発明のさらなる目的は、複
数の抱合した分子からなるＰｓｐＡタンパク質フラグメ
ントを提供することであって、各分子は肺炎球菌のＲｘ
１株のＰｓｐＡのアミノ酸残基１９２〜２６０からな
り、少なくとも一つの防御誘導エピトープを含み、各分
子は肺炎球菌の異なる株に由来する。
数の抱合した分子からなるＰｓｐＡタンパク質フラグメ
ントを提供することであって、各分子は肺炎球菌のＲｘ
１株のＰｓｐＡのアミノ酸残基１９２〜２６０からな
り、少なくとも一つの防御誘導エピトープを含み、各分
子は肺炎球菌の異なる株に由来する。
【００２８】そのようなタンデム分子は、継ぎ目部分で
正しい螺旋状コイル構造が維持され、免疫原性を有する
に充分な大きさで、さらに広範囲のＰｓｐＡと交差反応
するすることができる一連の防御誘導エピトープが発現
され得るように操作構築することができる。代わりに、
組換えによって産生された個々のペプチドを化学的手法
によって結合させて複合分子を形成してもよい。
正しい螺旋状コイル構造が維持され、免疫原性を有する
に充分な大きさで、さらに広範囲のＰｓｐＡと交差反応
するすることができる一連の防御誘導エピトープが発現
され得るように操作構築することができる。代わりに、
組換えによって産生された個々のペプチドを化学的手法
によって結合させて複合分子を形成してもよい。
【００２９】さらに別の方法としては、組換え融合産物
として、または化学的結合によって、例えば共有結合あ
るいはイオン結合などによって、ＰｓｐＡフラグメント
をより大きな担体タンパク質または細菌細胞と結合させ
てもよい。
として、または化学的結合によって、例えば共有結合あ
るいはイオン結合などによって、ＰｓｐＡフラグメント
をより大きな担体タンパク質または細菌細胞と結合させ
てもよい。
【００３０】ここで提供されるタンパク質フラグメント
およびそのペプチド対応物は、肺炎球菌感染によって引
き起こされる疾患に対するワクチンの成分として有用で
ある。したがって、本発明のさらなる目的は、それの免
疫学的活性成分としてここに定義されるＰｓｐＡタンパ
ク質フラグメントからなるワクチンを提供することにあ
る。
およびそのペプチド対応物は、肺炎球菌感染によって引
き起こされる疾患に対するワクチンの成分として有用で
ある。したがって、本発明のさらなる目的は、それの免
疫学的活性成分としてここに定義されるＰｓｐＡタンパ
ク質フラグメントからなるワクチンを提供することにあ
る。
【００３１】以下の実施例および図面においては、完全
なまたは不完全なｐｓｐＡ遺伝子配列を含む特定のプラ
スミド材料が参照として用いられている。次の表２はそ
れら材料の摘要である。
なまたは不完全なｐｓｐＡ遺伝子配列を含む特定のプラ
スミド材料が参照として用いられている。次の表２はそ
れら材料の摘要である。
【００３２】
【表２】 表２ プラスミド 同定 遺伝子産物 ｐＫＳＤ１０１４ 全遺伝子 アミノ酸１〜５８８ ｐＪＹ４２８４または ｐＪＹ４２８５ ５′末端領域 アミノ酸１〜１１５ ｐＪＹ４３１０ ５′末端領域 アミノ酸１〜１９２ ｐＪＹ４３０６ ５′末端領域 アミノ酸１〜２６０ ｐＢＣ２０７ ３′末端領域 アミノ酸１１９〜５８８ ｐＢＣ１００ ３′末端領域 アミノ酸１９２〜５８８
【００３３】
［実施例１］本実施例では、ここで用いられる細菌菌
株、プラスミドおよびハイブリドーマ抗体について説明
する。
株、プラスミドおよびハイブリドーマ抗体について説明
する。
【００３４】以下の表３のように同定された肺炎球菌株
を、０．５％の酵母抽出液を加えたトッド・ヒュイット
液体培地中で３７°で、または３％のヒツジ血液を含む
血液寒天プレート上でキャンドル・ジャー中で増殖させ
た。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株ＤＨ１（Ｈａｎａｈａ
ｎ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１６６：５５７）はＬＢ培
地または最少Ｅ培地中で増殖させた。プラスミドには、
ｐＵＣ１８（Ｇｅｎｅ３３：１０３）、ｐＪＹ４１６３
（Ｙｏｔｈｅｒら（ＩＩ））、およびｐＩＮ−ＩＩＩ−
ｏｍｐＡ（ＥＭＢＯ Ｊ．３：２４３７）が含まれる。
を、０．５％の酵母抽出液を加えたトッド・ヒュイット
液体培地中で３７°で、または３％のヒツジ血液を含む
血液寒天プレート上でキャンドル・ジャー中で増殖させ
た。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株ＤＨ１（Ｈａｎａｈａ
ｎ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１６６：５５７）はＬＢ培
地または最少Ｅ培地中で増殖させた。プラスミドには、
ｐＵＣ１８（Ｇｅｎｅ３３：１０３）、ｐＪＹ４１６３
（Ｙｏｔｈｅｒら（ＩＩ））、およびｐＩＮ−ＩＩＩ−
ｏｍｐＡ（ＥＭＢＯ Ｊ．３：２４３７）が含まれる。
【００３５】全ての抗体分泌ハイブリドーマ系は、非抗
体分泌骨髄腫細胞系Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ．８．６５３
（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２３：１５４８）との融合に
よって得られた。用いられる特異的抗体は以下の表３の
ように同定される。抗ＰｓｐＡハイブリドーマ細胞系Ｘ
ｉ６４、Ｘｉ１２６およびＸｉＲ２７８は先にＭｃＤａ
ｎｉｅｌら（Ｉ）およびＣｒａｉｎら（上記）に記述さ
れている。残りの細胞系は、ＣＢＡ／ＮマウスをＭｃＤ
ａｎｉｅｌら（Ｉ）に記載の手法でλｇｔＩＩ中で発現
させた組換えＤ３９ＰｓｐＡで免疫することによって調
製した。ＰｓｐＡに対する抗体を産生する細胞系は、マ
イクロ滴定プレートを加熱殺菌（６０℃、３０分）した
肺炎球菌株Ｒ３６ＡまたはＲｘ１でコートしたＥＬＩＳ
Ａを用いてすべて同定した。これによってＰｓｐＡ上の
表面露出エピトープと反応するこれらＭＡｂ（モノクロ
ーナル抗体）が選択される。ＭＡｂの重鎖アイソタイプ
を、ＩｇＭおよびＩｇＧマウス免疫グロブリンのμおよ
びγ重鎖に特異的なアフィニティ精製ヤギ抗体を用いて
ＥＬＩＳＡを展開することによって決定した。ＭＡｂの
ＰｓｐＡに関する特異性は、イムノブロット分析によっ
て確認した。
体分泌骨髄腫細胞系Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ．８．６５３
（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２３：１５４８）との融合に
よって得られた。用いられる特異的抗体は以下の表３の
ように同定される。抗ＰｓｐＡハイブリドーマ細胞系Ｘ
ｉ６４、Ｘｉ１２６およびＸｉＲ２７８は先にＭｃＤａ
ｎｉｅｌら（Ｉ）およびＣｒａｉｎら（上記）に記述さ
れている。残りの細胞系は、ＣＢＡ／ＮマウスをＭｃＤ
ａｎｉｅｌら（Ｉ）に記載の手法でλｇｔＩＩ中で発現
させた組換えＤ３９ＰｓｐＡで免疫することによって調
製した。ＰｓｐＡに対する抗体を産生する細胞系は、マ
イクロ滴定プレートを加熱殺菌（６０℃、３０分）した
肺炎球菌株Ｒ３６ＡまたはＲｘ１でコートしたＥＬＩＳ
Ａを用いてすべて同定した。これによってＰｓｐＡ上の
表面露出エピトープと反応するこれらＭＡｂ（モノクロ
ーナル抗体）が選択される。ＭＡｂの重鎖アイソタイプ
を、ＩｇＭおよびＩｇＧマウス免疫グロブリンのμおよ
びγ重鎖に特異的なアフィニティ精製ヤギ抗体を用いて
ＥＬＩＳＡを展開することによって決定した。ＭＡｂの
ＰｓｐＡに関する特異性は、イムノブロット分析によっ
て確認した。
【００３６】表３のようにＸｉＲ１５２６、ＸｉＲ３
５、ＸｉＲ１２２４、ＸｉＲ１６、ＸｉＲ１３２５およ
びＸｉＲ１３２３と同定された六つの新たに産生された
ＭＡｂの全てが、Ｒｘ１およびＤ３９株のイムノブロッ
ト中で予想された大きさ（見かけの分子量８４ｋＤａ）
のタンパク質を検出した。Ｒｘ１のＰｓｐＡ変異株であ
るＷＧ４４．１株（ＭｃＤａｎｉｅｌら（ＩＩＩ）およ
びＹｏｔｈｅｒら（ＩＩ）を参照されたい）のイムノブ
ロット中ではいずれのＭＡｂでも反応性は認められなか
った。
５、ＸｉＲ１２２４、ＸｉＲ１６、ＸｉＲ１３２５およ
びＸｉＲ１３２３と同定された六つの新たに産生された
ＭＡｂの全てが、Ｒｘ１およびＤ３９株のイムノブロッ
ト中で予想された大きさ（見かけの分子量８４ｋＤａ）
のタンパク質を検出した。Ｒｘ１のＰｓｐＡ変異株であ
るＷＧ４４．１株（ＭｃＤａｎｉｅｌら（ＩＩＩ）およ
びＹｏｔｈｅｒら（ＩＩ）を参照されたい）のイムノブ
ロット中ではいずれのＭＡｂでも反応性は認められなか
った。
【００３７】
【表３】 ［実施例２］本実施例では、ｐｓｐＡの肺炎球菌株Ｒｘ
１からのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によるｐｓｐ
Ａ遺伝子の作製について説明する。
１からのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によるｐｓｐ
Ａ遺伝子の作製について説明する。
【００３８】肺炎球菌株Ｒｘ１からのｐｓｐＡ遺伝子の
配列に基づいてＰＣＲプライマーをデザインした（第３
〜５図参照）。５′プライマーはＬＳＭ３およびＬＳＭ
４であった。ＬＳＭ３は２８塩基長で塩基５７６から始
まり、ＬＳＭ４は３１塩基長で塩基７９２から始まり、
双方とも追加のＢａｍＨＩ部位を含んだ。３′ｐｓｐＡ
プライマーは、３３塩基長で塩基１９９０で始まり追加
のＳａｌＩ部位を含んだＬＳＭ２であった。。
配列に基づいてＰＣＲプライマーをデザインした（第３
〜５図参照）。５′プライマーはＬＳＭ３およびＬＳＭ
４であった。ＬＳＭ３は２８塩基長で塩基５７６から始
まり、ＬＳＭ４は３１塩基長で塩基７９２から始まり、
双方とも追加のＢａｍＨＩ部位を含んだ。３′ｐｓｐＡ
プライマーは、３３塩基長で塩基１９９０で始まり追加
のＳａｌＩ部位を含んだＬＳＭ２であった。。
【００３９】プライマーのヌクレオチド配列は以下の通
りである。 LSM2 5'-GCGCGTCGACGGCTTAAACCCATTCACCATTGG-3'（配列
番号：３） LSM3 5'-CCGGATCCTGAGCCAGAGCAGTTGGCTG-3'（配列番
号：４） LSM4 5'-CCGGATCCGCTCAAAGAGATTGATGAGTCTG-3'（配列番
号：５） 約１０ｎｇのＲｘ１肺炎球菌ゲノムＤＮＡを５′および
３′プライマー対を用いて複製した。試料を最終濃度で
５０ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．
３）、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ2、０．００１％ゼラチン、
０．５ｍＭの各プライマーおよび２００ｍＭの各デオキ
シヌクレオシド三燐酸および２．５ＵのＴａｇＤＮＡポ
リメラーゼを含む全容量５０μｌに調製した。５０μｌ
の鉱油を試料に載せてから、試料を９４℃で２分間変性
させて、次いで９４℃１分間、５０℃で２分間および７
２℃で３分間のサイクルを１０回繰り返し、さらに９４
℃１分間、５０℃２分間および７２℃３分間のサイクル
を別に２０回繰り返し処理した。この３０サイクルを終
了した後、４℃に冷却する前に、試料を７２℃でさらに
５分間保持した。 ［実施例３］本実施例は、不完全ＰｓｐＡ分子の発現に
ついて説明するものである。
りである。 LSM2 5'-GCGCGTCGACGGCTTAAACCCATTCACCATTGG-3'（配列
番号：３） LSM3 5'-CCGGATCCTGAGCCAGAGCAGTTGGCTG-3'（配列番
号：４） LSM4 5'-CCGGATCCGCTCAAAGAGATTGATGAGTCTG-3'（配列番
号：５） 約１０ｎｇのＲｘ１肺炎球菌ゲノムＤＮＡを５′および
３′プライマー対を用いて複製した。試料を最終濃度で
５０ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．
３）、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ2、０．００１％ゼラチン、
０．５ｍＭの各プライマーおよび２００ｍＭの各デオキ
シヌクレオシド三燐酸および２．５ＵのＴａｇＤＮＡポ
リメラーゼを含む全容量５０μｌに調製した。５０μｌ
の鉱油を試料に載せてから、試料を９４℃で２分間変性
させて、次いで９４℃１分間、５０℃で２分間および７
２℃で３分間のサイクルを１０回繰り返し、さらに９４
℃１分間、５０℃２分間および７２℃３分間のサイクル
を別に２０回繰り返し処理した。この３０サイクルを終
了した後、４℃に冷却する前に、試料を７２℃でさらに
５分間保持した。 ［実施例３］本実施例は、不完全ＰｓｐＡ分子の発現に
ついて説明するものである。
【００４０】大腸菌中のＮ末端フラグメントを発現して
同フラグメントを肺炎球菌から放出させる３′欠失ｐｓ
ｐＡを、上記の米国特許出願番号８３５、６９８および
６５６、７７３（さらに上記のＹｏｔｈｅｒら（ＩＩ）
も参照されたい）に記述されたようにして構築した。
同フラグメントを肺炎球菌から放出させる３′欠失ｐｓ
ｐＡを、上記の米国特許出願番号８３５、６９８および
６５６、７７３（さらに上記のＹｏｔｈｅｒら（ＩＩ）
も参照されたい）に記述されたようにして構築した。
【００４１】５′欠失ｐｓｐＡ構造の発現のために分泌
ベクターｐＩＮ−ＩＩＩ−ｏｍｐＡを用いた。複製され
たｐｓｐＡフラグメントをＢａｍＨＩおよびＳａｌＩで
消化して、適当にＢａｍＨＩ／ＳａｌＩ消化ｐＩＮ−Ｉ
ＩＩ−ｏｍｐＡベクター中に連結させて、これによって
ｏｍｐＡリーダー配列に融合した挿入フラグメントをｌ
ａｃプロモーターの枠内制御下に形成することができ
る。大腸菌ＤＨ１の形質転換体を、カザミノ酸（０．１
％）、グルコース（０．２％）およびチアミン（０．０
５ｍＭ）および５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを添加し
た最少Ｅ培地上で選択した。
ベクターｐＩＮ−ＩＩＩ−ｏｍｐＡを用いた。複製され
たｐｓｐＡフラグメントをＢａｍＨＩおよびＳａｌＩで
消化して、適当にＢａｍＨＩ／ＳａｌＩ消化ｐＩＮ−Ｉ
ＩＩ−ｏｍｐＡベクター中に連結させて、これによって
ｏｍｐＡリーダー配列に融合した挿入フラグメントをｌ
ａｃプロモーターの枠内制御下に形成することができ
る。大腸菌ＤＨ１の形質転換体を、カザミノ酸（０．１
％）、グルコース（０．２％）およびチアミン（０．０
５ｍＭ）および５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを添加し
た最少Ｅ培地上で選択した。
【００４２】ｌａｃ発現の誘導のために、細菌を６６０
ｎｍで約０．６の最高密度になるまで３７℃で最少Ｅ培
地中で増殖させて、ＩＰＴＧを２ｍＭの濃度にまで加え
た。細胞を３７℃でさらに２時間インキュベートして、
集菌して、ペリプラズム内容物を浸透圧衝撃によって放
出させた。種々のプラスミドによって産生された不完全
ｐｓｐＡタンパク質のイムノブロットを第６図に示す。
ｎｍで約０．６の最高密度になるまで３７℃で最少Ｅ培
地中で増殖させて、ＩＰＴＧを２ｍＭの濃度にまで加え
た。細胞を３７℃でさらに２時間インキュベートして、
集菌して、ペリプラズム内容物を浸透圧衝撃によって放
出させた。種々のプラスミドによって産生された不完全
ｐｓｐＡタンパク質のイムノブロットを第６図に示す。
【００４３】これらの操作処理によって、３′欠失ｐｓ
ｐＡとしてプラスミドｐＪＹ４２８４、ｐＪＹ４２８
５、ｐＪＹ４３１０およびｐＪＹ４３０６、そして５′
欠失ｐｓｐＡとしてプラスミドｐＢＣ２０７およびｐＢ
Ｃ１００が作製された。プラスミドｐＪＹ４２８４およ
びｐＪＹ４２８５は、５６４塩基対の挿入物を含み、こ
れはヌクレオチド１〜５６４であって、アミノ酸１〜１
１５に対応する予想された１３ｋＤａのＰｓｐＡのＣ末
端欠失産物をコードするものである。プラスミドｐＪＹ
４３１０は、７９５塩基対の挿入物を含み、これはヌク
レオチド１〜７９５であって、アミノ酸１〜１９２に対
応する予想された２１ｋＤａのＣ末端欠失産物をコード
するものである。しかし、ｐＪＹ４３０６は、９９９塩
基対の挿入物を含み、これはヌクレオチド１〜９９９で
あって、アミノ酸１〜２６０に対応する予想された２９
ｋＤａのＣ末端欠失産物をコードするものであった。プ
ラスミドｐＢＣ１００は、１１９９塩基対の挿入物を含
み、これはヌクレオチド７９２〜１９９０であって、ア
ミノ酸１９２〜５８８を含む予想された４４ｋＤａのＰ
ｓｐＡのＮ末端欠失産物をコードするものであった。ｐ
ＢＣ２０７は、１４１５塩基対の挿入物を含み、これは
ヌクレオチド５７６〜１９９０であって、アミノ酸１１
９〜５８８を含む予想された５２ｋＤａのＰｓｐＡのＮ
末端欠失産物をコードするものであった。
ｐＡとしてプラスミドｐＪＹ４２８４、ｐＪＹ４２８
５、ｐＪＹ４３１０およびｐＪＹ４３０６、そして５′
欠失ｐｓｐＡとしてプラスミドｐＢＣ２０７およびｐＢ
Ｃ１００が作製された。プラスミドｐＪＹ４２８４およ
びｐＪＹ４２８５は、５６４塩基対の挿入物を含み、こ
れはヌクレオチド１〜５６４であって、アミノ酸１〜１
１５に対応する予想された１３ｋＤａのＰｓｐＡのＣ末
端欠失産物をコードするものである。プラスミドｐＪＹ
４３１０は、７９５塩基対の挿入物を含み、これはヌク
レオチド１〜７９５であって、アミノ酸１〜１９２に対
応する予想された２１ｋＤａのＣ末端欠失産物をコード
するものである。しかし、ｐＪＹ４３０６は、９９９塩
基対の挿入物を含み、これはヌクレオチド１〜９９９で
あって、アミノ酸１〜２６０に対応する予想された２９
ｋＤａのＣ末端欠失産物をコードするものであった。プ
ラスミドｐＢＣ１００は、１１９９塩基対の挿入物を含
み、これはヌクレオチド７９２〜１９９０であって、ア
ミノ酸１９２〜５８８を含む予想された４４ｋＤａのＰ
ｓｐＡのＮ末端欠失産物をコードするものであった。ｐ
ＢＣ２０７は、１４１５塩基対の挿入物を含み、これは
ヌクレオチド５７６〜１９９０であって、アミノ酸１１
９〜５８８を含む予想された５２ｋＤａのＰｓｐＡのＮ
末端欠失産物をコードするものであった。
【００４４】これらプラスミド中に含まれるｐｓｐＡ遺
伝子配列は、第２図に同定されるようなアミノ酸をコー
ドし、発現する。 ［実施例４］本実施例は、イムノアッセイを実施するた
めの操作処理を説明するものである。
伝子配列は、第２図に同定されるようなアミノ酸をコー
ドし、発現する。 ［実施例４］本実施例は、イムノアッセイを実施するた
めの操作処理を説明するものである。
【００４５】イムノブロット分析を、ＭｃＤａｎｉｅｌ
ら（ＩＶ）に記述にようにして行った。実施例３の記述
のようにして調製した不完全ＰｓｐＡ分子またはＰｓｐ
Ａを濃厚富化した肺炎球菌調製物（ＭｃＤａｎｉｅｌら
（ＩＩ）に記載）を、１０％ドデシル硫酸ナトリウムポ
リアクリルアミドゲル中で電気泳動して、ニトロセルロ
ース上で電気ブロットした。ブロットを実施例１の記述
のようにして調製したそれぞれのＭＡｂと反応させた。
ら（ＩＶ）に記述にようにして行った。実施例３の記述
のようにして調製した不完全ＰｓｐＡ分子またはＰｓｐ
Ａを濃厚富化した肺炎球菌調製物（ＭｃＤａｎｉｅｌら
（ＩＩ）に記載）を、１０％ドデシル硫酸ナトリウムポ
リアクリルアミドゲル中で電気泳動して、ニトロセルロ
ース上で電気ブロットした。ブロットを実施例１の記述
のようにして調製したそれぞれのＭＡｂと反応させた。
【００４６】イムノブロットで観察された反応性を定量
的に確認するために、直接結合ＥＬＩＳＡ法を用いた。
この操作処理において、浸透圧衝撃調製物を全タンパク
質濃度３μｇ／ｍｌに燐酸塩緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）
中で希釈して、１００μｌをイムロン（Ｉｍｍｕｌｎ）
４マイクロ滴定プレートのウェルに加えた。１％ウシ血
清アルブミンＰＢＳ溶液でブロックした後、それぞれの
ＭＡｂの未分画組織培養上清を、７個のウェルの３倍連
続希釈を用いて二重に力価測定して、ヤギ抗マウス免疫
グロブリン−アルカリホスファターゼ抱合第二抗体およ
びアルカリホスファターゼ基質を用いてＭｃＤａｎｉｅ
ｌら（ＩＶ）に記述の方法で展開した。プレートをダイ
ナテク（Ｄｙｎａｔｅｃｈ）プレートリーダーで４０５
ｎｍで読み、３０％終点を各抗体と各調製物について算
出した。
的に確認するために、直接結合ＥＬＩＳＡ法を用いた。
この操作処理において、浸透圧衝撃調製物を全タンパク
質濃度３μｇ／ｍｌに燐酸塩緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）
中で希釈して、１００μｌをイムロン（Ｉｍｍｕｌｎ）
４マイクロ滴定プレートのウェルに加えた。１％ウシ血
清アルブミンＰＢＳ溶液でブロックした後、それぞれの
ＭＡｂの未分画組織培養上清を、７個のウェルの３倍連
続希釈を用いて二重に力価測定して、ヤギ抗マウス免疫
グロブリン−アルカリホスファターゼ抱合第二抗体およ
びアルカリホスファターゼ基質を用いてＭｃＤａｎｉｅ
ｌら（ＩＶ）に記述の方法で展開した。プレートをダイ
ナテク（Ｄｙｎａｔｅｃｈ）プレートリーダーで４０５
ｎｍで読み、３０％終点を各抗体と各調製物について算
出した。
【００４７】ＭＡｂの防御能を試験するために、３匹の
ＣＢＡ／Ｎマウスに１０3ＣＦＵのＷＵ２またはＤ３９
肺炎球菌（＞１００×ＬＤ50）を静脈注射する１時間前
に０．１ｍｌの１／１０希釈（約５〜３０μｇ）の各ハ
イブリドーマ抗体を腹腔内注射した。防御能は、グルー
プ中の全マウスの死亡を阻止する能力によって判定し
た。防御されなかったマウスは全て、チャレンジ後４８
時間内に肺炎球菌感染によって死んだ。 ［実施例５］本実施例は、実施例１に記述のモノクロー
ナル抗体を用いるＰｓｐＡ上のエピトープのマッピング
について説明する。
ＣＢＡ／Ｎマウスに１０3ＣＦＵのＷＵ２またはＤ３９
肺炎球菌（＞１００×ＬＤ50）を静脈注射する１時間前
に０．１ｍｌの１／１０希釈（約５〜３０μｇ）の各ハ
イブリドーマ抗体を腹腔内注射した。防御能は、グルー
プ中の全マウスの死亡を阻止する能力によって判定し
た。防御されなかったマウスは全て、チャレンジ後４８
時間内に肺炎球菌感染によって死んだ。 ［実施例５］本実施例は、実施例１に記述のモノクロー
ナル抗体を用いるＰｓｐＡ上のエピトープのマッピング
について説明する。
【００４８】実施例１に記述され表３に同定された六つ
の新規産生モノクローナル抗体を、先に記述のモノクロ
ーナル抗体Ｘｉ６４、Ｘｉ１２６およびＸｉＲ２７８と
ともにＰｓｐＡ上のエピトープのマッピングに用いた。
の新規産生モノクローナル抗体を、先に記述のモノクロ
ーナル抗体Ｘｉ６４、Ｘｉ１２６およびＸｉＲ２７８と
ともにＰｓｐＡ上のエピトープのマッピングに用いた。
【００４９】各ＭＡｂが異なるエピトープを識別したか
どうかを決定するために、各ＭＡｂを表３に同定したよ
うな八つの追加の肺炎球菌株とＳＤＳ−ＰＡＧＥ分離タ
ンパク質のイムノブロット中で反応させた。七つの異な
るパターンの活性が観察された。ＸｉＲ１６、ＸｉＲ３
５およびＸｉＲ１５２６の三つの抗体がＲｘ１ＰｓｐＡ
上に見出されるエピトープを識別するように見えたが、
他のいずれのＰｓｐＡも識別するようには見えなかっ
た。したがって、これら三つの抗体がＲｘ１ＰｓｐＡと
同じエピトープと全て反応する可能性が考えられた。
どうかを決定するために、各ＭＡｂを表３に同定したよ
うな八つの追加の肺炎球菌株とＳＤＳ−ＰＡＧＥ分離タ
ンパク質のイムノブロット中で反応させた。七つの異な
るパターンの活性が観察された。ＸｉＲ１６、ＸｉＲ３
５およびＸｉＲ１５２６の三つの抗体がＲｘ１ＰｓｐＡ
上に見出されるエピトープを識別するように見えたが、
他のいずれのＰｓｐＡも識別するようには見えなかっ
た。したがって、これら三つの抗体がＲｘ１ＰｓｐＡと
同じエピトープと全て反応する可能性が考えられた。
【００５０】ＭＡｂ Ｘｉ６４およびＸｉ１２６の双方
ともＡＴＣＣ１０１８１３、ＷＵ２およびＲｘ１Ｐｓｐ
Ａ上のエピトープとだけ強く反応するが、他の菌株のＰ
ｓｐＡとは反応しなかった。しかし、ＰｓｐＡのより広
範のパネルの研究（ＭｃＤａｎｉｅｌら（ＩＩＩ）およ
びＣｒａｉｎらに記述）から、Ｘｉ１２６およびＸｉ６
４は異なる抗原決定基を識別することが知られている。
ともＡＴＣＣ１０１８１３、ＷＵ２およびＲｘ１Ｐｓｐ
Ａ上のエピトープとだけ強く反応するが、他の菌株のＰ
ｓｐＡとは反応しなかった。しかし、ＰｓｐＡのより広
範のパネルの研究（ＭｃＤａｎｉｅｌら（ＩＩＩ）およ
びＣｒａｉｎらに記述）から、Ｘｉ１２６およびＸｉ６
４は異なる抗原決定基を識別することが知られている。
【００５１】残りの四つの抗体はそれぞれ、ＰｓｐＡの
パネルと特徴的な反応性パターンを示した。したがっ
て、試験した九つ抗体はＰｓｐＡ上の少なくとも七つの
異なるエピトープを識別した。
パネルと特徴的な反応性パターンを示した。したがっ
て、試験した九つ抗体はＰｓｐＡ上の少なくとも七つの
異なるエピトープを識別した。
【００５２】明瞭ではない理由から、タイプ２株Ｄ３９
は、ＰｓｐＡに対する抗体の防御効果への特異な抵抗能
を有するようであった（Ｍｃｄａｎｉｅｌら（ＩＶ）。
ＭｃＤａｎｉｅｌら（Ｉ）に記述されているように、Ｄ
３９株に対する受動的防御には、ＷＵ２株と比較して４
０倍以上の量のＸｉｌ２６が必要であった。六つの新規
に産生されたモノクローナル抗体のいずれもＤ３９株に
対して防御能を示さなかった。これに対して、Ｒｘ１Ｐ
ｓｐＡでマウスを免疫すると、Ａ６６、ＷＵ２およびＥ
Ｆ６７９６株（それぞれマウス病原性肺炎球菌の莢膜型
３、３および６Ａ）に対する防御作用が誘導されるが、
これらは全てＲｘ１およびＤ３９とは異なるＰｓｐＡ型
を有する（ＭｃＤａｎｉｅｌら（ＩＶ）を参照された
い）。Ｒｘ１の２５型ＰｓｐＡとＷＵ２の１型ＰｓｐＡ
との間の高い血清学的近似性（Ｃｒａｉｎら）から考え
て、ＷＵ２肺炎球菌をＭＡｂで受動防御されていたマウ
スのチャレンジに用いた。ＷＵＰｓｐＡを結合すること
が観察された五つのＭＡｂの全てが１０００ＣＦＵのＷ
Ｕ２の感染に対する受動的防御能を示した。防御的抗体
は、ＩｇＭ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ｂおよびＩｇＧ２ａ重
鎖アイソタイプクラスに見出だされた。 ［実施例６］本実施例は、実施例３で形成された組換え
不完全ＰｓｐＡ分子を用いるＰｓｐＡのエピトープのマ
ッピングについて説明するものである。
は、ＰｓｐＡに対する抗体の防御効果への特異な抵抗能
を有するようであった（Ｍｃｄａｎｉｅｌら（ＩＶ）。
ＭｃＤａｎｉｅｌら（Ｉ）に記述されているように、Ｄ
３９株に対する受動的防御には、ＷＵ２株と比較して４
０倍以上の量のＸｉｌ２６が必要であった。六つの新規
に産生されたモノクローナル抗体のいずれもＤ３９株に
対して防御能を示さなかった。これに対して、Ｒｘ１Ｐ
ｓｐＡでマウスを免疫すると、Ａ６６、ＷＵ２およびＥ
Ｆ６７９６株（それぞれマウス病原性肺炎球菌の莢膜型
３、３および６Ａ）に対する防御作用が誘導されるが、
これらは全てＲｘ１およびＤ３９とは異なるＰｓｐＡ型
を有する（ＭｃＤａｎｉｅｌら（ＩＶ）を参照された
い）。Ｒｘ１の２５型ＰｓｐＡとＷＵ２の１型ＰｓｐＡ
との間の高い血清学的近似性（Ｃｒａｉｎら）から考え
て、ＷＵ２肺炎球菌をＭＡｂで受動防御されていたマウ
スのチャレンジに用いた。ＷＵＰｓｐＡを結合すること
が観察された五つのＭＡｂの全てが１０００ＣＦＵのＷ
Ｕ２の感染に対する受動的防御能を示した。防御的抗体
は、ＩｇＭ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ｂおよびＩｇＧ２ａ重
鎖アイソタイプクラスに見出だされた。 ［実施例６］本実施例は、実施例３で形成された組換え
不完全ＰｓｐＡ分子を用いるＰｓｐＡのエピトープのマ
ッピングについて説明するものである。
【００５３】実施例３に記述のようにして調製された第
２図に示す五つの重複しているＣ末端またはＮ末端欠失
ＰｓｐＡフラグメントを、ＰｓｐＡ上のエピトープのマ
ッピングに用いた。実施例５に記述したように、各マウ
スＭＡｂによって検出されたエピトープの一般位置を、
五つのＣ末端欠失および二つのＮ末端欠失ＰｓｐＡ分子
を用いて決定した。陽性のコントロールとして、各抗体
の反応性を全長ＰｓｐＡを発現するクローンｐＫＳＤ１
０１４を用いて調べた。
２図に示す五つの重複しているＣ末端またはＮ末端欠失
ＰｓｐＡフラグメントを、ＰｓｐＡ上のエピトープのマ
ッピングに用いた。実施例５に記述したように、各マウ
スＭＡｂによって検出されたエピトープの一般位置を、
五つのＣ末端欠失および二つのＮ末端欠失ＰｓｐＡ分子
を用いて決定した。陽性のコントロールとして、各抗体
の反応性を全長ＰｓｐＡを発現するクローンｐＫＳＤ１
０１４を用いて調べた。
【００５４】上記したように、ＭＡｂの反応性を二つの
方法によって決定した。一つの方法では、フラグメント
とＭＡｂとの間の反応性をそれらをＳＤＳ−ＰＡＧＥに
よって分離した後にフラグメント調製物をイムノブロッ
ティングして評価した。第二の方法では、ＭＡｂの非変
性ＰｓｐＡフラグメントとの反応性を定量するために直
接ＥＬＩＳＡを用いた。
方法によって決定した。一つの方法では、フラグメント
とＭＡｂとの間の反応性をそれらをＳＤＳ−ＰＡＧＥに
よって分離した後にフラグメント調製物をイムノブロッ
ティングして評価した。第二の方法では、ＭＡｂの非変
性ＰｓｐＡフラグメントとの反応性を定量するために直
接ＥＬＩＳＡを用いた。
【００５５】観察された反応性およびそのような活性の
定量的結果を表４に示す。
定量的結果を表４に示す。
【００５６】
【表４】 エピトープの予想される位置を第１図に示す。
【００５７】表４のデータから明らかなように、抗体の
うちの三つ、すなわちＸｉ１２６およびＸｉＲ３５およ
びＸｉＲ１５２６は三つのＣ末端欠失クローンの全てと
イムノブロット分析において強く反応し、これは三つ全
部によって検出されたエピトープを形成するために必要
な配列がＰｓｐＡの最初の１１５個のアミノ酸配列内に
あることを示している。このマッピング位置は、それぞ
れ最初の１１９および１９１個のアミノ酸を欠失してい
るＮ末端欠失クローンのいずれともこれら抗体が反応で
きなかったことと合致する。
うちの三つ、すなわちＸｉ１２６およびＸｉＲ３５およ
びＸｉＲ１５２６は三つのＣ末端欠失クローンの全てと
イムノブロット分析において強く反応し、これは三つ全
部によって検出されたエピトープを形成するために必要
な配列がＰｓｐＡの最初の１１５個のアミノ酸配列内に
あることを示している。このマッピング位置は、それぞ
れ最初の１１９および１９１個のアミノ酸を欠失してい
るＮ末端欠失クローンのいずれともこれら抗体が反応で
きなかったことと合致する。
【００５８】ＭＡｂＸｉＲ１２２４はイムノブロットに
よって最長のＣ末端欠失フラグメント（ｐＪＹ４３０
６）と強く反応したが、より短い二つのＣ末端欠失フラ
グメントとは実質的により弱い反応を示した。この結果
は、抗体結合部位は最初の１１５個のアミノ酸配列中に
あるかもしれないが、アミノ酸１９２より先の残基がエ
ピトープの構造または安定性に重要である可能性がある
ことを示している。
よって最長のＣ末端欠失フラグメント（ｐＪＹ４３０
６）と強く反応したが、より短い二つのＣ末端欠失フラ
グメントとは実質的により弱い反応を示した。この結果
は、抗体結合部位は最初の１１５個のアミノ酸配列中に
あるかもしれないが、アミノ酸１９２より先の残基がエ
ピトープの構造または安定性に重要である可能性がある
ことを示している。
【００５９】イムノブロットによって、Ｘｉ６４，Ｘｉ
Ｒ１３２５およびＸｉＲ２７８の三つの抗体の全てが最
長Ｃ末端欠失フラグメントおよびＮ末端欠失フラグメン
トの両方と反応することが示され、したがってそれらの
決定基がアミノ酸位置１９２と２６０の間に位置するこ
とがわかった。一般的な確証的結果は、天然分子を用い
るＥＬＩＳＡで得られた。しかし、二、三の場合、ある
抗体についてイムノブロットでは不完全フラグメントと
の反応を示すにもかかわらず、ＥＬＩＳＡでは全長Ｐｓ
ｐＡを用いての反応が観察されても同じ不完全分子との
反応は観察されなかった。これらの観察結果は、全長Ｐ
ｓｐＡおよび変性フラグメント中に存在する決定基の形
成をマスクしたり阻害するような生理学的条件下で不完
全フラグメントの構造が変化することによるのかもしれ
ない。
Ｒ１３２５およびＸｉＲ２７８の三つの抗体の全てが最
長Ｃ末端欠失フラグメントおよびＮ末端欠失フラグメン
トの両方と反応することが示され、したがってそれらの
決定基がアミノ酸位置１９２と２６０の間に位置するこ
とがわかった。一般的な確証的結果は、天然分子を用い
るＥＬＩＳＡで得られた。しかし、二、三の場合、ある
抗体についてイムノブロットでは不完全フラグメントと
の反応を示すにもかかわらず、ＥＬＩＳＡでは全長Ｐｓ
ｐＡを用いての反応が観察されても同じ不完全分子との
反応は観察されなかった。これらの観察結果は、全長Ｐ
ｓｐＡおよび変性フラグメント中に存在する決定基の形
成をマスクしたり阻害するような生理学的条件下で不完
全フラグメントの構造が変化することによるのかもしれ
ない。
【００６０】ＸｉＲ２１６およびＸｉＲ１３２３の二つ
の抗体は、最初は奇異に見えた反応を示したが、これは
抗体によって検出されたエピトープが一つ以上のＰｓｐ
Ａ部位にある可能性を示している。この予期しない結果
をかんがみて、不完全フラグメントの二組の調製物を用
いてアッセイを複数回繰り返した。追加のアッセイの結
果、これら二つのＭＡｂに関するエピトープの二位置マ
ッピングが確認された。
の抗体は、最初は奇異に見えた反応を示したが、これは
抗体によって検出されたエピトープが一つ以上のＰｓｐ
Ａ部位にある可能性を示している。この予期しない結果
をかんがみて、不完全フラグメントの二組の調製物を用
いてアッセイを複数回繰り返した。追加のアッセイの結
果、これら二つのＭＡｂに関するエピトープの二位置マ
ッピングが確認された。
【００６１】イムノブロッティングによって、ＭＡｂＸ
ｉＲ１６は二つの最長のＣ末端欠失フラグメントと強く
反応したが、最短のＮ末端欠失フラグメントとは反応し
なかった。したがって、検出されたエピトープは、Ｎ末
端から位置１９２までにあると考えられる。予期に反し
て、ＭＡｂＸｉＲ１６はイムノブロットで最長のＮ末端
欠失フラグメント（残基１１９〜１５８）および最短の
Ｃ末端欠失フラグメント（残基１〜１１５）の双方と弱
く反応した。フラグメントが重複しないことから、そし
てフラグメントとの弱いイムノブロット反応性（ＥＬＩ
ＳＡによっては見られない反応性）が人為的結果でなけ
れば、ＭＡｂＸｉＲ１６は両フラグメント上のエピトー
プを識別するに違いない。
ｉＲ１６は二つの最長のＣ末端欠失フラグメントと強く
反応したが、最短のＮ末端欠失フラグメントとは反応し
なかった。したがって、検出されたエピトープは、Ｎ末
端から位置１９２までにあると考えられる。予期に反し
て、ＭＡｂＸｉＲ１６はイムノブロットで最長のＮ末端
欠失フラグメント（残基１１９〜１５８）および最短の
Ｃ末端欠失フラグメント（残基１〜１１５）の双方と弱
く反応した。フラグメントが重複しないことから、そし
てフラグメントとの弱いイムノブロット反応性（ＥＬＩ
ＳＡによっては見られない反応性）が人為的結果でなけ
れば、ＭＡｂＸｉＲ１６は両フラグメント上のエピトー
プを識別するに違いない。
【００６２】ＭＡｂＸｉＲ１３２３の場合、イムノブロ
ットデータによると、検出されたエピトープは位置１９
２と２６０との間に明確に位置づけされる。しかし、Ｅ
ＬＩＳＡ分析では、ＸｉＲ１３２３はＣ末端欠失フラグ
メントのｐＪＹ４３１０（アミノ酸残基１〜１９２）お
よび最短のＮ末端欠失フラグメントのｐＢＣ１００（ア
ミノ酸残基１９２〜５８８）の双方と強いかつ再現性を
有する反応性を示した。奇異なことに、ＭＡｂ１３２３
はイムノブロットによってｐＪＹ４３０６（アミノ酸残
基１〜２６０）と強く反応したにもかかわらず、ＭＡｂ
ＸｉＲ１３２３とｐＪＹ４３０６とのＥＬＩＳＡ反応は
観察されなかった。
ットデータによると、検出されたエピトープは位置１９
２と２６０との間に明確に位置づけされる。しかし、Ｅ
ＬＩＳＡ分析では、ＸｉＲ１３２３はＣ末端欠失フラグ
メントのｐＪＹ４３１０（アミノ酸残基１〜１９２）お
よび最短のＮ末端欠失フラグメントのｐＢＣ１００（ア
ミノ酸残基１９２〜５８８）の双方と強いかつ再現性を
有する反応性を示した。奇異なことに、ＭＡｂ１３２３
はイムノブロットによってｐＪＹ４３０６（アミノ酸残
基１〜２６０）と強く反応したにもかかわらず、ＭＡｂ
ＸｉＲ１３２３とｐＪＹ４３０６とのＥＬＩＳＡ反応は
観察されなかった。
【００６３】これらの観察結果は、ＰｓｐＡの抗原決定
基に末端構造が影響することをさらに証明する。また、
天然のフラグメント上では、ＭＡｂＸｉＲ１３２３は位
置１９２の両側にあるエピトープを識別することを示
す。他のＰｓｐＡにおけるエピトープの発現とＲｘ１Ｐ
ｓｐＡにおけるそれらの位置との関係は、抗体をそれら
のＰｓｐＡにおける見かけのマップ位置によって列挙し
た表４に示されている。Ｎ末端〜位置１１６のエピトー
プを明らかに識別する五つの抗体（ＸｉＲ１６を含む）
が表４の左側に記載されている。Ｃ末端〜位置１９２の
エピトープを明らかに識別する四つの抗体が表４の右側
に記載されている。Ｎ末端〜位置１９２の五つのエピト
ープのうちの三つ（ＸｉＲ１５２６、ＸｉＲ３５および
ＸｉＲ１６で識別されるもの）は試験した他の八つのＰ
ｓｐＡのいずれにも見出だせなかった。一つのエピトー
プ（ＸｉＲ１２２４によって識別される）は他の一つの
菌株によって弱く発現され、別のエピトープ（Ｘｉ１２
６によって識別される）は他の二つの菌株上で発現され
た。これに対して、ＰｓｐＡのαヘリックス領域のＣ末
端３分の１に存在する四つのエピトープはそれぞれ２〜
６の他の菌株中に存在した。Ｎ末端〜位置１９２の領域
と較べてＣ末端〜位置１９２の領域の保存性は、カイ平
方および二サンプル順位検定の双方でＰ＜０．０５で有
意に大きいことが示された。マッピングの結果（表３）
および菌株分布の結果（表４）から、ＸｉＲ３５および
ＸｉＲ１５２６を考え得る例外として、全ての抗体は異
なるＰｓｐＡ決定基を識別するに違いないことが明かで
ある。 ［実施例７］本実施例には、実施例６で得られたマッピ
ングの結果の検討が含まれる。
基に末端構造が影響することをさらに証明する。また、
天然のフラグメント上では、ＭＡｂＸｉＲ１３２３は位
置１９２の両側にあるエピトープを識別することを示
す。他のＰｓｐＡにおけるエピトープの発現とＲｘ１Ｐ
ｓｐＡにおけるそれらの位置との関係は、抗体をそれら
のＰｓｐＡにおける見かけのマップ位置によって列挙し
た表４に示されている。Ｎ末端〜位置１１６のエピトー
プを明らかに識別する五つの抗体（ＸｉＲ１６を含む）
が表４の左側に記載されている。Ｃ末端〜位置１９２の
エピトープを明らかに識別する四つの抗体が表４の右側
に記載されている。Ｎ末端〜位置１９２の五つのエピト
ープのうちの三つ（ＸｉＲ１５２６、ＸｉＲ３５および
ＸｉＲ１６で識別されるもの）は試験した他の八つのＰ
ｓｐＡのいずれにも見出だせなかった。一つのエピトー
プ（ＸｉＲ１２２４によって識別される）は他の一つの
菌株によって弱く発現され、別のエピトープ（Ｘｉ１２
６によって識別される）は他の二つの菌株上で発現され
た。これに対して、ＰｓｐＡのαヘリックス領域のＣ末
端３分の１に存在する四つのエピトープはそれぞれ２〜
６の他の菌株中に存在した。Ｎ末端〜位置１９２の領域
と較べてＣ末端〜位置１９２の領域の保存性は、カイ平
方および二サンプル順位検定の双方でＰ＜０．０５で有
意に大きいことが示された。マッピングの結果（表３）
および菌株分布の結果（表４）から、ＸｉＲ３５および
ＸｉＲ１５２６を考え得る例外として、全ての抗体は異
なるＰｓｐＡ決定基を識別するに違いないことが明かで
ある。 ［実施例７］本実施例には、実施例６で得られたマッピ
ングの結果の検討が含まれる。
【００６４】実施例６に記述した結果は、ＰｓｐＡの防
御誘導エピトープが分子の表面露出αヘリックスの半分
のＮ末端側に限定されないことを明確に示している。事
実、肺炎球菌ＷＵ２に対して防御的な五つの抗体のうち
の四つがＰｓｐＡのαヘリックス領域のＣ末端側３分の
１と反応した。αヘリックス領域のこの部分は細胞壁に
最も近接していると考えられる（Ｙｏｔｈｅｒら（Ｉ
Ｉ）を参照されたい）。
御誘導エピトープが分子の表面露出αヘリックスの半分
のＮ末端側に限定されないことを明確に示している。事
実、肺炎球菌ＷＵ２に対して防御的な五つの抗体のうち
の四つがＰｓｐＡのαヘリックス領域のＣ末端側３分の
１と反応した。αヘリックス領域のこの部分は細胞壁に
最も近接していると考えられる（Ｙｏｔｈｅｒら（Ｉ
Ｉ）を参照されたい）。
【００６５】ＭＡｂの約半分がＮ末端〜アミノ酸１１５
で決定基を識別し、他の半分がＣ末端〜残基１９２でエ
ピトープを識別した。九つの抗体が加熱殺菌肺炎球菌の
全菌体表面上の天然ＰｓｐＡへの結合能によって選択さ
れたことから、それらが認識するエピトープの分布によ
って、位置１１５と１９２との間の決定基は免疫原性を
有していないかまたは肺炎球菌上に発現されたとき天然
分子上に露出していないかのいずれかであることが示唆
される。
で決定基を識別し、他の半分がＣ末端〜残基１９２でエ
ピトープを識別した。九つの抗体が加熱殺菌肺炎球菌の
全菌体表面上の天然ＰｓｐＡへの結合能によって選択さ
れたことから、それらが認識するエピトープの分布によ
って、位置１１５と１９２との間の決定基は免疫原性を
有していないかまたは肺炎球菌上に発現されたとき天然
分子上に露出していないかのいずれかであることが示唆
される。
【００６６】奇異なことに、二つのＭＡｂ（ＸｉＲ１６
およびＸｉＲ１３２３）はＰｓｐＡ上の一つ以上の位置
のエピトープと反応する可能性があるように見えた。Ｘ
ｉＲ１６に関するデータの大部分はエピトープがＮ末端
〜位置１１５にあることを示したが、弱いイムノブロッ
トパターンは反応性エピトープがＣ末端〜残基１１５に
も存在するかもしれないことを示唆している。ＸｉＲ１
３２３の場合には、データの大部分がそのエピトープが
位置１９２〜２６０にあることを示した。しかし、ＥＬ
ＩＳＡアッセイは、残基１から１９２に伸びるＣ末端欠
失ＰｓｐＡフラグメントとの抗体の有意の反応性を示し
た。ＰｓｐＡのＮ末端側半分には広範な反復はないが、
螺旋状コイル部分に１回以上起きる二、三の短い反復配
列がある。それらの配列の一つはアミノ酸位置１０５、
１３３および１４７から始まるｇｌｕ−ｇｌｕ−ａｌａ
−ｌｙｓであり、別の一つは位置１５０および２２０か
ら始まるｌｙｓ−ａｌａ−ｌｙｓ−ｌｅｕである（第３
〜５図を参照されたい）。ＸｉＲ１３２３の場合、抗体
は１〜１９２フラグメント上のエピトープと自然条件下
で反応し、変性条件下では反応しなかった。これは、こ
のエピトープが配座形態をとり、残基１９２と２６０と
の間で（自然および変性条件下のいずれでも）識別され
たエピトープと厳密に同一の配列ではないかもしれない
ことを示しているとも考えられる。
およびＸｉＲ１３２３）はＰｓｐＡ上の一つ以上の位置
のエピトープと反応する可能性があるように見えた。Ｘ
ｉＲ１６に関するデータの大部分はエピトープがＮ末端
〜位置１１５にあることを示したが、弱いイムノブロッ
トパターンは反応性エピトープがＣ末端〜残基１１５に
も存在するかもしれないことを示唆している。ＸｉＲ１
３２３の場合には、データの大部分がそのエピトープが
位置１９２〜２６０にあることを示した。しかし、ＥＬ
ＩＳＡアッセイは、残基１から１９２に伸びるＣ末端欠
失ＰｓｐＡフラグメントとの抗体の有意の反応性を示し
た。ＰｓｐＡのＮ末端側半分には広範な反復はないが、
螺旋状コイル部分に１回以上起きる二、三の短い反復配
列がある。それらの配列の一つはアミノ酸位置１０５、
１３３および１４７から始まるｇｌｕ−ｇｌｕ−ａｌａ
−ｌｙｓであり、別の一つは位置１５０および２２０か
ら始まるｌｙｓ−ａｌａ−ｌｙｓ−ｌｅｕである（第３
〜５図を参照されたい）。ＸｉＲ１３２３の場合、抗体
は１〜１９２フラグメント上のエピトープと自然条件下
で反応し、変性条件下では反応しなかった。これは、こ
のエピトープが配座形態をとり、残基１９２と２６０と
の間で（自然および変性条件下のいずれでも）識別され
たエピトープと厳密に同一の配列ではないかもしれない
ことを示しているとも考えられる。
【００６７】アミノ酸１１５と１９２との間のエピトー
プの露出の欠失を説明すると思われる一つのメカニズム
としては、αヘリックス配列のこの部分がそれ自身また
はＰｓｐＡの他の部分に折り返されて簡単な螺旋状コイ
ル二量体よりもより複雑な螺旋状コイル構造を形成する
ことが考えられる。このようなことが起きるとすれば、
いかにしてＰｓｐＡ三次構造がときに離れたＰｓｐＡ構
造に依存し得るかが説明できる。このようなことが事実
起きているであろうという示唆は、不完全型のいくつか
が、全分子上で生理的条件下で検出されてＳＤＳ中で変
性後にフラグメント中に存在することが示された特定の
エピトープを、同条件下で発現しないという観察結果か
ら出てきたものである。
プの露出の欠失を説明すると思われる一つのメカニズム
としては、αヘリックス配列のこの部分がそれ自身また
はＰｓｐＡの他の部分に折り返されて簡単な螺旋状コイ
ル二量体よりもより複雑な螺旋状コイル構造を形成する
ことが考えられる。このようなことが起きるとすれば、
いかにしてＰｓｐＡ三次構造がときに離れたＰｓｐＡ構
造に依存し得るかが説明できる。このようなことが事実
起きているであろうという示唆は、不完全型のいくつか
が、全分子上で生理的条件下で検出されてＳＤＳ中で変
性後にフラグメント中に存在することが示された特定の
エピトープを、同条件下で発現しないという観察結果か
ら出てきたものである。
【００６８】ＰｓｐＡワクチンにはいくつかの血清学的
に異なるＰｓｐＡフラグメントが含まれる必要があるか
もしれないことから、交差防御的抗体を誘導する可能性
が最も高いそれぞれのＰｓｐＡの部分のみをワクチンに
含ませることが望ましいと考えられる。ここにＲｘ１Ｐ
ｓｐＡについて提示した結果に基づけば、Ｒｘ１Ｐｓｐ
Ａの残基１９２〜２６０に対応するＰｓｐＡ配列の部分
が組換えＰｓｐＡワクチン中に含ませる最良のＰｓｐＡ
部分であると考えられる。ＰｓｐＡのこの部分のエピト
ープが他の菌株のＰｓｐＡに存在する可能性は配列残基
１〜１１５部分にあるエピトープの３．５倍であり、調
べた九つの抗体のいずれもαヘリックス領域の真ん中の
３分の１と明確に反応しなかった。 ［実施例８］本実施例は、ＰｓｐＡフラグメントによる
マウスの防御を示すものである。５匹のマウスを大腸菌
中でｐＢＣ２０７によって産生した精製フラグメントで
免疫し、別の５匹を大腸菌中でｐＢＣ１００によって産
生した精製フラグメントで免疫した。ともに、フラグメ
ントをフロイントの完全アジュバントと混合して注射し
た。それぞれのフラグメントで免疫したマウスは全て、
ＷＵ２莢膜型３の肺炎球菌の１００×ＬＤ50でのチャレ
ンジに抗して生存した。
に異なるＰｓｐＡフラグメントが含まれる必要があるか
もしれないことから、交差防御的抗体を誘導する可能性
が最も高いそれぞれのＰｓｐＡの部分のみをワクチンに
含ませることが望ましいと考えられる。ここにＲｘ１Ｐ
ｓｐＡについて提示した結果に基づけば、Ｒｘ１Ｐｓｐ
Ａの残基１９２〜２６０に対応するＰｓｐＡ配列の部分
が組換えＰｓｐＡワクチン中に含ませる最良のＰｓｐＡ
部分であると考えられる。ＰｓｐＡのこの部分のエピト
ープが他の菌株のＰｓｐＡに存在する可能性は配列残基
１〜１１５部分にあるエピトープの３．５倍であり、調
べた九つの抗体のいずれもαヘリックス領域の真ん中の
３分の１と明確に反応しなかった。 ［実施例８］本実施例は、ＰｓｐＡフラグメントによる
マウスの防御を示すものである。５匹のマウスを大腸菌
中でｐＢＣ２０７によって産生した精製フラグメントで
免疫し、別の５匹を大腸菌中でｐＢＣ１００によって産
生した精製フラグメントで免疫した。ともに、フラグメ
ントをフロイントの完全アジュバントと混合して注射し
た。それぞれのフラグメントで免疫したマウスは全て、
ＷＵ２莢膜型３の肺炎球菌の１００×ＬＤ50でのチャレ
ンジに抗して生存した。
【００６９】さらに５匹のマウスに、アジュバント＋非
ＰｓｐＡ産生性大腸菌上での同等の調製物を注射した。
同投与量のＷＵ２でチャレンジしたところ、全マウスが
死滅した。
ＰｓｐＡ産生性大腸菌上での同等の調製物を注射した。
同投与量のＷＵ２でチャレンジしたところ、全マウスが
死滅した。
【００７０】本実施例で示したデータは、Ｃ末端からア
ミノ酸１１９までおよび１９２までのエピトープがそれ
ぞれ防御的免疫を誘導し得ることを結論として証明して
いる。この結果は、アミノ酸１９２から２６０までのＰ
ｓｐＡの領域が防御誘導エピトープを含むという先の実
施例で見出だされた結果と一致している。 配列一覧 配列番号：１ ｐｓｐＡ遺伝子のＤＮＡ配列（第３〜５
図） 配列番号：２ ＰｓｐＡタンパク質の論理的アミノ酸配
列（第３〜５図） 配列番号：３ ＰＣＲプライマーＬＳＭ２のヌクレオチ
ド配列 配列番号：４ ＰＣＲプライマーＬＳＭ３のヌクレオチ
ド配列 配列番号：５ ＰＣＲプライマーＬＳＭ４のヌクレオチ
ド配列
ミノ酸１１９までおよび１９２までのエピトープがそれ
ぞれ防御的免疫を誘導し得ることを結論として証明して
いる。この結果は、アミノ酸１９２から２６０までのＰ
ｓｐＡの領域が防御誘導エピトープを含むという先の実
施例で見出だされた結果と一致している。 配列一覧 配列番号：１ ｐｓｐＡ遺伝子のＤＮＡ配列（第３〜５
図） 配列番号：２ ＰｓｐＡタンパク質の論理的アミノ酸配
列（第３〜５図） 配列番号：３ ＰＣＲプライマーＬＳＭ２のヌクレオチ
ド配列 配列番号：４ ＰＣＲプライマーＬＳＭ３のヌクレオチ
ド配列 配列番号：５ ＰＣＲプライマーＬＳＭ４のヌクレオチ
ド配列
【００７１】
（１）配列番号：１ （ｉ）配列の特徴 （Ａ）配列の長さ：２０８５塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：二本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）配列の型：タンパク質 （ｉｉｉ）仮定：ナシ （ｉｖ）アンチセンス：ナシ （ｖｉ）起源： （Ａ）微生物：肺炎球菌 （Ｂ）菌株：Ｒｘ１ （ｖｉｉ）直接材料： （Ｂ）クローン：ＪＹ４３１３ （ｉｘ）特性： （Ａ）名称／キー：イントロン （Ｂ）位置：１．．２０８５ （ｉｘ）特性： （Ａ）名称／キー：ＣＤＳ （Ｂ）位置：接合点（１２７．．１９８４） （ｘｉ）配列（配列番号：１）
【００７２】
【表５】
【００７３】
【表６】
【００７４】
【表７】
【００７５】（２）配列番号：２ （ｉ）配列の特徴 （Ａ）配列の長さ：６１９アミノ酸 （Ｂ）配列の型：アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）分子型：タンパク質 （ｘｉ）配列（配列番号：２）
【００７６】
【表８】
【００７７】
【表９】
【００７８】（３）配列番号：３ （ｉ）配列の特徴 （Ａ）配列の長さ：３３塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）分子の型：ＤＮＡ（ゲノム） （ｘｉ）配列（配列番号：３）
【００７９】
【表１０】
【００８０】（４）配列番号：４ （ｉ）配列の特徴 （Ａ）配列の長さ：２８塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）分子の型：ＤＮＡ（ゲノム） （ｘｉ）配列（配列番号：４）
【００８１】
【表１１】
【００８２】（５）配列番号：５ （ｉ）配列の特徴 （Ａ）配列の長さ：３１塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）分子の型：ＤＮＡ（ゲノム） （ｘｉ）配列（配列番号：５）
【００８３】
【表１２】
【図１】成熟ＰｓｐＡタンパク質の領域の図式的表示、
ならびに特定のモノクローナル抗体によって識別された
エピトープの一般位置の表示図である。
ならびに特定のモノクローナル抗体によって識別された
エピトープの一般位置の表示図である。
【図２】成熟ＰｓｐＡタンパク質の領域の図式的表示、
ならびに全長タンパク質（ｐＫＳＤ１０１４）をコード
する遺伝子配列、タンパク質のＮ末端部分の特定断片
（ｐＪＹ４２８４またはｐＪＹ４２８５、ｐＪＹ４３１
０、ｐＪＹ４３０６）をコードする遺伝子配列およびタ
ンパク質のＣ末端領域の特定断片（ｐＢＣ２０７、ｐＢ
Ｃ１００）をコードする遺伝子配列をそれぞれ含む特定
のプラスミドを同定して示す図である。
ならびに全長タンパク質（ｐＫＳＤ１０１４）をコード
する遺伝子配列、タンパク質のＮ末端部分の特定断片
（ｐＪＹ４２８４またはｐＪＹ４２８５、ｐＪＹ４３１
０、ｐＪＹ４３０６）をコードする遺伝子配列およびタ
ンパク質のＣ末端領域の特定断片（ｐＢＣ２０７、ｐＢ
Ｃ１００）をコードする遺伝子配列をそれぞれ含む特定
のプラスミドを同定して示す図である。
【図３】肺炎球菌のＲｘ１株のｐｓｐＡ遺伝子のＤＮＡ
配列および、それに基づいたＰｓｐＡタンパク質のアミ
ノ酸配列の図の一部である。図３、図４および図５の順
に配列が連続する。
配列および、それに基づいたＰｓｐＡタンパク質のアミ
ノ酸配列の図の一部である。図３、図４および図５の順
に配列が連続する。
【図４】肺炎球菌のＲｘ１株のｐｓｐＡ遺伝子のＤＮＡ
配列および、それに基づいたＰｓｐＡタンパク質のアミ
ノ酸配列の図の一部である。図３、図４および図５の順
に配列が連続する。
配列および、それに基づいたＰｓｐＡタンパク質のアミ
ノ酸配列の図の一部である。図３、図４および図５の順
に配列が連続する。
【図５】肺炎球菌のＲｘ１株のｐｓｐＡ遺伝子のＤＮＡ
配列および、それに基づいたＰｓｐＡタンパク質のアミ
ノ酸配列の図の一部である。図３、図４および図５の順
に配列が連続する。
配列および、それに基づいたＰｓｐＡタンパク質のアミ
ノ酸配列の図の一部である。図３、図４および図５の順
に配列が連続する。
【図６】ここで同定されたプラスミドによって産生され
るＰｓｐＡタンパク質遺伝子産物のイムノブロットの図
である。
るＰｓｐＡタンパク質遺伝子産物のイムノブロットの図
である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 9282−4Ｂ 21/08 9161−4Ｂ // Ｃ１２Ｎ 15/02 (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 ジャネット エル ヨーザー アメリカ合衆国 35242 アラバマ州 バ ーミンガム ハザーブルック ロード 2208 (72)発明者 ラリー エス マクダニエル アメリカ合衆国 35210 アラバマ州 バ ーミンガム コーネル ドライヴ 5354
Claims (14)
- 【請求項１】 肺炎球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ
ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）のＲｘ１株の肺炎球菌表面プ
ロテインＡタンパク質のアミノ酸残基１９２〜２６０か
らなり、少なくとも一つの防御誘導エピトープを含む、
分離肺炎球菌表面プロテインＡ（ＰｓｐＡ）タンパク質
フラグメント。 - 【請求項２】 Ｒｘ１菌株のＰｓｐＡタンパク質のアミ
ノ酸残基１９２〜２６０に対応するアミノ酸配列物を含
む請求項１に記載のタンパク質フラグメント。 - 【請求項３】 該アミノ酸配列を有する請求項２に記載
のタンパク質フラグメント。 - 【請求項４】 Ｒｘ１株のＰｓｐＡタンパク質のアミノ
酸残基１９２〜２６０と相同のアミノ酸配列を含む請求
項１、２または３に記載のタンパク質フラグメント。 - 【請求項５】 該アミノ酸配列を有する請求項４に記載
のタンパク質フラグメント。 - 【請求項６】 該タンパク質フラグメントを含む不完全
Ｃ末端欠失産物のかたちで組換えによって産生される請
求項１〜５のいずれか１項に記載のタンパク質フラグメ
ント。 - 【請求項７】 該不完全Ｃ末端欠失産生物が天然Ｐｓｐ
Ａタンパク質のαヘリックス領域のＣ末端側のほぼ３分
の１を含むことを特徴とする請求項６に記載のタンパク
質フラグメント。 - 【請求項８】 天然ＰｓｐＡタンパク質がＲｘ１Ｐｓｐ
Ａであることを特徴とする請求項７に記載のタンパク質
フラグメント。 - 【請求項９】 ポリペプチドである請求項１〜８のいず
れか１項に記載のタンパク質フラグメント。 - 【請求項１０】 肺炎球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕ
ｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）のＲｘ１株の肺炎球菌表面
プロテインＡ（ＰｓｐＡ）タンパク質のアミノ酸残基１
９２〜２６０に含まれる防御誘導エピトープのアミノ酸
配列に対応するアミノ酸配列からなる分離タンパク質フ
ラグメント。 - 【請求項１１】 それぞれの分子が請求項１〜１０のい
ずれか１項に記載の分離タンパク質フラグメントからな
り、それぞれの分子が肺炎球菌の異なる菌株に由来す
る、複数個の抱合分子からなる肺炎球菌表面プロテイン
Ａ（ＰｓｐＡ）タンパク質フラグメント。 - 【請求項１２】 請求項１〜１１のいずれか１項に記載
のＰｓｐＡタンパク質フラグメントを免疫学的活性成分
として含んでなる肺炎球菌感染によって引き起こされる
疾患に対するワクチン。 - 【請求項１３】 該ＰｓｐＡタンパク質フラグメントが
請求項１〜１０のいずれか１項に記載のものであってか
つより大きな分子に抱合されていることを特徴とする請
求項１２に記載のワクチン。 - 【請求項１４】 ＸｉＲ１５２６、ＸｉＲ３５、ＸｉＲ
１２２４、ＸｉＲ１６、ＸｉＲ１３２５およびＸｉＲ１
３２３とそれぞれ同定呼称される一群から選択されるモ
ノクローナル抗ＰｓｐＡ抗体。
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
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| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP08073594A Expired - Fee Related JP3245298B2 (ja) | 1993-04-20 | 1994-04-19 | 肺炎球菌表面プロテインａのエピトープ領域 |
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|---|---|---|---|
| JP2001227943A Pending JP2002167399A (ja) | 1993-04-20 | 2001-07-27 | 肺炎球菌表面プロテインａのエピトープ領域 |
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| JP (2) | JP3245298B2 (ja) |
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Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH0840927A (ja) * | 1994-05-20 | 1996-02-13 | Uab Res Found | 肺炎球菌抗原の経粘膜投与方法 |
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|---|---|---|---|---|
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| US6592876B1 (en) * | 1993-04-20 | 2003-07-15 | Uab Research Foundation | Pneumococcal genes, portions thereof, expression products therefrom, and uses of such genes, portions and products |
| US5955089A (en) | 1993-04-20 | 1999-09-21 | Uab Research Foundation | Strain selection of pneumococcal surface proteins |
| AU734488B2 (en) * | 1994-05-20 | 2001-06-14 | Uab Research Foundation | Mucosal administration of pneumococcal antigens |
| ZA964896B (en) * | 1995-06-07 | 1997-01-08 | Connaught Lab | Expression of lipoproteins |
| US7078042B2 (en) | 1995-09-15 | 2006-07-18 | Uab Research Foundation | Pneumococcal surface protein C (PspC), epitopic regions and strain selection thereof, and uses therefor |
| US6245335B1 (en) | 1996-05-01 | 2001-06-12 | The Rockefeller University | Choline binding proteins for anti-pneumococcal vaccines |
| JP2000511411A (ja) * | 1996-05-01 | 2000-09-05 | ザ ロックフェラー ユニヴァーシティ | 抗―肺炎球菌ワクチン用のコリン結合タンパク質 |
| US6420135B1 (en) | 1996-10-31 | 2002-07-16 | Human Genome Sciences, Inc. | Streptococcus pneumoniae polynucleotides and sequences |
| JP2002503087A (ja) | 1996-11-12 | 2002-01-29 | リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ ミネソタ | ストレプトコッカス・ニューモニアのｃ３結合タンパク質 |
| US6676943B1 (en) | 1997-04-24 | 2004-01-13 | Regents Of The University Of Minnesota | Human complement C3-degrading protein from Streptococcus pneumoniae |
| EP1073450A4 (en) * | 1998-04-23 | 2003-04-23 | Uab Research Foundation | PNEUMOCOCCAL SURFACE PROTEIN C (PSPC), EPITOPIC REGIONS, SELECTION OF CORRESPONDING STRES AND USES |
| JP2002531055A (ja) * | 1998-07-27 | 2002-09-24 | マイクロビアル テクニクス リミティッド | 肺炎連鎖球菌のタンパク質及び核酸分子 |
| US6936252B2 (en) | 1998-07-27 | 2005-08-30 | Microbial Technics Limited | Streptococcus pneumoniae proteins and nucleic acid molecules |
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