JPWO2017170494A1 - 抗肥満ワクチン - Google Patents
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Abstract
【選択図】なし
Description
臨床試験から、これらの薬剤はヒトの体重を減少させるが、偽薬投与群と比較して体重の減少は10%以下であることが明らかとなった。これらの薬剤の体重減少効果が満足のいくものではないことに加え、抗肥満薬は依然として、orlistatによる脂肪/油脂便、脂溶性ビタミンの吸収不良および肝臓障害(非特許文献1〜3)、lorcaserinによる発がん性、精神医学的症状、弁膜症などの潜在的で議論の余地のある危険性を有していることが報告されている(非特許文献3)。従って、効果的で安全な肥満の予防または治療方法の開発が必要である。
多くの内在性ホルモンの中で、グレリンは、食物の摂取を促進し、エネルギー消費を減少させて正のエネルギーバランスを助長することが知られている唯一の末梢ホルモンである(非特許文献4)。グレリンは28アミノ酸残基からなり、3番目のセリンがオクタノイル化されており、成長ホルモン分泌促進因子レセプター(GHSR)のリガンドとして同定された(非特許文献5)。グレリンは、主に胃のA/X-like 細胞で産生および分泌されるが(非特許文献6)、腸、膵臓および下垂体など多くの組織においても発現している(非特許文献7)。3番目のセリン残基のオクタノイル化は、グレリンO−アシルトランスフェラーゼ(GOAT)によって促進され、そのレセプターであるGHSRの活性化に不可欠である(非特許文献8および9)。アシル化されたグレリン(AG、アシル−グレリン)は、胃の迷走神経の求心性ニューロンにあるGHSRを介して空腹感を促し、食物摂取を増大させる。これに対し、アシル化されていないグレリン(UAG,脱アシル−グレリン)は、食物摂取とGHSR-迷走神経の活性には影響を及ぼさない(非特許文献10)。また、GHSRノックアウトマウスは、標準食の条件では正常な表現型を示すが、食餌誘発性肥満(DIO;diet-induced obesity)には耐性を示した(非特許文献11)。従って、体重増加における生理学的機能に照らし、血流中にグレリンが存在すること、AG-GHSR情報伝達系を阻害しても重篤な症状は生じないことなどから、グレリンは肥満治療に関する合理的で安全なターゲットであると思われる。
また、3番目のセリンをアシル化せずに、グレリンペプチド等をVLP(Virus-like particles)と化学的に結合させてワクチン抗原として使用した場合には、DIOマウスの体重増加は若干低下させるものの(特許文献2)、ob/obマウスのように、遺伝子異常に起因し、標準食摂餌下においても進行性かつ難治性の肥満を呈するマウスにおいては、体重増加を軽減させるかどうかについては不明であった(特許文献2の実施例5など)。以上のように、様々な原因により発症する肥満に対し、体重の増加を効果的に減少させるワクチンを開発することは、依然として、当該技術分野における重要な解決課題とされていた。
(1)担体タンパク質と、1または複数個のグレリンポリペプチドの全長を融合させた融合タンパク質を含むワクチン製剤。
(2)2〜4個のグレリンポリペプチドが融合されていることを特徴とする上記(1)に記載のワクチン製剤。
(3)3個のグレリンポリペプチドが融合されていることを特徴とする上記(1)または(2)に記載のワクチン製剤。
(4)担体タンパク質がN末端側に存在していることを特徴とする上記(1)ないし(3)のいずれかに記載のワクチン製剤。
(5)グレリンポリペプチド同士、およびグレリンポリペプチドと担体タンパク質がリンカーペプチドで連結されていることを特徴とする上記(1)ないし(4)のいずれかに記載のワクチン製剤。
(6)担体タンパク質がPspAであることを特徴とする上記(1)ないし(5)のいずれかに記載のワクチン製剤。
(7)前記グレリンポリペプチドが以下の(a)または(b)のいずれかであることを特徴とする上記(1)ないし(6)のいずれかに記載のワクチン製剤。
(a)配列番号1、配列番号2または配列番号3で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド
(b)配列番号1、配列番号2または配列番号3で表されるアミノ酸配列において、1または数個のアミノ酸が欠失、挿入、付加され、および/または、3番目のセリン以外のアミノ酸残基の1または数個のアミノ酸が置換されたアミノ酸配列からなり、かつ、3番目のセリンがオクタノイル化された場合にGHSRとの結合活性を有するポリペプチド
(8)前記融合タンパク質が配列番号6で表されるアミノ酸配列からなることを特徴とする上記(1)ないし(7)のいずれかに記載のワクチン製剤。
(9)前記融合タンパク質がcCHPナノゲルと複合体を形成していることを特徴とする上記(1)ないし(8)のいずれかに記載の抗肥満ワクチン製剤。
(10)担体タンパク質と、1または複数個のグレリンポリペプチドの全長を融合させた、融合タンパク質。
(11)前記担体タンパク質がPspAであることを特徴とする上記(10)に記載の融合タンパク質。
(12)前記グレリンポリペプチドが以下の(a)または(b)のいずれかであることを特徴とする上記(10)または(11)に記載の融合タンパク質。
(a)配列番号1、配列番号2または配列番号3で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド
(b)配列番号1、配列番号2または配列番号3で表されるアミノ酸配列において、1または数個のアミノ酸が欠失、挿入、付加され、および/または、3番目のセリン以外のアミノ酸残基の1または数個のアミノ酸が置換されたアミノ酸配列からなり、かつ、3番目のセリンがオクタノイル化された場合にGHSRとの結合活性を有するポリペプチド
(13)配列番号6で表されるアミノ酸配列からなる上記(10)ないし(12)のいずれかに記載の融合タンパク質。
(14)上記(10)ないし(13)のいずれかに記載の融合タンパク質をコードする核酸。
(15)配列番号5で表される核酸配列からなる上記(14)に記載の核酸。
グレリンは28アミノ酸残基からなり、3番目のセリンがオクタノイル化された活性型のグレリンは、成長ホルモン分泌促進因子レセプター(GHSR)と結合し、食物の摂取を促進させ、エネルギー消費を減少させる。これまでに、グレリンをワクチンとして用いる場合、3番目のセリンがオクタノイル化など、アシル化されたグレリンを用いるものが報告されているが、アシル化を行うことで、グレリンが生体内で不安定になること、親油性になりミセルなどを形成するおそれがあることなどから、本発明の実施形態においては、3番目のセリンがアシル化されていないグレリンポリペプチドの全長(28残基からなるポリペプチド)を、1個または複数個連結したものを免疫原として用いることとした。
なお、本明細書中では、28残基からなるグレリンポリペプチドのことを、単に「グレリン」と記載することもあるが、特に注記しない限り「グレリンポリペプチド」と同義である。
本発明の実施形態で使用されるグレリンポリペプチドは、種々の動物種由来のものを使用することができ、限定はしないが、例えば、ヒト由来(配列番号1)、マウス由来(配列番号2)、イヌ由来(配列番号3)の他、ラット、ブタ、ウシおよびヒツジなどの動物由来のものを使用することができる。
より具体的には、例えば、配列番号1、配列番号2または配列番号3で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの他、これらのポリペプチドと実質的に同一のポリペプチドであってもグレリンポリペプチドとして使用することができる。
「配列番号1、配列番号2または配列番号3で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドと実質的に同一のポリペプチド」とは、例えば、配列番号1、配列番号2または配列番号3で表されるアミノ酸配列において、1または数個のアミノ酸が欠失、挿入、付加され、および/または、3番目のセリン以外のアミノ酸残基の1または数個のアミノ酸が置換されたアミノ酸配列からなり、かつ、3番目のセリンがオクタノイル化など、アシル化された場合にGHSRとの結合活性を有するポリペプチドのことである。
ここで、PspAとは、肺炎球菌表面タンパク質A(pneumococcal surface protein A)のことで、family 1-3、clade1-6に分類されているが、本発明の実施形態においては、どのグループに分類されるPspAであっても使用することができる。
ポリペプチド同士を連結するためにリンカーを使用する場合には、リンカーペプチドとして当該技術分野で公知のものであれば如何なるものも使用することができる。本発明の実施形態において使用可能なリンカーペプチドとして、例えば、フレキシブルなリンカーとして、GGGGS(配列番号5)配列を数回繰り返したペプチド(本発明の実施例では4回繰り返したペプチドを使用)やGPGPなどを挙げることができ、より詳細には、Chenら, Fusion protein linkers: property, design and functionality. Adv Drug Deliv Rev. 2013; 65(10): 1357-69のtable 3に列挙されているようなものを使用することができる。
まず、担体タンパク質(例えば、ジフテリアCRM 197蛋白質、組換えB型肝炎ワクチン蛋白(酵母で調製)、PspAなど)およびグレリンの遺伝子情報は、GenBankなどのデータベースから容易に取得することができる。次に、取得した遺伝子情報に基づいて、これらの遺伝子配列と、リンカーペプチドをコードする核酸配列を、各タンパク質およびペプチドが連結して発現可能となるように核酸配列の読み枠を調整し、得られた核酸配列情報に基づいて、融合タンパク質をコードするDNAを合成する。合成されたDNAは適当な発現ベクターに挿入し、常法に基づいて、タンパク質を発現し、単離精製を行うことで、本発明の融合タンパク質を作製することができる。例えば、図1に示す配置の融合タンパク質の遺伝子配列として配列番号5の核酸配列を示すことができ、この配列を持つDNAを発現させると配列番号6で表されるアミノ酸配列からなる本発明の融合タンパク質を取得することができる。
cCHPナノゲル(cCHP;cationic type of cholesteryl group-bearing pullulan、自己凝集性ナノサイズヒドロゲル)(WO00/12564、Berryら, Infect Immun 57, 2037-2042 1989)は、そのナノマトリックス内部にタンパク質抗原を内包すると、人工的なシャペロンとして機能し、抗原の凝集および変性を防ぎ、抗原放出後のリフォールディングを助ける。このナノゲルは、効率的に細胞まで送達され、アジュバントフリーワクチンとして免疫応答を誘導する(Nochiら, Nat Mater 9, 572-578 2010:Yukiら, Biotechnol Genet Eng Rev 29, 61-72 2013)。さらに、マウスにおいて、経鼻的に投与した[111In]-標識 BoHc/A(ボツリヌスA型毒素の重鎖C末端領域無毒領域) を担持するcCHPナノゲルを経鼻的に投与しても、嗅球や脳などの中枢神経系に蓄積することはなかった(Nochiら, Nat Mater 9, 572-578 2010)。さらに、マウスにおいて、ナノゲル経鼻ワクチンが安全であり、かつ、強力な抗原特異的な全身性および粘膜性の抗体免疫応答を誘導することも報告されている(Kongら, Infect Immun 81, 1625-1634 2013)。
具体的には、まず、炭素数12〜50の水酸基含有炭化水素またはステロールと、OCN-R1-NCO(式中、R1は炭素数1〜50の炭化水素基である)で表されるジイソシアネート化合物を反応させて、炭素数12〜50の水酸基含有炭化水素又はステロールが1分子反応したイソシアネート基含有疎水性化合物を製造する。得られたイソシアネート基含有疎水性化合物と多糖類とを反応させ、炭素数12〜50の炭化水素基又はステリル基を含有する疎水性基含有多糖類を製造する。次に、得られた生成物をケトン系の溶媒で精製することにより、純度の高い疎水性基含有多糖類を製造することができる。
ここで、多糖類としては、プルラン、アミロペクチン、アミロース、デキストラン、ヒドロキシエチルデキストラン、マンナン、レバン、イヌリン、キチン、キトサン、キシログルカンおよび水溶性セルロース等が利用可能であり、特に、プルランが好ましい。
具体的には、減圧乾燥したCHP(例えば、0.15 g)をジメチルスルホキシド(DMSO)15mlに溶解し、これに1-1’カルボニルジイミダゾール(例えば、75mg)を窒素気流下に加え数時間(例えば、1時間程度)室温で反応させる。その反応溶液にエチレンジアミン(例えば、300mg)を徐々に添加し、数時間から数十時間程度(例えば、24時間程度)攪拌する。得られた反応溶液を蒸留水に対して、数日間透析する。透析後の反応溶液を凍結乾燥し、乳白色の固体を得る。エチレンジアミンの置換度は元素分析やH-NMRなどを用いて評価することができる。
本発明の融合タンパク質とナノゲルの複合体の形成は、融合タンパク質とナノゲルをバッファー中において混合し、4〜50℃、例えば、46℃で、30分〜48時間、例えば、1時間程度静置して、混合する。場合によっては、適当なアジュバントと共に本発明の融合タンパク質とナノゲルを混合してもよい。融合タンパク質とナノゲルの複合化に使用するバッファーは、特に、限定されず、融合タンパク質とナノゲルの種類により適宜調製することができ、あえて例示するならば、Tris-HCl緩衝液(50mM、pH7.6)などを挙げることができる。調製した融合タンパク質-ナノゲル複合体は、公知の方法によりその物理化学的性状を解析することが可能である。例えば、蛍光共鳴エネルギー移動(FRET; fluorescence response energy transfer)、動的光散乱法(DLS; dynamic light scattering)、および、ゼータ電位の測定などにより、解析が可能である。
1−1.動物
1−1−1.DIOマウスおよびob/obマウス
オスのC57BL/6JJclマウスは日本クレア株式会社から入手し、オスのC57BL/6JHamSlc-ob/obマウスは、日本エスエルシー株式会社から入手した。全てのマウスは、東京大学医科学研究所動物実験委員会が規定するガイドラインに従い、12時間-12時間の明暗周期で、不断給餌および不断給水の条件で飼育した。標準固形飼料(CA-1; 日本クレア)と高脂肪飼料(D12451; Research Diets Inc)は、各々、3.47 kcal/g(13.0% kcal(脂質由来)、31.2% kcal(タンパク質由来)および55.8% kcal(窒素不含エクストラクト由来))および4.73 kcal/g(45% kcal(脂質由来)、20% kcal(タンパク質由来)および35% kcal(炭水化物由来))であった。DIOマウスは8週齢になるまで標準食を与え、最終免疫後から高脂肪食を与えた。他方、ob/obマウスには、実験期間中ずっと標準固形飼料を与えた。
オスのC57BL/6JJclマウスは日本クレア株式会社から入手した。全てのマウスは、東京大学医科学研究所動物実験委員会が規定するガイドラインに従い、12時間-12時間の明暗周期で、不断給餌および不断給水の条件で飼育した。マウスには標準固形飼料(CA-1; 日本クレア)を与えた。
グレリン-PspA(本発明の融合タンパク質)(図1)は、C末端側にマウスの全長UAG(マウスプレプログレリン;アミノ酸24〜51)(GenBank アクセッション番号;AB035701)(配列番号2)の3個の繰り返し、N末端側のPspA/Rx1(pUAB055;アミノ酸1〜302)(PspA family 1, clade2)(GenBank アクセッション番号;M74122)が配置されている。個々のUAG配列は、フレキシブルな(GGGGS)4リンカーによって連結されている。グレリン-PspAをコードする遺伝子はタカラバイオ株式会社に合成を委託した。合成された遺伝子をNco IおよびXho I(タカラバイオ)で切断したのち、C末端にHis-tagを有するpET-20b(+)ベクター(Novagen)に挿入した。添付の説明書に従って、Rosetta2(DE)pLysSコンピテント細胞(Novagen)をグレリン-PspA遺伝子を挿入したベクターで形質転換した。得られた形質転換体を100μg/ml アンピシリンおよび34μg/ml クロラムフェニコールを含むLB培地に植菌し、37℃で、OD600が0.5-0.8に達するまでインキュベートした。0.4 mM イソプロピルβ-D-1-チオガラクトピラノシド(和光純薬工業)で誘導をかけたのち、3.5時間インキュベートし、細胞を5,000rpm、4℃、15分間遠心して回収し、40 mM イミダゾールとプロテアーゼインヒビター(cOmplete; Roshe Diagnostics)を含む培養容量の0.025容量のリン酸バッファーに懸濁した。目的のタンパク質は、硫安で塩析後、透析したのち、ニッケルアフィニティーカラム(GEヘルスケアジャパン)にチャージし、その後、Sephadex G-100(GEヘルスケアジャパン)に通して精製を行った。
1−3−1.DIOマウスおよびob/obマウス
抗原特異的な免疫応答反応を増強するために、10μgのサイクリックdi-GMP(ヤマサ醤油)を5μgのグレリン-PspAに加えた。次に、すでに報告された方法に従って、cCHPナノゲルを調製し(Nochiら, Nat Mater 9, 572-578 (2010):Ayameら, Bioconjug Chem 19, 882-890 (2008))、グレリン-PspAとサイクリックdi-GMPを、カチオン性ナノ粒子であるcCHPナノゲル中に封入するために、3:1(ナノゲル:グレリン-PspA)の分子比となるように混合し、1時間、46℃でインキュベートした。
(1)経鼻免疫
マウスに対し、cCHPに封入した5μgのグレリン-PspAと10μgのサイクリックdi-GMPから構成されるグレリン-PspAワクチンを、隔週で5回(4、5、6、7および8週齢のDIOマウス、および26、27、28、29および30週齢のob/obマウスに対して投与)、マイクロピペットで鼻孔に液滴(マウス1個体あたり7.99μl投与)を垂らして経鼻免疫した。
(2)皮下注射による免疫
抗原特異的な免疫応答を増強するために、グレリン-PspA 10μgをPBSにて100μlにメスアップし、さらにAlum(ImjectTM Alum Adjuvant, Thermo Scientific)100μl、AddaVaxTM(vac-adx-2、Invivogen)100 μl、poly IC(協和発酵バイオ株式会社から分与)50μg、サイクリック di-GMP 200μgのいずれかを加え、total 200μlとした。
C57BL/6Jの雄マウスに、グレリン-PspA 10μgと各アジュバントから構成されるワクチン溶液を、2週間毎に3回(4, 6, 8週齢)、23ゲージ注射針を用いて背部に皮下注射した。
抗原特異的な免疫応答反応を増強するために、10μgのサイクリックdi-GMP(ヤマサ醤油)を5μgのグレリン-PspAに加えた。次に、すでに報告された方法に従って、cCHPナノゲルを調製し(Nochiら, Nat Mater 9, 572-578 (2010):Ayameら, Bioconjug Chem 19, 882-890 (2008))、グレリン-PspAとサイクリックdi-GMPを、カチオン性ナノ粒子であるcCHPナノゲル中に封入するために、3:1(ナノゲル:グレリン-PspA)の分子比となるように混合し、1時間、46℃でインキュベートした。
マウスに対し、cCHPに封入した5μgのグレリン-PspAと10μgのサイクリックdi-GMPから構成されるグレリン-PspAワクチンを、隔週で5回(4、5、6、7および8週齢)、マイクロピペットで鼻孔に液滴(マウス1個体あたり7.99μl投与)を垂らして経鼻免疫した。
1−4−1.DIOマウスおよびob/obマウス
血清および鼻洗浄液中の抗体価は、ELISA法により測定した。
96マイクロウェルプレート(Immulon 1 B; Thermo Fisher Scientific)の各ウェルをBSAを結合させたAGまたはUAG、あるいは、PspA、0.1μgで、4℃、一晩コートした。抗原をコートしたプレートは、1% BSAを含むブロッキングバッファー(PBST;Tween20を含むPBS)で、1時間インキュベートした。血液サンプルは、キャピラリーチューブを眼窩後洞に挿入して回収し、血液を遠心(3,000rpm 20min)して血清を調製した。鼻洗浄液は200μlのPBSで鼻腔を洗い流すことで回収した。血清と鼻洗浄液は、ブロッキングバッファーで希釈(2倍段階希釈)し、AG-BSA、UAS-BSAまたはPspAでコートしたウェルに添加し、25℃、2時間インキュベートした。プレートをPBSTで洗浄した後、希釈したHRP結合ヤギ抗マウスIgG, IgA, IgEおよびIgM(SouthernBiotech)(1:2000 [IgE], 1:4000 [IgA, IgM], 1:5000 [IgG])を各ウェルに添加して25℃、1.5時間インキュベートした。
インキュベート後、反応産物をTMB Microwell peroxidase substrate system(Kirkegaard & Perry Laboratories)用いて発色させ、450nm波長の吸光度を測定した。エンドポイントタイターは、ネガティブコントロールよりも0.1 units高いOD450を示す最終希釈率のReciprocal log2として表した。
血清および鼻腔洗浄液中の抗体価は、ELISA法により測定した。
血清抗体価の測定において、96マイクロウェルプレート(Immulon 1 B; Thermo Fisher Scientific)の各ウェルをBSAを結合させたアシル化グレリン(AG)0.1μgで、4℃、一晩コートした。抗原をコートしたプレートは、1% BSAを含むブロッキングバッファー(PBST;Tween20を含むPBS)で、1時間インキュベートした。血液サンプルは、4〜11週齢時に1週ごとにキャピラリーチューブを眼窩後洞に挿入して回収し、血液を遠心(3,000rpm 20min)して血清を調製した。血清は、ブロッキングバッファーで希釈(2倍段階希釈)し、AG-BSAでコートしたウェルに添加し、25℃、2時間インキュベートした。プレートをPBSTで洗浄した後、希釈したHRP結合ヤギ抗マウスIgG(SouthernBiotech)(1:5000)を各ウェルに添加して25℃、1.5時間インキュベートした。インキュベート後、反応産物をTMB Microwell peroxidase substrate system(Kirkegaard & Perry Laboratories)用いて発色させ、450nm波長の吸光度を測定した。エンドポイントタイターは、ネガティブコントロールよりも0.1 units高いOD450を示す最終希釈率のReciprocal log2として表した。
1−5−1.DIOマウス
マウスの体重は、精密はかり(GX-6000;株式会社エー・アンド・デイ)を用いて、0.1gの精度で毎週測定した。各マウスの1日あたりの摂食量は、最終のワクチン接種から2〜3週間後に、連続2日間測定し、それら測定値の平均値を摂食量とした。また、最終免疫から4〜5週間に、各マウスの直腸の温度をデジタル体温計(BDT-100、バイオリサーチセンター)で測定した。
マウスの体重は、精密はかり(GX-6000;株式会社エー・アンド・デイ)を用いて、0.1gの精度で毎週測定した。
エネルギー消費量は、VO2を測定する間接的な熱量測定により算定した。各マウス(最終のワクチン接種から4週間後)(n = 9/グループ)は、個別にメタボリックチャンバーに入れ、マススペクトロメトリ(ARCO-2000;アルコシステム)でO2濃度を測定した。空気サンプルは、各チャンバーからポンプで引き出し、コットンカラムで乾燥させた。呼気はガス分析器に入れ、72時間、90秒毎分析した。VO2は、以下の式により算出した(Ishiharaら, J Nutr 130, 2990-2995 (2000):Nicholsonら, Physiol Meas 17, 43-55 (1996))。
VO2 = [(FEN2/FIN2)・FIO2−FEO2]・VT・10
(式中、FEN2およびFEO2は、各々、呼気中のN2およびO2濃度である。FIN2およびFIO2は、各々、吸気中のN2およびO2濃度である。VTは標準状態(STPD; standard temperature pressure dry)に対して補正した、チャンバーを通過したエアフローである)。
内臓脂肪を定量するためのCTイメージを取得するために、DIOマウス(最終のワクチン接種から5週間後)(n = 9/グループ)は、1% イソフルレンの入ったチャンバー内で麻酔をし、イソフルレンを吸入しながら試験台上に仰向けに固定した。CTスキャンは、実験動物用3DマイクロX線CT(R_mCT2; Rigaku)(電圧、100 kV;電流、160μA)を使用し、第4腰椎レベルで行った。CTAtlas Metabolic Analysis Ver. 2.03ソフトウェアを用いてCTイメージを解析し、内臓脂肪の定量を行った。また、腸間膜脂肪、精巣上体脂肪および腎臓周囲脂肪の総量を、内臓脂肪として解剖時に採取して測定した(最終のワクチン接種から5週間後)。摘出した腎臓周囲脂肪は、ヘマトキシリン・エオジン染色(HE)により染色し、その脂肪細胞のサイズを、各マウス(n = 9/グループ)、100倍の対物レンズを使用して連続する5視野をランダムに選択し、Adove Photoshop CS4 (Adobe Systems)を用いて測定した。
WAT(腎臓周囲脂肪)、胃および脳の組織サンプルは、4% パラホルムアルデヒドで固定し、パラフィンブロックに包埋した。脳組織に関しては、冠状面で視床下部の連続切片を作製した。胃は垂直断面にスライスした。全ての切片は、HEで染色した。脳と胃の切片は各組織内に炎症性細胞が浸潤していないかどうかを評価するための観察を行った。
1−9−1.DIOマウスの各組織におけるUCPおよびPPARのmRNAレベルの測定
総RNAは最終のワクチン接種(n = 9/グループ)から5週間後に、マウスのBAT(肩甲骨周囲脂肪)、WAT(腎臓周囲脂肪)および骨格筋(大腿四頭筋)の凍結組織から、TRIzol試薬(Life technologies)を用いて単離した。定量RT-PCRを行う前に、1μgの単離RNAをPrimeScript RT Master Mix(タカラバイオ)で逆転写した。合成したcDNAの定量的PCRは、SYBR Green Master Mix(Life technologies)を使用して、StepOnePlus System (Life technologies)を用いて行った。
PCRの増幅条件は、95℃、20秒反応後、95℃、3秒;60℃、30秒を40サイクルとした。PCR反応後、PCR産物の定量を行うために融解曲線分析を行った。プライマー配列については、表1を参照のこと。
総RNAは最終のワクチン接種(n = 6/グループ)から4週間後に、マウスの胃の凍結組織から、TRIzol試薬(Life technologies)を用いて単離した。定量RT-PCRを行う前に、1μgの単離RNAをPrimeScript RT Master Mix(タカラバイオ)で逆転写した。合成したcDNAの定量的PCRは、SYBR Green Master Mix(Life technologies)を使用して、StepOnePlus System (Life technologies)を用いて行った。
PCRの増幅条件は、95℃、20秒反応後、95℃、3秒;60℃、30秒を40サイクルとした。PCR反応後、PCR産物の定量を行うために融解曲線分析を行った。プライマー配列については、表2を参照のこと。
OGTT(Oral glucose tolerance test、経口グルコース負荷試験)(Andrikopoulosら, Am J Physiol Endocrinol Metab 295, E1323-1332 (2008))とIPITT(Intraperitoneal insulin tolerance test、腹腔内インスリン負荷試験)(Boweら, J Endocrinol 222, G13-25 (2014))を最終のワクチン接種から4週間後に行った(n = 9/グループ)。OGTTについては、マウスを6時間絶食させ、1kgの体重あたり2gのグルコースを投与した。血液サンプルは、グルコース投与後、0, 15, 30, 60, 90および120分後に尾の血管から採血した。グルコースレベルは、自動グルコースメーター(Glutest-Ace R ;三和化学研究所)を使用してグルコースオキシダーゼ法により決定した。IPITTについては、自由に飲水できる状況で、マウスを6時間絶食させ、1kgの体重あたり0.75 IUのインスリンを腹腔内注射した。血中グルコース濃度は、インスリン投与後、0, 15, 30, 45, 60および90分後に測定した。空腹時血清のLDL, FFAおよびTGは最終のワクチン接種から5週間後に比色分析法(和光純薬工業)により測定した(n = 9/グループ)。
血漿中のAG、UAG、レプチン、アディポネクチンおよび成長ホルモンについては、血漿サンプルを、最終のワクチン接種から5週間後に、16時間絶食させたコントロールDIOマウスおよびグレリン-PspAにて免疫したDIOマウスから採取した。AG測定用の血液サンプルには、プロテアーゼによるAGの消化を防ぐために、採取後すぐにp-ヒドロキシメルクリ安息香酸(最終サンプル中1mM)を加えた。グレリンの血漿濃度は、二重抗体サンドイッチ技術(SPI-BIO)に基づく酵素免疫測定法により測定した。他のホルモンはELISAキット(EMD Millipore)により評価した。
AGの半減期を測定するために、AGペプチドを合成し(Eurofins Genomics, Tokyo, Japan)、キレート剤のジエチレントリアミン5酢酸(DTPA)(同仁化学研究所)を用いてインジウム-111(111In)(日本メジフィジックス)で標識した。111In標識については、1 mgのAGを7.4Mbqの111Inで標識し、標識産物をPD-10カラム(GEヘルスケアジャパン)に通して標識されなかったフリーの111Inを除去した。次に、111In-グレリンをPBSで希釈した(100μl中、50μgの AGを含み、放射活性は5,000,000 cpm)。免疫したオスのC57BL/6JJclマウス、あるいは、免疫していないC57BL/6JJclマウスに100μlの111In-グレリンを投与した(n = 3/グループ)。111In-グレリン投与から1分、5分、10分、15分、30分、1時間、2時間および4時間後に、各マウスから採取した血清10μlあたりの放射活性をWIZARD Automatic Gamma Counters(PerkinElmer)で測定した。111In-グレリンのt1/2の算出については、ガンマーカウント数を片対数グラフ上にプロットし、直線の傾きを求めた。分布相(t1/2α)と排出相(t1/2β)の両方の半減期を算出した。
IgGに結合したAGをサンドイッチEIAで測定可能であることを確認するために、絶食させた免疫マウスの血漿を、Sephacryl S100(GEヘルスケアジャパン)(1.0 cm × 50 cm)ゲル濾過カラムにより分子サイズに従って分離した。AGを含むピーク画分は抗マウスIgG抗体(1:5000, Jackson ImmunoResearch Laboratories)を用い、ウエスタンブロッティングにより評価した。
マウスGHSR(GenBank登録番号 AAI37883)のDNA配列はタカラバイオ株式会社.に合成を委託した。合成したDNAは、ネオマイシン耐性遺伝子を保持するpcDNA3.1(+)ベクター(Thermo Fisher Scientific)をBamHIとXhoIで切断後、切断位置に挿入した。作製した発現ベクターは、Lipofectamine 3000 Transfection Reagent(Thermo Fisher Scientific)を使用してチャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞に形質導入した。安定形質導入株を選択するために、形質導入株を250μg/mlネオマイシン(Geneticin)(ナカライテスク)存在下でインキュベートした。安定形質導入株は遺伝子特異的なプライマーによるPCR(GHSR forward / BGH reverse)によって確認した。プライマー配列については表1を参照のこと。
値は、平均値±SEMで示した。統計的比較は、分散分析(ANOVA)で行い、2グループ間の対応のない両側スチューデントtテストを行った。P <0.01 およびP <0.05の場合に統計的に有意とした。
2−1.グレリン-PspAワクチンの開発およびその免疫応答
マウスの全長AG(配列番号2)の3回繰り返し配列とPspA/Rx1からなる新規のワクチン抗原、グレリン-PspAを設計した(図1)。グレリン-PspAを挿入した発現ベクターを大腸菌コンピテント細胞に導入し、細胞から精製したタンパク質は、ウエスタンブロッティングによりグレリン-PspAと同定した。
2−1−1.DIOマウス
グレリン-PspAワクチンの免疫原性を確認するために、cCHPナノゲルに封入した5μgのグレリン-PspAと10μgのサイクリックdi-GMPアジュバントでC57BL/6Jマウスを経鼻免疫した。5回のワクチン接種によって、AGおよびUAGの両方に対する血清IgGが誘導された(図2A)。血清IgGの他、IgM、IgAおよびIgEなどの他の免疫グロブリンアイソタイプはほとんど誘導されなかった(図2B)。抗AG血清IgG抗体の抗体価は、急速に上昇し、最終の免疫から1週間後にピークに達した(9週齢)。その後、数ヶ月にわたり、抗体価は徐々に低下したが、1年以上は維持された(図2C)。
また、アジュバントとして、Alum 100μl、AddaVaxTM 100 μl、poly IC 50 μg、サイクリック di-GMP 200 μgを用いて皮下注射による免疫を行った。2週間毎に3回(4, 6, 8週齢)、背部に皮下注射し、10週齢(ワクチン最終接種から2週後)時に、血清を採取し、抗体価(血清抗AG-IgG抗体)を測定した(n = 6/グループ)。その結果、各アジュバントを用いてグレリン-PspAを皮下注射したところ、いずれのアジュバントにおいても抗体価が確認された(図3)。
cCHPナノゲルに封入した5μgのグレリン-PspAと10μgのサイクリックdi-GMPアジュバントでC57BL/6Jマウスを、隔週で5回(4、5、6、7および8週齢)経鼻免疫した。13週齢時に鼻腔洗浄液の抗体価を測定したところ、総IgAが増加しており、その中には、グレリン特異的な抗体も含まれていた(図11)。
血清IgGについては、4〜11週齢時に1週ごとに抗体価を測定したところ、3回目の免疫後に抗AG抗体価が上昇し、5回目投与直後にピークを迎えた。その後、抗AG血清IgG抗体価は緩やかに低下し始めた(図12)。
2−2−1.DIOマウスおよびob/obマウス
体重減の増加に対するグレリン-PspAの効果を評価するために、2タイプの肥満モデル:DIOマウスおよび/またはレプチン欠損マウス(ob/ob)を使用した。
(1)経鼻免疫の場合
DIOマウスについては、肥満を誘導する前に、グレリン-PspAを5回経鼻免疫した。最終免疫を行った後、45 kcal %高脂肪食を与え始めた結果、急速に体重が増加した(図4A)。
グレリン-PspAを経鼻投与すると、DIOマウスの急速な体重増加が抑制された(図4A)。また、グレリン-PspA投与による体重増加の有意な低下は、ワクチン接種後8週間維持された(コントロール(未処置)、34.8±0.7 g:ワクチン(グレリン-PspA投与)、32.6±0.7 g;最終免疫から8週間後の測定結果、n = 12/グループ、p < 0.05)。なお、サイクリックdi-GMPアジュバントのみを封入したcCHPナノゲルの経鼻投与では体重増加を低下させることはなかった(コントロール、28.6±0.5 g:ビークル(アジュバント)、28.0±0.6 g;5回の免疫から4週間後の測定結果、n = 12/グループ、p = 0.43)。
ob/obマウスにおいてもグレリン-PspAのワクチン接種により、体重増加が低下した(図4B)。ワクチン接種前と最終のワクチン接種から1週間後のob/obマウスの体重変化は、コントロールのob/obマウスと比較して、有意に小さかった(コントロール、4.7±0.3 g:ワクチン、-0.9±0.6 g、n = 10/グループ、p < 0.01)(図4B)。
皮下注射終了後(8週齢)、標準固形飼料から高脂肪飼料に変更した。体重の推移を計測して、コントロールマウス(無処置、8週齢から高脂肪飼料)と比較した。また、12週齢(ワクチン最終接種から4週後)時に、血清を採取し、抗体価(血清抗AG-IgG抗体)を測定し、抗体価を確認した(reciprocal log2 titer 12.45±0.34, n = 11)。
また、体重に対する影響については、グレリン-PspA皮下注射により、非肥満時(肥満誘導前)での体重増加抑制が確認された(8週齢、コントロール 24.4±0.3 g、ワクチン 22.6±0.3 g、n = 11-12/グループ、p<0.01)(図5)。同様に高脂肪飼料開始後の体重増加も有意に抑制された(12週齢、コントロール 30.6±0.8 g、ワクチン 27.3±0.4 g、n = 11-12/グループ、p<0.01)(図5)。
グレリン-PspAでC57BL/6Jマウスを、隔週で5回(4、5、6、7および8週齢)経鼻免疫した。非肥満マウスにおいても、グレリン-PspAワクチン投与により体重増加が有意に抑制された(図13)。
体重の他、脂肪の量についてもコンピュータ断層撮影(CT)画像による評価と解剖による直接的な測定を行った。CTイメージによる脂肪の定量により、ワクチン接種したDIOマウスの総脂肪量は、コントロールのDIOマウスよりも有意に少ないことがわかった(図7A)。内臓脂肪と皮下脂肪は同様に減少していた(図7A)。解剖によって直接回収して測定した内臓脂肪の量はCTによる解析結果と一致していた(コントロール、2.44±0.10 g:ワクチン、1.53±0.08 g、n = 18/グループ、p < 0.01)。内臓の総脂肪量のみならず各内臓脂肪細胞のサイズも免疫したマウスにおいては減少していた(コントロール、8.74±0.40 μm:ワクチン、6.11±0.17 μm、n = 9/グループ、p < 0.01)(図7B)。
これまでのデータから、グレリン-PspAで免疫することで、エネルギー消費の上昇による体重、特に、脂肪量の減少が誘導されることが示唆された。免疫したDIOマウスにおけるエネルギー消費の分子的な制御について調べるため、ミトコンドリアのUCP(uncoupling protein)とその上流のシグナルであるペルオキシソーム増殖剤活性化受容体(PPARs)の発現をRT-PCRにより定量した(図6A〜I)。
非ふるえ熱産生(nonshivering thermogenesis)を担う褐色脂肪組織(BAT)におけるUCP1 mRNAは、免疫マウスにおいて、コントロールマウスよりも有意に上方制御されていた(図8A)。BATにおけるUCP1の上方制御因子の1つであるPPARγも免疫マウスにおいて増加していた(図8D)。白色脂肪組織(WAT)においては、UCP2とPPARγの発現が上方制御されていたが、筋肉におけるUCP3、PPARαおよびPPARδは免疫マウスとコントロールマウスとの間で差異はなかった(図8G〜I)。
グレリン以外に、レプチンやアディポネクチンもエネルギー恒常性を調節する重要なホルモンである。免疫DIOマウスの血漿中のレプチンとアディポネクチンのレベルは、コントロールDIOマウスと同程度であった(レプチン;コントロール、2.71±0.79 ng/ml:ワクチン、1.86±0.53 ng/ml、p = 0.283)(アディポネクチン;コントロール、1779±221 ng/ml:ワクチン、2944±902 ng/ml、p = 0.227)(n = 9/グループ)。他方、グレリンは、成長ホルモン分泌促進因子レセプターの内在性リガンドであるため、成長ホルモンは、グレリン-GHSRシグナルの修飾によって直接変動されるように思われたが、成長ホルモンもコントロールと免疫DIOマウスで有意な差は認められなかった(コントロール、5.40±1.47 ng/ml:ワクチン、9.51±4.16 ng/ml、n = 9/group, p = 0.499)。
グレリン-PspAの免疫によって誘導されるIgG抗体がAG-GHSR結合を直接阻害するかどうかを確認するために、レセプター結合アッセイを行った。GHSRを発現するチャイニーズハムスター卵巣細胞(CHO細胞)を調製するため、GHSRのDNA配列を合成し、PcDNA3.1(+)ベクターにサブクローニングし、得られたベクターをCHO細胞にトランスフェクトした。コントロールまたは免疫マウスから得た血清IgGと共にAGを投与し、あるいは、単独でAGを投与した前後において、蛍光指示薬を用いて細胞内カルシウム濃度([iCa2+])の変化を測定した。GHSR発現CHO細胞中において、IgG無しでAGを単独投与すると、[iCa2+]を増加させた(図10AおよびB)。コントロールマウスから得た血清IgGは、この[iCa2+]の増加を抑制しなかったが、免疫したマウス由来のIgGは[iCa2+]の増加を阻害した(図10AおよびB)。これらの結果から、AG特異的なIgG抗体がAG-GHSRシグナルを直接阻害していることが示唆された。
ワクチンを投与すると、血中グレリン濃度の上昇が見られるが、このグレリン濃度の上昇と内因性グレリンとの関連性について検討を行った。非肥満マウスに対し、グレリン-PspAを、隔週で5回(4、5、6、7および8週齢)経鼻免疫した。その後、10週齢時に胃を採取し、内因性グレリンが増加・活性化されているか否かをグレリンおよびGHSRのmRNAレベルで評価した。mRNAレベルはRT-PCR法で測定した。
胃はグレリンまたはその受容体であるGHSRの高発現臓器である。ワクチン投与後、胃において、グレリンおよびGHSRいずれのmRNAレベルも変化が見られなかった(図14)。この結果から、ワクチン投与後の血中グレリン濃度の上昇が、内因性グレリンの活性化によるものではないことが示唆された。
Claims (15)
- 担体タンパク質と、1または複数個のグレリンポリペプチドの全長を融合させた融合タンパク質を含むワクチン製剤。
- 2〜4個のグレリンポリペプチドが融合されていることを特徴とする請求項1に記載のワクチン製剤。
- 3個のグレリンポリペプチドが融合されていることを特徴とする請求項1または2に記載のワクチン製剤。
- 担体タンパク質がN末端側に存在していることを特徴とする請求項1ないし3のいずれかに記載のワクチン製剤。
- グレリンポリペプチド同士、およびグレリンポリペプチドと担体タンパク質がリンカーペプチドで連結されていることを特徴とする請求項1ないし4のいずれかに記載のワクチン製剤。
- 担体タンパク質がPspAであることを特徴とする請求項1ないし5のいずれかに記載のワクチン製剤。
- 前記グレリンポリペプチドが以下の(a)または(b)のいずれかであることを特徴とする請求項1ないし6のいずれかに記載のワクチン製剤。
(a)配列番号1、配列番号2または配列番号3で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド
(b)配列番号1、配列番号2または配列番号3で表されるアミノ酸配列において、1または数個のアミノ酸が欠失、挿入、付加され、および/または、3番目のセリン以外のアミノ酸残基の1または数個のアミノ酸が置換されたアミノ酸配列からなり、かつ、3番目のセリンがオクタノイル化された場合にGHSRとの結合活性を有するポリペプチド - 前記融合タンパク質が配列番号6で表されるアミノ酸配列からなることを特徴とする請求項1ないし7のいずれかに記載のワクチン製剤。
- 前記融合タンパク質がcCHPナノゲルと複合体を形成していることを特徴とする請求項1ないし8のいずれかに記載の抗肥満ワクチン製剤。
- 担体タンパク質と、1または複数個のグレリンポリペプチドの全長を融合させた、融合タンパク質。
- 前記担体タンパク質がPspAであることを特徴とする請求項10に記載の融合タンパク質。
- 前記グレリンポリペプチドが以下の(a)または(b)のいずれかであることを特徴とする請求項10または11に記載の融合タンパク質。
(a)配列番号1、配列番号2または配列番号3で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド
(b)配列番号1、配列番号2または配列番号3で表されるアミノ酸配列において、1または数個のアミノ酸が欠失、挿入、付加され、および/または、3番目のセリン以外のアミノ酸残基の1または数個のアミノ酸が置換されたアミノ酸配列からなり、かつ、3番目のセリンがオクタノイル化された場合にGHSRとの結合活性を有するポリペプチド - 配列番号6で表されるアミノ酸配列からなる請求項10ないし12のいずれかに記載の融合タンパク質。
- 請求項10ないし13のいずれかに記載の融合タンパク質をコードする核酸。
- 配列番号5で表される核酸配列からなる請求項14に記載の核酸。
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