KR101849831B1

KR101849831B1 - M 세포 표적 펩타이드-항원 결합체 및 점막점착제를 포함하는 백신 조성물

Info

Publication number: KR101849831B1
Application number: KR1020150126327A
Authority: KR
Inventors: 최윤재; 조종수; 강상기; 비제이 싱
Original assignee: 서울대학교산학협력단
Priority date: 2014-09-05
Filing date: 2015-09-07
Publication date: 2018-04-19
Also published as: KR20160030056A

Abstract

본 발명은 M 세포 표적 펩타이드(M cell-homing peptide) 및 항원이 연결된, M 세포 표적 펩타이드-항원 결합체; 및 점막점착제를 포함하는 백신 조성물, 이의 제조방법, 상기 백신 조성물을 포함하는 사료 첨가용 조성물 및 상기 백신 조성물을 이용하여 적리를 예방 또는 치료하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 점막점착제로 코팅된 M 세포 표적 펩타이드-항원 결합체는 M 세포 표적 펩타이드와 점막점착제가 시너지 효과를 일으켜 면역 반응 유도에 현저한 효과를 가지므로 백신으로서 사용될 수 있으며, 구체적으로 상기 백신을 사용하여 적리를 예방 또는 치료할 수 있다.

Description

M 세포 표적 펩타이드-항원 결합체 및 점막점착제를 포함하는 백신 조성물{Vaccine composition comprising M cell homing peptide-antigen conjugate and mucoadhesive vehicle}

본 발명은 M 세포 표적 펩타이드(M cell-homing peptide) 및 항원이 연결된, M 세포 표적 펩타이드-항원 결합체; 및 점막점착제를 포함하는 백신 조성물, 이의 제조방법, 상기 백신 조성물을 포함하는 사료 첨가용 조성물 및 상기 백신 조성물을 이용하여 적리를 예방 또는 치료하는 방법에 관한 것이다.

점막은 수많은 미생물과 바이러스의 공통적인 감염 경로이다. 점막 조직에서 상피 M(microfold) 세포는 주로 소화관의 페이에르판(Peyer's patch)에서 follicle-associated epithelium(FAE)에 위치해 있다. 상기 상피 M 세포는 면역 반응을 유도하기 위해 외부 물질을 잡아서 아래에 있는 gut-associated lymphoid tissues(GALT)로 상피 장벽을 통과해 전달해주는 역할을 한다(Nature reviews. Immunology, 2006, 6, 148-158). 이와 유사한 원리로 백신을 사용하여 면역 반응을 유도할 수 있다. 그러나 비경구투여용 백신은 장내의 감염에 대해 정확한 점막 면역 반응을 유도할 수 없는 문제가 있다. 반면, 점막을 통한 백신 접종 방법 중 경구투여 방법은 취급이 용이하고, 환자의 수용력이 높으며, 점막 면역 반응이 유도되는 장점이 있어 주목받고 있다. 그러나, 경구투여 방법을 이용하고자 하는 경우에는 소화관에 항원을 전달하는 경우 존재하는 물리적, 화학적 그리고 생물학적 장벽으로 인해 백신의 개발이 어려운 단점이 있다. 불침투성인 소화관의 상피는 물리적인 장벽으로 작용하고, 위의 pH 및 소화관의 효소는 항원을 분해하여 생물학적 이용도를 낮춘다(International journal of pharmaceutics, 2013, 447, 75-93). 또한 M 세포에 의한 트랜스시토시스(transcytosis)를 통한 항원의 세포내 흡수 역시 장벽으로 작용한다. 상기의 장벽이 해결되면 항원은 M 세포를 통해 아래에 있는 림프 모낭(lymphoid follicles)으로 전달되어 항원 제시 세포와 만날 수 있다. 그러므로, 항원 특이적 점막 면역 반응은 항원의 흡수와 항원 제시 세포에 의한 제시에 달려있다.

현재 경구투여용 백신은 약화되거나 또는 불활성화된 미생물; 또는 바이러스를 이용하고 있다. 그러나, 이들을 이용한 경구투여용 백신은 상기 항원이 높은 수준으로 투여될지라도 면역원성 및 안정성에 문제가 있다. 특히, 약화된 백신은 다시 병원성을 회복할 가능성이 높아 논란이 되고 있다. 그러므로 잠재적인 안전 문제를 해결하기 위해, 서브유닛 또는 펩타이드에 기초한 백신이 주목받고 있다. 그러나, 재조합 DNA 기술에 의해 제조된 재조합 백신의 경우, 전통적인 백신보다 비교적 안전하더라도, 면역성이 낮고, 수차례 투여해야 하며, 효과적인 점막 보조제가 필요하다는 문제점 또한 가진다.

이러한 배경 하에서, 본 발명자들은 면역 반응을 유도하는 능력이 우수한 백신을 개발하기 위해 노력한 결과, M 세포 표적 펩타이드-항원 결합체; 및 점막점착제를 포함하는 백신을 개발하였고, 상기 백신은 M 세포 표적 펩타이드와 점막점착제가 시너지 효과를 일으켜 면역 반응을 유도하는 능력이 우수함을 확인하여 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 M 세포 표적 펩타이드(M cell-homing peptide) 및 항원이 연결된, M 세포 표적 펩타이드-항원 결합체; 및 점막점착제를 포함하는 경구투여용 백신 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 조성물을 포함하는 사료 첨가용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 (a) M 세포 표적 펩타이드(M cell-homing peptide) 및 항원이 연결된, M 세포 표적 펩타이드-항원 결합체를 제조하는 단계; 및 (b) 상기 결합체를 점막점착제로 코팅하는 단계를 포함하는 경구투여용 백신의 제조방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 백신 조성물을 개체에게 투여하는 단계를 포함하는 적리의 예방 또는 치료 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 하나의 양태는 M 세포 표적 펩타이드(M cell-homing peptide) 및 항원이 연결된, M 세포 표적 펩타이드-항원 결합체; 및 점막점착제를 포함하는 경구투여용 백신 조성물을 제공한다.

본 발명의 점막점착제로 코팅된 M 세포 표적 펩타이드-항원 결합체는 항원의 안정성이 유지되고, 산성 환경인 위장관보다 소장에서 항원을 지속적으로 방출하며, M 세포 표적 펩타이드와 점막점착제가 면역 반응 유도에 시너지 효과를 가지므로, 백신 조성물에 매우 유용하게 사용될 수 있다.

본 발명에서 용어 "M 세포(M cell)"는 점막에 위치하며, 점막에서 면역 세포로 항원을 전달하여 점막 면역반응을 유도할 수 있는 세포를 의미한다. 상기 M 세포는 기관지점막 연관 림프조직(bronchus-associated lymphoid tissue, BALT), Peyer's patch의 여포 연관 상피(follicle-associated epithelium) 또는 소화관 점막에서 발견될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에서 용어 "M 세포 표적 펩타이드(M cell-homing peptide)"는 상기 M 세포를 표적하는 펩타이드를 의미한다. 본 발명에서 상기 M 세포 표적 펩타이드는 M 세포를 표적할 수 있는 펩타이드라면 제한 없이 포함할 수 있으나, 구체적으로 M 세포 표적 펩타이드는 서열번호 1 내지 4로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열로 구성될 수 있다.

또한, 상기 M 세포 표적 펩타이드는 서열번호 1 내지 4의 아미노산 서열뿐만 아니라 상기 서열과 70% 이상, 구체적으로는 80% 이상, 더욱 구체적으로는 90% 이상, 보다 더욱 구체적으로는 95% 이상, 가장 구체적으로는 98% 이상의 유사성을 나타내는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 또한, 이러한 유사성을 갖는 서열로서 실질적으로 상기 M 세포 표적 펩타이드와 동일하거나 상응하는 생물학적 활성을 갖는 아미노산 서열이라면, 일부 서열이 결실, 변형, 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 갖는 펩타이드 변이체도 본 발명의 범위 내에 포함됨은 자명하다.

본 발명에서 용어 "항원"이란 물질이 체내에 침입한 경우, 면역응답을 특이적으로 유발할 수 있는 물질을 말한다. 상기 항원은 항체에 반응할 수 있는 물질이다. 구체적으로, 부라키스피라 하이오디센테리에 막 단백질 B(Brachyspira hyodysenteriae membrane protein B, BmpB)일 수 있으며, 더욱 구체적으로 서열번호 6의 아미노산 서열로 구성되는 BmpB일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 서열번호 6으로 기재한 아미노산 서열뿐만 아니라 상기 서열과 70% 이상, 구체적으로는 80% 이상, 더욱 구체적으로는 90% 이상, 보다 더욱 구체적으로는 95% 이상, 가장 구체적으로는 98% 이상의 유사성을 나타내는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 또한, 이러한 유사성을 갖는 서열로서 실질적으로 상기 BmpB와 동일하거나 상응하는 생물학적 활성을 갖는 아미노산 서열이라면, 일부 서열이 결실, 변형, 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 갖는 펩타이드 변이체도 본 발명의 범위 내에 포함됨은 자명하다.

본 발명에서 용어 "M 세포 표적 펩타이드-항원 결합체"는 M 세포 표적 펩타이드가 항원의 생물학적 활성을 저해시키지 않도록 항원에 연결된 형태를 의미한다. 상기 M 세포 표적 펩타이드-항원 결합체는 화학적으로 연결되거나, 두 종류 이상의 폴리펩타이드가 효소작용에 의하여 연결되거나, 또는 유전자의 조작을 통해 두 종류 이상의 상이한 폴리펩타이드가 하나의 폴리펩타이드로 발현된 형태로 연결될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 M 세포 표적 펩타이드-항원 결합체는 M 세포 표적 펩타이드와 항원이 직접 연결된 형태일 수도 있고, 링커(linker)에 의해 연결된 형태일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에서 용어, "링커(linker)"란 기본적으로는 두 개의 서로 다른 융합 파트너(예를 들어, 생물학적 고분자 등)를 수소결합, 정전기적 상호작용, 반데르발스력, 이황화 결합, 염 브릿지, 소수성 상호작용, 공유결합 등을 이용하여 연결할 수 있는 연결체를 의미한다. 바람직하게는 생리학적 조건 또는 다른 표준 펩타이드 조건(예를 들면, 펩타이드 정제 조건, 펩타이드 저장 조건)하에서 적어도 하나의 이황화 결합에 참여할 수 있는 적어도 하나의 시스테인을 가질 수 있으며, 단순히 각각의 융합 파트너를 연결하는 역할 이외에도, 융합 파트너 사이에 일정한 크기의 간격을 부여하는 역할을 수행하거나 또는 융합체에 유연성 또는 강직성을 제공하는 힌지(hinge)의 역할을 수행할 수도 있다. 상기 링커는 비펩타이드 링커 또는 펩타이드 링커일 수 있으며, 펩티드 결합, 이황화 결합 등에 의해서 직접 연결되는 것도 포함된다.

본 발명에서 용어, "비펩타이드 링커"는 반복 단위가 2개 이상 결합된 생체적합성 링커를 의미하며, 상기 반복 단위들은 펩타이드 결합이 아닌 임의의 공유결합을 통해 서로 연결된다.

본 발명에 사용가능한 비펩타이드 링커는 폴리에틸렌 글리콜(polyethylene glycol; PEG) 단독 중합체, 폴리프로필렌 글리콜 단독 중합체, 에틸렌 글리콜-프로필렌 글리콜 공중합체, 폴리옥시 에틸화 폴리올, 폴리비닐 알콜, 폴리사카라이드, 덱스트란, 폴리비닐 에틸 에테르, 생분해성 고분자, 지질 중합체, 키틴류, 히아루론산 또는 이들의 조합일 수 있다. 당해 분야에 이미 알려진 이들의 유도체 및 당해 분야의 기술 수준에서 용이하게 제조할 수 있는 유도체들도 본 발명의 범위에 포함된다. 한 예로, 양 말단에 양기능성 알데히드(bifunctional aldehyde) 형태를 가져 폴리펩타이드 아미노 말단의 아민그룹과 결합하여, M 세포 표적 펩타이드와 항원을 서로 연결시킬 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

또한, 상기 M 세포 표적 펩타이드와 항원의 결합 형태는 특별히 이에 제한되지 않으나, 항원의 N-말단에 M 세포 표적 펩타이드가 결합한 형태가 될 수 있고, 상기 항원의 C-말단에 M 세포 표적 펩타이드가 결합한 형태가 될 수도 있으며, 상기 항원의 N-말단과 C-말단에 M 세포 표적 펩타이드가 결합한 형태가 될 수도 있다. 예를 들어, BmpB의 N-말단에 M 세포 표적 펩타이드가 결합한 형태가 될 수 있고, BmpB의 C-말단에 M 세포 표적 펩타이드가 결합한 형태가 될 수 있으며, BmpB의 N-말단과 C-말단에 M 세포 표적 펩타이드가 결합한 형태가 될 수 있다. 그러나 상기 예에 제한되지 않는다.

본 발명의 일 실시예에서는, BmpB(서열번호 6)의 N-말단에 M 세포 표적 펩타이드(서열번호 1)의 C-말단이 결합한 형태의 M 세포 표적 펩타이드-항원 결합체(M-BmpB)를 제조하였고, BmpB의 RAW 264.7 세포로부터 TNF-α의 분비를 유도하는 능력 및 JAWSII 세포로부터 IL-6의 분비를 유도하는 능력과 비교하였을 때, 본 발명의 M-BmpB는 BmpB와 그 능력이 서로 같음을 확인하였다(도 3).

본 발명에서 용어 "점막점착제"는 점막에 달라붙게 하는 물질을 말한다. 본 발명에서 상기 점막점착제는 상기 M 세포 표적 펩타이드-항원 결합체를 코팅하는데 사용될 수 있다. 구체적으로 상기 점막점착제는 위장관의 효소 분해 및 산성 pH로부터 경구투여된 M 세포 표적 펩타이드-항원 결합체를 보호하기 위해 pH 감수성을 가진 폴리머일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

또한, 본 발명의 상기 점막점착제로 코팅된 M 세포 표적 펩타이드-항원 결합체는 M 세포 표적 펩타이드-항원 결합체보다 더 높은 면역 능력을 가지며, 점막점착제와 M 세포 표적 펩타이드는 면역반응을 유도하는 데에 시너지 효과를 가진다.

또한, 상기 점막점착제는 티올기를 포함할 수 있다. 티올기를 포함한 점막점착제로 코팅된 M 세포 표적 펩타이드-항원 결합체는 티올기가 없는 점막점착제로 코팅된 M 세포 표적 펩타이드-항원 결합체보다 항원의 담지 함량 및 담지 효율성; 산성 pH로부터 항원의 보호 능력; 및/또는 면역반응을 유도하는 능력이 더 우수하다. 또한, 티올기를 포함한 점막점착제와 M 세포 표적 펩타이드는 면역반응을 유도하는 데에 시너지 효과를 가진다.

구체적으로, 상기 점막점착제는 M 세포 표적 펩타이드-항원 결합체에 대해 보호능력 및 면역 반응 유도능을 상승시킬 수 있다면 당업계에 공지된 다양한 종류가 사용될 수 있으나, 그 예로 Eudragit 고분자일 수 있으며, 특히 Eudragit 고분자 중 Eudragit® L-100-55 또는 Eudragit® S-100일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 티올기를 포함한 점막점착제는 Eudragit 고분자; 또는 Eudragit® L-100-55 또는 Eudragit® S-100에 티올기가 결합된 형태일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 Eudragit 고분자는 이의 유도체 형태 역시 포함한다.

본 발명의 일 실시예에서는 Eudragit® L-100으로 L-시스테인 하이드로클로라이드를 사용하여 티올기가 결합된 Eudragit(TE)을 제조하였다(도 2).

또한, 본 발명의 일 실시예에서는 점막점착제로서 Eudragit 또는 티올기가 결합된 Eudragit(TE)를 사용하고, 항원으로서 M-BmpB 또는 BmpB를 사용하여, 상기 항원이 담지된 미세입자(M-BmpB-TEMPs, BmpB-TEMPs, M-BmpB-EMPs, BmpB-EMPs)를 제조하였다(도 4). 그 결과, 미세입자는 부드러운 표면을 가진 구형 모형이었고, 입자의 크기는 약 1-10 ㎛이었다(A: M-BmpB-TEMPs, B: BmpB-TEMPs, C: M-BmpB-EMPs, D: BmpB-EMPs). 대식세포 및 M 세포와 같은 식세포는 1-5 ㎛의 직경의 미세입자를 잘 포획할 수 있으므로, 본 발명의 미세입자는 식세포에 잘 포획될 수 있음을 알 수 있었다.

또한, 본 발명의 일 실시예에서는 상기 항원이 담지된 미세입자의 담지 함량 및 담지 효율성을 분석한 결과, 티올기가 결합된 점막점착제를 사용하여 제조된 미세입자는 항원의 담지 함량 및 담지 효율성이 증가하여 더 우수한 백신이 될수 있음을 알 수 있었다(표 1).

또한, 본 발명의 일 실시예에서는 항원이 담지된 미세입자의 항원 방출을 인공 위액(pH 2.0) 및 인공 소장액(pH 7.2)에서 측정한 결과, 시간에 따라 TEMPs 및 EMPs에서 방출되는 항원의 누적량이 증가하였고, Eudragit 폴리머의 pH 감수성 때문에 pH 2.0 보다 pH 7.2에서 항원의 누적 방출률이 더 높았다. 그러나 TEMPs가 EMPs보다 산성 pH에 대한 항원 보호 능력이 더 우수하였다. 이를 통해, 본 발명의 항원이 담지된 미세입자는 산성 환경인 위장관보다 소장에서 항원이 지속적으로 방출됨을 알 수 있었고, 이는 본 발명의 미세입자가 경구용 백신으로서의 능력이 우수함을 시사한다.

또한, 본 발명의 일 실시예에서는 항원이 담지된 미세입자의 소장에 대한 점막점착성을 회장고리 분석법(ileal loop assay)을 통해 분석한 결과, 소장에 부착된 TEMPs의 수가 EMPs의 수보다 더 많았다(도 7).

또한, 본 발명의 일 실시예에서는 생후 6주된 암컷 BALB/c 생쥐에게 백신(점막점착성을 가지거나 또는 가지지 않은 BmpB(BmpB-TEMPs 또는 BmpB-EMPs); 또는 점막점착성을 가지거나 또는 가지지 않은 M-BmpB(M-BmpB-TEMPs 또는 M-BmpB-EMPs))을 투여하여 면역 반응을 분석한 결과, M-BmpB-EMPs는 BmpB-EMPs보다 더 높은 sIgA, IgG, IgG1 및 IgG2a 역가를 보였다(도 9a, 9b, 9c 및 9d). 상기 실시예 3에서 항원의 면역능력을 측정한 결과 M 세포 표적 펩타이드의 유무는 항원의 면역능력에 크게 영향을 주지 않음을 알 수 있었는데, 점막점착제로 코팅한 미세입자의 경우 M 세포 표적 펩타이드의 유무에 따라 sIgA, IgG, IgG1 및 IgG2a 역가가 차이가 남을 확인하였다. 이를 통해 M 세포 표적 펩타이드를 포함한 미세입자가 M 세포 표적 펩타이드가 없는 미세입자보다 더 높은 sIgA, IgG, IgG1 및 IgG2a 역가를 보인바, M 세포 표적 펩타이드와 점막점착제가 시너지 효과를 일으켜 면역능력이 더 증가하였음을 알 수 있었다.

즉, 본 발명의 점막점착제로 코팅된, M 세포 표적 펩타이드-항원 결합체는 백신으로서 면역 반응 유도에 현저한 효과를 가진다는 것을 시사한다.

또한, M-BmpB-TEMPs는 가장 높은 sIgA, IgG, IgG1 및 IgG2a 역가를 보이며, M-BmpB-EMPs보다 더 높은 sIgA, IgG, IgG1 및 IgG2a 역가를 보였다(도 9a, 9b, 9c 및 9d). 이를 통해, M 세포 표적 펩타이드는 티올기가 없는 점막점착제보다 티올기를 포함한 점막점착제와 더 큰 시너지 효과를 일으킴을 알 수 있었다.

즉, 본 발명의 티올기를 포함한 점막점착제로 코팅된, M 세포 표적 펩타이드-항원 결합체는 백신으로서 면역 반응 유도에 현저한 효과를 가진다는 것을 시사하였다.

본 발명에서 용어 "백신"은 생체에 면역을 주는 항원을 함유한 생물학적인 제제로서, 감염증의 예방을 위하여 사람이나 동물에 투여함으로써 생체에 면역이 생기게 하는 면역원 또는 항원성 물질을 말한다.

본 발명에 따른 백신 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체를 추가로 포함할 수 있으며, 상기 약제학적으로 허용되는 담체는 경구 투여시에는 결합제, 활택제, 붕해제, 부형제, 가용화제, 분산제, 안정화제, 현탁화제, 색소 및 향료 등을 사용할 수 있으며, 완충제, 보존제, 무통화제, 가용화제, 등장화제 및 안정화제 등을 혼합하여 사용할 수 있다. 분사제의 경우에는 적합한 분사제, 예컨대 , 압축공기, 질소, 이산화탄소, 또는 탄화수소 기반 낮은 끓는점 용매 등을 사용하여 가압팩 또는 분무기로부터 에어로졸 스프레이 제시체의 형태로 편리하게 전달될 수 있다.

또한, 본 발명의 백신 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 상술한 바와 같은 약제학적으로 허용되는 담체와 혼합하여 다양하게 제조될 수 있다. 예를 들어, 경구 투여시에는 정제, 트로키, 캡슐, 엘릴시르, 서스펜션, 시럽, 웨이퍼 등의 형태로 제조할 수 있다.

본 발명의 용어 "투여"란, 어떠한 적절한 방법으로 개체에게 소정의 물질을 도입하는 것을 말한다. 본 발명의 백신 조성물은 경구, 비강, 직장, 경피 또는 에어로졸을 통한 흡입 경로로 투여될 수도 있으며, 볼루스로 투여하거나 또는 서서히 주입할 수도 있으나, 바람직하게는 경구투여 또는 에어로졸로 투여될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 백신 조성물은 약제학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명의 용어 "약제학적으로 유효한 양"이란, 백신효과를 나타낼 수 있을 정도의 충분한 양과 부작용이나 심각한 또는 과도한 면역반응을 일으키지 않을 정도의 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 치료될 장애, 장애의 중증도, 특정 화합물의 활성, 투여 경로, M 세포 표적 펩타이드-항원 결합체; 및 점막점착제를 포함하는 미세입자의 제거 속도, 치료 지속 기간, M 세포 표적 펩타이드-항원 결합체; 및 점막점착제를 포함하는 미세입자와 조합되거나 또는 동시에 사용되는 약물, 대상체의 연령, 체중, 성별, 식습관, 일반적인 건강 상태, 및 의약 업계 및 의학 분야에 공지된 인자를 비롯한 다양한 인자들에 따라 달라질 것이다.

본 발명의 백신조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고, 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있다. 그리고 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.

본 발명의 다른 하나의 양태는 상기 백신 조성물을 포함하는 사료 첨가용 조성물을 제공한다.

본 발명의 사료 첨가용 조성물은 당업계에 공지된 다양한 형태로 제조될 수 있으며, 구체적으로는 본 발명의 M 세포 표적 펩타이드(M cell-homing peptide) 및 항원이 연결된, M 세포 표적 펩타이드-항원 결합체; 및 점막점착제를 유효성분으로 포함하는 것이다.

"M 세포 표적 펩타이드", "항원", "M 세포 표적 펩타이드-항원 결합체", "점막점착제" 및 "백신"은 전술한 바와 같다.

본 발명에 따른 사료 첨가제는 개별적으로 사용될 수 있고 종래 공지된 사료 첨가제와 병용하여 사용될 수 있고 종래의 사료첨가제와 순차적 또는 동시에 사용될 수 있다. 그리고 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.

본 발명의 사료 첨가용 조성물을 적용할 수 있는 개체는 특별히 한정되지 않고, 어떠한 형태의 것이든 적용 가능하다. 예를 들면, 닭, 돼지, 원숭이, 개, 고양이, 토끼, 모르모트, 래트, 마우스, 소, 양, 염소 등과 같은 동물에 제한 없이 적용가능하다.

본 발명의 또 다른 하나의 양태는 (a) M 세포 표적 펩타이드(M cell-homing peptide) 및 항원이 연결된, M 세포 표적 펩타이드-항원 결합체를 제조하는 단계; 및 (b) 상기 결합체를 점막점착제로 코팅하는 단계를 포함하는 백신의 제조방법을 제공한다. 구체적으로 상기 점막점착제는 티올기를 포함할 수 있다.

본 발명의 또 다른 하나의 양태는 상기 백신 조성물을 개체에게 투여하는 단계를 포함하는 적리의 예방 또는 치료 방법을 제공한다. 상기 백신 조성물은 항원으로 BmpB가 사용될 수 있다. 또한, 상기 개체는 인간을 제외한 개체일 수 있다.

항원으로 BmpB를 포함하는 본 발명의 백신 조성물은 부라키스피라 하이오디센테리에 대한 면역 반응을 유도하므로, 부라키스피라 하이오디센테리에 의한 적리의 예방 또는 치료에 매우 효과적으로 사용될 수 있다.

"투여"는 전술한 바와 같다.

본 발명의 용어 "개체"는 병원균이 감염될 수 있는 살아있는 유기체를 의미하는데, 구체적으로는 고등 척추동물이 될 수 있고, 더욱 구체적으로는 포유동물이 될 수 있나, 특별히 이에 제한되지는 않는다.

본 발명의 용어 "적리"는 혈액이 섞인 설사를 일으키는 병을 말한다. 상기 적리에는 세균성 적리 또는 아메바성 적리가 있며, 구체적으로 본 발명에서는 세균성 적리일 수 있으며, 더욱 구체적으로 부라키스피라 하이오디센테리에 의한 적리일 수 있으나, 이제 제한되지 않는다.

본 발명에서 용어 "예방"은 본 발명의 백신 조성물의 투여로 상기 적리를 억제 또는 지연시키는 모든 행위를 말한다.

본 발명에서 용어 "치료"는 본 발명의 백신 조성물의 투여로 상기 적리가 호전되거나 이롭게 되는 모든 행위를 말한다.

본 발명의 점막점착제로 코팅된 M 세포 표적 펩타이드-항원 결합체는 M 세포 표적 펩타이드와 점막점착제가 시너지 효과를 일으켜 면역 반응 유도에 현저한 효과를 가지므로 백신으로서 사용될 수 있으며, 구체적으로 상기 백신을 사용하여 적리를 예방 또는 치료할 수 있다.

도 1은 항원(BmpB 및 M-BmpB)의 크기 및 순도를 확인한 SDS-PAGE 결과를 보여주는 도이다.
도 2는 티올기가 결합된 Eudragit(TE)에서 티올기의 결합을 확인한 NMR 결과를 보여주는 도이다.
도 3은 RAW 264.7 세포로부터 TNF-α(A) 및 JAWSII 세포로부터 IL-6(B)의 분비를 유도하는 항원(BmpB 및 M-BmpB)의 면역능력을 보여주는 그래프이다.
도 4는 항원이 담지된 미세입자의 모양 및 크기를 보여주는 SEM 사진이다.
A: M-BmpB-TEMPs, B: BmpB-TEMPs, C: M-BmpB-EMPs, D: BmpB-EMPs
도 5는 pH 조건에 따른 항원이 담지된 미세입자(TEMPs(A) 및 EMPs(B))의 누적 항원 방출률을 나타낸 그래프이다.
도 6은 항원이 담지된 미세입자에서 방출되는 항원의 안정성을 보여주는 SDS-PAGE(A) 및 웨스턴 블럿(B)의 결과를 나타낸 도이다.
1: BmpB-TEMPs, 2: BmpB-EMPs, 3: Marker, 4: M-BmpB-TEMPs, 5: M-BmpB-EMPs
도 7은 소장에 대한 미세입자의 점막점착성을 공초점 레이저 현미경(CLSM)을 사용하여 측정한 면역조직화학 분석 결과를 나타낸 도이다.
도 8은 경구 면역화 스케줄을 보여주는 도이다.
도 9a는 배설물에서 측정한 BmpB 특이적 IgA 역가를 나타낸 그래프이다.
도 9b는 혈청에서 측정한 BmpB 특이적 IgG 역가를 나타낸 그래프이다.
도 9c는 혈청에서 측정한 BmpB 특이적 IgG1 역가를 나타낸 그래프이다.
도 9d는 혈청에서 측정한 BmpB 특이적 IgG2a 역가를 나타낸 그래프이다.

이하 본 발명을 하기 예에 의해 상세히 설명한다. 다만, 하기 예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 하기 예에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것은 아니다.

실시예 1. 재료

Eudragit® L-100은 Rohm Pharma(Weiterstadt, Germany)에서 구입하였고, 다이메틸설폭사이드(DMSO), N, N'디시클로헥실카르보디이미드(DCC), N-하이드록시숙시니이미드(NHS), L-시스테인 하이드로클로라이드 모노하이드레이트, 폴리(비닐 알콜)(PVA), Pluronic®F-127, 소혈청 알부민(BSA), 디클로로메탄, 4',6-디아미노-2-페니인돌, 디락테이트(DAPI) 및 쿠마린 6(C6)은 Sigma-Aldrich(St. Louis, MO, USA)에서 구입하였다. 또한, Tris-glycine-PAG pre-cast SDS 겔은 Komabiotech(서울,한국)에서, Amersham ECL prime western blotting detection reagent는 GE healthcare(Buckinghamshire, UK)에서, 홀스래디시(Horseradish) 퍼옥시다제(HRP)-결합 goat anti-mouse IgA, IgG, IgG1 및 IgG2a; 및 HRP-결합 goat anti-rabbit IgG 항체는 Santa Cruz Biotechnology(Dallas, TX, USA)에서 구입하였다.

실시예 2. 항원의 설계, 분리 및 정제

소장의 병원균인 부라키스피라 하이오디센테리에 막 단백질 B(Brachyspira hyodysenteriae membrane protein B, BmpB, 서열번호 6)를 코딩하는 유전자(서열번호 5); 또는 M 세포 표적 펩타이드(서열번호 1)의 C-말단 끝에 융합된 BmpB(M-BmpB, 서열번호 8)를 코딩하는 유전자(서열번호 7)를 각각 증폭하여 재조합 DNA 기술을 이용하여 발현벡터에 클로닝하였다. 상기 발현벡터로 대장균을 형질전환시켰다.

상기 BmpB 또는 M-BmpB를 코딩하는 유전자가 도입된 대장균의 종균 배양을 암피실린(100 ㎍/ml)을 포함한 LB broth(800 ml)에서 200 rpm으로 교반하면서 4 시간 동안 37℃에서 배양하였다. 상기 배양액에 IPTG(1 mM)를 첨가하여 12시간 이상 추가 배양한 후 상기 배양액을 6000g에서 10분 동안 원심분리하여 대장균 세포를 수득하였고, 200 ml 인산완충식염수(PBS)로 2번 세척하였다. 상기 세포를 25 ml His-binding 완충액에 재현탁하였고, 음파처리하였다. 12000g에서 30분 동안 원심분리하여 수용성 용해물 분획과 세포 찌꺼기를 분리하였다.

세포 용해물에서 His-tag을 가진 재조합 단백질을 설명서에 따라 Talon 금속 친화 레진(Clontech)을 사용하여 정제하였다. 단백질의 순도 및 크기를 12% SDS-PAGE(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel)를 사용하여 측정하였다(도 1). 정제된 단백질을 4 ℃에서 물(pH 7.9)로 밤새 투석하여 동결건조하였고, -20℃에서 사용 전까지 보관하였다.

실시예 3. 항원의 면역능력 측정

쥐 대식세포 라인, RAW 264.7을 10% 소태아혈청(FBS)이 첨가된 Dulbecco's modified Eagle 배지에서 배양하였다. 20% FBS 및 5 ng/mL 재조합 생쥐 과립구 대식세포 콜로니 자극 인자(recombinant mouse granulocyte macrophage colony stimulating factor)가 첨가된 HyClone^TM minimal essential medium alpha modification(Thermo Scientific)에서 쥐 수지상세포 라인 JAWSSII을 배양하였다.

RAW 264.7 및 JAWSII 세포로부터 각각 TNF-α 및 IL-6 사이토카인의 분비를 측정하기 위해 상기 세포에 항원인 BmpB 또는 M-BmpB를 각각 1 ㎍/ml씩 처리하여 일정 시간 동안 배양하였다(W.J. Lee, et al., 2011). 분비된 사이토카인의 양을 생쥐 TNF-α 및 IL-6 ELISA 키트(Thermo Scientific)를 설명서에 따라 사용하여 분석하였다. 또한, 미생물의 리포폴리사카라이드(LPS)는 미생물에서 막의 외부의 중요한 구성요소로서, 사이토카인의 분비를 유도하는 능력이 뛰어나므로, 이를 양성 대조군으로 사용하였다.

그 결과, BmpB와 M-BmpB는 RAW 264.7 세포로부터 TNF-α및 JAWSII 세포로부터 IL-6의 분비를 유도하는 능력이 서로 같았다(도 3). 즉 BmpB와 M-BmpB의 면역능력은 유사한바, M 세포 표적 펩타이드의 유무는 항원의 면역능력에 크게 영향을 주지 않음을 알 수 있었다.

또한, BmpB와 M-BmpB 모두 시간에 따라 분비되는 사이토카인의 양이 증가하였다. 대조군에서는 어떠한 반응도 유도되지 않았으므로 상기의 결과는 사용된 항원의 면역원성으로 인한 것임을 알 수 있었다. 상기 면역세포에서 사이토카인의 분비를 유도하는 항원의 면역능력은 양성 대조군인 LPS와 유사하였다.

실시예 4. 티올기가 결합된 Eudragit ( TE )의 합성 및 TE 의 티올기 확인

티올기가 결합된 Eudragit(TE)을 기존의 방법에 따라 합성하였다(J.S. Quan, et al., 2008). 먼저, Eudragit® L-100(4 g)을 DMSO(100 ml)에 용해시켰고, DCC(9 g) 및 NHS(5 g)을 Eudragit 용액에 첨가하여 질소 조건하에 24시간 동안 상온에서 교반하였다. 부산물을 여과한 여과액을 추가로 L-시스테인 하이드로클로라이드와 48시간 동안 상기와 유사한 조건에서 반응시켰다. 그 후 부산물을 여과한 여과액을 먼저 DMSO로 투석한 후 증류수로 투석하였다. 최후의 생산물을 동결건조하였고, -20℃에서 사용 전까지 보관하였다.

TE의 티올기를 확인하기 위해 NMR을 사용하여 TE에서 시스테인의 조성을 측정하였다(도 2). 시스테인의 결합 정도를 시스테인의 양성자 하나와 Eudragit의 메틸 기의 양성자 3개 사이에 적분 비율을 계산하여 측정하였다. 그 결과 TE에서 시스테인의 조성은 4.2 mol%이었다.

실시예 5. 중합에 의한 미세입자( microparticles , MPs )의 제조

실시예 5-1. 항원이 담지된 미세입자의 제조

위장관의 효소 분해 및 산성 pH로부터 경구투여용 백신을 보호하기 위해 pH에 민감한 폴리머를 사용하여 항원을 코팅해야므로, 항원이 담지된 미세입자를 제조하였다. 구체적으로, Eudragit 미세입자(EMPs) 및 티올기가 결합된 Eudragit 미세입자(TEMPs)를 제조하였다(W.-J. Lee, et al., 2011).

먼저, 디클로로메탄/에탄올(1:1) 또는 디클로로메탄 각각 5 ml에 Eudragit 또는 티올기가 결합된 Eudragit(TE)을 각각 50 mg씩 용해하여 Eudragit 또는 티올기가 결합된 Eudragit(TE)의 유기용액을 제조하였다. 입자 내부를 수상(aqueous phase)으로 만들기 위해 10 % 플루론 F-127 용액(100 ㎕)의 수용액을 BmpB 또는 M-BmpB 항원(100 ㎕)와 혼합하였다. 상기 수상을 초음파 균질기(Sonics, Vibra cells^TM)를 사용하여 상기 유기용액 5 ml로 유화하여 에멀전을 제조하였다. water-in-oil-in-water(W/O/W) 에멀전을 제조하기 위해, 상기 에멀전을 PVA(1 % w/v)의 외부 수상에 추가로 첨가하였고, 혼합물을 Ultra Turrax(T25, IKA, Germany)로 11,000 rpm으로 4분 동안 균질화하였다. 그 후 유기용매를 증발시키기 위해 에멀전을 6-8 시간 동안 상온에서 교반하였고, 생성된 항원이 담지된 미세입자(M-BmpB-TEMPs, BmpB-TEMPs, M-BmpB-EMPs, BmpB-EMPs)를 수득하여 증류수로 세척하였고, 동결건조하여 -20℃에서 사용 전까지 보관하였다.

실시예 5-2. 쿠마린 6( C6 )이 담지된 미세입자의 제조

쿠마린 6(C6)이 담지된 미세입자를 제조하기 위해, C6(5 mg)을 디클로로메탄 5 ml에 용해된 폴리머 유기용액에 용해하였다. 폴리머 용액을 PVA(1 % w/v)와 혼합하여 oil-in-water(O/W) 에멀전을 제조하였고, 상기 서술한 균질화 방법을 수행하였다. 또한, 추가적인 공정을 상기 서술한 항원이 담지된 미세입자의 제조 방법과 유사하게 수행하였다.

실시예 6. 항원이 담지된 미세입자의 분석

실시예 6-1. 항원이 담지된 미세입자의 형태 관측

미세입자의 형태를 분석하기 위해, 상기 미세입자(M-BmpB-TEMPs, BmpB-TEMPs, M-BmpB-EMPs, BmpB-EMPs)를 코팅 챔버(CT 1500 HF, Oxford Instruments Oxfordshire, UK)를 사용하여 금으로 코팅하였다. 코팅된 미세입자를 필드 방사 주사형 전자 현미경(FE-SEM; Supra 55VP; Carl Zeiss, Oberkochen, Germany)으로 관측하였다. SEM 사진에서 미세입자의 평균 크기를 측정하였다(도 4).

그 결과, 미세입자는 부드러운 표면을 가진 구형 모형이었고, 입자의 크기는 약 1-10 ㎛이었다(A: M-BmpB-TEMPs, B: BmpB-TEMPs, C: M-BmpB-EMPs, D: BmpB-EMPs). 대식세포 및 M 세포와 같은 식세포는 1-5 ㎛의 직경의 미세입자를 잘 포획할 수 있으므로, 본 발명의 미세입자는 식세포에 잘 포획될 수 있음을 알 수 있었다.

실시예 6-2. 담지 함량 및 담지 효율성 측정

항원이 담지된 미세입자의 담지 함량 및 담지 효율성을 분석하기 위해, 미세입자를 제조하는데 사용된 전체 항원의 양에 대한 실제적으로 담지된 항원의 양의 비율을 사용하여 담지 효율성을 측정하였다. 미세입자(2 mg)를 0.1 N NaOH(1 ml)에 분산하였고, 현탄액을 37℃에서 1시간 동안 유지하였다. 원심분리 후 200 ㎕ 상청액을 분리하여 단백질의 흡광도를 280 nm에서 Eppendorf BioPhotometer를 사용하여 측정하였고, 담지된 또는 방출된 단백질의 농도를 계산하기 위해 표준검증곡선을 사용하여 담지 함량 및 담지 효율성을 측정하였다(표 1).

Microparticles(MPs)	Loading content(%)	Loading efficiency(%)
M-BmpB-TEMPs	16 ± 2.1	75.2 ± 1.2
M-BmpB-EMPs	14 ± 1.3	69.1 ± 1.7
BmpB-TEMPs	18 ± 0.5	73.1 ± 0.6
BmpB-EMPs	13 ± 2.3	66.1 ± 3.1

상기 표 1에서 알 수 있듯이, TE로 코팅된 항원인 TEMPs가 Eudragit으로 코팅된 항원인 EMPs보다 항원의 담지 함량 및 담지 효율성이 더 높은 것을 알 수 있었다.

즉, 티올기가 결합된 점막점착제를 사용하여 제조된 미세입자는 항원의 담지 함량 및 담지 효율성이 증가하여 더 우수한 백신이 될 수 있음을 시사하였다.

실시예 7. 항원이 담지된 미세입자의 항원 방출 분석

항원이 담지된 미세입자의 항원 방출을 2 종류의 다른 pH 조건에서 측정하였다. 먼저, 항원이 담지된 미세입자(2 mg/ml)를 2종류의 생리적인 완충액(인공 위액(pH 2.0) 및 인공 소장액(pH 7.2))에 현탁하였다. 시간에 따라 항원이 담지된 미세입자부터 항원이 방출되는 것을 측정하기 위해 현탁된 미세입자를 37℃에서 100 rpm으로 교반하였다. 일정한 시간 후 미세입자를 1분 동안 6000 rpm으로 원심분리한 후 상청액을 분리하여 단백질의 흡광도를 280 nm에서 Eppendorf BioPhotometer를 사용하여 측정하였다. 실험을 3번 반복하였다(도 5).

그 결과, 시간에 따라 TEMPs에서 방출되는 항원의 누적량이 증가하였고, Eudragit 폴리머의 pH 감수성 때문에 pH 2.0 보다 pH 7.2에서 항원의 누적 방출률이 더 높았다.

이를 통해, 본 발명의 항원이 담지된 미세입자는 산성 환경인 위장관보다 소장에서 항원이 지속적으로 방출됨을 알 수 있었고, 이는 본 발명의 미세입자가 경구용 백신으로서의 능력이 우수함을 시사하는 것이었다.

실시예 8. 항원의 구조 및 기능 확인

단백질은 화학 약물과 달리 작용기 사이의 분자 내 결합에 의해 2, 3 및 4차 구조를 가지고, 이러한 구조가 파손되면 단백질의 활성이 상실된다. 따라서 단백질 항원이 미세입자에 담지되는 동안 단백질의 안정성이 유지되는지 확인하기 위해, 미세입자에 담지되기 전 또는 후의 단백질의 구조적 통합을 SDS-PAGE 및 웨스턴 블럿을 통해 측정하였다.

먼저, XCell SureLock^TMMini-Cell(Life Technologies, USA)을 130 V에서 1시간 동안 사용하여 환원 조건하에 4-20% SDS 겔에 의해 단백질을 분리하였다. 전기영동 후 Trans-Blot®SD Semi-Dry Electrophoretic Transfer Cell(Bio-Rad, USA)을 10 V에서 60분 동안 사용하여 단백질 겔을 니트로셀룰로스 막(Protran nitrocellulose membrane, Whatman, UK)에 전기적으로 전이시켰다. 그 후 막을 TBST(Tris-buffered saline-Tween)에 용해시킨 5% 탈지 우유로 상온에서 60분 동안 블럭시켰고, TBST로 세척하였다. 막을 BmpB에 대한 항체와 함께 4℃에서 밤새 교반한 후 TBST로 세척하였다. 추가적으로 막을 TBST에 용해시킨 HRP-결합 goat anti-rabbit IgG와 함께 상온에서 1시간 동안 배양하였고, TBST로 세척하였다. 막을 향상된 화학발광 검츨 시스템(GE Healthcare, UK)으로 처리하였고, 웨스턴 블럿에 대한 화학발광 신호를 수집하기 위해 Gel Doc XR system(BioRad, USA)을 사용하였다.

항원이 담지된 미세입자에서 방출된 항원은 SDS 겔에서 야생형 단백질과 유사한 크기를 가지고 있었다(도 6A).

또한, 웨스턴 블럿에서 항원과 항체의 결합을 확인한 결과, 항원이 미세입자에 담지되는 동안에 구조적으로 변형되지 않고 자신의 구조를 유지함을 확인하였다(도 6B).

이를 통해, 미세입자에 담지되는 동안 단백질 항원의 안정성이 유지됨을 확인하여 본 발명의 미세입자가 백신으로서 사용될 수 있음을 알 수 있었다.

실시예 9. 미세입자의 점막점착성 확인

점막 면역 반응은 항원과 점막의 직접적인 접촉에 의해 유도되므로, 미세입자의 소장에 대한 점막점착성을 회장고리 분석법(ileal loop assay)을 통해 분석하였다.

먼저, C6가 담지된 미세입자(1 mg/ml)를 생쥐 소장의 폐쇄된 회장고리(closed ileal loop)로 주사하였다. 1시간 후 폐쇄된 회장고리를 잘라내어 차가운 PBS로 세척하였다. 그 후 상기 조직 샘플을 4 %(v/v) 파라포름알데하이드로 고정하여 냉동 절단하였다. 샘플 절편을 DAPI로 염색하여 공초점 레이저 현미경(CLSM)(Carl Zeiss LSM710, Carl Zeiss, Inc.)으로 관측하였다.

소장의 냉동된 절편의 면역조직화학 분석 결과, 소장에 부착된 TEMPs의 수가 EMPs의 수보다 더 많았다(도 7). 이를 통해, 티올기를 포함하는 점막점착제가 티올기가 없는 점막점착제보다 점막점착 능력이 더 크다는 것을 알 수 있었다.

실시예 10. 경구 면역화 및 미세입자의 면역 반응

실시예 10-1. 경구 면역화

생후 6주된 암컷 BALB/c 생쥐를 Samtako, Co. Ltd.(오산, 한국)에서 구입하였고, 실험 내내 먹이와 물을 자유롭게 먹을 수 있도록 하였다. 생쥐를 표준 무병 조건 하에 보관하였고, 동물 실험의 가이드라인(서울대학교)을 따라 실험을 수행하였다. 생쥐를 5개의 코호트(cohort)로 나누었고, 1 코호트 당 5 마리의 생쥐를 포함하였다. PBS(200 ㎕)에 현탁된 미세입자에 포함된 200 ㎍ 단백질과 동량을 각각의 생쥐에게 위관영양법(gavage)으로 제공하였다.

도 1에 나타낸 바와 같이 각각의 그룹에게 총 6회(프라이밍 2회 및 부스팅 4회) 분의 백신(점막점착성을 가지거나 또는 가지지 않은 BmpB(BmpB-TEMPs 또는 BmpB-EMPs); 또는 점막점착성을 가지거나 또는 가지지 않은 M-BmpB(M-BmpB-TEMPs 또는 M-BmpB-EMPs))을 투여하였다.

면역 반응을 모니터하기 위해 혈청 및 배설물 샘플을 4주 동안 수집하였다. 혈액 샘플을 6,000 rpm에서 10분 동안 원심분리하여 혈청을 수득하였고, 항체 역가 분석 전까지 -70℃에서 보관하였다. 생쥐의 배설물 펠렛을 PBS에 담궈 상온에서 30분 동안 유지한 후, 6,000 rpm으로 10분 동안 원심분리하여 상청액을 수득하였고, 상기 상청액을 항원 특이적 IgA의 존재를 분석하는데 사용하였다. 마지막 샘플링 후 생쥐를 희생하여 소장을 즉시 적출하였고, 상기 소장을 PBS에서 균질화하였다. 조직을 4℃에서 10,000 rpm으로 10분 동안 원심분리하여 제거하였고, 수득한 상청액을 IgA 역가 분석 전까지 -70℃에서 보관하였다.

실시예 10-2. 미세입자의 면역 반응

경구용 백신이 성공적으로 전달되면 점막에서 분비성 IgA(sIgA) 항체를 자극하므로, 면역화 이후 sIgA의 수준을 측정하기 위해, 수집된 소장과 배설물의 샘플을 ELISA로 분석하였다.

그 결과, 배설물에서 항원이 담지된 TEMPs가 EMPs에 비해 더 높은 BmpB 특이적 sIgA의 역가를 보였다(도 9a).

또한, sIgA 항체가 점막 표면에서 체액성 면역 방어를 나타내는 지배적인 면역글로불린일지라도, 혈청 유래 면역글로불린 G(IgG)도 면역 방어에 중요한 역할을 한다. 면역화 이후 혈청에서 BmpB 특이적 IgG 항체의 역가를 측정하였다(도 9b). M-BmpB-TEMPs가 투여된 생쥐에서 가장 높은 BmpB 특이적 IgG의 역가를 보였다. 또한, M-BmpB-TEMPs와 M-BmpB-EMPs의 IgG 역가 차이가 BmpB-TEMPs와 BmpB-EMPs의 역가 차이보다 더 큰 차이를 보이는 것을 확인하였다. 이를 통해, M 세포 표적 펩타이드와 티올기를 포함한 점막점착제가 시너지 효과를 일으켜 M 세포 표적 펩타이드를 사용하지 않은 경우보다 면역능력이 더 증가하였음을 알 수 있었다.

즉, 본 발명의 티올기를 포함한 점막점착제로 코팅된, M 세포 표적 펩타이드-항원 결합체는 티올기를 포함한 점막점착제로 코팅된, 항원보다 면역 반응 유도에 현저한 효과를 가진다는 것을 시사하였다.

혈청에서 IgG1 및 IgG2a의 동종 수준을 면역 반응의 종류를 분석하기 위해 측정하였다. IgG1은 Th2-타입 반응과, IgG2a는 Th1-타입 반응과 관련되어 있다. 유도된 면역 반응의 Th1 또는 Th2 경향을 나타내기 위해, gG2a/IgG1 비율을 사용하였다. 각 면역화 이후 혈청에서 BmpB 특이적 IgG1 및 IgG2a 항체 반응을 각각 도 9c 및 9d에 나타내었다.

M-BmpB-TEMPs가 투여된 생쥐에서 가장 높은 BmpB 특이적 IgG1 및 IgG2a의 역가를 보였다. 이를 통해, 본 발명의 미세입자가 in vivo에서 Th1 및 Th2 면역 반응을 유도할 수 있음을 알 수 있었다.

M-BmpB-EMPs는 BmpB-EMPs보다 더 높은 sIgA, IgG, IgG1 및 IgG2a 역가를 보였다. 상기 실시예 3에서 항원의 면역능력을 측정한 결과 M 세포 표적 펩타이드의 유무는 항원의 면역능력에 크게 영향을 주지 않음을 알 수 있었는데, 점막점착제로 코팅한 미세입자의 경우 M 세포 표적 펩타이드의 유무에 따라 sIgA, IgG, IgG1 및 IgG2a 역가가 차이가 남을 확인하였다. 이를 통해 M 세포 표적 펩타이드를 포함한 미세입자가 M 세포 표적 펩타이드가 없는 미세입자보다 더 높은 sIgA, IgG, IgG1 및 IgG2a 역가를 보인바, M 세포 표적 펩타이드와 점막점착제가 시너지 효과를 일으켜 면역능력이 더 증가하였음을 알 수 있었다.

즉, 본 발명의 점막점착제로 코팅된, M 세포 표적 펩타이드-항원 결합체는 백신으로서 면역 반응 유도에 현저한 효과를 가진다는 것을 시사하였다.

마찬가지로, M-BmpB-TEMPs는 가장 높은 sIgA, IgG, IgG1 및 IgG2a 역가를 보이며, M-BmpB-EMPs보다 더 높은 sIgA, IgG, IgG1 및 IgG2a 역가를 보였다. 이를 통해, M 세포 표적 펩타이드는 티올기가 없는 점막점착제보다 티올기를 포함한 점막점착제와 더 큰 시너지 효과를 일으킴을 알 수 있었다.

이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시 예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

<110> Seoul National University R&DB Foundation <120> Vaccine composition comprising M cell homing peptide-antigen conjugate and mucoadhesive vehicle <130> KPA140450-KR-P1 <150> KR 10-2014-0119194 <151> 2014-09-05 <160> 8 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> M cell-homing peptide <400> 1 Cys Lys Ser Thr His Pro Leu Ser Cys 1 5 <210> 2 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> M cell-homing peptide <400> 2 Ser Phe His Gln Leu Pro Ala Arg Ser Pro Leu Pro 1 5 10 <210> 3 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> M cell-homing peptide <400> 3 Tyr Gln Cys Ser Tyr Thr Met Pro His Pro Pro Val 1 5 10 <210> 4 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> M cell-homing peptide <400> 4 Ser Leu Asp Ala Gly Gln Tyr Val Leu Val Met Lys Ala Asn Ser Ser 1 5 10 15 Tyr Ser Gly Asn Tyr Pro Tyr Ser Ile Leu Phe Gln Lys Phe 20 25 30 <210> 5 <211> 756 <212> DNA <213> Brachyspira hyodysenteriae <400> 5 atgggaaata cttcttctgg tgatcaaaag atagttaaag ttggttttgc tggagagtct 60 gattatcaaa tttgggatcc tatagtagct aaattagctg aagaaggaat taaagtagag 120 ctagtatctt tctctgatta tactatacct aatcaggctt tgaatgacgg agaaattgac 180 ttgaatgctt ttcagcatta tgcatacttt aatgatgaag tatcaaataa aggatatgac 240 ttaactgcta ttgctgatac ttatatatct gctatgaata tttattctac taatattact 300 gatgtaaaag aattaaaaaa cggcgataaa atagctatac ctaatgaccc ttctaatgga 360 ggaagagctt taaaagttct tcaggctgca ggaatcatta aagtaaaacc tgaagcagga 420 gatactccta gcgtaagcga tataatagaa aatcctctaa atattgaaat agtagaaatg 480 gatgcaggtg ctatttacgg tgttcttcct gatgttgctt gtgctgttat caatggaaac 540 tatgctatag acttcggttt gaatcctggt tctgattata tattcaaaga tgatccttct 600 atttacagcg gaaaatcttt tgttaattta atagctgcaa gaactaaaga taaagataat 660 gaattataca aaaaagttgt agaaacttat caatctgaaa tagtagaaaa agtttataat 720 gaaaatttct taggttctta tcttcctact tggaaa 756 <210> 6 <211> 252 <212> PRT <213> Brachyspira hyodysenteriae <400> 6 Met Gly Asn Thr Ser Ser Gly Asp Gln Lys Ile Val Lys Val Gly Phe 1 5 10 15 Ala Gly Glu Ser Asp Tyr Gln Ile Trp Asp Pro Ile Val Ala Lys Leu 20 25 30 Ala Glu Glu Gly Ile Lys Val Glu Leu Val Ser Phe Ser Asp Tyr Thr 35 40 45 Ile Pro Asn Gln Ala Leu Asn Asp Gly Glu Ile Asp Leu Asn Ala Phe 50 55 60 Gln His Tyr Ala Tyr Phe Asn Asp Glu Val Ser Asn Lys Gly Tyr Asp 65 70 75 80 Leu Thr Ala Ile Ala Asp Thr Tyr Ile Ser Ala Met Asn Ile Tyr Ser 85 90 95 Thr Asn Ile Thr Asp Val Lys Glu Leu Lys Asn Gly Asp Lys Ile Ala 100 105 110 Ile Pro Asn Asp Pro Ser Asn Gly Gly Arg Ala Leu Lys Val Leu Gln 115 120 125 Ala Ala Gly Ile Ile Lys Val Lys Pro Glu Ala Gly Asp Thr Pro Ser 130 135 140 Val Ser Asp Ile Ile Glu Asn Pro Leu Asn Ile Glu Ile Val Glu Met 145 150 155 160 Asp Ala Gly Ala Ile Tyr Gly Val Leu Pro Asp Val Ala Cys Ala Val 165 170 175 Ile Asn Gly Asn Tyr Ala Ile Asp Phe Gly Leu Asn Pro Gly Ser Asp 180 185 190 Tyr Ile Phe Lys Asp Asp Pro Ser Ile Tyr Ser Gly Lys Ser Phe Val 195 200 205 Asn Leu Ile Ala Ala Arg Thr Lys Asp Lys Asp Asn Glu Leu Tyr Lys 210 215 220 Lys Val Val Glu Thr Tyr Gln Ser Glu Ile Val Glu Lys Val Tyr Asn 225 230 235 240 Glu Asn Phe Leu Gly Ser Tyr Leu Pro Thr Trp Lys 245 250 <210> 7 <211> 807 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> M-BmpB <400> 7 atggcttgta aatcaacaca tccactttca tgtggtggag gtggatctct agaaggaaat 60 acttcttctg gtgatcaaaa gatagttaaa gttggttttg ctggagagtc tgattatcaa 120 atttgggatc ctatagtagc taaattagct gaagaaggaa ttaaagtaga gctagtatct 180 ttctctgatt atactatacc taatcaggct ttgaatgacg gagaaattga cttgaatgct 240 tttcagcatt atgcatactt taatgatgaa gtatcaaata aaggatatga cttaactgct 300 attgctgata cttatatatc tgctatgaat atttattcta ctaatattac tgatgtaaaa 360 gaattaaaaa acggcgataa aatagctata cctaatgacc cttctaatgg aggaagagct 420 ttaaaagttc ttcaggctgc aggaatcatt aaagtaaaac ctgaagcagg agatactcct 480 agcgtaagcg atataataga aaatcctcta aatattgaaa tagtagaaat ggatgcaggt 540 gctatttacg gtgttcttcc tgatgttgct tgtgctgtta tcaatggaaa ctatgctata 600 gacttcggtt tgaatcctgg ttctgattat atattcaaag atgatccttc tatttacagc 660 ggaaaatctt ttgttaattt aatagctgca agaactaaag ataaagataa tgaattatac 720 aaaaaagttg tagaaactta tcaatctgaa atagtagaaa aagtttataa tgaaaatttc 780 ttaggttctt atcttcctac ttggaaa 807 <210> 8 <211> 269 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> M-BmpB <400> 8 Met Ala Cys Lys Ser Thr His Pro Leu Ser Cys Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 10 15 Leu Glu Gly Asn Thr Ser Ser Gly Asp Gln Lys Ile Val Lys Val Gly 20 25 30 Phe Ala Gly Glu Ser Asp Tyr Gln Ile Trp Asp Pro Ile Val Ala Lys 35 40 45 Leu Ala Glu Glu Gly Ile Lys Val Glu Leu Val Ser Phe Ser Asp Tyr 50 55 60 Thr Ile Pro Asn Gln Ala Leu Asn Asp Gly Glu Ile Asp Leu Asn Ala 65 70 75 80 Phe Gln His Tyr Ala Tyr Phe Asn Asp Glu Val Ser Asn Lys Gly Tyr 85 90 95 Asp Leu Thr Ala Ile Ala Asp Thr Tyr Ile Ser Ala Met Asn Ile Tyr 100 105 110 Ser Thr Asn Ile Thr Asp Val Lys Glu Leu Lys Asn Gly Asp Lys Ile 115 120 125 Ala Ile Pro Asn Asp Pro Ser Asn Gly Gly Arg Ala Leu Lys Val Leu 130 135 140 Gln Ala Ala Gly Ile Ile Lys Val Lys Pro Glu Ala Gly Asp Thr Pro 145 150 155 160 Ser Val Ser Asp Ile Ile Glu Asn Pro Leu Asn Ile Glu Ile Val Glu 165 170 175 Met Asp Ala Gly Ala Ile Tyr Gly Val Leu Pro Asp Val Ala Cys Ala 180 185 190 Val Ile Asn Gly Asn Tyr Ala Ile Asp Phe Gly Leu Asn Pro Gly Ser 195 200 205 Asp Tyr Ile Phe Lys Asp Asp Pro Ser Ile Tyr Ser Gly Lys Ser Phe 210 215 220 Val Asn Leu Ile Ala Ala Arg Thr Lys Asp Lys Asp Asn Glu Leu Tyr 225 230 235 240 Lys Lys Val Val Glu Thr Tyr Gln Ser Glu Ile Val Glu Lys Val Tyr 245 250 255 Asn Glu Asn Phe Leu Gly Ser Tyr Leu Pro Thr Trp Lys 260 265

Claims

서열번호 1의 아미노산 서열로 구성된 M 세포 표적 펩타이드(M cell-homing peptide), 및 항원이 연결된, M 세포 표적 펩타이드-항원 결합체; 및 점막점착제를 포함하는 백신 조성물로서,
이때, 상기 항원은 부라키스피라 하이오디센테리에 막 단백질 B(BmpB)이고,
상기 점막점착제는 티올기가 결합된 유드라짓(Eudragit)인, 백신 조성물.
제1항에 있어서,
상기 조성물은 티올기가 결합되지 않은 유드라짓(Eudragit)을 점막점착제로 사용하는 경우에 비해 항원의 담지 함량 및 담지 효율성이 증가된 것인, 조성물.
제1항 또는 제2항에 있어서,
상기 백신은 경구투여용인 것인, 조성물.
삭제
제1항 또는 제2항에 있어서,
약제학적으로 허용되는 담체를 추가로 포함하는 것인, 조성물.
삭제
제1항 또는 제2항의 조성물을 포함하는 사료 첨가용 조성물.
삭제
(a) 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성된 M 세포 표적 펩타이드(M cell-homing peptide), 및 항원이 연결된, M 세포 표적 펩타이드-항원 결합체를 제조하는 단계; 및
(b) 상기 결합체를 점막점착제로 코팅하는 단계를 포함하는 백신의 제조방법으로서,
이때, 상기 항원은 부라키스피라 하이오디센테리에 막 단백질 B(BmpB)이고,
상기 점막점착제는 티올기가 결합된 유드라짓(Eudragit)인, 백신의 제조방법.
삭제
제1항의 조성물을 인간을 제외한 개체에게 투여하는 단계를 포함하는 적리의 예방 또는 치료 방법.