KR102140379B1 - 돼지 적리 치료 또는 예방용 백신 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 브라키스피라 하이오디센테리에의 세포벽 단백질 (BmpB) 및 M 세포 표적형 펩타이드 (CKS9)를 포함하는 항원 단백질을 회장 표적 점막점착성 고분자 담지체에 담지한 경구 투여용 백신에 관한 것으로, 본 발명의 백신 조성물은 경구 투여시 효율적으로 장막에 항원을 방출하여 직접적으로 점막면역을 유도할 수 있어, 소화 장관을 통해 침입하는 병원균의 초도 방어를 유도할 수 있고, 이를 암호화하는 벡터로 형질전환된 대장균을 사용하기 때문에 scale up이 용이하여 빠른 시간 내에 생산이 가능하므로, 고효율 및 저비용의 백신을 생산 및 공급할 수 있다.

Description

돼지 적리 치료 또는 예방용 백신 조성물{VACCINE COMPOSITION FOR TREATING OR PREVENTING SWINE DUSENTERY}

본 발명은 돼지에 대장의 염증과 혈액성 하리를 일으키는 전염병의 주요 원인균인 돼지 적리를 예방하기 위한 백신에 관한 것으로, 구체적으로, 브라키스피라 하이오디센테리에의 세포벽 단백질 (BmpB) 및 M 세포 표적형 펩타이드 (CKS9)를 포함하는 항원 단백질을 회장 표적 점막점착성 고분자 담지체에 담지한 경구 투여용 백신에 관한 것이다.

돼지의 대장의 염증과 혈액성 하리를 일으키는 전염병인 돼지 적리(Swine dusentery) (vibrionic dysentery, bloody scours, bloody dysentery, black scours 또는 mucohemorrhagic diarrhea로도 불림)는, 불려지는 질환으로 한번 감염되면 상재화 되는 경향이 있고, 발육지연, 사료 효율 저하 등 생산성을 저하시키는 질병이다. 돼지에 전염하는 경로는 이 병에 감염된 돼지의 설사 분변이나, 보균 하고 있는 돼지의 분변에 오염된 사료나 물 등을 섭취하였을 경우이며, 농장간에 보균돼지의 입식이나 사육자의 이동, 감염돈사의 하수구나 돈사에 출입하는 설치류가 이균을 매개한다고 추정하고 있고, 또한 파리도 균을 운반하는 역할을 할 수 있는것으로 보고되고 있다. 돼지 적리는 1921년 미국에서 최초 발생 보고된 이래 호주, 유럽, 일본 등 돼지를 생산하고 있는 세계 각 지역에서 넓게 만연되어 있는 실정이다. 국내에서 1993~1994년 전국의 50개 양돈장의 설사하는 비육돈 약 400두를 대상으로 조사한 결과, 약 20%의 농장이 돼지 적리병에 감염되어 있었고, 설사하는 비육돈 중에서는 약 40%가 돼지 적리병인 것으로 확인된 바 있다. 돼지 적리에 대한 예방백신이 개발되어 있지 않고, 현재 치료에 적용되는 카바톡스, 티아뮤린, 린코마이신과 같은 항생제에 대한 약재 내성에 따른 내성균주가 출현하고 있으며, 발병 농장에서의 재발 빈도가 높아 치료보다 원천적인 예방 차원의 대책이 필요한 상황이다. 이에, 기존의 백신처럼 가축에 스트레스와 상품가치 하락을 유발시키는 침습적 주사방식 보다는 점막면역반응을 효과적으로 유도할 수 있는 경구 백신과 같은 백신 기술 개발이 필요하다.

경구 백신은 주사로 인한 스트레스가 적을 뿐만 아니라, 경구백신을 통해 점막면역반응이 활성화 되면, 분비형 항체인 IgA가 소장 내강에서 병원균을 무력화 시켜 병원균이 소장 상피세포를 통과하여 체내로 들어오지 못하도록 막아주기 때문에 병원균을 초도에 방어할 수 있다는 장점이 있다. 따라서 이질, 콜레라 등의 세균 및 바이러스성 수인성 전염병을 감염 경로상에서 직접적으로 차단하고 예방하기 위해서는 주사방식의 백신보다 경구백신을 통해 소화장관 내 점막면역반응을 활성화 시키는 것이 효과적이다. 그러나, 백신체의 주요 구성 요소인 단백질등은 운송과정 중 위산에 의한 낮은 pH, 소장장관의 각종 영양소 분해효소 등에 의해 변성되어 그 고유 기능을 잃기 쉬우며, 안전하게 소화장관까지 전달되더라도 소장 점막층에서의 흡수효율이 낮아 체내로 흡수되는데 문제점을 나타내, 현재까지는 주사형 백신보다 경구 백신의 활용이 매우 제한적이다. 이에, 최근 백신의 경구투여 후 위에서 백신을 보호하기 위해 고분자들이 사용되었으나 (Dea-Ayuela et al.,), 점막점착성이나 M-Cell 특이성을 갖지 못해 효율이 낮은 문제가 있어, 보다 더 특이적이고 효과적인 면역유도 방법이 필요한 실정이다.

이에, 본 발명자들은 경구를 통해 감염되어 장내 질환을 야기하는 돼지 적리 질환의 특성상 소화 장관에 직접적으로 점막면역반응을 유도하여 소화 장관을 통해 침입하는 병원균의 초도 방어를 유도하는 전략이 질병의 예방에 효과적일 것으로 판단하여, 효율적인 회장 표적 방출 조절형 점막점착성 HPMCP 고분자를 개발하고 이 고분자에 M 세포 표적형 펩타이드 작용기가 결합된 돼지적리 항원 단백질(BmpB)을 담지시킨, 경구 백신 제제를 개발하였다.

MANUAL OF STANDARDS for diagnostic tests and vaccines, OIE, second edition, 1992. CLINICAL VETERINARY MICROBIOLOGY, Wolfe publishing, 1994. HAGAN AND BRUNER`S DISEASES OF DOMESTIC ANIMALS, conell university, eighth edition, 1988. Diseases of swine. Iowa State University Press, 7th edition, 1992. 수의전염병학, 경북대학교 출판부, 1994

본 발명의 목적은 브라키스피라 하이오디센테리에의 세포벽 단백질 (BmpB)을 암호화하는 핵산 분자 및 M 세포 표적형 펩타이드 (CKS9)를 암호화하는 핵산 분자를 포함하는 재조합 벡터를 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 목적은 본 발명의 벡터가 숙주세포에 형질전환된 재조합 세포주를 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 목적은 브라키스피라 하이오디센테리에의 세포벽 단백질 (BmpB) 및 M 세포 표적형 펩타이드 (CKS9)가 결합된 재조합 융합단백질을 포함하는 돼지 적리 치료 또는 예방용 백신 조성물을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 목적은 돼지 적리 예방용 백신의 제조방법을 제공하는 것이다.

아울러, 본 발명의 목적은 돼지 적리균에 대해 돼지를 면역화시키는 방법을 제공하는 것이다.

상기 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 브라키스피라 하이오디센테리에의 세포벽 단백질 (BmpB)을 암호화하는 핵산 분자 및 M 세포 표적형 펩타이드 (CKS9)를 암호화하는 핵산 분자를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.

또한, 본 발명은 본 발명의 벡터가 숙주세포에 형질전환된 재조합 세포주를 제공한다.

또한, 본 발명은 브라키스피라 하이오디센테리에의 세포벽 단백질 (BmpB) 및 M 세포 표적형 펩타이드 (CKS9)가 결합된 재조합 융합단백질을 포함하는 돼지 적리 치료 또는 예방용 백신 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 돼지 적리 예방용 백신의 제조방법을 제공한다.

아울러, 본 발명은 돼지 적리균에 대해 돼지를 면역화시키는 방법을 제공한다.

본 발명에 따른 브라키스피라 하이오디센테리에의 세포벽 단백질 (BmpB) 및 M 세포 표적형 펩타이드 (CKS9)가 결합된 재조합 융합단백질은 M-세포 특이적인 항원이며, 이를 회장 표적 방출 조절형 점막점착성 고분자 담지체에 담지함으로써, 경구 투여시 효율적으로 장막에 항원을 방출하여 직접적으로 점막면역을 유도할 수 있어, 소화 장관을 통해 침입하는 병원균의 초도 방어를 유도할 수 있고, 이를 암호화하는 벡터로 형질전환된 대장균을 사용하기 때문에 scale up이 용이하여 빠른 시간 내에 생산이 가능하므로, 고효율 및 저비용의 백신을 생산 및 공급할 수 있다.

도 1은 본 발명의 항원 단백질 발현에 사용한 pET-21a(+) 벡터의 개열지도이다.
도 2는 pET-21a(+) 벡터에 M-BmpB 유전자를 클로닝한 M-BmpB 단백질 발현 벡터를 개략적으로 나타낸 도식도이다.
도 3은 배양 시간대별로 IPTG에 의하여 과발현 되는 M-BmpB 단백질을 웨스턴블롯 분석을 통해 확인한 사진이다.
도 4는 배지 조건별로 IPTG에 의하여 과발현 되는 M-BmpB 단백질을 웨스턴블루를 통해 확인한 사진이다.
도 5는 정제한 후 M-BmpB 단백질을 SDS-PAGE 수행한 젤의 쿠마시블루 스테이닝 및 웨스턴블롯 분석을 통해 확인한 사진이다.
도 6은 젤 투과 크로마토그래피를 이용하여 M-BmpB 단백질의 순도를 확인한 사진이다.
도 7은 M-BmpB 항원단백질을 담지한 고분자 담지체인 HPMCP 및 이눌린을 동결건조한 분말의 사진이다.
도 8은 최종 형성된 항원 단백질 M-BmpB이 담지된 HPMCP의 형태를 SEM을 이용하여 확인한 사진이다.
도 9는 목적 동물의 전임상 시험을 위해 입식된 돼지가 돈적리 균에 대해 감염되지 않았음을 PCR로 확인한 사진이다.
도 10은 시험 백신 제조 후 무균시험을 진행하여 음성을 확인한 사진이다.
도 11은 M-BmpB를 HPMCP에 담지한 백신을 경구투여한 돼지 군의 항체가를 확인한 사진이다.
도 12는 M-BmpB를 이눌린에 담지한 백신을 경구투여한 돼지 군의 항체가를 확인한 사진이다.
도 13은 M-BmpB를 PBS와 혼합한 백신을 경구투여한 돼지 군의 항체가를 확인한 사진이다.
도 14는 M-BmpB 시험 백신 투여 및 공격접종 후 부검을 실시하여 적리증상이 확인된 사진이다.
도 15는 항체가 확인 시험 스케줄을 나타낸 도이다.

이하, 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 구현예로 본 발명을 상세히 설명하기로 한다. 다만, 하기 구현예는 본 발명에 대한 예시로 제시되는 것으로, 당업자에게 주지 저명한 기술 또는 구성에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 경우에는 그 상세한 설명을 생략할 수 있고, 이에 의해 본 발명이 제한되지는 않는다. 본 발명은 후술하는 특허청구범위의 기재 및 그로부터 해석되는 균등 범주 내에서 다양한 변형 및 응용이 가능하다.

또한, 본 명세서에서 사용되는 용어(terminology)들은 본 발명의 바람직한 실시예를 적절히 표현하기 위해 사용된 용어들로서, 이는 사용자, 운용자의 의도 또는 본 발명이 속하는 분야의 관례 등에 따라 달라질 수 있다. 따라서, 본 용어들에 대한 정의는 본 명세서 전반에 걸친 내용을 토대로 내려져야 할 것이다. 명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성요소를 "포함"한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성 요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다.

본 발명에서 사용되는 모든 기술용어는, 달리 정의되지 않는 이상, 본 발명의 관련 분야에서 통상의 당업자가 일반적으로 이해하는 바와 같은 의미로 사용된다. 또한 본 명세서에는 바람직한 방법이나 시료가 기재되나, 이와 유사하거나 동등한 것들도 본 발명의 범주에 포함된다. 본 명세서에 참고문헌으로 기재되는 모든 간행물의 내용은 본 발명에 도입된다.

일 측면에서, 본 발명은 브라키스피라 하이오디센테리에(Brachyspira hyodysenteriae)의 세포벽 단백질 (BmpB)을 암호화하는 핵산 분자 및 M 세포 표적형 펩타이드 (CKS9)를 암호화하는 핵산 분자를 포함하는 재조합 벡터에 관한 것이다.

일 구현예에서, 상기 브라키스피라 하이오디센테리에의 세포벽 단백질 (BmpB)은 서열번호 2의 아미노산서열을 포함할 수 있다.

상기 M 세포는 소화장관의 소장 및 대장에 존재하는 상피세포로써 항원을 포집하여 하부 면역시스템에 전달하는 역할을 한다. 주로 소화장관의 면역기관인 파이어스 패치 (peyer`s patch)에 많이 분포되어 있다.

상기 M 세포 표적형 펩타이드인 CKS9은 박테리오파지를 이용한 파지디스플레이 기법을 통해 발견한 펩타이드 서열로써 M 세포에 특이적으로 결합하는 리간드 (ligand)이다. M 세포 표적형 펩타이드는 항원단백질에 결합되어 있을 때, 항원 단백질이 M세포를 통해 하부 면역시스템으로 항원을 전달하는 효율을 높여준다.

일 구현예에서, 본 발명의 벡터는 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 재조합 융합 단백질을 암호화하는 핵산 분자를 포함할 수 있다.

일 구현예에서, 본 발명의 벡터는 서열번호 2의 염기서열을 포함할 수 있다.

본 발명에서 상기 벡터의 제작 시, 상기 항체를 생산하고자 하는 숙주세포의 종류에 따라 프로모터(promoter), 종결자(terminator), 인핸서(inhancer) 등과 같은 발현 조절 서열, 막 표적화 또는 분비를 위한 서열 등을 적절히 선택하고 목적에 따라 다양하게 조합할 수 있다.

본 발명의 벡터는 플라스미드 벡터, 코즈미드 벡터, 박테리오 파아지 벡터 및 바이러스 벡터 등을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 적합한 발현벡터는 프로모터, 오퍼레이터, 개시코돈, 종결코돈, 폴리아데닐화 시그널 및 인핸서 같은 발현 조절 엘리먼트 외에도 막 표적화 또는 분비를 위한 시그널 서열 또는 리더 서열을 포함하며 목적에 따라 다양하게 제조될 수 있다. 벡터의 프로모터는 구성적 또는 유도성일 수 있다. 상기 시그널 서열에는 숙주가 에쉐리키아속(Escherichia sp.)균인 경우에는 PhoA 시그널 서열, OmpA 시그널 서열 등이, 숙주가 바실러스속(Bacillus sp.)균인 경우에는 α-아밀라아제 시그널 서열, 서브틸리신 시그널 서열 등이, 숙주가 효모(yeast)인 경우에는 MFα 시그널 서열, SUC2 시그널 서열 등이, 숙주가 동물세포인 경우에는 인슐린 시그널 서열, α-인터페론 시그널 서열, 항체 분자 시그널 서열 등을 이용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한 벡터는 벡터를 함유하는 숙주 세포를 선택하기 위한 선택 마커를 포함할 수 있고, 복제 가능한 벡터인 경우 복제 기원을 포함한다.

일 측면에서, 본 발명은 본 발명의 벡터가 숙주세포에 형질전환된 재조합 세포주에 관한 것이다.

일 구현예에서, 상기 숙주세포는 기탁번호 KCTC13713BP의 숙주세포 BL21/pET-M-bmpB일 수 있다.

일 구현예에서, 상기 숙주세포는 박테리아 또는 동물세포일 수 있으며, 동물 세포주는 CHO 세포, HEK 세포 또는 NSO 세포일 수 있고, 박테리아는 대장균일 수 있다.

일 구현예에서, 상기 재조합 세포주는 본 발명의 재조합 융합 단백질을 암호화하는 핵산 분자를 포함하는 벡터가 형질전환된 대장균주일 수 있다.

본 발명에 따른 상기 벡터를 적절한 숙주세포, 예를 들어, 대장균 또는 효모 세포 등에 형질전환시킨 후, 형질전환된 숙주세포를 배양함으로써 본 발명에 따른 재조합 융합 단백질을 대량 생산할 수 있다. 숙주세포의 종류에 따른 적절한 배양 방법 및 배지 조건 등은 당해 분야의 통상의 기술자에게 알려진 공지 기술로부터 당업자가 용이하게 선택할 수 있으나, 일 실시예에서, 본 발명의 벡터를 대장균에 형질전환시킨 후, 대량 배양하여 재조합 융합 단백질을 최적 생산할 수 있는 조건을 확립하였다. 상기 숙주세포는 대장균(E. coli) 또는 바실러스 서브틸러스(Bacillus subtilis)와 같은 원핵 생물일 수 있다. 또한, 사카로마이세스 세르비시아(Saccharomyces cerevisiae)와 같은 효모, 곤충 세포, 식물 세포, 동물 세포로부터 유래한 진핵 세포일 수 있다. 또한, 상기 동물 세포는 자가 또는 동종 이계 동물 세포일 수 있다. 상기 숙주세포로의 벡터 도입 방법은 당업자에게 공지된 어느 방법을 사용해도 무방하다.

일 측면에서, 본 발명은 브라키스피라 하이오디센테리에의 세포벽 단백질 (BmpB) 및 M 세포 표적형 펩타이드 (CKS9)가 결합된 재조합 융합단백질을 포함하는 돼지 적리균 감염증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.

일 측면에서, 본 발명은 브라키스피라 하이오디센테리에의 세포벽 단백질 (BmpB) 및 M 세포 표적형 펩타이드 (CKS9)가 결합된 재조합 융합단백질을 포함하는 돼지 적리 치료 또는 예방용 백신 조성물에 관한 것이다.

일 구현예에서, 본 발명의 백신 조성물은 점막점착성 고분자담지체를 추가로 포함할 수 있다.

일 구현예에서, 상기 점막점착성 고분자담지체는 HPMCP (Hydroxypropyl methylcellulose phthalate), 유드라짓 L-100(Eudragit L-100), 유드라짓 S-10D(Eudragit S-10D) 및 셀룰로즈 아세테이트 프탈레이트(Cellulose acetate phthalate)일 수 있으며, HPMCP인 것이 가장 바람직하다.

일 구현예에서, 본 발명의 재조합 융합단백질이 점막점착성 고분자담지체에 담지될 수 있다.

일 구현예에서, 본 발명의 재조합 융합단백질은 M 세포 표적형 펩타이드 (CKS9)가 브라키스피라 하이오디센테리에의 세포벽 단백질 (BmpB)의 앞쪽에 위치하도록 결합된 단백질일 수 있다.

일 구현예에서, 상기 백신은 불활화 백신일 수 있으며, 경구용일 수 있다.

일 구현예에서, 본 발명의 백신 조성물은 소장에서 항원인 본 발명의 재조합 융합단백질을 방출할 수 있다.

일 구현예에서, 본 발명의 백신 조성물은 면역강화제(아쥬반트)를 추가로 포함할 수 있다.

본 발명에서 상기 아쥬반트는 면역반응의 향상 및/또는 접종 후 흡수 속도를 촉진하는 화합물 또는 혼합물을 칭하는 것으로 임의의 흡수-촉진제를 포함한다. 허용가능한 아쥬반트는 프로인트 완전아쥬반트, 프로인트 불완전아쥬반트, 사포닌, 미네랄 젤 예컨대 수산화 알루미늄, 계면활성제 예컨대 리소레시틴, 플루론 폴리올, 다중음이온, 펩타이드,오일 또는 탄화수소 에멀전, 키홀림펫 헤모시아닌, 디니트로페놀, 등을 포함하나, 이로 제한되는 것은 아니다.

본 발명에서 불활화 백신 조성물은 죽은 세포주 또는 이의 활성 성분을 포함하는 조성물을 의미하는 것으로, 상기 조성물을 포함하는 백신은 당업계에 알려져 있는 방법에 의해 제조될 수 있다. 예를 들어, 백신 세포주가 높은 역가로 증식되면, 이를 수득한 후 이들을 포르말린, 베타프로프리오락톤(BPL), 이성분 에틸렌이민(BEI) 또는 감마선으로 처리하거나, 당업자에게 공지된 기타 방법에 의해 비활성화시킨다. 이어서 비활성화된 세포주를 제약상 허용 가능한 캐리어 (예컨대 염수 용액) 및 임의의 보조제와 함께 혼합한다. 바람직하게는 최종농도 0.2% 포름알데히드에서 불활화한 것일 수 있다.

본 발명에서 사용된 용어 "백신"은 동물에서 면역학적 반응을 유도하는 적어도 하나의 면역학적으로 활성인 성분을 함유하는 약학적 조성물을 의미한다. 백신의 면역학적으로 활성인 성분은 살아있는 세포주 또는 죽은 세포주의 적절한 요소를 함유할 수 있고 (서브유닛 백신), 이에 의해 이들 요소는 전체 세포주 또는 이의 성장 배양물을 파괴하고, 이어서 원하는 구조물(들)을 수득하는 정제 단계에 의해, 또는 제한되는 것은 아니지만 바이러스, 박테리아, 곤충, 포유동물 또는 다른 종과 같은 적절한 시스템의 적절한 조작에 의해 유도된 합성과정 및 이어서 단리 및 정제과정에 의해, 또는 적절한 약학적 조성물을 사용하여 유전자 물질의 직접적인 혼입에 의한 백신을 필요로하는 동물에서 상기 합성 과정의 유도에 의해 (폴리뉴클레오타이드 백신화)제조된다. 백신은 상기 기술된 요소의 하나 또는 동시에 하나 이상을 포함할 수 있다.

상기 백신은 당업계에 알려진 임의의 형태, 예를 들면, 액제 및 주사제의 형태 또는 현탁액에 적합한 고체 형태일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 이러한 제제는 또한 리포좀이나 가용 유리 내로 유화 또는 캡슐화되거나 에어로졸이나 스프레이 형태로도 제조될 수 있다. 이들은 경피 (transdermal) 팻치에 함유시킬 수도 있다. 액제 또는 주사제의 경우, 필요시 프로필렌 글리콜 및 용혈 현상을 방지하는데 충분한 양 (예: 약 1%)의 염화나트륨을 함유할 수 있다.

본 발명의 백신조성물은 필요에 따라 기술분야의 당업자에게 공지된 방법, 예를 들면 근육, 피하, 복강, 정맥, 경구, 진피, 또는 안구 접종될 수 있으며, 경구 투여인 것이 가장 바람직하다.

백신에 적합한 담체는 기술분야의 당업자에게 공지되어 있으며, 단백질, 당 등을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기의 담체는 수용액, 또는 비-수용액, 현탁액 또는 에멀젼일 수 있다. 면역원성을 증가시키기 위한 면역보조제로서 정형 또는 비정형 유기 또는 무기 고분자등이 사용될 수 있다. 면역보조제는 일반적으로 항원에 대한 화학적 물리적 결합을 통해 면역반응을 촉진시키는 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 면역 조성물은 다양한 보조제와 면역반응 촉진 첨가물의 조합에 의해 최적의 면역반응 유도를 위한 조성으로 사용될 수 있다. 또한 백신에 추가될 있는 조성물로는 안정제, 불활화제, 항생제, 보존제, 등이 사용될 수 있다. 백신의 투여 경로에 따라 백신 항원은 증류수, 완충용액 등과도 혼합하여 사용될 수 있다.

본 발명에서, 용어 "예방"이란 본 발명에 따른 조성물의 투여에 의해 돼지 적리균 감염증의 발생, 확산 및 재발을 억제 또는 지연시키는 모든 행위를 의미한다.

본 발명에서 사용된 용어 "치료"란 본 발명에 따른 조성물의 투여로 돼지 적리균 감염증 및 이로 인한 합병증의 증세를 호전시키거나 이롭게 변경하는 모든 행위를 의미한다. 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면, 대한의학협회 등에서 제시된 자료를 참조하여 본원의 조성물이 효과가 있는 질환의 정확한 기준을 알고, 개선, 향상 및 치료된 정도를 판단할 수 있을 것이다.

본 발명의 조성물의 치료적으로 유효한 양은 여러 요소, 예를 들면 투여방법, 목적부위, 돼지 개체의 상태 등에 따라 달라질 수 있다.

본 발명의 약학적조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명에서 사용되는 용어, "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분하며 부작용을 일으키지 않을 정도의 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 돼지 개체의 건강상태, 감염증의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 방법, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 배합 또는 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고, 종래의 치료제와 순차적으로 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기한 요소들을 모두 고려하여, 부작용없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.

일 구현예에서, 상기 약학 조성물은 경구형 제형, 외용제, 좌제, 멸균 주사용액 및 분무제를 포함하는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 제형일 수 있다.

본 발명의 조성물은 또한 생물학적 제제에 통상적으로 사용되는 담체, 희석제, 부형제 또는 둘 이상의 이들의 조합을 포함할 수 있다. 약학적으로 허용 가능한 담체는 조성물을 생체 내 전달에 적합한 것이면 특별히 제한되지 않으며, 예를 들면, Merck Index, 13th ed., Merck & Co. Inc. 에 기재된 화합물, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로스 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 이용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한, 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주이용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다. 더 나아가 당 분야의 적정한 방법으로 또는 Remington's Pharmaceutical Science(Mack Publishing Company, Easton PA, 18th, 1990)에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화할 수 있다.

본 발명의 조성물에 추가로 동일 또는 유사한 기능을 나타내는 유효성분을 1종 이상 함유할 수 있다. 본 발명의 조성물은, 조성물 총 중량에 대하여 상기 단백질을 0.0001 내지 10 중량 %로, 바람직하게는 0.001 내지 1 중량 %를 포함한다.

본 발명의 약학 조성물은 약학적으로 허용 가능한 첨가제를 더 포함할 수 있으며, 이때 약학적으로 허용 가능한 첨가제로는 전분, 젤라틴화 전분, 미결정셀룰로오스, 유당, 포비돈, 콜로이달실리콘디옥사이드, 인산수소칼슘, 락토스, 만니톨, 엿, 아라비아고무, 전호화전분, 옥수수전분, 분말셀룰로오스, 히드록시프로필셀룰로오스, 오파드라이, 전분글리콜산나트륨, 카르나우바 납, 합성규산알루미늄, 스테아린산, 스테아린산마그네슘, 스테아린산알루미늄, 스테아린산칼슘, 백당, 덱스트로스, 소르비톨 및 탈크 등이 사용될 수 있다. 본 발명에 따른 약학적으로 허용 가능한 첨가제는 상기 조성물에 대해 0.1 중량부 내지 90 중량부 포함되는 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 조성물은 목적하는 방법에 따라 비 경구 투여(예를 들어 정맥 내, 피하, 복강 내 또는 국소에 적용)하거나 경구 투여할 수 있으며, 경구 투여 하는 것이 가장 바람직하다. 투여량은 돼지 개체의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설률 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양하다.

본 발명의 조성물의 경구 투여를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데, 통상적으로 사용되는 단순 희석제인 물, 액체 파라핀 이외에 다양한 부형제, 예컨대 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 함께 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성 용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제 등이 포함된다.

일 측면에서, 본 발명은 (a) 제 5항의 재조합 세포주를 배양하여 브라키스피라 하이오디센테리에의 세포벽 단백질 (BmpB) 및 M 세포 표적형 펩타이드 (CKS9)가 결합된 재조합 융합단백질을 생산하는 단계; (b) 고분자 담지체를 제조하는 단계; 및 (c) 상기 단계 (a)의 재조합 융합 단백질을 점막점착성 고분자담지체에 담지하는 단계를 포함하는, 돼지 적리 예방용 백신의 제조방법에 관한 것이다.

일 측면에서, 본 발명은 백신 조성물을 돼지에게 경구투여하는 것을 포함하는 돼지 적리균에 대해 돼지를 면역화시키는 방법에 관한 것이다.

상기 면역화는 백신 조성물 또는 이를 포함하는 백신 중에 포함된 항원 또는 항원들에 대해 특이적으로 지시된 항체, B 세포, 헬퍼 T 세포, 서프레서 T 세포, 세포독성 T 세포 및 감마-델타 T 세포의 생산 또는 활성화, 숙주에서 치료학적 또는 보호 면역학적 반응을 나타내어 새로운 감염에 대한 내성이 증진되거나 질환의 임상적 중증도가 감소되는 효과중 하나 이상을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 바람직하게는 보호 면역 반응일 수 있다.

상기 보호는 감염된 숙주가 통상적으로 나타내는 임상적 징후의 감소 또는 부재, 보다 신속한 회복 시간 또는 보다 낮아진 지속시간 또는 낮아진 치사율에 의해 입증된다.

상기 면역 유효량은 면역 반응을 유도하여 돼지 적리의 빈도수 또는 이의 중증도를 감소시킬 수 있는 백신의 양을 의미하며, 당업자라면 적절하게 선택할 수 있다.

하기의 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 그러나 하기 실시예는 본 발명의 내용을 구체화하기 위한 것일 뿐 이에 의해 본 발명이 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1> M-BmpB 발현용 벡터 제작

돼지에 대장의 염증과 혈액성 하리를 일으키는 전염병인 돼지적리(Swine dusentery)를 유발하는 원인균인 브라키스피라 하이오디센테리에(Brachyspira hyodysenteriae)의 세포벽 단백질(BmpB)을 항원단백질로 선별하여, M 세포 표적형 펩타이드인 CKS9를 연결한 단백질 (M-BmpB)을 대장균에서 생산할 수 있도록 발현 벡터를 제작하였다. 구체적으로, 브라키스피라 하이오디센테리의 세포벽 단백질을 PCR을 통해 유전자를 확보한 후 대장균 발현벡터인 pET21a (도 1)에 Nde I 및 Xho I 제한효소를 사용하여 연결하였다 (pET-BmpB). 그 후, M 세포 표적형 펩타이드인 CKS9의 염기서열을 확인한 후 BmpB와 마찬가지로 PCR을 통해 유전자를 확보한 뒤, NdeI 및 XbaI 제한효소를 사용하여 pET-BmpB 벡터에서 CKS9의 염기서열이 BmpB 염기서열 앞쪽에 위치하도록 연결하여, pET21a 벡터에 M 세포 표적형 펩타이드인 CKS9 및 BmpB 항원단백질이 연결된 pET-M-BmpB 벡터를 완성하였다 (도 2).

<실시예 2> 항원 단백질 M-BmpB의 생산

2-1. 배양 시간에 따른 항원 단백질 발현 최적화

백신균주인 M 세포 (서울대학교 조종수교수님 연구실) 표적 펩타이드(CKS9) 결합형 BmpB 단백질 (M-BmpB)의 발현 최적화 조건을 확립하기 위해, 상기 pET-M-BmpB 벡터로 형질전환된 재조합 E.coli를 플라스크에서 배양하면서 배양 시간에 따른 M-BmpB 발현 정도를 확인하였다. 구체적으로, pET-M-BmpB 벡터를 발현하는 재조합 E.coli 스탁을 LB agar(BD, France)+ ampicillin 50ug/ml 플레이트에 스트리킹한 뒤 37℃ 배양기 (JSR, Korea)에서 하룻밤 동안 배양한 후, 싱글 콜로니를 10ml LB (BD, France)+ ampicillin 50ug/ml 배지에 접종하여 37℃ 진탕배양기에서 200rpm으로 하룻밤 동안 배양하였다. 500ml 플라스크에 LB 200ml(BD, France)+ ampicillin 50ug/ml 배지를 넣고, 상기 전-배양균 10ml을 접종하여 2시간 30분동안 배양한 뒤 OD600값<0.7 임을 확인하여 IPTG를 최종농도 1mM이 되도록 첨가하여 단백질 발현을 유도하였다 (표 1). IPTG 유도 후 1H, 3H, 5H 및 8H에 5ml씩 샘플링하여 3ml을 원심분리하여 세포 펠렛을 수득한 뒤 1x PBS로 재현탁하여 초음파 파쇄(sonication)를 5분 (30%, on 10초, off 15초) 동안 실시하였다. 그 후, 원심분리 (13,000rpm, 15분, 4℃)를 수행한 뒤 상층액만 분리하여 새 1.5ml 마이크로 튜브에 옮겨담아 발현 단백질을 정량하고 표적 단백질을 6x his 항체를 사용하여 웨스턴 블롯 분석을 수행하여, 표적 단백질인 M-BmpB의 발현을 확인하였다.

배양시간	OD	온도 (℃)	rpm	비고
0H	0.065	37	200
2.5H	0.667	37	200	IPTG 1mM induction
3.5H	1.516	37	200	induction 1H
5.5H	3.673	37	200	induction 3H
7.5H	4.46	37	200	induction 5H
10.5H	5.71	37	200	induction 8H

그 결과, IPTG 유도 1H, 3H 및 5H까지는 M-BmpB의 발현이 시간 의존적으로 증가하였으나, 8H에는 오히려 감소하는 것으로 나타나, 항원 단백질 M-BmpB의 발현의 최적화를 위한 IPTG 유도 시간은 3H 내지 8H인 것으로 나타났다 (도 3).

2-2. 배지 조건에 따른 항원 단백질 발현 최적화

항원 M-BmpB의 대량 발현을 위한 배양 조건을 확립하기 위해, 시중에 판매되는 LB 배지, pH5 또는 pH7의 생산 배지 (1 L 기준으로 glucose 10g, Yeast extract 10g, KH₂PO₄ 13.5g, MgSO₄·7H₂O 1.4g)를 이용하여, 4L 발효기(fermentor)에서 M-BmpB 항원을 대량 배양하였다. 구체적으로, M-BmpB 항원을 발현하는 재조합 E.coli를 10ml LB (BD, France) + ampicillin 50ug/ml를 넣은 50ml 튜브 3개에 접종한 뒤, 37℃ 진탕배양지에서 하룻밤 동안 배양한 후, 100ml LB (BD, France) + ampicillin 50ug/ml 및 100ml 생산배지 + ampicillin 50ug/ml가 각각 들어 있는 플라스크에 10ml씩 각각 접종하여 37℃ 진탕배양기에서 배양하였다. 배양 시간별로 OD600 값을 측정한 후 LB 배지 및 pH5의 생산배지 (생산배지 1)는 OD600값 0.5∼0.7 일 때, IPTG 1mM을 처리하였고, pH7의 생산배지 (생산배지 2)는 OD600값이 1.0 정도일 때 IPTG 1mM을 처리하여 항원 단백질 M-BmpB의 발현을 유도하였다. 각 배양액의 IPTG 유도는 0H, 3H 또는 8H 동안 진행한 뒤 샘플링하여 단백질 발현량을 상기 실시예 2-1에서와 같이 웨스턴 블롯 분석으로 비교하였다.

그 결과, LB 배지와 생산 배지에서의 균 성장량과 단백질 발현량을 비교하였을 때, 생산 배지가 3배 정도 발현량이 많은 것으로 나타났다 (도 4). 또한, 생산 배지의 pH 별 단백질 발현량은 pH7.0의 생산 배지 2배 정도 많은 것으로 나타났다. 따라서, 5L 발효기와 같이, 대량 생산 (배양) 시에는 pH 7.0의 생산 배지를 사용하는 것이 표적 항원 단백질인 M-BmpB 생산에 최적인 것을 알 수 있었다.

2-3. 항원 단백질 대량 배양

5L 발효기를 이용하여 표적 항원 단백질인 M-BmpB를 대량 생산하기 위해, M-BmpB 발현하는 재조합 E.coli를 LB (BD, France) 아가 + ampicillin 50ug/ml 플레이트에 스트리킹하고 37℃ 배양기 (JSR, Korea)에서 하룻밤 동안 배양한 후, 싱글 콜로니를 40ml LB (BD, France) + ampicillin 50ug/ml에 접종하여 37℃ 진탕배양기에서 하룻밤 동안 배양하였다. 그 후, 이를 360ml LB (BD, France)+ ampicillin 50ug/ml에 접종한 뒤 37℃ 진탕배양기에서 2시간 동안 배양하다가, OD600값이 1.0이상이 되었을 때, 4L LB (BD, France)+ ampicillin 50ug/ml이 담긴 5L 발효기에 400ml을 접종하였다. 이 때, 1N NaOH 및 0.5N HCl을 첨가여 pH7.0을 유지하도록 하였으며, 스터러(stirrer) RPM을 조절하여 산소포화도가 20% 전후를 유지하도록 배양하였다. 배양 중 1시간 단위로 OD600, 온도, pH, 산소포화도 및 글루코즈 농도를 측정하였다. 시간별로 측정한 글루코즈 농도가 0에 가까워졌을 때를 균의 성장이 최대치로 판단하여 IPTG를 1mM 처리하고 27℃에서 배양함으로써 항원 단백의 발현을 최대로 유도하였다. 배양이 진행됨에 따라 pH가 조금씩 낮아져, 1N NaOH를 첨가하여 pH를 7.0으로 조절하면서 배양을 진행하였다. 그 결과, 최대 OD600값이 10.49까지 측정되었다.

2-4. 항원 단백질 정제

2-4-1. 암모늄 설페이트 침전

표적 항원 단백질인 M-BmpB를 정제하기에 앞서 불순물을 제거하기 위해 암모늄 설페이트(ammonium sulfate) 침전을 수행하였다. M-BmpB 발현하는 재조합 E.coli를 파쇄 후 확보한 총 단백질에 암모늄 설페이트를 각각 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80 또는 90 %가 되도록 첨가한 뒤, 침전물 및 상등액을 각각 SDS-PAGE 분석하여, M BmpB가 침전되는 암모늄 설페이트 농도를 확인하였다. 그 결과 M BmpB는 암모늄 설페이트 농도 30%부터 침전되기 시작하여 70% 농도에서 모두 침전되는 것을 알 수 있었다 (데이터 미도시). 이에, 항원 단백질 정제시 30% 암모늄 설페이트를 첨가하여 침전되는 불순물을 제거한 뒤 상등액에 다시 70%가 되도록 암모늄 설페이트를 첨가하여 침전되는 단백질을 수득하였다. 암모늄 설페이트를 제거하기 위해 침전된 총 단백질을 PBS 버퍼로 재부유한 뒤 anion exchange chromatography 정제버퍼인 20mM Tris-HCl(pH7.2) 2L로 dialysis 하였다.

2-4-2. Anion Exchange chromatography 정제

M BmpB protein의 PI 값이 4.75 인 것을 확인한 뒤 anion-exchange chromatography를 수행하였다. Chromatography는 GE사의 AKTA pure기기로 진행하였고, column은 Hi trap Q FF, 5ml (GE)을 사용하였다. Anion-exchange column에 total protein loading 한 뒤 250mM NaCl buffer에서 elution되는 M-BmpB protein을 확보하였다.

2-4-3. affinity chromatography 정제

더 순도 높게 M BmpB protein을 정제하기 위해 affinity 정제를 수행하였다. M BmpB는 histidine tagging된 단백질로 GE사의 His trap FF column을 이용하여 정제 진행하였다. 1차 정제로 anion exchange chromatography 정제 한 protein을 His trap FF column에 loading한 뒤 500 mM imidazole 버퍼로 용출하였다. 그 결과 크로마토그램 상에서 용출된 단백질 피크를 확인하였고, 이를 SDS-PAGE 및 웨스턴 블롯 분석 방법으로 확인하였다 (도 5).

2-5. 정제된 항원단백질 순도 확인

상기 실시예 2-4에서 정제한 M BmpB 단백질의 순도를 확인하기 위해, GE사의 superose 6 increase 5/150 GL 컬럼을 사용하여 젤 투과 크로마토그래피(gel filtration chromatography)를 수행하였다.

그 결과, 그로마토그램 상에서 단일 단백질 피크를 확인하였으며, 순도는 99.7%임을 알 수 있었다 (도 6).

<실시예 3> 백신 제조

3-1. HPMCP-시스테인 고분자 전달체 합성

HPMCP(Hydroxypropyl methylcellulose phthalate) 55 (4g)을 유기용매인 DMSO(dimethyl sulfoxide) 60ml에 녹인 뒤 활성화제인 DCC (N,N’-dicyclohexylcarbodiimide)(4.87g)/ NHS (N-hydroxyl succinimide)(2.71g)를 각각 DMSO 30ml과 DMSO 15ml에 녹인 후 실온에서 24시간 동안 반응시키며 HPMCP의 카르복실그룹을 활성화시켰다. 그 후, DMSO에 용해된 시스테인 0.461g을 첨가하여 48시간 동안 반응시켜 HPMCP와 시스테인 간의 아마이드 결합을 유도하여 HPMCP-시스테인(Cysteine)를 합성하였다. 산소에 의한 불필요한 반응 배제를 위해 각 과정은 질소가스 공급 하에 진행되었다. 그 후, 미반응 시스테인의 제거를 위해 DMSO 4L에 투석한 뒤, 잔존 DMSO는 D.W.(distilled water) 4L에 3일간 수 차례 투석하여 제거하였다. 투석 완료 후 합성된 HPMCP-시스테인은 동결건조를 통해 분말 상태로 얻었다 (도 7의 왼쪽 튜브). 합성된 HPMCP-시스테인 고분자는 ¹H NMR(Nuclear magnetic resonance)을 통하여 검증하였다. 그 결과, 11.4mol%의 티오(thio) 그룹이 HPMCP 고분자에 도입된 것을 확인할 수 있었다.

3-2. 이눌린-아세테이트 고분자 합성

이눌린(Inulin)은 글루코즈 하나에 프럭토즈(fructose) n개가 연결된 다당체이다. 각 당 단위의 첫 번째 수산화기에 아세트산무수물(acetic anhydride)을 반응시키면 이눌린 아세테이트 (IN-AC)가 합성된다. 이를 위해, 구체적으로, α-이눌린 1g을 DMF(Dimethyformamide) 5ml에 녹이고 촉매제로 5% 아세트산 나트륨 (NaOAc) 0.2ml을 첨가하였다. 질소 가스를 채워넣어 용기안에 공기를 모두 제거하고 아세트산무수물(acetic anhydride) 10ml을 첨가하였다. 40℃에서 24시간 동안 교반하여 반응시키고 투석망에 넣어 증류수로 투석하여 유기 용매를 제거하였다. 투석을 4℃에서 24시간 동안 진행한 후 동결건조하였다 (도 7의 오른쪽 튜브). 이 후, H-NMR을 통해 이눌린의 프럭토즈의 첫 번째 수산화기가 아세틸기로 치환되었으며, 이눌린에 아세틸기가 약 80.8%가 도입 (프럭토즈 1000개 중 808개의 첫 번째 수산화기가 아세틸기로 치환)된 것을 확인하였다.

3-3. 항원 단백질의 점막점착성 고분자 담지

항원 단백질인 M BmpB를 담지하는 점막점착성 고분자 미립자는 W/O/W(water-in-oil-in-water) 이중 에멀전 방법(double emulsion method)을 이용하여 형성하였다. 첫 번째 수용상은 DW에 용해된 항원 단백질 M BmpB (50mg/ml), 오일상은 점막점착성 고분자가 용해되어있는 DCM(dichloromethane), 및 안정제는 Pluronic F-127을 사용하여 제 1 에멀전을 형성하였고, 2차 수용상은 1%(w/v) PVA[poly(vinyl alcohol)]을 사용하여 Ultra Turrax homogenizer(11,000 rpm)으로 미립자를 제조하였다. 최종 W/O/W 에멀전은 4시간 동안 실온에서 DCM을 휘발시킨 뒤, 원심분리하여 상층액 제거 후 동결 건조를 진행하여 생성하였다. SEM을 이용하여 최종 형성된 M-BmpB 항원 단백질이 담지된 HPMCP-시스테인의 형태를 관찰한 결과, 크기가 1 내지 10um 정도인 구형 모양의 미세입자(microparticle)가 형성된 것을 확인할 수 있었다 (도 8).

<실시예 4> 항체가 확인

4-1. 목적 동물에서의 항체가 확인

공격접종 균주로 농림축산검역본부 수의유전자원(KVCC)에서 분양받은 브라키스피라 하이오디센테리에 (KVCC-BA1200229, 돈적리균)를 이용하였다. 돈적리 균은 강한 용혈성을 보이는 혐기성 균주이므로, 배지는 혈액 아가 플레이트(Blood agar plate) (한일코메드)를 사용하여, anaerobic condition pouch (BD)에서 혐기성 조건으로 배양하였다. 공격 접종 시 균주의 생균수는 1x10⁸ cfu/ml로 2ml씩 경구투여하였다 (구체적인 시험 스케줄은 도 15에 도시하였다.).

한편, 목적 동물 시험을 위해 랜드종 수컷돼지 3주령 12마리를 구입하여 입식하였고, anal swab 샘플링하여 PCR로 돈적리 균 감염여부를 확인하였다. 그 결과, 12마리 모두 PCR 밴드가 확인되지 않아 돈적리 균 음성인 것으로 확인하였다 (도 9). 상기 동물들은 입식 후부터 백신접종이 완료될 때까지 체중 및 체온 측정을 측정하였다. 돼지 입식 후 3주간 적응기간이 지난 후, 시험 백신을 5ml씩 경구투여하여 백신 접종을 수행하였다 (M-BmpB 항원을 장내까지 안전적으로 전달하여 장내에서 점막면역반응을 활성화시키는 것이 목적이므로, 일반적인 주사방식이 아닌 경구투여함). 시험 백신을 투여한 군은 대조군 (PBS 투여) 및 A, B 및 C 군이며, 여기에서, A군은 항원인 M-BmpB과 이눌린-아세테이트가, B군은 항원인 M-BmpB과 HPMCP가 혼합된 백신 투여군이고, C군은 M-BmpB 및 PBS를 혼합한 아쥬반트(adjuvant)의 효과를 확인하기 위한 대조군 백신 투여군이다 (표 2). 상기 각 시험 백신들은 제조완료 후 티오글라이콜레이트 배지(Thioglycollate broth), 영양 배지(nutrient broth) 및 아가 배지를 사용하여 진균, 혐기성균, 호기성균 (예컨대, Clostridium sporogenes, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Aspergillus brasiliensis, Bacillus subtilis, Candida albicans 등)의 검출 여부를 통해 무균시험을 진행한 백신들이다 (도 10). 백신 접종 후 1주 경과하여 채혈한 뒤 1주 후에 2차 접종하는 식으로 진행하였으며, 대조군과 A, B 및 C군은 3차 접종까지 진행하였다. 백신접종 후 이상징후를 확인하기 위해 일주일 기간으로 체온, 체중, 설사유무를 측정하였으나, 접종 후 모든 군에서 임상증상이 나타나지 않았으며, 체온도 정상범위를 유지하고, 백신 접종 후 체중 감소, 설사는 물론 다른 특이점은 확인되지 않았다. 시험 백신 최종 접종이 완료되고 1주 후 채혈한 혈청까지 확보한 뒤, 백신 접종 전/후 혈청으로 M-BmpB에 대한 IgG 항체가를 indirect ELISA로 확인하였다.

군	항원	adjuvant	접종량	접종밥법	n
대조군	PBS	-	5ml	PO	2
A	BmpB	inulin	5ml	PO	2
B	BmpB	HPMCP	5ml	PO	2
C	BmpB	PBS	5ml	PO	2

그 결과, M-BmpB 항원을 HPMCP에 담지한 백신을 경구투여로 3차접종까지 진행한 B 군은, 3차 접종한 후 IgG 항체가가 백신 접종 전에 비해 약 2배 상승한 것으로 나타났으며, 이 결과는 p value가 0.05 이하로 계산되어 유의한 것으로 판단된다 (도 11).

또한, M-BmpB 항원을 이눌린에 담지한 백신을 경구투여로 3차 접종까지 진행한 A 군은, 3차 접종한 후 IgG 항체가가 백신접종 전에 비해 약 1.5배 상승한 것으로 나타났으나, 이 결과는 p value가 0.05 이상으로 계산되어 유의하지 않은 결과인 것으로 판단된다 (도 12).

아울러, M-BmpB 항원만 있는 백신을 경구투여로 3차 접종까지 진행한 C 군은, 3차 접종한 후 IgG 항체가가 백신접종 전 항체가에 비해 거의 상승하지 않은 것으로 나타나 (도 13), 항원이 안정적으로 소장으로 전달되지 않은 것으로 판단되며, 이 결과는 p value이 0.05 이하로 계산되어 유의한 결과인 것으로 판단된다.

4-2. 방어능 형성 확인

상기 표 2의 돼지군들에 돈적리 야외균주를 1x10⁸ cfu로 접종한 뒤, 10일 동안 폐사, 설사 증상 및 소장 내 출혈 (설사증상시 부검하여 확인)을 확인함으로써 본 발명의 백신에 대한 방어능 형성 여부를 확인하였다.

그 결과, B 군에서는 공격접종 이후에도 설사를 비롯한 임상증상이 확인되지 않았고, 부검 시 소장에서 충혈 및 출혈이 확인되지 않았다. 또한, 모든 그룹에서 폐사가 발생하지 않았으나, 대조군, A 군 및 C 군에서는 공격접종 이후 1주일이내에 설사를 시작하였으며 (표 3), 부검 시 소장내에서 충혈 및 출혈이 있음을 확인할 수 있었다 (표 4 및 도 14).

이는 돈적리의 일반적인 증상으로 공격 접종한 균주로 인해서 증상이 나타난 것으로 판단되며, 이눌린 및 항원만으로는 소장내에서 점막 면역을 효과적으로 유도하지 못하는 것을 확인할 수 있었다.

이를 통해, M-BmpB 항원 단백질만을 경구투여시 백신의 효과를 확인할 수 없으나, 점막점착성 고분자담지체인 HPMCP가 안정성있게 소장까지 항원을 전달하여 소장과 회장내에서 점막면역을 활성화하는 것을 확인할 수 있었다. 이는 소장에 직접 항원을 방출하는 백신의 특성으로 돈적리 질병에 대한 우수한 방어 효과가 있음을 의미한다.

기탁기관명 : 한국생명공학연구원

수탁번호 : KCTC13713BP

수탁일자 : 20181113

<110> WOOGENE B&G CO., LTD. <120> VACCINE COMPOSITION FOR TREATING OR PREVENTING SWINE DUSENTERY <130> PN1808-302 <160> 2 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 277 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> M-BmpB <400> 1 Met Ala Cys Lys Ser Thr His Pro Leu Ser Cys Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 10 15 Leu Glu Gly Asn Thr Ser Ser Gly Asp Gln Lys Ile Val Lys Val Gly 20 25 30 Phe Ala Gly Glu Ser Asp Tyr Gln Ile Trp Asp Pro Ile Val Ala Lys 35 40 45 Leu Ala Glu Glu Gly Ile Lys Val Glu Leu Val Ser Phe Ser Asp Tyr 50 55 60 Thr Ile Pro Asn Gln Ala Leu Asn Asp Gly Glu Ile Asp Leu Asn Ala 65 70 75 80 Phe Gln His Tyr Ala Tyr Phe Asn Asp Glu Val Ser Asn Lys Gly Tyr 85 90 95 Asp Leu Thr Ala Ile Ala Asp Thr Tyr Ile Ser Ala Met Asn Ile Tyr 100 105 110 Ser Thr Asn Ile Thr Asp Val Lys Glu Leu Lys Asn Gly Asp Lys Ile 115 120 125 Ala Ile Pro Asn Asp Pro Ser Asn Gly Gly Arg Ala Leu Lys Val Leu 130 135 140 Gln Ala Ala Gly Ile Ile Lys Val Lys Pro Glu Ala Gly Asp Thr Pro 145 150 155 160 Ser Val Ser Asp Ile Ile Glu Asn Pro Leu Asn Ile Glu Ile Val Glu 165 170 175 Met Asp Ala Gly Ala Ile Tyr Gly Val Leu Pro Asp Val Ala Cys Ala 180 185 190 Val Ile Asn Gly Asn Tyr Ala Ile Asp Phe Gly Leu Asn Pro Gly Ser 195 200 205 Asp Tyr Ile Phe Lys Asp Asp Pro Ser Ile Tyr Ser Gly Lys Ser Phe 210 215 220 Val Asn Leu Ile Ala Ala Arg Thr Lys Asp Lys Asp Asn Glu Leu Tyr 225 230 235 240 Lys Lys Val Val Glu Thr Tyr Gln Ser Glu Ile Val Glu Lys Val Tyr 245 250 255 Asn Glu Asn Phe Leu Gly Ser Tyr Leu Pro Thr Trp Lys Leu Glu His 260 265 270 His His His His His 275 <210> 2 <211> 810 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> M-BmpB <400> 2 catatggctt gtaaatcaac acatccactt tcatgtggtg gaggtggatc tctagaagga 60 aatacttctt ctggtgatca aaagatagtt aaagttggtt ttgctggaga gtctgattat 120 caaatttggg atcctatagt agctaaatta gctgaagaag gaattaaagt agagctagta 180 tctttctctg attatactat acctaatcag gctttgaatg acggagaaat tgacttgaat 240 gcttttcagc attatgcata ctttaatgat gaagtatcaa ataaaggata tgacttaact 300 gctattgctg atacttatat atctgctatg aatatttatt ctactaatat tactgatgta 360 aaagaattaa aaaacggcga taaaatagct atacctaatg acccttctaa tggaggaaga 420 gctttaaaag ttcttcaggc tgcaggaatc attaaagtaa aacctgaagc aggagatact 480 cctagcgtaa gcgatataat agaaaatcct ctaaatattg aaatagtaga aatggatgca 540 ggtgctattt acggtgttct tcctgatgtt gcttgtgctg ttatcaatgg aaactatgct 600 atagacttcg gtttgaatcc tggttctgat tatatattca aagatgatcc ttctatttac 660 agcggaaaat cttttgttaa tttaatagct gcaagaacta aagataaaga taatgaatta 720 tacaaaaaag ttgtagaaac ttatcaatct gaaatagtag aaaaagttta taatgaaaat 780 ttcttaggtt cttatcttcc tacttggaaa 810

Claims (16)

1. 삭제
2. 삭제
3. 삭제
4. 삭제
5. 삭제
6. 브라키스피라 하이오디센테리에의 세포벽 단백질 (BmpB) 및 M 세포 표적형 펩타이드 (CKS9)가 결합된 재조합 융합단백질을 포함하는 돼지 적리 치료 또는 예방용 백신 조성물로서, 상기 돼지 적리 치료 또는 예방용 백신 조성물은 점막점착성 고분자담지체로서 HPMCP (Hydroxypropyl methylcellulose phthalate)를 추가로 포함하며 상기 HPMCP는 시스테인으로부터 티올기가 도입되어 티올화 된 것이며, 상기 백신은 불활화 백신인 돼지 적리 치료 또는 예방용 백신 조성물.
7. 삭제
8. 제 6항에 있어서, 상기 백신은 경구용인 돼지 적리 치료 또는 예방용 백신 조성물.
9. 삭제
10. 삭제
11. 제 6항에 있어서, 재조합 융합단백질이 점막점착성 고분자담지체에 담지된 돼지 적리 치료 또는 예방용 백신 조성물.
12. 제 6항에 있어서, 재조합 융합단백질은 M 세포 표적형 펩타이드 (CKS9)가 브라키스피라 하이오디센테리에의 세포벽 단백질 (BmpB)의 앞쪽에 위치하도록 결합된 돼지 적리 치료 또는 예방용 백신 조성물.
13. 제 6항에 있어서, 소장에서 항원인 재조합 융합단백질을 방출하는 돼지 적리 치료 또는 예방용 백신 조성물.
14. 제 6항에 있어서, 면역강화제를 추가로 포함하는 돼지 적리 치료 또는 예방용 백신 조성물.
15. (a) 브라키스피라 하이오디센테리에(Brachyspira hyodysenteriae)의 세포벽 단백질 (BmpB)을 암호화하는 핵산 분자 및 M 세포 표적형 펩타이드 (CKS9)를 암호화하는 핵산 분자를 포함하는 재조합 벡터를 숙주세포에 형질전환된 재조합 세포주를 배양하여 브라키스피라 하이오디센테리에의 세포벽 단백질 (BmpB) 및 M 세포 표적형 펩타이드 (CKS9)가 결합된 재조합 융합단백질을 생산하는 단계;
    (b) 고분자 담지체로서 HPMCP (Hydroxypropyl methylcellulose phthalate)를 제조하는 단계; 및
    (c) 상기 단계 (a)의 재조합 융합 단백질을 점막점착성 고분자담지체에 담지하는 단계를 포함하는, 돼지 적리 예방용 백신의 제조방법으로 상기 백신은 불활화 백신인 돼지 적리 예방용 백신의 제조방법.
16. 제 6항의 백신 조성물을 돼지에게 경구투여하는 것을 포함하는 돼지 적리균에 대해 돼지를 면역화시키는 방법.

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