KR100933090B1 - 점착성 융합단백질 및 이를 이용한 가축의 설사증 예방또는 치료용 면역보조제 - Google Patents

Abstract

본 발명은 장 내벽에 점착하는 점착성 융합단백질, 이를 발현하는 형질전환체, 및 이의 용도에 관한 것으로, 보다 상세하게는 락토바실러스 브레비스의 표면 단백질의 전장 아미노산 서열(Accession No. CAA78618) 중 장 내벽에 점착하는 특징을 가진 31 내지 465 번째 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드, 및 설사증을 유발하는 항원에 특이적으로 결합하는 항체와 친화력을 가진 프로테인 A의 전장 아미노산 서열(Accession No. AAA73085) 중 101 내지 241 번째 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드를 포함하는 융합단백질, 및 상기 융합단백질을 발현하는 형질전환체, 및 이의 용도에 관한 것이다. 특히, 본 발명에 따른 점착성 융합단백질은 바이러스나 병원성 세균에 의한 가축의 설사증 예방, 개선, 또는 치료를 위한 면역보조제로서 유용하게 사용될 수 있다.

점착성 융합단백질, 설사증

Description

점착성 융합단백질 및 이를 이용한 가축의 설사증 예방 또는 치료용 면역보조제{ADHESIVE FUSION PROTEIN AND IMMUNOADJUVANT FOR PREVENTING OR TREATING LIVESTOCK DIARRHEA USING THE SAME}

본 발명은 장 내벽에 점착하는 점착성 융합단백질, 이를 발현하는 형질전환체, 및 이를 이용한 바이러스나 병원성 세균에 의한 가축의 설사증 예방, 개선, 또는 치료를 위한 면역보조제로서 용도에 관한 것이다.

가축의 설사증(Diarrhea)은 주로 바이러스나 또는 병원성 세균에 의한 감염으로 발생하게 되는데, 그 감염경로를 보면 바이러스나 병원성 세균이 가축의 경구를 통하여 감염된 후 소장점막에 부착하여 증식하고 장독소를 생성하며, 이렇게 생성된 독소가 장관내의 삼투압을 변화시켜 설사나 수분 손실에 의한 탈수증상, 및 심할 경우에는 사망케 한다.

이러한 설사증을 일으키는 병원성 세균은 두 가지의 주요한 병원성 인자 즉, 소장의 점막에 부착하여 세균의 증식을 유도하는 부착인자와, 증식한 세균이 생성하는 장독소로 나눌 수 있다. 일례로, 병원성 세균에 의한 돼지의 설사증은 우리나라뿐만 아니라, 전세계적으로 발생하고 있으며 각 지역에 따라 그 원인균의 특성 은 조금씩 다르지만, 앞에서 언급한 공통적인 병원성 인자를 가진다는 점에서는 동일한 특징을 가진다.

전세계적으로 바이러스 또는 병원성 세균에 의한 설사증의 예방을 위하여 백신을 통한 예방법이 사용되어 왔으며, 현재까지도 이 방법이 가장 광범위하게 사용되고 있다. 백신을 통한 예방법은 분만전의 어미 돼지에게 백신을 접종하여 어미돼지의 몸에 항체를 만들게 한 다음, 분만 후에 초유를 통하여 항체를 새끼돼지에게 전달함으로써 이루어지는 예방법으로, 이를 위해서는 효과적인 백신의 개발, 어미돼지의 항체 형성능, 및 새끼돼지에의 충분한 초유 급여 등이 요구되며, 특히 이러한 세가지 조건들 중 하나 혹은 그 이상에 문제가 발생할 경우, 세균성 설사증이 유발하게 되는 문제점을 안고 있다.

이러한 문제점을 해결하고자, 많은 연구자들은 좀 더 효과적인 백신 및 항체 개발에 주력하고 있으나, 백신 개발은 아직까지 뚜렷한 연구성과를 보이지 않고 있으며, 항체 개발은 혈청의 안전성 문제, 검사비용의 증가, 생산기간의 한계성 등에 의한 혈청의 가격 상승으로 실용성에 많은 문제점을 갖고 있다.

따라서, 이러한 문제점을 극복하기 위하여 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 바이러스나 병원성 세균에 의한 가축의 설사증을 예방, 개선, 또는 치료하는데 유용한 장 내벽에 점착하는 점착성 융합단백질을 제공하는 것이다.

또 다른 본 발명의 기술적 과제는, 상기 융합단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 발현벡터를 제공하는 것이다.

또 다른 본 발명의 기술적 과제는, 상기 발현벡터로 형질전환된 형질전환체를 제공하는 것이다.

또 다른 본 발명의 기술적 과제는, 면역보조제로서 상기 융합단백질, 및 설사증을 유발하는 항원 특이적인 항체를 포함하는, 가축의 설사증 예방, 개선, 또는 치료용 약학 조성물을 제공하는 것이다.

상기 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 락토바실러스 브레비스의 표면 단백질의 전장 아미노산 서열(Accession No. CAA78618) 중 장 내벽에 점착하는 특징을 가진 31 내지 465 번째 아미노산 서열을 가진 폴리펩티드, 및 상기 폴리펩티드의 아미노 말단 또는 카르복시 말단에 연결되며, 설사증을 유발하는 살모넬라 엔테리티디스(Salmonella enteritidis) 항원, 대장균(E. coli) 항원, 코로나 바이러스(Corona virus) 항원, 헬리코박터 파이로리(Helicobacter pylori) 항원 및 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus) 항원으로 이루어진 군으로부터 선 택된 1이상의 항원에 결합하는 항체와 친화력을 가진 프로테인 A의 아미노산 서열(Accession No. AAA73085) 중 101 내지 241 번째 아미노산 서열을 가진 폴리펩티드의 융합단백질을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 융합단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 발현벡터를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 융합단백질을 발현하는 형질전환체인 기탁번호 KCTC 11194BP인 균주를 제공한다.

또한, 본 발명은 면역보조제로서 상기 융합단백질, 및 설사증을 유발하는 살모넬라 엔테리티디스(Salmonella enteritidis) 항원, 대장균(E. coli) 항원, 코로나 바이러스(Corona virus) 항원, 헬리코박터 파이로리(Helicobacter pylori) 항원 및 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus) 항원으로 이루어진 군으로부터 선택된 1이상의 항원을 산란계에 면역시켜 생산된 난황항체 (IgY)를 포함하는, 설사증 예방, 개선, 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

표면 단백질(surface(S)-layer protein)은 통상적으로 40 내지 200 kDa 정도의 크기를 가진 단일 단백질 또는 당단백질의 서브유닛으로 이루어져 있으며, 반복적인 6각형, 4각형, 또는 선형 대칭으로 세포 표면에 정렬되어 있다(Sleytr, U.B., and P. Messner, Annu. Rev. Microbiol., 37: 311-339, 1983). 이러한 표면 단백질을 가진 미생물 중 유산균인 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis)는 세포 표면에 약 51 kDa의 분자량을 가지며 4각형의 정렬된 서브유닛으로 이루어진 표 면 단백질(S-layer protein)을 가지고 있으며(Masuda, K., and T. Kawata., Microbiol. Immunol., 23: 941-953, 1979), 바실러스 브레비스(Bacillus brevis)는 1개 이상의 표면 단백질을 가지고 있는 것으로 보고되고 있다(Adachi, T., et al., J. Bacteriol., 171: 1010-1016, 1989; Yamada, H., et al., J. Bacteriol., 148: 322-332, 1981).

세포상에서 이러한 표면 단백질(S-layer protein)의 기능에 대해서는 아직까지 완전하게 밝혀지지는 않았으나, 세포의 생존과 관련되어 있는 것으로 보고되고 있다(Smit, J., John Wiley & Sons, Inc., New York, p.343-376, 1986). 즉, 표면 단백질은 i) 환경적 유해물질에 대한 보호장벽으로 작용하고, ii) 영양소 및 대사산물의 이동을 조절하며, iii) 세포 고착(cell adhesion) 및 세포 표면의 인지 능력을 촉진하고, 및 iv) 세포 형태 및 세포막의 견고성 유지에 관여하고 있는 것으로 알려져 있으며(Sleytr, U.B., and P. Messner., J. Bacteriol., 170: 2891-2897, 1988), 최근에는 자가 결합력을 가지고 있다고 보고되었다(Gyorvary, E.S., et al., Journal of microscopy, 202, 300-306, 2003; Howorka, S., et al., FEMS microbiology letters, 172, 187-196, 1999).

따라서, 본 발명은 이러한 특징을 가진 락토바실러스 브레비스의 표면 단백질과, 설사증을 유발하는 항원에 특이적으로 결합하는 항체와 친화력을 가진 프로테인 A의 융합단백질을 제조하고, 이를 바이러스나 병원성 세균에 의한 가축의 설사증 예방, 개선, 또는 치료를 위한 면역보조제로서 이용하고자 하였다.

구체적으로, 본 발명자들은 락토바실러스 브레비스의 표면 단백질의 전장 아 미노산 서열(Accession No. CAA78618) 중 장 내벽에 점착하는 특징을 가진 31 내지 465 번째 아미노산 서열을 가진 폴리펩티드(서열번호 1), 및 상기 폴리펩티드의 아미노 말단 또는 카르복시 말단에 연결되며 설사증을 유발하는 항원에 특이적으로 결합하는 항체와 친화력을 가진 프로테인 A의 전장 아미노산 서열(Accession No. AAA73085) 중 101 내지 241 번째 아미노산 서열을 가진 폴리펩티드(서열번호 3)의 융합단백질을 제조하고, 제조된 상기 융합단백질을 설사증을 유발하는 항원에 특이적인 항체와 혼합하여 투여함으로써 소, 돼지, 닭 등의 가축의 장점막에서의 우수한 점착률 및 항원을 특이적으로 억제하여, 바이러스나 병원성 세균에 의한 가축의 설사증을 예방, 개선, 또는 치료하는데 유용하게 사용될 수 있음을 밝힘으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 융합단백질은 통상의 발현벡터를 이용하여 제조할 수 있으며, 보다 상세하게는 락토바실러스 브레비스의 표면 단백질의 전장 아미노산 서열(Accession No. CAA78618) 중 장 내벽에 점착하는 특징을 가진 31 내지 465 번째 아미노산 서열을 코딩하는 유전자, 및 설사증을 유발하는 살모넬라 엔테리티디스(Salmonella enteritidis) 항원, 대장균(E. coli) 항원, 코로나 바이러스(Corona virus) 항원, 헬리코박터 파이로리(Helicobacter pylori) 항원 및 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus) 항원으로 이루어진 군으로부터 선택된 1이상의 항원에 결합하는 항체와 친화력을 가진 프로테인 A의 전장 아미노산 서열(Accession No. AAA73085) 중 101 내지 241 번째 아미노산 서열을 코딩하는 유전자, 및 이 두 유전자가 작동 가능하게 연결된 하나의 프로모터를 포함하는, 재조합 발현벡터일 수 있다. 후술하는 본 발명의 바람직한 구체예에서는 이러한 발현벡터 중 대표적인 하나의 발현벡터를 예로 들어 도 1에 도시하였다.

상기 발현벡터 제조시 사용되는 프로모터는 특별히 한정되어 있는 것은 아니며, 상기 융합단백질을 소, 돼지, 닭 등의 가축의 장점막에서 지속적으로 발현시켜 활성화시킬 수 있는 lac, tac, ara, 및 T7 중 어느 하나의 프로모터를 사용할 수 있다.

상기 발현벡터에 도입된 표면 단백질과 프로테인 A의 코딩 유전자는 각각 프로모터의 활성에 의한 상기 각 유전자의 발현을 효과적으로 유도할 수 있도록 발현벡터 상에 존재하는 프로모터의 전사 방향과 일치하도록 배열하는 것일 수 있고, 이때 상기 프로테인 A의 코딩 유전자는 상기 표면 단백질의 코딩 유전자의 아미노 말단 또는 카르복시 말단에 위치하도록 배열하는 것일 수 있으나, 바람직하게는 융합단백질을 효과적으로 발현할 수 있도록 카르복시 말단에 위치하도록 배열하는 것일 수 있다.

또한, 상기 표면 단백질의 코딩 유전자는 서열번호 2인 염기서열을 갖는 것일 수 있고, 상기 프로테인 A의 코딩 유전자는 서열번호 4인 염기서열을 갖는 것일 수 있다.

따라서, 본 발명에서는 서열번호 2인 염기서열을 갖는 장 내벽에 점착하는 특징을 가진 락토바실러스 브레비스의 표면 단백질의 코딩 유전자와, 항원에 특이적으로 결합하는 항체와 친화력을 가진 서열번호 4인 염기서열을 갖는 프로테인 A의 코딩 유전자를 각각 준비하고,

전사 방향이 일치하도록 상기 두 유전자 단편들을 하나의 프로모터를 가진 벡터의 제한효소 인지 부위에 연속적으로 '표면 단백질-프로테인 A' 또는 '프로테인 A-표면 단백질', 바람직하게는 '표면 단백질-프로테인 A' 순으로 정렬되도록 삽입하여 재조합 발현벡터를 제조하였다.

또한, 본 발명의 융합단백질은 장 내벽에 점착하는 점착률을 측정할 수 있도록 적절한 형광 단백질, 예를 들면 녹색형광단백질(green fluorescent protein, GFP), 황색형광단백질(yellow fluorescent protein, YFP), 청색형광단백질(cyan fluorescent protein, CFP), 적색형광단백질(red fluorescent protein, RFP), 및 루시퍼라제(luciferase)로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나의 형광단백질을 발현벡터 상에서 함께 발현시켜 장 내벽에서의 형광 발생 여부를 측정하여 모니터링 할 수 있다.

이러한 모니터링 방법은 상기 융합단백질과 기존에 알려진 송아지나 돼지의 설사증 예방, 개선, 또는 치료용으로 사용되고 있는 난황항체인 Ig-Drink(ADbiotech㈜, 대한민국), 또는 설사증을 유발하는 살모넬라 엔테리티디스(Salmonella enteritidis) 항원, 대장균(E. coli) 항원, 코로나 바이러스(Corona virus) 항원, 헬리코박터 파이로리(Helicobacter pylori) 항원 및 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus) 항원으로 이루어진 군으로부터 선택된 1이상의 항원을 산란계에 면역시켜 생산된 난황항체(IgY)를 적절한 비율로 혼합하여 투여 함으로써 가축의 설사증을 예방, 개선, 또는 치료하는데 유용한지를 생체 내에서 실시간으로 판별하는데 이용될 수 있다.

이렇게 제조된 상기 재조합 발현벡터는 통상적으로 사용되는 숙주인 대장균 BL21(DE3), 바실러스(Bacillus), 락토바실러스(Lactobacillus), 사카로마이세스 세레비재(Saccahromyces cerevisiae), 및 아스퍼질러스 오리재(Aspergillus oryzae)로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나의 균주에 형질전환시킬 수 있으며, 본 발명의 바람직한 구체예에서는 일예로서 대장균에 형질전환하여 형질전환체를 제조하였다.

본 발명에서는 상기 융합단백질(녹색형광단백질-표면 단백질-프로테인 A)을 발현하는 형질전환체를 Escherichia coli BL21(DE3)/pSZ3으로 명명하였고, 2007년 9월 11일 대한민국 대전광역시 유성구 어은동 52번지에 위치한 한국생명공학연구원에 기탁하였으며, 기탁번호 KCTC 11194BP를 부여받았다.

또한, 본 발명의 융합단백질은 상기한 바와 같이 자가 결합력과 설사증을 유발하는 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 항체-친화력을 가지고 있기 때문에, 송아지나 돼지의 설사증을 예방, 개선, 또는 치료용으로 사용되고 있는 난황항체 (IgY), 또는 설사증을 유발하는 살모넬라 엔테리티디스(Salmonella enteritidis) 항원, 대장균(E. coli) 항원, 코로나 바이러스(Corona virus) 항원, 헬리코박터 파이로리(Helicobacter pylori) 항원 및 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus) 항원으로 이루어진 군으로부터 선택된 1이상의 항원을 산란계에 면역시켜 생산된 난황항체(IgY)와 적절히 혼합 투여함으로써, 항원-특이적인 면역항체를 장점막에 지속적으로 점착시켜 외부로부터 유입된 바이러스나 병원성 세균에 의한 설사증의 예방, 개선, 또는 치료에 유용한 면역보조제로 사용될 수 있다.

본 명세서에서 '면역보조제'란 생체내 또는 시험관내에 항원을 투여할 경우, 투여되는 피험체에서 항원에 대한 면역반응을 증가시키거나, 또는 항원에 대한 항체 특이성을 강화시키는 물질을 의미한다.

따라서, 본 발명은 면역보조제로서 상기 융합단백질, 및 설사증을 유발하는 살모넬라 엔테리티디스(Salmonella enteritidis) 항원, 대장균(E. coli) 항원, 코로나 바이러스(Corona virus) 항원, 헬리코박터 파이로리(Helicobacter pylori) 항원 및 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus) 항원으로 이루어진 군으로부터 선택된 1이상의 항원을 산란계에 면역시켜 생산된 난황항체 (IgY)를 포함하는, 가축의 설사증 예방, 개선, 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.

상기 조성물은 융합단백질을 기준으로 할 경우, 전체 조성물 100 중량부에 대하여 0.1 내지 99 중량부, 바람직하게는 1 내지 50 중량부로 포함할 수 있다.

또한, 상기 조성물은 면역보조제로서 융합단백질, 설사증을 유발하는 항원- 특이적인 항체로서 난황항체(IgY) 외에 약학적으로 허용가능한 부형제, 붕해제, 결합제 및 활택제로 이루어진 군으로부터 선택된 1이상의 첨가제를 더욱 포함할 수 있으며, 이때 상기 첨가제의 종류는 특별히 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 상기 조성물은 비경구 또는 경구용으로 사용될 수 있으나, 바람직하게는 경구용으로 사용할 수 있고, 예를 들면 산제, 정제, 캡슐제, 액제 또는 과립제 등으로 제형화될 수 있다.

상기 조성물의 투여량은 용도, 사용목적, 환자의 상태, 나이, 성별, 체중, 처방약 및 질병의 종류에 따라 적절하게 조절하는 것이 바람직하며, 통상적으로는 체중 kg 당 0.005 내지 5.0 mg, 보다 바람직하게는 체중 kg 당 0.01 내지 1.0 mg이고, 하루에 1회 내지 수회, 보다 바람직하게는 1일 3회로 나누어 투여할 수 있다.

상기 조성물은 본 발명에 따른 융합단백질과 함께 송아지나 돼지의 설사증을 예방, 개선, 또는 치료용으로 사용되고 있는 난황항체(IgY)를 적절히 혼합하여 사용될 수 있으며, 그 혼합비는 특별히 한정되어 있는 것은 아니며, 바이러스나 병원성 세균에 의해 감염된 가축의 설사증을 예방, 개선, 또는 치료하는데 유용한 함량 범위인 1:100(융합단백질의 함량 0.01 mg: 난황항체의 함량 1.0 mg), 바람직하게는 1:2(융합단백질의 함량 0.5 mg: 난황항체의 함량 1.0 mg) 비율로 혼합하여 투여할 수 있다.

상기 조성물에 함유된 융합단백질의 함량 범위는 특별히 한정되어 있는 것은 아니며, 전체 조성물을 기준으로 할 경우, ml 당 0.1 내지 10.0 mg, 바람직하게는 ml 당 1.0 내지 5.0 mg일 수 있다.

상술한 바와 같이, 본 발명에 따른 장 내벽에 점착하는 특징을 가진 락토바실러스 브레비스의 표면 단백질과 항원 특이적인 항체와 친화력을 가진 프로테인 A의 융합단백질은 장점막에 대한 점착성이 높고 독성이 없기 때문에, 설사증을 유발하는 항원 특이적인 항체와 혼합하여 사용할 경우, 가축의 설사증을 예방, 개선, 또는 치료하는데 유용한 면역보조제로 사용될 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발 명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

[ 실시예 ]

실시예 1: 융합단백질( 녹색형광단백질 -표면 단백질- 프로테인 A)의 발현벡터 제조

1-1: 녹색형광단백질(GFP)의 코딩 유전자 및 락토바실러스 브레비스( Lactobacillus brevis ) 표면 단백질의 코딩 유전자 증폭

녹색형광단백질(GFP)을 코딩하는 유전자를 수득하기 위하여, pGFP 벡터 (Clontech, 미국)를 NCo I 및 EcoR I 제한효소로 절단하여 약 700 bp의 DNA 단편을 분리한 다음, 이를 주형으로 상기 DNA 단편의 양 말단에 Kpn I 및 EcoR I 제한효소 인지부위가 생성되도록 프라이머를 설계하여 PCR 반응으로 녹색형광단백질의 코딩 유전자 부위를 증폭하였다. 상기 PCR 반응에 사용된 각 프라이머를 하기 표 1에 기재하였고, PCR 반응은 하기 표 3과 같다.

프라이머	서열(5'->3')	서열번호
Forward	5'-GGGGTACCATGGTGAGCAA-3'	5
Reverse	5'-GACCGGCGCTCAGTTGGAAT-3'	6

또한, 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis) 표면 단백질의 전장 아미노산 서열(Accession No. CAA78618) 중 장 내벽에 점착하는 특징을 가진 31 내지 465 번째 아미노산 서열을 코딩하는 유전자(서열번호 2)를 수득하기 위하여, NCBI 등재번호(Accession No. Z14250)의 DNA를 주형으로 상기 DNA의 양 말단에 Bam HI 및 Kpn I 제한효소 인지부위가 생성되도록 프라이머를 설계하여 PCR 반응으로 상기 유전자 부위를 증폭하였다. 상기 PCR 반응에 사용된 각 프라이머를 하기 표 2에 기재하였고, PCR 조건은 하기 표 3과 같다.

프라이머	서열(5'->3')	서열번호
Forward	5'-CGGGATCCAAGTCATACGCTA-3'	7
Reverse	5'-CCGGAATTCTTAGTTGAACCAAGT-3'	8

		온도	시간	Cycle
1st Denaturation		94℃	2 min
Amplification	2nd Denaturation	94℃	1 min		25 Cycles
	Annealing	55℃	1 min	go to 2nd Denaturation
	Extension	72℃	30 sec
Final Extension		72℃	4 min

PCR 반응에 사용된 PCR용 조성물은 200 ml PCR 튜브에 0.5 ㎕의 Taq polymerase(Takara, 일본), 4.0 ㎕의 2.5 mM dNTP, 5.0 ㎕의 Taq polymerase buffer(Takara, 일본), 1.0 ㎕(10 pmol/㎕)의 상기 각 프라이머, 3.0 ㎕(100 ng/㎕)의 주형 DNA(pGFP 벡터 내에서 분리한 약 700 bp의 DNA 단편 또는 락토바실러스 브레비스의 염색체 DNA), 및 35.5 ㎕의 멸균수를 첨가하여 최종부피가 50 ㎕가 되도록 제조하였다.

표 3의 PCR 조건에서 반응시킨 후, PCR 반응물을 1.0% 아가로스 겔 상에서 전기영동하고 UV transiluminator를 이용하여 그 크기를 확인한 결과, 상기 녹색형광단백질을 코딩하는 유전자 단편의 크기는 약 700 bp이고, 상기 락토바실러스 브레비스 표면 단백질을 코딩하는 유전자 단편의 크기는 약 1300 bp임을 확인하였다.

1-2: 프로테인 A를 코딩하는 유전자 증폭

pEZZ18 벡터(Pharmacia, 미국) 내에 삽입되어 있는 프로테인 A의 전장 아미노산 서열(Accession No. AAA73085) 중 항체와 친화력을 가진 101 내지 241 번째 아미노산 서열을 코딩하는 유전자(서열번호 4)를 수득하기 위하여, NCBI 등재번호(Accession No. M74186)의 DNA를 주형으로 하기 프라이머를 이용한 PCR 반응으로 상기 유전자 부위를 증폭하였다. 상기 PCR에 사용된 각 프라이머를 하기 표 4에 기재하였고, PCR 조건은 상기 표 3과 동일하다.

Primer	서열(5'->3')	서열번호
Forward	5'-CGCGCGAAGCTTGACAACAAATTCAACAAAGA-3'	9
Reverse	5'-ATATAAGCTTCCGCCAGCCATTGCAACGGAATCG-3'	10

PCR 반응에 사용된 PCR용 조성물은 pEZZ18 벡터 DNA를 주형 DNA로 첨가하는 것을 제외하고는, 상기 1-1에서 준비한 PCR용 조성물의 조성 및 용량과 동일하다.

상기 표 3의 PCR 조건에서 반응시킨 후, PCR 반응물을 0.8% 아가로스 겔 상에서 전기영동하고 UV transiluminator를 이용하여 크기를 확인한 결과, 그 크기가 약 450 bp임을 확인하였다.

1-3: 유전자 클로닝 및 형질전환체 제조

상기 1-1에서 준비한 녹색형광단백질 및 표면 단백질의 코딩 유전자, 및 상기 1-2에서 준비한 프로테인 A의 코딩 유전자를 모두 포함하는 발현벡터(녹색형광단백질-표면 단백질-프로테인 A-pET30b)를 제조하기 위하여, pET30b 벡터의 다중 클로닝 부위(multi-cloning site)에 삽입할 수 있는 제한효소 인지부위가 없는 프로테인 A 유전자는 다음과 같은 sub-cloning 과정을 통하여 준비하였다. 즉, 상기 1-2에서 수득한 프로테인 A의 코딩 유전자의 PCR 반응물을 아가로스 겔 상에서 분리한 후, Gel Extraction kit(QIAGEN, 미국)를 이용하여 DNA를 정제하였고, 이를 pGEM easy T-벡터(Promega, 미국)에 클로닝한 다음, DH5α(Invitrogen, 미국)에 형질전환시켰다. 형질전환된 클론을 선별하여 LB 배지에서 배양한 후, Plasmid mini kit(Promega, 미국)를 이용하여 DNA를 분리하였다. 상기 분리된 DNA를 Hind III로 절단하여 프로테인 A의 코딩 유전자 부위를 추출한 다음, 동일한 제한효소 인지부위(Hind III)로 절단된 pET30b 벡터에 클로닝하였다.

반면, 상기 1-1에서 수득한 녹색형광단백질 및 표면 단백질의 코딩 유전자의 PCR 반응물은 양 말단에 있는 각 제한효소 인지부위를 인식하는 제한효소로 처리한 후, 프로테인 A의 코딩 유전자의 정제방법과 동일하게 정제하여 pET30b 벡터의 다중 클로닝 부위에 직접 클로닝하였다. 이렇게 클로닝된 상기 벡터를 BL21(DE3) 균주(Stratagene, 미국)에 형질전환하였고, 형질전환된 클론 중 녹색형광단백질이 발현되는 클론을 선별하여 그 DNA를 정제하였고, 정제된 DNA를 Hind III로 처리하여 1 % 아가로스 겔 상에서 전기영동하여 융합단백질 부위가 삽입됨을 확인하였다(도 3).

상기에서 선별된 형질전환 클론들은 ABI 3700XL DNA Sequencer(Applied Biosystems, Foster City, SCA, USA)를 이용하여 서열 분석하였다.

이로부터, 본 발명자들은 융합단백질(녹색형광단백질-표면 단백질-프로테인 A)을 발현하는 형질전환체를 Escherichia coli BL21(DE3)/pSZ3으로 명명하였고, 상기 균주를 2007년 9월 11일 대한민국 대전광역시 유성구 어은동 52번지에 위치한 한국생명공학연구원에 기탁하였으며, 기탁번호 KCTC 11194BP를 부여받았다.

실시예 2: 융합단백질의 정제

상기 1-3에서 제조된 형질전환체로부터 본 발명에 따른 융합단백질을 대량으로 생산 및 정제하기 위하여, 상기 형질전환체를 발효조(fermenter)에서 대량으로 배양한 후, 하기와 같이 상기 융합단백질을 대량으로 생산 및 정제하였다.

구체적으로, 5 L의 멸균된 TB(terrific broth) 배지(60 g 트립톤, 120 g 효모 추출물, 4.5 L 2차 증류수, 20 ml 글리세린, 11.55 g 인산이수소칼륨 및 62.75 g 인산이수소칼륨을 함유한 500 ml 2차 증류수)로부터 100 ml을 수취한 후, 상기 1-3에서 제조된 형질전환체를 접종하여 28℃, 160 rpm, 24 시간 동안 진탕 배양하였다. 배양된 균주 1 %(1 ml)를 가나마이신이 함유된 상기 5 L 멸균 TB 배지에 접종하여 하루 동안 진탕 배양한 후, 4 ℃, 6,000 rpm에서 30 분 동안 원심 분리하였다. 원심 분리한 후, 펠렛이 풀어지지 않게 상등액을 천천히 제거하였고, 50 mM 인산완충용액(pH 7.0)을 펠렛의 양과 동일하게 첨가하여 현탁시켰다. 상기 과정을 2~3번 반복하여 펠렛을 세척하였고, 이때, 펠렛에 첨가되는 인산완충용액의 양은 2배로 증가시켰다.

상기에서 수득된 펠렛을 분쇄하기 위하여, 펠렛 양의 3 배의 50 mM 인산완충용액을 첨가하여 흔들어 준 다음, 아이스가 담겨 있는 비이커 내에서 40 분간 초음파로 분쇄하였다. 펠렛을 분쇄한 후, 4 ℃, 6,000 rpm에서 40 분간 원심 분리하여 상등액을 제거하였고, 펠렛 1.0 g 당 1.0 ml의 5 mM 염화리튬(LiCl)를 첨가하여 14~16시간 동안 배양하였다. 배양된 상기 배양액을 다시 4 ℃, 6,000 rpm에서 40 분간 원심 분리한 다음, 상등액만을 수취하여 투석하였다.

투석 과정은 다음과 같다:

1) 막(Dialysis cellulose membrane, Sigma-Aldrich, 미국)을 상등액이 들어갈 정도의 크기로 자른 다음 3차 증류수로 세척하고,

2) 세척된 막의 아래쪽을 묶은 후, 상기에서 수득한 상등액을 막에 넣은 다음 위쪽은 집게로 막고,

3) 상기 막을 3 L 비이커에 고물줄을 연결하여 고정한 뒤, 막이 잠길 정도로 3차 증류수를 넣고 4 ℃에서 회전시키고,

4) 15 분 마다 3차 증류수를 8번 교환해준 후 하루 동안 방치하고,

5) 상기 막의 상등액을 4 ℃, 12,000 rpm에서 10 분 동안 원심 분리하여 펠렛을 수득하고,

6) 상기 수득된 펠렛에 500 ㎕의 50 mM 인산완충용액을 첨가하여 펠렛을 현탁시킨 후 e-tube에 옮기고,

7) 상기 e-tube를 4 ℃, 12,000 rpm에서 5 분 동안 다시 원심 분리하여 펠렛을 수득하고,

8) 상기 수득된 펠렛이 마르지 않도록 상등액을 조금 남겨둔 후 -70 ℃에서 보관하였다.

상기 투석 과정을 통하여, 녹색형광단백질, 표면 단백질, 및 프로테인 A를 포함하는 융합단백질을 대량으로 정제하였고, 정제된 융합단백질의 양은 배양액 l L 당 약 2~10 mg이었다.

실시예 3: 융합단백질의 구조 및 장벽내 분포 양상 분석

3-1: 융합단백질의 구조적 특징 분석

본 발명의 융합단백질의 구조적 특징을 분석하기 위하여, 실시예 2에서 정제한 융합단백질을 아르곤 가스로 코팅한 후 진공건조하여 통상의 스캐닝 전자현미경(Scanning Electronic Microscope, Hitachi S0-4100, 일본)으로 관찰하였다. 그 결과를 도 6a 내지 6c에 나타내었다.

도 6a 내지 6c에 나타낸 바와 같이, 본 발명에 따른 융합단백질은 그 표면이 나노미터 크기의 격자 무늬를 만들면서 그물모양의 형상을 하고 있으며(도 6a), 자체적으로 자가 결합하여 침전물을 형성하고 있음을 관찰할 수 있었다(도 6b). 또한, 상기 융합단백질과 송아지의 설사증을 예방 또는 치료하는데 사용되는 난황항체인 Ig-Drink(ADbiotech㈜, 대한민국)를 1:1(v/v) 비율로 혼합하여 전계방사형 주사전자현미경(FE-SEM/EDS (1), S-4100, Hitachi, 일본)으로 측정한 결과, 융합단백질의 표면에 항체가 코팅되어 막을 형성하고 있음을 관찰할 수 있었다(도 6c).

3-2: 생체내 주입한 융합단백질의 장벽내 분포 양상 분석

상기와 같은 구조적 특징을 가진 융합단백질을 생체내로 주입할 경우, 주입된 융합단백질이 대상동물의 장 내벽에 분포하는 양상을 확인하기 위하여, 효창사이언스사(대한민국)에서 분양 받은 생후 4 주령된 수컷 ICR 마우스(총 12 마리) 1마리 당 실시예 2에서 정제한 융합단백질 200 ㎍을 100 ㎕ 멸균 증류수에 희석하여 경구 투여하였고, 이를 실험군으로 정하였다. 대조군은 상기 ICR 마우스 (총 12 마리) 1마리 당 100 ㎕ 멸균 증류수를 경구 투여하여 준비하였다. 3 일 경과 후, 각 마우스를 클로로포름(Junsei, 일본)으로 마취하였고, 장을 적출하여 형광현미경으로 관찰하였다. 그 결과를 도 7에 나타내었다.

도 7에 나타낸 바와 같이, 융합단백질을 투여한 실험군의 장 내벽에는 녹색형광단백질이 발현되었으나(도 7a), 융합단백질을 투여하지 않은 대조군은 녹색형광단백질이 전혀 발현되지 않음을 확인할 수 있었다(도 7b). 이는, 본 발명의 융합단백질이 생체내에서 효과적으로 장 내벽에 부착하여 분포하고 있음을 의미한다.

실시예 4: 면역보조제로서의 효능 분석

본 발명의 융합단백질과 설사증을 유발하는 균주에 대한 항체를 혼합할 경우, 상기 융합단백질이 장 내에서 상기 항체를 오랫동안 잔류시킬 수 있는지 조사하기 위하여, 실시예 2에서 정제한 융합단백질과 송아지 또는 돼지의 설사증의 예방 또는 치료용 면역항체, 즉 설사증을 유발하는 대장균(Escherichia coli), 로타 바이러스(Rota virus), 코로나 바이러스(Corona virus), 및 살모넬라(Salmonella) 항원에 대한 면역항체(경상북도 가축위생시험소에서 제조)를 각각 1:1(v/v)로 희석한 후, 1 ml씩 4 주령된 수컷 ICR 마우스(n=2)에 각각 경구 투여하였다. 1~3시간 경과 후, 마우스를 희생시켜 위(stomach) 바로 아래에 있는 소장 부위를 20 cm 정도 절개하였고, 절개된 부위에 1 ml의 증류수로 세척하여 얻어진 장세척 내용물에 잔류된 상기 각 항체의 역가를 ELISA 방법으로 측정하였다.

ELISA 분석을 위하여, 상기 4 종류의 항원이 각각 코팅된 96-well plate에 상기에서 준비된 100 ㎕의 각 장세척 내용물을 첨가한 후, 492 nm의 파장에서 흡광도를 측정하였다. 측정된 흡광도에 의해 마우스에 투여된 상기 4종류의 장 내벽에 분포하는 면역항체의 잔존율(%)을 조사하였다. 그 결과를 도 8에 나타내었다.

도 8에 나타낸 바와 같이, 본 발명에 따른 융합단백질과 상기 대장균, 로타 바이러스 및 살모넬라 항원에 대한 면역항체를 각각 혼합하여 경구 투여한 마우스의 장세척 내용물(실험군)에 잔류된 면역항체의 역가는 모두 면역항체만 경구 투여한 마우스의 장세척 내용물(대조군)에 잔류된 면역항체의 역가에 비해 통계적으로 유의한 차이를 보였다(도 8). 그러나, 코로나 바이러스에 대한 면역항체를 경구 투여한 경우, 융합단백질의 혼합 유무에 상관없이 마우스의 장세척 내용물에 잔류된 면역항체의 역가는 거의 유사하였다(도 8).

실시예 5: 단회 투여 급성독성시험

본 발명에 따른 융합단백질의 단회 투여 독성시험을 측정하기 위하여, 실시예 2에서 수득한 융합단백질을 멸균수에 희석하여 8 주령의 특정병원체부재(specific pathogen-free, SPF) SD(Sprague-Dawley, Harlan, USA) 랫트에 경구 투여하였다. 상기 랫트에 각각 멸균수에 희석한 실시예 2의 융합단백질을 0 mg/kg, 800 mg/kg, 1,600 mg/kg, 3,200 mg/kg의 용량으로 경구용 존데(oral sonde)을 이용하여 20 ml/kg씩 경구 투여 후, 실험동물의 폐사여부, 임상증상 및 체중변화를 관찰하고 혈액학적 검사와 혈액생화화적 검사를 실시하였으며, 상기의 실험용 랫트를 부검하여 육안으로 복강장기와 흉강장기의 이상 유무를 관찰하였다.

실험 결과, 융합단백질을 투여한 모든 실험용 랫트에서 특이할 만한 임상증상이나 폐사된 동물은 없었으며, 체중변화, 혈액검사, 혈액생화학 검사 및 부검 소견 등에서도 독성 변화는 관찰되지 않았다. 상기의 결과에 따라, 본 발명의 융합단백질은 랫트에서 3.2 g/kg까지도 독성이 나타나지 않았으며, 경구 투여 최소치사량 (MLD: Minimum Lethal Dose)은 3.2 g/kg 이상인 안전한 물질로 판단되었다.

이하에서는, 본 발명에 따른 융합단백질을 포함하는 약학 조성물 또는 식품 조성물의 제제예를 설명하는 것이며, 본 발명은 이를 한정하고자 함이 아닌 단지 구체적으로 설명하고자 함이다.

제조예 : 융합단백질을 이용한 면역보조용 제제

제조예 1. 산제의 제조

융합 단백질 분말 20 mg

난황항체(Ig-Drink, ADbiotech㈜, 대한민국) 20 mg

유당 100 mg

탈크 10 mg

상기의 성분들을 혼합하고 기밀포에 충진하여 산제를 제조하였다.

제조예 2. 정제의 제조

융합단백질 분말 10 mg

난황항체(Ig-Drink, ADbiotech㈜, 대한민국) 10 mg

옥수수전분 100 mg

유당 100 mg

스테아린산 마그네슘 2 mg

상기의 성분들을 혼합한 후 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조하였다.

제조예 3. 캡슐제의 제조

융합단백질 분말 10 mg

난황항체(Ig-Drink, ADbiotech㈜, 대한민국) 10 mg

락토오스 14.8 mg

마그네슘 스테아레이트 0.2 mg

통상의 캡슐제 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합하고 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조하였다.

제조예 4. 액제의 제조

융합단백질 분말 20 mg

난황항체(Ig-Drink, ADbiotech㈜, 대한민국) 20 mg

이성화당 10 g

만니톨 5 g

정제수 적량

통상의 액제의 제조방법에 따라 정제수에 각각의 성분을 가하여 용해시키고 상기의 성분을 혼합한 다음 정제수를 가하여 전체 100 ㎖로 조절한 후 갈색병에 충진하여 멸균시켜 액제를 제조하였다.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 점착성 융합단백질을 발현하는 발현벡터의 맵(Map)을 나타낸 것이다.

도 2a 및 도 2b는 각각 본 발명의 일 실시예에 따른 발현벡터 내에 삽입된 락토바실러스 브레비스의 표면 단백질을 암호화하는 유전자의 전장 염기서열 중 31 내지 465번째 아미노산 서열을 코딩하는 유전자의 염기서열(밑줄친 부위; 91 내지 1395 bp) 및 프로테인 A를 암호화하는 유전자의 전장 염기서열 중 101 내지 241번째 아미노산 서열을 코딩하는 유전자의 염기서열(밑줄친 부위; 301 내지 723 bp)을 나타낸 것이다.

도 3은 본 발명의 일 실시예에 따라 선별된 점착성 융합단백질(녹색형광단백질-표면 단백질-프로테인 A)을 발현하는 형질전환체를 나타낸 사진이고, 플레이트 내 사진은 선별된 형질전환체의 DNA를 추출한 후 제한효소인 Hind III로 처리하여 삽입된 insert 부위가 존재하는지를 분석한 아가로스 겔 사진이며(레인 2)이다.

도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 형질전환체로부터 분리 및 정제된 점착성 융합단백질을 나타낸 사진이다(녹색형광을 띰).

도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 점착성 융합단백질이 카르복시메틸 셀룰로오스(carboxymethyl cellulose, CMC) 아가상에서 유리구슬에 대한 셀룰로오스 효소의 고정화에 미치는 영향을 나타낸 사진으로, 좌측은 유리구슬에 융합단백질과 셀룰로오스 효소를 혼합한 부위이고, 우측은 유리구슬에 셀룰로오스 효소만 처리한 부위를 나타내는 것이다.

도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 융합단백질의 구조적 특징을 전자현미경으로 측정하여 나타낸 사진으로, 도 6a는 나노미터 크기의 격자를 만들면서 그물모양의 형상을 하고 있는 융합단백질을 나타낸 상이고(좌측: ×70 배율, 우측: ×150 배율), 도 6b는 자가결합으로 침전물을 형성한 융합단백질의 표면을 나타낸 상이며(좌측: ×8 배율, 우측: ×20 배율), 및 도 6c는 항체와 결합하여 막을 형성하고 있는 융합단백질의 표면을 나타낸 상이다.

도 7은 본 발명의 일 실시예에 따른 융합단백질을 투여한 실험군(도 7a)과 융합단백질을 투여하지 않은 대조군(도 7b)을 각각 비교한 마우스의 장 내벽에 점착하는 융합단백질의 형광현미경 상을 나타낸 것이다.

도 8은 본 발명의 일 실시예에 따른 융합단백질과 4종류의 설사증 치료 또는 예방용 면역항체를 각각 혼합 유무에 따라 ELISA로 측정한 마우스의 장 내벽에 분포하는 면역항체의 잔존율(%)을 나타낸 그래프이다.

<110> Industry-Academic Cooperation Yeungnam University <120> ADHESIVE FUSION PROTEIN AND IMMUNOADJUVANT FOR PREVENTING OR TREATING LIVESTOCK DIARRHEA USING THE SAME <130> DPP-2007-1139-KR <160> 10 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 435 <212> PRT <213> 31st to 465th amino acid sequence of Lactobacillus brevis S-layer protein <400> 1 Lys Ser Tyr Ala Thr Ala Gly Ala Tyr Ser Thr Leu Lys Thr Asp Ala 1 5 10 15 Ala Thr Arg Asn Val Glu Ala Thr Gly Thr Asn Ala Leu Tyr Thr Lys 20 25 30 Pro Gly Thr Val Lys Gly Ala Lys Val Val Ala Ser Lys Ala Thr Met 35 40 45 Ala Lys Leu Ala Ser Ser Lys Lys Ser Ala Asp Tyr Phe Arg Ala Tyr 50 55 60 Gly Val Lys Thr Thr Asn Arg Gly Ser Val Tyr Tyr Arg Val Val Thr 65 70 75 80 Met Asp Gly Lys Tyr Arg Gly Tyr Val Tyr Gly Gly Lys Ser Asp Thr 85 90 95 Ala Phe Ala Gly Gly Ile Lys Ser Ala Glu Thr Thr Thr Lys Ala Asp 100 105 110 Met Pro Ala Arg Thr Thr Gly Phe Tyr Leu Thr Asp Thr Ser Lys Asn 115 120 125 Thr Leu Trp Thr Ala Pro Lys Tyr Thr Gln Tyr Lys Ala Ser Lys Val 130 135 140 Ser Leu Tyr Gly Val Ala Lys Asp Thr Lys Phe Thr Val Asp Gln Ala 145 150 155 160 Ala Thr Lys Thr Arg Glu Gly Ser Leu Tyr Tyr His Val Thr Ala Thr 165 170 175 Asn Gly Ser Gly Ile Ser Gly Trp Ile Tyr Ala Gly Lys Gly Phe Ser 180 185 190 Thr Thr Ala Thr Gly Thr Gln Val Leu Gly Gly Leu Ser Thr Asp Lys 195 200 205 Ser Val Thr Ala Thr Asn Asp Asn Ser Val Lys Ile Val Tyr Arg Thr 210 215 220 Thr Asp Gly Thr Gln Val Gly Ser Asn Thr Trp Val Thr Ser Thr Asp 225 230 235 240 Gly Thr Lys Ala Gly Ser Lys Val Ser Asp Lys Ala Ala Asp Gln Thr 245 250 255 Ala Leu Glu Ala Tyr Ile Asn Ala Asn Lys Pro Ser Gly Tyr Thr Val 260 265 270 Thr Asn Pro Asn Ala Ala Asp Ala Thr Tyr Gly Asn Thr Val Tyr Ala 275 280 285 Thr Val Ser Gln Ala Ala Thr Ser Lys Val Ala Leu Lys Val Ser Gly 290 295 300 Thr Pro Val Thr Thr Ala Leu Thr Thr Ala Asp Ala Asn Asp Lys Val 305 310 315 320 Ala Ala Asn Asp Thr Thr Ala Asn Gly Ser Ser Val Ala Gly Ser Thr 325 330 335 Val Tyr Ala Ala Gly Thr Lys Leu Ala Gln Leu Thr Thr Asp Leu Thr 340 345 350 Gly Glu Lys Gly Gln Val Val Thr Leu Thr Ala Ile Asp Thr Asp Leu 355 360 365 Glu Asp Ala Thr Phe Thr Gly Thr Thr Thr Tyr Tyr Ser Asp Leu Gly 370 375 380 Lys Ala Tyr His Tyr Thr Tyr Thr Tyr Asn Lys Asp Ser Ala Ala Ser 385 390 395 400 Ser Asn Ala Ser Thr Gln Phe Gly Ser Asn Val Thr Gly Thr Leu Thr 405 410 415 Ala Thr Leu Val Met Gly Lys Ser Thr Ala Thr Ala Asn Gly Thr Thr 420 425 430 Trp Phe Asn 435 <210> 2 <211> 1305 <212> DNA <213> Nucleotide sequence conding 31st to 465th amino acid sequence of S-layer protein <400> 2 aagtcatacg ctactgcagg tgcctattca acgttaaaga cggacgctgc tactcgtaac 60 gtcgaagcta ctggtactaa cgctttatac acgaagccag gtactgttaa gggtgctaag 120 gttgtcgctt ctaaggctac tatggctaag ttagcttctt caaagaagtc agctgactac 180 ttccgtgctt acggtgttaa gaccactaac cgtggttcag tttactaccg tgttgtaacg 240 atggatggca agtaccgtgg ttacgtttat ggtggcaagt ctgacactgc ctttgctggt 300 ggtatcaagt ctgctgaaac gactactaag gctgatatgc ctgcacgtac tactgggttc 360 tacttaactg acacttcaaa gaacactctt tggacggctc ctaagtacac tcaatacaag 420 gcaagtaaag ttagccttta tggtgttgct aaggacacca agtttactgt agatcaggct 480 gctactaaga ctcgtgaagg ttcattatac tatcacgtaa ctgctactaa cggtagtggt 540 attagtggtt ggatttacgc tggtaagggc ttcagtacta ctgctactgg tacacaagta 600 cttggtggtc tgtcaactga taagtcagtt acagcaacca acgataacag tgttaagatt 660 gtttaccgta cgactgatgg cactcaagtt ggttctaaca cttgggtaac ttcaactgat 720 ggtacaaagg caggttctaa ggtaagcgat aaggccgccg atcaaactgc tcttgaagcc 780 tacatcaatg ctaacaagcc tagcggttac actgtaacta accctaatgc tgcagatgct 840 acctatggta acacagttta cgctactgtt tcccaagcag ctacttctaa ggtcgctttg 900 aaggtctcag ggactcctgt tactactgca ttgactacag ctgatgctaa tgataaggtt 960 gcagctaacg ataccactgc taatggtagt tctgttgcag gctcaacagt ctatgctgct 1020 ggtactaagt tggctcaatt aacaactgac ttgactggtg aaaagggtca agttgtcaca 1080 ttaactgcca tcgatactga tttggaagac gctacgttca ctggaactac gacttactat 1140 tcagatcttg gtaaagcata ccactacact tacacttaca ataaggacag tgctgcttct 1200 tcaaatgcaa gtacccaatt tggttcaaac gtcactggta ctttaactgc tacccttgtt 1260 atgggtaagt ctactgctac tgctaacggt actacttggt tcaac 1305 <210> 3 <211> 141 <212> PRT <213> 101st to 241st amino acid sequence of protein A <400> 3 Val Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile 1 5 10 15 Leu His Leu Pro Asn Leu Asn Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln 20 25 30 Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Asn Leu Leu Ala Glu Ala 35 40 45 Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys Val Asp Ala Asn Ser Ser 50 55 60 Ser Val Pro Gly Asp Pro Leu Glu Ser Thr Cys Arg His Ala Ser Leu 65 70 75 80 Ala Leu Ala Val Val Leu Gln Arg Arg Asp Trp Glu Asn Pro Gly Val 85 90 95 Thr Gln Leu Asn Arg Leu Ala Ala His Pro Pro Phe Ala Ser Trp Arg 100 105 110 Asn Ser Glu Glu Ala Arg Thr Asp Arg Pro Ser Gln Gln Leu Arg Ser 115 120 125 Leu Asn Gly Glu Trp Arg Phe Arg Cys Asn Gly Trp Arg 130 135 140 <210> 4 <211> 423 <212> DNA <213> Nucleotide sequence coding 101st to 241st amino acid sequence of protein A <400> 4 gtagacaaca aattcaacaa agaacaacaa aacgcgttct atgagatctt acatttacct 60 aacttaaacg aagaacaacg aaacgccttc atccaaagtt taaaagatga cccaagccaa 120 agcgctaacc ttttagcaga agctaaaaag ctaaatgatg ctcaggcgcc gaaagtagac 180 gcgaattcga gctcggtacc cggggatcct ctagagtcga cctgcaggca tgcaagcttg 240 gcactggccg tcgttttaca acgtcgtgac tgggaaaacc ctggcgttac ccaacttaat 300 cgccttgcag cacatccccc tttcgccagc tggcgtaata gcgaagaggc ccgcaccgat 360 cgcccttccc aacagttgcg cagcctgaat ggcgaatggc gattccgttg caatggctgg 420 cgg 423 <210> 5 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer used for amplifying GFP coding gene <400> 5 ggggtaccat ggtgagcaa 19 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer used for amplifying GFP conding gene <400> 6 gaccggcgct cagttggaat 20 <210> 7 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer used for amplifying Lactobacillus breveis S-layer protein coding gene <400> 7 cgggatccaa gtcatacgct a 21 <210> 8 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer used for amplifying Lactobacillus brevis S-layer protein coding gene <400> 8 ccggaattct tagttgaacc aagt 24 <210> 9 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer used for amplifying protein A coding gene <400> 9 cgcgcgaagc ttgacaacaa attcaacaaa ga 32 <210> 10 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer used for amplifying protein A coding gene <400> 10 atataagctt ccgccagcca ttgcaacgga atcg 34

Claims (5)

1. 락토바실러스 브레비스의 표면 단백질의 전장 아미노산 서열(Accession No. CAA78618) 중 장 내벽에 점착하는 특징을 가진 31 내지 465 번째 아미노산 서열을 가진 폴리펩티드, 및

   상기 폴리펩티드의 아미노 말단 또는 카르복시 말단에 연결되며, 설사증을 유발하는 살모넬라 엔테리티디스(Salmonella enteritidis) 항원, 대장균(E. coli) 항원, 코로나 바이러스(Corona virus) 항원, 헬리코박터 파이로리(Helicobacter pylori) 항원 및 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus) 항원으로 이루어진 군으로부터 선택된 1이상의 항원에 결합하는 항체와 친화력을 가진 프로테인 A의 전장 아미노산 서열(Accession No. AAA73085) 중 101 내지 241 번째 아미노산 서열을 가진 폴리펩티드의 융합단백질.
2. 제1항의 융합단백질을 발현하는 기탁번호 KCTC 11194BP인 대장균(Escherichia coli BL21(DE3)/pSZ3).
3. 면역보조제로서 제1항의 융합단백질, 및

   설사증을 유발하는 살모넬라 엔테리티디스(Salmonella enteritidis) 항원, 대장균(E. coli) 항원, 코로나 바이러스(Corona virus) 항원, 헬리코박터 파이로리(Helicobacter pylori) 항원 및 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus) 항원으로 이루어진 군으로부터 선택된 1이상의 항원을 산란계에 면역시켜 생산된 난황항체(IgY)

   를 포함하는, 설사증 예방 또는 치료용 약학 조성물.
4. 제3항에 있어서, 상기 융합단백질은 전체 조성물 100 중량부에 대하여 1 내지 50 중량부인 설사증 예방 또는 치료용 약학 조성물.
5. 제3항에 있어서, 상기 조성물은 약학적으로 허용가능한 부형제, 붕해제, 결합제 및 활택제로 이루어진 군으로부터 선택된 1이상의 첨가제를 더욱 포함하는, 조성물.

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