KR101309583B1 - 닭 전염성질병 예방용 사료첨가조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 닭 전염성질병 예방용 사료첨가조성물에 관한 것이다.
본 발명의 닭 전염성질병 예방용 사료첨가조성물은, 조성물의 전체 중량을 기준으로 산수유 추출물 7 ~ 15 중량 %, 여정실 추출물 10 ~ 15 중량 %, 어성초 추출물 10 ~ 15 중량 %, 오배자 추출물 2 ~ 5 중량 %, 감초 추출물 3 ~ 5 중량 %, 현지초 추출물 5 ~ 10 중량 %, 면역항체가 형성된 난황 40 ~ 60 중량 %로 구성된다.
본 발명에 의해, 인체 무해한 천연약용식물들과 면역항체가 형성된 난황을 이용하여 항생물질을 대체할 수 있는 닭 전염성질병 예방용 사료첨가조성물이 제공된다.

Description

닭 전염성질병 예방용 사료첨가조성물{COMPOSITION FOR PREVENTING CHICKEN CONTAGIOUS DISEASE}

본 발명은 닭 전염성질병 예방용 사료첨가조성물에 관한 것으로, 특히 인체 무해한 천연약용식물들과 면역항체가 형성된 난황을 이용하여 항생물질을 대체할 수 있는 닭 전염성질병 예방용 사료첨가조성물에 관한 것이다.

일반적으로 동물들은 각종 질병으로부터 자기를 보호하기 위하여, 어떤 병원체에 감염된 후 면역기능을 발휘하여 회복된다.

또한, 질병을 앓지 않고 면역기능을 갖도록 만들기 위해서, 특정 병원균으로 예방약을 제조하여 인위적으로 접종함으로서 면역을 얻게 할 수도 있고, 외부에서 이미 만들어진 면역물질을 체내에 주입시켜서 유사한 효력을 얻게 할 수도 있다.

닭의 경우 집단사육으로 인해 어린 일령에서부터 다수의 병원체에 노출되어 있으며, 질병에 대한 저항력도 떨어지며 면역능력과 질병에 대한 항병력이 매우 낮아져 조그마한 스트레스가 가해져도 높은 폐사율을 나타내고 있다.

또한, 일부 어린 일령에서는 모체이행 항체의 결여로 질병에 대한 저항력이 약해 각종 질병에 대한 방어능력이 현격히 떨어져 질병감염으로 인한 폐사가 발생되고 있는 실정이다.

닭의 소화기 및 호흡기질병을 일으키는 주요 질병으로 닭 레오바이러스, 닭 전염성F낭병 바이러스, 닭 대장균증, 살모넬라증, 캠필로박터병, 마이코플라스마감염증, 황색 포도상구균증 등을 들 수 있으며, 현재 일반적으로 상기 질병원에 대한 예방약, 항생제, 설파제 등을 사용하여 닭의 질병을 예방 및 치료를 하고 있다.

그러나, 상기한 예방약, 항생제, 설파제 등만으로는 질병을 조기에 효과적으로 예방 및 치료할 수 없다는 문제점이 있다.

또한, 항생제나 설파제를 과다하게 사용함으로써 수많은 부작용이 나타나고 있다.

이에 따라, 닭의 질병을 치료하고 예방하기 위한 새로운 차원의 연구가 절실히 필요한 실정이다.

상기 질병은 주요 전염성질병으로서 구체적으로 설명하면 다음과 같다.

닭 레오바이러스(Reo virus; REOV)는 소독제와 환경에 대한 저항성이 강하여 실온에서 거의 1년이상 생존하기 때문에 일단 오염된 농장은 거의 영구적으로 순환 감염될 것으로 믿어진다.

일령이 어릴수록 피해가 심하며, 1주령까지는 주로 발육저하증후군, 2주령까지는 골격이상으로 다리를 절거나 깃털 발육불량을 나타내고, 사료의 소화흡수장애를 일으키기 때문에 어느 영양분이 흡수되지 않았느냐에 따라 다양한 증상을 나타낸다.

흡수불량증후군은 눈에 보이는 피해보다는 사료효율의 저하, 발육저하와 시장성이 매우 떨어져 눈에 안 보이는 피해가 더욱 크다.

흡수불량증후군 외에 병아리의 조기 폐사율이 증가하고 종란의 부화율 감소가 일어날 수 있으며 장염으로 인해 설사를 동반하며, 또한 전염성 훼브리셔스낭병(F낭병)과 같이 면역형성을 일시적으로 억제하기도 한다.

닭 전염성 F낭병(Infectious bursal disease)바이러스는 어린 닭에서 발생하는 급성 전염성질환으로 면역조직, 특히 F낭에 1차적으로 감염되어 면역기관이상을 일으키는 질병으로 어린병아리에 감염되면 2차적인 바이러스나 세균 감염에 대한 감수성이 높아지며, 백신효능을 저하시키는 등의 면역억제 및 생산성저하를 유발하는 질병으로서, 감염된 닭의 분변으로 배설된 바이러스가 오염된 사료나 물 등을 섭취함으로 감염이 나타난다.

3 ~ 8주령의 산란계에 바이러스가 감염될 경우 깃털이 헝클어지고 사료와 물을 섭취하지 않으며, 몸을 웅크린다.

항문 깃털에 수양성 또는 백색 설사가 묻어 있으며, 병이 진행되면 심한 체중감소와 함께 운동실조, 심한 허탈 등이 나타내며 폐사한다.

살모넬라증(Salmonellosis)의 원인균은 Salmonella enteritidis , Salmonella gallinarium, Salmonella pullorum이 감염되어 질병을 일으킨다.

조류에서 발생하는 급·만성의 전염병으로 모든 일령에 나타나는 패혈증에 의한 높은 폐사율이 특징이며, 양계산업에 막대한 경제적 손실을 주고 있는 질병으로서 일반적인 증상으로서는 벼슬이 창백하고 웅크리고 눈을 감은 채 앉아 있으며, 심한 장염과 황색 또는 푸른색의 설사 증상을 보이며 폐사율이 높은 것이 특징이다.

또한, 사료섭취가 떨어지고 산란율이 감소하며 지속적으로 질병이 확산되는 경향이 있으며 폐사가 일어난다.

닭 대장균증(E. coli , Avian colibacillosis)은 호흡기질병으로서, 출혈성장염과 복합 감염되는 경우 막대한 경제적 피해를 초래하는 중요한 질병이며, 전염성기관지염바이러스와 뉴캣슬병 바이러스 및 마이코플라스마균과 복합적으로 호흡기질병을 유발하게 되는 경우가 일반적이다.

캠필로박터병(Campylobacteriosis)의 원인균인 Campylobacter jejuni는 식중독 원인균의 하나로 감염된 동물의 분변으로 배출되어 분변 및 토양에 오염되어 이를 통해 다른 동물로 전염된다.

이 질병에 감염되면 설사를 주증으로 육류제품이나 애완동물을 통해 사람으로도 감염될 수 있는 인수공통전염병의 중요한 식중독 원인균의 하나이다.

대부분의 동물에 감수성이 있으며, 감염된 동물의 분변으로 배출되어 분변 및 토양에 오염되어 이를 통해 다른 동물로 전염이 되며, 사람으로의 감염경로는 닭, 칠면조 등의 덜 익힌 가금류 혹은 원유 등이 주요 원인이 되기도 한다.

캠필로박터(Campylobacter) 박테리아는 증상이나 질환을 일으키지 않은 채 인간과 동물의 소화관에 존재할 수 있다.

하지만, 인간이 생우유, 오염된 물, 또는 충분히 조리하지 않은 육류나 가금육에 들어 있는 생균을 섭취한다면, 캠필로박터증에 걸릴 수 있다.

Campylobacter 감염증은 일반적으로 박테리아를 섭취한 후 2일에서 7일 내에 나타나며, 열과 두통, 근육통에 이어 설사, 위통 및 구토를 포함한다.

닭 마이코플라즈마 감염증(Mycoplasmosis)은 닭에 병원성이 높은 Mycoplasma gallisepticum(MG)이 감염되는 것으로 알려져 있다.

MG는 만성호흡기병의 원인체이며 주로 일반적인 증상으로는 콧물, 이상 호흡음 및 기침 등의 호흡기증상이 나타나며 육수와 육간이 창백하며 야위고 성장이 지연되며 우모가 거칠고 원기가 없어 보인다.

관절이 종창되거나 발바닥이 붓고 파행증상을 나타내면서 걷기를 싫어하며 급성으로 감염된 닭은 녹색변을 확인할 수 있다.

대장균이나 전염성기관지염등과 혼합 감염시 그 증상은 심하게 나타날 수 있다.

황색 포도상구균증(Staphylococcosis)은 뼈, 건 및 관절 등에 침입하여 병소를 유발하며, 급성폐사를 일으키는 패혈증, 내장이나 피부 등의 국소조직의 농양형성, 화농성관절염 및 건활막염이 특징이다.

Staphylococcus aureus는 사람에 화농성질환과 포도구균성 식중독을 일으키므로 포도상구균증에 걸린 닭은 환경식품에 오염원이 될 수 있는 질환이다.

이러한 질병들을 예방하기 위해서는 현재 일반적으로 상기 질병에 대한 예방은 일부 예방약을 사용하고 있으나, 질병이 발생되면 항생제, 설파제 등을 사용하여 질병을 치료하고 있는 실정이다.

그러나 상기 항생물질이나 항균제 등 약제의 사용은 내성균 출현의 문제 또는 축산물 안전성의 문제를 일으킬 뿐만 아니라, 닭 전염성질병에 대한 예방 또는 치료를 위하여 항생제를 투여하는 경우에는 증체량이 감소되는 문제점도 발생된다.

따라서, 안전성에 대한 문제가 발생되지 않으면서 생체내에서 상승효과를 나타내어 생체내의 면역 시스템 중 보체계의 활성화 및 여러 가지 사이토킨(cytokine)의 활성화 및 일상의 식품 성분과의 상승작용으로 신체 항산성(抗酸性)을 유지하도록 역할을 하는 천연약용식물들을 이용하여 닭 전염성질병에 대한 예방 및 치료물질을 개발하여 항생물질의 대체 물질에 대한 연구가 요구되고 있는 실정이다.

본 발명은 상기와 같은 문제를 해결하기 위하여, 인체에 무해한 천연약용식물들의 추출물들과 면역항체가 형성된 난황을 이용하여 항생 물질을 대체할 수 있는 닭 전염성질병 예방용 사료첨가조성물을 제공하려는 목적이 있다.

본 발명의 닭 전염성질병 예방용 사료첨가조성물은, 조성물의 전체 중량을 기준으로 산수유 추출물 7 ~ 15 중량 %, 여정실 추출물 10 ~ 15 중량 %, 어성초 추출물 10 ~ 15 중량 %, 오배자 추출물 2 ~ 5 중량 %, 감초 추출물 3 ~ 5 중량 %, 현지초 추출물 5 ~ 10 중량 %, 면역항체가 형성된 난황 40 ~ 60 중량 %로 구성된다.

상기 산수유 추출물, 여정실 추출물, 어성초 추출물, 오배자 추출물, 감초 추출물, 현지초 추출물은, 물에 물 중량대비 10 ~ 20 중량 %의 상기 추출물의 재료인 산수유, 여정실, 어성초, 오배자, 감초, 현지초 중 선택된 1종을 넣고 90 ~ 100 ℃에서 2 ~ 3시간동안 열수추출하여 얻은 것이 특징이다.

상기 산수유 추출물, 여정실 추출물, 어성초 추출물, 오배자 추출물, 감초 추출물, 현지초 추출물은 당도가 14 ~ 30 Brix인 것이 특징이다.

상기 면역항체가 형성된 난황은 닭 레오바이러스(Reovirus), 닭 전염성F낭병 바이러스 (Infectious bursal disease virus), 살모넬라균증(Salmonella enteritidis, Salmonella gallinarium , Salmonella pullorum), 닭 대장균증(Avian colibacillosis), 캠필로박터병(Campylobacteriosis), 닭 마이코플라즈마 감염증(Mycoplasmosis), 황색 포도상구균증(Staphylococosis)으로 이루어진 항원들을 접종한 산란계가 낳은 계란에서 얻은 것이 특징이다.

본 발명에 의해, 항생물질을 대체할 수 있음과 동시에 인체 무해한 천연약용식물들의 추출물과 면역항체가 형성된 난황을 이용하여 안전성 및 안정성을 확보한 상태에서 양계 농가의 소득증대에 크게 이바지할 수 있는 닭 전염성질병 예방용 사료첨가조성물이 제공된다.

도 1은 본 발명인 닭 전염성질병 예방용 사료첨가조성물의 제조방법도.

본 발명에 대하여 보다 상세히 설명하면 다음과 같다.

본 발명의 발명자들은 환경 친화적이고 강력한 항균작용과 면역력증진 효과를 갖고 있는 여러 천연약용식물들을 이용하여 항생물질 대신에 닭 전염성질병에 대한 예방효과를 갖는 물질을 개발하기 위한 목적으로 수차례 연구한 결과, 수많은 천연약용식물들 중 산수유, 여정실, 어성초, 오배자, 감초, 현지초 등을 선별하게 되었다.

본 발명의 주재료를 보면

① 산수유(Cornus officinalis)는 층층나무과 산수유(山茱萸)나무의 열매로써, 과육(果肉)에는 코르닌(cornin), 모로니사이드(Morroniside), 로가닌(Loganin), 타닌(tannin), 사포닌(Saponin) 등의 배당체와 포도주산·사과산·주석산 등의 유기산이 함유되어 있고, 그밖에 비타민 A와 다량의 당(糖)도 포함되어 있다.

종자에는 팔미틴산·올레인산·리놀산 등이 함유되어 있으며, 성분 중 코르닌은 부교감신경의 흥분작용이 있는 것으로 알려져 있다.

한방에서는 산수유의 과육을 약용으로 사용하였으며 강음(强陰), 신정(腎精)과 신기(腎氣)보강, 수렴 등의 효능이 있다고 하며, 두통, 이명(耳鳴), 해수병, 해열, 월경과다 등의 약재로 쓰이며 식은땀· 야뇨증 등의 민간요법에도 사용된다.

② 여정실(Ligustrum japonicum)은 쌍떡잎식물 용담목 물푸레나무과의 상록 관목으로서, 올레아놀릭 산(oleanolic acid), 포도당, 팔미트 산(palmitic acid), 유솔리산(ursolic acid)가 함유되어 있으며, 종자에는 지방유가 함유되어 있다.

약리작용으로는 강심·이뇨 작용과 간 기능 보호 작용이 보고되어 있으며, 건강한 사람의 림프 세포의 모세포 전화 작용을 촉진시키는 작용도 하며, 황색포도상구균, 이질간균, 인플루엔자, 녹농균, 대장균을 억제하는 작용도 보이며, 항암 효과에도 활성 반응을 보인다.

임상결과 백혈구감소증에 약침 제제로 효력이 있으며, 만성간염에도 유효율을 높여주며, 고지혈증 환자가 1개월간 복용하여 총 콜레스테롤의 수치를 70.6% 감소시켜준다고 보고된 바가 있다.

③ 어성초(Houttynia cordat)는 삼백초과의 약모밀(Houttuynia cordata thunberg)의 개화기의 지상부를 말한다.

일본에서는 십약(十藥)이라하며, 중국에서는 전초 또는 지상부라고 규정하고 있다.

어성초의 생김새는 줄기에 세로주름이 있고 마디가 분명하다.

밑의 마디에는 가는 뿌리가 남아 있고 질은 무르며 꺾어지기 쉽다.

잎은 말리거나 쭈그러져 있으나 펴면 심장형으로 되어 있다.

잎은 끝이 뾰족하고 윗면은 어두운 황록색이나 황갈색이고 아랫면은 회녹색이나 회갈색이다.

어성초란 잎에서 고기 비린내가 나기 때문에 붙여진 이름으로 이 약은 잎을 비벼서 부수면 생선비린내가 나며 맛은 맵고 성질은 약간 차다.

어성초는 해열, 배농(排膿)작용이 뛰어나 폐 농양으로 인한 기침, 피고름을 토할 때, 폐렴, 급 만성기관지염, 장염, 요로감염증, 종기에 쓰이며, 열이 많고 소변을 못 볼 때 사용한다.

약리작용으로 항균작용, 면역증강작용, 항염증작용, 이뇨작용, 진해작용이 보고되었다.

④ 오배자(Rhus chinensis)는 매미목[同翅目] 진딧물과의 오배자(五倍子)면충이 옻나무과의 붉나무(오배자나무)의 잎에 기생하여 만든 벌레 혹으로서, 한방에서는 수렴(收斂), 지혈, 해독, 항균의 효력이 있어 설사, 탈항, 위궤양, 십이지장궤양, 도한, 유정(遺精), 혈변, 혈뇨, 구내염 등에 효능이 있다고 알려졌으며, 주요 성분인 탄닌(50 ~ 60 %)의 수렴작용에 의하여 지사작용, 지혈작용, 억균작용, 선분비억제 작용을 하며, 약리작용으로 수렴효과, 항 미생물작용, 항 생육작용, 간 기능보호, 황산화작용이 보고되어 있다.

⑤ 감초(Glycyrrhiza uralensis)는 동속식물의 뿌리와 기는 줄기를 껍질이 붙은 채로, 또는 껍질을 벗겨서 사용하며 특이한 냄새가 나며 맛은 달다.

감초는 우랄감초, 굽은 감초라고 하며 러시아(시베리아), 이란, 아프가니스탄, 파키스탄, 중국(감숙성, 신강성), 몽골에서 자라며 우리나라에서 재배하기도 한다.

감초는 모든 약의 독성을 조화시켜서 약효가 잘 나타나게 하며 장부의 한열과 사기를 다스리고 모든 혈맥의 소통을 잘 시키며 근육과 뼈를 튼튼하게 해주며, 약리작용으로서는 해독작용, 간염, 두드러기, 피부염, 습진 등에 효과가 있으며, 진해·거담, 근육이완, 이뇨작용, 항염작용이 있으며 소화성궤양을 억제시킨다.

⑥ 현지초(Geranium thunbergii Seib. et Zucc.)는 쥐손이풀과(Geraniaceae)로서 수렴, 정장, 지시약으로 설사, 복통에 사용하고, 종기, 피부병 등에 외용(外用)제로 쓰이며, 항 진균작용(抗眞菌作用)이 있다.

현지초는 풍습(風濕)을 제거시키고 경락을 소통시켜 골격과 근육을 강건하게 하므로 사지마비동통, 관절불리, 타박상등에 활용되며, 이질과 만성설사복통, 장염, 피부가려움증과 옴, 악창에 효과기 있으며, 항균 및 항바이러스 작용이 있어 황색포도상구균, 연쇄상구균, 폐렴쌍구균, 이질균 및 유행성 바이러스 증식을 억제하며, 술에 담가 우려내어 먹으면 중풍을 예방하고 혈액순환을 좋게 하는데 효과가 뛰어나고 흑설탕과 반씩 섞어서 발효시켜 복용하면 만성, 장염, 중풍, 신경통 등을 예방하고 치료할 수 있다.

또한, 혈액순환을 좋게 하고 출혈을 멎게 하며 근육과 뼈를 튼튼하게 하고 소변을 잘 나오게 하며 손발의 마비나 경련을 치료하는데 효과가 좋다고 알려져 있다.

본 발명자는 상기와 같은 효능을 갖는 천연약용식물들을 각각 추출하고, 여기에 면역항체가 형성된 난황을 혼합하여 사용할 시, 닭 전염성질병인 닭 레오바이러스, 닭 전염성F낭병 바이러스, 닭 대장균증, 살모넬라증, 캠필로박터병, 마이코플라스마감염증, 황색포도상구균증에 대한 면역력을 증강시켜 주고 일시적인 치료 목적으로 사용되는 항생물질을 사용하지 않고도 질병을 예방 치료할 수 있음을 알게 되어 본 발명을 발명하게 되었다.

본 발명의 닭 전염성질병 예방용 사료첨가조성물은 조성물의 전체 중량을 기준으로 산수유 추출물 7 ~ 15 중량 %, 여정실 추출물 10 ~ 15 중량 %, 어성초 추출물 10 ~ 15 중량 %, 오배자 추출물 2 ~ 5 중량 %, 감초 추출물 3 ~ 5 중량 %, 현지초 추출물 5 ~ 10 중량 %, 면역항체가 형성된 난황 40 ~ 60 중량 %로 구성되는 것이 특징이다.

이때, 상기 산수유추출물, 여정실추출물, 어성초추출물, 오배자추출물, 감초추출물, 현지초추출물은, 물에 물 중량대비 10 ~ 20 중량 %의 상기 추출물의 재료인 산수유, 여정실, 어성초, 오배자, 감초, 현지초 중 선택된 1종을 넣고 90 ~ 100℃에서 2 ~ 3시간동안 각각 열수 추출하여 생성되는 것이 좋다.

또한, 상기 면역항체가 형성된 난황은 닭 레오바이러스, 닭 전염성F낭병 바이러스, 닭 대장균증, 살모넬라증, 캠필로박터병, 마이코플라스마감염증, 황색 포도상구균증으로 이루어진 항원들을 접종한 산란계가 낳은 계란에서 얻은 것이 특징이다.

즉, 상기와 같이 항원(antigen)을 생체내에 투여하면 이 항원의 자극에 의해 혈청내에 항체가 생성되며, 이 항체가 특정항원과 접촉하였을 때 이 특정항원에 대응하는 성질을 갖게 됨으로써 이를 면역항체라고 한다.

이상과 같이, 본 발명의 닭 전염성질병 예방용 사료첨가조성물은 닭 전염성질병의 원인체인 닭 레오바이러스(Reovirus), 닭 전염성F낭병(Infectious bursal disease)바이러스, 살모넬라균증(Salmonellosis), 대장균(Avian colibacillosis), 캠필로박터병(Campylobacteriosis), 닭 마이코플라즈마 감염증(Mycoplasmosis), 황색 포도상구균증(Staphylococosis)에 대해 뛰어난 예방효과를 나타냄으로써, 사료첨가제 등으로도 매우 유용하게 이용될 수 있다.

삭제

본 발명에 따른 닭 전염성질병 예방용 사료첨가조성물의 유효 투여량은 체내에서 활성성분의 흡수도, 불활성화율 및 배설속도, 연령, 성별 및 상태, 치료할 질병의 중증 정도 등에 따라 적절히 선택될 수 있다.

이하, 본 발명에 대하여 실시예 및 실험예를 통하여 보다 상세히 설명하나, 이들이 본 발명의 범위를 제한하는 것은 아니다.

<실시예 1> 천연약용식물들의 추출물 제조

가. 천연약용식물들 선정

본 발명에 있어서 세균성으로 질병을 일으키는 닭 질병에 대한 항균성 측정시험 결과, 항균성 시험결과를 토대로 산수유, 여정실, 어성초, 오배자, 감초, 현지초를 선정하였다.

나. 천연약용식물들의 준비방법

천연약용식물들은 깨끗한 물로 2회 이상 씻어준 다음, 건조시킨 후 사용하였다.

다. 천연약용식물들의 추출

상기 '나'에서 준비된 천연약용식물들을 각각 분쇄기를 이용하여 분쇄한 다음, 추출기(동남산업 DN0017^TM)에 증류수 5,000 ㎖에 생약재 500g을 넣고 100 ℃에서 3시간 추출하였으며, 추출한 추출물은 Advantec 1번 여과지(Advantec 1번 Filter paper)를 이용하여 1차 여과 후 Advantec 1.0 여과지(Advantec 1.0 Membrane filter)를 이용하여 추출물을 각각 2차 여과하였다.

라. 추출액 농축

상기 '다'에서 제조된 천연약용식물의 추출액을 회전증발농축기(BUCHI, Rotavapor R-220)를 이용하여 농축한 다음 당도(Brix. ATAGO, HSR500^TM)를 측정한 결과, 산수유추출물(20Brix), 여정실추출물(30Brix), 어성초추출물(14Brix), 오배자추출물(20Brix), 감초추출물(24Brix), 현지초추출물(16Brix)을 제조하였다.

<실시예 2> 면역항체가 형성된 난황 생산

1. 주요 질병 원인체에 대한 항원제조

가. 닭 레오 바이러스(Reo virus)

1) 바이러스접종 및 배양

10 일령 발육계란의 계태아 섬유아세포(세포수 120만개/㎖)를 증식용 배양액(부기)으로 37℃ 인큐베이터에서 약 18시간 배양한 다음, 10^3.0TCID₅₀/의 레오 바이러스를 각각 접종하고 37℃ 인큐베이터에서 2~3일간 회전 배양하면서 바이러스에 의한 세포변성효과를 확인 관찰한 후 약 80%이상 세포변성효과가 일어났을 때까지 배양하였다.

2) 바이러스수확 및 처리

바이러스를 접종하고 37℃ 인큐베이터에서 2~3일간 회전 배양하면서 레오 바이러스에 의한 세포변성효과를 확인 관찰한 후 약 80%이상 세포변성효과가 일어났을 때 수확하며, 이때 배양 감염액의 바이러스 함유량은 1 ㎖당 10^8.0TCID₅₀이상이어야 하며, 감염액은 -80℃에서 3회 동결 융해한 다음 원심침전 후 상층액을 농축하여 항원으로 사용하였다.

나. 닭 전염성F낭병(Infectious bursal disease)바이러스

1) 바이러스접종 및 배양

10 일령 SPF 발육계란의 계태아 섬유아세포(세포수 120만개/㎖)를 증식용 배양액(부기)으로 37℃ 인큐베이터에서 약 18시간 배양한 다음, 10^4.0TCID₅₀/의 전염성 F낭병 바이러스를 접종하고 2~3일간 회전 배양하면서 바이러스에 의한 세포변성효과를 확인 관찰한 후 약 80%이상 세포변성효과가 일어났을 때까지 배양하였다.

2) 바이러스수확 및 처리

바이러스를 접종하고 37℃ 인큐베이터에서 2~3일간 회전 배양하면서 전염성 F낭병 바이러스에 의한 세포변성효과가 약 80%이상 일어났을 때 수확하며, 이때 배양 감염액의 바이러스 함유량은 1㎖당 10^7.0TCID₅₀이상이어야 하며, 감염액은 -80 ℃에서 3회 동결 융해한 다음 원심침전 후 상층액을 농축하여 항원으로 사용하였다.

<부기. 증식용 배양액 조성성분(1,000 ㎖)>

a-MEM --------------------------------- 930 ㎖

Fetal bovine serum(FBS) --------------- 50 ㎖

7.5% NaHCO_{3 ---------------------------------------------} 20 ㎖

Penicillin G-Na ----------------------- 100 unit/㎖

Streptomycin sulfate ------------------ 100 /㎖

Fungizone ----------------------------- 0.025 /㎖

다. 살모넬라(Salmonella)균

1) 종균배양

-80 ℃에 보관중인 살모넬라 속(S. enteritidis , S. gallinarium , S. pullorum) 균주를 SBA(Sheep blood agar)배지에 각각 이식하여 37 ℃ 인큐베이터에서 20시간 배양 후, 전형적인 단독집락을 선택하여 BHI(Brain heart infusion) 액체배지에 각각 계대 배양한 배양액을 종균으로 사용하였다.

2) 본 배양

BHI(Brain heart infusion) 액체배지에 살모넬라 속(S. typhimurum , S. gallinarium , S. pullorum) 균주를 본 배양배지의 2.5%를 각각 접종하고 37 ℃ 인큐베이터에서 120rpm으로 교반하면서 18시간 진탕 배양하였다.

3) 균체수집 및 처리

37 ℃ 인큐베이터에서 18시간 각각 진탕 배양한 감염배양액에 0.3% 포르말린을 첨가하여 불활화시킨 후 농축한 다음, 농축한 배양균체를 5,000 rpm에서 30분간 원심 분리하여 균체를 수집하였고, Dulbecco's PBS(Phosphate buffered solution)로 수집된 균체를 2회 세척한 후 분광광도계(Spectrophotometer)를 이용하여 410 nm의 파장에서 O.D(Optical density)값을 측정한 다음, 1.0이 되도록 조정하여 항원으로 사용하였다.

라. 대장균(Escherichia coli , Avian colibacillosis)

1) 종균배양

-80 ℃에 보관중인 균주를 SBA(Sheep blood agar) 배지에 이식하여 37 ℃인큐베이터에서 20시간 배양한 후, 전형적인 단독집락을 선택하여 BHI(Brain heart infusion) 배지에 계대 배양하여 배양한 배양액을 종균으로 사용하였다.

2) 본 배양

BHI(Brain heart infusion) 액체배지에 종균을 본 배양배지의 2.5%를 접종하여 37 ℃ 인큐베이터에서 120rpm으로 교반하면서 18시간동안 진탕배양 하였다.

3) 균체수집 및 처리

37℃ 인큐베이터에서 18시간 진탕 배양한 감염배양액에 0.3% 포르말린을 첨가하여 불활화시킨 후 농축한 다음, 농축한 배양균체를 5,000rpm에서 30분간 원심 분리하여 균체를 수집하였고, Dulbecco's PBS(Phosphate buffered solution)로 수집된 균체를 2회 세척한 후 분광광도계를 이용하여 410 nm의 파장에서 O.D값을 측정한 다음, 1.0이 되도록 조정하여 항원으로 사용하였다.

마. 캠필로박터병(Campylobacteriosis)

1) 종균배양

-80 ℃에 보관중인 균주(Campylobacter jejuni )를 Modified Campy blood free 한천배지 또는 Abeyta-Hunt Blood 한천배지에 접종하여 혐기성배양용 gas pack을 넣은 혐기성배양기에서 24~48시간 배양한 후 전형적인 단독집락을 선택하여 Campylobacter enrichment broth 5% Horse serum을 첨가한 배지에 이식하여 혐기성배양기에서 48시간 배양한 배양액을 종균으로 사용하였다.

2) 본 배양

배양 종균을 Blood agar 또는 Campylobacter agar배지에 5% Horse serum을 첨가한 배지에 접종하여 혐기성배양용 gas pack을 넣은 혐기성배양기에서 2~3일간 배양하였다.

3) 균체수집 및 처리

배양된 Campylobacter 균을 셀 콜렉터(cell collecter)로 회수하여 멸균생리식염수(PBS, pH7.2)에 부유시킨 다음, 0.2%가 되도록 포르말린을 첨가하여 37℃에서 2일간 불활화시킨 후, 배양균체를 5,000rpm에서 30분간 원심 분리하여 균체를 수집하였고, Dulbecco's PBS(Phosphate buffered solution)로 수집된 균체를 2회 세척한 후 분광광도계를 이용하여 410 nm의 파장에서 O.D값을 측정한 다음, 1.0이 되도록 조정하여 항원으로 사용하였다.

바. 닭 마이코플라즈마 감염증(Mycoplasmosis)

1) 종균배양

-80℃에 보관중인 균주를 Mycoplasba gallisepticum 배양용 액체배지 5㎖에 이식하여 37℃ 인큐베이터에서 48시간 140rpm으로 배양하면서 배양된 종균의 배지색의 pH 변화를 확인하였다.

2) 본 배양

종균을 배양한 균체 5㎖에 Mycoplasba gallisepticum 배양용 액체배지 20㎖을 첨가하고 동일한 방법으로 배양하면서 배지색의 변색을 확인한 후 배양된 균체의 5배량의 배양액을 첨가하고 동일한 방법으로 배양하였다.

3) 균체수집 및 처리

배양한 감염배양액에 0.3% 포르말린을 첨가하여 불활화시킨 후 농축한 다음, 배양균체를 5,000rpm에서 30분간 원심 분리하여 균체를 수집한 후, Dulbecco's PBS (Phosphate buffered solution)로 수집된 균체를 2회 세척한 후 분광광도계를 이용하여 410 nm의 파장에서 O.D값을 측정한 다음, 1.0이 되도록 조정하여 항원 항원으로 사용하였다.

2. 면역형성용 면역제제

상기 1과 같이 준비된 닭 레오바이러스, 닭 전염성F병 바이러스 및 살모넬라증, 닭 대장균증, 캠필로박터병, 닭 마이코플라즈마 감염증의 농축된 항원들을 각각 혼합하여 30%의 유제액을 만든 다음, 70%의 면역증강제(Oil adjuvant, Montnide ISA70)를 가하여 잘 혼합한 다음, 13,000rpm에서 3분간 균질기(Homogenizer)를 이용하여 면역제제를 생산하였다.

3. 면역형성용 면역제제 접종방법

상기 2.에서 생산된 산란계 면역형성용 면역제제를 20주령의 산란계에 마리당 0.8㎖씩 앞가슴 근육에 1차로 접종하고, 2차 접종은 1차 접종 3주후, 3차 접종은 2차 접종 3주후에 근육에 각각 접종하였으며, 그 이후 면역제제 접종은 3개월 단위로 추가 접종하였다.

4. 면역항체가 형성된 난황 수거

상기 3.에 따라 면역제제를 3차접종 2주후부터 면역 항체가 형성된 계란을 위생적으로 수거한 후, 150ppm의 차아염소산나트륨을 계란에 분사하여 깨끗하게 세척한 다음, 건조실에서 계란 표면의 수분을 완전히 건조시켰다.

상기와 같이 건조시킨 계란을 할란하여 면역항체가 형성된 난황을 채취하여 분말형태로 제조하였다.

5. 난황 내 면역난황항체 추출

항체가 형성된 난황 내 면역항체를 추출하기 위하여 수거한 종란을 세척 소독한 후 난황만 분리하여 Mixer한 다음, 이온수(pH 4.0)와 난황 유제액을 5 : 1의 비율로 혼합하여 냉실(4℃)에 1~2일 보존한 후 상층액을 수거하여 8,000rpm에서 10분간 원심하여 난황항체를 분리하였다.

<실시예 3> 본 발명인 닭 전염성질병 예방용 사료첨가조성물1

상기 실시예 1에서 제조된 천연약용식물들의 추출물들을 혼합하되, 전체중량을 기준으로 산수유추출물 6%(20Brix), 여정실추출물 8%(30Brix), 어성초추출물 10%(14Brix), 오배자추출물 5%(20Brix), 감초추출물 3%(24Brix), 현지초추출물 8%(16Brix)의 비율로 혼합하였다.

여기에 상기 실시예 2에서 제조된 면역항체가 형성된 난황을 넣되, 전체중량을 기준으로 면역항체가 형성된 난황 60%를 넣고 잘 혼합한 후, 이를 분무건조기(Spray dryer)를 이용하여 디스크 및 노즐형태의 분무방법으로 수분을 건조시켜 수분 함량이 10% 미만의 분말형태로 건조시켜 본 발명인 닭 전염성질병 예방용 사료첨가조성물 1을 제조하였다.

<실시예 4> 본 발명인 닭 전염성질병 예방용 사료첨가조성물2

상기 실시예 1에서 제조된 천연약용식물들의 추출물들을 혼합하되, 전체중량을 기준으로 산수유추출물 5%(20Brix), 여정실추출물 5%(30Brix), 어성초추출물 7%(14Brix), 오배자추출물 4%(20Brix), 감초추출물 3%(24Brix), 현지초추출물 6%(16Brix)의 비율로 혼합하였다.

여기에 상기 실시예 2에서 제조된 면역항체가 형성된 난황에서 분리한 항체추출액을 넣되, 전체중량을 기준으로 면역항체 추출액 70%를 넣고 잘 혼합하여 본 발명인 닭 전염성질병 예방용 사료첨가조성물 2를 제조하였다.

<실험예 1> 천연약용식물의 항균력 측정

1. 항균력 실험에 사용한 병원체

닭 질병을 일으키는 닭 대장균(E. coli), 살모넬라균(S. enteritidis , S. gallinarium , S. pullorum), 닭 마이코플라즈마균(Mycoplasma gallisepticum), 황색포도상구균(Staphylococcus aureus)에 대한 천연약용식물의 추출물에 대한 항균성을 측정하였다.

2. 실험재료

천연약용식물인 산수유, 여정실, 어성초, 오배자, 감초, 현지초를 각각 추출하여 여과지(Advantec 1번 Filter paper)를 이용하여 1차 여과 후 원심분리기(한일 Supra 22K^TM)를 이용하여 5,000rpm에서 30분간 원심한 후 상청액을 여과지(Advantec 1.00 Membrane filter)를 이용하여 2차 여과한 후, 진공농축기(EYELA SB1000^TM)를 이용 80 ℃ 온탕수조에서 10배로 감압 농축하여 실험재료로 사용하였다.

3. 페이퍼 디스크

페이퍼 디스크(ADVANTEC AD49005040^TM, 6)에 상기 천연약용식물의 실험재료들을 각각 20 ㎖씩 흡착시킨 다음, 50 ℃ 건조기에서 충분히 건조시킨 후 항균력 실험에 사용하였다.

4. 병원체 배양

가. 병원체(균주)

닭 대장균(E. coli), 살모넬라균(S. enteritidis , S. gallinarium , S. pullorum) 및 황색포도상구균(Staphylococcus aureus)

나. 배양 및 처리

닭 질병의 원인체에 대한 항균력 실험을 실시하기 위하여 -80℃에 보관중인 상기 균주를 agar 평판배지에서 24~48시간 배양하여 Colony를 선정하여 균 배양액인 BHI(Brain heart infusion) 배지에 접종하여 37℃ 인큐베이터에서 18~24시간 균주를 배양하였으며, 배양액의 균 증식확인은 분광광도계를 이용하여 410nm의 파장에서 O.D값을 측정한 다음, 1.0으로 조정하여 사용하였다.

5. 항균력 실험

페트리디쉬(Petri dish, 87×15mm)에 BHI(Brain heart infusion) agar 배지를 15㎖씩 가한 평판배지에 각각 배양한 균액 100㎕를 골고루 도말하고, 그 위에 각각의 상기 3항에서 준비해 둔 페이퍼 디스크들을 각각 올려놓고 37℃ 인큐베이터에서 24시간 배양한 다음, 디스크 주변에 형성된 Clear zone(균 증식이 억제되어 투명하게 형성된 지역)의 직경을 측정하였다.

6. 실험결과

상기 실험결과, 아래의 표1과 같이 나타났다.

사용균주	Clear zone(mm)
	산수유	여정실	어성초	오배자	감초	현지초
Escherichia coli	10	10	3	20	10	5
Salmonella enteritidis	9	8	4	11	7	3
Salmonella gallinarium	15	10	2	30	4	10
Salmonella pullorum	8	10	2	25	5	8
Staphylococcus aureus	10	10	6	14	12	15

<실험예 2> 천연약용식물의 항균력시험

1. 항균력 실험에 사용한 병원체 -Mycoplasma gallisepticum

2. 실험재료

천연약용식물인 산수유, 여정실, 어성초, 오배자, 감초, 현지초를 각각 추출하여 여과지(Advantec 1번 Filter paper)를 이용하여 1차 여과 후 원심분리기(한일 Supra 22K^TM)를 이용하여 5,000rpm에서 30분간 원심한 후 상청액을 여과지(Advantec 1.00 Membrane filter)를 이용하여 2차 여과한 후, 진공농축기(EYELA SB1000^TM)를 이용 80 ℃ 온탕수조에서 10배로 감압 농축하여 실험재료로 사용하였다.

3. 병원체 배양

균주를 배양용 액체배지 5 ㎖에 이식하여 37℃ 인큐베이터에서 48시간 140rpm으로 배양하면서 배양된 종균의 배지색의 pH 변화를 확인하면서 종균을 배양한 균체 5㎖에 Mycoplasba gallisepticum 배양용 액체배지 20㎖을 첨가 배양액을 첨가하고 동일한 방법으로 배양하였으며, 배양액의 균 증식확인은 분광광도계를 이용하여 410nm의 파장에서 O.D값을 측정하여 사용하였다.

4. 균 증식배양 실험

O.D값을 측정하여 1.50의 균액을 시험관에 분주한 다음 상기 2.에서 준비한 추출액 0.1%을 각각 넣어 37℃ 인큐베이터에서 대조군과 함께 48시간 배양한 후 균 증식상태를 간접적으로 확인하고 O.D값을 측정하였다.

분광광도계를 이용하여 410nm의 파장에서 측정한 결과, 어성초, 오배자, 감초, 현지초 추출액은 균 증식이 억제되어 O.D값의 수치가 낮아지고, 균 증식을 억제하지 못한 산수유, 여정실 추출액은 O.D값의 수치가 높게 나타내었다.

5. 실험결과

상기 실험결과, 아래의 표2와 같이 나타났다.

생약	Mycoplasma gallisepticum
	균증식	O.D값
산수유 추출물	+*	1.1399
여정실 추출물	+	1.1654
어성초 추출물	-*	0.7110
오배자 추출물	-	0.6270
감초 추출물	-	0.6940
현지초 추출물	-	0.7011
대조군	+	1.2791

* - : 균 증식하지 않음. + : 균 증식

실험예1에 기재된 표 1과 상기 표 2에 나타나 있듯이, 천연약용식물인 산수유, 여정실, 어성초, 오배자, 감초, 현지초의 추출물에서 닭 세균성질병의 병원체에 대한 항균력을 나타냄을 알 수 있었으며, 상기 결과들을 통해 본 발명자는 닭 전염성질병의 원인체에 대한 면역난황항체 및 천연약용식물인 산수유, 여정실, 어성초, 오배자, 감초, 현지초의 추출물을 첨가하여 사용하는 것이 바람직하다는 결론과 이에 근거하여 면역난황항체에 산수유, 여정실, 어성초, 오배자, 감초, 현지초의 추출물에서 전염성질병에 대한 감염을 더 효과적으로 예방 및 치료할 수 있을 것으로 사료되어 아래의 실험들을 시행하였다.

<실험예 3> 난황 내에 형성된 면역항체가 측정실험

1. 실험방법

항원의 균체를 초음파파쇄기(sonicator)로 처리하여 추출한 균체의 외피단백질(Outer membrane protein)을 라우로살코신(N-lauroylsarcosine)으로 처리한 후 세파덱스(Sephadex G-200 gel)를 이용한 컬럼 크로마토그래피(Column chromatatography)로 추출된 항원을 이용하여 효소면역측정법(Enzyme-linked immunosorbent assay : ELISA)으로 난황에 대한 면역항체가를 다음과 같은 방법으로 측정하였다.

가. 검사기구

① ELISA용 microplate

② Microplate(10㎕, 200㎕용), 12-Channel Multipipette(20~200㎕용)

③ Shaker(microplate용)

④ ELISA reader 및 washing

나. 검사 시약

1) 완충액 및 용액

① Carbonate coating buffer(0.M, pH 9.6)

·NaHCO₃ ----- 2.93 g

·Na₂CO₃ ----- 1.59 g

1,000㎖ DW에서 교반하면서 pH가 9.6이 되도록 조정하여 4 ℃보관하여 사용하였다.

② Phosphate buffered saline(PBS), pH 7.4

·NaCl --------- 8 g

·KH₂PO₄ ------ 0.2 g

·Na₂HPO₄ ----- 1.19 g

·KCl --------- 0.2 g

DW 1,000㎖에 용해한 다음 pH가 7.4로 조정하여 사용하였다.

③ Washing buffer(PBS + Tween 20)

· PBS 2,000㎖에 Tween 20을 1㎖씩 첨가하였다.

④ Blocking buffer : 2% BSA(Bovine serum albumin) in PBS

⑤ AP substrate solution(0.05M carbonate, pH 9.8)

·A 용액 : NaHCO₃ 4.2g + MgCl₂·6H₂O 0.203g-> 1,000㎖ DW

·B 용액 : Na₂CO₃ 5.3g + MgCl₂·6H₂O 0.203g-> 1,000㎖ DW

교반하면서 pH가 9.8이 될 때까지 B용액에 A용액을 천천히 혼합하여 4℃보관하여 사용하였다.

⑥ HRP substrate solution(0.1M Citrate-phosphate buffer, pH 5)

·0.1M Citrate acid : Citrate acid 19.21g을 1,000㎖ DW에 녹였다.

·0.2M Na₂HPO₄ : Na₂HPO₄ 28.4g을 1,000㎖ DW에 녹였다.

·0.1M Citrate acid 12.5㎖ + Na₂HPO₄ 12.85㎖ + DW 25㎖

상기 용액에 OPD(sigma P7288) 20㎎을 녹인 후 마지막으로 30% H₂O₂ 20㎕을 넣어 바로 사용하였다.

⑦ Stop solution : AP -> 1M NaOH

HRP -> 2.5M H₂SO₄

다. 면역항체가 확인 시험방법

① 항원을 Coating buffer에 적정농도로 희석(100배) 하였다.

② ELISA plate 각 well에 coating buffer로 희석된 항원 100㎕씩 분주한 다음 4℃에 overnight 시켰다.

③ Washing buffer를 각 well에 200㎕씩 분주한 다음 세척하였다.

이 과정을 3회 실시하였다.

④ 각 well에 blocking buffer 200㎕씩 분주한 다음 37℃에서 1시간 정치시 켰다.

⑤ Washing buffer를 각 well에 200㎕씩 분주한 다음 세척하였다.

이 과정을 3회 실시하였다.

⑥ 다른 U-form microplate를 이용하여 첫 well에 PBS 180㎕에 난황추출물 20㎕를 혼합하고 나머지 well에 PBS 100㎕씩 분주 후 첫 well의 혼합액 100㎕를 11번 well까지 2배수 계단 희석하여 옮긴 다음 마지막 well의 100㎕는 버렸다.

12번 well은 이미 역가를 알고 있는 면역난황항체 양성과 음성(Sigma 제조난황분말)을 100㎕ 씩 넣었다.

⑦ 항원이 흡착된 ELISA plate에 2진 희석된 난황추출물의 양성, 음성을 각 well에 옮긴 후 37℃에서 2시간 반응시켰다.

⑧ Washing buffer를 각 well에 200㎕씩 분주한 다음 세척하였다.

이 과정을 3회 실시하였다.

⑨ 콘쥬게이트(Conjugate)를 PBS에 희석하여 각 well에 100㎕씩 분주한 후 37℃에서 1시간 반응시켰다.

⑩ Washing buffer를 각 well에 200㎕씩 분주한 다음 세척하였다.

이 과정을 4회 실시하였다.

⑪ Substrate(OPD)를 각각 well에 100㎕씩 분주한 다음 실온에서 정확히 10분간 반응시켰다.

⑫ Stoping solution 50㎕를 가하여 반응을 중지시키고 ELISA reader(492nm)로 흡광도를 측정하여 P/N(시험품/음성)값이 2이상인 희석배수를 면역항체가로 판정하였다.

2. 실험결과

닭 레오바이러스, 닭 전염성F낭병 바이러스 및 살모넬라증, 닭 대장균증, 캠필로박터병, 닭 마이코플라즈마 감염증을 일으키는 항원을 산란계에 2차접종한 후 3주째부터 면역시킨 닭의 계란을 수득하여 난황 내에 형성된 면역항체가를 상기와 같은 방법으로 측정한 결과, 아래의 표 3과 같이 나타났다.

재료		ELISA항체가
		Reovirus	F낭병virus	Salmonella	E. coli	Mycoplasma
실험군	1	2,560	1,280	2,560	5,120	2,560
	2	1,280	2,560	5,120	2,560	2,560
	3	2,560	2,560	2,560	5,120	2,560
	4	2,560	1,280	5,120	2,560	5,120
	5	1,280	2,560	2,560	2,560	2,560
대조군	1	<10	<10	<10	<10	<10
	2	<10	<10	<10	<10	<10

상기 표 3에서와 같이, 닭 레오바이러스에 대한 항체가는 1,280~2,560배, 닭 전염성F낭병 바이러스 항체가는 1,280~2,560배를 각각 나타내었으며, 살모넬라균 항체가는 2,560~5,120배, 닭 대장균 항체가는 2,560~5,120배, 닭 마이코플라즈마균 항체가는 2,560~5,120배를 각각 나타내었으며, 대조군에서는 모두 10배 이하의 항체가를 나타냄을 알 수 있었다.

<실험예 4> 천연약용식물 함유 난황항체 역가 분석

1. 실험방법

난황 중에 들어있는 닭 레오바이러스, 닭 전염성F낭병 바이러스, 살모넬라균, 닭 대장균, 닭 마이코플라즈마 균에 대한 면역 항체가를 측정하였다.

이때, 대조군으로 음성난황 분말 및 면역항체가 형성된 난황(IgY)을 준비하였으며, 실험군으로는 면역항체가 형성된 난황(IgY)에 실시예 1에서 제조된 산수유추출물, 여정실추출물, 어성초추출물, 오배자추출물, 감초추출물, 현지초추출물을 각각 넣어 준비하고, 본 발명인 실시예 3의 조성물(IgY+산수유추출물+여정실추출물+어성초추출물+오배자추출물+감초추출물+현지초추출물)도 준비하여 면역 항체가를 측정하였다.

2. 실험결과

그 결과, 아래의 표4 와 같이 나타났다.

구분		ELISA항체가
		Reovirus	F낭병virus	Salmonella	E. coli	Mycoplasma
실험군	IgY+산수유	2,560	1,280	2,560	2,560	2,560
	IgY+여정실	1,280	1,280	2,560	2,560	1,280
	IgY+어성초	1,280	1,280	5,120	1,280	1,280
	IgY+오배자	1,280	1,280	2,560	5,120	1,280
	IgY+감초	1,280	1,280	1,280	2,560	1,280
	IgY+현지초	1,280	1,280	2,560	2,560	1,280
	IgY+6종혼합	1,280	1,280	2,560	1,280	1,280
대조군	양성 IgY	1,280	1,280	2,560	2,560	1,280
	음성 IgY	<10	<10	<10	<10	<10

상기 표 4에 나타나 있듯이, 본 발명인 실시예 3의 조성물이 닭 전염성질병을 일으키는 닭 레오바이러스, 닭 전염성F낭병 바이러스, 살모넬라균, 닭 대장균, 닭 마이코플라즈마 균 모두에 대해 면역 항체가를 나타냄을 알 수 있었다.

<실험예 5> 생약추출물의 최소발육억제 농도 측정

1. 실험방법

공시 균주를 Brain heart infusion(BHI) agar 평판에 계대 배양하여 얻은 colony를 BHI brith에 접종하여 37℃에서 24시간 배양하였다.

배양액의 균 증식확인은 분광광도계(Spectrophotometer)를 이용하여 410nm의 파장에서 O.D(Optical density)값을 측정하여 균 증식배양액을 O.D값 1.0로 조정 사용하였다.

2. 실험결과

그 결과, 아래의 표 5와 같이 나타났다.

사용균주	MIC(%)
	2.0	1.0	0.5	0.25	0.10
E. coli	-*	-	-	+	+
Salmonella gallinarium	-	-	+	+	+
Salmonella pullorum	-	-	+	+	+
Salmonella enteritidis	-	-	-	+	+
Staphylococcus aureus	-	-	-	-	+

* - : colony를 형성하지 않음. + : colony를 형성함

상기 표 5에 나타나 있듯이, 산수유, 여정실, 어성초, 오배자, 감초, 현지초를 각각 추출 혼합한 조성물을 닭의 병원성 세균에 대한 Minimum inhibitory concetration(MIC)을 조사한 결과, Staphylococcus aureus는 0.25%이상의 농도에서, Escherichia coli , Salmonella enteritidis는 0.5%이상의 농도에서, Salmonella gallinarium , Salmonella pullorum은 1%이상의 농도에서 각각 항균효과를 나타내었다.

<실험예 6> 조성물제제가 Salmonella 감염계군의 장관정착에 미치는 영향

1. 실험방법

Salmonella enteritidis 감염계군에 대한 설사발생 및 체중변화를 조사하기 위하여 특정 병원체 부재 종란(Specific pathogen free egg, SPF) 계란을 부화시켜 사육한 병아리로서, Salmonella 항체음성인 건강한 병아리 90마리(실험군 60마리, 대조군 30마리)를 선정하여 30마리씩 케이지에 사육하였다.

실험군으로써 실시예3의 조성물 1은 사료에 0.5%첨가하고, 실시예4의 조성물 2는 1일 마리당 2㎖씩을 14일간 급여하였으며, 대조군은 조성물을 첨가하지 않은 사료로 급여하였다.

2. 실험결과

1) Salmonella enteritidis 감염시험

실험결과, 아래의 표 6과 같이 나타났다.

구분		설사발생			증체량(g)
		1일	7일	14일	1일	7일	14일
실험군	실시예3 (조성물1)	0	11	2	448.60±3.20	875.54±22.18	923.12±23.21
	실시예4 (조성물2)	0	9	3	439.40±5.20	866.42±19.45	914.28±19.15
대조군		0	25	5	411.51±10.30	802.20±24.30	814.70±38.04

상기 표 6에 나타나 있듯이, Salmonella enteritidis 감염계군에 대한 설사발생 상태 및 체중변화를 조사하기 위하여 14일령의 병아리에 0.2㎖(Salmonella enteritidis 배양 균액 10⁷CFU/㎖)씩 경구투여 하였으며, 조성물 1은 사료에 0.5%첨가하고, 조성물 2는 1일 마리당 2㎖씩을 급여한 후 분변의 상태와 항문주변의 부착여부로 설사발생을 판단한 결과, 실험군은 균 감염 7일 후 조성물 1에서는 30마리중 11마리, 조성물 2에서는 9마리, 대조군에서는 30마리중 25마리, 균 감염 14일 후 실험군 조성물 1에서는 30마리중 2마리, 조성물 2에서는 3마리, 대조군에서는 30마리중 5마리가 설사증상을 나타내었다.

균 접종 후 체중의 변화는 개체별로 측정하여 평균치를 산정한 결과, 실험군이 대조군에 비해 증체율이 증가하였다.

2) Salmonella enteritidis 균의 장관정착 억제효과

가. 맹장 내용물 중 Salmonella enteritidis 균의 분포

실험결과, 아래의 표 7과 같이 나타났다.

구분		Salmonella enteritidis 균의 검사일별 생균수(CFU/g)
		1 일	7 일	14 일
실험군	실시예3 (조성물1)	5.63±0.54 (10/10)*	5.85±0.42 (10/10)	0 (0/10)
	실시예4 (조성물2)	5.48±0.32 (10/10)	5.62±0.51 (10/10)	0 (0/10)
대조군		6.17±0.26 (10/10)	7.11±0.36 (10/10)	3.29±1.12 (10/10)

*(10/10) : 세균검출 닭 마리수/전체 시험군 닭마리수

상기 표 7에 나타나 있듯이, 조성물 급여에 의한 Salmonella 균의 장관정착에 대한 억제효과를 확인하기 위하여 감염계군의 맹장 내용물로부터 Salmonella 균을 분리한 결과, 조성물 1, 2를 각각 급여한 실험군에서는 균 접종 1일부터 균 분리가 감소하다 7일째에는 약간 증가하였으나 14일째에는 모두 분리되지 않았으며, 대조군에서도 균 접종 1일보다 7일에 약간 증가하였으며 14일째에도 검출되었다.

나. 감염계군의 장기조직에서 Salmonella enteritidis 분리 빈도

실험결과, 아래의 표 8과 같이 나타났다.

구분		시험계	검사장기별 균 검출수
			비장	간	맹장
실험군	실시예3 (조성물1)	균 접종 7일	3/5	2/5	5/5
		균 접종 14일	0/5	0/5	0/5
		시험기간 중 폐사	0/10	0/10	0/10
	실시예4 (조성물2)	균 접종 7일	3/5	3/5	5/5
		균 접종 14일	0/5	0/5	0/5
		시험기간 중 폐사	0/10	0/10	0/10
대조군		균 접종 7일	4/4	4/4	4/4
		균 접종 14일	2/4	2/4	4/4
		시험기간 중 폐사	2/10	2/10	2/10

상기 표 8에 나타나 있듯이, 조성물이 첨가된 사료 급여 후 Salmonella 감염증에 대한 방어효과를 검토하기 위하여 균 접종 7일과 14일째에 부검하여 비강, 간 및 맹장으로부터 균을 분리한 결과, 실험군의 조성물 1에서는 균 감염 7일에 5마리중 비장에서 3마리, 간에서 2마리, 맹장에서는 5마리 모두 분리되었으며, 조성물 2에서도 균 감염 7일에 5마리중 비장에서 3마리, 간에서 3마리, 맹장에서는 5마리 모두 분리되었으며, 14일후에는 모든 장기에서 분리되지 않았으며, 대조군에서는 균 감염 7일에 4마리 모두 비장, 간, 맹장에서 분리되었고, 14일 후에는 비장 2마리, 간에서 2마리가 분리되고, 맹장에서는 4마리 모두 균이 분리되었다.

시험기간 6일 및 9일째 대조군에서 1마리씩 각각 폐사하였으며 폐사체의 각 장기에서도 균이 분리되었다.

4. 감염계군의 Salmonella에 대한 혈중 항체가

실험결과, 아래의 표 9와 같이 나타났다.

구분		시험계번호	균접종
			1일	7일	14일
실험군	실시예 3 (조성물1)	1	<1:2	1:4	1:4
		2	<1:2	1:4	1:8
		3	<1:2	1:2	NT*
		4	<1:2	1:4	1:4
		5	<1:2	1:4	1:8
	실시예 4 (조성물2)	1	<1:2	1:4	1:4
		2	<1:2	1:4	1:4
		3	<1:2	1:4	1:8
		4	<1:2	1:2	1:4
		5	<1:2	1:4	1:4
대조군		1	<1:2	1:4	NT
		2	<1:2	1:4	1:16
		3	<1:2	1:2	1:8
		4	<1:2	1:4	1:16
		5	<1:2	1:4	1:16

* NT : Not tested

상기 표 9에 나타나 있듯이, Salmonella enteritidis 균 접종 후 1일, 7일 및 14일에 혈액을 채취하여 분리한 혈청에 대한 항체가를 Microplate 응집반응(microplate agglutination test : MAT)으로 검사한 결과, 조성물을 급여한 실험군 7일에서 1:2~1:4배, 14일에서는 1:4~1:8배의 수준이었으나 대조군에서는 7일에서 1:2~1:4배에서 14일에는 1:8~1:16배로 상승하였다.

<실험예 7> 조성물 급여 후 계육에 대한 이화학적 검사

1.실험방법

닭 전염성질병 예방용 사료첨가조성물을 병아리에 급여한 후, 증체량, 치사율, 사료요구율, 이화학적 검사(Cholesterol, 수분, 조단백, 지방산, 회분, 체중, 지방산, 아미노산)를 실시하였으며, 실험에서 얻어진 성적은 SAS/PC(SAS,1988)을 이용하여 처리구간을 분산분석 및 Duncan의 다중검정 방법으로 각 요인간의 유의성을 비교 분석하였다.

생후 7일령의 육계(브로일러)에 본 발명인 실시예3의 조성물 1을 시판중인 배합사료에 0.5%가 되도록 균질하게 혼합하고, 실시예4의 조성물 2는 원형 큰 물통을 이용하여 1일 마리당 약 2씩을 30일간 급여한 후 계육내 이화학적 성상검사를 실시하였다.

2.실험결과

1. 계육의 조지방, 조회분 및 전수분 함량에 미치는 영향

실험결과, 아래의 표 10과 같이 나타났다.

구 분		조지방	조회분	전수분
실험군	실시예3 (조성물 1)	10.11±0.48	0.90±0.00	76.23±0.13
	실시예4 (조성물 2)	12.22±0.438	0.89±0.00	78.14±0.16
대 조 군		9.61±0.62	0.92±0.00	74.61±1.01

상기 표 10에 나타나 있듯이, 실시예3의 조성물 1과 실시예4의 조성물 2에 대한 육계 계육 내 조지방, 조회분 및 전수분에 미치는 영향을 조사한 바, 조성물을 각각 급여한 실험군이 대조군에 비하여 조지방의 증가, 조회분의 감소 및 전수분의 증가를 나타내었다.

2. 계육의 지방산에 미치는 영향

실험결과, 아래의 표 11과 같이 나타났다.

Fatty acids	실험군		대조군
	실시예3(조성물1)	실시예4(조성물2)
Myristic acid	0.75±0.03	0.75±0.06	0.76±0.04
Palmitic acid	24.48±0.86	24.75±068	24.12±0.71
Palmitoleic acid	6.40±0.06	6.39±0.03	6.31±0.13
Stearic acid	9.54±0.12	9.44±0.43	11.41±0.71
Oleic acid	36.91±0.45	37.13±0.73	34.52±1.00
Linoleic acid	18.32±0.17	18.15±0.21	16.18±0.12
Linolenic acid	0.82±0.05	0.87±0.02	0.89±0.04
Arachidonic acid	0.92±0.04	0.96±0.06	0.88±0.02
SFA*	34.52±0.83	34.65±0.89	37.15±0.78
UFA*	63.72±0.76	65.37±0.82	62.82±0.77
MUFA*	38.53±0.86	39.68±0.57	34.52±0.38
PUFA*	24.32±0.27	23.86±0.33	24.42±0.23

* SFA(Saturation fatty acid) : Myristic acid, Palmitic acid, Stearic acid

* UFA(Unsaturation fatty acid) : Palmitoleic acid, Oleic acid, Linoleic acid, Arachidonic acid, Linolenic acid

* MUFA(Monounsaturation fatty acid) : Palmitoleic acid, Oleic acid

* PUFA(Polyunsaturation fatty acid) : Linoleic acid, Linolenic acid, Arachidonic acid

상기 표 11에 나타나 있듯이, 본 발명의 예방용 조성물 1, 2에 대한 육계 계육의 지방산에 미치는 영향을 조사한 바, 조성물을 급여한 실험군이 대조군에 비하여 포화지방산(Stearic acid)은 감소하였으며, 불포화지방산(Oleic acid, Linoleic acid)은 증가하였다.

3. 계육의 아미노산 조성에 미치는 영향

실험결과, 아래의 표 12와 같이 나타났다.

Amino acids	실 험 군		대 조 군
	실시예 3 (조성물1)	실시예 4 (조성물 2)
Valine	1053.2±48.15**	1064.3±56.20**	942.5±13.45**
Methionine	489.2±19.52*	486.5±25.24*	435.9±4.58*
Lysine	1750.2±56.20	1766.6±56.29	1748.0±65.78
Isoleucine	1058.2±52.27*	1080.40±12.20*	902.5±21.47*
Leucine	1648.2±35.54	1661.8±53.80**	1430.3±4.00**
Phenylalanine	845.2±34.15*	829.1±43.12*	736.0±20.49*
Aspartic acid	1884.1±53.10	1879.2±48.97*	1725.7±65.05*
Serine	770.8±22.36	780.6±32.12	795.7±32.23
Glutamine	2632.1±142.1	2611.2±121.22	2980.0±110.07
Glycocoll	933.6±53.94	922.2±38.98	854.6±83.12
Histidine	672.2±36.13*	680.1±33.50*	574.8±26.90*
Threonine	825.2±35.38*	868.4±23.20*	798.1±11.45*
Arginine	1338.6±50.35	1342.4±46.02	1356.3±85.13
Alanine	1472.6±53.42*	1490.8±71.20*	612.4±46.23*
Proline	788.9±61.45**	793.2±57.10**	617.4±52.14**
Tyrosine	701.3±12.42	720.1±42.31	635.2±19.36

Unit : ㎎/100g

* P< 0.05, ** P< 0.01

상기 표 12에 나타나 있듯이, 본 발명의 예방용 조성물 1, 2에 대한 육계 계육의 아미노산 조성에 미치는 영향을 조사하였던바, 조성물 1, 2를 각각 급여한 실험군이 대조군에 비하여 Valine, Methionine, Leucine, Phenylalanine, Aspartic acid, Histidine 및 Threonine이 증가하였다.

4. 육계의 계육색깔에 미치는 영향

실험결과, 아래의 표 13과 같이 나타났다.

구 분		Color
		lightness	redness	yellowness
실험군	실시예 3 (조성물 1)	48.74±1.43	3.22±1.58	9.27±0.61
	실시예 4 (조성물 2)	49.03±1.22	3.53±1.02	9.39±0.12
대 조 군		48.96±2.10	2.98±1.86	9.71±2.49

상기 표 13에 나타나 있듯이, 본 발명의 예방용 조성물 1, 2에 대한 육계의 계육색깔에 미치는 영향을 조사하였던바, 조성물 1, 2를 각각 급여한 실험군이 대조군에 비하여 적색깔(Redness)이 증가하였고 노란색깔(Yellowness)은 감소를 보였다.

5. 육계의 사양에 미치는 영향

실험결과, 아래의 표 14와 같이 나타났다.

구 분	실 험 군		대조군
	실시예 3 (조성물 1)	실시예 4 (조성물 2)
평균 체중	1.82kg	1.80kg	1.68kg
육 성 율	95%	94%	91%
페 사 율	5%	6%	9%
사료요구율	1.74	1.76	1.85

상기 표 14에 나타나 있듯이, 본 발명의 예방용 조성물 1, 2에 대한 육계의 사양에 미치는 영향을 조사한 바, 조성물 1, 2를 각각 급여한 실험군이 대조군에 비하여 평균체중의 증가, 육성율의 증가, 폐사율 및 사료요구율의 감소를 나타내었다.

6. 육계에 미치는 안전성평가

실험결과, 아래의 표 15와 같이 나타났다.

검사항목	범 위			실험군에 대한 평가
	실 험 군		대 조 군
	실시예 3 (조성물1)	실시예 4 (조성물2)
SGOT	87 - 204	91 - 201	85 - 200	정상 범위내
SGPT	10.0 - 40.2	10.0 - 40.0	10.0 - 40.1	정상 범위내
Glucose	154 - 183	152 - 185	151 - 185	정상 범위내
Bilirubin	0.01 - 0.18	0.01 - 0.19	0.01 - 0.18	정상 범위내
LDH	86 - 287	85 - 279	85 - 271	정상 범위내

상기 표 15에 나타나 있듯이, 본 발명의 예방용 조성물 1, 2에 대한 육계의 안전성평가를 실시하기 위하여 조성물 1, 2를 각각 급여한 실험군과 대조군 육계의 혈액을 1㎖ 채취하여 3,000rpm으로 20분간 원심 분리한 혈청을 -80℃에 냉동보관하면서 생화학분석기(RA-X7, Techmmicon, USA)를 이용하여 안전성평가를 실시한 결과 SGOT, SGPT, Glucose, Bilirubin, LDH가 정상 범위내에 있었다.

<실험예 8> 병아리에 대한 효능시험

1. 실험방법

닭 질병의 항원에 대한 감염 예방 및 치료 효과를 증대시킬 수 있는 지의 여부를 확인하기 위하여 10일령 육계병아리 300마리를 선정하여 실험군에서는 본 발명의 실시예3의 조성물 1을 0.5% 사료에 첨가 혼합하고, 실시예4의 조성물 2는 원형 큰 물통을 이용하여 1일 마리당 약 2씩을 14일간 각각 100마리씩 급여하고, 대조군 100마리와 함께 21일간 임상증상을 관찰하였다.

2.실험결과

그 결과, 아래의 표 16과 같이 나타났다.

구분		시험수 (마리)	임상관찰
			호흡기증상	수양성설사	관절, 발바닥	녹색설사	폐사
실험군	실시예3 (조성물1)	100	21	19	13	5	13
	실시예4 (조성물2)	100	25	17	11	8	11
대조군		100	43	38	19	5	26

상기 표 16에 나타나 있듯이, 실험군의 조성물 1에서는 콧물, 이상호흡음 및 기침 등의 호흡기증상이 21마리, 장염, 수양성설사 및 백색설사가 19마리, 관절이 종창 또는 발바닥이 붓고 파행증상을 보인 13마리와 녹색설사 보인 5마리 등의 임상증상을 나타내었으며, 이 중 복합적인 질병 감염으로 13마리가 폐사함을 확인하였다.

조성물 2에서는 콧물, 이상호흡음 및 기침 등의 호흡기증상이 25마리, 장염, 수양성설사 및 백색설사가 17마리, 관절이 종창 또는 발바닥이 붓고 파행증상을 보인 11마리와 녹색설사 보인 8마리 등의 임상증상을 나타내었으며, 이 중 복합적인 질병 감염으로 11마리가 폐사함을 확인하였다.

대조군에서는 콧물, 이상호흡음 및 기침 등의 호흡기증상이 43마리, 장염, 수양성설사 및 백색설사가 38마리, 관절이 종창 또는 발바닥이 붓고 파행증상을 보인 19마리와 녹색설사 보인 5마리 등의 임상증상을 나타내었으며, 이 중 복합적인 질병 감염으로 26마리가 폐사함을 확인하였다.

한편, 실험군에서 임상증상을 보이던 육계들은 빠른 회복상태를 보여 제품의 효력이 입증되었으며, 일반적으로 사육농가에서는 항생제 등 기타 보조사료를 투여하고 있으나 본 시험에서는 항생제 및 설파제 사용을 하지 않아 대조군에서의 피해가 많았다.

<실험예 9> 농장에서의 실증시험

1. 실험방법

경기도 이천시 호법면 단천리 육계(브로일러) 사육농장에서의 본 발명인 실시예3의 조성물 1을 사료 중량대비 0.5%만큼 사료에 혼합하여 14일간 급여한 후 임상관찰을 실시하였다.

그 결과, 조성물 1을 급여하기 전보다 질병의 발병율이 현저히 감소하였으며, 콧물, 이상호흡음, 기침 등의 호흡기증상, 장염, 수양성설사 및 관절의 종창 또는 발바닥이 붓고 파행증상 등의 복합감염으로 인한 폐사수도 줄었다.

또한, 조성물 1을 급여하여 사육한 육계들은 소화율이 높고 기호성이 좋아 질병의 발병율과 폐사율이 감소하였으며, 사료효율 및 증체율이 향상되었고, 성장촉진 등 건강상태가 양호하여 출하일령 단축 등으로 양계농장의 생산성을 높여줬다.

이에, 본 발명의 닭 전염성질병 예방용 사료첨가조성물을 친환경적인 사육방법에 필요한 기능성제제로 제공할 수 있으며, 소화기 및 호흡기질병에 대한 면역기능을 증강시켜 폐사를 줄이고 증체율을 향상시킴으로서 양계농가의 소득증대에 크게 이바지할 수 있을 것이라 사료된다.

Claims (5)

1. 조성물의 전체 중량을 기준으로 산수유 추출물 7 ~ 15 중량 %, 여정실 추출물 10 ~ 15 중량 %, 어성초 추출물 10 ~ 15 중량 %, 오배자 추출물 2 ~ 5 중량 %, 감초 추출물 3 ~ 5 중량 %, 현지초 추출물 5 ~ 10 중량 %, 면역항체가 형성된 난황 40 ~ 60 중량 %로 구성되며,
   상기 산수유 추출물, 여정실 추출물, 어성초 추출물, 오배자 추출물, 감초 추출물, 현지초 추출물은, 물에 물 중량대비 10 ~ 20 중량 %의 상기 추출물의 재료인 산수유, 여정실, 어성초, 오배자, 감초, 현지초 중 선택된 1종을 넣고 90 ~ 100 ℃에서 2 ~ 3시간동안 열수추출하여 얻은 것임을 특징으로 하고,
   상기 산수유 추출물, 여정실 추출물, 어성초 추출물, 오배자 추출물, 감초 추출물, 현지초 추출물은 당도가 14 ~ 30 Brix인 것을 특징으로 하며,
   상기 면역항체가 형성된 난황은 닭 레오바이러스(Reovirus), 닭 전염성F낭병 바이러스 (Infectious bursal disease virus), 살모넬라균증(Salmonella enteritidis, Salmonella gallinarium, Salmonella pullorum), 닭 대장균증(Avian colibacillosis), 캠필로박터병(Campylobacteriosis), 닭 마이코플라즈마 감염증(Mycoplasmosis), 황색 포도상구균증(Staphylococosis)으로 이루어진 항원들을 접종한 산란계가 낳은 계란에서 얻은 것임을 특징으로 하는,
   닭 전염성질병 예방용 사료첨가조성물.
   
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