KR101134987B1

KR101134987B1 - 돼지 전염성질병 예방용 조성물

Info

Publication number: KR101134987B1
Application number: KR1020090129419A
Authority: KR
Inventors: 김권회; 조성수; 전용수; 김곤섭; 우정부
Original assignee: (주)양성그린바이오
Priority date: 2009-12-23
Filing date: 2009-12-23
Publication date: 2012-04-09
Also published as: KR20110072473A

Abstract

본 발명은 돼지 전염성질병 예방용 조성물에 관한 것이다.

본 발명의 돼지 전염성질병 예방용 조성물은, 조성물의 전체 중량을 기준으로 오배자 추출물 1 ~ 5 중량 %, 산수유 추출물 1 ~ 5 중량 %, 가자 추출물 1 ~ 5 중량 %, 여정실 추출물 5 ~ 10 중량 %, 하고초 추출물 1 ~ 5 중량 %, 구지뽕나무 추출물 5 ~ 10 중량 %, 면역항체가 형성된 난황 60 ~ 80 중량 %로 이루어진다.

본 발명에 의해, 인체 무해한 천연약용식물들을 이용하여 항생 물질을 대체할 수 있는 돼지 전염성질병 예방용 조성물이 제공된다.

난황항체, 오배자, 산수유, 가자, 여정실, 하고초, 구지뽕나무

Description

돼지 전염성질병 예방용 조성물{COMPOSITION FOR PREVENTING PIG INFECTIOUS DISEASES}

본 발명은 돼지 전염성질병 예방용 조성물에 대한 것으로, 특히 돼지의 소화기 및 호흡기질병의 주요 원인인 전염성질병에 대한 면역항체가 형성된 난황에 천연약용식물의 추출물을 첨가하여 조성된 돼지 전염성질병 예방용 조성물에 관한 것이다.

일반적으로 동물들은 각종 질병으로부터 자기를 보호하기 위하여, 어떤 병원체에 감염된 후 면역기능을 발휘하여 회복된다.

또한, 질병을 앓지 않고 면역기능을 갖도록 만들기 위해서, 특정 병원균으로 예방약을 제조하여 인위적으로 접종하므로서 면역을 얻게 할 수도 있고, 외부에서 이미 만들어진 면역물질을 체내에 주입시켜서 유사한 효력을 얻게 할 수도 있다.

돼지의 경우 집단사육으로 인해 어린 자돈들이 과거에 비해 면역능력과 질병에 대한 항병력이 매우 낮아져 조그마한 스트레스가 가해져도 바로 병원체에 노출되어 높은 폐사율을 나타내고 있다.

또한, 어린 자돈들은 모체이행 항체의 결여로 질병에 대한 저항력이 약해 각 종 질병에 대한 방어능력이 현저히 떨어져 질병감염으로 인한 폐사가 발생되고 있는 실정이다.

돼지의 소화기 및 호흡기질병을 일으키는 주요 질병으로는 돼지 전염성위장염바이러스, 유행성설사병바이러스, 로타 바이러스, 써코 바이러스, 대장균증, 살모넬라증, 글래써병, 흉막폐렴, 파스튜렐라 폐렴, 마이코플라즈마 폐렴, 연쇄상구균성 폐렴 등을 들 수 있다.

상기 돼지의 소화기 및 호흡기질병을 일으키는 주요 질병에 대해 구체적으로 설명하면 다음과 같다.

① 돼지 전염성위장염 바이러스(Transmissible gastroenteritis virus; TGEV)는 흔히 코로나바이러스로 불리우는 질병으로써, 분변에 오염된 사료나 물을 섭취함으로서 발생하는 설사병으로 어린 자돈에 주로 발생하며, 수양성설사를 일으키는 것이 특징이며, 심한 설사와 동시 급속히 탈수상태로 진행되어 체중이 감소되며 생후 7일령이내의 자돈이 감염될 경우 대부분 폐사한다.

육성돈에서는 돌발적으로 수양성설사를 일으켜 발병율은 100%에 가깝지만 폐사율은 낮은 편이다.

② 돼지 유행성설사병바이러스(Porcine epidemic diarrhea virus; PEDV)는 주로 어린 자돈들에게 설사를 유발시키는 질병으로써, 국내에서의 폐사율은 거의 100%에 달하는 무서운 질병이다.

육성돈에서도 설사를 일으키긴하나 폐사는 거의 없으며 대부분 구토, 원기소실, 식욕결핍 등의 증상을 보이다가 회복하지만 체중감소가 심하여 돼지 설사병 중 가장 피해가 심한 질병이다.

③ 돼지 로타바이러스(Pocine rotavirus infection; PRV)는 생후 1 ~ 4주령의 자돈에 심한 수양성설사를 일으키는 것이 특징이며, 대부분 회복하나 10 ~ 15 %의 폐사율을 일으키며, 초기에는 침울, 식욕부진, 운동기피, 구토 등 심한 수양성설사를 나타낸 후 탈수상태에서 폐사한다.

④ 돼지 써코바이러스(Pocine circovirus; PCV) 감염증은 1998년 우리나라에서 처음 보고되면서 전국적으로 질병이 확산되어 이유자돈 및 육성돈에서 주로 발생하는 질병으로써, 체중감소, 위축, 호흡곤란, 폐렴, 수양성설사, 신경증상, 빈혈 및 황달(간의 손상)을 일으키며 면역기능이 저하되는 증상으로 혼합 감염 시 해당 질병을 도와 높은 폐사율을 보이고 체중감소로 위축된 전신소모성증후군 등을 유발하기도 하며, 설사병이나 호흡기질병의 감염이 용이하여 농장 전체로 확산되며 항생제의 치료효과도 저하시키는 질병이다.

⑤ 병원성대장균(Escherichia coli)증은 생후 1 ~ 4일령의 어린 자돈에서 주로 발생하며 수양성설사를 많이 하고 심한 경우 폐사한다.

이유자돈에서도 회백색의 설사를 하는 것이 특징이며 감염된 자돈은 수척해지고 위축돈이 되며 심한 경우 탈수와 패혈증이 동반하여 폐사를 일으킨다.

⑥ 살모넬라증(Salmonellosis)은 살모넬라 속(Salmonella typhimurum)균의 감염에 의한 전염병으로써, 폐사율이 높은 급성패혈증과 이유자돈과 육성돈에 설사를 주증으로 하는 급?만성 소장결장염을 일으키는 것이 특징이며, 종종 폐렴, 뇌막염의 증상도 함께 일어나기도 한다.

패혈증은 어린 자돈에 흔히 발생하며 갑자기 폐사하거나 체온이 높고 원기가 없으며 폐렴증상과 신경증상을 나타내기도 하며, 불현성 감염으로 내과 하는 돼지도 있어 방역상 많은 어려움이 있으며 이러한 보균돈에 의한 식육 오염은 공중 보건상 문제가 되고 있다.

⑦ 글래써병(Glasser's disease)은 헤모필러스 속(Hemophilus parasuis)의 원인균으로 5주령 이상의 자돈에서 발생하며 계절에 관계없이 연중 발생하는 질병으로서, 사양 환경의 급변, 수송, 밀사, 기후변화 등 스트레스가 유발인자이며, 발열, 구토, 신경증상, 관절염등을 일으키는 질병으로서, 한번 감염되면 급사하거나 위축되는 경우가 많다. 보통 증상이 급속하게 진행되므로 치료하는데 어려움이 있다.

⑧ 돼지 흉막폐렴은 흉막폐렴균(Actinobacillus pleuropneumoniae)이 원인균이며 12가지 혈청형이 있으며, 감염은 주로 공기감염으로 이루어지고 직접접촉에 의해 전파되는 질병으로서, 급성으로 진행되면 식욕불량, 호흡곤란, 구토, 청색증, 고열, 코와 입의 출혈 등을 일으키며, 24시간에 폐사하는 질병으로서 돼지 세균성 호흡기질병의 중의 하나로써, 양돈 산업을 하는 나라에서는 대부분 발생하는 질병이다.

이 질병에 감염되면 폐사 및 생산성 감소와 치료비 또는 백신비용의 증가 등으로 이어지기 때문에 양돈 산업에 있어 많은 주의를 기울여야 할 질병으로서, 이 질병의 어려운 문제 중 하나는 효과적인 항균물질로 치료될 수 있는 경우도 있지만 초기 병변이 심하게 진행되기 때문에 치료하기가 힘든 경우도 있다.

⑨ 돼지 파스튜렐라 폐렴은 파스튜렐라균(Pastuellar multocida)에 의해 발생되는 질병으로 단독감염에 의하기 보다는 유행성폐렴이나 흉막폐렴 등에 이은 2차 감염으로 인해 발병하며, 상부호흡기점막에 존재하고 있다가 사양 환경의 악화나 스트레스, 기타 바이러스질환 등으로 정상적인 방어기능이 약화되었을 때 기관지 및 폐포에 침입하여 심한 염증상태를 유발하며 감염돼지의 구강 또는 비강분비물의 직접 접촉이나 공기 전파에 의해 감염되는 질병으로서, 호흡이 곤란하며, 습성기침, 체온상승, 침울, 식욕부진, 코에서 염증성 삼출물이 관찰되며, 귀 복부 등의 피부에 적색반점이 뚜렸이 나타나고 안 점막은 충혈 된다.

급성인 경우 5 ~ 10일 경과 후 폐사하고 만성으로 진행시 지속적인 건성기침과 성장지연을 보인다.

⑩ 마이코플라즈마 폐렴은 유행성폐렴균(Mycoplasma hyopneumoniae)이 원인체이며 전 세계적으로 만연되고 있는 중요한 전염성질병으로, 감염 시 호흡기관의 면역체계를 억제하고 기능을 약하게 하여 다른 질병의 2차 감염을 용이하게 하며 전염력이 강하고 만성폐렴 증상을 나타내며, 높은 이병율과 낮은 치사율을 특징으로 하는 질병으로서 건성기침과 재채기, 사료효율저하, 증체율 감소 등으로 큰 경제적 피해를 주는 만성호흡기질병이다.

⑪ 연쇄상구균성 폐렴(Streptococcus suis)증은 패혈증, 다발성 장막염, 우상성 심내막염, 질염, 유산 등을 유발하며, 특히 비육돈에서는 폐렴 등의 호흡기 감염으로 심각한 경제적 손실을 야기하며 이유자돈에서는 급성 폐혈증에 대한 사례가 많으며, 심급성형의 경우에는 특별한 증상 없이 폐사하거나 뇌막염 증상을 나타 내며, 대부분의 경우 식욕부진, 우울, 발진, 발열, 마비, 신경증상을 일으킨다.

이러한 질병들을 예방하기 위해서는 현재 일반적으로는 상기 질병에 대한 예방은 일부 예방약을 사용하고 있으나, 질병이 발생되면 항생제, 설파제 등을 사용하여 질병을 치료하고 있는 실정이다.

그러나 상기 항생물질이나 항균제 등의 약제의 사용은 내성균의 출현의 문제 또는 축산물의 안전성의 문제를 일으킬 뿐만 아니라, 돼지 전염성질병에 대한 예방 또는 치료를 위하여 항생제를 투여하는 경우에 증체량이 감소되는 문제점이 발생된다.

따라서, 안전성에 대한 문제가 발생되지 않으면서 생체내에서 상승효과를 나타내어 생체내의 면역 시스템 중 보체계의 활성화 및 여러 가지 사이토킨(cytokine)의 활성화 및 일상의 식품 성분과의 상승작용으로 신체 항산성(抗酸性)을 유지하도록 역할을 하는 천연약용식물들을 이용하여 돼지 전염성질병에 대한 예방 및 치료물질을 개발하여 항생물질의 대체 물질에 대한 연구가 요구되고 있는 실정이다.

본 발명은 상기와 같은 문제를 해결하기 위하여, 면역항체가 형성된 난황과 무해한 천연약용식물들의 추출물들을 이용하여 항생 물질을 대체할 수 있는 돼지 전염성질병 예방용 조성물을 제공하려는 목적이 있다.

본 발명은 돼지 전염성질병 예방용 조성물에 관한 것이다.

본 발명에 대하여 보다 상세히 설명하면 다음과 같다.

본 발명의 발명자들은 환경 친화적이고 강력한 항균작용과 면역력증진 효과를 갖고 있는 여러 천연약용식물들을 이용하여 항생물질 대신에 돼지 전염성질병에 대해 예방효과를 갖는 물질을 개발하기 위한 목적으로 수차례 연구한 결과, 여러 천연약용식물들 중 오배자, 산수유, 가자, 여정실, 하고초, 구지뽕나무들을 선별하게 되었다.

본 발명의 주 재료인 오배자(Rhus chinensis)는 매미목[同翅目] 진딧물과의 오배자(五倍子)면충이 옻나무과의 붉나무(오배자나무)의 잎에 기생하여 만든 벌레 혹으로서, 한방에서는 수렴(收斂), 지혈, 해독, 항균의 효력이 있어 설사, 탈항, 위궤양, 십이지장궤양, 도한, 유정(遺精), 혈변, 혈뇨, 구내염 등에 효능이 있다고 알려졌으며, 주요 성분인 탄닌(50 ~ 60 %)의 수렴작용에 의하여 지사작용, 지혈작용, 억균작용, 선분비억제 작용을 하며, 약리작용으로 수렴효과, 항 미생물작용, 항 생육작용, 간 기능보호, 황산화작용이 보고되어 있다.

산수유(Cornus officinalis)는 층층나무과 산수유(山茱萸)나무의 열매로써, 과육(果肉)에는 코르닌(cornin), 모로니사이드(Morroniside), 로가닌(Loganin), 타닌(tannin), 사포닌(Saponin) 등의 배당체와 포도주산?사과산?주석산 등의 유기산이 함유되어 있고, 그밖에 비타민 A와 다량의 당(糖)도 포함되어 있다.

종자에는 팔미틴산?올레인산?리놀산 등이 함유되어 있으며, 성분 중 코르닌은 부교감신경의 흥분작용이 있는 것으로 알려져 있다.

한방에서는 산수유의 과육을 약용으로 사용하였으며 강음(强陰), 신정(腎精)과 신기(腎氣)보강, 수렴 등의 효능이 있다고 하며, 두통, 이명(耳鳴), 해수병, 해열, 월경과다 등의 약재로 쓰이며 식은땀? 야뇨증 등의 민간요법에도 사용된다.

가자(訶子, Terminalia chebula retzius)는 가리득 열매로서, 약간 특이한 냄새가 나며 약성은 쓰고 조금 시며 떫은 맛을 내며, 이는 기를 내리고 오래된 담과 기침을 사키고 숨이 차는 것, 오래된 설사, 이질, 대하, 탈항에 효험이 있으며, 소화를 돕고 입맛을 돋우며 뱃속의 태아를 편하게 하는 작용도 한다.

약리작용으로는 수렴, 지사, 녹농균 등에 대한 억균작용이 보고되어 있으며, 실험 및 연구를 통해 가자는 사람과는 달리 가축 및 가금 등에 대하여는 뚜렷한 항생효과가 있는 것을 확인한 바가 있다.

여정실(Ligustrum japonicum)은 쌍떡잎식물 용담목 물푸레나무과의 상록 관목으로서, 올레아놀릭 산(oleanolic acid), 포도당, 팔미트 산(palmitic acid), 유솔리산(ursolic acid)가 함유되어 있으며, 종자에는 지방유가 함유되어 있다.

약리작용으로는 강심?이뇨 작용과 간 기능 보호 작용이 보고되어 있으며, 건강한 사람의 림프 세포의 모세포 전화 작용을 촉진시키는 작용도 하며, 황색포도상구균, 이질간균, 인플루엔자, 녹농균, 대장균을 억제하는 작용도 보이며, 항암 효과에도 활성 반응을 보인다.

임상결과 백혈구감소증에 약침 제제로 효력이 있으며, 만성간염에도 유효율을 높여주며, 고지혈증 환자가 1개월간 복용하여 총 콜레스테롤의 수치를 70.6% 감소시켜준다고 보고된 바가 있다.

하고초(Brunnella vulgaris L)는 단향과에 속하는 댑싸리 하고초의 전초와 꿀풀과에 속하는 것으로서, 꿀풀 하고초라 지칭하며, 혈압, 혈관확장, 두통, 어지럼증, 결핵성림프선염, 종기, 신경성 고혈압, 강장, 고혈압, 자궁염, 이뇨, 해열, 안질, 갑상선종, 임질, 나력, 두창, 각종, 연주창, 결핵성림프선염, 종기 보간, 화농성 유선염, 이뇨, 진해, 지혈, 정신불안 등에 효능이 있는 것으로 알려져 있으며 유방암 등에 항암효과도 있다고 보고된바 있다.

구지뽕나무(Cudrania rtcuspidata)는 뽕나무과에 속하는 낙엽활엽교목으로서, 이를 약으로 쓸 때는 줄기, 줄기껍질, 잎, 열매, 뿌리를 쓰며, 약성은 따뜻하고 맛은 달고 쓰며 독은 없다.

특히 구지뽕나무는 여성들의 여러가지 질병에 좋은 약으로 알려져 있는 것으로써, 부인의 붕중혈결을 다스리고 월경을 통하게 하며 어혈을 풀고 신장의 결석을 없애주며, 또한 근골을 튼튼하게 하고 혈액을 맑게 하는 작용이 있다고 알려져 있다.

본 발명자는 상기와 같은 효능을 갖는 천연약용식물들을 각각 추출하고, 여기에 면역항체가 형성된 난황을 혼합하여 사용할 시, 돼지 전염성질병(돼지 전염성위장염바이러스, 유행성설사병바이러스, 로타 바이러스, 써코 바이러스, 대장균증, 살모넬라증, 글래써병, 흉막폐렴, 파스튜렐라 폐렴, 마이코플라즈마 폐렴, 연쇄상구균성 폐렴)에 대한 방어력을 증강시켜 주고 일시적인 치료 목적으로 사용되는 항생물질을 사용하지 않고도 질병을 예방할 수 있음을 알게 되어 본 발명을 발명하게 되었다.

본 발명의 돼지 전염성질병 예방용 조성물은 조성물의 전체 중량을 기준으로 오배자 추출물 1 ~ 5 중량 %, 산수유 추출물 1 ~ 5 중량 %, 가자 추출물 1 ~ 5 중량 %, 여정실 추출물 5 ~ 10 중량 %, 하고초 추출물 1 ~ 5 중량 %, 구지뽕나무 추출물 5 ~ 10 중량 %, 면역항체가 형성된 난황 60 ~ 80 중량 %로 이루어진 것이 특징이다.

이때, 상기 오배자 추출물, 산수유 추출물, 가자 추출물, 여정실 추출물, 하고초 추출물, 구지뽕나무 추출물은 물에 물 중량대비 10 ~ 20 중량 %의 상기 추출물의 재료인 오배자, 산수유, 가자, 여정실, 하고초, 구지뽕나무 중 어느 하나를 넣고 90 ~ 100 ℃에서 2 ~ 3 시간동안 열수추출하여 생성되는 것이 좋다.

또한, 상기 오배자 추출물, 산수유 추출물, 가자 추출물, 여정실 추출물, 하고초 추출물, 구지뽕나무 추출물은 당도가 20 ~ 30 Brix인 것이 좋다.

또한, 상기 면역항체가 형성된 난황은 돼지 전염성위장염 바이러스, 돼지 유행성설사병 바이러스, 돼지 로타바이러스, 돼지 써코바이러스, 대장균, 살모넬라증으로 이루어진 항원들을 접종한 산란계가 낳은 계란에서 얻은 것이 특징이다.

즉, 상기와 같이 항원(antigen)을 생체내에 투여하면 이 항원의 자극에 의해 혈청속 내에 항체가 생성되며, 이 항체가 특정항원과 접촉했을때 이 특정항원에 대응하는 성질을 갖게 됨으로써 이를 면역항체라고 한다.

이상과 같이, 본 발명의 돼지 전염성질병 예방용 조성물은 돼지 전염성질병의 원인체인 돼지 전염성위장염 바이러스(Transmissible gastroenteritis virus), 돼지 유행성설사병바이러스(Porcine epidemic diarrhea virus), 돼지 로타바이러스(Pocine rotavirus infection), 돼지 써코바이러스(Pocine circovirus), 병원성대장균증(Escherichia coli), 살모넬라증(Salmonella typhimurum), 글래써병(Hemophilus parasuis), 돼지 흉막폐렴(Actinobacillus pleuropneumoniae S2, S5), 파스튜렐라 폐렴(Pastuellar multocida), 마이코플라즈마 폐렴(Mycoplasma hyopneumoniae), 연쇄상구균성 폐렴(Streptococcus suis) 속 중 선택된 1 종 이상에 대해 뛰어난 예방효과를 나타냄으로써, 사료첨가제 등으로도 매우 유용하게 이용될 수 있다.

또한, 약학적 조성물로도 이용할 수 있으며, 약제학적 분야에서의 공지의 방법에 의해 제조될 수 있고, 그 자체 또는 약학적으로 허용되는 담체, 부형제, 희석제 등과 혼합하여 분말, 과립, 정제, 캡슐제 또는 주사제 등의 제형으로 제조되어 사용될 수 있고, 이들은 경구 또는 비경구로 투여될 수 있다.

본 발명에 따른 돼지 전염성질병 예방용 조성물의 유효 투여량은 체내에서 활성성분의 흡수도, 불활성화율 및 배설속도, 연령, 성별 및 상태, 치료할 질병의 중증 정도 등에 따라 적절히 선택될 수 있다.

본 발명에 의해, 항생물질을 대체할 수 있음과 동시에 인체무해한 천연약용식물의 추출물과 면역항체가 형성된 난황을 이용하여 안전성 및 안정성을 확보한 상태에서 양돈 농가의 소득증대에 크게 이바지할 수 있는 돼지 전염성질병 예방용 조성물이 제공된다.

이하, 본 발명에 대하여 실시예 및 실험예를 통하여 보다 상세히 설명하나, 이들이 본 발명의 범위를 제한하는 것은 아니다.

<실시예 1> 천연약용식물들의 추출물 제조

가. 천연약용식물들 선정

본 발명에 있어서 세균성으로 질병을 일으키는 돼지 전염성질병에 대한 항균성 측정시험 결과 항균성 시험결과가 우수한 오배자, 산수유, 가자, 여정실, 하고초, 구지뽕나무를 선정하였다.

나. 천연약용식물들의 준비방법

천연약용식물들은 깨끗한 물로 2 회이상 씻어준 다음, 건조시킨 후 사용하였다.

다. 천연약용식물들의 추출

상기 나.에서 준비된 천연약용식물들을 각각 분쇄기를 이용하여 분쇄한 다음, 추출기(동남산업 DN0017^TM)에 증류수 5,000 ㎖에 생약재 500 g을 넣고 100 ℃에서 3 시간 추출하였으며, 추출한 추출물은 Advantec 1번 여과지(Advantec 1번 Filter paper)를 이용하여 1차 여과 후 Advantec 1.0㎛ 여과지(Advantec 1.0㎛ Membrane filter)를 이용하여 추출물을 각각 2차 여과한 후 당도(Brix. ATAGO, HSR500^TM)를 측정하여 사용하였다.

이에, 오배자추출물(30Brix), 산수유추출물(20Brix), 가자추출물(30Brix), 여정실추출물(30Brix), 하고초추출물(30Brix), 구지뽕나무추출물(25Brix)을 제조하였다.

<실시예 2> 면역항체가 형성된 난황 생산

1. 주요 질병 원인체에 대한 항원제조

가. 돼지 전염성위장염 바이러스

1) 바이러스접종 및 배양

ST(Swine testicle) 또는 SK(Swine kidney) 세포를 37℃에서 세포증식용 배양액(부기 1)에 배양하여 세포의 단층이 50 % 형성하였을 때 증식용 배양액을 제거한 후 1 ㎖당 10^4.0TCID₅₀의 175 L 바이러스(국립수의과학검역원 분양)가 함유된 세포유지용 배양액(부기 2)을 가한 다음, 37 ℃에서 2 ~ 3일간 회전배양하였다.

2) 바이러스수확 및 처리

접종 바이러스에 의한 세포변성효과가 약 80 %이상 일어났을 때 수확하며 이때 배양 감염액의 바이러스 함유량은 1 ㎖당 10^6.0TCID₅₀이상이어야 하며, 감염액은 -80℃에서 3회 동결 융해한 다음 원심침전 후 상층액을 농축하여 항원으로 사용하였다.

<부기 1. 세포증식용 배양액 조성성분(1,000㎖)>

α-MEM --------------------------------- 930 ㎖

Fetal bovine serum(FBS) ---------------- 50 ㎖

7.5% NaHCO₃ _{---------------------------------------------}20 ㎖

Penicillin G-Na ------------------------ 100 unit/㎖

Streptomycin sulfate ------------------- 100 ㎍/㎖

Fungizone ------------------------------ 0.025 ㎍/㎖

<부기 2. 세포유지용 배양액 조성성분(1,000㎖)>

α-MEM --------------------------------- 950 ㎖

Fetal bovine serum(FBS) ---------------- 30 ㎖

7.5% NaHCO₃ _{---------------------------------------------}20 ㎖

Penicillin G-Na ------------------------ 100 unit/㎖

Streptomycin sulfate ------------------- 100 ㎍/㎖

Fungizone ------------------------------ 0.025 ㎍/㎖

나. 돼지 유행성설사병 바이러스

1) 바이러스접종 및 배양

Vero(Green monkey kidney)세포를 37 ℃에서 세포증식용 배양액에 배양하여 세포의 단층이 형성하였을 때 증식용 배양액을 제거한 후 간결정트립신(Crystallized trypsin)이 1 ㎖당 10 ㎍이 첨가된 배지에 1 ㎖당 10^4.0TCID₅₀의 SM98P바이러스(국립수의과학검역원 분양)를 접종한 다음 37℃에서 1시간 감작시킨 후 우태혈청(FBS, Fetal bovine serum)이 비 함유된 α-MEM에 간결정트립신(Crystallized trypsin)이 1 ㎖당 0.5㎍을 첨가한 세포유지용 배양액(부기 2)을 가하여 37 ℃에서 24 ~ 48시간 회전배양하였다.

2) 바이러스수확 및 처리

접종 바이러스에 의한 세포변성효과가 약 80 %이상 일어났을 때 수확하며 이때 배양 감염액의 바이러스 함유량은 1 ㎖당 10^6.0TCID₅₀이상이어야 하며, 감염액은 -80 ℃에서 3 회 동결 융해한 다음 원심침전 후 상층액을 농축하여 항원으로 사용하였다.

다. 돼지 로타바이러스

1) 바이러스접종 및 배양

MA104(Green monkey kidney)세포를 37℃에서 세포증식용 배양액에 배양하여 세포의 단층이 형성하였을 때 증식용 배양액을 제거한 후 간결정트립신(Crystallized trypsin)이 1 ㎖당 10 ㎍ 이 첨가된 배지에 1 ㎖당 10^4.0TCID₅₀의 10, A1바이러스(국립수의과학검역원 분양)를 각각 접종한 다음 37℃에서 1시간 감작시킨 후 FBS가 비 함유된 α- MEM에 간결정트립신(Crystallized trypsin)이 1 ㎖당 0.5㎍을 첨가한 세포유지용 배양액(부기 2)을 가하여 37℃에서 24 ~ 48시간 각각 회전배양하였다.

2) 바이러스수확 및 처리

접종바이러스에 의한 세포변성효과가 약 80 %이상 일어났을 때 수확하며 이때 배양 감염액의 바이러스 함유량은 1 ㎖당 10^5.5TCID₅₀이상이어야 하며, 감염액은 -80 ℃에서 3 회 동결 융해한 다음 원심침전 후 상층액을 농축하여 항원으로 사용하였다.

라. 돼지 써코바이러스

1) 바이러스접종 및 배양

곤충세포의 유래인 Hi-5세포를 27 ℃에서 세포배양액(부기 3)에 배양하여 세포의 단층이 형성하였을 때 증식용 배양액을 제거한 후 유전자 재조합바이러스(PCV/type2) 1㎖을 Grace's medium 50 ㎖에 희석하여 175 ㎠ 플라스크(flask)에 5㎖ 씩 써코 바이러스를 접종한 후 27 ℃에서 1시간 감작한 다음 세포 배양액(부기 3)을 가하여 5 ~ 7 일간 배양하였다.

2) 바이러스수확 및 처리

접종 바이러스에 의한 세포변성효과가 약 80 %이상 일어났을 때 배양 감염액과 감염된 세포를 수확하여 6,000 rpm에서 20분간 원심한 후 감염된 세포를 적당량의 PBS로 재 부유시켜 초음파처리(Sonicate)하여 8,000 rpm에서 20분간 원심, 상층액을 수집 불활화시킨 후 항원으로 사용하였다.

<부기 3. 세포 배양액 조성성분(1,000㎖)>

Grace's medium ------------------------- 900 ㎖

Fetal bovine serum(FBS) ---------------- 100 ㎖

Penicillin G-Na ------------------------ 100 unit/㎖

Streptomycin sulfate ------------------- 100 ㎍/㎖

Fungizone ------------------------------ 0.025 ㎍/㎖

마. 대장균(E. coli)

1) 종균배양

-80℃에 보관중인 k88ab, k88ac, k99, 987P, F41 균주(국립수의과학검역원 분양)를 SBA(Sheep blood agar) 배지에 각각 이식하여 37 ℃에서 20 시간 각각 배양한 후, 전형적인 단독집락을 각각 선택하여 BHI(Brain heart infusion) 배지에 계대 배양하여 배양한 배양액을 종균으로 사용하였다.

2) 본 배양

BHI(Brain heart infusion) 액체배지에 종균을 본 배양배지의 2.5 %를 접종하여 37 ℃에서 150 rpm으로 교반하면서 18 시간동안 각각 진탕배양하였다.

3) 균체수집 및 처리

37 ℃에서 18 시간 각각 진탕 배양한 감염배양액에 0.3 % 포르말린을 가하여 불활화 시킨 후 농축한 다음, 농축한 배양균체를 5,000 rpm에서 30 분간 원심 분리하여 균체를 수집하였고, Dulbecco's PBS(Phosphate buffered solution)로 수집된 균체를 2 회 세척한 후 분광광도계(Spectrophotometer)를 이용하여 410 ㎚의 파장에서 O.D(Optical density)값을 측정한 후 항원으로 사용하였다.

바. 살모넬라(Salmonella)균

1) 종균배양

-80 ℃에 보관중인 살모넬라 속(S. typhimurum,, 국립수의과학검역원 분양) 균주를 SBA(Sheep blood agar)배지에 이식하여 37 ℃에서 20 시간 배양 후, 전형적 인 단독집락을 선택하여 BHI(Brain heart infusion) 액체배지에 계대 배양하여 배양한 배양액을 종균으로 사용하였다.

2) 본 배양

BHI(Brain heart infusion) 액체배지에 살모넬라 속(S. typhimurum) 균주를 본 배양배지의 2.5 %를 각각 접종하고 37 ℃에서 150 rpm으로 교반하면서 18 시간 진탕배양하였다.

3) 균체수집 및 처리

37 ℃에서 18 시간 각각 진탕 배양한 감염배양액에 0.3 %포르말린을 가하여 불활화시킨 후 농축한 다음, 농축한 배양균체를 5,000 rpm에서 30 분간 원심 분리하여 균체를 수집하였고, Dulbecco's PBS(Phosphate buffered solution)로 수집된 균체를 2 회 세척한 후 분광광도계(Spectrophotometer)를 이용하여 410 ㎚의 파장에서 O.D(Optical density)값을 측정한 후 항원으로 사용하였다.

2. 면역형성용 면역제제

상기 1.과 같이 준비된 돼지 전염성위장염바이러스, 유행성설사병 바이러스, 로타바이러스, 써코바이러스 및 대장균, 살모넬라증의 농축된 항원들을 각각 혼합하여 30 %의 유제액을 만든 다음, 70 %의 면역증강제(Oil adjuvant, Montnide ISA70)를 가하여 잘 혼합한 다음, 13,000 rpm에서 3 분간 균질기(Homogenizer)를 이용하여 면역제제를 생산하였다.

3. 면역형성용 면역제제 접종방법

상기 2.에서 생산된 산란계 면역형성용 면역제제를 20 주령의 산란계에 마리당 0.8 ㎖씩 앞가슴 근육에 1차로 접종하고, 2차 접종은 1차 접종 3주후, 3차 접종은 2차 접종 3주후에 근육에 각각 접종하였으며, 그 이후 면역제제 접종은 3개월 단위로 추가 접종하였다.

4. 면역항체가 형성된 난황 수거

1) 난황 수거

상기 3.에 따라 면역제제를 3 차접종 2 주후부터 면역 항체가 형성된 계란을 위생적으로 수거한 후, 150 ppm의 차아염소산나트륨을 계란에 분사하여 깨끗하게 세척한 다음, 건조실에서 계란 표면의 수분을 완전히 건조시켰다.

상기와 같이 건조시킨 계란을 할란하여 면역항체가 형성된 난황을 채취하여 분말형태로 제조하였다.

<실시예 3> 본 발명인 돼지 전염성질병 예방용 조성물1

상기 실시예 1에서 제조된 천연약용식물들의 추출물들을 혼합하되, 전체중량을 기준으로 오배자 추출물 4 %(20Brix), 산수유 추출물 5 %(20Brix), 가자 추출물 4 %(30Brix), 여정실 추출물 6 %(30Brix), 하고초 추출물 5 %(30Brix), 구지뽕나무 추출물 6 %(25Brix)의 비율로 혼합하였다.

여기에 상기 실시예 2에서 제조된 면역항체가 형성된 난황을 넣되, 전체중량 을 기준으로 면역항체가 형성된 난황 70%를 넣고 잘 혼합하며, 이를 분무건조기(Spray dryer)를 이용하여 디스크 및 노즐형태의 분무방법으로 수분을 건조시켜 수분 함량이 10 % 미만의 분말형태로 될때까지 건조시켜 본 발명인 돼지 전염성질병 예방용 조성물1을 제조하였다.

<실시예 4> 본 발명인 돼지 전염성질병 예방용 조성물2

상기 실시예 3에서 제조된 돼지 전염성질병 예방용 조성물1의 100g에 물 500 ㎖을 넣은 후 반죽기를 이용하여 매끄러운 반죽이 되도록 균질화 시킨 다음, 프락토 올리고당(Fructo-oligosaccharides) 20g, 탄산수소나트륨(Sodium bicarbonate) 4.46g, 염화칼륨(Potassium chloride) 2.68g, 글리신(Glycine) 7.2g, 덱스트로스(Dextrose) 35.5g을 첨가하여 페이스트 형태로 본 발명인 돼지 전염성질병 예방용 조성물2를 제조하였다.

<실험예 1> 천연약용식물에 대한 항균력 측정

1. 실험방법

1) 항균력 실험에 사용한 병원체

돼지 질병을 일으키는 대장균증(Escherichia coli), 살모넬라증(Salmonella typhimurum), 글래써병(Hemophilus parasuis), 돼지 흉막폐렴(Actinobacillus pleuropneumoniae S2, S5), 파스튜렐라 폐렴(Pastuellar multocida), 마이코플라즈마 폐렴(Mycoplasma hyopneumoniae), 연쇄상구균성 폐렴(Streptococcus suis)에 대 한 병원체를 대상으로 천연약용식물들의 추출물들이 나타내는 항균성을 측정하였다.

2) 실험재료

천연약용식물인 오배자, 산수유, 가자, 여정실, 하고초, 구지뽕나무을 각각 열수 추출하여 여과지(Advantec 1번 Filter paper)를 이용하여 1차 여과한 후 원심분리기(한일 Supra 22K^TM)를 이용하여 5,000 rpm에서 30 분간 원심 후 상청액을 여과지(Advantec 1.00㎛ Membrane filter)를 이용하여 2차 여과한 후, 진공농축기(EYELA SB1000^TM)를 이용하여 80 ℃ 온탕수조에서 10 배로 감압 농축하여 각각의 실험재료들을 준비하였다.

3) 항균력에 사용할 페이퍼 디스크

페이퍼 디스크(ADVANTEC AD49005040^TM, 6㎜)에 상기 실험재료들을 각각 20 ㎕씩 흡착시킨 다음, 50 ℃ 건조기에서 충분히 건조시킨 후 항균력 실험에 사용하였다.

4) 항균력 실험방법

ㄱ. 대장균증(Escherichia coli), 살모넬라증(Salmonella typhimurum), 파스튜렐라 폐렴(Pastuellar multocida), 연쇄상구균성 폐렴(Streptococcus suis) 균주

돼지 질병의 원인체에 대한 항균력 실험을 실시하기 위하여 - 80 ℃에 보관중인 균주를 Agar 평판배지에서 24 ~ 48 시간 배양하여 Colony를 선정하여 균 배양 액인 BHI(Brain heart infusion) 배지에 접종하여 37 ℃에서 18 ~ 24 시간 균주를 배양하였으며, 배양액의 균 증식확인은 분광광도계(Spectrophotometer)를 이용하여 410 nm의 파장에서 O.D(Optical density)값을 측정하여 균 증식배양액을 O.D(Optical density)값 1.2로 조정 사용하였다.

페트리디쉬(Petri dish, 87×15㎜)에 MHA(Mueller hinton agar)배지를 15 ㎖씩 가한 평판배지에 균액 100 ㎕를 골고루 도말하고, 그 위에 각각의 상기 3) 에서 준비해 둔 페이퍼 디스크들을 각각 올려놓고 37 ℃ 인큐베이터에서 24 시간 배양한 다음, 디스크 주변에 형성된 Clear zone(균 증식이 억제되어 투명하게 형성된 지역)의 직경을 측정하였다.

ㄴ. 돼지 흉막폐렴(Actinobacillus pleuropneumoniae S2, S5), 글래써병(Hemophilus parasuis)

돼지 질병의 원인체에 대한 항균력 실험을 실시하기 위하여 - 80 ℃에 보관중인 균주를 β-NAD(Nicotinamideade-ninedinucleotide)가 첨가된 Agar 평판배지에서 24 ~ 48 시간 배양하여 Colony를 선정하여 균 배양액인 BHI(Brain heart infusion) 배지에 β-NAD를 5 ㎍/㎖ 첨가하여 배양하였으며, 배양액의 균 증식확인은 분광광도계(Spectrophotometer)를 이용하여 410 nm의 파장에서 O.D(Optical density)값을 측정하여 균 증식배양액을 O.D(Optical density)값 1.2로 조정 사용하였다.

BHI 배지에 β-NAD를 5 ㎍/㎖을 첨가하여 페트리디쉬(Petri dish, 87×15㎜) 에 15 ㎖씩 가한 평판배지에 균액 100 ㎕를 골고루 도말하고, 그 위에 각각의 상기 3) 에서 준비해 둔 페이퍼 디스크들을 각각 올려놓고 37 ℃ 인큐베이터에서 24 시간 배양한 다음, 디스크 주변에 형성된 Clear zone(균 증식이 억제되어 투명하게 형성된 지역)의 직경을 측정하였다.

ㄷ. 마이코플라즈마 폐렴(Mycoplasma hyopneumoniae)

Hank's BSS 배지에 시약 및 혈청을 첨가하여 37 ℃에서 7 일이상 균을 배양하였으며, 배양액의 균 증식확인은 분광광도계(Spectrophotometer)를 이용하여 410nm의 파장에서 O.D값을 측정하여 1.35의 균액을 시험관에 분주한 다음 추출한 생약재 0.1%를 각각 넣어 37 ℃에서 7 일간 배양한 후 균 증식을 간접적으로 대조군과 비교하였다.

2. 실험결과

상기 실험결과, 아래의 표 1, 표 2와 같이 나타났다.

균주명		Clear zone
균주명		오배자 추출물	산수유 추출물	가자 추출물	여정실 추출물	하고초 추출물	구지뽕나무 추출물
Escherichia coli		30 ㎜	20 mm	12 ㎜	10 ㎜	9 ㎜	5 ㎜
Salmonella		32 ㎜	22 ㎜	10 ㎜	7 ㎜	13 ㎜	8 ㎜
P.multocida(A)		38 ㎜	22 ㎜	21 ㎜	5 ㎜	16 ㎜	8 ㎜
A.pleuropneumoniae	S2	28 ㎜	20 ㎜	12 ㎜	8 ㎜	16 ㎜	10 ㎜
A.pleuropneumoniae	S5	30 ㎜	25 ㎜	16 ㎜	10 ㎜	20 ㎜	12 ㎜
H.parasuis		46 ㎜	38 ㎜	32 ㎜	13 ㎜	26 ㎜	16 ㎜
S.suis		30 ㎜	18 ㎜	20 ㎜	10 ㎜	17 ㎜	9 ㎜

	Mycoplasma hyopneumoniae
	균 증식억제	O.D 값
오배자추출물	-	1.2974
산수유추출물	+	1.3327
가자추출물	+	1.3385
여정실추출물	+	1.3392
하고초추출물	+	1.3400
구지뽕나무추출물	+	1.3364
대조군	+	1.3395

상기 표 1과 표 2에 나타나 있듯이, 천연약용식물인 오배자, 산수유, 가자, 여정실, 하고초, 구지뽕나무의 추출물에서 돼지 세균성질병의 병원체에 대한 뛰어난 항균력을 나타냄을 알 수 있었다.

특히, 표 2에 나타나 있듯이, 분광광도계(Spectrophotometer)를 이용하여 410nm의 파장에서 균의 증식이 양호한 경우 O.D값의 수치가 높고, 균의 증식이 억제되었을 경우 O.D값의 수치는 낮게 나타내었으며, 오배자의 경우 추출액을 가한 균 배양액에서 균 증식 억제는 물론 증식된 균을 사멸시킴을 확인하였다.

상기 결과들을 통해 본 발명자는 돼지 소화기질병의 원인체에 대한 면역난황항체에 호흡기질병의 원인체에 대한 천연약용식물인 오배자, 산수유, 가자, 여정실, 하고초, 구지뽕나무의 추출물을 첨가하여 사용하는 것이 바람직하다는 결론과 이에 근거하여 면역난황항체에 오배자, 산수유, 가자, 여정실, 하고초, 구지뽕나무 추출물에서 소화기 및 호흡기질병에 대한 감염을 더 효과적으로 예방 및 치료할 수 있을 것으로 사료되어 아래의 실험들을 시행하였다.

<실험예 2> 난황 내에 형성된 면역항체가 확인실험

1. 실험방법

항원의 균체를 초음파파쇄기(sonicator)로 처리하여 추출한 균체의 외피단백질(Outer membrane protein)을 라우로살코신(N-lauroylsarcosine)으로 처리한 후 스파덱스(Sephadex G-200 gel)를 이용한 컬럼 크로마토그래피(Column chromatatography)로 추출된 항원을 이용하여 효소면역측정법(Enzyme-linked immunosorbent assay : ELISA)으로 난황에 대한 면역항체가를 다음과 같은 방법으로 측정하였다.

1) 검사기구

① ELISA용 microplate

② Microplate(10㎕, 200㎕용), 12-Channel Multipipette(20 ~ 200 ㎕용)

③ Shaker(microplate용)

④ ELISA reader 및 washing

2) 검사 시약

① 완충액 및 용액

ⓐ Carbonate coating buffer(0.M, pH 9.6)

ㆍNaHCO₃ ----- 2.93 g

ㆍNa₂CO₃ ----- 1.59 g

1,000㎖ DW에서 교반하면서 pH가 9.6이 되도록 조정하여 4 ℃보관하여 사용하였다.

ⓑ Phosphate buffered saline(PBS), pH 7.4

ㆍNaCl ------- 8 g

ㆍKH₂PO₄ ------ 0.2 g

ㆍNa₂HPO₄ ----- 1.19 g

ㆍKCl --------- 0.2 g

DW 1,000㎖에 용해한 다음 pH가 7.4로 조정하여 사용하였다.

ㆍPBS 2,000㎖에 Tween 20을 1 ㎖씩 첨가하였다.

ⓓ Blocking buffer : 2% BSA(Bovine serum albumin) in PBS

ⓔ AP substrate solution(0.05M carbonate, pH 9.8)

ㆍA 용액 : NaHCO₃ 4.2g+ MgCl_2?6H₂O 0.203g → 1,000㎖ DW

ㆍB 용액 : Na₂CO₃ 5.3g+ MgCl_2?6H₂O 0.203g → 1,000㎖ DW

교반하면서 pH가 9.8이 될 때까지 B용액에 A용액을 천천히 혼합하여 4 ℃보관하여 사용하였다.

ⓕ HRP substrate solution(0.1M Citrate-phosphate buffer, pH 5)

ㆍ0.1M Citrate acid : Citrate acid 19.21g을 1,000㎖ DW에 녹였다.

ㆍ0.2M Na₂HPO₄ : Na₂HPO₄ 28.4g을 1,000㎖ DW에 녹였다.

ㆍ0.1M Citrate acid 12.5㎖ +Na₂HPO₄ 12.85㎖ + DW 25㎖

상기 용액에 OPD(sigma P7288) 20㎎을 녹인후 마지막으로 30 % H₂O₂ 20㎕을 넣어 바로 사용하였다.

ⓖ Stop solution : AP → 1M NaOH

HRP → 2.5M H₂SO₄

3) 면역항체가 확인 시험방법

① 항원을 Coating buffer에 적정농도로 희석(100배) 하였다.

② ELISA plate 각 well에 coating buffer로 희석된 항원 100 ㎕씩 분주한 다음 4 ℃에 overnight 시켰다.

③ Washing buffer를 각 well에 200㎕씩 분주한 다음 세척하였다.

이 과정을 3회 실시하였다.

④ 각 well에 blocking buffer 200 ㎕씩 분주한 다음 37 ℃에서 1 시간 정치시켰다.

⑤ Washing buffer를 각 well에 200㎕씩 분주한 다음 세척하였다.

이 과정을 3회 실시하였다.

⑥ 다른 U-form microplate를 이용하여 첫 well에 PBS 180 ㎕에 난황추출물 20 ㎕를 혼합하고 나머지 well에 PBS 100 ㎕씩 분주 후 첫 well의 혼합액 100 ㎕를 11번 well까지 2배수 계단 희석하여 옮긴 다음 마지막 well의 100 ㎕ 는 버렸다.

12번 well은 이미 역가를 알고 있는 면역난황항체 양성과 음성(Sigma 제조난황분말)을 100㎕ 씩 넣었다.

⑦ 항원이 흡착된 ELISA plate에 2진 희석된 난황추출물의 양성, 음성을 각 well에 옮긴 후 37 ℃에서 2 시간 반응시켰다.

⑧ Washing buffer를 각 well에 200 ㎕씩 분주한 다음 세척하였다.

이 과정을 3회 실시하였다.

⑨ 콘쥬게이트(Conjugate)를 PBS에 희석하여 각 well에 100 ㎕씩 분주한 후 37 ℃에서 1 시간 반응시켰다.

⑩ Washing buffer를 각 well에 200 ㎕씩 분주한 다음 세척하였다.

이 과정을 4회 실시하였다.

⑪ Substrate(OPD)를 각각 well에 100 ㎕씩 분주한 다음 실온에서 정확히 10분간 반응시켰다.

⑫ Stoping solution 50 ㎕를 가하여 반응을 중지시키고 ELISA reader(492nm)로 흡광도를 측정하여 P/N(시험품/음성)값이 2이상인 희석배수를 면역항체가로 판정하였다.

2. 실험결과

돼지 전염성위장염바이러스(TGE), 유행성설사병바이러스(PED), 로타 바이러스(PRV), 써코 바이러스(PCV), 대장균증(E.coli), 살모넬라증(Salmonella)의 항원을 산란계에 2 차접종한 후 3 주째부터 면역시킨 닭의 계란을 수득하여 난황 내에 형성된 면역항체가를 상기와 같은 방법으로 측정한 결과, 아래의 표 3과 같이 나타났다.

재료		면역항체가
재료		TGE	PED	PRV	PCV	E.coli	Salmonella
시험군	1	1,280	2,560	2,560	1,280	2,560	5,120
	2	2,560	2,560	2,560	1,280	2,560	2,560
	3	2,560	1,280	1,280	2,560	5,120	2,560
	4	1,280	2,560	2,560	1,280	2,560	5,120
	5	2,560	2,560	1,280	1,280	5,120	5,120
대조군	1	<10	<10	<10	<10	<10	<10
대조군	2	<10	<10	<10	<10	<10	<10

상기 표 3에 나타나 있듯이, 돼지 전염성위장염바이러스에 대한 항체가는 1,280 ~ 2,560배, 유행성설사병바이러스는 1,280 ~ 2,560배, 로타바이러스는 1,280 ~ 2,560배, 써코바이러스의 항체가도 1,280 ~ 2,560배를 각각 나타내었으며, 대장균은 2,560 ~ 5,120배, 살모넬라 2,560 ~ 5,120배의 항체가를 각각 나타내었으며, 대조에서는 모두 10배 이하의 항체가를 나타냄을 알 수 있었다.

<실험예 3> 본 발명인 돼지 전염성질병 예방용 조성물의 면역항체가 실험

1. 실험방법

돼지 전염성위장염바이러스(TGE), 유행성설사병바이러스(PED), 로타 바이러스(PRV), 써코 바이러스(PCV), 대장균증(E.coli), 살모넬라증(Salmonella)에 대한 면역항체가를 측정하였다.

이때, 대조군으로 면역항체가 형성된 난황(IgY)를 준비하였으며, 시험군으로는 면역항체가 형성된 난황(IgY)에 실시예 1에서 제조된 오배자추출물, 산수유추출물, 가자추출물, 여정실추출물, 하고초추출물, 구지뽕나무추출물을 각각 넣어 준비하고, 본 발명인 실시예 3의 조성물(IgY+오배자추출물+산수유추출물+가자추출물+여정실추출물+하고초추출물+구지뽕나무추출물)도 준비하여 면역항체가를 측정하였다.

2. 실험결과

그 결과, 아래의 표 4와 같이 나타났다.

재료	면역항체가
재료	IgY (대조군)	IgY+ 오배자 추출물	IgY+ 산수유 추출물	IgY+ 가자 추출물	IgY+ 여정실 추출물	IgY+ 하고초 추출물	IgY+ 구지뽕나무 추출물	IgY+ 6종혼합
TGEV	1,280	1,280	1,280	1,280	640	1,280	1,280	1,280
PEDV	1,280	1,280	1,280	1,280	1,280	1,280	1,280	1,280
PRV	1,280	1,280	1,280	1,280	640	1,280	1,280	1,280
PCV	640	1,280	1,280	640	1,280	1,280	1,280	1,280
E.coil	2,560	2,560	2,560	1,280	2,560	2,560	2,560	2,560
Salmonella	2,560	2,560	1,280	2,560	2,560	2,560	1,280	2,560

상기 표 4에 나타나 있듯이, 본 발명인 실시예 3의 조성물이 돼지 전염성질병을 일으키는 돼지 전염성위장염바이러스(TGE), 유행성설사병바이러스(PED), 로타 바이러스(PRV), 써코 바이러스(PCV), 대장균증(E.coli), 살모넬라증(Salmonella) 모두에 대해 가장 높은 면역항체가를 나타냄을 알 수 있었다.

<실험예 4> 본 발명의 돼지 전염성질병 예방용 조성물에 대한 효능실험

가. 분말제제(실시예 3)에 대한 시험(5회 실시)

생후 7 일령 자돈 400 두를 선정하여 시험군 200 두에는 실시예 3의 조성물을 사료에 0.5 %(사료 100 kg당 500 g) 혼합하여 21일간 급여하면서 임상증상을 확인한 결과, 아래의 표 5와 같이 나타났다.

구분	자돈	증상발현두수/시험두수
구분	자돈	호흡곤란	식욕부진	설사?위축	구토	침울 (신경증상)
실시예 3	200 두	21/200	19/200	26/200	15/200	13/200
대조군	200 두	49/200	52/200	68/200	26/200	24/200

상기 표 5에 나타나 있듯이, 호흡곤란(21/200), 식욕부진(19/200), 설사? 위축(26/200), 구토(15/200) 및 침울(13/200)등의 임상증상을 나타내었으며, 설사? 위축 및 호흡곤란이 심한 자돈의 경우 폐렴증상 등 복합적인 증상으로 8두가 폐사하였으며, 비 급여 대조군 200두에서도 전형적인 호흡곤란(49/200), 식욕부진(52/200), 설사?위축(68/200), 구토(26/200) 및 침울(24/200)의 복합적인 임상증상을 나타내었으며, 설사?위축 및 호흡곤란이 심한 자돈의 경우 폐렴증상 등 복합적인 증상으로 21두가 폐사함을 확인하였다.

이에, 본 발명인 실시예 3의 조성물을 돼지 전염성질병에 대해 효과적으로 예방하는데 사용할 수 있음을 알 수 있었다.

나. 페이스트 제제(실시예 4)에 대한 시험(8회 실시)

프락토 올리고당을 가하여 제조한 페이스트제제가 돼지 전염성질병에 대한 감염예방 및 치료효과를 확인하기 위하여 생후 2일령의 포유자돈 600두를 선정하여 시험군 300두에는 초유급여 후 두당 5 ㎖씩 14 일간 급여하면서 임상증상을 확인한 결과, 아래의 표 6과 같이 나타났다.

구분	자돈	증상발현두수/시험두수
구분	자돈	호흡곤란	식욕부진	설사?위축	구토	침울 (신경증상)
실시예 4	300 두	28/300	31/300	42/300	17/300	18/300
대조군	300 두	59/300	72/300	68/300	38/300	31/300

상기 표 6에 나타나 있듯이, 호흡곤란(28/300), 식욕부진(31/300), 설사?위축(42/300), 구토(17/300) 및 침울(18/300)의 임상증상을 나타내었으며, 설사?위축 및 호흡곤란 등으로 13두가 폐사하였으며, 비 급여 대조군(300두)에서도 전형적인 호흡곤란(59/300), 식욕부진(72/300) 및 설사?위축(68/300), 구토(38/300) 및 침울(31/300)의 복합적인 임상증상을 나타내었으며, 설사?위축 및 호흡곤란이 심한 자돈의 경우 폐렴증상 등으로 28두가 폐사함을 확인하였다.

이에, 본 발명인 실시예 4의 조성물을 돼지 전염성질병에 대해 효과적으로 예방하는데 사용할 수 있음을 알 수 있었다.

다. 자돈 증체량 측정

생후 7 일령 자돈에 실시예 3의 조성물(분말제제)을 사료에 0.5 %(사료 100 kg당 500 g) 혼합하여 21일간 급여한 자돈에 대한 증체율과 생후 2일령 자돈에 실시예 4의 조성물(페이스트제제)을 14일간 급여한 자돈에 대한 증체율을 측정한 결과, 아래의 표 7과 표 8과 같이 나타났다.

구분		체중변화(kg)
구분		급여전	급여10일후	급여20일후	증체율
실시예 3	1	3.02	3.47	6.80	3.78
	2	2.98	3.52	6.95	3.97
	3	3.08	3.54	6.75	3.67
	4	3.11	3.49	6.78	3.67
	5	3.09	3.37	6.91	3.82
	6	2.88	3.38	6.87	3.99
	7	2.97	3.26	6.89	3.92
	8	3.10	3.45	6.79	3.69
	9	3.05	3.50	7.02	3.97
	10	2.98	3.29	6.95	3.97
대조군	11	3.01	3.36	5.98	2.97
	12	3.04	3.34	5.85	2.81
	13	3.05	3.41	6.01	2.96
	14	2.99	3.39	5.95	2.96
	15	3.00	3.40	5.86	2.86
	16	2.88	3.40	5.88	3.00
	17	3.05	3.42	6.01	2.96
	18	2.93	3.44	5.92	2.99
	19	2.99	3.39	5.95	2.96
	20	2.89	3.40	5.89	3.00

구분		체중변화(kg)
구분		급여전	급여10일후	급여20일후	증체율
실시예 4	1	1.49	3.61	6.87	5.38
	2	1.52	3.59	6.80	5.28
	3	1.48	3.64	6.90	5.42
	4	1.55	3.68	7.00	5.45
	5	1.57	3.65	6.98	5.41
	6	1.46	3.58	6.91	5.45
	7	1.48	3.59	6.88	5.40
	8	1.50	3.63	6.93	5.43
	9	1.49	3.61	6.97	5.48
	10	1.52	3.59	6.99	5.47
대조군	11	1.52	3.51	5.95	4.43
	12	1.49	3.49	5.87	4.38
	13	1.51	3.58	6.00	4.49
	14	1.50	3.53	5.91	4.41
	15	1.48	3.50	5.84	4.36
	16	1.47	3.47	5.91	4.44
	17	1.51	3.51	5.89	4.38
	18	1.46	3.55	5.95	4.49
	19	1.49	3.53	5.93	4.44
	20	1.48	3.49	5.88	4.40

상기 표 7과 표 8에 나타나 있듯이, 실시예 3의 조성물에 대해 급여 전 2.88 ~ 3.11kg 이었으며, 점차적으로 체중이 증가하여 급여 20일후에는 6.75 ~ 7.02kg으로, 3.67 ~ 3.97kg의 체중이 증가한 반면, 대조군에서는 급여 전 2.93 ~ 3.05 kg에서 20 일후에는 5.85 ~ 6.01kg으로 2.81 ~ 3.00kg의 체중이 증가하여 대조군보다 실시예 3의 조성물 급여군에서 860 ~ 970g의 증체율을 보임을 확인하였다.

또한, 실시예 4의 조성물에 대해 급여 전 1.46 ~ 1.57kg이었으나, 점차적으로 체중이 증가하여 급여 20일후에는 6.87 ~ 7.00kg으로, 5.28 ~ 5.48kg의 체중이 증가한 반면, 대조군에서는 급여 전 1.46 ~ 1.52kg에서 5.84 ~ 6.00kg으로 4.36 ~ 4.49kg의 체중이 증가하여 대조군보다 실시예 4의 조성물 급여군에서 920 ~ 990g의 증체율을 보임을 확인하였다.

이에, 본 발명인 실시예 3, 4의 조성물이 돼지 전염성질병에 대해서도 효과적임으로 인해 자돈의 체중도 증체됨을 알 수 있었다.

이에, 본 발명의 돼지 전염성질병 예방용 조성물을 자돈에게 급여할 시, 자돈들은 소화율이 높고 기호성이 좋아 질병의 발병율과 폐사율이 감소하였으며, 사료효율 및 증체율 향상되었고, 성장촉진으로 인한 출하일령 단축 등 자돈들의 건강상태가 양호하여 농장의 생산성을 높여주었으며, 이로 인해 본 발명의 돼지 전염성질병 예방용 조성물은 종래에 사용되어온 항생물질을 대체할 수 있는 물질임을 확인하였다.

이에, 본 발명의 돼지 전염성질병 예방용 조성물을 친환경적인 사육방법에 필요한 기능성제제로 제공할 수 있어, 돼지의 폐사를 줄이고 증체율을 향상시킴으로서 양돈농가의 소득 증대에 크게 이바지할 수 있을 것이라 사료된다.

도 1은 본 발명인 돼지 전염성질병 예방용 조성물의 제조방법도.

Claims

조성물의 전체 중량을 기준으로 오배자 추출물 1 ~ 5 중량 %, 산수유 추출물 1 ~ 5 중량 %, 가자 추출물 1 ~ 5 중량 %, 여정실 추출물 5 ~ 10 중량 %, 하고초 추출물 1 ~ 5 중량 %, 구지뽕나무 추출물 5 ~ 10 중량 %, 면역항체가 형성된 난황 60 ~ 80 중량 %로 이루어진 조성물로서,

돼지 전염성위장염 바이러스(Transmissible gastroenteritis virus), 돼지 유행성설사병바이러스(Porcine epidemic diarrhea virus), 돼지 로타바이러스(Pocine rotavirus infection), 돼지 써코바이러스(Pocine circovirus), 병원성대장균증(Escherichia coli), 살모넬라증(Salmonella typhimurum) 중 선택된 1 종 이상에 대해 예방효과를 갖는 것이 특징인,

돼지 전염성질병 예방용 조성물.
제1항에 있어서,

상기 오배자 추출물, 산수유 추출물, 가자 추출물, 여정실 추출물, 하고초 추출물, 구지뽕나무 추출물은 물에 물 중량대비 10 ~ 20 중량 %의 상기 추출물의 재료인 오배자, 산수유, 가자, 여정실, 하고초, 구지뽕나무 중 어느 하나를 넣고 90 ~ 100 ℃에서 2 ~ 3 시간동안 열수추출하여 얻은 것임을 특징으로 하는,

돼지 전염성질병 예방용 조성물.
제1항에 있어서,

상기 오배자 추출물, 산수유 추출물, 가자 추출물, 여정실 추출물, 하고초 추출물, 구지뽕나무 추출물은 당도가 20 ~ 30 Brix인 것을 특징으로 하는,

돼지 전염성질병 예방용 조성물.
제1항에 있어서,

상기 면역항체가 형성된 난황은 돼지 전염성위장염 바이러스, 돼지 유행성설사병 바이러스, 돼지 로타바이러스, 돼지 써코바이러스, 대장균, 살모넬라증으로 이루어진 항원들을 접종한 산란계가 낳은 계란에서 얻은 것임을 특징으로 하는,

돼지 전염성질병 예방용 조성물.
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