KR100597711B1

KR100597711B1 - 백화사설초 및 영지버섯 추출물을 함유하는 기능성 조성물

Info

Publication number: KR100597711B1
Application number: KR1020040081678A
Authority: KR
Inventors: 라정찬; 박형근; 최미경; 이항영; 강경선
Original assignee: 알앤엘생명과학주식회사
Priority date: 2004-10-13
Filing date: 2004-10-13
Publication date: 2006-07-07
Also published as: KR20060032733A

Abstract

본 발명은 항바이러스 활성을 나타내는 백화사설초 및 영지버섯 추출물을 포함하는 조성물에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는, PMWS 바이러스, PRRS 바이러스, PED 바이러스, TGE 바이러스, 파보 바이러스 및 디스템퍼 바이러스에 대해 우수한 항바이러스 활성을 나타내는 백화사설초 및 영지버섯 추출물을 유효성분으로 함유하는 기능성 조성물에 관한 것이다.

본 발명에 따른 조성물은 천연물 유래의 물질로써 독성 및 부작용이 없으며, 다양한 바이러스에 대하여 탁월한 살균효과를 나타내므로, 바이러스 질환의 예방 및 개선에 효과적이고 안전한 식품 또는 사료 조성물로 유용하게 이용될 수 있다.

백화사설초, 영지버섯, 바이러스, 의약품

Description

백화사설초 및 영지버섯 추출물을 함유하는 기능성 조성물{Functional Composition Comprising Oldenlandia Diffusa and Ganoderma Lucidum Extracts}

현대의학이 발전하면서 세균질환은 항생제, 예방백신 등의 개발로 현저하게 억제되고 있지만, 바이러스 질환은 아직도 정복되고 있지 않을 뿐 아니라 오히려 대기오염, 환경오염 등을 통해 더 늘어나는 것으로 보고되고 있다.

PMWS는 이유자돈의 전신소모성증후군(post-weaning multisystemic wasting syndrome)으로, 주요 증상으로는 체중감소로 인한 식욕결핍, 전신쇠약, 호흡곤란, 황달 등이며, 가끔씩 설사, 기침을, 때로는 중추신경계 장애를 나타내기도 하며 주로 전신 임파장기에 다발성 병변을 일으키는 것이 특징인 소모성 질병을 말한다. 감염돈을 부검시 전신적인 림프절 종창, 림프절의 출혈 등의 소견등을 볼 수 있는데, 이러한 경우는 이유자돈에서 이환율은 낮은 편이지만 임상증상을 보인 경우에는 폐사율이 약 70%로 높은 편이다 (Harding, J.C., Proc. West. Can. Assoc. Swine. Pract., 58:503, 1996). PMWS의 정확한 발병원인에 대해서는 아직 일부 논란이 있긴 하지만 PMWS 발생돈에서 공통적으로 돼지써코바이러스 2형(porcine circovirus type 2; PCV2)의 감염이 증명되어 왔기 때문에 PCV2가 PMWS의 1차적인 원인체로 인정되고 있으며, 최근에는 PMWS 이외에도 다양한 질병 증후군들, 즉 번식장애 질병, 돼지 피부염신증증후군(PDNS), 돼지호흡기질병복합감염증(PRDC), 증식성괴사성폐렴(PNP), 선천성진전증(congenital tremors) 등 다양한 질병과 PCV2가 연관성이 있는 것으로 보고되고 있다.

돼지 생식기 및 호흡기 증후군(porcine reproductive and respiratory syndrome; PRRS)은 아르테리비리대(arteriviridae)과의 막이 있는 양성 가닥 RNA 바이러스(enveloped positive-stranded virus)에 의해서 유발된다. 대략 10~15년전에 두 개의 다른 PRRS 바이러스 균주가 명백히 독립적으로 미국과 유럽에서 출현하였고, 현재 이 질병은 북미, 유럽 및 아시아의 많은 돼지 생산 국가에서 돼지의 생식능력 감소 및 호흡기 질환을 유발하고 있으며, 미국에서 감염의 유행은 70%에 이르는 것으로 추정된다 (Snijder, E.F. and Meulenberg J.J.M., J. of General Virology, 79:961, 1998). PRRS 바이러스는 호흡, 성취, 물린 상처 또는 바늘에 의해서 감염되며, 점막, 폐 또는 국소부위의 대식세포(macrophage)에서 번식한다. 준임상적으로 상기 질병은 분해 또는 지속적으로 감염으로 귀착되며, 지속적으로 감 염된 동물은 경구/인두의 체액, 혈액, 배설물, 소변 및 정액에서 바이러스를 방출한다. 암퇘지에서의 임상학적 증상은 유산 또는 약하게 태어나는 돼지의 조산성 분만, 사산 돼지 및 자기 분해된 태아와 관련있다.

돼지 유행성 설사증(porcine epidemic diarrhea; PED)의 원인체는 코로나바이러스에 속하는 돼지 유행성 설사 바이러스이며, 이 코로나바이러스는 TGE 바이러스와는 항원적으로 전혀 관련성이 없는 코로나바이러스이다. 바이러스의 증식은 소장과 결장의 상피세포 및 장간막 림프절에서 이루어진다. PED는 유럽 및 일본에서 주로 발생되고 있으며, 국내에서는 1992년 처음으로 PED 바이러스가 분리, 보고된 이후 꾸준히 발생되고 있다. PED 바이러스는 일부 TGE(transmissible gastroenteritis; 돼지전염성 위장염)와 복합감염되어 피해를 증가시키고 있으며, 일령에 관계없이 모돈 돼지에 감염되어 발병된다. 포유자돈에서의 증상은 구토를 보이며 갑자기 수양성 설사를 일으키다 폐사하고, 성돈 및 육성, 비육돈의 경우는 산발적인 구토와 설사, 식욕부진을 보이다가 3~5일 후에 회복된다. 폐사율은 어린일령일수록 높고 성돈의 폐사는 드물다. 돼지전염성 위장염(TGE)의 병원체는 코로나바이러스에 속하는 TGE 바이러스이며 햇빛, 고온에 쉽게 사멸하고 포르말린, 가성소다, 요오드용액, 에테르 및 클로로포름에서 쉽게 불활화된다. TGE의 발생양상은 PED와 거의 유사하지만, 온도가 높은 계절에는 발생하지 않으며 주로 겨울철에 발생한다.

개 파보바이러스(canine parvo virus; CPV)는 파보바이러스과(pravoviridae), 파보바이로스속(parvovirus)에 속하며, 고양이 파보바이러스(feline parvovirus)의 일종에 속한다. 개 파보파이러스 입자의 직경은 18~26nm로써 엔벨로프(envelope)가 없고 단쇄의 DNA 바이러스이며, 바이러스 단백질은 3종의 폴리펩타이드를 가지고 있다. 파보바이러스에 의한 주요증상으로는 경구감염 5일 후 중증이 되며 감수성 개가 바이러스에 노출될 경우, 개의 100%가 감염되고 약 75%가 불현성 감염, 25%가 치사율이 높은 임상증상을 갖는다. 초기 증상으로는 기력이 없고, 식욕감퇴와 구토를 일으키며, 구토를 시작한 후 24~48시간 안에 설사가 관찰되고 계속 진행되면 탈수, 체중감소, 수양성 및 혈액이 포함된 설사가 관찰된다.

개 디스템퍼바이러스 감염증(canine distemper virus infection)은 개를 비롯한 육식동물에서 전염성이 매우 높은 급성 또는 아급성의 열성전염병이며, 전세계적으로 애완견에서 뿐만 아니라, 개과 동물인 개, 여우, 늑대, 너구리과 동물인 너구리, 팬다 등과 족제비과 동물인 족제비, 오소리, 스컹크, 흰족제비 등의 육식동물에 감염되어 높은 이환율과 폐사율을 나타내는 바이러스성 질병이다. 개 디스템퍼바이러스 감염증의 병원체는 디스템퍼바이러스로서 파라믹소바이러스과(paramyxoviridae)의 모르비리바이러스속(morbillivirus)에 속하며, 이 바이러스는 환축의 혈액, 뇌척수액, 림파절, 비장, 폐, 기관지, 뇌 등에 다량 함유되어 있으며, 급성의 경우 비말, 안구 분비물, 타액, 뇨 등으로 배출되어 기도 감염 및 접촉감염으로 전파되고 있다. 임상증상은 다양하나 대개 호흡기, 소화기, 피부 및 신경 등 4가지 증상이 단독 또는 복합적으로 나타나며 발열과 비루, 카달성안루, 기관지염, 인두염 등의 호흡기 증상과 동시에 설사 등 소화기 증상도 보인다. 개 디스템퍼바이러스 감염증에 대한 치료법은 거의 없는 실정이며, 가끔 혈청요법으로 혈청제제가 이용되지만 사용시기를 놓치기 쉽기 때문에 실용성이 거의 없다.

상기 PMWS, PRRS, PED, TGE, CD 및 CP 바이러스 등은 전 세계적으로 발생하고 있으며, 축산산업에 있어 막대한 경제적 손실을 주고 있다. 그러나, 이에 대한 마땅한 대처방안을 찾지 못하고 있는 실정이어서 이에 대한 대책이 시급히 요구된다.

한편, 본 발명의 백화사설초는 꼭두서니과(Rubiaceae)에 속하는 1년생 초본인 백운풀(Hedyotis lindleyana var. hirsuta HARA or Oldenlandia diffusa L. ROXB.)의 일년생 전초로서 높이 20~40㎝이고, 밑부분이 옆으로 자라면서 가지가 갈라져서 비스듬히 서며 다세포로 된 백색털이 다소 있다 (Yoshida, Y. et al., Int. J. Immunopharmacol., 19:359, 1997). 백화사설초의 기미는 차가우나 독이 없고 맛은 달고 쓰며, 작용하는 경락은 위경, 대장경, 소장경 등이고, 본초학적으로 청열해독(淸熱解毒), 이수통림(利水通淋), 활혈화어(活血化瘀), 소옹(消癰)의 효능이 있어 폐열기침, 편도선염, 인후염, 충수염, 이질, 황달, 자궁부속기염, 관절염 등의 각종 염증 및 소화기암, 간암, 폐암, 임파암 및 인후암 등 각종 암에 활용되고 있다 (Tong, I.H. et al., Phytochemistry., 25:1988, 1986).

또한, 영지버섯(Ganoderma lucidum(Fr.) Karst)은 불로초과(Ganodermataceae)에 속하며, 불로초, 만년버섯 등으로 불리며, 한국, 일본, 중국 등 분반구 온대 이북에 분포한다. 여름부터 가을까지 활엽수의 생목밑동이나 그루터기 위에 군생 또는 단생하는 근주심재 부후성 버섯으로, 여러 가지 아미노산과 수용성 단백질, 스테로이드물질, 안트라퀴논 유도체, 탄수화물, 각종 배당체, 소량의 알칼로이드 환원성 물질들과 리그닌을 분해하는 효소를 함유하고 있다. 영지버섯은 부작용이 없으며, 항암효과, 조압작용, 정혈작용, 감당작용, 이뇨작용, 해독작용 등 170여 가지의 각종 질환의 치료 및 예방에 유효하여 약용으로 널리 이용되고 있으며, 영지버섯에서 유래된 다당류는 종양에 대한 비특이적인 능동 면역을 부여할 수 있는 생체반응 조절물질로 인식되고 있다 (Shimura, K. et al., Japan. J. Pharmac., 33:403, 1983). 또한 영지버섯 균사체 배양물로부터 추출·분리한 다당체는 미생물 및 종양세포에 대한 직접적인 세포독성과 대식세포 활성에 따른 숙주의 면역기능이 활성화되어 면역능을 높이는 작용에 의해 항미생물작용과 항암작용을 가진다고 보고되고 있다 (Kim, S.W., J. Korean. Soc. Food. Sci. Nutr., 27:1183, 1998).

상기와 같은 천연물을 모체로 한 생리활성물질 도출은 경제적일 뿐 아니라 부작용 및 독성이 적어, 최근에는 이에 대한 연구가 활발히 진행되고 있다. 생약제를 이용한 바이러스 치료제로써, 한국특허출원 제10-2003-0011238호는 아프리카산 영지버섯 추출물의 B형 간염 바이러스(HBV) 및 사람 면역결핍 바이러스(HIV)에 대한 항바이러스 활성에 대하여 개시하고 있으며, 한국특허출원 제10-2003-0024419호는 백화사설초를 함유하는 HIV/AIDS 환자 치료용 약학조성물에 관하여 개시하고 있다. 그러나, PMWS 바이러스, PRRS 바이러스, PED 바이러스 등의 다양한 바이러스에 대한 백화사설초 및 영지버섯 추출물의 항바이러스 활성에 대해서는 어떠한 개시나 교시된 바 없다.

이에 본 발명자들은 독성 및 부작용이 거의 없는 천연물 유래의 생약재를 대상으로 다양한 바이러스에 대한 항바이러스 활성을 연구하던 중, 본 발명의 백화사설초 및 영지버섯 추출물의 PMWS 바이러스, PRRS 바이러스, PED 바이러스, TGE 바이러스, CP 바이러스 및 CD 바이러스에 대한 탁월한 항바이러스 효과를 확인하고, 본 발명을 완성하였다.

결국, 본 발명의 주된 목적은 백화사설초 및 영지버섯 추출물을 유효성분으로 함유하는 바이러스 질환의 예방 또는 개선을 위한 사료 조성물을 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 백화사설초 및 영지버섯 추출물과 식품학적으로 허용 가능한 식품보조 첨가제를 포함하는 바이러스 질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공하는데 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 항바이러스 활성을 갖는 백화사설초(Oldenlandia diffusa) 및 영지버섯(Ganoderma lucidum) 추출물을 포함하는 바이러스 질환의 예방 또는 개선을 위한 사료 조성물을 제공한다.

본 발명은 또한, 항바이러스 활성을 갖는 백화사설초 및 영지버섯 추출물과 식품학적으로 허용 가능한 식품보조 첨가제를 포함하는 바이러스 질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다.

본 발명에 있어서, 상기 백화사설초 및 영지버섯 추출물은 0.1~10:0.1~5의 중량비로 배합될 수 있으며, 바람직하게는 4~10:1~3의 중량비로, 더욱 바람직하게는 7~9:1~3의 중량비로 배합될 수 있고, 상기 백화사설초 및 영지버섯 추출물은 조성물 총 중량에 대하여 10~99중량%로 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 조성물은 차가버섯, 상황버섯, 운지버섯, 동충하초, 노루궁뎅이버섯, 복령, 아가리쿠수, 장수버섯, 잎새버섯, 저령, 말굽버섯, 느타리버섯, 팽이버섯, 표고버섯, 신령버섯, 뽕나무버섯, 기와버섯, 송이버섯 및 목이버섯 추출물로 이루어진 그룹으로부터 선택된 1종 이상의 생약재 추출물 또는 이염화이소시안산나트륨(sodium dichloroisocyanurate)을 추가로 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 바이러스는 PMWS(post-weaning multisystemic wasting syndrome) 바이러스, PRRS(porcine reproductive and respiratory syndrome) 바이러스, PED(porcine epidemic diarrhea) 바이러스, TGE(transmissible gastroenteritis) 바이러스, CP(canine parvo) 바이러스 또는 CD(canine distemper) 바이러스인 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 사료 조성물은 돼지, 개, 여우, 늑대, 너구리, 팬다, 족제비, 오소리 또는 스컹크에 급여하는 것을 특징으로 할 수 있다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명의 백화사설초 및 영지버섯 추출물은 하기와 같이 수득될 수 있다.

본 발명의 백화사설초 또는 영지버섯을 구입하여 30~50메쉬로 분쇄한 후, 백화사설초 또는 영지버섯 시료 중량의 약 2~10배, 바람직하게는 약 3~6배에 달하는 부피의 물 및 메탄올, 에탄올, 부탄올 등과 같은 C₁~C₄의 저급알콜의 극성 용매 또는 이들의 약 1:0.1~1:10의 혼합비를 갖는 혼합용매로, 바람직하게는 30~70% 에탄올 또는 주정으로 실온에서 약 1일~5주간, 바람직하게는 1일~5일 동안 열수 추출, 냉침 추출, 환류 냉각 추출 또는 초음파 추출 등의 추출방법을 사용하여 추출한 후, 0.1~10㎛의 필터로 여과한 다음, 상층액을 모으고 감압농축하여 10~70브릭스(brix), 바람직하게는 20~50브릭스의 백화사설초 또는 영지버섯 추출물을 수득할 수 있다.

백화사설초 및 영지버섯 혼합 추출물은 상기와 같은 방법으로 각각을 추출한 후, 백화사설초 및 영지버섯 추출물을 혼합하거나, 각 성분을 먼저 혼합한 후, 상기의 방법에 따라 추출하여 수득할 수 있다.

또한 본 발명의 비극성 용매 가용 추출물은 상기 추출물을 증류수에 현탁한 후, 이를 현탁액이 약 1~100배, 바람직하게는 약 1~5배 부피의 헥산, 에틸아세테이트, 클로로포름과 같은 비극성 용매를 가하여 1회~10회, 바람직하게는 2회~5회 비극성용매 가용층을 추출, 분리하여 수득할 수 있다. 또한 추가로 통상의 분획 공정을 수행할 수도 있다 (Harborne, J.B., Phytochemical methods: A guide to modern techniques of plant analysis, 3:6-7, 1998).

본 발명은 상기의 제법으로 얻어진 백화사설초 및 영지버섯 추출물을 유효성분으로 함유하는 바이러스 질환의 예방 및 개선을 위한 기능성 조성물을 제공한다. 상기 본 발명의 조성물은 효과의 증진을 위하여 임의의 다른 생약재 또는 그의 추출물을 추가로 포함할 수 있으며, 이 경우 상기 추출방법에 따라 생약재의 추출물을 제조한 후, 본 발명의 조성물에 가하거나 백화사설초 및 영지버섯과 생약재를 함께 혼합한 후, 상기의 방법으로 추출하여 얻어진 추출물을 조성물에 포함시킬 수 있다.

상기 본 발명의 조성물에 첨가될 수 있는 생약재 추출물로는 차가버섯, 상황버섯, 운지버섯, 동충하초, 노루궁데이버섯, 복령, 아가리쿠스, 장수버섯, 잎새버섯, 흰목이, 저령, 말굽버섯, 느타리버섯, 팽이버섯, 표고버섯, 신령버섯, 뽕나무버섯, 기와버섯, 송이버섯 및 목이버섯 추출물을 예시할 수 있으나, 이에 한정되지는 않으며 상기 생약재 추출물들은 각각 단독으로 또는 서로 배합하여 사용할 수 있다. 또한, 본 발명의 조성물의 효과 증진을 위해 이염화이소시안산나트륨(sodium dichloroisocyanu rate)을 추가로 포함할 수 한다. 상기 첨가되는 생약재 추출물 및 이염화이소시안산나트륨은 조성물 총 중량에 대하여 0~90중량%로, 바람직하게는 40~80중량%로 포함될 수 있다.

또한, 본 발명의 백화사설초 및 영지버섯은 오랫동안 생약으로 사용되어 오던 약재로서 이로부터 추출된 본 발명의 추출물들 역시 독성 및 부작용 등의 문제가 없다.

상기와 같은 방법으로 얻어진 백화사설초 및 영지버섯 추출물의 항바이러스 효과를 검색한 결과, PMWS 바이러스, PRRS 바이러스, PED 바이러스, TGE 바이러스, CP 바이러스 및 CD 바이러스에 대하여 탁월한 항바이러스 활성을 나타냄을 확인할 수 있었다.

상기 본 발명의 항바이러스 활성을 갖는 백화사설초 및 영지버섯 추출물을 함유하는 조성물은 바이러스 질환의 예방 및 개선을 위한 사료 조성물 또는 식품 조성물로 유용하게 이용될 수 있다.

본 발명의 백화사설초 및 영지버섯 추출물은 바이러스 질환의 예방 효과를 위하여 다양한 식품에 첨가될 수 있다. 상기 추출물을 첨가할 수 있는 식품으로는, 예를 들어, 각종 식품류, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 건강 기능성 식품류 등이 있다.

본 발명의 건강 기능성 음료 조성물은 지시된 비율로 필수 성분으로서 상기 추출물을 함유하는 외에는 다른 성분에는 특별한 제한이 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상술한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100㎖당 일반적으로 약 1~20g, 바람직하게는 약 5~12g이다.

상기 외에 본 발명의 추출물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그밖에 본 발명의 추출물들은 천연 과일 쥬스 및 과일 쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 그렇게 중요하진 않지만 본 발명의 추출물 100 중량부 당 0~20 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예 1: 백화영지산의 제조

1-1. 백화사설초 추출물의 제조

건조된 백화사설초를 구입하여 30~50메쉬(mesh)로 분쇄한 후, 백화사설초 분말 1g에 40% 에탄올 10㎖를 가한 다음, 100℃에서 3시간 동안 환류추출한 후, 액체 성분을 35브릭스(brix)가 되도록 증발시켜 백화사설초 추출물을 수득하였다.

1-2. 영지버섯 추출물의 제조

건조된 영지버섯를 구입하여 30~50메쉬(mesh)로 분쇄한 후, 백화사설초 분말 1g에 40% 에탄올 10㎖를 가한 다음, 100℃에서 3시간 동안 환류추출한 후, 액체 성분을 35브릭스가 되도록 증발시켜 영지버섯 추출물을 수득하였다.

1-3. 백화영지산 추출물의 제조

건조된 백화사설초와 영지버섯을 구입하여 30~50메쉬로 분쇄한 후, 분쇄된 백화사설초 분말 및 영지버섯 분말을 8:2의 비율로 혼합한 다음, 상기와 같은 방법으로 추출하여 백화사설초 및 영지버섯의 혼합 추출물을 수득하였으며, 이를 '백화영지산'이라 명명하였다.

실시예 2: PMWS(전신소모성증후군) 바이러스 살균효과

백화영지산의 PMWS 바이러스 살균효과를 알아보기 위하여, PMWS의 유발 원인체이 돼지써코 바이러스 2형(porcine circovirus type 2; PCV2)의 세포주로 PK 15 세포주를 사용하였으며, 양성대조군 바이러스로는 PCV2 strain DR673(10^6.0TCID₅₀/0.1㎖ by PCR)을 사용하였다.

백화영지산 시료 1㎖와 바이러스액 1㎖를 가한 후, 살균된 경수를 첨가하여 8㎖가 되도록 한 다음 혼합하여 1:10배로 희석하였다. 상기 희석액 1㎖에 바이러스 액 1㎖를 가하고 살균된 경수를 첨가하여 8㎖가 되도록 한 다음 혼합하여 1:50 배로 희석하였다. 상기와 같은 방법을 반복하여 500배, 800배, 1,000배, 1,200배, 1,500배, 2,000배의 희석액을 수득하였다. 수득된 희석액을 4℃에서 30분 동안 배양하였으며, PK-15세포가 제거된 PCV를 포함하는 3개의 96-웰 플레이트는 배지를 제거하고 PBS로 세척하였다. 96-웰 플레이트에 각각의 희석액(800, 1000, 1200, 1500, 2000배) 100㎕를 3회 반복하여 접종한 후, 37℃에서 1시간 동안 배양하였으며, 음성대조군은 배양배지 100㎕를 접하였다. 배양 후 희석액을 제거하고 PBS로 3회 세척한 다음, 플레이트의 각 웰에 300mM D-글루코사민 50㎕를 접종하여 15분 동안 배양한 후, 바이러스 액을 제거하고 PBS로 3회 세척하였다. 바이러스 액이 제거된 플레이트의 각 웰에 배양 배지를 200㎕ 첨가하여 다시 37℃에서 48시간 동안 배양한 다음 IFA 방법을 이용하여 PMWS 바이러스에 대한 살균효과를 측정하였다. 즉, 각 웰로부터 배양배지를 제거한 후 -20℃에서 2시간 이상 에탄올을 이용하여 96-웰 플레이트를 고정한 다음, 에탄올을 제거하고 30분 동안 플레이트를 건조시켰다. 각 웰에 PCV 양성 혈청 100㎕를 첨가하여 37℃에서 2시간 동안 배양한 다음 혈청을 제거하고, PBS 100㎕로 3회 반복하여 세척한 후, 50㎕ 플루오레세인 컨쥬게이트된 항-돼지 IgG(fluorescein conjugated anti-swine IgG)를 각 웰에 첨가하여 37℃에서 1시간 동안 배양하였다. 각 웰을 다시 한번 세척한 다음, 형광현미경(10X objective lens)을 이용하여 플레이트를 관찰하였다.

실험결과, 본 발명의 백화영지산은 1% 유기물 및 5% 유기물 조건에서 PCV2 바이러스를 1,000배 농도까지 유효하게 살균하는 것을 확인할 수 있었다.(표 1 참조).

	1% 유기물	5% 유기물
800	유	유
1,000	유	유
1,200	Null	Null
1,500	Null	Null
2,000	Null	Null

실시예 3: 항바이러스 효과

백화영지산의 PRRS, PED, TGE, CP 및 CD 바이러스 살균 효과를 측정하기 위하여, 하기 표 2의 세포주 및 공시바이러스를 사용하였다. 백화영지산의 바이러스 살균효과에 대한 실험은 바이러스의 소독제 효력시험지침(한국동물약품협회: http://kahpa.or.kr/index_k.htm, 별표 2의 규정)에 따라 하기와 같이 수행하였다.

구체적으로, 각각의 바이러스에 대한 세포주를 10% FBS를 첨가한 MEM[minimum essential medium; L-글루타민, HEPES 완충액, 비필수아미노산, NaHCO₃, 항생물질(antibiotics)]배지에서 계대배양하였으며, 계대배양 중 활력있는 바이러스를 사용하고, 바이러스의 증식이 최대인 시점에서 채독하여 사용직전까지 단시간 동안 얼음물에서 보관하였다. 실험시료와 바이러스를 반응시키기 전에 소독제 효력시험지침 상의 소독제의 희석 방법에 따라 400배, 500배, 600배, 700배, 800배, 900배, 1000배로 희석하였다. 상기 증식된 4℃의 바이러스액 1.0㎖를 4℃의 1% 유기물 희석액 19.0㎖에 섞은 후에 1분 간격으로 혼합액 2.5㎖를 꺼내어 4℃에 있는 동량의 시료 희석액이 들어있는 시험관에 넣고 혼합한 다음, 4℃에서 정확히 30분 동안 반응시켰으며, 반응 중간에 10분마다 혼합하여 주었다. 대조군은 시료 대신에 경수 또는 증류수를 사용하였다. 반응이 끝난 후, 즉시 1.0㎖를 꺼내어 37℃ 동량의 중화배지에 넣고 혼합한 다음, 중화반응액을 희석하고 적합한 양을 세포에 접종하여 바이러스 함량을 측정하였다. 바이러스의 증식여부를 판정하기 위해, 시료를 접종할 단층배양한 플레이트에서 배지를 제거하고 PBS로 세척한 다음, 플레이트의 각 웰에 희석된 시료를 100㎕씩 3회 반복으로 접종하였다. 이 때 음성대조군은 배지성분을 200㎕ 첨가하였으며, 플레이트는 37℃에서 72시간 동안 배양한 후, 세포변성효과(CPE)를 이용하여 바이러스의 증식여부를 관찰하였다. 바이러스 함유량은 Kaerber method를 이용하였으며, 병원체 대조군의 바이러스 함량에서 시료 처리군의 바이러스 함량을 대조로 하여 10⁴ TCID₅₀ 불활화가 인정되는 희석농도를 유효농도로 하고, 최종 유효희석배수는 3회 반복 실험결과의 중위수로 하였다.

실험결과, 하기 표 3에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 백화영지산은 5% 유기물 조건에서 PRRS 바이러스를 1:900농도까지 유효하게 살균하는 것을 확인할 수 있었다. 또한, PED 바이러스, TGE 바이러스 및 개 파보바이러스(CPV)는 1:800농도까지, 개 디스템퍼바이러스(CDV)는 1:500농도까지 유효하게 살균하는 것을 확인할 수 있었다.

	세포주	공시바이러스
PRRS 바이러스	MARC-145 cells	VR-2332 strain, 10^5.0TCID₅₀/㎖
PED 바이러스	Vero cells	KPEDV-9 strain, 10^5.5TCID₅₀/㎖
TGE 바이러스	ST cells	Pyungtak-40 strain, 10^5.5TCID₅₀/㎖
CP 바이러스 (개 파보바이러스)	CRFK cells	C-780916 strain, 10^5.0TCID₅₀/㎖
CD 바이러스 (개 디스템퍼바이러스)	Vero cells	Lederle strain, 10^5.0TCID₅₀/㎖

희석배수	항바이러스 유효농도
희석배수	PRRS	PED	TGE	CP	CD
1:400	유	유	유	유	유
1:500	유	유	유	유	유
1:600	유	유	유	유	무
1:700	유	유	유	유	무
1:800	유	유	유	유	무
1:900	유	무	무	무	무
1:1,000	무	무	무	무	무

실시예 4: 독성 평가

3 주령의 스프라구-도울리(sprague-dawley)계 랫트 암, 수 각 50마리를 사용하여 독성실험을 실시하였다. 먼저, 실험동물을 온도 22±3℃, 상대습도 50±10%, 12시간 명암대비의 사육실에서 1주일간 순화시킨 다음, 일반증상을 관찰하여 건강한 랫트(암, 수 각 40마리)만을 선별하여, 무작위로 용매대조군, 저용량 투여군[사료 0.0001%(w/w)], 중간용량 투여군[사료 0.01%(w/w)], 고용량 투여군[사료 0.1%(w/w)]으로 분류하였다. 본 발명의 백화사설초 추출물 분말을 시험물질의 농도에 적합하게 사료분말과 전분을 배합하여 사료를 만든 다음, 각 그룹당 암, 수 각 10마리씩의 동물에 자유로이 섭취하도록 하였다. 실험물질은 1일 1회, 총 90일간 투여하였으며, 실험 물질 투여 후 동물의 폐사여부, 임상증상 및 체중변화를 관찰하고 혈액학적 검사와 혈청 생화학적 검사를 실시하였으며, 부검하여 장기의 중량 및 크기를 측정하고 조직병리학적 검사를 시행하였다.

실험 결과, 실험 물질을 투여한 모든 동물에서 특기할 만한 임상증상이나 폐사된 동물은 없었으며, 체중변화, 혈액검사, 혈액생화학 검사 및 부검 소견 등에서도 독성변화는 관찰되지 않았다. 이상의 결과, 본 발명의 백화사설초는 고용량인 백화사설초 추출물 10% 사료혼합 섭취 이하의 농도에서는 독성변화를 나타내지 않았으며, 경구투여 최소치사량(LD₅₀)이 약 5731㎎/㎏인 안전한 물질로 판단되었다.

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

이상에서 상세히 설명한 바와 같이, 본 발명의 백화사설초 및 영지버섯 추출물을 포함하는 조성물은 천연물 유래의 물질로써 독성 및 부작용이 없으며, 다양한 바이러스에 대하여 우수한 살균효과를 나타내므로, 바이러스 질환의 예방 및 개선에 효과적이고 안전한 식품 또는 사료용 조성물로 유용하게 이용될 수 있다.

Claims

항바이러스 활성을 갖는 백화사설초(Oldenlandia diffusa) 및 영지버섯(Ganoderma lucidum) 추출물을 포함하는, PMWS(post-weaning multisystemic wasting syndrome) 바이러스, PRRS(porcine reproductive and respiratory syndrome) 바이러스, PED(porcine epidemic diarrhea) 바이러스, TGE(transmissible gastroenteritis) 바이러스, CP(canine parvo) 바이러스 및 CD(canine distemper) 바이러스로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 바이러스에 의해 유발된 질환의 예방 또는 개선용 사료 조성물.
제1항에 있어서, 상기 백화사설초 및 영지버섯 추출물은 0.1~10:0.1~5의 중량비로 배합되는 것을 특징으로 하는 사료 조성물.
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제1항에 있어서, 상기 사료 조성물은 돼지, 개, 여우, 늑대, 너구리, 팬다, 족제비, 오소리 또는 스컹크에 급여하는 것을 특징으로 하는 사료 조성물.
항바이러스 활성을 갖는 백화사설초(Oldenlandia diffusa) 및 영지버섯(Ganoderma lucidum) 추출물을 포함하는, PMWS(post-weaning multisystemic wasting syndrome) 바이러스, PRRS(porcine reproductive and respiratory syndrome) 바이러스, PED(porcine epidemic diarrhea) 바이러스, TGE(transmissible gastroenteritis) 바이러스, CP(canine parvo) 바이러스 및 CD(canine distemper) 바이러스로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 바이러스에 의해 유발된 질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물.
제6항에 있어서, 분말, 정제, 과립, 캡슐 또는 음료의 형태로 제형되는 것을 특징으로 하는 식품 조성물.
제6항에 있어서, 상기 백화사설초 및 영지버섯 추출물은 0.1~10:0.1~5의 중량비로 배합되는 것을 특징으로 하는 식품 조성물.
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