KR100881035B1 - 맨드라미 추출물을 함유하는 바이러스로 인한 인간 질환의치료 및 예방용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 맨드라미 추출물을 함유하는 바이러스로 인한 인간 질환의 예방 및 치료를 위한 조성물에 관한 것으로, 본 발명에 의한 맨드라미 추출물은 인플루엔자 A 바이러스 (influenza A virus), 뉴캣슬병 바이러스 (newcastle disease virus), 닭 전염성기관지염 바이러스 (infectious broncheitis virus), 조류 뉴모 바이러스 (avian pneumovirus), 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스 (porcine reproductive and respiratory syndrome virus), 콕사키 바이러스 (coxsakie virus), 세망내피증 바이러스 (reticuloendotheliosis virus), 오제스키 바이러스 (aujeszky's disease virus) 및 아데노 바이러스 (adeno virus)의 감염 세포주를 이용한 시험관 내 (in vitro) 실험 및 상기 바이러스 감염 동물을 이용한 생체 내 (in vivo) 실험 에서 바이러스 증식 억제 및 살바이러스에 의한 항바이러스 효과가 탁월하므로, 상기 바이러스의 체내 감염으로 유발되는 인간 질환의 예방 및 치료에 유용한 약학조성물 및 건강기능식품에 이용할 수 있다.

바이러스, 맨드라미, 약학 조성물, 건강기능식품.

Description

맨드라미 추출물을 함유하는 바이러스로 인한 인간 질환의 치료 및 예방용 조성물 {Composition comprising an extract of Celosia for preventing and treating human disease caused by viruses}

도 1은 맨드라미 60% 에탄올 추출물의 인플루엔자 바이러스에 대한 플라크 감소분석 결과를 나타낸 도이며,

도 2는 맨드라미 비극성 용매 가용추출물의 인플루엔자 바이러스에 대한 플라크 감소분석 결과를 나타낸 도이다.

본 발명은 맨드라미 추출물을 함유하는 바이러스로 인한 인간 질환의 치료 및 예방용 조성물에 관한 것이다.

인플루엔자 바이러스 (Influenza virus)는 오르소믹소 계통 (Family Orthomyxoviridae)에 속하는 RNA 바이러스로서 혈청형은 A형, B형, C형 등 3가지로 구분된다. 그 중 B형과 C형은 사람에서만 감염이 확인되고 있으며, A형은 사람, 말 , 돼지, 기타 포유류 그리고 다양한 종류의 가금과 야생조류에서 감염이 확인되고 있다 (Selmons et al., Avian Dis., 18(1), pp119-124, 1974; Turek R et al., Acta Virol., 27(6), pp523-527, 1983; Webster RG et al., Microbiol Rev., 56(1), pp152-179, 1992).

A형 인플루엔자 바이러스의 혈청형은 바이러스 표면의 두 가지 단백질인 햄어글루티닌 (Hemagglutinin: HA), 뉴라미니다제 (Neuraminidase: NA)의 종류에 따라 구분되며, 혈청형에 따라 144종류 (HA 단백질 16종과 NA 단백질 9종)로 분류할 수 있다. HA는 바이러스가 체세포에 부착하는 역할을 하며, NA는 바이러스가 세포 내로 침투할 수 있도록 한다. (Alexander DJ, Vet. Microbiol., 74(1-2), pp3-13, 2000).

A형 인플루엔자 바이러스의 정상적인 자연숙주는 오리, 갈매기 등과 같은 야생 물새류로 알려져 있으며, 전 세계적으로 야생조류에 대한 인플루엔자 감염 역학조사를 실시한 결과 현존하는 모든 16종의 HA형과 9종의 NA형 인플루엔자 바이러스가 야생조류에서 감염되고 있음이 확인되었다 (Selmons et al., Avian Dis., 18(1), pp119-124, 1974). A형으로 분류되는 조류인플루엔자 바이러스는 인수(人獸) 공통 전염병 바이러스로, 병원성에 따라 닭에 감염 시 가벼운 호흡기 증상을 유발하는 비병원성 조류 인플루엔자, 1∼30 % 내외의 폐사와 산란 저하를 유발하는 저병원성 조류 인플루엔자 (Low pathogenic avian influenza: LPAI) 그리고 95 % 이상의 높은 치사성을 보이고 “조류독감 (버드플루: Bird flu)”이라고도 불리는 고병원성 조류 인플루엔자 (Highly pathogenic avian influenza: HPAI)등 크게 3가 지 병형으로 구분하고 있다 (Alexander DJ, Vet. Microbiol., 74(1-2), pp3-13, 2000). 이중 고병원성 조류 인플루엔자는 국제수역사무국 (OIE)에서 A 등급으로, 그리고 국내에서는 제1종 가축전염병으로 분류하고 있다.

고병원성 조류 인플루엔자 (HPAI)는 1980년도 이후 미국(1983년), 호주(1985, 1992, 1994, 1997년), 멕시코(1994년), 파키스탄(1994, 2004년), 홍콩(1997, 2001년), 이탈리아(1997, 1999년), 네덜란드(2003년), 벨기에(2003년), 독일(2003년), 캐나다(2004년) 등 전 세계적으로 발생이 확인되고 있다. 특히 2003년 12월 한국을 시작으로 2004년 베트남, 일본, 태국, 캄보디아, 라오스, 라오스, 인도네시아, 중국 등 동남아시아와 극동아시아 전 지역에서 거의 동시 다발적으로 혈청형 A/H5N1 고병원성 조류 인플루엔자가 발생되었다. 특히 베트남과 태국등지에서 발생한 고병원성 조류 인플루엔자는 그 당시 한국과 일본 등지에서 발생한 인체에 감염이 안되는 전통적인 고병원성 조류 인플루엔자와는 달리 감염조류와 접촉 시 인체 감염이 가능한 변이형 조류독감 (변이형 A/H5N1 HPAI) 바이러스로 2004년 3월까지 베트남에서는 감염조류와 접촉한 22명이 감염되어 그중 15명이 사망하였고, 인접국인 태국에서는 감염조류와 접촉한 11명이 감염되어 그중 8명이 사망하여 현재 전 세계가 우려의 목소리를 높이고 있는 실정이다. 최근 고병원성 조류 인플루엔자의 발생빈도가 과거에 비하여 10배 가량 증가된 셈이며, 특히 2001년도부터는 전 세계적으로 매년 발생되는 양상을 취하고 있어 고병원성 조류 인플루엔자를 효과적으로 방제할 수 있는 보다 새로운 개념의 방제대책이 요구되고 있다 (Song CS et al., Korean J. Poult. Sci., 31(2), pp129-136, 2004).

사람 인플루엔자에 대한 최초의 기록은 기원전 412년으로 거슬러 올라가나, 인류 최초의 인플루엔자 대유행 (pandemic influenza) 기록은 1173년부터 1174년에 유럽 전역에서 발생한 것으로 추정하고 있다 (Grmek MD, Les Maladies a L'aube de la Civilization Accidentale, Payot, Paris, 1893; Hirsch A, Handbook of Geographical and Histological Pathology, New Syndenham Society, London, 1883). 20세기에 접어들면서 인플루엔자에 대한 기록이 보다 과학적으로 다루어지면서 남겨진 자료를 근거해 보면 20세기 이후 지금까지 사람에서 3번의 인플루엔자 대유행 있었다. 1918년부터 1920년 사이에 전 세계적으로 유행한 20세기 이후 1차 인플루엔자 대유행 (일명 스페인 독감)은 인류가 겪은 가장 큰 피해로 기록되고 있으며 그 기간 중 2천만 명에서 5천만 명의 사람이 사망하였다 (Walter JH, Bull. NY Acad. Med., 54, pp855-864, 1978). 스페인 독감의 원인 바이러스는 돼지 인플루엔자 바이러스와 매우 유사한 혈청형 A/H1N1으로 판명되었으며 지금도 매년 전 세계적으로 유행하고 있는 유행성 독감의 주된 유행주이다 (Taubenberger JK et al., Science, 275, pp1793-1796, 1997). 1957년부터 1958년 사이에 발생한 20세기이후 2차 인플루엔자 대유행은 중국에서 시작하여 6-7개월 사이에 해안을 따라 인근의 홍콩, 싱가포르, 일본, 대만 등지로 급속도로 전파되었다. 이 기간 중 전 세계 인구의 약 40- 50% 정도가 감염되었으며, 그중 25 % 정도가 임상증상을 보였으며, 주로 유아층이나 중장년층들만이 감염되어 사망하였으며, 그 기간 중 약 1백만명의 사람이 사망하였다 (Potter CW, J. appl. Microbiol., 91, pp572-579, 2001). 원인 바이러스는 혈청형 A/H2N2 인플루엔자 바이러스로 확인되었다. 또한 1968부터 1969년 사이에 발생한 3차 인플루엔자 대유행은 홍콩에서 유래된 것으로 확인되었으며 대만, 필리핀, 싱가포르, 베트남 등지로 급속히 전파되었다. 원인 바이러스는 혈청형 A/H3N2 바이러스로서 이전의 혈청형 H2N2 바이러스와 HA형이 다른데, 이 HA형은 조류로부터 전달된 것으로 분석되고 있으며, 지금도 매년 전 세계적으로 유행하고 있는 유행성 독감의 주된 유행주이다 (Oxford JS, Rev. Med. Virol., 10(2), pp119-133, 2000).

조류에서 주로 문제시되고 있는 AIV 중 일부 혈청형은 사람에 감염되어 독감증세를 보이다가 사망을 유발하기도 한다. 현재까지 “홍콩조류독감”이라 불리고 있는 혈청형 A/H5N1을 포함하여 혈청형 A/H7N7, 그리고 혈청형 A/H9N2 등 총 3종의 조류 유래 조류독감 바이러스 중 일부의 변종 바이러스들이 인체에 감염될 가능성이 있는 것으로 추정되고 있다. 따라서 현재 이들 3종의 혈청형에서 유래된 변종 바이러스에 대한 연구가 전 세계적으로 진행되고 있는 실정이다 (Suarez DL et al., J. Virol., 72(8), pp6678-6688, 1998).

최근 베트남에서 보고되고 있는 조류 독감 바이러스 (혈청형 A/H5N1 조류 인플루엔자 바이러스)의 종속간의 장벽을 뛰어넘는 인체감염 사례는 20세기 이후 4차 사람 인플루엔자 대유행의 전주곡으로서 전 세계가 현재 이 인체감염이 가능한 변이 바이러스의 사람에서 사람으로의 직접전염 등 그 전파양상에 주목하고 있다. 이 변이 바이러스는 혈청형 A/H5N1이 속하는 조류 인플루엔자 바이러스이며, 이 바이러스 역시 인류가 처음으로 경험하는 지금까지 조류에서만 유행하던 조류 인플루엔자 바이러스이기 때문이다.

인플루엔자 바이러스는 호흡기에 감염되어 전신증상을 일으키고, 주기적으로 모습을 바꿀 뿐 아니라, 숙주를 죽이지 않고 숙주가 죽기 전에 다른 숙주로 이동하기 때문에 과학자들은 인플루엔자 바이러스는 인류의 종말까지 살아남는 바이러스일 것으로 추측한다. 인류에게 가장 큰 경제적 손실을 가져오는 바이러스이며 예방백신이 개발되어 있기는 하지만 바이러스의 변이를 따라 잡지는 못하고 있는 실정이며, 아직 근본적인 바이러스 치료는 이루어지지 않고 있다.

조류 인플루엔자 예방백신 중 생바이러스 백신은 변이가 쉽게 되는 바이러스의 특성상 개발이 거의 불가능한 실정이며, 현재까지 개발된 백신은 크게 사독백신과 유전자재조합 백신으로 구분할 수 있다. 1999년도 이탈리아 그리고 2003년 홍콩에서는 고병원성 조류 인플루엔자 발생이 장기화되고 전국으로 확산되면서 조류 인플루엔자 예방백신을 선택적 살처분 정책과 병행하여 고병원성 조류 인플루엔자 퇴치의 수단으로 이용하였으며, 현재 이탈리아와 홍콩에서는 조류 인플루엔자 예방백신의 사용이 고병원성 조류 인플루엔자를 방제하는데 효과적이었다는 긍정적인 평가를 받고 있다 (Capua I et al., Avian Pathol., 32, pp47-55, 2003; Capua I and Marangon S, Avian Pathol., 32, pp335-343, 2003; Swayne DE et al., Avian Pathol., 28, pp245-255, 1999). 이탈리아 (혈청형 A/H7N1)와 홍콩 (혈청형 A/H5N1)에서 긍정적인 평가를 받은 백신은 모두 사독백신으로 HA형은 동일하나 NA형이 다른 이종 혈청형의 바이러스 (혈청형 A/H7N3, 혈청형 A/H5N2)로 사독백신을 제조하여 항체검사 시 야외감염과의 구별을 시도한 경우이다. 그러나 이 사독백신은 기존 A형 조류 인플루엔자 표준진단법인 한천겔 침강 (AGP, Agar Gel Precipitation) 검사법으로는 백신항체와 야외감염항체의 구분이 불가능하고 NA형을 감별하는 형광항체법은 대규모의 항체 모니터링 검사에 적합하지 않다는 점이 가장 큰 단점으로 지적되고 있다. 또한 현재 개발되어 있는 사독백신은 고병원성 조류 인플루엔자 감염시 분변으로 배출되는 바이러스의 양을 줄여줄 수는 있지만 완벽하게 질병의 확산을 막지는 못하는 것으로 평가되고 있다 (Capua I et al., Avian Pathol., 32, pp47-55, 2003; Capua I and Marangon S, Avian Pathol., 32, pp335-343, 2003; Swayne DE et al., Avian Pathol., 28, pp245-255, 1999).

멕시코의 경우, 1993년도 후반 혈청형 A/H5N2 저병원성 조류 인플루엔자 발생시 전국으로 확산된 바이러스가 고병원성으로 병원성이 증강되어 결국 살처분 정책을 포기하고, 처음에는 자국 내에서 분리된 바이러스를 이용하여 자가 사독오일백신을 생산하여 사용하다가, 백신접종계와 야외감염계의 구분을 위하여 첨단 유전자 재조합 백신접종으로 전환하여 현재까지 사용하고 있다. 멕시코에서 지금까지 사용되고 있는 백신은 계두 바이러스 (fowl pox virus)에 고병원성 조류 인플루엔자 바이러스의 표면 단백인 햄어글루티닌 (Hemagglutin) 유전자를 삽입하여 백신접종시 계두와 고병원성 조류 인플루엔자를 동시에 효과적으로 예방할 수 있는 첨단 유전자 재조합 바이러스 벡터 백신이나, 또 한편으로는 우리나라를 포함하여 계두 백신을 사용하는 국가에서는 기존의 계두백신 접종으로 유도된 항체의 간섭현상으로 인하여 바이러스 벡터 백신의 효과가 반감되는 단점도 있는 것으로 평가되고 있다. 그 외 전염성 후두기관염 (Infectious Laryngotracheitis Virus: ILT)에 고병원성 조류 인플루엔자 바이러스의 표면 단백인 햄어글루티닌 (Hemagglutin) 유전자 를 삽입하여 유전자 재조합 바이러스 백터백신이 개발되어 있으나 이것 역시 우리나라를 포함하여 전염성 후두기관염 백신을 사용하는 국가에서는 효과가 반감되며, 사용 가능 대상이 닭에만 국한된다는 단점이 있는 것으로 평가되고 있다 (Beard CW et al., Avian Dis., 35, pp356-359, 1991; Webster RG et al., Avian Dis., 40, pp461-465, 1996; Swayne DE et al., Avian Dis., 41, pp910-922, 1997; Swayne DE et al., Avian Dis., 44, pp132-137, 2000).

아만타딘 (amantadine)과 리만타딘 (rimantadine)은 인플루엔자 바이러스의 M2 이온채널 단백의 기능을 억제하는 물질로 생체 내 인플루엔자 바이러스의 증식을 억제하는 대표적인 항바이러스 제제들이다. 그러나 이들 두 가지 항바이러스 제제들은 혈청형 A형 인플루엔자 바이러스에만 효과적이며, M2 단백질이 없는 혈청형 B형 인플루엔자 바이러스에는 효과가 없는 것으로 확인되었다. 또한 아만타딘과 리만타딘은 사용 시 인플루엔자 바이러스 M2 단백의 이온채널기능에 영향을 미치지 못하는 변이 바이러스의 출현이 매우 쉽게 일어나는 단점이 있는 것으로 확인되고 있다. 이러한 단점을 보완하기 위하여 개발된 자나미비르 (zanamivir)와 오셀타미비르 (oseltamivir)는 인플루엔자 바이러스의 뉴라미니다제 (neuraminidase) 단백의 기능을 억제하는 물질로 생체 내 인플루엔자 바이러스의 증식을 억제하는 대표적인 항바이러스 제제들이다. 이들 두 가지 항바이러스제제들은 16종의 모든 혈청형 A형 인플루엔자 바이러스와 혈청형 B형 인플루엔자 바이러스에도 효과적인 것으로 알려져 있다. 그러나 자나미비르는 흡입 및 정맥 투여해야 하는 단점이 있으며, 오셀타미비르는 경구투여가 가능하나 최근 내성 바이러스의 출현 보고와 경구투여 시 구토와 현기증 등의 부작용이 있어 단점으로 지적되고 있다 (Ward P et al., J. antimicrob. Chemother., 55(supp1), ppi5-i21, 2005).

뉴캣슬병 바이러스 (Newcastle disease virus)는 단일가닥 RNA 바이러스로 파라믹소바이러스과 (Paramyxoviridae) 아뷰라바이러스 속 (Avulavirus genus)에 속한다. 뉴캣슬병 바이러스는 외피를 가지고 있으며 외피에는 바이러스가 숙주세포에 결합할 수 있도록 해주는 HN (Haemaglutinin-Neuraminidase) 단백질 및 외피가 숙주 세포와 융합을 일으키도록 하는 F (Fusion) 단백질이 있다. F 단백질과 HN 단백질은 당단백질 (glycoprotein)로서 외피의 표면에 분포되어 있다(Alexander DJ, Disease of poultry, 10th edn, pp541-569, 1997).

뉴캣슬병 (Newcastle disease)은 가금에서 치명적이고 전염성이 강한 제1종 가축전염병으로 백신을 접종하지 않은 닭에 감염될 때는 100% 폐사율을 초래하며, 적절한 백신을 하지 않는 경우 호흡기 및 소화기 증상과 산란계에서 산란율 저하로 경제적인 피해를 일으키는 치명적인 질병이다. 국내의 경우 매년 발생주의보를 방역당국에서 발표하고 있으나 발생이 계속 증가하고 전국적으로 발생되는 추세에 있으며 양계 농가에 큰 피해를 주고 있다. 뉴캣슬병의 주요증상은 처음에는 졸기 시작하여 콧물, 기침 등의 호흡기 증상이 나타나고 녹색설사를 하다 죽는다. 또한, 적절한 백신을 하지 않은 경우 백신항체가가 낮은 산란계나 종계는 산란율이 떨어지거나 중지되기도 하고 예방접종을 했다고 하더라도 접종 시기나 방법이 잘못되어 항체가가 높지 않은 닭에서는 다리와 목이 마비되는 신경증상이 나타나기도 한다 (Song CS et al., Korean J. Vet. Res., 40(3), pp563-573, 2000).

한국은 일본의 연구자들에 의해 1920년대부터 뉴캣슬병 바이러스에 대해 연구를 하였고, 동남아시아 유래의 바이러스가 영국에 전파되어 서양에 처음으로 알려진 후 현재 전 세계적인 발병이 보고되고 있다. 1949, 1982-1984, 1988-1997, 1995-2002년도의 국내 뉴캣슬병 유행기에 분리된 뉴캣슬병 바이러스를 미국, 유럽, 일본, 대만과 중국 등지에서 보고된 뉴캣슬병 바이러스의 유전자와 비교분석한 결과, 한국분리주는 각각 유전자형 III, V, VI, VII 형에 속하는 것으로 확인되었다. 이와 같은 결과는 과거 다섯 번의 한국 뉴캣슬병 유행기에 분리된 바이러스의 유전형이 시대 순으로 차례대로 III, V, VI, VII 형으로 교체되어 왔음을 의미한다고 보고되고 있다. 뉴캣슬병 바이러스 한국분리주 중 유전자형 V형에 속하는 바이러스는 1970년대의 유럽 유행주와 관련성이 있는 반면, 1988년 이후 분리된 유전자형 VI형과 VII형의 바이러스는 일본, 대만, 중국과 같은 극동아시아의 뉴캣슬병 발생과 관련성이 높은 것으로 확인되었다. 따라서 최근에는 극동아시아 유래의 유전자형 VI형과 VII형이 한국분리주의 주류를 이루고 있는 것으로 보고되고 있다 (Lee YJ et al., Avian Pathology, 33(5), pp1-10, 2004).

뉴캣슬병 백신은 크게 생독백신과 사독백신으로 구분된다. 생독백신은 백신주로 사용하는 바이러스의 잔여독력에 따라 크게 중간독주 (mesogenic strain), 약독주 (lentogenic strain), 비병원성주 (apathogenic strain) 등으로 분류 할 수 있다 (Alexander DJ, Disease of poultry, 10th edn, pp541-569, 1997). 약독주중 B1주와 La Sota주 (Clone주 포함)는 국내 뿐 만 아니라 전 세계적으로 가장 널리 사용되어 온 대표적인 뉴캣슬병 생독백신주이며 접종 시 주로 닭의 호흡기도에서 증식되는 특성이 있어 닭의 일령에 따라 정도의 차이는 있지만 일반적으로 백신접종 후 쉽게 감지될 정도의 백신접종반응을 유발하는 것으로 알려져 있다. 최근 생독백신 접종 시 나타나는 백신접종반응을 최소화시키기 위하여 소화기 점막에서 주로 증식되는 호흡기 비병원성 (장친화성) 백신주인 V4주, Ulster 2c주, VG/GA주 및 NDV-6/10주 등을 이용한 각종 생독백신들이 개발되어 있다. 그러나 이들 호흡기 비병원성 백신주들은 접종 시 백신접종반응이 거의 없다는 장점이 있는 반면에 상대적으로 B1주등 약독주들에 비하여 백신접종효능이 다소 떨어지며, 특히 최근 한국에서 유행하고 있는 유전자형 VII형에 속하는 내장성 강독 뉴캣슬병 바이러스의 방어에는 효과적이지 못한 단점이 있는 것으로 평가되고 있다. 뉴캣슬병 생독백신의 문제점은 최근 주로 동절기 육계농장에서 자주 확인이 되며, 특히 2-3회의 생독백신 접종에도 불구하고 뉴캣슬병이 발생하여 지역적으로 유행화되고 있어 문제시 되고 있다 (Song CS et al., Korean J. Vet. Res., 40(3), pp563-573, 2000).

뉴캣슬병 사독백신은 겔백신과 오일백신으로 구분되는데 최근에는 뉴캣슬병, 닭전염성기관지염, 산란저하증 등 3종 이상의 질병을 동시에 예방 할 수 있는 다가혼합 사독오일백신이 개발되어 전 세계적으로 사용되고 있다. 다가혼합 사독오일백신의 개발은 1회 백신접종으로 3종의 이상의 질병이 동시에 예방되어 노동력과 인건비 절감효과가 있으나 산란계 농장의 경우 면역력 저하로 인한 뉴캣슬병 발생 피해사례가 늘어나고 있다. 특히 동절기 산란계 농장의 경우 뉴캣슬병 발생이 지역적으로 유행화되어 산란저하 유발에 따른 경제적 피해를 가중 시키고 있다. 육계와는 달리 수차례의 생독백신과 사독백신을 접종함에도 불구하고, 폐사는 일어나지 않지 만 산란율 저하피해는 매우 심각한 경우가 많은 것으로 보고되고 있다. 다가혼합 사독오일백신은 제조 시 사용되는 항원과 오일의 상대적인 비율이 뉴캣슬병 단미 오일백신에 비하여 뉴캣슬병 바이러스 항원량이 적어 백신의 면역능과 지속능 저하 등의 문제점이 있어 단점으로 지적되고 있다. 따라서 최근 유럽연합에서는 백신 권장접종량의 1/50의 함량을 숙주동물인 닭에 접종하여 생성되는 항체수준을 측정함으로써, 뉴캣슬병 백신의 바이러스 항원함량을 좀 더 정량적으로 평가하는 등 항원함량을 늘이기 위해 노력하고 있다. 또한 사독백신 제조용 뉴캣슬병 백신주가 최근 유행하고 있는 유전자형 VII형 뉴캣슬병 바이러스 유행주를 얼마나 효과적으로 방어할 수 있는가 하는 문제점이 지적되고 있다. 그러나 산란저하까지 완벽하게 막아줄 수 있는 뉴캣슬병 사독백신은 아직까지 전 세계적으로 개발되어 있지 못한 실정이다 (Darrell R. Kapczynski et al., Vaccine, 23, pp3424-3433, 2005).

닭전염성기관지염 (Chicken Infectious Bronchitis: 이하 'CIB'라 함)은 닭전염성기관지염 바이러스 (CIBV)에 의해서 발생되는 닭의 급성 전염병으로서, 국내 뿐 만 아니라 전 세계적으로 양계산업에 많은 경제적 피해를 유발하고 있는 주요 생산성 저하 질병 중의 하나이다. CIBV에 감염된 닭들은 일반적으로 크게 세 가지 병증을 유발한다. 첫째는 어린 병아리에 감염되어 콧물이나 기침 등의 호흡기 증상을 일으키는 병증으로 간혹 2차적인 호흡기 세균감염을 유도하여 높은 이병률과 함께 폐사를 일으키는 경우이다. 두번째는 산란장기에 손상을 주는 병증으로 산란율 저하와 함께 계란의 품질이나 난각질을 저하시킨다. 세번째는 신장에 심한 손상을 주어 많은 폐사를 일으키는 병증이다 (King DJ et al., Disease of poultry, 9th edn, pp471-484, 1991).

CIBV는 코로나바이러스과 코로나바이러스 (Coronaviridae coronavirus)에 속하는 바이러스로, 서로 다른 CIBV 간의 재조합으로 인하여 변이형 바이러스가 생긴다는 사실이 실험적으로 확인되었고, 앞으로도 계속해서 새로운 혈청형의 CIBV들이 출현할 가능성이 있으며, 이들 각 혈청형에서 변이된 변이형 바이러스까지 포함하는 그 종류는 수십 종에 이를 것으로 추정되고 있다. 또한 이들 혈청형 간에는 상호 교차 반응이나 교차 면역이 잘 되지 않기 때문에 변이형 CIBV에 대한 예방에는 많은 어려움이 따르게 된다 (Lambrechts C. et al., Avian Pathology, 22, pp577-599, 1993).

현재까지 전 세계적인 발생을 보이고 있는 CIBV 혈청형으로는 메사추세츠형과 793B 또는 4/91이라 불리우는 변이형 또는 지역별로 유행하고 있는 바이러스라 할 수 있다. 미국의 경우 1950년도부터 메사추세츠형 CIBV가 유행하였고, 1957년도부터는 코네티컷형 CIBV가 유행되었으며, 그 후 알칸사스, 플로리다, 델라웨어, 조오지아 변이주 등 매우 다양한 혈청형의 CIBV가 유행하고 있다. 현재 미국에서는 다양한 혈청형에 광범위한 방어력을 보이는 메사추세츠형 백신을 기본으로 하여 미국 내 각 지역에서 유행하고 있는 코네티컷형과 알칸사스형 백신을 개발하여 병행 사용하고 있다.

영국에서는 UK6/82를 비롯하여 8가지의 혈청형의 CIBV가 분리, 보고된 바 있으며, 1991년 793/B형의 CIBV가 확인되기 이전에는 메사추세츠형 CIBV 백신만이 사용되어져 왔으나 현재는 793/B형 CIBV 백신이 병행 사용되고 있다.

호주의 경우에는 미국이나 서유럽 국가들에서 유행하고 있는 CIBV와는 전혀 다른 새로운 CIBV의 유형이 주류를 이루고 있다. 즉, 혈청형 A (Vac1) ,B (Vic S), C, D, E, F, G, H, I, J, K, L, M, O 등으로 명명되고 있는 CIBV가 유행중이며, 이중 혈청형 A와 B에서 유래된 Vac1 과 Vic S등 2종류의 백신이 사용되고 있다. 호주 유래 CIBV는 바이러스의 S1 유전자 분석자료를 근거로 하여 그룹 I (신장형), 그룹 Ⅱ (호흡기형) 등 두 개의 유전그룹으로 호주 내 유행 CIBV를 구분하고 있다.

국내의 경우에는 1986년도에 최초 CIB 발생 확인보고가 있었으며 피해방지를 위하여 메사추세츠형 CIBV로 제조된 생독 및 사독 오일백신이 사용되기 시작하였다. 그 당시에는 CIBV 감염으로 인한 피해는 호흡기증상 유발 및 기형란을 동반하는 산란저하 피해가 주류를 이루었으며 메사추세츠형 CIB 백신접종으로 야외 CIBV 감염으로 인한 피해를 효과적으로 막을 수 있었다. 그러나 1990년도 이후 메사추세츠형 CIBV 백신을 전국적으로 사용하고 있음에도 불구하고 산란계나 종계의 경우에는 다양한 산란저하 피해사례가 속출되었으며, 육계의 경우에는 육성중인 병아리에서 10% 내 외의 폐사와 함께 심한 신장염 등을 수반하는 변이형 CIBV가 발생되어 현재까지도 피해가 이어지고 있다. 현재 국내에서 유행중인 CIBV는 크게 Korean 1 그룹에 속하는 호흡기형 CIBV와 Korean 2 그룹에 속하는 신장형 CIBV (genotype III)로 대별할 수 있다 (Rhee YO et al., Korean J. Vet. Res., 26, pp277-282, 1986; Song CS et al., Avian Pathology, 27, pp409-416, 1998; Song CS et al., Korean J. Poult. Sci., 27(2), pp91-98, 2000).

전세계적으로 유행하고 있는 CIBV의 혈청형은 수십종 이상으로 추정되고 있으며 혈청형간의 교차방어능은 인정되지 않는 경우도 많지만 그렇다고 매번 새로운 혈청형이 발견될 때마다 동종의 혈청형에 의한 백신을 개발하는 것은 불가능하다고 볼 수 있다. 야외에서 유행하고 있는 CIBV들 중에는 어느 한 종의 혈청형이 다른 여러 혈청형의 CIBV를 완벽하지는 못하지만 상당한 교차방어 효과를 유발하는 것도 있는 것으로 보고되고 있으며, 이렇게 광범위한 교차방어능을 보이는 CIBV 분리주들은 차세대 CIB 백신 개발에 주로 이용되고 있다.

현재 전세계적으로 사용되고 있는 CIB 생독백신은 메사추세츠형 (H120, Ma5)으로 일종의 변이형인 신장형 CIB 감염피해를 완벽하게 막아줄 수는 없지만 반복적으로 분무접종을 실시할 경우 어느정도 효과가 있는 것으로 분석되고 있다. 그러나 최근 한국을 비롯하여 아시아 지역에서 유럽지역으로 변이형 신장형 CIB 감염으로 인한 피해사례가 증가되고 있으며, 특히 변이형 신장형 CIB 감염으로 인한 호흡기와 복막염 발생피해는 전 세계 육계와 산란계 산업에 막대한 경제적 피해를 유발하고 있어 문제시 되고 있다. 비교적 다양한 종류의 CIBV에 광범위한 면역원성이 있는 것으로 알려진 기존의 메사추세츠형 CIB 생독백신도 변이형 신장형 CIBV 감염 시 산란저하 뿐만 아니라 호흡기, 복막염 유발의 문제점이 있어 단점으로 지적되고 있다.

코로나바이러스는 사람에 감염 시 호흡기 증상을 유발하나 증상이 미미하여 사람 감염병으로는 주목 받지 못한 바이러스였다. 그러나 2002년말 중국 남부지방에서 발생한 중증급성호흡기증후군(Severe acute respiratory disease: SARS)가 전 세계적으로 확산되어 많은 인명 피해와 경제적 손실을 가져왔다. 2003년 2월 11일 세계보건기구(WHO) 전염병 감시 및 대응 조직 (CSR, Communicable disease surveillance and response)에서는 "중국 광동성 지방에서 원인이 밝혀지지 않은 중증급성호흡기증후군(SARS: 사스) 발생으로 300명의 환자와 5명의 사망자가 발견되어 중국 보건 당국에서 가검물 채취 및 역학 조사를 시행 중"이라는 내용을 발표하였다.

중국 광동성에서의 발생에 이어 베트남에서도 한명의 초발환자가 중국 상해, 홍콩을 방문한 후 급성호흡기증후군으로 입원 치료를 받던 중 20명의 병원 직원이 유사한 증상을 보임이 확인 되었다. 또한 홍콩의 한 공공병원에서 50명의 병원직원 중 23명이 급성호흡기 증상을 보여 8명이 폐렴 소견으로 입원한 기록이 있다. 사스 코로나 바이러스는 현재까지 사람에서의 재차 감염은 확인되지 않고 있으나 홍콩 소재 동굴에서 서식하는 박쥐에서 사스 코로나바이러스와 유사한 유전 형질의 바이러스가 발견되어 주목받고 있다. 사스 코로나바이러스를 예방할 수 있는 백신은 개발 중이나 아직 상용화되지는 못하고 있으며, 효과적인 치료제 또한 개발 중이나 상용화되지 못한 상태이며, 바이러스의 특성 상 기존의 항바이러스제제에 내성을 갖는 변이주의 출현 가능성이 있어 문제시되고 있다 (Henry LY et al., TRENDS in molecular medicine, 9(8), pp323-325, 2003; Kathryn VH et al., J. Clin. Invest, 111, pp1605-1609, 2003).

뉴모바이러스 (Avian Pneumovirus: 이하 'APV'라 함)는 파라믹소바이러스과 뉴모바이러스에 속하는 단일가닥 RNA 바이러스이다. APV 감염증은 상부호흡기의 카타르성 염증 및 포말성 결막염과 부비강염과 관련하여 유럽에서 타조의 비기관염 (Turkey rhinotracheitis, TRT)으로 알려져 왔다. 상부호흡기도 섬모의 감소와 운동성의 소실 등을 야기하여 이로 인한 기침, 재채기나 두부의 부종 증상을 나타내는 닭에서 두부종창증 (Swollen head syndrome: SHS)을 야기한다 (Cook JKA, The Veterinary Journal, 160, pp118-125, 2000).

뉴모바이러스는 A형과 B형이 주로 닭에서 문제시되며, C형은 주로 칠면조에서 호흡기 질환을 유발한다. 닭에서의 임상증상은 대장균, 마이코플라즈마균, 보데텔라균 등 세균의 이차감염에 의해 심화되며, 상부호흡기도에서 닭전염성기관지염의 증식에 중요한 역할을 한다. 호흡기 질환과 함께 생식기관에 영향을 주어 기형란 및 산란저하를 유발한다. 임상증상이 나타나지 않아도 혈청검사 결과 항체가 검출되어 잠재적인 발병의 원인으로 작용할 수 있으며, 공기를 통한 전파를 통해 쉽게 이환되어 그 위험성이 크다(Cook JKA et al., Avian Pathology, 31, pp117-132, 2002).

최근 인수공통전염병이 사회적 문제로 크게 대두되고 있다. 최근에는 네덜란드에서 메타뉴모바이러스에 속하는 새로운 바이러스가 28 명의 어린이에서 분리되어 사회적으로 큰 주목을 받은바 있다. 이 새로운 바이러스는 사람 뉴모바이러스라고 불리며, 조류의 뉴모바이러스 C 형과 유사한 것으로 보고 되고 있다. 따라서 사람의 바이러스가 조류로, 또는 그 반대의 방식으로 감염이 이루어질 수 있는 가능성에 대한 평가가 이루어져야 된다는 의견이 지배적이다 (Njenga MK et al., Virus Research, 91, pp163-169, 2003).

호흡기 감염에 대한 병원성 기전을 파악하기 위해 기존의 호흡기 친화성 바이러스와 세균 즉, 뉴캣슬병 (Newcastle disease), 전염성후두기관염 (Infectious laryngotracheitis), 계두 (Fowl pox), 마이코플라스마 감염증 (Mycoplasmosis), 파스튜렐라 (Pasteurellosis) 그리고 헤모필러스 감염증 (Hemophilus paragallinarum) 등에 대한 혼합감염의 기병론과 감별 진단에 대한 연구가 실시 되고 있다.

질병 방제를 위한 백신으로 사독오일 백신과 생독 백신이 개발되어 다양한 임상평가가 이루어 지고 있다. 뉴모바이러스 백신은 칠면조와 닭에서의 임상증상과 산란저하 등 생산성 저하방지에는 효과가 인정되고 있으나 뉴모바이러스 혈청형별 백신의 교차방어능에 대한 의문점이 아직 남아 있으며, 특히 백신접종이 뉴모바이러스 감염 자체를 막을 수는 없어 단점으로 지적되고 있다. 사람 뉴모바이러스에 대한 백신과 치료제는 아직 개발되어 상용화되어 있지 시급한 대책 마련이 요구되는 질병이다.

돼지 생식기 호흡기기 증후군 (Porcine reproductive and respiratory syndrome: PPRS)은 아르테리바이러스과 (arteriviridae)의 막이 있는 양성가닥 RNA 바이러스 (enveloped positive-stranded virus)인 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스 (PRRSV)에 의해서 유발된다. 대략 10~15년 전에 두 개의 다른 PRRSV 주 (strain)가 명백히 독립적으로 미국과 유럽에서 출현하였고, 현재 이 질병은 북미, 유럽 및 아시아의 많은 돼지 생산 국가에서 돼지의 생식능력 감소 및 호흡기 질환을 유발하고 있으며, 미국에서 감염의 유행은 70%에 이르는 것으로 추정된다 (Snijder EJ and Meulenberg JJ, J. Gen. Virol., 79, pp961-979, 1998). PRRSV는 호흡, 성취, 물린상처 또는 주사바늘에 의해서 감염되며, 점막, 폐 또는 국소부위 의 대식세포의 체액, 혈액, 배설물, 소변 및 정액을 통해서 바이러스를 체외로 배출한다. 암퇘지에서의 임상학적 증상은 유산 또는 약하게 태어나는 돼지의 조산성 분만, 사산 돼지 및 자기 분해된 태아와 관련 있다. PRRSV는 전 세계적으로 발생하고 있으며, 축산산업에 있어 막대한 경제적 손실을 주고 있으나 적절한 대처방안이 없어 대책마련이 시급히 요구되고 있다 (Hampl H et al., J. Virol., 52, pp583-590, 1984).

PRRS는 양돈을 하는 대부분의 국가에서 발생하는 것으로 알려져 있으며, 이 질병이 처음 발생할 당시인 1989년에는 번식 및 분만시 손실이 가장 뚜렷했으나 상재화되면서 돼지호흡기복합감염증 또는 이유후전신소모성증후군을 유도하는 요인으로서도 매우 중요하게 인식되고 있다. PRRSV는 준임상형감염, 돈군 내 지속적 바이러스의 순환, 감수성 번식돈군의 계속적 유입, 변이주의 출현 등이 이 바이러스에 의한 피해예방을 어렵게 한다 (Goyal SM et al., J. Vet. Diagn. Invest., 5, pp656-664, 1993).

국내에서는 1993년 PRRSV가 분리되었으나 혈청학적인 검사결과에 따르면 1980년대 중반에 양돈업의 급성장과 함께 미국 등지로부터 수입된 PRRS 감염 종돈에 의해 국내에 유입되었을 것으로 추정되고 있다 (Kang JY et al., Korean J. Vet. Res., 39(2), pp294-300, 1999). 그 당시국내에서는 PRRS에 대한 이해가 부족해서 초동방역이 제대로 이루어지지 않아 감염종돈의 보급에 따라 질병이 쉽게 전국으로 확산되었을 것으로 추정되고 있다. PRRS는 바이러스 감염 시 지속감염되며, 동일한 농장에서도 유전적으로 혈청학적 형질이 다른 바이러스가 공존할 수 있으 며, 수직-수평으로 바이러스가 전파하므로 돈군의 집단 면역을 안정적으로 지속시키기가 매우 어려운 것으로 보고되고 있다. 또한 현재 접종하고 있는 백신은 장기간 보호면역을 지속시키지 못하며, 정액이나 분뇨 등을 통한 바이러스 배출도 감소시키지 못하므로 백신에 의존한 질병방어는 확신할 수 없는 문제점이 있어 단점으로 지적되고 있다 (Kwon CH et al., Korean J. Vet. Res., 34, pp77-83, 1994).

RNA 바이러스 가운데에서도 비교적 크기가 작은 바이러스들이 있다. 이들은 작다는 뜻의 pico'라는 말과 RNA를 합쳐 피코나바이러스라고 부르며, 여기에 속한 바이러스들을 통틀어 피코나바이러스과 (Piconaviridae)라고 부른다. 피코나바이러스과에 속하는 엔테로바이러스는 무균성 수막염, 수족구병, 포진성 구협염, 확장성 심근염, 급성 출열성 결막염 등의 다양한 임상증상을 일으키는 약 70가지 혈청형을 포함하고 있으며, 폴리오바이러스 (Poliovirus), 콕사키바이러스 (Cossackievirus) 및 에코바이러스 (Echovirus)와 기타 엔테로바이러스로 분류된다. 엔테로바이러스는 바이러스 입자의 직경이 20~30 나노미터 정도인 외가닥 RNA 바이러스이며, 콕사키바이러스 (Coxsackievirus, CXV)는 피코나바이러스과에 속하는 사람 엔테로바이러스 (human enterovirus)로서 크게 A형 (A type)과 B형 (B type)으로 구분된다 (Pallansch MA and Roos RP, Fields Virology, 4th edi, pp723-775, 2001).

또한 최근 세계 곳곳에서 고위험성 엔테로바이러스 및 변종 바이러스 (엔테로바이러스 71형, 콕사키바이러스 A24 변이주)가 새롭게 발견되어 유행되고 있어 이를 조기에 탐지하기 위한 국가 간 공동감시체계 구축이 요구되고 있다. 실제로 국내에서 2000년 엔테로바이러스 71형, 무균성 수막염이 크게 유행한 2002년에는 에코바이러스 13형, 전국적으로 급성출혈성 결막염이 폭발적으로 유행했던 2002년과 2003년에는 콕사키바이러스 A24형 변이주가 유행했음을 확인하고 이에 대한 대국민 홍보를 실시한 바 있다.

콕사키바이러스를 포함하는 엔테로바이러스는 척추동물의 소화기관을 비롯하여 호흡기관 및 중추신경계에까지 감염되어 다양한 임상증상을 유발하기 때문에 국가 차원의 대책 마련이 시급히 요구되고 있으나 바이러스의 종류와 혈청형이 매우 다양하여 효과적인 상용화 백신이나 치료제가 개발되어 있지 못한 실정이다.

세망내피증 바이러스 (reticuloendotheliosis virus: RE)는 레트로바이러스과 (retroviridae)에 속하는 RNA 바이러스로서 주로 칠면조, 닭, 오리 등에서 발생하며 꿩과 메추리에서도 일부 발생된다. RE 바이러스 (REV)는 조류 백혈병/육종 바이러스 (avian leukosis/sarcoma virus)와 마찬가지로 RNA 의존성 역전사 효소 (reverse transcriptase)를 가지지만 항원적으로나 형태학적으로는 차이가 있다. REV에는 칠면조에서 분리된 T주 (strain T), 닭에서 분리된 닭 합포체 바이러스 (chicken syncytial virus: CSV), 오리에서 분리된 비장괴사증 바이러스 (spleen necrosis virus: SNV) 및 오리 전염성 빈혈 바이러스 (duck infectious anemia virus: DIAV) 등이 있으나 중화시험으로는 바이러스간의 차이점을 없는 것으로 알려져 있다. 이중 T주는 급성 종양을 유발할 수 있는 종양 유전자 (v-rel)를 갖고 있으나 스스로는 증식할 수 없는 증식결손바이러스 (replication defective virus: re-REV)와 종양 유전자는 가지고 있지 않으나 re-REV의 증식을 돕는 T주 헬퍼 바이러스 (REV associated helper virus: REV-A)로 구성되어 있다 (Witter RL and Fadly AM, Disease of poultry, 10th edn, pp517-536, 1997).

세망내피증은 닭에서 선위염, 깃털의 이상, 증체율의 저하 및 면역저하를 나타내는 왜소병 증후군 (runting disease syndrome)이 나타나기도 하며 종양이나 백혈병 종양과 유사한 만성종양을 유발하기도 한다. 또한 REV에 감염된 닭들은 면역능력의 저하로 전염성후두기관염, 계두, 콕시듐증 및 살모넬라 등의 질병 감염에 대한 저항성이 크게 감소하며 마렉병이나 뉴캣슬병 등의 백신 면역이 저하되는 것으로 보고되고 있다. 닭에서의 세망내피증의 전파는 감염계로부터 동거계로의 수평감염도 쉽게 일어나지만 이 경우에는 질병으로 인한 피해가 나타나지 않는 경우가 대부분이며 질병으로 인한 피해는 감염된 모계로부터 후대 병아리에게로 수직 감염되거나 조기 감염될 경우에만 나타난다 (Theilen GH et al., Journal of the National Cancer Institute, 37, pp731-743, 1966).

REV는 1본쇄 RNA로 되어 있으나 RNA 의존성 DNA 중합효소를 가지고 있어서 증식 중에는 2본쇄 DNA로 될 수 있으며 이러한 2본쇄 DNA는 세포의 염색체 DNA에 삽입되어 프로바이러스 (provirus) 형태로 존재할 수 있다 (Fritsch E et al., Virology, 83, pp313-321, 1977). 이러한 REV의 감염 시 숙주 게놈에 유전자 형태로 남는 특성으로 인하여 세망내피증에 대한 생독백신은 개발 및 사용이 불가한 실정이며 사독백신 또한 바이러스의 중화항체를 생산하는 당단백 85 (glycoprotein 85: gp85)가 매우 불안정하여 백신 제조가 불가한 실정이다.

오제스키병 바이러스 (aujeszky's disease virus: ADV) 허피스바이러스과 (herpesviridae)의 알파 허피스 바이러스 (alpha herpesvirus subfamily)에 속하는 DNA 바이러스로서 돼지를 자연숙주로 소, 개, 고양이, 토끼, 밍크, 마우스, 랫트, 기니픽 그리고 조류 까지 광범위한 숙주 영역을 갖는 바이러스 이다 (Thowley DG et al., J. AM.Vet. Med. Assoc., 176, pp1001-1003, 1980). 오제스키병은 가성광견병 (psedorabies)이라고도 하며, ADV로 인한 돼지질병은 타 질병에서 나타나는 특징적인 가려움증은 나타내지 않고 성돈의 심한 호흡기 증상과 성장저하 및 임신돈에서의 유사산 등 번식장애, 자돈의 높은 폐사율 등 양돈산업에 많은 경제적 피해를 유발하고 있다 (Lee JB et al., Korean J. Vet. Res., 28(1), pp99-103, 1988).

오제스키병 감염으로 인한 경제적 손실을 줄이기 위하여 백신접종을 실시하고 있으나 감염 시 임상증상은 나타나지 않으나 감염 자체는 막아주지 못하며 잠복감염이 성립되게 되어 ADV의 근절에는 효과적이지 못한 단점이 있다. 따라서 야외 ADV 감염돈과 백신접종돈을 구별하기 위하여 유전자 결손 백신의 개발과 아울러 야외 ADV 감염을 감별진단 할 수 있는 항체검사킷트가 개발되어 사용되고 있으나 잠복감염에 의한 질병의 전파와 근절은 여전히 풀지 못한 숙제로 남아 있다.

아데노바이러스는 아데노바이러스과 (Adenoviridae)에 속하는 DNA 바이러스로서 소아 및 면역기능이 저하된 환자에서 다양한 호흡기 감염증과 위장관염을 주로 일으키며, 유행성 각결막염 (Epidemic keratoconjunctivitis), 출혈성 방광염 (Hemorrhagic cystitis) 및 뇌막염 (Meningitis) 등 다양한 질환을 야기하는 바이러스이다 (Ruuskanen O et al., Clinical Virology, pp525-548, 1997). 아데노바이러스 감염은 감염된 사람의 분비물이 비말, 오염된 물건과의 접촉 등에 의해 전파 되며, 아데노바이러스 감염에 의한 사망은 물론 특정한 혈청형에 의한 감염이나 면역기능이 저하된 환자에서는 사망까지 초래할 수도 있는 것으로 알려져 있다.

아데노바이러스에 의해 야기되는 호흡기 질환에는 발열성 급성인두염 (Acute pharyngitis), 급성호흡기질환 (Acute respiratory disease: ARD) 및 폐렴 (Peumonia) 등이 있으며, 아데노바이러스 감염환자 중 4-18%는 폐렴의 형태로 나타나고 상기도 감염, 인후두염 및 후두염 등 다양한 감염양상을 나타내는 것으로 알려져 있다. 아데노바이러스의 호흡기 감염에 따른 폐 손상은 종종 매우 심각한 문제를 일으키기도 하는데, 폐렴환자의 경우 60-65%, 상기도감염 환자의 경우 10%가 폐쇄성 기관지염, 기관지 확장증 및 McLoed 증후군 등의 합병증을 포함한 다양한 폐손상을 유발하는 것으로 알려져 있다 (Gold R et al., J. Can. Assoc. Radiol., 20, pp218-224, 1969).

아데노바이러스 감염의 발생양상은 늦겨울, 봄, 초여름에 걸쳐 발생빈도가 높지만 연중 산발적으로 발생하며 (Ahn KM et al., Korean Med. Sci., 14, pp405-411, 1999), 대부분 영유아나 어린이, 노인 및 면역기능이 저하된 환자에게서 주로 나타나는 것으로 알려져 있으나 학교, 병원, 군대, 탁아소 등 집단시설에서 환자발생이 유행성으로 나타날 수도 있다 (Esteban RE et al., Rev. Clin . Esp ., 196, pp82-86, 1996).

호흡기 질환을 유발하는 인플루엔자 등 다른 바이러스의 경우에는 비교적 효과적인 다양한 백신이나 치료제가 개발되어 사용되고 있는데 반해 아데노바이러스에 대한 효과적인 백신은 아직 개발되어 있지 않은 상태이며, 치료법 또한 확립되 지 않은 상태이기 때문에 발열 시 적절한 수분 공급과 안정, 해열제 복용 등의 대증적인 (Symptomatic) 요법 이외에는 특별한 치료법이 없는 실정이다.

맨드라미는 일반적으로 화단용 또는 분화용으로 많이 이용되는 화종으로 미국, 아시아, 아프리카 등의 열대 및 아열대지역 원산으로 60 여종 정도가 알려져 있다. 많이 재배되고 이용되는 맨드라미의 품종은 흔히 닭 벼슬 모양 또는 둥근 모양의 Celosia cristata 종, 깃털 맨드라미라고 하는 Celosia plumosa 종, 우리나라에서 널리 분포하며 개맨드라미라고 불리는 Celosia argentea 종 그리고 이들의 교잡종들이 있다. 국내 자생 개맨드라미는 제주 및 남부지방을 위시하여 경기도 등 중부지방에도 일부 분포한다. 국내 자생 개맨드라미는 약용효과로도 그 이용가치가 커서 경엽 (莖葉) 및 근 (根)은 청상, 종자를 청상자 (靑箱子)라고 하고, 화서 (花序)는 청상화라하여 한약재로 많이 사용되고 있다. 맨드라미 추출물에는 10% 정도의 수산 (蓚酸) 성분이 함유되어 있으며, 종자는 8-10월에 채취하는데 지방유 (脂肪油)와 풍부한 황산칼륨과 니코틴산이 함유되어 있다(Lee CB, Illustrated flora of Korea, 향문사, 서울, p321, 1999).

그러나 상기 문헌 어디에도 맨드라미의 항바이러스효과에 관한 교시나 개시된 바가 없다.

이에, 본 발명자들은 상기 바이러스의 감염으로 인한 피해를 최소화 하고, 기존의 생독백신의 단점을 극복하고 이를 대체할 수 있는 안전하고 효과가 우수한 차세대 천연물 살바이러스제를 개발하기 위한 연구를 수행한 결과, 본 발명의 맨드라미추출물이 탁월한 바이러스 증식 억제 효과 및 살바이러스 효과를 가짐을 확인 함으로써, 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 탁월한 항바이러스 효과를 지닌 맨드라미 추출물을 유효성분으로 함유한 바이러스로 인한 인간 질환의 예방 및 치료에 유용한 약학조성물 및 건강기능식품을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 맨드라미 추출물을 유효성분으로 함유하는 바이러스로 인한 질환의 예방 및 치료용 약학 조성물을 제공한다.

본원에서 정의되는 추출물은 조추출물 또는 비극성용매 가용 추출물을 포함하며, 조추출물은 물, C₁ 내지 C₄의 저급알콜 또는 이들의 혼합용매로부터 선택되어진 극성용매, 바람직하게는 50 내지 70 % 물 및 C₁ 내지 C₄의 저급알콜의 혼합용매, 보다 바람직하게는 60 % 에탄올에 가용한 추출물을 포함하고, 비극성용매 가용추출물은 디클로로메탄, 클로로포름 또는 에틸 아세테이트로부터 선택된 비극성용매로, 바람직하게는 디클로로메탄에 가용한 추출물을 포함한다.

본원에서 정의되는 맨드라미는 개맨드라미 (Celosia argentea), 깃털맨드라미 (Celosia plumosa), 또는 둥근맨드라미 (Celosia cristata)를 포함한다.

본원에서 정의되는 바이러스는 RNA형 바이러스 또는 DNA형 바이러스를 포함 한다.

본원에서 정의되는 RNA형 바이러스는 인플루엔자 바이러스 (influenza virus), 뉴캣슬병 바이러스 (newcastle disease virus), 닭 전염성 기관지염 바이러스 (Chicken infectious broncheitis virus), 조류 폐렴바이러스 (avian pneumovirus) , 돼지 생식기 및 호흡 증후군 바이러스 (porcine reproductive and respiratory syndrome virus), 콕사키 바이러스 (coxsakie virus) 또는 세망내피증 바이러스 (reticuloendotheliosis virus)를 포함한다.

본원에서 정의되는 인플루엔자 바이러스는 H1N1, H9N2 또는 H6N5의 혈청형을 가짐을 특징으로 한다.

본원에서 정의되는 DNA형 바이러스는 오제스키병 바이러스 (aujeszky's disease virus) 및 아데노 바이러스 (adeno virus)를 포함한다.

본원에서 정의되는 바이러스로 인한 질환은 인플루엔자 바이러스를 포함하는 오르소믹소바이러스과 (orthomyxovirus family) 바이러스, 뉴캣슬병 바이러스 (newcastle disease virus)를 포함하는 파라믹소 바이러스과 (paramyxovirus family) 바이러스, 닭 전염성 기관지염 바이러스 (Chicken infectious broncheitis virus)를 포함하는 코로나 바이러스과 (coronavirus famil) 바이러스, 콕사키 바이러스 (coxsakie virus)를 포함하는 피코나 바이러스과 (picorna virus family) 바이러스, 세망내피증 바이러스 (reticuloendotheliosis virus)를 포함하는 레트로 바이러스과 (retrovirus family) 바이러스, 오제스키병 바이러스 (aujeszky's disease virus)를 포함하는 허피스 바이러스과 (herpesvirus family) 바이러스 또는 아데노 바이러스 (adeno virus)를 포함하는 아데노 바이러스과 (adenovirus famoly) 바이러스의 체내 감염으로 인해 유발됨을 특징으로 한다.

본원에서 정의되는 오르소믹소 바이러스과 (orthomyxo virus family) 바이러스의 체내 감염으로 인해 유발되는 질환은 독감, 감기, 조류독감 또는 변이형 감염성 조류독감을 포함한다.

본원에서 정의되는 파라믹소 바이러스과 (paramyxo virus family) 바이러스의 체내 감염으로 인해 유발되는 질환은 파라인플루엔자(Parainfluenza) 감염증, 유행성이하선염(Mumps), 홍역(Measles), 니파바이러스(Nipah virus)감염증, 헨드라바이러스(Hendra virus)감염증, 사람 알에스바이러스 (Respiratory syncytial virus)감염증 또는 사람 메타뉴모바이러스 (Human metapneumovirus)감염증을 포함한다.

본원에서 정의되는 코로나 바이러스과 (coronavirus family) 바이러스의 체내 감염으로 인해 유발되는 질환은 사람 호흡기 코로나 바이러스 (HCoV-229E)감염증, 중증급성호흡기증후군(Severe Acute Respiratory Syndrome: SARS) 또는 사람 호흡기 코로나 바이러스(HCoV-OC43)감염증을 포함한다.

본원에서 정의되는 피코나 바이러스과 (picornavirus family) 바이러스의 체내 감염으로 인해 유발되는 질환은 뇌심근염바이러스 (Encephalomyocarditis virus)감염증, 폴리오바이러스 (Poliovirus)감염증, 콕사키바이러스 (Coxsackievirus)감염증, 에코바이러스 (Echovirus)감염증, 라이노바이러스 (Rhinovirus)감염증, 파레코 바이러스 (Parecovirus)감염증 또는 A형 간염 바이러스 (Hepatitis A virus)감염증를 포함한다.

본원에서 정의되는 레트로 바이러스과 (retrovirus family) 바이러스의 체내 감염으로 인해 유발되는 질환은 사람 면역결핍 바이러스 1형 및 2형 (human immunodeficiency virus type 1 & 2)또는 사람 포미바이러스 (human foamy virus)감염증를 포함한다.

본원에서 정의되는 허피스 바이러스과 (herpesvirus family) 바이러스의 체내 감염으로 인해 유발되는 질환은 사람 단순포진 바이러스 (human herpes simplex virus)감염증, 엡스타인바 바이러스 (epstein-barr virus)감염증, 사이토메갈로 바이러스 (cytomegalovirus)감염증, 베리셀라조스터 바이러스 (varicella-zoster virus)감염증, 사람 허피스 바이러스 6, 6A, 6B, 7형 (human herpesvirus 6, 6A, 6B, 7)감염증, 카포시 육종 바이러스(kaposi's sarcomavirus) 감염증 또는 세르코피테신 허피스 바이러스 (cercopithecine herpesvirus)감염증을 포함한다.

본원에서 정의되는 아데노 바이러스과 (adeno virus family) 바이러스의 체내 감염으로 인해 유발되는 질환은 사람 호흡기 감염증, 사람 위장관염, 사람 유행성 각결막염 (Human Epidemic keratoconjunctivitis), 출혈성 방광염 (Hemorrhagic cystitis)또는 뇌막염 (Meningitis)을 유발하는 사람 아데노 바이러스 감염증을 포함한다.

또한, 본 발명은 맨드라미 추출물 및 식품학적으로 첨가 가능한 식품보조첨가제를 함유하는 바이러스로 인한 질환의 예방 및 개선용 건강기능식품을 제공한다.

본 발명의 맨드라미 추출물을 유효성분으로 함유하는 바이러스로 인한 질환의 예방 및 치료용 약학 조성물은, 조성물 총 중량에 대하여 상기 추출물을 0.1 ~ 50 중량% 포함한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명의 맨드라미 추출물은 하기와 같이 수득될 수 있다.

본 발명의 맨드라미를 채집하여, 물로 수세 후 음건한 후 잘게 마쇄하여 맨드라미 시료 중량의 약 1 내지 30배, 바람직하게는 약 1 내지 15배에 달하는 부피의 물, 에탄올 및 메탄올 등과 같은 C₁ 내지 C₄의 저급알콜의 극성 용매 또는 이들의 약 1: 0.1 내지 1: 10의 혼합비를 갖는 혼합용매로, 바람직하게는 30 내지 100 %의 에탄올로 약 10 ℃ 내지 100 ℃에서 약 1시간 내지 1일, 바람직하게는 5시간 내지 20시간 동안 열수 추출, 환류 순환 추출 또는 가압추출, 초음파 추출 등의 추출방법을 사용하여, 바람직하게는 열수 추출 또는 환류 순환 추출하여 감압여과, 원심분리한 후 저급 알콜의 극성용매 또는 혼합용매로 추출한 상층액은 건열멸균기에 넣고 50- 150 ℃, 바람직하게는 60- 130 ℃에서 건조한 후 증류수에 정용한 후 동결건조하여 맨드라미 추출물을 수득할 수 있다.

또한, 맨드라미를 채집하여, 물로 수세 후 음건한 후 잘게 마쇄하여 맨드라미 시료 중량의 약 1 내지 30배, 바람직하게는 약 1 내지 15배에 달하는 부피의 물, 에탄올 및 메탄올 등과 같은 C₁ 내지 C₄의 저급알콜의 극성 용매 또는 이들의 약 1: 0.1 내지 1: 10의 혼합비를 갖는 혼합용매로, 바람직하게는 30 내지 100 %의 에탄올로 약 10 ℃ 내지 100 ℃에서 약 1시간 내지 1일, 바람직하게는 5시간 내지 20 시간 동안 열수 추출, 환류 순환 추출 또는 가압추출, 초음파 추출 등의 추출방법을 사용하여, 바람직하게는 열수 추출 또는 환류 순환 추출하여 감압여과, 원심분리한 후 상층액을 취하여 감압하에서 증발건조하여 수득한 맨드라미 조추출물을 물에 현탁한 후, 디클로로메탄, 에틸아세테이트, n-부탄올 순으로 용매를 이용하여 추출하여 본 발명의 맨드라미 비극성용매 가용추출물, 바람직하게는 에틸아세테이트 가용성 분획물을 수득할 수 있고, 더욱 구체적으로는 맨드라미 60 % 에탄올 추출물에 동량의 디클로로메탄:물:메탄올을 일정 비율, 바람직하게는 10:9:1로 혼합하여 디클로로메탄 분획물 및 수가용성 분획물을 수득할 수 있고, 다시 상기 수가용성 분획물에 동량의 에틸아세테이트를 가하여 에틸아세테이트 가용성 분획물 및 수가용성 분획물을 수득할 수 있고, 마지막으로 상기 수가용성 분획물을 동량의 부탄올로 추출하여 부탄올 가용성 분획물과 수가용성 분획물을 수득할 수 있다.

본 발명은 상기의 제조공정으로 얻어진 맨드라미 추출물을 유효성분으로 함유하는 바이러스로 인한 질환의 예방 및 치료용 약학 조성물을 제공한다.

본 발명에 따른 맨드라미 추출물은 맨드라미의 종류와는 상관없이 일정한 항바이러스 효과를 나타내었으며, 추출용매에 따른 항바이러스 효과는 극성용매 추출물 중에서는 60% 에탄올 추출물이, 비극성 용매 가용성 추출물 중에서는 디클로로메탄 추출물의 항바이러스 효과가 탁월하였다.

또한, 본 발명에 따른 맨드라미 극성용매 가용성 추출물을 인플루엔자 A 바이러스 (influenza A viruses), 뉴캣슬병 바이러스 (newcastle disease virus), 닭 전염성기관지염 바이러스 (infectious broncheitis virus), 조류 뉴모 바이러스 (avian pneumovirus), 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스 (porcine reproductive and respiratory syndrome virus), 콕사키 바이러스 (coxsakie virus), 세망내피증 바이러스 (reticuloendotheliosis virus), 오제스키병 바이러스 (aujeszky's disease virus) 및 아데노 바이러스 (adeno virus)가 감염된 MDCK세포, 계태아세포, MARK-145 세포, Hep-2 세포 및 SPF 종란를 이용한 시험관 내 (in vitro) 항바이러스 효능시험에 처리하였을 때 살바이러스효과가 탁월하였으며, 맨드라미 비극성용매 가용성 추출물을 인플루엔자 A 바이러스 및 뉴캣슬병 바이러스가 감염된 MDCK 세포 및 계태아 섬유아세포 를 이용한 시험관 내 (in vitro) 항바이러스 효능시험에 처리하였을 때 살바이러스효과가 탁월하였고, 또한 인플루엔자 A 바이러스가 감염된 마우스에 대하여 본 발명의 맨드라미 추출물의 위관 투여에 따른 치료효과가 탁월함을 확인할 수 있었다.

본 발명의 맨드라미 추출물은 독성 및 부작용이 거의 없으므로 예방 목적으로 장기간 투여 시에도 안심하고 사용할 수 있다.

본 발명의 맨드라미 추출물을 포함하는 약학 조성물은 통상의 방법에 따른 적절한 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다.

본 발명의 맨드라미 추출물을 포함하는 약학조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리쓰리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레 이트 및 광물유를 들 수 있다.

본 발명에 따른 맨드라미 추출물을 포함하는 약학조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다.

본 발명의 맨드라미 추출물의 사용량은 환자의 나이, 성별, 체중에 따라 달라질 수 있으나, 0.1 내지 100 mg/㎏의 양을 1일 1회 내지 수회 투여할 수 있다. 또한 그 솔잎 추출물의 투여량은 투여경로, 질병의 정도, 성별, 체중, 나이 등에 따라서 증감될 수 있다. 따라서, 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

또한, 본 발명은 상기 공정에서 얻어지는 맨드라미 추출물을 유효성분으로 함유하는 바이러스로 인한 질환의 예방 및 개선용 건강기능식품을 제공한다.

본원에서 정의되는 "건강기능식품"은 건강기능식품에 관한 법률 제6727호에 따른 인체에 유용한 기능성을 가진 원료나 성분을 사용하여 제조 및 가공한 식품을 의미하며, "기능성"이라 함은 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하거나 생리학적 작용 등과 같은 보건 용도에 유용한 효과를 얻을 목적으로 섭취하는 것을 의미한다.

본 발명의 바이러스로 인한 질환의 예방 및 개선을 위한 건강기능식품은, 조성물 총 중량에 대하여 상기 추출물을 0.01 내지 95 %, 바람직하게는 1 내지 80 % 중량백분율로 포함한다.

또한, 바이러스로 인한 질환의 예방 및 개선을 위한 목적으로 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 환제, 현탁액, 에멀젼, 시럽 등의 약학투여형태 또는 건강음료 등의 형태인 건강기능식품으로 제조 및 가공이 가능하다.

본 발명의 건강 기능성 음료 조성물은 지시된 비율로 필수 성분으로서 상기 추출물을 함유하는 외에는 다른 성분에는 특별한 제한이 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상술한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제 (타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진등) 및 합성 향미제( 사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100 ㎖당 일반적으로 약 1~ 20 g, 바람직하게는 약 5~ 12 g이다.

상기 외에 본 발명의 조성물은 여러가지 영양제, 비타민, 광물 (전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제 (치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그밖에 본 발명의 조성물들은 천연 과일 쥬스 및 과일 쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 그렇게 중요하진 않지만 본 발명의 조성물 100 중량부 당 0 내지 약 20 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적 이다.

이하, 본 발명을 하기의 참고예, 실시예 및 실험예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 참고예, 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 참고예, 실시예 및 실험예에 의해 한정되는 것은 아니다.

참고예 1. 맨드라미 분말 수득

전라북도 전주 야산에서 자생하는 (1)개맨드라미 (Celosia argentea), (2)깃털맨드라미 (Celosia cristata) 및 (3)둥근맨드라미 (Celosia plumosa)하여 물로 수세 후 표면의 물기를 제거하고 음건한 후 분쇄기 (ball mill, 정신기업사, 한국)로 미세하게 분쇄하여 건조 분말화 하였다.

참고예 2. RNA 바이러스 준비

RNA 바이러스로는 인플루엔자 A 바이러스 (Influencza A virus), 뉴캣슬병 바이러스 (Newcastle disease virus), 닭 전염성 기관지염 바이러스 (Infectious broncheitis virus), 조류독감 바이러스 (Avian pneumovirus), 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스 (Porcine reproductive and respiratory syndrome virus), 콕사키 바이러스 (Coxsakie virus: CXV), 세망내피증 바이러스 (reticuloendotheliosis virus)를 준비하였다.

2-1. 인플루엔자 A 바이러스 (Influencza A virus)

2-1-1. A/PR/8/34 (H1N1)

공시 바이러스인 인플루엔자 바이러스 A/PR/8/34 (H1N1)는 북해도대학에서 분양받았으며, in vitro 및 in vivo 실험을 위하여 10일령 SPF 종란에서 48시간 증식하여 -80 ℃에 보관하면서 사용하였다.

2-1-2. A/HS/MS96/96 (H9N2-2)

국내 분리주인 A/HS/MS96/96는 국립수의과학검역원에서 분양받았으며, in vitro 및 in vivo 실험을 위하여 10일령 SPF 종란에서 48시간 증식하여 -80 ℃에 보관하면서 사용하였다.

2-2. 뉴캣슬병 바이러스 (Newcastle disease virus: NDV)

국내 분리주인 Kr-005/00 및 교정원 주 (KJW strain)는 국립수의과학검역원에서 분양받았으며, in vitro 및 in vivo 실험을 위하여 10일령 SPF 종란에서 48시간 증식하여 -80 ℃에 보관하면서 사용하였다.

2-3. 전염성 기관지염 바이러스 (Infectious broncheitis virus: IBV)

M41주는 국립수의과학검역원에서 분양받았으며, in vitro 실험을 위하여 10일령 SPF 종란에서 48시간 증식하여 -80 ℃에 보관하면서 사용하였다.

2-4. 뉴모 바이러스 (Avian pneumovirus: APV)

뉴모 바이러스 A형 (APV A type) 생독백신인 Poulvac® SHS vaccine (Fort Dodge Animal Health, UK)를 사용하였다.

2-5. 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스 (Porcine reproductive and respiratory syndrome virus: PRRSV)

돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스 생독백신인 Ingelvac® PRRS의 모바이러스주 (ATCC VR-2332)를 국립수의과학검역원에서 분양받았으며 MARK-145 세포에서 증식하여 -80 ℃ 보관하면서 사용하였다.

2-6. 콕사키 바이러스 (Coxsakie virus: CXV)

콕사키 바이러스는 국립보건연구원에서 분양받았으며, Hep-2 세포에서 증식하여 -80 ℃ 보관하면서 사용하였다.

2-7. 세망내피증 바이러스 (reticuloendotheliosis virus: REV)

세망내피증 바이러스는 닭 합포체 바이러스 (chicken syncytial virus: CSV)를 ATCC에서 분양받았으며, 계태아섬유아세포에서 증식하여 -80 ℃ 보관하면서 사용하였다.

참고예 3. DNA 바이러스 준비

DNA 바이러스로는 오제스키 바이러스 (aujeszky's disease virus), 아데노바이러스 (Adeno virus)를 준비하였다.

3-1. 오제스키 바이러스 (aujeszky's disease virus: ADV)

오제스키 바이러스는 국립수의과학검역원에서 분양받았으며, MDCK 세포에서 증식하여 -80 ℃ 보관하면서 사용하였다.

3-2. 아데노 바이러스 (Adeno virus :ADV)

아데노 바이러스는 국립보건연구원에서 분양받았으며, Hep-2 세포에서 증식하여 -80 ℃ 보관하면서 사용하였다.

참고예 4. 세포배양

4-1. MDCK (Madin Darby Canine Kidney) 세포

MDCK 세포는 ATCC(American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA)에서 구입하였으며, 10 % 우태아혈청 (fetal bovine serum, Gibco, USA)을 첨가한 이글 엠이엠 (Eagle's minimum essential medium: EMEM) 배지를 사용하여, 37℃ 및 5% CO₂ 배양조건에서 세포를 유지하였다. 항바이러스 효능 스크리닝 시에는 트립신 5 ㎍/㎖, 0.22 % 중조 (NaHCO₃), 겐타마이신 (gentamycin) 40 ㎍/㎖를 MEM 배지에 첨가하여 사용하였다.

4-2. Hep-2 세포

Hep-2 세포는 한국화학연구소에서 분양 받았으며 5% 우태아혈청 (fetal bovine serum, Gibco, USA)을 첨가한 엠이엠 (Minimum essential medium: MEM) 배지를 사용하여, 37℃ 및 5% CO₂ 배양조건에서 세포를 유지하였다.

4-3. 계태아 섬유아세포 (Chicken embryo fibroblast cell)

10일령 SPF 계태아 (chicken embryo)의 내부장기를 무균적으로 제거한 뒤 트립신으로 소화하여 10% TPB (Tryptose phosphate broth), 8% 송아지혈청 (Calf serum, Gibco, USA)이 함유된 M199 배지(5%) + HAM's F10배지(5%) (Gibco, USA)를 사용하여, 37℃ 및 5% CO₂ 배양조건에서 세포를 유지하였다.

4-4. MARK-145 세포

MARK-145 세포는 국립수의과학검역원에서 분양 받았으며 5% 우태아혈청 (fetal bovine serum, Gibco, USA)을 첨가한 엠이엠 (Minimum essential medium: MEM) 배지를 사용하여, 37℃ 및 5% CO₂ 배양조건에서 세포를 유지하였다.

참고예 4. 시험관내 바이러스 소독효능 시험 (Quantitative suspension test with viruses)

바이러스 소독효능 시험은 국립수의과학검역원 예규 제30호(2003.1.27) 소독제 효력시험 지침에 의거 수행되었다. 시료의 시험관내 살바이러스 효능 (Virucidal activity)을 시험하기 위하여 시료를 증류수로 100배 희석한 것을 기준으로 하여 1000배, 2000배, 4000배, 8000배, 16000배, 32000배 희석하였다. 4 ℃ 상태의 시료 희석액 2.5 ㎖이 들어있는 시험관에 1분 간격으로 준비된 바이러스액 2.5 ㎖을 시험관에 넣고 혼합한 다음 4 ℃에서 정확히 30분 동안 반응시키며 도중에 10분마다 잘 흔들어주었다. 대조군은 희석된 시료 대신 증류수를 사용하는 점만 다르게 실험하였다. 상기의 희석된 시료와 바이러스를 섞은 혼합액을 세포 배양용 배지를 사용하여 희석배수를 원액, 10^-1, 10^-2, 10^-3, 10^-4, 10^-5으로 하여 세포를 단층으로 배양한 96 웰 조직 배양 플레이트 (greiner사, 독일)에 8 웰(well)/희석배수로 적용하여 혼합액을 25 ㎕씩 접종한 후, 30분 흡착시킨 후 배지를 갈아주었다. 인플루엔자 바이러스 시험의 경우에는 세포변성효과(CPE, cytophatic effect)를 유발하기 위하여 5ug/ml 트립신(trypsin)이 함유된 배지로 갈아주었다. 접종 후 37 ℃의 CO₂ 배양기에서 4일 동안 배양하며, 매일 현미경으로 세포변성효과 여부를 관찰하고 최종적으로 접종 3-4일 후 CPE를 해석 (reading)하여 바이러스 존재 여부를 판단하였다. 사용된 바이러스에 따라 접종에 사용한 세포는 적절하게 치환되었으며, 세포에서 CPE를 나타내지 않는 바이러스 (H9N2 및 IBV)의 경우 희석배수별 시료와 각각의 바이러스 반응액을 10일령 SPF 종란에 0.2 ㎖ 씩 접종하여 접종 3일 후 혈구 응집반응 및 도트 면역분석법 (Dot immunoassay)를 통하여 바이러스의 존재 여부를 판단하였다 (Song CS et al., Avian Diseases, 42(92), pp92-100, 1998). 바이러스 함유량 계산은 캐버 방법 (Kaeber method) 을 이용하여 산출하였다 (Payment P et al., Methods and Techniques in Virology, p33, 1993).

참고예 5. 플라크 억제효과 분석 (Plaque reduction assay)

MDCK 세포를 6-웰 조직배양용 플레이트에 6 X 10⁵ 세포수/웰의 농도로 넣고 배양하여 단층 (monolayer)이 형성되면 배지를 제거하고 400 pfu/㎖의 바이러스를 0.1 ㎖ 씩 접종한 뒤 1시간 동안 37℃, 5% CO₂ 배양기에서 바이러스를 흡착시켰다. 농도가 1000, 500, 250, 125, 62.5, 31.25 ㎍/㎖ 이 되도록 MEM 배지에 희석된 시료를 1% 아가로즈 (agarose)와 동량 희석하여 바이러스가 접종된 세포에 중층 (double-layer) 하였다. 아가로즈가 굳은 후 37℃, 5% CO₂ 조건에서 2-3일간 배양한 뒤 플라크의 수를 측정하였다.

참고예 6. 뉴트럴 레드 비색분석 (Neutral red colorimetric assay)

[Microtiter Neutral Red Assay for Antiviral or Cytotoxicity Activity: Neutral red colorimetric assay]

맨드라미 종류별 추출물의 바이러스 증식억제 효과를 시험하기 위하여 상기 실험방법에서 제조한 60 % 맨드라미 에탄올 추출물 및 분획을 최종농도가 1000, 320, 100, 32, 10, 3.2, 1, 0.1 ug/ml 되도록 증류수에 희석하여 실험하였다. 96 웰 조직 배양 플레이트 (greiner사, 독일)를 사용하여 한 플레이트 당 두 가지 분획의 유효농도와 세포독성을 세 반복 되게 측정할 수 있도록 하였다. 먼저 유효농도 측정법은 배양세포를 단층으로 배양한 96 웰 조직 배양 플레이트에 시험 할 분획의 희석농도를 3 웰(well)/희석농도로 적용하여 증식억제 시험용 바이러스를 100 TCID₅₀/100ul/well 로 접종한 후, 30분 흡착시킨 후 각 희석 배수별 분획을 100ul씩 첨가 하였다. 대조군은 희석된 맨드라미 추출물 대신 증류수를 사용하는 점만 다르게 하여 양성 대조군과 음성 대조군을 모두 두었으며 96 웰 조직 플레이트의 정중앙 6개 웰 (well)은 증류수만 첨가하여 blank로 두었다. 접종 후 37 ℃의 CO₂ 배양기에서 3-4일 동안 배양하며, 매일 현미경으로 세포 변성 효과 (CPE, cytophatic effect) 여부를 관찰하고 접종 4일에 뉴트럴 레드분석(neutral red assay)을 실시하였다. 뉴트럴 레드분석은 세포가 있는 플레이트에 0.034% 의 뉴트럴 레드를 100ul/웰 로 첨가 후 호일 등으로 빛을 차단하여 살아있는 세포가 염색액(neutral red)을 흡수할 수 있도록 37℃에서 2시간 동안 반응 후 세포를 PBS로 2회 세척한다. 세포를 완전히 건조시킨 후 100% 에탄올과 소렌슨 시트레이트 버퍼(Sorensen citrate buffer)가 동량 희석된 용액을 200ul/well 되도록 첨가하고 540nm의 파장으로 분광광도계(spectrophotometer, SUNRISE, Tecan, 오스트리아)에서 흡광도값 (Optical density value: OD value)을 측정하였다. 세포독성 측정법은 바이러스 접종 없이 희석농도별 분획만을 첨가하여 유효농도 측정법과 같은 플레이트 내에서 실험하였으며 이 후 실험법은 유효농도 측정법과 동일하게 진행하였다 (Donald FS et al., Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 45(3), pp743-748, 2001).

실시예 1. 맨드라미 극성용매 추출물의 제조

1-1. 맨드라미 물추출물의 제조

상기에서 수득한 각 맨드라미 분말 80 g을 증류수 800 ㎖에 현탁시킨 후 열수추출기에 넣고 90 ℃에서 4시간 동안 추출하여 여과한 후, 10,000 ×g에서 30분간 원심분리한 후 상층액을 취하여 동결건조기 (ModulyoD, ThermoSavant, USA)에 넣고 건조하여 개맨드라미 열수추출물 분말 3 g, 깃털맨드라미 열수추출물 분말 2 g, 둥근맨드라미 열수추출물 분말 3 g을 수득하였으며, 4 ℃ 냉장고에 보관하면서 실험에 사용하였다.

1-2. 맨드라미 에탄올 추출물의 제조

상기에서 수득한 각 맨드라미 분말 80 g을 30 %, 60 % 및 100 % 에탄올 800 ㎖에 각각 현탁시킨 후 실온에서 18시간 환류추출하여 여과한 후, 10,000×g에서 30분간 원심분리하여 침전물을 제거하고 상층액을 취하여 감압하에서 증발건조 (Evaporate or, BUCHI, 스위스)시켜 에탄올 성분을 완전히 제거하였으며, 시료별로 각각 증류수 200 ㎖을 적용한 후 동결건조기 (ModulyoD, ThermoSavant, USA)로 건조하여 개맨드라미 에탄올 추출물 분말 (30% 4 g, 60 % 8 g, 100 % 9 g), 깃털맨드라미 에탄올 추출물 분말 (30% 4 g, 60 % 8 g, 100 % 9 g), 둥근맨드라미 에탄올 추출물 분말 (30% 4 g, 60 % 8 g, 100 % 9 g)을 수득하여 4 ℃ 냉장고에 보관하면 서 실험에 사용하였다.

1-3. 맨드라미 메탄올 추출물의 제조

상기에서 수득한 각 맨드라미 분말 80 g을 100 % 메탄올 800 ㎖에 각각 현탁시킨 후 실온에서 18시간 환류 추출하여 여과한 후, 10,000×g에서 30분간 원심분리하여 침전물을 제거하고 상층액을 취하여 감압하에서 증발건조 (Evaporate or, BUCHI, 스위스)시켜 메탄올 성분을 완전히 제거하였으며, 시료별로 각각 증류수 200 ㎖을 적용한 후 동결건조기 (ModulyoD, ThermoSavant, USA)로 건조하여 개맨드라미 메탄올 추출물 분말 (9g), 깃털맨드라미 메탄올 추출물 분말 (9g), 둥근맨드라미 메탄올 추출물 분말 (9g)을 수득하여 4 ℃ 냉장고에 보관하면서 실험에 사용하였다.

상기 실시예에서 준비된 맨드라미 추출물의 회수율은 개맨드라미를 기준으로 하여 하기 표 1에 나타낸 바와 같이, 60% 및 100% 에탄올로 추출하였을 때 가장 회수율이 높았다.

용매	사용된 맨드라미분말 (g)	추출 후 회수된 양 (g)	회수율 (%)
물	80	3	3.75
30% 에탄올	80	4	5
60% 에탄올	80	8	10
100% 에탄올	80	9	11.25
100% 메탄올	80	9	11.25

실시예 2. 맨드라미 비극성용매 추출물의 제조

2-1. 디클로로메탄 가용추출물의 제조

상기에서 수득한 개맨드라미 분말 800 g을 60% 에탄올 8L에 현탁시킨 후 42℃에서 환류추출하여 여과한 후, 10,000×g에서 30분간 원심분리하여 침전물을 제거하고 상층액을 취하여 감압하에서 증발건조 (Evaporate or, BUCHI, 스위스)시켜 제조한 맨드라미 추출물을 다시 증류수 800 ml로 현탁한 것에 디클로로메탄 (CH₂Cl₂) 800 ml을 가하여 혼합한 후 분획하여 수가용성 분획층 800 ml 및 디클로로메탄 가용성 분획물 800 ml를 얻은 후, 이 디클로로메탄 가용성 분획물을 감압하에서 증발 건조하여 디클로로메탄 가용추출물 4.5 g을 수득하였다.

2-2. 맨드라미 에틸아세테이트 가용추출물의 제조

상기 실시예 2에서 수득한 수가용성 분획층 800 ml에 에틸아세테이트 (EtOAc) 800 ml을 가하여 혼합한 후 분획하여 수가용성 분획층 800 ml 및 에틸아세테이트 가용성 분획물 800 ml를 얻은 후, 이 에틸아세테이트 가용성 분획물을 감압하에서 증발 건조하여 에틸아세테이트 가용추출물 2.023 g을 수득하였다.

2-3. 맨드라미 부탄올 가용추출물의 제조

상기 실시예 3에서 수득한 수가용성 분획층 800 ml에 부탄올 (n-BuOH) 800 ml을 가하여 혼합한 후 분획하여 수가용성 분획층 800 ml 및 부탄올 가용성 분획물 800 ml를 얻은 후, 이 부탄올 가용성 분획물 및 수가용성 분획물을 감압하에서 증발 건조하여 부탄올 가용추출물 7.354 g 및 수가용성 추출물 61.59 g을 수득하였다.

실험예 1. 맨드라미 종류별 추출물의 시험관내 살바이러스 효능 스크리닝

맨드라미 종류별 추출물의 시험관내 살바이러스 효능을 시험하기 위하여 상기 실시예 1-2에서 제조한 60 % 맨드라미 에탄올 추출물을 각각 증류수로 500배 희석하였다. 준비된 인플루엔자 H1N1 바이러스액 2.5 ㎖을 4 ℃ 상태의 동량의 상기 희석된 맨드라미 추출물이 들어있는 시험관에 넣고 혼합한 다음 4 ℃에서 정확히 30분 동안 반응시키며 도중에 10분마다 잘 흔들어주었다. 대조군은 희석된 맨드라미 추출물 대신 증류수를 사용하는 점만 다르게 실험하였다. 상기의 희석된 맨드라미 추출물과 바이러스를 섞은 혼합액을 MDCK 세포 배양용 배지를 사용하여 희석배수를 원액, 10^-1, 10^-2, 10^-3, 10^-4, 10^-5, 10^-6으로 하여 MDCK를 단층으로 배양한 96 웰 조직 배양 플레이트 (greiner사, 독일)에 8개 웰(well)/희석배수로 적용하여 혼합액을 25 ㎕씩 접종한 후, 30분 흡착시킨 후 배지를 갈아주었다. 접종 후 37 ℃의 CO₂ 배양기에서 3-4일 동안 배양하며, 매일 현미경으로 세포 변성 효과 (CPE, cytophatic effect) 여부를 관찰하였으며, 최종적으로 관찰한 CPE의 정도 여부로 바이러스 존재 여부를 판단하였다. 참고예 4에 준하여 사용된 바이러스에 따라 사용한 세포를 바꿔주었으며 세포에서 CPE를 나타내지 않는 바이러스 (H9N2 인플루엔자 바이러스 및 Infectious broncheitis 바이러스)의 경우에는 희석배수별 맨드라미 추출물과 각각의 바이러스 반응액을 10일령 SPF 종란에 0.2ml 씩 접종하여 접종 3일 후 혈구 응집반응 및 도트 면역분석 (Dot immunoassay)를 통하여 바이러스의 존재 여부를 판단하였다. 바이러스 함유량 계산은 캐버 방법 (Kaeber method)을 이용하여 하기 표 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8에 나타내었다 (Payment P et al., Methods and Techniques in Virology, p33, 1993).

구분	시험관내 살바이러스 효능
	완전감소	104 감소	102 감소
개맨드라미 추출물	500배 희석 (2 mg/㎖)	500배 희석 (2 mg/㎖)	500배 희석 (2 mg/㎖)
깃털맨드라미 추출물	500배 희석 (2 mg/㎖)	500배 희석 (2 mg/㎖)	500배 희석 (2 mg/㎖)
둥근맨드라미 추출물	500배 희석 (2 mg/㎖)	500배 희석 (2 mg/㎖)	500배 희석 (2 mg/㎖)
* 처리 바이러스: Influenza virus H1N1 (105.6 TCID50/㎖) * 처리 추출물 및 처리조건: 60 % 에탄올 추출물, 4 ℃, 30분

상기 표 2에 나타낸 바와 같이, 500배 희석 (2 mg/㎖)된 개맨드라미, 깃털맨드라미, 둥근맨드라미 추출물 각각에 바이러스를 30분 반응시킨 결과 10^5.6 TCID₅₀/㎖ 의 인플루엔자 바이러스 H1N1이 10², 10⁴ 및 완전 감소되었으며, 이는 국내 자생 맨드라미인 개맨드라미, 깃털맨드라미 및 둥근맨드라미 유래 맨드라미 추출물이 모두 시험관내 살바이러스 효능이 있음을 나타낸다.

구분	시험관내 살바이러스 효능
	완전감소	104 감소	102 감소
개맨드라미 추출물	500배 희석 (2 mg/㎖)	500배 희석 (2 mg/㎖)	500배 희석 (2 mg/㎖)
깃털맨드라미 추출물	500배 희석 (2 mg/㎖)	500배 희석 (2 mg/㎖)	500배 희석 (2 mg/㎖)
둥근맨드라미 추출물	500배 희석 (2 mg/㎖)	500배 희석 (2 mg/㎖)	500배 희석 (2 mg/㎖)
* 처리 바이러스: Newcastle disease virus (105.6 TCID50/㎖) * 처리 추출물 및 처리조건: 60 % 에탄올 추출물, 4 ℃, 30분

상기 표 3에 나타낸 바와 같이, 500배 희석 (2 mg/㎖)된 개맨드라미, 깃털맨드라미, 둥근맨드라미 추출물 각각에 바이러스를 30분 반응시킨 결과 10^5.6 TCID₅₀/㎖ 의 뉴캣슬병 바이러스가 10², 10⁴ 및 완전 감소되었으며, 이는 국내 자생 맨드라미인 개맨드라미, 깃털맨드라미 및 둥근맨드라미 유래 맨드라미 추출물이 모두 시험관내 살바이러스 효능이 있음을 나타낸다.

구분	시험관내 살바이러스 효능
	완전감소	104 감소	102 감소
개맨드라미 추출물	500배 희석 (2 mg/㎖)	500배 희석 (2 mg/㎖)	500배 희석 (2 mg/㎖)
깃털맨드라미 추출물	500배 희석 (2 mg/㎖)	500배 희석 (2 mg/㎖)	500배 희석 (2 mg/㎖)
둥근맨드라미 추출물	500배 희석 (2 mg/㎖)	500배 희석 (2 mg/㎖)	500배 희석 (2 mg/㎖)
* 처리 바이러스: Infectious bronchitis virus (105.6 TCID50/㎖) * 처리 추출물 및 처리조건: 60 % 에탄올 추출물, 4 ℃, 30분

상기 표 4에 나타낸 바와 같이, 500배 희석 (2 mg/㎖)된 개맨드라미, 깃털맨드라미, 둥근맨드라미 추출물 각각에 바이러스를 30분 반응시킨 결과 10^5.6 TCID₅₀/㎖ 의 닭전염성기관지염 바이러스가 10², 10⁴ 및 완전 감소되었으며, 이는 국내 자생 맨드라미인 개맨드라미, 깃털맨드라미 및 둥근맨드라미 유래 맨드라미 추출물이 모두 시험관내 살바이러스 효능이 있음을 나타낸다.

구분	시험관내 살바이러스 효능
	완전감소	104 감소	102 감소
개맨드라미 추출물	500배 희석 (2 mg/㎖)	500배 희석 (2 mg/㎖)	500배 희석 (2 mg/㎖)
깃털맨드라미 추출물	500배 희석 (2 mg/㎖)	500배 희석 (2 mg/㎖)	500배 희석 (2 mg/㎖)
둥근맨드라미 추출물	500배 희석 (2 mg/㎖)	500배 희석 (2 mg/㎖)	500배 희석 (2 mg/㎖)
* 처리 바이러스: Avian pneumovirus (105.6 TCID50/㎖) * 처리 추출물 및 처리조건: 60 % 에탄올 추출물, 4 ℃, 30분

상기 표 5에 나타낸 바와 같이, 500배 희석 (2 mg/㎖)된 개맨드라미, 깃털맨드라미, 둥근맨드라미 추출물 각각에 바이러스를 30분 반응시킨 결과 10^5.6 TCID₅₀/㎖ 의 뉴모바이러스가 10², 10⁴ 및 완전 감소되었으며, 이는 국내 자생 맨드라미인 개맨드라미, 깃털맨드라미 및 둥근맨드라미 유래 맨드라미 추출물이 모두 시험관내 살바이러스 효능이 있음을 나타낸다.

구분	시험관내 살바이러스 효능
	완전감소	104 감소	102 감소
개맨드라미 추출물	500배 희석 (2 mg/㎖)	500배 희석 (2 mg/㎖)	500배 희석 (2 mg/㎖)
깃털맨드라미 추출물	500배 희석 (2 mg/㎖)	500배 희석 (2 mg/㎖)	500배 희석 (2 mg/㎖)
둥근맨드라미 추출물	500배 희석 (2 mg/㎖)	500배 희석 (2 mg/㎖)	500배 희석 (2 mg/㎖)
* 처리 바이러스: PRRS virus (105.6 TCID50/㎖) * 처리 추출물 및 처리조건: 60 % 에탄올 추출물, 4 ℃, 30분

상기 표 6에 나타낸 바와 같이, 500배 희석 (2 mg/㎖)된 개맨드라미, 깃털맨드라미, 둥근맨드라미 추출물 각각에 바이러스를 30분 반응시킨 결과 10^5.6 TCID₅₀/㎖ 의 돼지생식기호흡기증후군 바이러스가 10², 10⁴ 및 완전 감소되었으며, 이는 국내 자생 맨드라미인 개맨드라미, 깃털맨드라미 및 둥근맨드라미 유래 맨드라미 추출물이 모두 시험관내 살바이러스 효능이 있음을 나타낸다.

구분	시험관내 살바이러스 효능
	완전감소	104 감소	102 감소
개맨드라미 추출물	500배 희석 (2 mg/㎖)	500배 희석 (2 mg/㎖)	500배 희석 (2 mg/㎖)
깃털맨드라미 추출물	500배 희석 (2 mg/㎖)	500배 희석 (2 mg/㎖)	500배 희석 (2 mg/㎖)
둥근맨드라미 추출물	500배 희석 (2 mg/㎖)	500배 희석 (2 mg/㎖)	500배 희석 (2 mg/㎖)
* 처리 바이러스: Coxsakie virus (105.6 TCID50/㎖) * 처리 추출물 및 처리조건: 60 % 에탄올 추출물, 4 ℃, 30분

상기 표 7에 나타낸 바와 같이, 500배 희석 (2 mg/㎖)된 개맨드라미, 깃털맨드라미, 둥근맨드라미 추출물 각각에 바이러스를 30분 반응시킨 결과 10^5.6 TCID₅₀/㎖ 의 콕사키 바이러스가 10², 10⁴ 및 완전 감소되었으며, 이는 국내 자생 맨드라미인 개맨드라미, 깃털맨드라미 및 둥근맨드라미 유래 맨드라미 추출물이 모두 시험관내 살바이러스 효능이 있음을 나타낸다.

구분	시험관내 살바이러스 효능
	완전감소	104 감소	102 감소
개맨드라미 추출물	500배 희석 (2 mg/㎖)	500배 희석 (2 mg/㎖)	500배 희석 (2 mg/㎖)
깃털맨드라미 추출물	500배 희석 (2 mg/㎖)	500배 희석 (2 mg/㎖)	500배 희석 (2 mg/㎖)
둥근맨드라미 추출물	500배 희석 (2 mg/㎖)	500배 희석 (2 mg/㎖)	500배 희석 (2 mg/㎖)
* 처리 바이러스: Reticuloendotheliosis virus (105.6 TCID50/㎖) * 처리 추출물 및 처리조건: 60 % 에탄올 추출물, 4 ℃, 30분

상기 표 8에 나타낸 바와 같이, 500배 희석 (2 mg/㎖)된 개맨드라미, 깃털맨드라미, 둥근맨드라미 추출물 각각에 바이러스를 30분 반응시킨 결과 10^5.6 TCID₅₀/㎖ 의 세망내피증 바이러스가 10², 10⁴ 및 완전 감소되었으며, 이는 국내 자생 맨드라미인 개맨드라미, 깃털맨드라미 및 둥근맨드라미 유래 맨드라미 추출물이 모두 시험관내 살바이러스 효능이 있음을 나타낸다.

구분	시험관내 살바이러스 효능
	완전감소	104 감소	102 감소
개맨드라미 추출물	500배 희석 (2 mg/㎖)	500배 희석 (2 mg/㎖)	500배 희석 (2 mg/㎖)
깃털맨드라미 추출물	500배 희석 (2 mg/㎖)	500배 희석 (2 mg/㎖)	500배 희석 (2 mg/㎖)
둥근맨드라미 추출물	500배 희석 (2 mg/㎖)	500배 희석 (2 mg/㎖)	500배 희석 (2 mg/㎖)
* 처리 바이러스: Aujeszky's disease virus (105.6 TCID50/㎖) * 처리 추출물 및 처리조건: 60 % 에탄올 추출물, 4 ℃, 30분

상기 표 9에 나타낸 바와 같이, 500배 희석 (2 mg/㎖)된 개맨드라미, 깃털맨드라미, 둥근맨드라미 추출물 각각에 바이러스를 30분 반응시킨 결과 10^5.6 TCID₅₀/㎖ 의 오제스키 바이러스가 10², 10⁴ 및 완전 감소되었으며, 이는 국내 자생 맨드라미인 개맨드라미, 깃털맨드라미 및 둥근맨드라미 유래 맨드라미 추출물이 모두 시험관내 살바이러스 효능이 있음을 나타낸다.

구분	시험관내 살바이러스 효능
	완전감소	104 감소	102 감소
개맨드라미 추출물	500배 희석 (2 mg/㎖)	500배 희석 (2 mg/㎖)	500배 희석 (2 mg/㎖)
깃털맨드라미 추출물	500배 희석 (2 mg/㎖)	500배 희석 (2 mg/㎖)	500배 희석 (2 mg/㎖)
둥근맨드라미 추출물	500배 희석 (2 mg/㎖)	500배 희석 (2 mg/㎖)	500배 희석 (2 mg/㎖)
* 처리 바이러스: Adeno virus (105.6 TCID50/㎖) * 처리 추출물 및 처리조건: 60 % 에탄올 추출물, 4 ℃, 30분

상기 표 10에 나타낸 바와 같이, 500배 희석 (2 mg/㎖)된 개맨드라미, 깃털맨드라미, 둥근맨드라미 추출물 각각에 바이러스를 30분 반응시킨 결과 10^5.6 TCID₅₀/㎖ 의 아데노 바이러스가 10², 10⁴ 및 완전 감소되었으며, 이는 국내 자생 맨드라미인 개맨드라미, 깃털맨드라미 및 둥근맨드라미 유래 맨드라미 추출물이 모두 시험관내 살바이러스 효능이 있음을 나타낸다.

실험예 2. 추출방법별 맨드라미 추출물의 시험관 내 살바이러스 효능 측정

추출방법별 맨드라미 추출물의 시험관내 살바이러스 효능을 시험하기 위하여 상기 실시예 1에서 제조한 개맨드라미 열수, 30 %, 60 % 및 100 % 에탄올 추출물을 증류수로 100배 희석한 것을 기준으로 하여 1000배, 2000배, 4000배, 8000배, 16000배, 32000배 희석하여 참고예 4의 방법에 의해 바이러스 증식억제 효과를 측정하였다. 각각의 4 ℃ 상태의 맨드라미 추출물 희석액 2.5 ㎖가 들어있는 시험관에 1분 간격으로 준비된 바이러스액 2.5 ㎖를 시험관에 넣고 혼합한 다음 4 ℃에서 정확히 30분 동안 반응시키며 도중에 10분마다 잘 흔들어주었다. 대조군은 희석된 맨드라미 추출물 대신 증류수를 사용하는 점만 다르게 실험하였다. 상기의 희석된 맨드라미 추출물과 바이러스를 섞은 혼합액을 MDCK 세포 배양용 배지를 사용하여 희석배수를 원액, 10^-1, 10^-2, 10^-3, 10^-4, 10^-5, 10^-6으로 하여 MDCK를 단층으로 배양한 96-웰 조직 배양 플레이트 (96 well tissue culture plate)에 8 웰(well)/희석배수로 적용하여 혼합액을 25 ㎕씩 접종한 후, 30분 흡착시킨 후 배지를 갈아주었다. 인플루엔자 바이러스 시험의 경우에는 세포변성효과(CPE, cytophatic effect)를 유발하기 위하여 5ug/ml 트립신이 함유된 배지로 갈아주었다. 접종 후 37 ℃의 CO₂ 배양기에서 4일동안 배양하며, 매일 현미경으로 세포 변성 효과 (CPE, cytophatic effect) 여부를 관찰하고 최종적으로 접종 3-4일 후 CPE를 해석 (reading)하여 바이러스 존재 여부를 판단하였다. 사용된 바이러스에 따라 접종에 사용한 세포는 적절하게 치환되었으며, 세포에서 CPE를 나타내지 않는 바이러스 (H9N2 및 IBV)의 경우 희석배수별 시료와 각각의 바이러스 반응액을 10일령 SPF 종란에 0.2 ㎖ 씩 접종하여 접종 3일 후 혈구 응집반응 및 도트 면역분석법 (Dot immunoassay)를 통하여 바이러스의 존재 여부를 판단하였다 (Song CS et al., Avian Diseases, 42(92), pp92-100, 1998). 바이러스 함유량 계산은 캐버 방법 (Kaeber method) 을 이용하여 산출하였다 (Payment P et al., Methods and Techniques in Virology, p33, 1993).

구분	시험관내 살바이러스 효능
	완전감소				102 감소
추출 용매별 추출물	100 % 에탄올 추출물	60 % 에탄올 추출물	30 % 에탄올 추출물	열수 추출물	100 % 에탄올 추출물	60 % 에탄올 추출물	30 % 에탄올 추출물	열수 추출물
추출물 처리 농도	4000배 희석 (250 ㎍)	4000배 희석 (250 ㎍)	-	-	8000배 희석 (125 ㎍)	8000배 희석 (125 ㎍)	-	-
* 처리 바이러스: Influenza virus H1N1 (105.6 TCID50/㎖) * 처리조건: 4 ℃, 30분

상기 표 11에 나타낸 바와 같이, 4000배 희석된 맨드라미 100 % 에탄올추출물 (250 ㎍), 4000배 희석된 60 % 에탄올추출물 (250 ㎍)에 바이러스를 30분 반응시킨 결과 10^5.6 TCID₅₀/㎖ 의 인플루엔자 바이러스 A/H1N1이 완전 감소되었으며, 8000배 희석된 맨드라미 100 % 에탄올추출물 (125㎍), 8000배 희석된 60 % 에탄올추출물 (125 ㎍)에 바이러스를 30분 반응시킨 결과 10^5.6 TCID₅₀/㎖ 의 인플루엔자 바이러스 A/H1N1이 10² 감소되었다. 상기 실험 결과 60 % 및 100 % 에탄올 추출물의 살바이러스 효능이 가장 탁월하였다.

맨드라미는 60% 에탄올 추출법 적용시 인플루엔자 바이러스에 대한 살바이러스 효능이 가장 탁월하게 조사되어 뉴캣슬병 바이러스, 닭전염성기관지염 바이러스, 뉴모바이러스 바이러스, 돼지생식기호흡기증후군 바이러스, 콕사키바이러스, 세망내피증 바이러스, 오제스키 바이러스, 아데노바이러스 등에 대한 살바이러스 효능시험에도 60% 에탄올 추출법으로 추출된 맨드라미 추출물을 사용하였다.

실험예 3. 맨드라미 추출물의 시험관 내 살바이러스 효능 스크리닝

3-1. RNA 바이러스

3-1-1. MDCK 세포에서의 시험관내 살 A/PR/8/34 (H1N1) 인플루엔자 바이러스 효능

MDCK 세포에서의 시험관 내 살 A/PR/8/34 (H1N1) 인플루엔자 바이러스 효능을 측정하기 위해 개맨드라미 60 % 에탄올 추출물을 증류수로 100배 희석한 것을 기준으로 하여 1000배, 2000배, 4000배, 8000배, 16000배, 32000배 희석하여 참고예 4의 방법에 의해 시험관내 살바이러스 효능을 측정하여 하기 표 12에 그 결과를 나타내었다.

또한, 참고예 5의 플라크 감소 분석법을 이용하여 A/PR/8/34 (H1N1) 인플루엔자 바이러스에 대한 세포내 바이러스 증식억제 효능을 측정하여 하기 도 1에 그 결과를 나타내었다.

구분	시험관내 살바이러스 효능
60% 에탄올 맨드라미 추출물 처리농도	완전감소	102 감소
	4000배 희석 (250㎍)	8000배 희석 (125㎍)
* 처리 바이러스: Influenza virus H1N1 (105.6 TCID50/㎖) * 처리조건: 4 ℃, 30분

상기 표 12에 나타낸 바와 같이, 4000배 희석된 맨드라미 60 % 에탄올추출물 (250 ㎍)에 바이러스를 30분 반응시킨 결과 10^5.6 TCID₅₀/㎖ 의 인플루엔자 바이러스 A/PR/8/34 (H1N1)이 완전 감소되었으며, 8000배 희석된 맨드라미 60 % 에탄올 추출물 (125 ㎍)에 바이러스를 30분 반응시킨 결과 10^5.6 TCID₅₀/㎖ 의 인플루엔자 바이러스 A/PR/8/34 (H1N1)이 10² 감소되었다.

또한, 도 1에 나타낸 바와 같이, 플라크 감소 분석 결과 본 발명의 맨드라미 추출물의 바이러스를 50% 억제하는 유효농도 (50% Inhibitory concentration : IC₅₀)가 55.6 ㎍으로 상기 관 실험의 결과와 일치하는 경향을 나타내었다.

상기 실험 결과 개맨드라미 60 % 에탄올 추출물은 A/PR/8/34 (H1N1) 인플루엔자 바이러스에 대한 시험관내 살바이러스 효능 (Virucidal activity)와 세포내 바이러스 증식억제 효능 (Antiviral activity)이 탁월하였다.

3-1-2. SPF 종란에서의 시험관내 살 A/HS/MS96/96 (H9N2) 인플루엔자 바이러스 효능

SPF 종란에서의 시험관 내 살 A/HS/MS96/96 (H9N2) 인플루엔자 바이러스 효능을 측정하기 위해 개맨드라미 60 % 에탄올 추출물을 증류수로 100배 희석한 것을 기준으로 하여 1000배, 2000배, 4000배, 8000배, 16000배, 32000배 희석하여 참고예 4의 방법에 의해 시험관내 살바이러스 효능을 측정하여 하기 표 13에 그 결과를 나타내었다.

구분	시험관내 살바이러스 효능
60% 에탄올 맨드라미 추출물 처리농도	완전감소	102 감소
	4000배 희석 (250㎍)	8000배 희석 (125㎍)
* 처리 바이러스: Avian Influenza virus H9N2 (105.6 TCID50/㎖) * 처리조건: 4 ℃, 30분

상기 표 13에 나타낸 바와 같이, 4000배 희석된 맨드라미 60 % 에탄올추출물 (250 ㎍)에 바이러스를 30분 반응시킨 결과 10^5.6 EID₅₀/㎖ 의 조류 인플루엔자 바이러스 A/HS/MS96/96 (H9N2)이 완전 감소되었으며, 8000배 희석된 맨드라미 60 % 에탄올추출물 (125 ㎍)에 바이러스를 30분 반응시킨 결과 10^5.6 EID₅₀/㎖ 의 인플루엔자 바이러스 A/HS/MS96/96 (H9N2)이 10² 감소되었다. 상기 실험 결과 개맨드라미 60 % 에탄올 추출물은 A/HS/MS96/96 (H9N2) 인플루엔자 바이러스에 대한 시험관내 살바이러스 효능이 탁월하였다.

3-1-3. 계태아 섬유아세포에서의 시험관내 살 뉴캣슬병 바이러스 효능

계태아 섬유아세포에서의 시험관 내 살 뉴캣슬병 바이러스 (NDV) 효능을 측정하기 위해 개맨드라미 60 % 에탄올 추출물을 증류수로 100배 희석한 것을 기준으로 하여 1000배, 2000배, 4000배, 8000배, 16000배, 32000배 희석하여 참고예 4의 방법에 의해 NDV의 한 종류인 교정원 주 (KJW strain)를 이용한 시험관내 살바이러스 효능을 측정하여 하기 표 14에 그 결과를 나타내었다.

구분	시험관내 살바이러스 효능
60% 에탄올 맨드라미 추출물 처리농도	완전감소	102 감소
	16000배 희석 (62.5㎍)	32000배 희석 (31.25㎍)
* 처리 바이러스: Newcastle disease virus KJW strain (105.6 TCID50/㎖) * 처리조건: 4 ℃, 30분

상기 표 14에 나타낸 바와 같이, 16000배 희석된 맨드라미 60 % 에탄올추출물 (62.5 ㎍)에 바이러스를 30분 반응시킨 결과 10^5.6 TCID₅₀/㎖ 의 뉴캣슬병 바이러스 교정원 주가 완전 감소되었으며, 32000배 희석된 맨드라미 60 % 에탄올추출물 (31.25 ㎍)에 바이러스를 30분 반응시킨 결과 10^5.6 TCID₅₀/㎖ 의 뉴캣슬병 바이러스 교정원 주가 10² 감소되었다. 상기 실험 결과 맨드라미 60 % 에탄올 추출물은 뉴캣슬병 바이러스에 대한 시험관내 살바이러스 효능이 탁월하였다.

3-1-4. SPF 종란에서의 시험관내 살 닭 전염성 기관지염 바이러스 효능

SPF 종란에서의 시험관 내 살 전염성 기관지염 바이러스 (IBV) 효능을 측정하기 위해 맨드라미 60 % 에탄올 추출물을 증류수로 100배 희석한 것을 기준으로 하여 1000배, 2000배, 4000배, 8000배, 16000배, 32000배 희석하여 참고예 4의 방법에 의해 시험관내 살바이러스 효능을 측정하여 하기 표 15에 그 결과를 나타내었다.

구분	시험관내 살바이러스 효능
60% 에탄올 맨드라미 추출물 처리농도	완전감소	102 감소
	16000배 희석 (250㎍)	-
* 처리 바이러스: IBV M41 strain (105.6 TCID50/㎖) * 처리조건: 4 ℃, 30분

상기 표 15에 나타낸 바와 같이, 16000배 희석된 맨드라미 60 % 에탄올추출물 (62.5 ㎍)에 바이러스를 30분 반응시킨 결과 10^5.6 EID₅₀/㎖의 전염성 기관지염 바이러스 M41 주가 완전 감소되었다. 상기 실험 결과 맨드라미 60 % 에탄올 추출물은 전염성 기관지염 바이러스에 대한 시험관내 살바이러스 효능이 탁월하였다.

3-1-5. 계태아 섬유아세포에서의 시험관내 살 조류 뉴모바이러스 효능

계태아 섬유아세포에서의 시험관 내 살 조류 뉴모바이러스 (APV) 효능을 측정하기 위해 60 % 에탄올 맨드라미 추출물을 증류수로 100배 희석한 것을 기준으로 하여 1000배, 2000배, 4000배, 8000배, 16000배, 32000배 희석하여 참고예 4의 방법에 의해 시험관내 살바이러스 효능을 측정하여 하기 표 16에 그 결과를 나타내었다.

구분	시험관내 살바이러스 효능
60% 에탄올 맨드라미 추출물 처리농도	완전감소	102 감소
	16000배 희석 (62.5㎍)	32000배 희석 (31.25㎍)
* 처리 바이러스: Avian pneumovirus (105.6 TCID50/㎖) * 처리조건: 4 ℃, 30분

상기 표 16에 나타낸 바와 같이, 16000배 희석된 맨드라미 60 % 에탄올추출물 (62.5㎍)에 바이러스를 30분 반응시킨 결과 10^5.6 EID₅₀/㎖의 조류 뉴모 바이러스가 완전 감소되었으며, 32000배 희석된 맨드라미 60 % 에탄올추출물 (31.25 ㎍)에 바이러스를 30분 반응시킨 결과 10^5.6 TCID₅₀/㎖ 의 조류 뉴모 바이러스가 10² 감소되었다. 상기 실험 결과 맨드라미 60 % 에탄올 추출물은 조류 뉴모 바이러스에 대한 시험관내 살바이러스 효능이 탁월하였다.

3-1-6. MARK-145 세포에서의 항 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스 효능

MARK-145 세포에서의 항 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스 (PRRSV) 효능을 측정하기 위해 60 % 에탄올 맨드라미 추출물을 증류수로 100배 희석한 것을 기준으로 하여 1000배, 2000배, 4000배, 8000배, 16000배, 32000배 희석하여 참고예 4의 방법에 의해 시험관내 살바이러스 효능을 측정하여 하기 표 17에 그 결과를 나타내었다.

구분	시험관내 살바이러스 효능
60% 에탄올 맨드라미 추출물 처리농도	완전감소	102 감소
	16000배 희석 (62.5㎍)	32000배 희석 (31.25㎍)
* 처리 바이러스: PRRS virus (105.6 TCID50/㎖) * 처리조건: 4 ℃, 30분

상기 표 17에 나타낸 바와 같이, 16000배 희석된 맨드라미 60 % 에탄올추출물 (62.5㎍)에 바이러스를 30분 반응시킨 결과 10^5.6 TCID₅₀/㎖의 PRRSV가 완전 감소되었으며, 32000배 희석된 맨드라미 60 % 에탄올추출물 (31.25㎍)에 바이러스를 30분 반응시킨 결과 10^5.6 TCID₅₀/㎖의 PRRSV가 10² 감소되었다. 상기 실험 결과 맨드라미 60 % 에탄올 추출물은 PRRSV에 대한 시험관내 살바이러스 효능이 탁월하였다.

3-1-7. Hep-2 세포에서의 시험관내 살 콕사키 바이러스 효능

Hep-2 세포에서의 시험관 내 살 콕사키 바이러스 (CXV) 효능을 측정하기 위해 60 % 에탄올 맨드라미 추출물을 증류수로 100배 희석한 것을 기준으로 하여 1000배, 2000배, 4000배, 8000배, 16000배, 32000배 희석하여 참고예 4의 방법에 의해 시험관내 살바이러스 효능을 측정하여 하기 표 18에 그 결과를 나타내었다.

구분	시험관내 살바이러스 효능
60% 에탄올 맨드라미 추출물 처리농도	완전감소	102 감소
	100배 희석 (10㎎/㎖)	500배 희석 (2㎎/㎖)
* 처리 바이러스: Coxsakie virus (105.6 TCID50/㎖) * 처리조건: 4 ℃, 30분

상기 표 18에 나타낸 바와 같이, 100배 희석된 맨드라미 60 % 에탄올추출물 (10 ㎎)에 바이러스를 30분 반응시킨 결과 10^5.6 TCID₅₀/㎖의 CXV가 완전 감소되었으며, 500배 희석된 맨드라미 60 % 에탄올추출물 (2㎎)에 바이러스를 30분 반응시킨 결과 10^5.6 TCID₅₀/㎖의 CSV가 10² 감소되었다. 상기 실험 결과 맨드라미 60 % 에탄올 추출물은 CXV에 대한 시험관내 살바이러스 효능이 탁월하였다.

3-1-8. 계태아섬유아 세포에서의 시험관내 살 세망내피증 바이러스 효능

Hep-2 세포에서의 시험관 내 살 세망내피증 바이러스 (REV) 효능을 측정하기 위해 60 % 에탄올 맨드라미 추출물을 증류수로 100배 희석한 것을 기준으로 하여 1000배, 2000배, 4000배, 8000배, 16000배, 32000배 희석하여 참고예 4의 방법에 의해 시험관내 살바이러스 효능을 측정하여 하기 표 19에 그 결과를 나타내었다.

구분	시험관내 살바이러스 효능
60% 에탄올 맨드라미 추출물 처리농도	완전감소	102 감소
	4000배 희석 (250㎍/㎖)	8000배 희석 (125㎍/㎖)
* 처리 바이러스: Reticuloendotheliosis virus (105.6 TCID50/㎖) * 처리조건: 4 ℃, 30분

상기 표 19에 나타낸 바와 같이, 4000배 희석된 맨드라미 60 % 에탄올추출물 (250㎍)에 바이러스를 30분 반응시킨 결과 10^5.6 TCID₅₀/㎖의 REV가 완전 감소되었으며, 8000배 희석된 맨드라미 60 % 에탄올추출물 (125 ㎍)에 REV 바이러스를 30분 반응시킨 결과 10^5.6 TCID₅₀/㎖의 REV가 10² 감소되었다. 상기 실험 결과 맨드라미 60 % 에탄올 추출물은 REV에 대한 시험관내 살바이러스 효능이 탁월하였다.

3-2. DNA 바이러스

3-2-1. MDCK 세포에서의 시험관내 살 오제스키 바이러스 효능

Hep-2 세포에서의 시험관 내 살 오제스키 바이러스 (ADV) 효능을 측정하기 위해 60 % 에탄올 맨드라미 추출물을 증류수로 100배 희석한 것을 기준으로 하여 1000배, 2000배, 4000배, 8000배, 16000배, 32000배 희석하여 참고예 4의 방법에 의해 시험관내 살바이러스 효능을 측정하여 하기 표 20에 그 결과를 나타내었다.

구분	시험관내 살바이러스 효능
60% 에탄올 맨드라미 추출물 처리농도	완전감소	102 감소
	4000배 희석 (250㎍/㎖)	8000배 희석 (125㎍/㎖)
* 처리 바이러스: Aujeszky's disease virus (105.6 TCID50/㎖) * 처리조건: 4 ℃, 30분

상기 표 20에 나타낸 바와 같이, 4000배 희석된 맨드라미 60 % 에탄올추출물 (250㎍)에 바이러스를 30분 반응시킨 결과 10^5.6 TCID₅₀/㎖의 ADV가 완전 감소되었으며, 8000배 희석된 맨드라미 60 % 에탄올추출물 (125 ㎍)에 ADV 바이러스를 30분 반응시킨 결과 10^5.6 TCID₅₀/㎖의 REV가 10² 감소되었다. 상기 실험 결과 맨드라미 60 % 에탄올 추출물은 ADV에 대한 시험관내 살바이러스 효능이 탁월하였다.

3-2-2. Hep-2 세포에서의 시험관내 살 아데노 바이러스 효능

Hep-2 세포에서의 시험관 내 살 아데노 바이러스 (ADV) 효능을 측정하기 위해 60 % 에탄올 맨드라미 추출물을 증류수로 100배 희석한 것을 기준으로 하여 1000배, 2000배, 4000배, 8000배, 16000배, 32000배 희석하여 참고예 4의 방법에 의해 시험관내 살바이러스 효능을 측정하여 하기 표 21에 그 결과를 나타내었다.

구분	시험관내 살바이러스 효능
60% 에탄올 맨드라미 추출물 처리농도	완전감소	102 감소
	100배 희석 (10㎎/㎖)	500배 희석 (2㎎/㎖)
* 처리 바이러스: Adeno virus (105.6 TCID50/㎖) * 처리조건: 4 ℃, 30분

상기 표 21에 나타낸 바와 같이, 100배 희석된 맨드라미 60 % 에탄올추출물 (10㎎/㎖)에 바이러스를 30분 반응시킨 결과 10^5.6 TCID₅₀/㎖의 아데노 바이러스가 완전 감소되었으며, 500배 희석된 맨드라미 60 % 에탄올추출물 (2㎎)에 ADV 바이러스를 30분 반응시킨 결과 10^5.6 TCID₅₀/㎖의 REV가 10² 감소되었다.

실험예 4. 맨드라미 비극성용매 가용 추출물의 시험관 내 살바이러스 효능 측정

4-1. MDCK 세포에서의 시험관내 살 A/PR/8/34 (H1N1) 인플루엔자 바이러스 효능

MDCK 세포에서의 시험관내 살 인플루엔자 바이러스 효능을 측정하기 위해 상기 실시예 2의 맨드라미 비극성용매 가용 추출물들을 증류수로 100배 희석한 것을 기준으로 하여 1000배, 2000배, 4000배, 8000배, 16000배, 32000배 희석하여 참고예 4의 방법에 의해 시험관내 살바이러스 효능을 측정하여 하기 표 22에 그 결과를 나타내었다.

또한, 참고예 5의 플라크 감소 분석법을 이용하여 A/PR/8/34 (H1N1) 인플루엔자 바이러스에 대한 맨드라미 비극성용매 가용 추출물들의 세포내 바이러스 증식억제 효과를 측정하여 하기 도 3에 그 결과를 나타내었다.

맨드라미추출물 분획	시험관내 살바이러스 효능
	완전감소	102 감소
디클로로메탄 (CH2Cl2) 가용성 추출물	4000배 희석 (250㎍/㎖)	8000배 희석 (125㎍/㎖l)
에틸아세테이트 (EtOAc) 가용성 추출물	100배 희석 (10㎎/㎖)	100배 희석 (10㎎/㎖)
부탄올 (n-BuOH) 가용성 추출물	-	-
수 (H2O) 가용성 추출물	-	-
맨드라미분말 60% 에탄올 추출물	4000배 희석 (250㎍/㎖)	8000배 희석 (125㎍/㎖)
* 처리 바이러스: Influenza virus H1N1 (105.6 TCID50/㎖) * 처리조건: 4 ℃, 30분

상기 표 22에 나타낸 바와 같이, 디클로로메탄 가용성 추출물 250 ㎍/㎖, 에틸아세테이트 가용성 추출물 10 ㎎/㎖ 농도에서 완전 감소하였다.

또한, 도 2에 나타낸 바와 같이, 플라크 감소 분석 결과 본 발명의 맨드라미 비극성 용매 가용 추출물 각각의 농도가 100 ㎍/㎖일 때, 바이러스의 억제%는 각각 디클로로메탄 가용성 추출물 45.5%, 에틸아세테이트 가용성 추출물 0 %, 부탄올 가용성 추출물 0 % 및 수가용성 추출물 0 % 로 상기 관 실험의 결과와 일치하는 경향을 나타내었다.

상기 실험 결과 맨드라미 비극성용매 가용성 추출물 중 디클로로메탄 가용성 추출물만이 인플루엔자 바이러스에 대한 시험관내 살바이러스 효능 (Virucidal activity)와 세포내 바이러스 증식억제 효능 (Antiviral activity)이 탁월하였다.

4-2. 계태아 섬유아세포에서의 시험관내 살 뉴캣슬병 바이러스 효능

계태아 섬유아세포에서의 시험관 내 살 뉴캣슬병 바이러스 (NDV) 효능을 측정하기 위해 상기 실시예 2의 맨드라미 비극성용매 가용 추출물들을 증류수로 100배 희석한 것을 기준으로 하여 1000배, 2000배, 4000배, 8000배, 16000배, 32000배 희석하여 참고예 4의 방법에 의해 시험관내 살바이러스 효능을 측정하여 하기 표 23에 그 결과를 나타내었다.

맨드라미추출물 분획	시험관내 살바이러스 효능
	완전감소	102 감소
디클로로메탄 (CH2Cl2) 가용성 추출물	16000배 희석 (62.5㎍/㎖)	32000배 희석 (31.25㎍/㎖l)
에틸아세테이트 (EtOAc) 가용성 추출물	100배 희석 (10㎎/㎖)	100배 희석 (10㎎/㎖)
부탄올 (n-BuOH) 가용성 추출물	-	-
수 (H2O) 가용성 추출물	-	-
맨드라미분말 60% 에탄올 추출물	16000배 희석 (62.5㎍/㎖)	32000배 희석 (31.25㎍/㎖)
* 처리 바이러스: Newcastle disease virus KJW strain (105.6 TCID50/㎖) * 처리조건: 4 ℃, 30분

상기 표 23에 나타낸 바와 같이, 디클로로메탄 가용성 추출물 62.5㎍/㎖ 및 에틸아세테이트 가용성 추출물 10 ㎎/㎖ 농도 농도에서 완전 감소하여 시험관 내 탁월한 살바이러스 효능을 나타내었다.

실험예 5. 동물실험을 통한 맨드라미 추출물의 항바이러스 효과 실험

5-1. 마우스에서의 맨드라미 추출물의 항바이러스 효과

5-1-1. 인플루엔자 바이러스 공격접종에 대한 맨드라미 추출물의 위관(존데) 투여에 의한 치료효과

맨드라미 추출물의 인플루엔자 바이러스 감염 마우스에 대한 치료효과를 시험하기 위하여 상기에서 제조한 개맨드라미 60 % 에탄올 추출물을 증류수로 희석하여 맨드라미 추출물을 제조하였다. 시험군은 바이러스 공격접종 후 맨드라미 추출물로 치료를 실시하는 실험군과 바이러스 공격접종 후 치료를 실시하지 않은 음성대조군 등 2가지 시험군으로 구분하였다.

마우스는 체중 18~21g의 자성 SPF BALB/c 마우스 (오리엔트, 한국)를 사용하였으며, 공격접종 바이러스는 감염 시 마우스에서 뚜렷한 임상증상과 높은 폐사율을 유발하는 사람유래 마우스 적응주인 인플루엔자 바이러스 A/PR/34 (H1N1)을 사용하였다. 바이러스 공격접종 시 마우스는 케타민 마취 후 역가 10^2.5 TCID₅₀/90 ㎕의 바이러스액을 각 90 ㎕/마리로 비강 접종하였다. 치료는 공격접종 4시간 전 투여를 시작으로 하여 15일간 위관삽입법으로 맨드라미 추출물이 10 mg/kg/day의 용량이 되도록 2회/day 치료하였다. 또한, 음성대조군은 치료제 대신 생리식염수를 1일 2회 위관삽입 하였다. 공격접종 후 접종동물은 2주간 사료소비량과 음수량을 매일 측정하고 또한 임상증상 및 폐사 마리수 등을 매일 관찰하여 치료효과를 산출하였다. 또한, 맨드라미 추출물 치료로 인한 바이러스 감소효과를 판정하기 위하여 각 그룹 당 5마리의 마우스로부터 공격접종 후 (역가 10^2.0 TCID₅₀/90 ㎕) 3일과 6일에 폐를 적출하여 폐경화도, 폐 무게 및 폐내 바이러스 함량을 측정하였다 (Sidwell RW et al., Antiviral Research, 51, pp179-187, 2001). 위관 삽입 투여에 따른 마우스 치료효과는 하기 표 24 및 표 25 에 나타내었다.

투여물	조성(mg/kg/day)	공격접종 역가(CCID50/ml)	체중(g) (mean±SD)		공격접종 결과
					생존율A
			접종전	접종후	폐사수/총두수	MDTB±SD
맨드라미추출물	10	102.5	21.1±1.4	13.1±1.0	1/10*	13.0±0.0
식염수	-		20.7±0.8	14.6±1.2	10/20	10.4±1.9
A 생존두수/접종두수 B Mean death time(day) *P<0.05 by Fisher's exact test(식염수 처리군 대비)

투여물 및 조성(mg/kg/day)		공격접종 역가(CCID50/ml)	평균병변지수(Mean lung parameters)
			Day 3			Day 6
			경화도A ±S.D	무게 (mg±S.D.)	바이러스역가(log10/g±S.D.)	경화도A±S.D	무게(mg±S.D.)	바이러스역가(log10/g±S.D.)
맨드라미추출물	10	102.0	0.0±0.0	148±10	7.4±0.3	1.64±0.7	194±23	5.8±0.3**
식염수	-		0.0±0.0	150±9.4	7.53±0.5	1.94±0.3	187±18	6.815±0.7
A 경화도(consolidation); 0(정상) - 4(짙은 보라색) *P<0.05; **P<0.01; ***P<0.001 by Fisher's exact test(식염수 처리군 대비)

표 24 에 나타난 바와 같이 맨드라미 추출물을 치료목적으로 시험군에 처리한 결과 맨드라미 추출물을 처리하지 않은 음성대조군과 비교하여 인플루엔자 바이러스 10^2.5 TCID₅₀/90ul 공격접종 시 통계학적으로 유의성 있는 (P<0.05) 폐사율의 감소 효과가 뚜렷하게 나타났다. 또한 표 25에 나타난 바와 같이 인플루엔자 바이러스 공격접종 후 3일과 6일 후 맨드라미 추출물을 처리한 시험군은 음성대조군에 비하여 폐내 바이러스 함량이 통계학적으로 유의성 있게 감소되었다 (P<0.05 이상).

본 발명의 맨드라미 추출물은 아래와 같은 제형으로 투여할 수 있으며, 아래의 제제 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 이에 의해 본 발명의 내용이 제한되는 것은 아니다.

제제예 1. 정제의 제조

맨드라미 60% 에탄올 추출물..................200㎎

유당........................................100㎎

전분........................................100㎎

스테아린산 마그네슘.........................적량

상기의 성분을 혼합하고 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조한다.

제제예 2. 캡슐제의 제조

맨드라미 60% 에탄올 추출물.................100㎎

유당........................................50㎎

전분........................................50㎎

탈크........................................2㎎

스테아린산 마그네슘.........................적량

상기의 성분을 혼합하고 통상의 캡슐제의 제조방법에 따라서 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조한다.

제제예 3. 액제의 제조

맨드라미 60% 에탄올 추출물......,........1000㎎

설탕........................................20g

이성화당....................................20g

레몬향......................................적량

정제수를 가하여 전체 1000㎖로 맞추었다.

통상의 액제의 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 갈색병에 충전하고 멸균시켜 액제를 제조한다.

제제예 4. 건강 식품의 제조

맨드라미 60% 에탄올 추출물..............1000 ㎎

비타민 혼합물.............................적량

비타민 A 아세테이트......................70 ㎍

비타민 E................................1.0 ㎎

비타민 B1..............................0.13 ㎎

비타민 B2..............................0.15 ㎎

비타민 B6...............................0.5 ㎎

비타민 B12..............................0.2 ㎍

비타민 C.................................10 ㎎

비오틴...................................10 ㎍

니코틴산아미드..........................1.7 ㎎

엽산.....................................50 ㎍

판토텐산 칼슘...........................0.5 ㎎

무기질 혼합물.............................적량

황산제1철..............................1.75 ㎎

산화아연...............................0.82 ㎎

탄산마그네슘...........................25.3 ㎎

제1인산칼륨..............................15 ㎎

제2인산칼슘..............................55 ㎎

구연산칼륨...............................90 ㎎

탄산칼슘................................100 ㎎

염화마그네슘...........................24.8 ㎎

상기의 비타민 및 미네랄 혼합물의 조성비는 비교적 건강식품에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만, 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하며, 통상의 건강식품 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 과립을 제조하고, 통상의 방법에 따라 건강식품 조성물 제조에 사용할 수 있다.

제제예 5. 건강 음료의 제조

맨드라미 60% 에탄올 추출물...............1000 ㎎

구연산...................................1000 ㎎

올리고당...................................100 g

매실농축액...................................2 g

타우린.......................................1 g

정제수를 가하여 전체......................900 ㎖

통상의 건강음료 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 약 1시간동안 85℃에서 교반 가열한 후, 만들어진 용액을 여과하여 멸균된 2ℓ 용기에 취득하여 밀봉 멸균한 뒤 냉장 보관한 다음 본 발명의 건강음료 조성물 제조에 사용한다.

상기 조성비는 비교적 기호음료에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만, 수요계층, 수요국가, 사용 용도 등 지역적, 민족적 기호도에 따라서 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하다.

본 발명의 맨드라미 추출물은 인플루엔자 A 바이러스 (influenza A viruses), 뉴캐슬병 바이러스 (newcastle disease virus), 닭 감염성 기관지염 바이러스 (infectious broncheitis virus), 조류 폐렴 바이러스 (avian pneumovirus), 돼지 생식 및 호흡 증후군 바이러스 (porcine reproductive and respiratory syndrome virus), 콕사키 바이러스 (coxsakie virus), 세망내피증 바이러스 (reticuloendotheliosis virus), 오제스키 바이러스 (aujeszky's disease virus) 및 아데노 바이러스 (adeno virus) 및 콕사키 바이러스 (coxsakie virus)의 감염 세포주를 이용한 시험관 내 (in vitro) 실험 및 상기 바이러스 감염 동물을 이용한 생체 내 (in vivo) 실험에서 바이러스 증식 억제 및 살바이러스에 의한 항바이러스 효과가 탁월하므로, 상기 바이러스의 체내 감염으로 유발되는 질환의 예방 및 치료용 약학 조성물 및 건강기능식품에 이용할 수 있다.

Claims (37)

1. 개맨드라미 (Celosia argentea), 깃털맨드라미 (Celosia plumosa) 또는 둥근맨드라미 (Celosia cristata) 추출물을 유효성분으로 함유하는 바이러스로 인한 질환의 예방 및 치료용 약학 조성물.
2. 제 1항에 있어서, 상기 추출물은 조추출물인 약학 조성물.
3. 제 2항에 있어서, 상기 조추출물은 물, C₁ 내지 C₄의 저급알콜 또는 이들의 혼합용매로부터 선택되어진 극성용매에 가용한 추출물인 약학 조성물.
4. 제 1항에 있어서, 상기 추출물은 디클로로메탄 또는 에틸 아세테이트에 가용한 추출물인 약학 조성물.
5. 삭제
6. 삭제
7. 제 1항에 있어서, 상기 바이러스는 RNA형 바이러스 또는 DNA형 바이러스인 약학 조성물.
8. 제 7항에 있어서, 상기 RNA형 바이러스는 인플루엔자 바이러스 (influenza virus), 뉴캣슬병 바이러스 (newcastle disease virus), 닭 전염성 기관지염 바이러스 (Chicken infectious broncheitis virus), 조류 폐렴바이러스 (avian pneumovirus), 돼지 생식기 및 호흡 증후군 바이러스 (porcine reproductive and respiratory syndrome virus), 콕사키 바이러스 (coxsakie virus) 또는 세망내피증 바이러스 (reticuloendotheliosis virus)로부터 선택된 바이러스인 약학 조성물.
9. 제 8항에 있어서, 상기 인플루엔자 바이러스는 H1N1, H9N2 또는 H6N5의 혈청형을 가짐을 특징으로 하는 약학 조성물.
10. 제 7항에 있어서, 상기 DNA형 바이러스는 오제스키병 바이러스 (aujeszky's disease virus) 또는 아데노 바이러스 (adeno virus) 또는 콕사키 바이러스 (coxsakie virus)인 약학 조성물.
11. 제 1항에 있어서, 바이러스로 인한 질환은 인플루엔자 바이러스, 뉴캣슬병 바이러스 (newcastle disease virus), 닭 전염성 기관지염 바이러스 (Chicken infectious broncheitis virus), 콕사키 바이러스 (coxsakie virus), 세망내피증 바이러스 (reticuloendotheliosis virus), 오제스키병 바이러스 (aujeszky's disease virus) 또는 아데노 바이러스 (adeno virus)의 체내 감염으로 인해 유발됨을 특징으로 하는 약학 조성물.
12. 제 11항에 있어서, 상기 인플루엔자 바이러스의 체내 감염으로 인해 유발되는 질환은 독감, 조류독감 또는 변이형 감염성 조류독감인 약학 조성물.
13. 제 11항에 있어서, 상기 뉴캣슬병 바이러스의 체내 감염으로 인해 유발되는 질환은 파라인플루엔자(Parainfluenza) 감염증 또는 사람 알에스 바이러스 (Respiratory syncytial virus) 감염증인 약학조성물.
14. 제 11항에 있어서, 상기 닭 전염성 기관지염 바이러스의 체내 감염으로 인해 유발되는 질환은 사람 호흡기 코로나 바이러스 감염증 또는 중증급성호흡기증후군(Severe Acute Respiratory Syndrome: SARS)인 약학 조성물.
15. 제 11항에 있어서, 상기 콕사키 바이러스의 체내감염으로 인해 유발되는 질환은 콕사키바이러스(Coxsackievirus) 감염증 또는 라이노바이러스 (Rhinovirus) 감염증인 약학 조성물.
16. 제 11항에 있어서, 상기 세망내피증 바이러스의 체내 감염으로 인해 유발되는 질환은 사람 면역결핍 바이러스 1형 또는 2형(human immunodeficiency virus type 1 & 2) 감염증인 약학 조성물.
17. 제 11항에 있어서, 상기 오제스키병 바이러스의 체내 감염으로 인해 유발되는 질환은 사람 단순포진 바이러스(human herpes simplex virus) 감염증 또는 사람 허피스 바이러스 6, 6A, 6B, 7형 (human herpesvirus 6, 6A, 6B, 7) 감염증인 약학 조성물.
18. 제 11항에 있어서, 상기 아데노 바이러스의 체내 감염으로 인해 유발되는 질환은 사람 호흡기 감염증 또는 사람 유행성 각결막염 (Human Epidemic keratoconjunctivitis)인 약학 조성물.
19. 제 1항에 있어서, 조성물 총 중량에 대하여 상기 추출물이 0.1 ~ 50 중량% 포함되는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
20. 제 1항의 개맨드라미 (Celosia argentea), 깃털맨드라미 (Celosia plumosa), 또는 둥근맨드라미 (Celosia cristata) 추출물 및 식품학적으로 첨가 가능한 식품보조첨가제를 함유하는 바이러스로 인한 질환의 개선용 건강기능식품.
21. 제 20항에 있어서, 상기 추출물은 조추출물인 건강기능식품.
22. 제 21항에 있어서, 상기 조추출물은 물, C₁ 내지 C₄의 저급알콜 또는 이들의 혼합용매로부터 선택되어진 극성용매에 가용한 추출물인 건강기능식품.
23. 제 20항에 있어서, 상기 추출물은 디클로로메탄 또는 에틸 아세테이트에 가용한 추출물인 건강기능식품.
24. 삭제
25. 삭제
26. 제 20항에 있어서, 상기 바이러스는 RNA형 바이러스 또는 DNA형 바이러스인 건강기능식품.
27. 제 26항에 있어서, 상기 RNA형 바이러스는 인플루엔자 바이러스 (influenza virus), 뉴캣슬병 바이러스 (newcastle disease virus), 닭 전염성 기관지염 바이러스 (Chicken infectious broncheitis virus), 조류 폐렴바이러스 (avian pneumovirus), 돼지 생식기 및 호흡 증후군 바이러스 (porcine reproductive and respiratory syndrome virus), 콕사키 바이러스 (coxsakie virus) 또는 세망내피증 바이러스 (reticuloendotheliosis virus)로부터 선택된 바이러스인 건강기능식품.
28. 제 27항에 있어서, 상기 인플루엔자 바이러스는 H1N1, H9N2 또는 H6N5의 혈청형을 가짐을 특징으로 하는 건강기능식품.
29. 제 26항에 있어서, 상기 DNA형 바이러스는 오제스키병 바이러스 (aujeszky's disease virus) 또는 아데노 바이러스 (adeno virus)인 건강기능식품.
30. 제 20항에 있어서, 바이러스로 인한 질환은 인플루엔자 바이러스, 뉴캣슬병 바이러스 (newcastle disease virus), 닭 전염성 기관지염 바이러스 (Chicken infectious broncheitis virus), 콕사키 바이러스 (coxsakie virus), 세망내피증 바이러스 (reticuloendotheliosis virus), 오제스키병 바이러스 (aujeszky's disease virus) 또는 아데노 바이러스 (adeno virus)의 체내 감염으로 인해 유발됨을 특징으로 하는 건강기능식품.
31. 제 20항에 있어서, 상기 인플루엔자 바이러스의 체내 감염으로 인해 유발되는 질환은 독감, 조류독감 또는 변이형 감염성 조류독감인 건강기능식품.
32. 제 20항에 있어서, 상기 뉴캣슬병 바이러스의 체내 감염으로 인해 유발되는 질환은 파라인플루엔자(Parainfluenza) 감염증 또는 사람 알에스 바이러스(Respiratory syncytial virus) 감염증인 건강기능식품.
33. 제 20항에 있어서, 상기 닭 전염성 기관지염 바이러스의 체내 감염으로 인해 유발되는 질환은 사람 호흡기 코로나 바이러스 감염증 또는 중증급성호흡기증후군(Severe Acute Respiratory Syndrome: SARS)인 건강기능식품.
34. 제 20항에 있어서, 상기 콕사키 바이러스의 체내감염으로 인해 유발되는 질환은 콕사키바이러스(Coxsackievirus) 감염증 또는 라이노바이러스 (Rhinovirus) 감염증인 건강기능식품.
35. 제 20항에 있어서, 상기 세망내피증 바이러스의 체내 감염으로 인해 유발되는 질환은 사람 면역결핍 바이러스 1형 또는 2형 (human immunodeficiency virus type 1 & 2) 감염증인 건강기능식품.
36. 제 20항에 있어서, 상기 오제스키 바이러스의 체내 감염으로 인해 유발되는 질환은 사람 단순포진 바이러스(human herpes simplex virus) 감염증 또는 사람 허피스 바이러스 6, 6A, 6B, 7형(human herpesvirus 6, 6A, 6B, 7) 감염증인 건강기능식품.
37. 제 20항에 있어서, 상기 아데노 바이러스의 체내 감염으로 인해 유발되는 질환은 사람 호흡기 감염증 또는 사람 유행성 각결막염 (Human Epidemic keratoconjunctivitis)인 건강기능식품.

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