KR101317318B1

KR101317318B1 - 신종인플루엔자, 조류인플루엔자, 일반 및 독감감기, ｓａｒｓ 바이러스 억제 효능을 갖는 오배자 추출물 또는 이로부터 분리된 화합물을 유효성분으로 함유하는 약학 조성물

Info

Publication number: KR101317318B1
Application number: KR1020110036241A
Authority: KR
Inventors: 박현; 김경민; 송현옥; 김성연
Original assignee: 원광대학교산학협력단
Priority date: 2011-04-19
Filing date: 2011-04-19
Publication date: 2013-10-14
Also published as: WO2012144754A2; WO2012144754A3; KR20120118707A

Abstract

본 발명은 항바이러스를 갖는 조성물에 관한 것으로, 상세하게는 오배자(Galla Rhois)의 추출물 또는 이로부터 분리된 화합물을 유효성분으로 함유하는 본 발명의 조성물은 신종인플루엔자바이러스, 조류인플루엔자바이러스 및 코로나바이러스에 대한 뛰어난 항바이러스 효과를 나타내므로 신종인플루엔자바이러스, 조류인플루엔자바이러스 및 인체 감염형 혹은 인수 공통 감염형 코로나바이러스에의 예방 및 치료를 위한 약학 조성물 또는 건강기능식품으로 유용하게 이용될 수 있다.

Description

신종인플루엔자, 조류인플루엔자, 일반 및 독감감기, ＳＡＲＳ 바이러스 억제 효능을 갖는 오배자 추출물 또는 이로부터 분리된 화합물을 유효성분으로 함유하는 약학 조성물 {A composition comprising the extract of Galla Rhois or the compounds isolated therefrom showing inhibiting activity of novel influenza, avian influenza, or SARS syndrome}

본 발명은 오배자 추출물 또는 이로부터 분리된 화합물을 유효성분으로 함유하는 계절 독감, 신종인플루엔자바이러스, 조류인플루엔자바이러스 및 일반 감기나 중증급성호흡기증후군(SARS)을 일으키는 인체 감염형 혹은 인수 공통 감염형 코로나바이러스의 예방 및 치료용 약학 조성물 또는 건강기능식품에 관한 것이다.

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인플루엔자 바이러스(Influenza virus)는 오르소믹소 계통(Family Orthomyxoviridae)에 속하는 RNA 바이러스로서 혈청형은 A형, B형, C형 등 3가지로 구분된다. 그 중 B형과 C형은 사람에서만 감염이 확인되고 있으며, A형은 사람, 말, 돼지, 기타 포유류 그리고 다양한 종류의 가금과 야생조류에서 감염이 확인되고 있다(Selmons et al., Avian Dis., 18(1), pp119-124, 1974; Webster RG et al., Microbiol Rev., 56(1), pp152-179, 1992).

A형 인플루엔자 바이러스의 혈청형은 바이러스 표면의 두 가지 단백질인 햄어글루티닌(Hemagglutinin: HA), 뉴라미니다제(Neuraminidase: NA)의 종류에 따라 구분되며, 혈청형에 따라 144종류(HA 단백질 16종과 NA 단백질 9종)로 분류할 수 있다. HA는 바이러스가 체세포에 부착하는 역할을 하며, NA는 바이러스가 감염된 세포로부터 발아해 다른 세포 내로 침투할 수 있도록 한다(Alexander DJ, Vet. Microbiol., 74(1-2), pp3-13, 2000). A형 인플루엔자 바이러스의 정상적인 자연숙주는 오리, 갈매기 등과 같은 야생 물새류로 알려져 있으며, 전 세계적으로 야생조류에 대한 인플루엔자 바이러스 감염 역학조사를 실시한 결과 현존하는 모든 16종의 HA형과 9종의 NA형 인플루엔자 바이러스가 야생조류에서 감염되고 있음이 확인되었다(Selmons et al., Avian Dis., 18(1), pp119-124, 1974). A형으로 분류되는 조류인플루엔자 바이러스는 인수(人獸) 공통 감염병 바이러스로, 닭에 감염 시 병원성에 따라 가벼운 호흡기 증상을 유발하는 비병원성 조류인플루엔자 바이러스, 1~30% 내외의 폐사와 산란 저하를 유발하는 저병원성 조류인플루엔자 바이러스(Low pathogenic avian influenza: LPAI) 그리고 95% 이상의 높은 치사성을 보이고 "조류독감(버드플루: Bird flu)"이라고도 불리는 고병원성 조류인플루엔자 바이러스(Highly pathogenic avian influenza: HPAI)등 크게 3가지 병형으로 구분하고 있다(Alexander DJ, Vet. Microbiol., 74(1-2), pp3-13, 2000). 이중 고병원성 조류인플루엔자 바이러스는 국제수역사무국(OIE)에서 A 등급으로, 국내에서는 제1종 가축전염병으로 분류하고 있다.

사람 인플루엔자에 대한 최초의 기록은 기원전 412년으로 거슬러 올라가나, 인류 최초의 인플루엔자 대유행(pandemic influenza) 기록은 1173년부터 1174년에 유럽 전역에서 발생한 것으로 추정하고 있다(Grmek MD, Les Maladies a L'aube de la Civilization Accidentale, Payot, Paris, 1893). 20세기에 접어들면서 인플루엔자에 대한 기록이 보다 과학적으로 다루어지면서 남겨진 자료를 근거해 보면 20세기 이후 지금까지 사람에서 3번의 인플루엔자 바이러스 대유행이 있었다. 1918년부터 1920년 사이에 전 세계적으로 유행한 20세기 이후의 1차 인플루엔자 대유행(일명 스페인 독감)은 인류가 겪은 가장 큰 피해로 기록되고 있으며 그 기간 중 2천만 명에서 5천만 명의 사람이 사망하였다(Walter JH, Bull. NY Acad. Med., 54, pp855-864, 1978). 스페인 독감의 원인 바이러스는 지금도 매년 전 세계적으로 유행하고 있는 유행성 독감의 주된 유행주로서 돼지인플루엔자 바이러스와 매우 유사한 혈청형인 A/H1N1으로 판명되었으나, 스페인 독감 원인 바이러스의 RNA 폴리머라제(poymerase) PA, PB1, PB2 서브유닛(subunit)은 조류에서 유래한 것으로 이 바이러스가 적응과정(Adaptation)을 거치는 동안 변이가 일어나서 사람에게 감염되었다는 것이 보고되었다(Taubenberger JK et al., Nature, 437, pp889-893, 2005). 1957년부터 1958년 사이에 발생한 20세기 이후의 2차 인플루엔자 바이러스 대유행은 중국에서 시작하여 6-7개월 사이에 해안을 따라 인근의 홍콩, 싱가포르, 일본, 대만 등지로 급속도로 전파되었다. 이 기간 중 전 세계 인구의 약 40-50% 정도가 감염되었으며, 그중 25% 정도가 임상증상을 보였고, 주로 유아층이나 중장년층들만이 감염되어 사망하였으며, 그 기간 중 약 1백만명의 사람이 사망하였다(Potter CW, J. appl. Microbiol., 91, pp572-579, 2001). 원인 바이러스는 혈청형 A/H2N2 인플루엔자 바이러스로 확인되었다. 또한 1968부터 1969년 사이에 발생한 3차 인플루엔자 바이러스 대유행은 홍콩에서 유래된 것으로 확인되었으며 대만, 필리핀, 싱가포르, 베트남 등지로 급속히 전파되었다. 원인 바이러스는 혈청형 A/H3N2 바이러스로서 이전의 혈청형 H2N2 바이러스와 HA형이 다른데, 이 HA형은 조류로부터 전달된 것으로 분석되고 있으며, 지금도 매년 전 세계적으로 유행하고 있는 유행성 독감의 주된 유행주이다(Oxford JS, Rev. Med. Virol., 10(2), pp119-133, 2000).

조류에서 주로 문제시되고 있는 조류인플루엔자바이러스 중 일부 혈청형은 사람에 감염되어 독감증세를 보이다가 사망을 유발하기도 한다. 현재까지 "홍콩조류독감"이라 불리고 있는 혈청형 A/H5N1을 포함하여 혈청형 A/H7N7, 그리고 혈청형 A/H9N2 등 총 3종의 조류 유래 조류 독감 바이러스 중 일부의 변종 바이러스들이 인체에 감염될 가능성이 있는 것으로 추정되고 있다. 따라서 현재 이들 3종의 혈청형에서 유래된 변종 바이러스에 대한 연구가 전 세계적으로 진행되고 있는 실정이다(Suarez DL et al., J. Virol., 72(8), pp6678-6688, 1998).

최근 베트남에서 보고되고 있는 조류 독감 바이러스(혈청형 A/H5N1 조류 인플루엔자 바이러스 바이러스)의 종속간의 장벽을 뛰어넘는 인체감염 사례는 20세기 이후의 4차 사람 인플루엔자 대유행의 전주곡으로서 전 세계가 현재 이 인체감염이 가능한 변이 바이러스의 사람에서 사람으로의 직접전염 등 그 전파양상에 주목하고 있다. 이 변이 바이러스는 혈청형 A/H5N1이 속하는 조류 인플루엔자 바이러스이며, 이 바이러스 역시 인류가 처음으로 경험하는 지금까지 조류에서만 유행하던 조류 인플루엔자 바이러스이기 때문이다.

인플루엔자 바이러스는 호흡기에 감염되어 전신증상을 일으키고, 주기적으로 모습을 바꿀 뿐 아니라, 숙주를 죽이지 않고 숙주가 죽기 전에 다른 숙주로 이동하기 때문에 과학자들은 인플루엔자 바이러스는 인류의 종말까지 살아남는 바이러스일 것으로 추측한다. 인류에게 가장 큰 경제적 손실을 가져오는 바이러스이며 예방백신이 개발되어 있기는 하지만 바이러스의 변이를 따라 잡지는 못하고 있는 실정이며, 아직 근본적인 바이러스 치료는 이루어지지 않고 있다.

아만타딘(amantadine)과 리만타딘(rimantadine)은 인플루엔자 바이러스의 M2 이온채널 단백의 기능을 억제하는 물질로 생체 내 인플루엔자 바이러스 바이러스의 증식을 억제하는 대표적인 항바이러스 제제들이다. 그러나 이들 두 가지 항바이러스 제제들은 혈청형 A형 인플루엔자 바이러스에만 효과적이며, M2 단백질이 없는 혈청형 B형 인플루엔자 바이러스에는 효과가 없는 것으로 확인되었다. 또한 아만타딘과 리만타딘은 사용 시 인플루엔자 바이러스 M2 단백질의 이온채널기능에 영향을 미치지 못하는 변이 바이러스의 출현이 매우 쉽게 일어나는 단점이 있는 것으로 확인되고 있다. 2005-2006년의 독감시즌에 91%의 인플루엔자 바이러스가 아만타딘과 리만타딘에 내성이 있었으므로 CDC에서는 이 시기에 아만타딘과 리만타딘 사용중단을 권하였다(MMWR Morb Mortal Wkly Rep., 55, pp44-46, 2006). 이러한 단점을 보완하기 위하여 개발된 자나미비르(zanamivir)와 오셀타미비르(oseltamivir)는 인플루엔자 바이러스의 뉴라미니다제(neuraminidase) 단백질의 기능을 억제하는 물질로 생체 내 인플루엔자 바이러스의 증식을 억제하는 대표적인 항바이러스 제제들이다. 이들 두 가지 항바이러스제제들은 16종의 모든 혈청형 A형 인플루엔자 바이러스 바이러스와 혈청형 B형 인플루엔자 바이러스 바이러스에도 효과적인 것으로 알려져 있다. 그러나 자나미비르는 흡입 및 정맥 투여해야 하는 단점이 있으며, 오셀타미비르는 경구투여가 가능하나 최근 내성 바이러스의 출현 보고와 경구투여 시 구토와 현기증 등의 부작용이 있어 단점으로 지적되고 있다(Ward P et al., J. antimicrob. Chemother., 55(supp1), pp5-21, 2005). 따라서 새로운 항인플루엔자 제제 개발의 필요성이 지속적으로 대두되고 있다.

인플루엔자 바이러스의 RNA 폴리머라제(RNA polymerase)는 바이러스의 유전전달물질인 RNA 합성에 매우 중요한 효소이다. 따라서 뉴라미니다제의 기능을 억제하는 항바이러스 제제의 개발과 함께 많은 항바이러스 제제의 개발이 RNA 합성을 저해하는 방향으로 이루어왔다. RNA 합성을 저해하는 방법은 크게 두 가지로 나누어 생각해 볼 수 있는데, 첫째는 뉴클레오시드 아날로그(nucleoside analog)로서, 이들은 RNA를 합성할 때 재료로 쓰이는 네 가지 뉴클레오베이스(nucleobase)인 아데닌(Adenine), 티아민(Thymine), 시토신(Cytosine), 구아닌(Guanine)과 비슷한 뉴클레오시드(nucleoside) 구조를 가지고 있어 RNA 합성 시에 마치 뉴클레오베이스처럼 끼어들어갈 수 있지만 당구조가 달라서 RNA 합성은 지속되지 않는다(Clercq ED, Nature Rew; Drug Discovery, 5, pp1015-1025, 2006). 두 번째는 RNA 폴리머라제 자체를 저해하는 방법이다. RNA 폴리머라제는 PA, PB1, PB2 세 개의 서브유닛(subunit)으로 이루어져 있으며 이들 서브유닛 간의 결합을 통해 최종 활성형의 단백질이 된다(Obayashi E et al., Nature, 455, pp1127-1132, 2008). 최근에는 RNA 폴리머라제의 구조 및 이들 서브유닛 간의 결합 모드가 밝혀지면서 구조를 기반으로 하는 RNA 폴리머라제의 저해제 개발이 활발히 이루어지고 있다.

코로나바이러스는 다양한 형태로 직경 100~160nm 크기의 단일 가닥 RNA 바이러스이다. 바이러스 외피로부터 표출되어있는 곤봉 모양의 돌기 때문에 왕관모양처럼 보이는 데에서 그 이름이 유래되었다. 코로나바이러스는 3가지 항원군으로 나누어지는데, 대표적인 동물 감염형 코로나바이러스로는 쥐와 같은 설치류에서 위장, 간, 신경계에 감염되어 병리현상을 일으키는 종인 MHV(혈청군 II)가 있다. 그 중 MHV-JHM과 MHV-A59 균주가 가장 많이 연구되었는데 그 이유는 신경계에 감염하여 뇌척수염이나 뇌경색 등을 일으키는데 이 병리현상이 사람의 병리현상과 매우 유사하기 때문이다. 사람에서 감기를 일으키는 HCoV-229E와 HCoV-OC43 코로나바이러스 균주는 각각 혈청군 I과 II에 속하는 사람분리주로서 아미노펩티다제(Aminopeptidase) N 수용체 또는 시알산(Sialic acid) 수용체를 통해 비인두의 섬모화 상피세포를 감염시킨다. 최근 코로나바이러스 HCoV-NL63(I군)와 HCoV-HKUI(II군)이 급성호흡기질환으로 입원한 환자에서 추가로 분리되었다(van der Hoek et al., 2004 Nature Med., 10, pp68-373, 2004; Woo et al., J. Virol., 79, pp884-895, 2005; Fouchier et al., PNAS, 101, pp6212-6216, 2004). 2002~2003년 사스(SARS)로 알려진 코로나바이러스 관련 질환의 유행이 있었다. 중국 남부에서 시작된 유행이 아시아, 유럽 및 아메리카의 28개국으로 펴져 약 8천 명의 환자가 발생되었다. 이러한 사스 코로나바이러스(SARS-CoV)의 자연계 병원소는 말굽박쥐(Horseshoe bat)로 추정되며 사향고양이(Palm civet)와 같은 감염된 동물과 사람이 접촉하면서 유행이 시작된 것으로 생각되고 있다. 즉 사스 코로나바이러스는 인수 공통 감염병을 일으킬 수 있는 바이러스이다. 사스 코로나바이러스는 엔지오텐신(angiotensin) 전환효소 2 수용체를 통하여 사람 호흡기를 감염시키는데 그 전파기전은 완전하게 밝혀져 있지 않고, 입증된 치료법 또한 없다. 리바비린(Ribavirin)이 자주 사용되어왔지만 SARS-CoV에 대한 시험관 내 효과가 거의 없고 질환의 경과에도 효과가 없었다(Fauci et al., Harrison's Principle of Internal Medicine, 17th Ed., Vol 1, pp1362-1364, 2009; Knipe DM and Howley PM, Fields Virology, 5th Ed., Vol1, pp1307-1323, 2007). 이렇듯 인체에 감염되어 감기 증상을 일으키는 코로나바이러스에 대한 뚜렷한 치료제가 없는 바, 항인플루엔자 제제와 마찬가지로 인체 감염형 코로나바이러스에 대한 항코로나바이러스 제제의 개발도 요구되고 있다.

본 발명자들은 새로운 항인플루엔자 및 항코로나바이러스 제제 개발의 필요성이 지속적으로 요구되는 현 상황에서 기존의 화합물과는 전혀 다르고 독성도 적으며 신규 타깃이 될 수 있는 신규 물질로 천연물 성분을 고려하였다. 천연물 성분을 이용한 개발은 화학 합성물 탐색을 이용한 유기 합성 물질 유래 제제 개발보다 상대적으로 적은 비용을 투입하고도 개발 성공 가능성이 높으며, 합성 신약의 개발에 비해 천연물 의약의 개발은 연구 개발비와 소요 기간에 있어서 경제적이다. 또한 천연물 신약이 초기질환 및 감염질환의 예방 목적으로 선호됨에 따라 시장이 급속히 성장하고 있으며 기존 항바이러스 제제의 장기 투여에 따른 부작용 및 내성 문제를 대체할 수 있을 것으로 기대된다.

이에 본 발명자들은 천연약품자원으로부터 항바이러스 효과를 갖는 물질을 확인하던 중 본 발명자들에 의해 특허등록된 바 있는 오배자 추출물 및 이로부터 분리된 화합물들의 효능에 대해 집중 연구하였다. 기존 특허에서 본 발명자들은 오배자 추출물 및 이로부터 분리된 화합물들이 돼지 호흡기 또는 소화기 질환에 뛰어난 항균 및 항바이러스 효과를 나타냄을 확인한 바가 있다(한국특허등록 제 10-1008463호). 오배자는 옻나무과(Anacardiaceae)에 속하는 붉나무(Rhus javanica L.)의 잎에 오배자진딧물(Aphis chinensis J. Bell)이 자상(刺傷)을 주어생긴 벌레집을 말하는데, 우리나라 각지에 분포한다. 오배자의 형태를 보면, 외면은 회갈색으로 연한 털이 있고, 길이는 3~7cm, 폭 2~5cm, 두께 2mm 정도이며 단단하면서도 쉽게 부숴 진다. 속은 대개 비어 있거나 회백색의 죽은 벌레와 분비물이 남아 있을 때도 있고, 역겨운 냄새가 나기도 한다. 채집한 오배자는 햇볕에 말리거나 삶거나 쪄서 사용된다. 주성분으로는 피로가롤 탄닌(pyrogallol tannin)이 50~70% 함유되어 있으며, 몰식자산, 갈산(gallic acid) 등이 있다. 약효로는 수렴, 지사, 지혈제로 설사, 가래, 당뇨, 하혈, 빈혈 등에 이용한다(정보섭 외, 향약대사전, pp. 380~384, 영림사, 1998).

따라서 본 발명에서는 오배자 추출물 또는 이로부터 분리된 화합물이 항인플루엔자 및 항코로나바이러스 효과를 나타내는지 연구하고 그 작용기전을 연구하였다. 본 발명에서는 오배자 추출물 및 이로부터 분리된 화합물로 신종인플루엔자바이러스, 조류인플루엔자바이러스 및 동물 감염형 코로나바이러스에 대한 항바이러스 실험을 수행한 바, 이들의 탁월한 항바이러스 효과를 확인하여 본 발명을 완성하였다.

상기한 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 생체에 독성 및 내성이 적고 항균 활성을 나타내는 오배자(Galla Rhois) 추출물(TCM-33) 또는 이로부터 분리된 화합물을 유효성분으로 함유하는 계절 독감 바이러스, 신종인플루엔자바이러스, 조류인플루엔자바이러스, 인체 감염형 혹은 인수 공통 감염형 코로나바이러스 또는 구내염바이러스에 기인한 질환의 예방 및 치료를 위한 약학 조성물을 제공한다.

본원에서 정의되는 계절 독감 바이러스 또는 신종인플루엔자바이러스는 A/H1N1, A/H2N2, A/H3N1, A/H3N2, A/H3N8 등이며 조류인플루엔자 바이러스는 A/H9N2 (A/Chicken/Korea/MS96/1996), A/H1N1, A/H5N1, A/H7N7, A/H7N2, A/H7N3 등(실제 조류인플루엔자 감염환자가 발생한 경우로서, 이론적으로는 16종류의 H와 9종류의 N의 조합을 통한 144종의 조류인플루엔자바이러스 subtype이 가능함)을 포함하며, 상기 인체 감염형 코로나바이러스는 HCoV-229E(I군), HCoV-NL63(II군), HCoV-OC43(II군), HCoV-HKUI(II군), SARS-CoV(II군)등을 포함한다. 이 외 구내염바이러스는 VSV형을 포함한다.

본원에서 정의되는 계절 독감 바이러스 또는 신종인플루엔자바이러스, 조류인플루엔자바이러스 또는 인체 감염형 혹은 인수 공통 감염형 코로나바이러스 또는 구내염바이러스에 기인한 질환은 계절 독감, 신종인플루엔자, 조류인플루엔자, 일반 감기 또는 중증급성호흡기증후군(SARS) 바람직하게는 신종인플루엔자, 조류인플루엔자 또는 중증급성호흡기증후군(SARS) 질환을 포함한다.

상기 질환은 사람을 포함한 포유동물에 발생하는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 오배자(Galla Rhois) 추출물(TCM-33) 또는 이로부터 분리된 화합물을 유효성분으로 함유하는 조성물은, 조성물 총 중량에 대하여 상기 추출물을 0.1 ~ 50 중량% 포함한다.

또한 본 발명은 오배자(Galla Rhois) 추출물(TCM-33)로부터 분리된 화합물은 하기 구조식 (1) 내지 (5)로 표기되는 갈산(gallic acid; 1), 파라 디 갈산과 메타 디 갈산의 복합물(a mixture of methyl p-digallic acid and methyl m-digallic acid; 2), 펜타 오-갈로일 글루코스(penta-O-galloyl glucose; 3), 에틸 갈레이트(ethyl gallate; 4) 또는 에틸 파라 디 갈레이트와 에틸 메타 디 갈레이트의 복합물(a mixture of ethyl p-digallate and ethyl m-digallate; 5), 바람직하게는 파라 디 갈산과 메타 디 갈산의 복합물(a mixture of p-digallic acid and m-digallic acid) 또는 에틸 파라 디 갈레이트와 에틸 메타 디 갈레이트의 복합물(a mixture of ethyl p-digallate and ethyl m-digallate), 보다 바람직하게는 이들의 1~2: 1 중량비의 복합물, 가장 바람직하게는 이들의 1: 1 중량비의 복합물을 유효성분으로 함유하는 신종인플루엔자바이러스, 조류인플루엔자바이러스 또는 인체 감염형 코로나바이러스에 기인한 질환의 예방 및 치료를 위한 약학 조성물을 제공한다.

또한, 상기 추출물은 물, 탄소수 1 내지 4의 저급알코올 또는 이들의 혼합용매로부터 선택된 용매, 바람직하게는 물, 에탄올 또는 이들의 혼합용매, 보다 바람직하게는 50 내지 90% 에탄올 혼합용매, 보다 더 바람직하게는 70 내지 80% 에탄올 혼합용매로 추출한 것을 포함한다.

이하, 본 발명의 추출물 및 화합물을 수득하는 방법을 상세히 설명한다.

본 발명의 오배자 추출물은, 건조된 오배자를 세절하여 건조 중량의 약 1 내지 30배, 바람직하게는 약 10 내지 20배의 물, 탄소수 1 내지 4의 저급 알콜 또는 이들의 혼합용매, 바람직하게는 물, 에탄올 또는 이들의 혼합용매, 보다 바람직하게는 50 내지 90% 에탄올 혼합용매, 보다 더 바람직하게는 70 내지 80% 에탄올 혼합용매로, 20 내지 100℃, 바람직하게는 80 내지 100℃ 추출온도에서 약 1시간 내지 10일, 바람직하게는 약 2시간 내지 5시간동안 냉침추출, 열수추출, 초음파 추출, 환류냉각 추출 등의 추출방법, 바람직하게는 환류냉각 추출방법을 이용하여 수득한 1 내지 5회, 바람직하게는 2 내지 3회 반복 추출한 후 감압 농축하여 본 발명의 오배자 추출물을 수득할 수 있다.

따라서, 본 발명은 상기 제조 방법 및 상기 제조방법으로부터 수득됨을 특징으로 하는 갈산(1), 파라 디 갈산과 메타 디 갈산의 복합물(2), 에틸 갈레이트(4) 및 에틸 파라 디 갈레이트와 에틸 메타 디 갈레이트의 복합물(5)의 함유비(4.3:1:7.2:16.3)로 구성되는 오배자 70% 에탄올 추출물(이하 GR70E이라 함)을 제공한다.

또한 본 발명의 화합물은, 상기 오배자 추출물을 수득하는 제 1단계; 상기 조추출물을 증류수에 녹인 후, 앰버라이트 XAD-2 수지 컬럼에 걸고 증류수, 50% 수성 에탄올 및 에탄올로 각각 용출하는 제 2단계; 제 2단계에서 수득한 50% 수성 에탄올 용출 분획물을 크로마토그래피를 수행하여 7개의 분획으로 나누는 제 3단계; 상기 제 3단계의 분획 중 첫 번째 분획을 크로마토그래피를 수행하여 3개의 분획으로 나누는 제 4단계; 상기 제 4단계의 분획물 중 첫 번째 분획을 실리카겔 컬럼 크로마토그래피로 분리하여 갈산을 수득하는 제 5단계; 상기 제 4단계의 분획물 중 두 번째 분획을 컬럼 크로마토그래피를 실시하여 파라 디갈산과 메타 디갈산의 복합물을 수득하는 제 6단계; 상기 제 4단계의 분획물 중 세 번째 분획을 컬럼 크로마토그래피를 실시하여 펜타 오-갈로일 글루코스를 수득하는 제 7단계; 상기 제 4단계의 분획물 중 네 번째 분획을 컬럼 크로마토그래피를 실시하여 에틸 갈레이트를 수득하는 제 8단계; 상기 제 4단계의 분획물 중 여섯 번째 분획을 컬럼 크로마토그래피를 실시하여 에틸 파라 디 갈레이트와 에틸 메타 디 갈레이트의 복합물을 수득하는 제 9단계의 제조 공정을 통해 본 발명의 오배자 추출물로부터 순수 분리된 화합물을 수득할 수 있다.

또한, 추가로 통상의 분획 공정을 수행할 수도 있다(Harborne J.B., Phytochemical methods: A guide to modern techniques of plant analysis, 3rd Ed., pp6-7, 1998).

본 발명은 상기의 제조방법으로 얻어진 오배자(Galla Rhois) 추출물 또는 이로부터 분리된 화합물을 유효성분으로 함유하는 신종인플루엔자바이러스, 조류인플루엔자바이러스 또는 인체 감염형 혹은 인수 공통 감염형 코로나바이러스에 기인한 질환의 예방 및 치료를 위한 약학 조성물을 제공한다.

본 발명의 오배자 추출물 및 이로부터 분리된 화합물은 독성 및 내성이 적으며 또한 신종인플루엔자바이러스, 조류인플루엔자바이러스 및 동물 감염형 코로나 바이러스에 대한 항바이러스 실험을 수행한 바, 이들의 탁월한 항바이러스 효과를 확인하였으므로 신종인플루엔자바이러스, 조류인플루엔자바이러스 및 인체 감염형 혹은 인수 공통 감염형 코로나바이러스에 기인한 계절 독감, 신종인플루엔자, 조류인플루엔자, 일반 감기 또는 중증급성호흡기증후군(SARS)의 치료 및 예방에 유용함을 확인하였다.

본 발명의 약학 조성물은, 조성물 총 중량에 대하여 상기 추출물 또는 화합물을 0.1 내지 50 중량%로 포함한다.

본 발명의 추출물 또는 화합물을 함유하는 약학 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다.

본 발명의 추출물 또는 화합물의 약학적 투여 형태는 이들의 약학적 허용 가능한 염의 형태로도 사용될 수 있고, 또한 단독으로 또는 타 약학적 활성 화합물과 결합뿐만 아니라 적당한 집합으로 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 추출물 또는 화합물을 함유하는 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 화합물을 함유하는 조성물에 함유될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골(macrogol), 트윈 (tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세롤젤라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 추출물 또는 화합물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 그러나 바람직한 효과를 위해서, 본 발명의 추출물 또는 화합물은 1일 0.0001 내지 100 ㎎/kg으로, 바람직하게는 0.001 내지 10 ㎎/kg으로 투여하는 것이 좋다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

본 발명의 추출물 또는 화합물은 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막 또는 뇌혈관 내(intracerebroventricular) 주사에 의해 투여될 수 있다.

또한, 본 발명은 오배자(Galla Rhois) 추출물 또는 이로부터 분리된 화합물을 유효성분으로 함유하는 신종인플루엔자바이러스, 조류인플루엔자바이러스 또는 인체 감염형 혹은 인수 공통 감염형 코로나바이러스에 기인한 질환의 예방 및 개선용 건강기능식품을 제공한다.

본 발명의 추출물 또는 화합물을 첨가할 수 있는 식품으로는, 예를 들어, 각종 식품류, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 건강 기능성 식품류 등이 있다.

또한, 코로나바이러스 및 인플루엔자 바이러스로 인한 질환의 예방 효과를 목적으로 식품 또는 음료에 첨가될 수 있다. 이 때, 식품 또는 음료 중의 상기 추출물의 양은 전체 식품 중량의 0.01 내지 15 중량%로 가할 수 있으며, 건강 음료 조성물은 100 ㎖를 기준으로 0.02 내지 5 g, 바람직하게는 0.3 내지 1 g의 비율로 가할 수 있다.

본 발명의 건강기능식품은 정제, 캡슐제, 환제, 액제 등의 형태를 포함한다.

본 발명의 건강 기능성 음료 조성물은 지시된 비율로 필수 성분으로서 상기 추출물 또는 화합물을 함유하는 외에는 다른 성분에는 특별한 제한이 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상술한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진등))및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100㎖당 일반적으로 약 1 내지 20g, 바람직하게는 약 5 내지 12g이다.

상기 외에 본 발명의 추출물 또는 화합물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그밖에 본 발명의 추출물 또는 화합물은 천연 과일 쥬스 및 과일 쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 그렇게 중요하진 않지만 본 발명의 추출물 100 중량부 당 0 내지 약 20 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.

상기에 언급한 바와 같이, 본 발명의 오배자 추출물 및 이로부터 분리된 화합물은 신종인플루엔자바이러스, 조류인플루엔자 바이러스 또는 인체 감염형 혹은 인수 공통 감염형 코로나바이러스에 기인한 질환에 대하여 뛰어난 항바이러스 효과를 나타내어 약학조성물 또는 건강기능식품으로 이용될 수 있다.

도 1은 RT-PCR과 plaque assay 통해 본 오배자 추출물로부터 분리된 5종 구성화합물의 항인플루엔자 바이러스 효과를 나타낸 도이고,
도 2는 코로나바이러스의 RNA 합성 억제 및 단백질 N과 M에 대한 억제 결과를 나타낸 도이고,
도 3은 Plaque assay 통해 본 OB-34, OB-36, OB-3131의 항코로나바이러스 효과를 나타낸 도이고,
도 4는 코로나바이러스인 MHV-A59와 MHV-JHM, 구내염바이러스인 VSV에 대한 OB-36, OB-3131의 항바이러스 시너지 효과를 나타낸 도이고,
도 5는 OB-34, OB-36, OB-3131의 항코로나바이러스 작용기전을 나타낸 도이다.

이하, 본 발명을 하기의 실시예 및 실험예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예 및 실험예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 오배자 조추출물의 제조

1-1. 오배자 물 추출물의 제조

익산시 소재 대학한약국에서 구입한 건조된 오배자를 분쇄기를 이용하여 입자의 크기가 30메시(mesh) 이하가 되도록 분쇄하여 오배자 분말을 수득한 후, 상기에서 수득한 건조된 오배자(30 g) 질량의 10배에 해당하는 증류수를 가하여 100℃에서 2시간 동안 환류 냉각 추출하고 여과 및 동결건조하여 20.0 g의 오배자 물 추출물(이하 G"라 명명함; 추출율 66.7%)을 수득하였다.

1-2. 오배자 에탄올 추출물의 제조

1-2-1. 70% 에탄올 추출물의 제조 ( TCM -33)

익산시 소재 대학한약국에서 구입한 건조된 오배자를 분쇄기를 이용하여 입자의 크기가 30메시 이하가 되도록 분쇄하여 분말을 수득한 후, 상기에서 수득한 건조된 오배자(30 g) 질량의 10배에 해당하는 70% 수성 에탄올을 가하여 100℃에서 2시간 동안 환류 냉각 추출하고 여과 및 감압 농축 (EYELA사, N-1000, 일본)하여 22.4 g의 오배자 에탄올 추출물(이하 GR70E"이라 명명함; 추출율 74.7%)을 수득하였다.

1-2-2. 30% 에탄올 추출물의 제조

추출용매로 30% 에탄올 추출용매를 사용하는 점만 달리하고 상기 제조공정과 동일하게 추출을 수행하여 오배자 30% 에탄올 추출물(이하 GR30E"이라 명명함;추출율 67.9%)을 수득하였다.

1-2-3. 50% 에탄올 추출물의 제조

추출용매로 50% 에탄올 추출용매를 사용하는 점만 달리하고 상기 제조공정과 동일하게 추출을 수행하여 오배자 50% 에탄올 추출물(이하 GR50E"이라 명명함;추출율 69.7%)을 수득하였다.

1-2-4. 100% 에탄올 추출물의 제조

추출용매로 100% 에탄올 추출용매를 사용하는 점만 달리하고 상기 제조공정과 동일하게 추출을 수행하여 오배자 100% 에탄올 추출물(이하 GR100E"이라 명명함;추출율 53.3%)을 수득하였다.

실시예 2. 오배자 추출물로부터 화합물의 분리

2-1. 수지에 의한 GR70E 의 분획물 제조

상기 실시예 1-2-1 단계에서 얻은 GR70E 37.3 g을 앰버라이트 XAD-2 수지 컬럼에 걸고 각각 1 ℓ의 증류수, 50% 에탄올 및 100% 에탄올을 용출용매로 사용하여 크로마토그래피를 실시하여 증류수, 50% 에탄올 및 100% 에탄올의 용출 분획을 얻었다.

2-2. 갈산의 분리( 화합물1 (“ OB -311”이라 함))

상기 실시예 2-1 단계에서 얻은 50% 에탄올 용출분획 2.5 g을 취하여 역상 YMC 컬럼에 걸고 메탄올:증류수(3:7→5:5→10:0,v/v)을 용출용매로 사용하여 크로마토그래피를 실시하여 박층 크로마토그래피에서 동일한 양상을 나타내는 것들을 합하고 농축하여 7개의 분획(A-G)으로 나누었으며, 이중 첫 번째 분획인 A(0.9 g)를 세파덱스 LH-20 컬럼에 걸고 클로로포름과 메탄올 (6:1→3:1→1:1,v/v)을 용출용매로 사용하여 크로마토그래피를 실시하여 3개의 이차 분획으로 소분획(A1~A3)하였다. 이차분획 중 첫 번째 분획인 A1 (30 mg)을 클로로포름:메탄올:증류수(6:1:0.1, v/v)를 용출용매를 사용하여 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피를 실시하여 화합물1(7 mg)을 수득하였고, 기기분석결과 하기 물성치를 갖는 갈산(gallic acid)임을 확인하였다(Cha et al., Kor. J. Pharmacogn., 31, pp185-189, 2000).

무색분말: (-)-ESI-MS m/z 169 [M-H]^-;

¹H-NMR(acetone-d ₆, 500 MHz): 7.06(2H, s, galloyl-2, 6).

2-3. 파라 디 갈산과 메타 디 갈산의 분리( 화합물2 (“ OB -312”이라 함))

상기 실시예 2-2 단계에서 얻은 2차 분획 중 두 번째 분획인 A2(80 mg)를 클로로포름:메탄올:증류수(4.5:1:0.1, v/v)를 사용하여 실리카겔 컬럼 크로마토그래피를 실시하여 화합물2(50 mg)를 수득하였고, 기기분석결과 하기 물성치를 갖는 파라 다이 갈산과 이의 아이소머인(isomer) 메타 다이 갈산(p- and m-digallic acid) 복합물임을 확인하였다(Nishizawa et al., J. Chem. Soc. Perkin Trans. I, pp2963-2968, 1982).

무색분말: (-)-ESI-MS m/z 321 [M-H]^-;

¹H-NMR(acetone-d ₆, 500 MHz): (p-digallic acid) 7.20(2H, s, galloyl-2', 6'), 7.11(2H, s, galloyl-2, 6); (m-digallic acid) 7.40(1H, d, J = 1.8 Hz, galloyl-2), 7.23(1H, d, J = 1.8 Hz, galloyl-6), 7.20 (2H, s, galloyl-2', 6');

¹³C-NMR(acetone-d ₆, 125 MHz): (p-digallic acid) 128.5 (C-1), 108.8 (C-2, 6), 150.4(C-3,5), 131.3(C-4), 168.0(C=O), 119.4(C-1'), 109.7 (C-2', 6'), 145.3(C-3',5'), 138.8(C-4'), 164.7(C'=O); (m-digallic acid) 121.0(C-1), 114.0(C-2), 146.1(C-3), 142.7(C-4), 138.8(C-5), 116.4(C-6), 167.7(C=O), 119.5(C-1'), 109.8(C-2', 6'), 145.4(C-3',5'), 139.0(C-4'), 164.22 (C'=O).

2-4. 펜타 오- 갈로일 글루코스의 분리( 화합물3 (“ OB -3131”이라 함)

상기 실시예 2-2 단계에서 얻은 2차 분획 중 세 번째 분획인 A3(460 mg)를 세파덱스 LH-20 컬럼에 걸고 메탄올을 용출용매로 사용하여 크로마토그래피를 실시하여 1개의 분획(A31)으로 정제하였다. A31을 역상 YMC 컬럼에 걸고 메탄올:증류수(4:6, v/v)을 용출용매로 사용하여 크로마토그래피를 실시하여 박층 크로마토그래피에서 동일한 양상을 나타내는 것들을 합하고 농축하여 4개의 분획(A311-A314)으로 나누었으며, 이중 세 번째 분획 A313(146 mg)을 메탄올:증류수(8:2→9:1→10:0, v/v)를 사용하여 세파덱스 LH-20 컬럼 크로마토그래피를 실시하여 화합물3(42 mg)를 수득하였고, 기기분석결과 하기 물성치를 갖는 팬타 오-갈오일 글루코스(penta-O-galloyl-β-D-glucopyranose)임을 확인하였다(Khanbabaee and Lotzerich, Tetrahedron, 53, pp10725-10732, 1997).

무색분말: (-)-ESI-MS m/z 939 [M-H]^-;

¹H-NMR(CD₃OD, 500 MHz): 7.10, 7.04, 6.97, 6.94, 6.89(each 2H, s, galloyl-2, 6), 6.23(1H, d, J = 8.2 Hz, H-1), 5.90(1H, t, J = 9.6 Hz, H-3), 5.61(1H, t, J = 9.6 Hz, H-4), 5.58(1H, t, J = 9.6 Hz, H-2), 4.35-4.51(3H, m, H-5, 6);

¹³C-NMR(CD₃OD, 125 MHz): 92.5(C-1), 70.8(C-2), 72.7(C-3), 68.4(C-4), 73.1(C-5), 61.8(C-6), 118.4, 118.8, 118.9, 119.0, 119.6(galloyl-1), 109.0, 109.1, 109.3(galloy-2, 6), 144.8, 144.9, 145.0, 145.1, 145.2(galloy-3, 5), 138.7, 138.8, 139.0, 139.1, 139.4(galloy-4), 164.9, 165.6, 165.7, 165.9, 166.6(C=O).

2-5. 에틸 갈레이트의 분리( 화합물4 (“ OB -34”이라 함)

상기 실시예 2-2 단계에서 얻은 분획 중 4 번째 분획인 D(430 mg)를 클로로포름:메탄올:증류수(9:1:0.1, v/v)를 사용하여 실리카겔 컬럼 크로마토그래피를 실시하여 화합물4(240 mg)를 수득하였고, 기기분석결과 하기 물성치를 갖는 에틸 갈레이트(ethyl gallate)임을 확인하였다(Redwane et al., J. Ethnopharmacol., 79, pp261-263, 2002).

무색분말: (-)-ESI-MS m/z 197 [M-H]^-;

¹H-NMR(acetone-d ₆, 500 MHz): 7.11(2H, s, galloyl-2, 6), 4.23(2H, q, J = 7.3 Hz, OCH₂), 1.30(3H, t, J = 7.3 Hz, CH₃);

¹³C-NMR(acetone-d ₆, 125 MHz): 121.3(C-1), 108.9(C-2, 6), 145.2(C-3, 5), 137.8(C-4), 60.0(OCH₂), 13.8(CH₃), 165.9(C=O).

2-6. 에틸 파라 디 갈레이트와 에틸 메타 디 갈레이트의 분리( 화합물5 (“ OB -36" 이라 함))

상기 실시예 2-2 단계에서 얻은 분획 중 6 번째 분획인 F(190 mg)를 역상 YMC 컬럼에 걸고 메탄올:증류수(4:6, v/v)을 용출용매로 사용하여 크로마토그래피를 반복 실시하여 화합물5(15.6 mg)를 수득하였고, 기기분석결과 하기 물성치를 갖는 에틸 파라 디 갈레이트와 이의 아이소머인(isomer) 에틸 메타 디 갈레이트(ethyl p- and m-digallate)혼합물임을 확인하였다(Nishizawa et al., J. Chem. Soc. Perkin Trans. I, pp2963-2968, 1982; Yang et al., Yaoxue Xuebao, 34, pp457-462, 1999).

무색분말: (-)-ESI-MS m/z 349 [M-H]^-;

¹H-NMR(acetone-d ₆, 500 MHz): (ethyl p-digallate) 7.25(2H, s, galloyl-2', 6'), 7.17(2H, s, galloyl-2, 6), 4.29(2H, q, J = 7.3 Hz, OCH₂), 1.33(3H, t, J = 7.3 Hz, CH₃); (ethyl m-digallate) 7.44(1H, d, J = 1.8 Hz, galloyl-2), 7.33(1H, d, J = 1.8 Hz, galloyl-6), 7.26(2H, s, galloyl-2', 6'), 4.27(2H, q, J = 7.3 Hz, OCH₂), 1.31(3H, t, J = 7.3 Hz, CH₃);

¹³C-NMR(acetone-d ₆, 125 MHz): (ethyl p-digallate) 128.3(C-1), 108.8(C-2, 6), 150.4(C-3,5), 131.5(C-4), 165.5(C=O), 119.9(C-1'), 109.8(C-2', 6'), 145.3(C-3',5'), 139.0(C-4'), 60.4(OCH₂), 13.8(CH₃), 164.1(C'=O); (ethyl m-digallate) 121.1(C-1), 113.6(C-2), 146.1(C-3), 142.5(C-4), 138.5(C-5), 116.4(C-6), 165.3(C=O), 120.0(C-1'), 109.9(C-2', 6'), 145.2(C-3',5'), 138.7(C-4'), 60.6(OCH₂), 13.7(CH₃), 163.4(C'=O).

실험예 1. 조류인플루엔자 바이러스 저해 활성 시험

상기 실시예에서 얻은 시료들의 조류인플루엔자 바이러스에 대한 억제활성을 확인하기 위하여 문헌에 개시된 방법을 응용하여 하기와 같이 실험하였다(Choi JQ et al., J. of Veterinary Science, 9(1), pp67-74, 2008).

국내에서 분리된 조류인플루엔자 바이러스(A/Chicken/Korea/MS96/1996(H9N2); Dr. Sun Joon Kim [서울대학교]로부터 분양받음)를 사용하여 2x10⁶ EID₅₀/0.2 ml 함량의 조류인플루엔자 바이러스와 동량을 혼합하고 실온에서 45분 동안 반응시킨 후 생존한 바이러스 함량을 종란에 접종하는 방법으로 진행되었다.

오배자 추출물의 조류인플루엔자 사멸 효과

samples	시료농도에 따른 조류인플루엔자 사멸 효과 검색(mg/ml)
samples	25	12.5	6.25	3.13	1.56	바이러스
TCM-33	-	0/5	0/5	5/5	5/5	5/5

본 조류인플루엔자바이러스(AIV)의 사멸효능을 조사한 결과, 오배자 추출물이 6.25 mg/ml 농도까지 사멸효능이 있는 것으로 확인되었다.

실험예 2. 오배자 추출물로부터 얻은 화합물들의 항인플루엔자 바이러스 (A/ H1N1 ) 효능 시험

상기 실시예에서 오배자 추출물로부터 얻은 화합물들의 인플루엔자 바이러스에 대한 항바이러스 효능을 확인하기 위하여 문헌에 개시된 방법을 응용하여 하기와 같이 실험하였다(Hoffmann et al., Arch. Virol., 146, pp2275-2289, 2001).

인플루엔자바이러스(A/human/korea/KUMC-33/2006/H1N1, 분양기관: 병원성바이러스은행[주관기관,고려대학교])를 세포에 감염시킨 후 일정 시간 동안 방출된 바이러스를 모아서 폴리에틸렌 글리콜(PEG; Polyethylene glycol 8000, Usb corporation)로 바이러스를 침전시킨 후 바이러스 RNA (Viron RNA)를 추출하였다. NS segment에 특이적인 primer를 제조해 RT-PCR을 수행한 결과, 비처리군 세포 및 DMSO 만을 처리한 세포에서는 NS segment의 바이러스 RNA가 검출되었으나 오배자 추출물로부터 분리된 화합물(OB-34, OB-36, OB-311, OB-312, OB-3131)을 처리한 세포 샘플에서는 NS segment의 바이러스 RNA가 검출되지 않아, 인플루엔자 A 바이러스(H1N1)에 대해 항바이러스 효능이 있음을 입증하였다(도 1참조).

인플루엔자바이러스(A/human/korea/KUMC-33/2006/H1N1, 분양기관: 병원성바이러스은행[주관기관,고려대학교])를 세포에 감염시킨 후 오배자 에탄올 추출물로부터 분리된 화합물(OB-34, OB-36, OB-311, OB-312, OB-3131)을 함께 처리하였다. 바이러스를 감염시킨 세포는 배양기에서 일정 시간 동안 더 배양한 후, 약제에 의해 바이러스방출이 감소되었는지를 플라크분석법(Plaque assay)으로 조사하였다. 조사결과, 오배자 추출물로부터 분리된 화합물(OB-34, OB-36, OB-311, OB-312, OB-3131)을 처리하였을 때 인플루엔자 A 바이러스(H1N1)의 방출양이 대조군(DMSO)에 비해 현저히 감소해 인플루엔자 A 바이러스(H1N1)에 대해 항바이러스 효능이 있음을 입증하였다(도 1 참조).

실험예 3. 오배자 추출물의 항코로나바이러스 효과 시험

상기 실시예에서 얻은 오배자 추출물의 항코로나 바이러스 효과를 확인하기 위하여 문헌에 개시된 방법을 응용하여 하기와 같이 실험하였다(Kim et al., J. Clin. Virol., 41, pp112-118, 2008; Kim et al., Antiviral therapy, 15, pp697-709, 2010).

세포에 MHV-A59와 MHV-JHM 코로나바이러스 균주 및 VSV 구내염바이러스 균주를 감염시킨다. 이때 오배자 추출물을 함께 처리하고 바이러스를 감염시킨 세포는 배양기에서 일정 시간 동안 배양한 후, 약제에 의해 바이러스방출이 감소되었는지를 플라크분석법(Plaque assay)으로 조사하였다. 조사 결과, 오배자 추출물이 대조물질인 리바비린(Ribavirn)보다 항코로나바이러스 효과가 더 우수함을 입증하였다(표 2 참조).

오배자 추출물의 다양한 균주(MHV-A59 과 MHV-JHM은 Dr. Shinji Makino [U of Texas Medical Branch, Galveston, TX, USA]로부터 분양받음)에 대한 항코로나바이러스 효과

samples	Relative titer of released virus
samples	MHV-A59	MHV-JHM	VSV
Virus only	100.0	100.0	100.0
DMSO	103.0±7.9	91.1±7.8	98.7±21.0
TCM-33 (100 ug/ml)	0.003±0.0008
Ribavirin (50 ug/ml)	16.0±4.6	0.3131±0.06	10.2±0.9

실험예 4. 오배자 추출물의 항코로나바이러스 작용기전 시험

상기 실시예에서 얻은 오배자 추출물의 항 코로나바이러스에 대한 작용기전을 학인하기 위하여 문헌에 개시된 방법을 응용하여 하기와 같이 실험하였다(Kim et al., J. Clin. Virol., 41, pp112-118, 2008; Kim et al., Antiviral therapy, 15, pp697-709, 2010).

바이러스 RNA는 Northern blotting 방법으로, 바이러스 단백질은 Western blotting 방법을 시행하였다. Northern blotting을 위해 바이러스가 감염된 세포에서 RNA를 추출하고 변성시킨 후 아가로즈 겔(agarose gel)에 전기영동 한다. 이 후 나이론 멤브레인(nylon membrane)으로 옮겨 MHV 코로나바이러스 균주에 특이적인 ³²P-labeled random-primed probe를 사용하여 RNA를 검출하였다. Western blotting을 위해 바이러스가 감염된 세포를 용해시켜 단백질을 분리한 후 SDS-PAGE로 전기영동 한다. 멤브레인에 옮겨 MHV 코로나바이러스 균주의 S, M, N 단백질에 대한 항체로 해당 단백질의 유무를 판단하였다.

오배자 추출물이 코로나바이러스의 RNA 합성을 억제함을 Northern blotting을 통해 관찰하였으며, 결과적으로 구조 단백질인 N과 M 단백질 합성도 억제함을 Western blotting으로 확인하였다(도 2 참조).

실험예 5. 오배자 추출물로부터 분리된 화합물들의 항코로나바이러스 효과

상기 실시예에서 얻은 오배자 추출물로부터 분리된 화합물들의 항코로나바이러스 효과를 확인하기 위하여 문헌에 개시된 방법을 응용하여 하기와 같이 실험하였다(Kim et al., J. Clin. Virol., 41, pp112-118, 2008; Kim et al., Antiviral therapy, 15, pp697-709, 2010).

세포에 MHV-A59와 MHV-JHM 코로나바이러스 균주 및 VSV 구내염바이러스 균주를 감염시킨다. 이때 오배자 추출물과 오배자 추출물로부터 분리된 화합물(OB-34, OB-36, OB-311, OB-312, OB-3131)을 함께 처리하였다. 바이러스를 감염시킨 세포는 배양기에서 일정 시간 동안 더 배양한 후, 약제에 의해 바이러스방출이 감소되었는지를 플라크분석법(Plaque assay)으로 조사하였다.

OB-34, OB-36, OB-3131의 세 가지 화합물은 대조물질인 리바비린과 비교해, 코로나바이러스에 대한 항바이러스 효능이 최대 1,000배까지 높음을 확인할 수 있었고, 또한 OB-3131은 코로나바이러스 외에도 VSV (음성가닥 RNA 바이러스인 rhabodoviridae과의 바이러스) 구내염바이러스 균주의 증식도 억제함을 확인할 수 있었다(도 3 및 표 3참조).

오배자 추출물로부터 분리된 화합물들의 다양한 균주(MHV-A59 과 MHV-JHM은 Dr. Shinji Makino [U of Texas Medical Branch, Galveston, TX, USA]로부터 분양받음)에 대한 항코로나바이러스 효과

samples	Relative titer of released virus
samples	MHV-A59	MHV-JHM	VSV
Virus only	100.0	100.0	100.0
DMSO	103.0±7.9	91.1±7.8	98.7±21.0
TCM-33 (100 ug/ml)	0.003±0.0008
OB-311 (100 uM)	71.8±6.7	6.3±9.9	65.7±11.6
OB-312 (100 uM)	95.8±6.0	79.7±12.0	33.3±3.3
OB-34 (100 uM)	2.0±0.3	12.3±1.7	95.5±10.2
OB-36 (100 uM)	0.4±0.3	14.2±3.3	36.7±6.7
OB-3131 (100 uM)	0.01±0.002	0.02±0.02	0.04±0.001
Ribavirin(50 ug/ml)	16.0±4.6	0.3131±0.06	10.2±0.9

본 실험 결과, OB-3131은 코로나바이러스 외에도 VSV (음성가닥 RNA 바이러스인 rhabodoviridae과의 바이러스) 구내염바이러스의 증식도 억제하는 것으로 보여 광범위한 항바이러스 제제로서의 가능성 있음을 확인하였다.

실험예 6. 오배자 추출물로부터 분리된 화합물 세 가지( OB -34, OB36 , OB -3131)의 항바이러스 시너지 효과 시험

상기 실시예에서 얻은 오배자 추출물로부터 분리된 세 가지 화합물의 항바이러스 시너지 효과를 확인하기 위하여 문헌에 개시된 방법을 응용하여 하기와 같이 실험하였다(Kim et al., J. Clin. Virol., 41, pp112-118, 2008; Kim et al., Antiviral therapy, 15, pp697-709, 2010).

세포에 MHV-A59와 MHV-JHM 코로나바이러스 균주 및 VSV 구내염바이러스 균주를 감염시킨다. 이때 오배자 추출물과 오배자 추출물로부터 분리된 화합물 중 OB-36과 OB-3131을 단독 혹은 농도를 반으로 줄인 후 함께 처리하였다. 바이러스를 감염시킨 세포는 배양기에서 일정 시간 동안 더 배양한 후, 약제에 의해 바이러스방출이 감소되었는지를 플라크분석법(Plaque assay)으로 조사하였다.

그 결과, MHV-JHM 균주(Dr. Shinji Makino [U of Texas Medical Branch, Galveston, TX, USA]로부터 분양받음)의 경우 OB-36과 OB-3131 각각을 단독으로 처리했을 때보다 함께 처리했을 때 항바이러스 효과가 우수함을 입증할 수 있었다(도 4 참조).

실험예 7. 오배자 추출물 유효성분 세 가지( OB -34, OB36 , OB -3131)의 항코로나바이러스 작용기전 실험

상기 실시예에서 얻은 오배자 추출물로부터 분리된 화합물들의 항코로나바이러스 작용기전을 확인하기 위하여 문헌에 개시된 방법을 응용하여 하기와 같이 실험하였다(Kim et al., J. Clin. Virol., 41, pp112-118, 2008; Kim et al., Antiviral therapy, 15, pp697-709, 2010).

이와 함께 흡착실험을 통해 화합물이 바이러스의 감염의 흡착단계(entry)를 억제하는지를 조사하였다. 오배자 추출물로부터 분리된 화합물인 OB-34, OB-36, OB-3131이 바이러스가 세포에 흡착되는 것을 억제시키는지를 알아보기 위해 바이러스를 세포에 부착시킬 때 화합물을 처리한 실험군과 처리하지 않은 대조군으로 나누어 부착 정도를 관찰하였다. 부착 정도는 세포 내 바이러스 RNA를 분리한 후, Northern blotting으로 조사하였다. 만약 화합물이 바이러스가 세포에 흡착되는 것을 저해한다면 화합물을 처리하지 않은 대조군에 비해 바이러스 RNA이 양이 감소될 것이다.

조사 결과, OB-34와 OB-36은 코로나바이러스의 RNA 합성과 구조단백질인 N 단백질의 합성을 저해하지 못하는 것으로 나타나 코로나바이러스의 조립이나 방출 단계를 억제할 가능성이 높고, OB-3131은 코로나바이러스의 RNA 합성 및 N 단백질의 합성을 저해해 코로나바이러스 증식의 초기 단계(entry, RNA 합성단계 또는 비구조단백질의 processing)를 억제할 가능성이 높았다(도 5 참조).

본 발명의 추출물 또는 화합물을 아래와 같은 제형으로 투여할 수 있으며, 아래의 제제 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 이에 의해 본 발명의 내용이 제한되는 것은 아니다.

제제예 1. 산제의 제조

GR50E 추출물 20 mg

유당 100 mg

탈크 10 mg

상기의 성분들을 혼합하고 기밀포에 충진하여 산제를 제조한다.

제제예 2. 정제의 제조

OB-36 화합물 10 mg

옥수수전분 100 mg

유당 100 mg

스테아린산 마그네슘 2 mg

상기의 성분들을 혼합한 후 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조한다.

제제예 3. 캡슐제의 제조

OB-3131 화합물 10 mg

결정성 셀룰로오스 3 mg

락토오스 14.8 mg

마그네슘 스테아레이트 0.2 mg

통상의 캡슐제 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합하고 젤라틴 캡슐에 충진하여 캡슐제를 제조한다.

제제예 4. 주사제의 제조

OB-3131 화합물 10 mg

만니톨 180 mg

주사용 멸균 증류수 2974 mg

Na₂HPO₄12H₂O 26 mg

통상의 주사제의 제조방법에 따라 1 앰플당 (2㎖) 상기의 성분 함량으로 제조한다.

제제예 5. 액제의 제조

OB-34 화합물 10 mg

이성화당 10 g

만니톨 5 g

정제수 적량

통상의 액제의 제조방법에 따라 정제수에 각각의 성분을 가하여 용해시키고 레몬향을 적량 가한 다음 상기의 성분을 혼합한 다음 정제수를 가하여 전체를 100 ㎖로 조절한 후 갈색병에 충진하여 멸균시켜 액제를 제조한다.

제제예 6. 건강 식품의 제조

GR70E 추출물 1000 ㎎

비타민 혼합물 적량

비타민 A 아세테이트 70 ㎍

비타민 E 1.0 ㎎

비타민 B1 0.13 ㎎

비타민 B2 0.15 ㎎

비타민 B6 0.5 ㎎

비타민 B12 0.2 ㎍

비타민 C 10 ㎎

비오틴 10 ㎍

니코틴산아미드 1.7 ㎎

엽산 50 ㎍

판토텐산 칼슘 0.5 ㎎

무기질 혼합물 적량

황산제1철 1.75 ㎎

산화아연 0.82 ㎎

탄산마그네슘 25.3 ㎎

제1인산칼륨 15 ㎎

제2인산칼슘 55 ㎎

구연산칼륨 90 ㎎

탄산칼슘 100 ㎎

염화마그네슘 24.8 ㎎

상기의 비타민 및 미네랄 혼합물의 조성비는 비교적 건강식품에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만, 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하며, 통상의 건강식품 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 과립을 제조하고, 통상의 방법에 따라 건강식품 조성물 제조에 사용할 수 있다.

제제예 7. 건강 음료의 제조

GR100E 추출물 1000 ㎎

구연산 1000 ㎎

올리고당 100 g

매실농축액 2 g

타우린 1 g

정제수를 가하여 전체 900 ㎖

통상의 건강음료 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 약 1시간동안 85℃에서 교반 가열한 후, 만들어진 용액을 여과하여 멸균된 2ℓ 용기에 취득하여 밀봉 멸균한 뒤 냉장 보관한 다음 본 발명의 건강음료 조성물 제조에 사용한다.

Claims

건조된 오배자를 세절하여 건조 중량의 10 내지 20배의 70 내지 80% 에탄올 혼합용매로, 20 내지 100℃ 추출온도에서 2시간 내지 5시간동안 냉침추출, 열수추출, 초음파 추출 또는 환류냉각 추출방법을 이용하여 수득한 1 내지 5회 반복 추출한 후 감압 농축하는 단계의 제조방법으로부터 수득됨을 특징으로 하는 갈산(1), 파라 디갈산과 메타 디 갈산의 복합물(2), 에틸 갈레이트(4) 및 에틸 파라 디 갈레이트와 에틸 메타 디 갈레이트의 복합물(5)의 함유비(4.3:1:7.2:16.3)로 구성되는 70 내지 80% 에탄올 혼합용매 추출물 또는 이로부터 분리된 팬타 오-갈로일 글루코스(penta-O-galloyl glucose), 에틸 갈레이트(ethyl gallate) 또는 에틸 파라 디 갈레이트와 에틸 메타 디 갈레이트의 복합물(a mixture of ethyl p-digallate and ethyl m-digallate)을 유효성분으로 함유하는 A/H1N1 계절 독감 바이러스에 기인한 계절독감 또는 신종인플루엔자; A/H9N2 (A/Chicken/Korea/MS96/1996), 또는 A/H1N1으로부터 선택된 조류인플루엔자바이러스에 기인한 조류인플루엔자의 예방 및 치료를 위한 항균조성물.
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건조된 오배자를 세절하여 건조 중량의 10 내지 20배의 70 내지 80% 에탄올 혼합용매로, 20 내지 100℃ 추출온도에서 2시간 내지 5시간동안 냉침추출, 열수추출, 초음파 추출 또는 환류냉각 추출방법을 이용하여 수득한 1 내지 5회 반복 추출한 후 감압 농축하는 단계의 제조방법으로부터 수득됨을 특징으로 하는 갈산(1), 파라 디갈산과 메타 디 갈산의 복합물(2), 에틸 갈레이트(4) 및 에틸 파라 디 갈레이트와 에틸 메타 디 갈레이트의 복합물(5)의 함유비(4.3:1:7.2:16.3)로 구성되는 70 내지 80% 에탄올 혼합용매 추출물 또는 이로부터 분리된 팬타 오-갈로일 글루코스(penta-O-galloyl glucose), 에틸 갈레이트(ethyl gallate) 또는 에틸 파라 디 갈레이트와 에틸 메타 디 갈레이트의 복합물(a mixture of ethyl p-digallate and ethyl m-digallate)을 유효성분으로 함유하는 A/H1N1 계절 독감 바이러스에 기인한 계절독감 또는 신종인플루엔자; A/H9N2 (A/Chicken/Korea/MS96/1996), 또는 A/H1N1으로부터 선택된 조류인플루엔자바이러스에 기인한 조류인플루엔자의 예방 및 개선용 건강기능식품.
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