KR20240045546A - 항 인플루엔자 바이러스제 - Google Patents
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Abstract
인플루엔자 바이러스의 억제 효과가 있는 복합 천연물 제제를 개시한다. 본 발명에 항 인플루엔자 바이러스제는 프로폴리스추출물, 사차인치 오일, 산화아연 및 고소애 오일을 유효성분으로 한다.
Description
본 발명은 항 인플루엔자 바이러스제에 관한 것으로, 더 상세하게는 프로폴리스추출물, 사차인치 오일, 산화아연 및 고소애 오일('밀웜 오일'이라고도 함. 이하에서는 '고소애 오일'이라고 함)을 유효성분으로 하는 항 인플루엔자 바이러스제에 관한 것이다.
인플루엔자 바이러스(influenza virus)는 오르토믹소비리대과(Family Orthomyxoviridae)에 속하는 RNA 바이러스로서 호흡기에 염증을 유발시키며, 감염자의 기침 및 타액으로 공기 중으로 직접 전달되거나 독감 환자의 접촉물 등에 의해 간접적으로도 타인에게 전염될 수 있는 전염력이 강한 바이러스이며, 바이러스의 혈청형은 A형, B형 및 C형으로 구분된다. 그 중 B형과 C형은 인간에서만 감염이 확인되고 있으며, A형은 인간, 말, 돼지, 기타 포유류 그리고 다양한 종류의 가금과 야생조류에서 감염이 확인되고 있다. A형 인플루엔자 바이러스의 혈청형은 바이러스 표면의 두 가지 단백질인 헤마글루티닌(Hemagglutinin: HA)과 뉴라미니다제(Neuraminidase: NA)의 종류에 따라 구분되며, 혈청형에 따라 144종류(HA형 16종과 NA형 9종)로 분류할 수 있다. HA 단백질은 바이러스가 체세포에 부착하는 역할을 하며, NA 단백질은 바이러스가 세포 내로 침투할 수 있도록 한다. 근래, 세계적으로 유행했던 신종 인플루엔자는 인체 인플루엔자A형으로서, 서브타입은 HA(Hemagglutinin) 단백질이 1형(H1)이고 NA(Neuraminidase) 단백질이 1형(N1)인Influenza A(H1N1) 바이러스이다.
A형 인플루엔자 바이러스 치료제로, 인플루엔자 바이러스의 뉴라미니다아제 저해 물질로서 인공합성된 자나미비르(zanamivir, 상표명 :레렌자(Relenza))와 오셀타미비르(oseltamivir, 상표명 : 타미플루(TAMIFLU))가 알려져 있다. 자나미비르(zanamivir)와 오셀타미비르(oseltamivir)는 인플루엔자 바이러스의 뉴라미니다제(neuraminidase) 단백질의 기능을 억제하는 물질로 생체내 인플루엔자 바이러스의 증식을 억제하는 대표적인 항바이러스 제제들이다. 이들 두 가지 항바이러스 제제들은 16종의 모든 혈청형 A형 인플루엔자 바이러스와 혈청형 B형 인플루엔자 바이러스에도 효과적인 것으로 알려져 있다. 그러나, 자나미비르는 흡입 및 정맥 투여해야 하는 단점이 있으며, 오셀타미비르는 경구투여가 가능하나 최근 내성 바이러스의 출현이 보고되고 있고 경구투여시 구토와 현기증 등의 부작용이 있다. 따라서, 자나미비르나 오셀타미비르 정도의 효과를 가지면서 간편하게 투여할 수 있고, 부작용이 없는 천연 물질 유래 항 인플루엔자 바이러스제 개발이 다양하게 이루어지고 있다.
천연 물질 유래 항 인플루엔자 바이러스제의 예로, 한국등록특허 제10-1118230호에는 바나바, 산국 및 오레가노 중에서 하나 이상 선택되는 식물 추출물을 포함하는 항-인플루엔자바이러스 활성을 가지는 식물 추출물이 기재되어 있고, 한국등록특허 제10-1426888호에는 인삼 또는 홍삼 추출물, 사포닌 또는 산성다당체를 유효성분으로 포함하는 조류독감 바이러스 증식 억제 및 항-조류독감 바이러스 조성물이 기재되어 있고, 한국등록특허 제10-0923884호에는 오리나무(Alnus japonica) 추출물을 함유하는 항바이러스 조성물이 기재되어 있고, 한국등록특허 제10-1035463호에는 흑삼 뿌리로부터 추출된 추출물을 유효성분으로 하는 고병원성 조류 인플루엔자 바이러스의 예방 및 치료용 조성물이 기재되어 있고, 한국등록특허 제10-1322851호에는 인동등, 황금, 생지황, 갈근, 감초 및 마늘의 혼합 추출물을 포함하는 조류독감 바이러스의 증식 억제용 조성물이 기재되어 있고, 한국등록특허 제10-1139376호에는 오렌지(Citrus spp.), 캣츠클로(Uncaria tomentosa), 베이베리(Myrica cerifera), 루타(Ruta graveolens), 에버라스팅(Helichrysum italicum), 린덴(Tilia cordata), 올스파이스(Pimenta officinalis), 카카오(Theobroma cacao), 모과(Chaenomeles sinensis, Pseudocydonia sinensis)로 이루어지는 군에서 선택되는 1종 또는 2종 이상의 식물 추출물을 유효성분으로 하는 항 인플루엔자 바이러스제가 기재되어 있고, 한국공개특허 제10-2014-0104652호에는 딱지꽃 추출물을 유효성분으로 하는 항 인플루엔자용 조성물이 기재되어 있고, 한국등록특허 제10-1443510호에는 치커리(Cichorium intybus) 추출물을 유효성분으로 함유하는 인플루엔자 예방 또는 치료용 약학적 조성물이 기재되어 있고, 한국등록특허 제10-1310033호에는 여우오줌풀 추출물을 유효성분으로 포함하는 인플루엔자 바이러스 감염 예방 또는 치료용 조성물이 기재되어 있고, 한국공개특허 제10-2011-0093975호에는 울금(Turmeric) 추출물을 포함하는 인플루엔자 바이러스 감염의 예방 및 치료용 조성물이 기재되어 있고, 한국등록특허 제10-1376231호에는 새싹보리 추출물을 유효성분으로하는 인플루엔자 바이러스의 예방 치료용 조성물이 기재되어 있고, 한국공개특허 제10-2014-0141178호에는 대파 추출물을 유효성분으로 하는 항 인플루엔자 바이러스제가 기재되어 있고, 한국공개특허 제10-2014-0115576호에는 왕호장의 추출물 또는 이로부터 분리된 화합물을 유효성분으로 함유하는 항 인플루엔자 바이러스제가 기재되어 있고, 한국공개특허 제10-2014-0143115호에는 자일리톨과, 인삼 또는 홍삼 물 투석층, 인삼 또는 홍삼 전체 추출물, 인삼 또는 홍삼 다당체 및 인삼 또는 홍삼 사포닌으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 또는 2 이상을 포함하는 인플루엔자 바이러스 감염증 예방 또는 개선용 건강식품 조성물이 기재되어 있고, 한국등록특허 제10-1334143호에는 폴리갈라 카렌시움(Polygala karensium) 추출물 및 이로부터 분리된 잔톤계 화합물을 함유하는 감기, 조류 인플루엔자, 돼지 인플루엔자 또는 신종플루의 예방 또는 치료용 조성물이 기재되어 있고, 한국등록특허 제10-0950445호에는 감초(Glycyrrhiza uralensis) 유래의 뉴라미니데이즈 효소(neuraminidase)를 저해하는 화합물 및 이를 유효성분으로 포함하는 조류 및 돼지 인플루엔자와 신종플루의 예방과 치료에 사용하는 조성물이 기재되어 있고, 한국등록특허 제10-1177182호에는 약쑥 95%주정 추출물이 함유된 신종플루 바이러스와 조류인플루엔자 바이러스 불활화능제가 기재되어 있고, 한국등록특허 제10-1021830호에는 크레이스토카릭스 오페르쿠라투스의 유기용매 추출액 유래의 돼지 인플루엔자 및 신종플루에 대한 항바이러스제가 기재되어 있고, 한국등록특허 제10-1317318호에는 오배자(Galla Rhois)의 추출물 또는 이로부터 분리된 화합물을 유효성분으로 함유하는 인플루엔자 억제 조성물이 기재되어 있고, 한국공개특허 제10-2011-0132407호에는 판람근(Radix isatidis)으로부터 제조된 추출물 및 금은화(Flos Lonicerae)로부터 제조된 추출물을 포함하는 인플루엔자의 예방 및 치료를 위한 식물 추출물 조성물이 기재되어 있고, 한국등록특허 제10-0295395호에는 나복자, 천련자, 금은화, 작약 및 천궁의 추출물을 포함하여 이루어지는 감기 예방 및 치료용 항바이러스성 약제가 기재되어 있고, 한국등록특허 제10-0295389호에는 모과, 덜 익은 유자 생강 및 후박의 추출물을 포함하는 항바이러스성약제가 기재되어 있고, 한국공개특허 제10-2003-0027133호에는 블랙엘더베리 추출물을 주원료로하는 인풀루엔자 바이러스 감염 예방 약제가 기재되어 있고, 한국등록특허 제10-1165592호에는 라즈베리(Rubus idaeus), 스트로베리(Fragaria vesca), 블랙베리(Rubus fruticosus), 무화과(Ficus carica), 명아주(Chenopodium album), 아그리모니(Agrimonia eupatoria), 유칼립투스(Eucalyptus globulus), 복숭아(Prunus persica), 사과(Malus pumila), 바이올렛(Viola odorata), 쿠로모지(Lindera umbellata), 과라나(Paullinia cupana), 밀몽화(Buddleia officinalis), 닭의장풀(Commelina communis), 냉이(Capsella bursa-pastoris), 연명초(Rabdosia japonica), 와일드 스트로베리(Fragaria vesca), 허하운드(Marrubium vulgare), 마쉬말로우(Althaea officinalis), 질경이(Plantago asiatica), 레몬버베나(Aloysia triphylla), 서양톱풀(Achillea millefolium), 빙도의(Cetraria islandica), 산수국(Gynostemma pentaphyllum), 머위(Petasites japonicus)의 추출물을 유효성분으로 하는 항 인플루엔자 바이러스제가 기재되어 있고, 한국등록특허 제10-1086811호에는 어성초, 오가피, 방풍 또는 시호의 추출물 중에서 선택되는 1종 또는 2종 이상의 추출물로 이루어지는 항 인플루엔자 바이러스 효과가 있는 천연 추출물이 기재되어 있고, 한국등록특허 제10-1011454호에는 고삼(Sophora flavescens) 추출물, 이의 분획물, 이로부터 분리한 테로카판계 화합물 및 플라보노이드계 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 인플루엔자 바이러스 감염 질환의 예방 및 치료용 약학적 조성물이 기재되어 있고, 한국공개특허 제10-2010-0052656호는 조류인플렌자 바이러스 A/H5N1에 대한 뛰어난 항바이러스 활성물질로, 민족도리풀(Asarum sieboldii) 뿌리의 메탄올추출을 여과후 증류수에 현탁한 후 Chloroform으로 분리한 분획물이 기재되어 있고, 한국등록특허 제10-1203484호에는 한국산 겨우살이를 포함하는 조류독감 억제용 약학조성물에 관한 것으로 보다 상세하게는 사료에 있어서, 한국산 겨우살이를 포함하는 조류독감 억제용 약학조성물이 기재되어 있고, 한국등록특허 제101115063호에는 초두구 추출물을 포함하는 인플루엔자 바이러스 감염의 예방 및 치료용 조성물이 기재되어 있고, 한국공개특허 제10-2011-0041936호에는 붉나무 유래 화합물을 포함하는 인플루엔자 바이러스 감염의 예방용 조성물이 기재되어 있고, 한국공개특허 제10-1087759호에는 꾸지뽕나무 추출물을 포함하는 뉴라미니데이즈 활성의 억제용 조성물 및 인플루엔자 바이러스 감염 질환의 예방 및 치료용 약제학적 조성물이 기재되어 있고, 한국등록특허 제10-1195120호에는 선복화 추출물을 함유하는 고병원성 조류인플루엔자 H5N1 감염 예방 및 치료용 조성물이 기재되어 있고, 한국등록특허 제10-1189823호에는 폴리페놀성 화합물을 포함하는 인플루엔자 바이러스 감염의 예방 및 치료용 조성물이 기재되어 있고, 한국공개특허 제10-2011-0055852호에는 플라보노이드를 유효성분으로 포함하는 바이러스 치료 또는 예방용 조성물이 기재되어 있고, 한국등록특허 제10-1135946호에는 연교추출물을 함유하는 고병원성 조류인플루엔자 H5N1 바이러스 감염예방 및 치료용 조성물이 기재되어 있고, 한국등록특허 제10-1160743호에는 음수투여제 또는 사료첨가제의 형태로 녹차를 유효성분으로 함유하는 조류 인플루엔자에 대한 항바이러스제가 기재되어 있고, 한국공개특허 제10-2011-0040629호에는 은행 추출물을 포함하는 신종인플루엔자 Ａ（Ｈ１Ｎ１） 바이러스 감염의 예방용 조성물이 기재되어 있고, 한국등록특허 제10-1373219호에는 관동화 꽃, 행인 종자, 황기 뿌리 패장 식물체의 메탄올 추출 후 그 분획물로 된 인플루엔자 바이러스 H1N1에 대하여 항바이러스 활성을 가지는 약용 식물 추출물을 기재하고 있고 있고, 한국공개특허 제10-2012-0026851호에는 드리나리아속 식물 추출물을 포함하는 인플루엔자 바이러스 감염 질환의 예방 및 치료용 약학적 조성물이 기재되어 있고, 한국공개특허 제10-2011-0110381호에는 흑인삼꽃봉오리 건조분말 또는 그 추출물을 유효성분으로 함유하는 고병원성 조류 인플루엔자 바이러스의 예방 및 치료용 조성물이 기재되어 있고, 한국등록특허 제10-1164515호에는 천궁, 방풍, 당귀, 작약, 연교, 박하엽, 마황, 망초, 대황, 석고, 길경, 황금, 백출, 산치자, 형개, 생강, 활석, 감초, 음양곽, 금은화, 원지 및 목향을 포함하는 생약을 유기용매로 추출한 생약 추출물이 기재되어 있고, 한국공개특허 제10-2014-0030360호에는 홍삼을 유효성분으로 함유하는 인플루엔자 의사 증상과 상기도 감염 증상의 예방 및 개선을 위한 조성물이 기재되어 있고, 한국등록특허 제10-1387353호에는 아이비엽 추출물 및 이로부터 분리된 화합물을 유효성분으로 함유하는 인플루엔자 바이러스 관련 질환의 예방 및 치료용 조성물이 기재되어 있고, 한국등록특허 제10-1369100호에는 아이비엽 및 황련으로 구성된 복합생약 추출물을 유효성분으로 함유하는 인플루엔자 바이러스 관련 질환의 예방 및 치료용 조성물이 기재되어 있고, 한국등록특허 제10-1627065호에는 마누카꿀, 프로폴리스추출물, 자일리톨, 유향, 몰약, 행인, 도인, 삼릉, 봉출 및 비타민C를 유효성분으로 하는 항 인플루엔자 바이러스제가 기재되어 있다.
이들 항 인플루엔자 바이러스제들은 그 안전성이나 약효가 일부 검증되기도 하였지만, 인플루엔자 바이러스의 효과적인 예방 및 치료를 위하여 더 많은 천연물 유래 항 인플루엔자 바이러스제의 개발이 필요한 실정이다. 이에, 본 발명자는, 항바이러스 및 항균 효과 등이 있는 것으로 알려져 있는 프로폴리스추출물에, 사차인치 오일, 산화아연 및 고소애 오일을 혼합할 때, 특히 인플루엔자 바이러스로 인한 질병 증상의 예방 또는 치료에 뛰어난 효과가 있음을 밝힘으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명이 해결하고자 하는 과제는, 인플루엔자 바이러스의 억제 효과가 있는 복합 천연물 제제를 제공하는 데 있다.
본 발명은 상술한 과제 해결 수단으로, 프로폴리스추출물, 사차인치 오일, 산화아연 및 고소애 오일을 유효성분으로 하는 항 인플루엔자 바이러스제를 제공한다.
본 발명의 효과를 확인하기 위하여, 고소애 오일을 유효성분으로 하는 항 인플루엔자 바이러스제(이하, 비교 예1라고 한다)와, 프로폴리스추출물, 사차인치오일 및 산화아연을 유효성분으로 하는 항 인플루엔자 바이러스제(이하, 비교 예2라고 한다)를 별도로 배합하고, 이들 비교 예1 및 비교 예2와, 항 인플루엔자 바이러스제로 시판 중인 Oseltamivir (Tamiflu®)(이하, 비교 약물이라고 한다)를, 다양한 농도(0㎍/㎖,12.5㎍/㎖, 25㎍/㎖, 50㎍/㎖, 100㎍/㎖, 200㎍/㎖)로 조절하여, 바이러스를 감염시킨 배양 세포에 처리하고, 일정시간 후 Western blot method로 추출한 바이러스의 핵단백질(NP)을 b-actin과 대조하는 방법으로, 시료의 바이러스 사멸 효과를 측정하였다. 그 결과 다음과 같은 효과를 확인하였다.
1) 본 발명에 따른 실시 예와 비교 예1은 양성 대조군 (P.C)인 감염군 대비 모든 농도에서 통계학적으로 유의한 항바이러스 효능을 나타냈다 (p<0.05).
2) 본 발명에 따른 실시 예, 비교 예1 및 비교 예2는 모두 특정 농도 (50μg/ml)에서 가장 높은 항바이러스 효능을 나타냈으며 (p<0.01), 비교 약물 (OS)인 Oseltamivir (Tamiflu®) 보다 더 높은 항바이러스 효능을 확인했다.
3) 모든 처리 농도에서 비교 예1과 비교 예2의 복합물인 본 발명에 따른 실시 예의 항바이러스 효능이 가장 높게 나타났다. [50μg/ml 기준 (본 발명의 실시 예 : 60% > 비교 예1 : 41% > 비교 예2 : 26%)]
이상의 결과로 보아, 본 발명에 따른 실시 예, 비교 예1, 비교 예2는 인플루엔자 A 바이러스에 대해 통계학적 유의한 항바이러스 효과 (p<0.01)가 있음을 증명하였으며, 특정 농도 (50μg/ml) 에서는 비교 약물 (OS)인 Oseltamivir (Tamiflu®) 보다 높은 항바이러스 효과가 나타났음을 확인했다. 또한 비교 예1과 비교 예2의 복합물인 본 발명에 따른 실시 예의 항바이러스 효능이 가장 우수함을 확인하였다.
도 1은 비교 예1의 처리에 따른 인플루엔자 바이러스(H1N1, PR8) 핵단백질(NP)의 변화를 농도별로 보여주는 도표이다.
도 2는 비교 예2의 처리에 따른 인플루엔자 바이러스(H1N1, PR8) 핵단백질(NP)의 변화를 농도별로 보여주는 도표이다.
도 3은 본 발명의 실시 예의 처리에 따른 인플루엔자 바이러스(H1N1, PR8) 핵단백질(NP)의 변화를 농도별로 보여주는 도표이다.
도 2는 비교 예2의 처리에 따른 인플루엔자 바이러스(H1N1, PR8) 핵단백질(NP)의 변화를 농도별로 보여주는 도표이다.
도 3은 본 발명의 실시 예의 처리에 따른 인플루엔자 바이러스(H1N1, PR8) 핵단백질(NP)의 변화를 농도별로 보여주는 도표이다.
이하, 첨부한 도면을 참조하여 본 발명에 따른 항 인플루엔자 바이러스제의 구체적인 실시 예를 상세히 설명한다.
본 발명은 프로폴리스추출물, 사차인치 오일, 산화아연 및 고소애 오일을 유효성분으로 하는 항 인플루엔자 바이러스제를 제공한다.
프로폴리스추출물은 프로폴리스의 열수추출물 또는 알코올 추출물이다. 프로폴리스는, 나무의 검 삼출물(gum exudate)로부터 벌에 의해 수집된 수지성 재료로 벌통에서 항박테리아제로 사용된다. 지금까지, 고초균, 포도상구균, 백선균, 대장균, 트리코모나스균, 살모넬라균 등에 효과가 있는 것으로 알려져 있다. 꿀벌은 벌집의 틈이 난 곳에 프로폴리스를 발라 병균이나 바이러스로부터 스스로를 보호하고, 말벌이나 쥐와 같은 적의 침입을 막는다. 특히 여왕벌이 산란할 때에는 일벌이 산란장소를 소독하는 데 사용하기도 한다. 프로폴리스(propolis)는 치환된 벤조산, 시나미산 및 플라보노이드를 포함한다. 플라보노이드가 프로폴리스 중에서 항박테리아 기능을 하는 주요 물질이다. 항박테리아 활성 물질에 대한 원인이 된 것으로 규명된 플라보노이드는 갈랑긴(galangin), 피노셈브린(pinocembrin), 카페산 및 페룰산을 포함한다. 프로폴리스의 주요한 효능으로는 항균작용, 항염증작용, 진통작용, 면역증강작용, 항암작용, 항산화작용 등이 있다. 항염 효과를 내는 것은 사람의 몸에 염증을 일으키는 프로스타그란딘을 만들어내는 효소를 절반까지 줄이기 때문이다. 또 주요 성분인 플라보노이드가 활성산소를 없애기 때문에 항산화 효과가 있다. 항암 효과를 나타내는 케르세틴 등이 있어 암세포의 유전자가 복제되기 전에 차단하는 일도 한다.
사차인치오일(Sacha Inchi oil)은 아프리칸 월넛(Plukenetia Volubilis)의 씨를 압착해 얻은 오일이다. 사차인치오일은 오메가3(48%), 오메가6(36%), 오메가9(9%)를 함유하고, 요오드와 비타민 A, E를 풍부하게 함유하고 있는 천연 야생식물이다. 사차인치오일에 함유된 오메가3와 비타민E는 피부 재생 효과에 탁월한 효능을 가지고 있는 것으로 알려져 있다.
산화아연(ZnO,Zinc Gluconate)는 물에 녹지 않는 무색의 결정이다. 분말은 아연화, 아연백 등이라 한다. 가벼운 백색 분말로 녹는점 1,975℃(가압), 1,720℃(상압)이며, 비중 5.47(비결정성), 5.78(결정성)이다. 약 300℃로 가열하면 황색으로 변하지만 식히면 원래의 빛깔이 된다. 물에는 거의 녹지 않지만 묽은 산 및 진한 알칼리에는 녹는 양쪽성 산화물이다. 홍아연석의 주성분이며 인공적으로는 탄산아연이나 질산아연을 가열하여 만든다. 식품 첨가물의 하나로 영양 강화에 쓴다.
고소애 오일은 갈색거저리(Tenebrio molitor)의 유충(밀웜)에서 얻은 오일이다. 밀웜 오일(mealworm oil)이라고도 한다. 건조 갈색거저리의 유충(밀웜)을 압착추출하여 만든다. 올레산, 리놀레산, 리놀렌산등 불포화지방산을 약 75% 이상 함유하는 것으로 알려져 있다.
[약효 실험]
아래의 실험결과는 복합 천연물인 본 발명에 따른 실시 예와, 비교 예1, 비교 예2의 인플루엔자 A 바이러스에 대한 항바이러스 효과를 검증하기 위하여 한국화학연구원 바이러스융합연구단에 실험 의뢰한 후 제출 받은 것이다.
<세포 내 실험-in vitro>
1. 시료의 준비
본 발명의 효과를 확인하기 위하여, 프로폴리스추출물, 사차인치 오일, 산화아연 및 고소애 오일을 다음 표 1과 같은 비율로 배합하고, 0.1%~10.0% Surfactant in DMSO(Dimethyl sulfoxide)을 사용하여 농도를 조절하였다. DMSO(Dimethyl sulfoxide)은 극성, 비극성 물질을 모두 용해하는 유기용제이다.
본 발명에 따른 항 인플루엔자 바이러스제와의 비교를 위하여, 고소애 오일의 단일 성분을 유효성분으로 하는 항 인플루엔자 바이러스제(이하, 비교 예1라고 한다)와, 프로폴리스추출물, 사차인치오일 및 산화아연의 3성분을 유효성분으로 하는 항 인플루엔자 바이러스제(이하, 비교 예2라고 한다)를 다음 표 1과 같은 비율로 별도로 배합하고, 0.1%~10.0% Surfactant in DMSO(Dimethyl sulfoxide)을 사용하여 농도를 조절하였다.
또한, 본 발명에 따른 항 인플루엔자 바이러스제와의 비교를 위하여, 항 인플루엔자 바이러스제로 시판 중인 약물 중 하나인 Oseltamivir (Tamiflu®)(이하, 비교 약물이라고 한다)를 다음 표 1과 같이 준비하였다.
| 시료 성분 | ||
| 비교 예1 | ||
| 원료명 | 함량 | 배합비율(%) |
| 고소애 오일 Surfactant in DMSO |
10g 50ml |
20% 80% |
| 농도 | 200mg/ml | 100% |
| 비교 예2 | ||
| 원료명 | 함량 | 배합비율(%) |
| 프로폴리스추출물 사차인치오일 산화아연 Surfactant in DMSO |
5.42g 2.41g 2.17g 50ml |
10.84% 4.82% 4.34% 80% |
| 농도 | 200mg/ml | 100% |
| 본 발명의 실시 예 | ||
| 원료명 | 함량 | 배합비율(%) |
| 프로폴리스추출물 사차인치오일 산화아연 고소애 오일 Surfactant in DMSO |
5.42g 2.41g 2.17g 3.77g 68.85ml |
10.84% 4.82% 4.34% 7.54% 72.46% |
| 농도 | 200mg/ml | 100% |
| 비교 약물(Oselmativir) | ||
| 원료명 | 함량 | 배합비율(%) |
| Oseltamivir Surfactant in DMSO |
1.5g 50ml |
3% 97% |
| 농도 | 30mg/ml | 100% |
2. 실험 방법
바이러스를 감염시킨 배양 세포에 시료를 적용하고, 일정시간 후 Western blot method로 추출한 바이러스의 핵단백질(NP)을 b-actin과 대조하는 방법으로, 시료의 바이러스 사멸 효과를 측정하였다.
1) Influenza A virus (H1N1, PR8) 및 A549 세포 및 배양
실험에 사용된 virus는 Human influenza A virus (H1N1, PR8)이다. 바이러스의 감염과 증폭을 위해 사용된 세포는 A549세포(Human lung cell line)이다. A549 폐암세포주는 배양을 위해 90% RPMI-1650 배지, 10% fetal bovine serum (FBS)에 1% antibiotics가 포함된 배지를 사용하여 37℃, 5% CO₂조건 하에 배양하였다.
2)시료 처리
A549세포를 적정한 농도로 plate에 seeding 한 후 세포단층을 형성할 때까지 배양하였다. 그 후 세포 배양액을 PBS 로 wash out 시킨 후 Influenza A virus(H1N1, PR8)를 1MOI의 농도로 접종시켜 바이러스 흡착(adsorption) 배양시켰다(매 15분마다 rocking). 1시간 후, PBS로 바이러스를 세척하고 본 발명에 따른 실시 예, 비교 예1, 비교 예2를 여러 농도(0㎍/㎖,12.5㎍/㎖, 25㎍/㎖, 50㎍/㎖, 100㎍/㎖, 200㎍/㎖)로 희석하여 각 농도별로 처리하였으며, 비교 약물(OS)인 Oseltamivir (Tamiflu® )는 30㎍/㎖으로 처리 및 배양하였다. 배양 48시간 후 세포 배양액을 제거한 후, Western blot method를 통한 세포 내, 외부 Total protein 추출을 통해 Influenza A virus Nucleoprotein (NP) 농도를 b-actin에 대조하여 본 발명에 따른 실시 예와 비교 예1 및 비교 예2의 항바이러스 효능을 비교분석하였다.
3) 구체적 시험 방법
시험군은 음성 대조군 (N.C, 비감염군)과 양성 대조군 (P.C, 감염군, 시료 0㎍/㎖ 처리), 본 발명에 따른 실시 예, 비교 예1, 비교 예2 처리군 (12.5㎍/㎖, 25㎍/㎖, 50㎍/㎖, 100㎍/㎖, 200㎍/㎖), 비교 약물 (OS, Tamiflu®)으로 구성되었으며, 본 시험에 사용된 바이러스는 인플루엔자 A 바이러스 (H1N1, PR8)이며, 세포주는 A549 (human lung cell)이다. 처리된 바이러스 농도는 1MOI이며, A549 세포단층에 인플루엔자 A 바이러스 감염 1시간 후 PBS로 세척 후 본 발명에 따른 실시 예, 비교 예1, 비교 예2 및 Oseltamivir (Tamiflu®)가 농도별로 처리되었다. 배양 48시간 후 상층액을 제거하고 세포를 Total protein lysis buffer로 분해시켜 세포 내, 외부에 있는 인플루엔자 A 바이러스 핵단백질을 항체를 이용해 검출하는 Western blot method를 사용하여 비교 약물 대비 인플루엔자 A 바이러스 핵단백질 감소율 분석 및 유의성을 비교하였다.
3. 시험결과
모든 실험결과의 분석은 각 그룹의 측정값을 Mean(평균) ± STDEV (표준오차)로 요약하였으며, Student t-test 로 분석하여 P-value가 0.05 미만일 경우 유의성을 인정하였다.
1) 측정 결과
실험 결과 인플루엔자 A 핵단백질 레벨 및 b-actin에 대한 비율을 정리하면 표 2와 같다.
| Treat |
Concentration
(μg/ml) |
Protein level | ||
| Influenza A NP | b-actin | NP/b-actin | ||
| 비교 예1 | 0 | 124474.6 | 108310.6 | 1 |
| 12.5 | 97621.11 | 99206.64 | 0.856235631 | |
| 25 | 67825.35 | 77103.71 | 0.765432791 | |
| 50 | 48712.16 | 86203.47 | 0.491703081 | |
| 100 | 56261.64 | 89824.42 | 0.545014808 | |
| 200 | 80247.42 | 91940.25 | 0.759478915 | |
| 비교 약물(Oseltamivir) | 30 | 77343.62 | 96738.3 | 0.695690981 |
| Treat |
Concentration
(μg/ml) |
Protein level | ||
| Influenza A NP | b-actin | NP/b-actin | ||
| 비교 예2 | 0 | 104029.7 | 114000.8 | 1 |
| 12.5 | 77469.28 | 91282.47 | 0.930020336 | |
| 25 | 58490.19 | 95495.71 | 0.671196145 | |
| 50 | 65622.92 | 96861.3 | 0.742430061 | |
| 100 | 59965.45 | 88465.37 | 0.742810655 | |
| 200 | 70442.04 | 67196.66 | 1.148773786 | |
| 비교 약물(Oseltamivir) | 30 | 52805.84 | 82305.3 | 0.703079621 |
| Treat |
Concentration
(μg/ml) |
Protein level | ||
| Influenza A NP | b-actin | NP/b-actin | ||
| 본 발명에 따른 실시 예 | 0 | 120848.4 | 84039.82 | 1 |
| 12.5 | 80933.47 | 65540.47 | 0.858742162 | |
| 25 | 69664.47 | 71439.64 | 0.678135146 | |
| 50 | 52498.59 | 88871.01 | 0.410801237 | |
| 100 | 72309.64 | 96222.47 | 0.522593359 | |
| 200 | 80836.84 | 102415 | 0.548896042 | |
| 비교 약물(Oseltamivir) | 30 | 67029.77 | 88653.94 | 0.525791855 |
2) 비교 예1의 인플루엔자 A 바이러스 핵단백질 감소율 (도 1)
도 1은 비교 예1의 처리에 따른 A형 인플루엔자 바이러스(H1N1, PR8) 핵단백질(NP)의 감소를 보여주는 도표이다.
도 1에서 NP는 Influenza A virus의 핵단백질(Nucleoprotein)을 나타내고, N.C는 음성대조군(Negative Control)(비감염군), P.C는 양성대조군(Positive Control)(감염군-비교 예1의 농도를 0㎍/㎖으로 처리)를 나타내고, OS는 비교 약물을 타나낸다. 도면에서 P<0.05은 *로, P<0.01은 **로 각각 나타내었다.
비교 예1은 모든 농도에서 양성 대조군 (P.C)인 감염군 대비 통계적으로 유의한 인플루엔자 A 핵단백질의 발현율이 감소하는 것을 확인하였다 (P<0.05). 특히 50㎍/㎖ 농도에서 비교 약물 (OS)인 Oseltamivir (Tamiflu®) 보다 높은 감소율을 나타냈다(감소율 : 비교 예1 51% > Oseltamivir 30%).
3) 비교 예2의 인플루엔자 A 바이러스 핵단백질 감소율 (도 2)
도 2는 비교 예2의 처리에 따른 인플루엔자 바이러스(H1N1, PR8) 핵단백질(NP)의 감소를 보여주는 도표이다.
도 2에서 NP는 Influenza A virus의 핵단백질(Nucleoprotein)을 나타내고, N.C는 음성대조군(Negative Control)(비감염군), P.C는 양성대조군(Positive Control)(감염군-비교 예2의 농도를 0㎍/㎖으로 처리)를 나타내고, OS는 비교 약물을 타나낸다. 도면에서 P<0.05은 *로, P<0.01은 **로 각각 나타내었다.
비교 예2는 25㎍/㎖, 50㎍/㎖, 100㎍/㎖ 세가지 농도에서 비교 약물 (OS)인 Oseltamivir (Tamiflu®)와 비슷한 핵단백질의 감소 효과를 확인하였으나 (P<0.05), 고농도인 200㎍/㎖에서는 핵단백질의 감소 효과가 나타나지 않았다.
4) 본 발명의 실시 예의 인플루엔자 A 바이러스 핵단백질 감소율 (도 3)
도 3은 본 발명의 실시 예의 처리에 따른 인플루엔자 바이러스(H1N1, PR8) 핵단백질(NP)의 감소를 보여주는 도표이다.
도 3에서 NP는 Influenza A virus의 핵단백질(Nucleoprotein)을 나타내고, N.C는 음성대조군(Negative Control)(비감염군), P.C는 양성대조군(Positive Control)(감염군-본 발명의 실시 예의 농도를 0㎍/㎖으로 처리)를 나타내고, OS는 비교 약물을 타나낸다. 도면에서 P<0.05은 *로, P<0.01은 **로 각각 나타내었다.
본 발명의 실시 예는 모든 농도에서 양성 대조군 (P.C)인 감염군 대비 통계적으로 유의한 인플루엔자 A 핵단백질의 발현율이 감소하는 것을 확인하였으며 (P<0.05), 특히 50㎍/㎖ 농도에서 세가지 샘플 중 가장 높은 감소율 (본 발명의 실시 예 60% > 비교 예1 51% > 비교 예1 26%)을 나타냈으며, 비교 약물 (OS)인 Oseltamivir (Tamiflu®) 보다 높은 감소율을 나타냈다(감소율 : 본 발명의 실시 예 60% > Oseltamivir 47%).
4. 시험 결과 분석
본 발명의 복합 추출물인 본 발명에 따른 실시 예, 비교 예1, 비교 예2 세가지 모두 저농도 (12.5 μg/ml)에서 특정 농도 (50μg/ml)까지 농도 의존적으로 인플루엔자 A 바이러스의 핵단백질의 통계적 유의한 감소율이 확인되었으며 (P<0.05), 특히 본 발명의 실시 예의 경우 50μg/ml에서 양성 대조군 (P.C, 감염군) 대비 절반 이상의 항바이러스 효능과 비교 약물 (OS)인 Oseltamivir (Tamiflu®) 보다 높은 항바이러스 효능이 나타났다 (감소율 : 본 발명의 실시 예 60% > Oseltamivir 47%).
5. 결론
종합적인 결과로 보았을 때, 본 발명의 실시 예는 비교 예1과 비교 예2의 복합물로써, 이 비교 예1과 비교 예2의 항바이러스 효능의 시너지 효과로 인해 가장 극대화된 항바이러스 효능이 나타난 것이라고 확인된다.
이와 같이, 본 발명에 따른 항 인플루엔자 바이러스제는 인플루엔자 바이러스에 매우 강력한 억제력이 있는 유용한 발명이다.
Claims (1)
- 프로폴리스추출물, 사차인치 오일, 산화아연 및 고소애 오일을 유효성분으로 하는 항 인플루엔자 바이러스제.
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