KR101135946B1

KR101135946B1 - 연교추출물을 함유하는 고병원성 조류인플루엔자 ｈ5ｎ1 감염예방 및 치료용 조성물

Info

Publication number: KR101135946B1
Application number: KR1020090107087A
Authority: KR
Inventors: 백현동; 서상희; 이장현
Original assignee: 건국대학교 산학협력단
Priority date: 2009-11-06
Filing date: 2009-11-06
Publication date: 2012-04-18
Also published as: KR20110050207A

Abstract

본 발명은 연교추출물을 함유하는 고병원성 조류인플루엔자 H5N1 바이러스 감염예방 및 치료용 조성물을 제공하는 뛰어난 효과가 있다.

연교, 고병원성 조류인플루엔자 H5N1, 조성물

Description

연교추출물을 함유하는 고병원성 조류인플루엔자 Ｈ5Ｎ1 감염예방 및 치료용 조성물{A theraputic composition containing extracts of Forsythia suspensa Vahl against highly pathogenic avian influenza}

본 발명은 의성개나리 열매 연교의 추출물에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 고병원성 조류인플루엔자 H5N1에 항바이러스 활성을 가지는 연교추출물을 유효성분으로 함유하는 고병원성 조류인플루엔자 H5N1 감염예방 및 치료용 조성물에 관한 것이다.

인플루엔자 (Influenza)는 급성 호흡기 질환으로 10-40년을 주기로 대유행을 일으키며 인류에게 인명 피해는 물론 경제적으로 큰 피해를 가져왔다. 특히, 스페인 인플루엔자 (Spanish flu)는 1918년부터 1920년 동안 강력한 전염성을 보여, 당시 약 20억 명의 세계 인구의 25-30%가 감염되었고, 약 4,000만 명의 사상자를 발생시킨 역사상 가장 치명적인 독감으로 기록되어 있다.

인플루엔자는 Orthomyxoviridae에 속하는 인플루엔자 바이러스에 의해서 발 병한다. 인플루엔자 바이러스는 single strand RNA 바이러스로서 nucleoprotein (NP) 및 matrix antigen의 항원성에 따라 A, B, C 3가지 타입으로 분류된다. B형 인플루엔자와 C형 인플루엔자는 A형에 비해 항원 변화가 적고, 포유류 숙주에서 분리되었더라도 인체에서 대해서는 제한적이고 경미한 경과를 보이는 반면, A형 인플루엔자는 매우 다양한 종류의 조류와 포유류에 감염을 일으켜 집단 폐사를 초래하기도 한다. 특히, A형 인플루엔자는 인체에서 가장 주요한 호흡기 질환의 원인이며, 바이러스의 유전자 재배열에 의해서 새로운 바이러스가 출현하여, 인플루엔자 대유행 (pandemic)의 원인이 된다. A형 인플루엔자 바이러스 외피에는 돌출되어 있는 2가지 종류의 당 단백질인 hemagglutinin (HA)과 neuraminidase (NA)가 있으며, 인플루엔자 바이러스는 hemagglutinin의 종류에 따라 16가지의 subtype (H1-H16)으로 나뉘고, neuraminidase의 종류에 따라 9가지의 subtype (N1-N9)으로 구분된다. HA는 가장 중요한 항원 결정 부위 (antigenic determinant)로서 세포 표면에 존재하는 sialic acid 수용체와 결합하며, 결과적으로 바이러스가 숙주 내로 침투하는 것을 용이하게 한다. 또 다른 antigenic determinant인 NA는 숙주세포의 sialic acid를 제거함으로써, 비리온 (virion)과의 글리코시드 결합 (glycosidic linkage)의 분리를 촉매하고, virion aggregation을 예방하여, 숙주 세포로부터 새로 만들어진 바이러스가 쉽게 방출되도록 한다. A형 인플루엔자 바이러스의 막 단백질 (membrane protein)에는 M2 단백질이 소량 존재하는데, 바이러스의 내부 pH를 조절하여, 숙주 세포 안으로 들어온 바이러스의 외피를 벗기고, 바이러스의 RNA가 노출되게 한다.

사람에게서는 주로 H1N1형이나 H3N2형 등이 감염을 일으키지만, 대부분의 조류 인플루엔자는 사람에게서 경미한 증상이 나타나거나, 증세가 전혀 나타나지 않는다. 그러나 최근 닭과 같은 가금류와 철새에서 치명적인 고병원성 조류인플루엔자 바이러스 H5형과 H7형이 보고되고 있다. 조류인플루엔자의 haemagglutinin은 그 특성에 따라 숙주의 호흡기 세포 표면에 존재하는 sialic acid로 구성된 oligosaccharide를 인식하여 세포 표면에 부착되어 감염이 일어난다. SA (sialic acid)-α-2, 6-Gal과 결합하는 사람 인플루엔자 바이러스와는 달리, 대부분의 조류인플루엔자는 SA-α-2, 3-Gal과 결합하는 것으로 알려져 왔다. 그러나 고병원성 조류인플루엔자 바이러스인 H5N1은 SA-α-2, 3-Gal 뿐만 아니라 SA-α-2, 6-Gal도 인식할 수 있어, 사람에게로 감염 전파되는 것이 가능하며 중증의 폐질환을 일으킬 수 있다.

고병원성 조류인플루엔자 바이러스 H5N1은 1996년 중국 광동에서 처음 발견되었으며, 2003년에 인체로 감염되어 처음으로 사망 사례를 기록하였다. 2009년 2월까지 세계보건기구 WHO는 전 세계에 걸쳐 발생 건수 406건과 254건의 사망 사례를 보고하였다. 인체 감염 시 높은 치사율을 가진 조류인플루엔자 바이러스 H5N1가 국내에서는 아직 인체 감염 사례가 보고되고 있지 않지만, 2003년 충북 음성에서 가금류에 대한 최초 감염이 보고된 이후 2004년 연기군, 2005년과 2007년 충남지역에서 발생하여, 확산을 막기 위한 가금류의 살 처분으로 인해 관련 산업에서의 막대한 경제적인 손실뿐만 아니라 사회적인 비용 손실을 가져왔다. 2009년 3월에는 신종 A형 인플루엔자 H1N1 바이러스가 창궐하여, 전 세계적으로 확산되고 있으며, 약 4,000명의 사망 사례가 공식 집계되고 있다. 또한 칠레 가금류 농장에서 칠면조의 신종 인플루엔자 H1N1 바이러스 감염이 보고되어 변이된 신종 인플루엔자의 출현과 유행이 우려되고 있다.

인플루엔자 바이러스의 유행에 대항하기 위한 방법으로서 백신 개발은 높은 수준의 안전 시설과 기술을 필요로 하며, 바이러스의 단백질 변이에 따라 적합한 개발 과정이 필연적으로 필요하기 때문에 많은 시간과 비용이 뒤따른다. 최근에는 백신 개발 외에 항바이러스제 개발이 활발히 이루어지고 있다. Neuraminidase 억제제로서 zanamivir와 oseltamivir가 사용되고 있으며, 특히 oseltamivir는 'Tamiflu'라는 상표명으로 인플루엔자 감염 치료제로서 많이 사용되고 있다. 또한 M2 ion channel 억제제로서 amantadine과 rimantadine이 사용되고 있다. 이러한 항바이러스제들은 예방 및 치료제로서 사용되고 있지만, 향후에 저항성을 가진 변종 인플루엔자의 출현에 의해 그 사용이 제한될 수가 있다. Zanamivir의 경우 환자에게 사용함에 있어서 흡입기가 반드시 필요하고, 기관지 경련의 위험이 있어 주의가 필요하다. 내성 변이주의 출현과 투여 상 번거로움 외에도 투여 후 부작용 또한 이들 항 인플루엔자 치료제의 사용을 제한한다. Oseltamivir는 투여 환자에게서 신경계에 부작용을 가지고 있으며, 내성이 보고되고 있다.

현재 사용되는 항바이러스제들의 효과에 버금가는 천연물 유래 항바이러스 물질들에 대한 연구가 활발히 이루어지고 있다. 특히, 한국, 중국, 일본, 동남아시아와 같은 아시아에서 전통적으로 사용해오던 약용 식물 및 식용 식물의 약리 작용에 대한 연구가 활발하다. 녹차로부터 분리된 폴리페놀 화합물인 catechin이 MDCK 세 포 내에서의 인플루엔자 바이러스의 복제를 저해하며, direct virucidal effect를 가지고 있다고 보고 되었다. Haidari 등은 Punica granatum에서 분리한 pomegranate의 항바이러스 저해효과와 Oseltamivir와 함께 사용되었을 때, 상승효과에 대해 보고하였다. 본 발명자들은 고병원성 조류인플루엔자 H5N1에 대해 한약재인 세신 (Asarum sieboldii)의 항바이러스 활성을 입증하여 논문 투고 및 특허를 출원한 바 있다(특허원 제10-2008-111466호). 또한 선복화 (Inula japonica)의 조류인플루엔자 바이러스 H5N1에 대한 항바이러스 활성을 입증하여 특허를 출원한 바 있다(특허원 제10-2009-65849호).

Forsythia suspensa Vahl (의성개나리)는 물푸레나무과 (Oleaceae)에 속하는 식물로서 한의학에서는 연교 (連翹)라 불리는 열매를 사용하고 있다(도2). 주요성분은 lignin 류 화합물로서 phillygenin, pinoresinol, arctigenin, matairesinol, phillyrin 등이 함유되어 있으며, oleanic acid, suspenolic acid 등이 기타 성분으로 함유되어 있다. 연교의 약리 작용으로는 항염증, 항균, 항산화, 혈소판 활성 억제, 간 보호 효과 등이 보고되었다. Ozaki 등은 연교에서 분리한 물질을 쥐에 투여한 결과 carrageenin으로 유도한 부종을 억제하고 육아종 형성을 억제하였다고 보고하였으며, Chang 등은 연교에서 분리한 lignan류 화합물이 Cu²⁺로 유도되는 HDL의 산화를 억제한다고 보고하였다.

본 발명에서는 고병원성 조류인플루엔자 바이러스 H5N1에 대한 항바이러스 활성을 갖는 주요 한약재들을 탐색하여, 그 결과 연교 추출물의 우수한 항바이러스 효과를 검증하는데 그 특징이 있다.

따라서, 본 발명의 목적은 고병원성 조류인플루엔자 H5N1 에 대한 항바이러스 활성을 가지는 연교추출물을 제공함에 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 연교추출물을 유효성분으로 함유하는 고병원성 조류인플루엔자 H5N1 감염 예방 및 치료용 조성물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 상기 목적은 20가지의 한약재 약용식물의 메탄올 추출물을 준비하는 단계와; MEM배지에서 MDCK세포에 H5N1 조류인플루엔자 바이러스 100 TCID₅₀를 접종하여 배양하는 단계와; 상기 감염된 MDCK 세포를 PBS를 이용하여 세척하고 상기 한약재의 메탄올 추출물을 포함한 배지에 첨가하고 HA assay를 통하여 항바이러스 활성을 측정하는 단계와; 항바이러스 활성을 가지는 시료를 극성에 따라 분리하여 활성변화에 대응하는 분획물 (fractions)을 제조하는 단계를 통하여 달성하였다.

본 발명의 연교추출물은 H5N1 조류인플루엔자에 대한 항바이러스의 뛰어난 효과가 있다.

시료준비

실험에 사용된 20가지 한약재를 [표 1]에 나타내었다. 약용 식물의 메탄올 추출물은 도1과 같은 방법으로 준비하였다. 건조된 한약재 30 g을 마쇄한 후 300 mL의 99% 메탄올에 침지하여 24시간 동안 실온에서 방치였다. 여과지 (Whatman no. 2)를 이용하여 여과한 후 40℃ 이하에서 감압 농축하였다. 한약재 농축물을 -70℃에서 동결한 후 감압 하에서 동결건조를 실시하고, 4℃에서 보관하였다.

바이러스 증식

본 발명 실험에 사용된 조류인플루엔자 바이러스 (A/Vietnam/1194/04(H5N1)-NIBRG-14)는 한국질병관리본부, 세계보건기구 (WHO) 및 미국 질병관리본부 (CDC)의 허가를 받아 도입하여 BL-3 시설에서 사용하였다. 11일간 부화시킨 수정계란의 장뇨액 (allantoic fluid)를 이용하여 바이러스를 증식하여 사용하였다.

항바이러스 활성 검증

본 발명 한약재의 항바이러스 활성을 검증하기 위해 MDCK (Madin-Darby canine kidney) 세포를 항생제와 10%의 FBS가 첨가된 Eagle's minimum essential medium (MEM)에서 배양하였다. 24시간 배양하여 단층의 MDCK 세포를 얻은 후 100TCID₅₀의 H5N1 조류인플루엔자 바이러스를 접종하고, 바이러스의 감염을 위해 1시간 동안 재 배양 하였다. 바이러스에 감염된 MDCK 세포를 PBS를 이용하여 세척한 후 한약재의 methanol 추출물을 포함한 배지 (1:100)를 첨가하였다. 48시간 후 상등액의 바이러스 역가를 hemagglutination (HA) assay를 통하여 측정하여, 항바이러스 활성 여부 검증하였다. 시료를 첨가하지 않았을 때 바이러스 역가는 2⁷ HA unit이었으며, 시료를 첨가하지 않은 경우의 역가와 비교하여 4 log 이상 감소하였을 때 항바이러스 활성을 가진 것으로 판명하였다 [표 2].

고병원성 조류인플루엔자 바이러스 H5N1에 대한 항바이러스 활성을 갖는 천 연 소재를 탐색하기 위해 20가지 한약재의 항인플루엔자 활성을 검증하였다. 실험에 사용된 한약재 중에서 Forsythia suspensa Vahl 열매의 메탄올 추출물을 첨가했을 때 고병원성 조류인플루엔자 H5N1에 대해서 항바이러스 활성이 나타났다[표 1]. 시료를 첨가하지 않은 경우 바이러스의 역가는 2⁷HA unit이었으며, 시료를 첨가한 경우 2¹ HA unit으로, 6 log 감소하였다. Forsythia suspensa Vahl 열매의 메탄올 추출물을 동량의 n-hexane과 증류수로 분획하고, 같은 방법으로 chloroform, ethyl acetate, n-butanol로 순차적으로 분획한 후 분획물들의 항바이러스 활성을 검증한 결과 chloroform 분획물을 첨가한 경우 바이러스의 역가가 5 log 감소하였으며, 다른 분획물을 첨가했을 경우 유효한 활성 (4 log reduction)이 나타나지 않았다. 따라서 Forsythia suspensa Vahl의 조류인플루엔자 바이러스에 대한 항바이러스 활성을 갖는 주요 성분은 극성이 다소 적은 물질로 사료된다.

항바이러스 활성시료 분획

본 발명 실험에 사용된 약용 식물의 추출물 중에서 고병원성 조류인플루엔자 바이러스 H5N1에 대한 항바이러스 활성을 갖는 시료를 극성에 따라 분리하여 항바이러스 활성 변화를 검토하였다. 항바이러스 활성을 갖는 약용 식물의 메탄올 추출물을 증류수에 현탁한 후 동량의 n-hexane을 첨가하여 혼탁시키고, 층 분리가 나타날 때까지 정치시켰다. n-hexane 층이 투명해질 때까지 위의 과정을 반복하였으며, 과정이 완료된 후 chloroform, ethyl acetate, n-butanol을 이용하여 순차적으로 위의 과정을 반복하여 각각의 분획물을 제조하였다(도2). 항바이러스 활성은 최종적으로 HA assay를 이용하여 검증하였다(도3).

본 발명은 고병원성 조류인플루엔자 바이러스 H5N1에 대한 항바이러스 활성을 가지는 연교추출물을 제공하며 이를 유효성분으로 하는 조류인플루엔자 바이러스 예방 기능성식품 및 사료 첨가제 기타 치료용 약학적 조성물을 제공할 수 있으므로 고병원성 조류인플루엔자 바이러스 H5N1에 대응한 기능성식품 또는 생물의약 산업상 매우 유용한 발명인 것이다.

도1은 본 발명 실시예로서 한약재의 추출공정의 개략도이다.

도2는 본 발명 의성개나리 열매(연교)의 사진도이다.

도3은 본 발명 한약재 연교의 메탄올 추출물의 항바이러스 활성 분획물 분리공정도이다.

Claims

의성개나리(Forsythia suspensa Vahl)의 연교의 메탄올 추출물을 증류수에 현탁한 후 n-헥산으로 층분리한 후 동량의 클로로폼으로 추출한 분획물을 유효성분으로 함유함을 특징으로 하는 고병원성 조류인플루엔자 H5N1 바이러스 감염예방 또는 치료용 약학 조성물.
제1항의 조성물을 유효성분으로 함유하는 건강기능성식품.