KR101008463B1 - 항균 및 항바이러스 활성을 갖는 오배자 추출물 또는이로부터 분리된 화합물을 유효성분으로 함유하는 수의학적조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 항균 및 항바이러스 활성을 갖는 조성물에 관한 것으로, 상세하게는 오배자 추출물 또는 이로부터 분리된 화합물을 유효성분으로 함유하는 본 발명의 조성물은 돼지 호흡기 또는 소화기 질환에 대한 뛰어난 항균 및 항바이러스 효과를 나타내므로, 상기 질환의 예방 및 치료를 위한 수의학적 조성물 및 사료첨가제로 유용하게 이용될 수 있다.

오배자, 항균, 항바이러스

Description

항균 및 항바이러스 활성을 갖는 오배자 추출물 또는 이로부터 분리된 화합물을 유효성분으로 함유하는 수의학적 조성물 {A veterinary composition comprising extract of Galla Rhois or the compounds isolated therefrom showing antibacterial and antiviral activity}

본 발명은 오배자 추출물 또는 이로부터 분리된 화합물을 유효성분으로 함유하는 돼지 호흡기 또는 소화기 질환의 예방 및 치료용 수의학적 조성물 및 사료첨가제에 관한 것이다.

[문헌 1] 강영배, 권창희, 권병준 등, 돼지 유행성 설사: 발생피해, 병리진단 및 방역 대책, 대한수의사회지, 31, pp.38-56, 1994

[문헌 2] 정보섭 외, 향약대사전, pp.380-384, 영림사, 1998

[문헌 3] Harborne J.B., Phytochemical methods: A guide to modern techniques of plant analysis , 3 rd Ed., pp.6-7, 1998

[문헌 4] Cha et al., Kor . J. Pharmacogn ., 31, pp.185-189, 2000

[문헌 5] Nishizawa et al., J. Chem . Soc . Perkin Trans . I, pp.2963-2968, 1982

[문헌 6] Khanbabaee and Lotzerich, Tetrahedron, 53, pp.10725-10732, 1997

[문헌 7] Redwane et al., J. Ethnopharmacol ., 79, pp.261-263, 2002

[문헌 8] Kim O, Chae C. Journal of Comparative Pathology. 129, pp.55-60, 2003

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[문헌 10] Yang et al., Yaoxue Xuebao, 34, pp.457-462, 1999

항생제가 가축의 질병예방에 만병통치약으로 인식되면서 사료첨가제 형태로 많은 양의 항생제들이 축산 동물에 급여되고 있다. 사료첨가제 항생제들은 전염병의 예방과 그로 인한 증체율 향상 등의 긍정적 효과가 있으나, 공중보건학적으로 식육 중의 항생제 잔류와 그를 섭취한 사람들에서 항생제 내성 문제가 크게 대두되고 있는 실정이다. 항생제 내성을 가지는 여러 가지 세균들 중 대표적으로 메티실린-저항 황색포도상구균(Methicillin-resistant S. aureus; MRSA), 반코마이신-저항 엔테로코시(Vancomycin-resistant enterococci; VRE), 반코마이신-매개 황색포도상구균(Vancomycin intermediate S. aureus; VISA), 그리고 최소 6종 이상의 항생제 내성을 가진 대장균(E. coli) O157:H7 등이다. 현재 가축에서의 항생제 및 항균제 사용은 축산물의 안전성 문제로 인해 규제가 날로 강화되고 있으며 특히 배합사료에 첨가되는 항생제 사용규제가 향후 더욱 강화될 것으로 보이며 잔류검사 강화로 축산 농가들도 휴약 기간이 긴 항생제 사용을 기피하고 있다. 농가들이 이의 대체제로 생균제 사용을 선호하고 있지만 확실한 효력검증이 되지 않아 축산 농가들의 피해가 우려되는 상황이다.

이와 같은 항생제로 인한 피해를 최소화하고 이를 대체할 수 있는 물질에 대한 연구 또한 활발하여 오래전부터 민간요법으로 사용되어 오던 식물이나 생균제(probiotics) 등을 이용하여 항균 효과 또는 항바이러스 효과 등을 얻고자 하는 연구가 진행되고 있다.

대장균(Enterotoxigenic E. coli: 장관독소원성 대장균)은 인체 및 가축의 장내에서 증식하는 병원성 세균으로서 소아뿐만 아니라 건강한 성인에게도 위장염과 관련 있는 원인균으로 알려져 있다. 돼지에서 병원성대장균은 심한 설사를 유발하여 어린 돼지 폐사의 주요 원인이 되고 있으며 성돈의 경우에도 설사로 인한 체중증체 저하로 축산 농가에 경제적 손실을 입히는 것으로 보고되고 있다. 병원성대장균 감염증은 국내 양돈 농가에서 만연하는 질병으로 경제적 손실 액수가 막대하여 효과적인 예방법 확립이 절실히 필요한 실정이다.

코로나 바이러스는 국내, 외 돼지 사육 현장에서 발생하는 중요한 전염성 위장염, 일종의 설사병의 원인 바이러스(transmissible gastroenteritis virus; TGEV)로써, 포유 자돈의 80~90%, 자돈의 20% 이상을 폐사시키며, 육성돈과 성돈에서는 식욕을 감퇴시켜서 성장을 저해시킨다. 이러한 질병은 양돈장 및 자연환경에 서식하는 코로나 바이러스에 의해서 일어나며, 또한 이 바이러스는 전염성이 강하여 그 폐해가 더욱더 증가하고 있는 실정이다.

코로나 바이러스는 돼지 전염성 위장염, 설사증 등의 증상을 통해 가축을 포함한 동물 및 사람 등에 영향을 미치므로, 항생제를 투여하더라도 코로나 바이러스에 대한 치료 효과를 볼 수 없으며 단지 2차 감염을 일으키는 미생물에 대한 치료 효과만 기대할 수 있다. 또한 돼지에서는 전염성 위장염(transmissible gastroenteritis; TGE) 코로나 바이러스의 감염 예방을 위해 백신이 사용되고 있으나 백신 사용에 의한 부작용이 발생할 수 있다는 문제점이 제기되고 있다.

PEDV(Porcine epidemic diarrhea virus)는 돼지에 설사를 유발하는 코로나 바이러스로서 연중 발생하여 국내 양돈 농가에 막대한 경제적 손실을 유발하는 돼지 유행성 설사병(Porcine epidemic diarrhea; PED)이다. PED는 어린 연령의 설사에 의한 폐사를 유발하며, 성돈의 경우 설사에 의한 체중 감소로 경제적 손실과 전파원으로서 역할이 문제가 되고 있다. PEDV에 대한 여러 종류의 백신이 국내에 도입되고 있지만 PED에 의한 피해가 줄어들고 있지 않아 국내 양돈 산업에 막대한 경제적 손실을 유발하는 것으로 알려져 있다(강영배, 권창희, 권병준 등, 돼지 유행성 설사: 발생피해, 병리진단 및 방역 대책, 대한수의사회지, 31, pp.38-56, 1994). 따라서 안전하게 사용할 수 있는 효율적인 예방책이 절실히 필요하다.

오배자는 옻나무과(Anacardiaceae)에 속하는 붉나무(Rhus javanica L.)의 잎에 오배자진딧물(Aphis chinensis J. Bell)이 자상 (刺傷)을 주어 생긴 벌레집을 말하는데, 우리나라 각지에 분포한다. 오배자의 형태를 보면, 외면은 회갈색으로 연한 털이 있고, 길이는 3∼7cm, 폭 2∼5cm, 두께 2mm 정도이며 단단하면서도 쉽게 부숴 진다. 속은 대개 비어 있거나 회백색의 죽은 벌레와 분비물이 남아 있을 때도 있고, 역겨운 냄새가 나기도 한다. 채집한 오배자는 햇볕에 말리거나 삶거나 찐다. 주성분은 피로가롤 탄닌 (pyrogalloltannin)이 50~70% 함유되어 있으며, 몰식자산, 갈산 (gallic acid) 등이 있다. 약효로는 수렴, 지사, 지혈제로 설사, 가래, 당뇨, 하혈, 빈혈 등에 이용한다 (정보섭 외, 향약대사전, pp 380~384, 영림사, 1998)

이에 본 발명자들은 오배자 추출물 또는 이로부터 분리된 화합물을 유효성분으로 함유하는 항균 및 항바이러스 제재를 개발하여 돼지 호흡기 또는 소화기 질환에 대한 항균 및 항바이러스 효과가 뛰어남을 확인하여 본 발명을 완성하였다.

상기한 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 오배자 추출물 또는 이로부터 분리된 화합물을 유효성분으로 함유하는 돼지 호흡기 또는 소화기 질환의 예방 및 치료용 수의학적 조성물을 제공한다.

또한 본 발명의 오배자(Galla Rhois) 추출물로부터 분리된 화합물은 하기 구조식 (1) 내지 (5)로 표기되는 갈산(gallic acid; 1), 파라 디 갈산과 메타 디 갈산의 복합물(a mixture of methyl p-digallic acid and methyl m-digallic acid; 2), 팬타 오-갈로일 글루코스(penta-O-galloyl glucose; 3), 에틸 갈레이트(ethyl gallate; 4) 또는 에틸 파라 디 갈레이트와 에틸 메타 디 갈레이트의 복합물(a mixture of ethyl p-digallate and ethyl m-digallate; 5), 바람직하게는 파라 디 갈산과 메타 디 갈산의 복합물(a mixture of p-digallic acid and m-digallic acid) 또는 에틸 파라 디 갈레이트와 에틸 메타 디 갈레이트의 복합물(a mixture of ethyl p-digallate and ethyl m-digallate), 보다 바람직하게는 이들의 1~2: 1 중량비의 복합물, 가장 바람직하게는 이들의 1: 1 중량비의 복합물을 유효성분으로 함유하는 수의학적 조성물을 제공한다.

(1)

(2)

(3)

(4)

(5)

또한, 본 발명은 오배자 추출물 또는 이로부터 분리된 화합물을 유효성분으로 함유하는 돼지 호흡기 또는 소화기 질환의 예방 및 개선용 동물사료 첨가제 및 이를 포함하는 사료를 제공한다.

본원에서 정의되는 추출물은 물, C₁ 내지 C₄의 저급알코올 또는 이들의 혼합용매로부터 선택된 용매, 바람직하게는 물 또는 물 및 에탄올의 혼합용매, 보다 바 람직하게는 50 내지 90% 에탄올 혼합용매, 가장 바람직하게는 70 내지 80% 에탄올 혼합용매로 추출한 것을 포함한다.

상기 질환은 포유동물, 가금류 및 어류에 발생하는 것을 특징으로 한다.

본원에서 정의되는 돼지 호흡기 질환 원인균은 맨하이미아 해모리티카(Mannheimia haemolytica), 해모필러스 솜너스(Haemopilus somnus), 파스튜렐라 멀토시다(Pasteurella multocida), 마이코 플라즈마(Mycoplasma hyopneumoniae) 또는 흉막폐렴균(Actinobacillus pleuropneumonia)을 포함하고, 바람직하게는 파스튜렐라 멀토시다(Pasteurella multocida), 마이코 플라즈마(Mycoplasma hyopneumoniae) 또는 흉막폐렴균(Actinobacillus pleuropneumonia)을 포함한다.

본원에서 정의되는 돼지 호흡기 질환 원인 바이러스는 PVC-2(Porcine circo virus type 2), PPV(Porcine parvovirus), PEV(Porcine entero virus), SIV(Swine influenza virus) 또는 PRRSV(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus)를 포함한다.

또한 본원에서 정의되는 돼지 소화기 질환 원인균은 에르시니아(yersinia), 하이오디센테리아(hyodysenteriae), 캄필로박터(campylobacter), 클로스트리듐(clostridium), 살모넬라(Salmonella spp.), 로소니아 인트라셀룰라리스(Lawsonia intracellularis), 브라키스피라 필로시콜리(Brachyspira pilosicoli) 또는 대장균(E.coli)을 포함하고, 바람직하게는 살모넬라(Salmonella spp.) 또는 대장균(E. coli)을 포함한다.

본원에서 정의되는 돼지 소화기 질환 원인 바이러스는 TGE( Transmissible Gastroenteritis) 바이러스 또는 PEDV(Porcine epidemic diarrhea virus) 등의 코로나바이러스(coronaviridae)를 포함하고, 바람직하게는 PEDV(Porcine epidemic diarrhea virus)를 포함한다.

상기 돼지 호흡기 질환은 돼지 파스튜렐라 폐렴, 돼지 마이코플라즈마 폐렴, 돼지 위축성 비염, 돼지 흉막폐렴, 글래써병, PRRS(Porcine reproductive and respiratory syndrome, 돼지 생식기 호흡기 증후군), PMWS(Post-weaning Multisystemic Wasting Syndrome, 이유후 전신성 소모성증후군) 또는 PRDC(Porcine Respiratory Disease Complex, 돼지호흡기 복합증후군)를 포함하고, 바람직하게는 돼지 파스튜렐라 폐렴, 돼지 마이코플라즈마 폐렴, 돼지 위축성 비염 또는 돼지 흉막폐렴을 포함하며, 보다 바람직하게는 돼지 마이코플라즈마 폐렴 또는 돼지 흉막폐렴을 포함한다.

상기 돼지 소화기 질환은 에르시니아 장염, 증식성 회장염, 결장염, 돈적리, 비감염성 결장염, 살모넬라성 장염, 대장균성 설사, TGE(Transmissible Gastroenteritis, 전염성 위장염) 또는 PED(Porcine Epidemic Diarrhea, 돼지유행성설사)를 포함하고, 바람직하게는 증식성 회장염, 결장염, 대장균성 설사 또는 살모넬라성 장염을 포함하며, 보다 바람직하게는 증식성 회장염 또는 결장염을 포함한다.

이하, 본 발명의 추출물 및 화합물을 수득하는 방법을 상세히 설명한다.

본 발명의 오배자 추출물은, 건조된 오배자를 세절하여 건조 중량의 약 1 내 지 30배, 바람직하게는 약 10 내지 20배의 물, C₁ 내지 C₄의 저급 알콜 또는 이들의 혼합용매, 바람직하게는 물 또는 물 및 에탄올의 혼합용매로, 보다 바람직하게는 50 내지 90% 에탄올 혼합용매, 가장 바람직하게는 70 내지 80% 에탄올 혼합용매로, 20 내지 100℃, 바람직하게는 80 내지 100℃ 추출온도에서 약 1시간 내지 10일, 바람직하게는 약 2시간 내지 5시간동안 냉침추출, 열수추출, 초음파 추출, 환류냉각 추출 등의 추출방법, 바람직하게는 환류냉각 추출방법을 이용하여 1 내지 5회, 바람직하게는 2 내지 3회 반복 추출한 후 감압 농축하는 단계를 포함하는 공정을 통하여 본 발명의 오배자 추출물을 수득할 수 있다.

따라서, 본 발명은 상기 제조 방법 및 상기 제조방법으로부터 수득됨을 특징으로 하는 본원 도 1(HPLC)에 기재되는 바와 같은 갈산(1), 파라 디 갈산과 메타 디 갈산의 복합물(2), 에틸 갈레이트(4) 및 에틸 파라 디 갈레이트와 에틸 메타 디 갈레이트의 복합물(5)의 함유비(4.3:1:7.2:16.3)로 구성되는 오배자 70% 에탄올 추출물(이하 “GR”이라 함)을 제공한다.

본 발명의 화합물은, 상기 오배자 추출물을 수득하는 제 1단계; 상기 조추출물을 증류수에 녹인 후, 앰버라이트 XAD-2 수지 컬럼에 걸고 증류수, 50% 수성 에탄올 및 에탄올로 각각 용출하는 제 2단계; 제 2단계에서 수득한 50% 수성 에탄올 용출 분획물을 크로마토그래피를 수행하여 7개의 분획으로 나누는 제 3단계; 상기 제 3단계의 분획 중 첫 번째 분획을 크로마토그래피를 수행하여 3개의 분획으로 나누는 제 4단계; 상기 제 4단계의 분획물 중 첫 번째 분획을 실리카겔 컬럼 크로마 토그래피로 분리하여 갈산을 수득하는 제 5단계; 상기 제 4단계의 분획물 중 두 번째 분획을 컬럼 크로마토그래피를 실시하여 파라 디갈산과 메타 디갈산의 복합물을 수득하는 제 6단계; 상기 제 4단계의 분획물 중 세 번째 분획을 컬럼 크로마토그래피를 실시하여 팬타 오-갈로일 글루코스를 수득하는 제 7단계; 상기 제 4단계의 분획물 중 네 번째 분획을 컬럼 크로마토그래피를 실시하여 에틸 갈레이트를 수득하는 제 8단계; 상기 제 4단계의 분획물 중 여섯 번째 분획을 컬럼 크로마토그래피를 실시하여 에틸 파라 디 갈레이트와 에틸 메타 디 갈레이트의 복합물을 수득하는 제 9단계의 제조 공정을 통해 본 발명의 오배자 추출물로부터 순수 분리된 화합물을 수득할 수 있다.

또한, 추가로 통상의 분획 공정을 수행할 수도 있다(Harborne J.B., Phytochemical methods: A guide to modern techniques of plant analysis , 3 rd Ed ., pp.6-7, 1998).

본 발명은 상기의 제조방법으로 얻어진 오배자 추출물 또는 이로부터 분리되어진 갈산, 파라 디 갈산과 메타 디 갈산의 복합물, 팬타 오-갈로일 글루코스, 에틸 갈레이트 및 에틸 파라 디 갈레이트와 에틸 메타 디 갈레이트의 복합물을 유효성분으로 포함하는 돼지 호흡기 또는 소화기 질환의 예방 및 치료용 조성물은 총 중량에 대하여 상기 추출물 또는 이로부터 분리된 화합물을 0.1 ~ 50 중량% 포함한다.

본 발명에 따른 오배자 추출물 또는 이로부터 분리된 화합물은 종류와는 상관없이 일정한 항균 및 항바이러스 효과를 나타내었다.

본 발명의 추출물 또는 이로부터 분리된 화합물은 독성 및 부작용이 거의 없으므로 예방 목적으로 장기간 투여 시에도 안심하고 사용할 수 있다.

본 발명의 추출물 또는 이로부터 분리된 화합물의 수의학적 투여 형태는 이들의 수의학적 허용 가능한 염의 형태로도 사용될 수 있고, 또한 단독으로 또는 타 수의학적 활성 화합물과 결합뿐만 아니라 적당한 집합으로 사용될 수 있다.

본 발명의 추출물 또는 이로부터 분리된 화합물을 포함하는 수의학적 조성물은 수의학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다.

본 발명의 추출물 또는 이로부터 분리된 화합물을 포함하는 수의학적 조성물에 포함될 수 있는 부형제 및 희석제로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트, 세탄올, 스테아릴알콜, 유동파라핀, 솔비탄모노스테아레이트, 폴리소르베이트 60, 메칠파라벤, 프로필파라벤 및 광물유를 들 수 있다.

본 발명에 따른 추출물 또는 이로부터 분리된 화합물을 포함하는 수의학적 조성물은 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향신료, 유화제, 방부제 등을 추가로 포함할 수 있는데, 본 발명에 의한 수의학적 조성물은 동물에 투여된 후 활성성분의 신속, 지속 또는 지연된 방출을 제공할 수 있도록 당업계에 잘 알려진 방법을 사용하여 제형화될 수 있고, 제형은 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 용액, 시럽, 에어로졸, 연질 또는 경질 젤라틴 캅셀, 좌제, 멸균 주사용액, 멸균 외용제 등의 형태일 수 있다.

본 발명에 의한 수의학적 조성물은 동물의 나이, 성별, 체중에 따라 달라질 수 있으나, 0.1 내지 100 mg/㎏의 양을 1일 1회 내지 수회 투여할 수 있다. 또한 오배자 추출물 또는 이로부터 분리된 화합물의 투여량은 투여경로, 질병의 정도, 성별, 체중, 나이 등에 따라서 증감될 수 있다. 따라서 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

또한, 본 발명은 상기 공정에서 얻어지는 오배자 추출물 또는 이로부터 분리된 화합물을 유효성분으로 함유하는 돼지 호흡기 또는 소화기 질환의 예방 및 개선에 유용한 동물사료 첨가제 및 이를 포함하는 사료를 제공한다.

상기의 동물사료 첨가제용 오배자 추출물 또는 이로부터 분리된 화합물은 20 내지 90% 고농축액이거나 분말 또는 과립형태일 수 있다.

본 발명의 동물사료 첨가제용 추출물 또는 이로부터 분리된 화합물은은 구연산, 후말산, 아디픽산, 젖산, 사과산 등의 유기산이나 인산나트륨, 인산칼륨, 산성피로인산염, 폴리인산염(중합인산염) 등의 인산염이나 폴리페놀, 카테킨(catechin), 알파-토코페롤, 로즈메리 추출물(rosemary extract), 비타민 C, 녹차 추출물, 감초 추출물, 키토산, 탄닌산, 피틴산 등의 천연 항산화제 중 어느 하나 또는 하나 이상을 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 추출물 또는 이로부터 분리된 화합물을 함유하는 동물사료 첨가제 및 이를 포함하는 사료는 보조성분으로 아미노산, 무기염류, 비타민, 항생물질, 항 균물질, 항산화, 항곰팡이 효소, 살아있는 미생물 제제 등과 같은 각종보조제가 곡물, 예를 들면 분쇄 또는 파쇄된 밀, 귀리, 보리, 옥수수 및 쌀; 식물성 단백질 사료, 예를 들면 평지, 콩 및 해바라기를 주성분으로 하는 것; 동물성 단백질 사료, 예를 들면 혈분, 육분, 골분 및 생선분; 당분 및 유제품, 예를 들면 각종 분유 및 유장 분말로 이루어지는 건조 성분, 건조 첨가제를 모두 혼합한 후, 액체 성분과, 가열 후에 액체가 되는 성분, 즉, 지질, 예를 들면 가열에 의해 임의로 액화시킨 동물성 지방 및 식물성 지방 등과 같은 주성분 이외에 영양보충제, 소화 및 흡수향상제, 성장촉진제, 질병예방제 등과 같은 물질과 함께 사용될 수 있다.

상기 동물사료 첨가제용 오배자 추출물 또는 이로부터 분리된 화합물은 동물에게 단독으로 식용 담체 중에서 다른 사료 첨가제와 조합되어 투여될 수 있다.

또한, 상기 동물사료 첨가제용 추출물 또는 이로부터 분리된 화합물은 탑 드레싱으로서 또는 이들을 동물 사료에 직접 혼합하거나 또는 사료와 별도로, 별도의 경구 제형으로, 주사 또는 경피로 또는 다른 성분과 조합하여 쉽게 투여할 수 있다. 통상적으로, 당업계에 잘 알려진 바와 같이 단독 일일 투여량 또는 분할 일일 투여량을 사용할 수 있다.

상기 동물사료 첨가제용 추출물 또는 이로부터 분리된 화합물을 동물 사료와 별도로 투여할 경우, 당업계에 잘 알려진 바와 같이 이들을 비-독성 제약상 허용 가능한 식용 담체와 조합하여 즉석 방출 또는 서방성 제형으로 제조할 수 있다. 이러한 식용 담체는 고체 또는 액체, 예를 들어 옥수수 전분, 락토스, 수크로스, 콩 플레이크, 땅콩유, 올리브유, 참깨유 및 프로필렌 글리콜일 수 있다. 고체 담체가 사용될 경우, 추출물의 투여형은 정제, 캡슐제, 산제, 토로키제 또는 함당정제 또는 미분산성 형태의 탑 드레싱일 수 있다. 액체 담체가 사용될 경우, 연 젤라틴 캡슐제, 또는 시럽제 또는 액체 현탁액제, 에멀젼제 또는 용액제의 투여 형태일 수 있다. 또한, 투여 형태는 보조제, 예를 들어 보존제, 안정화제, 습윤제 또는 유화제, 용액 촉진제 등을 함유할 수 있다. 또한 이들은 바이러스로 인한 질환의 개선 및 예방상 유용한 다른 물질을 함유할 수 있다.

또한, 오배자 추출물 또는 이로부터 분리된 화합물이 동물사료 첨가제로 포함되는 동물사료는 동물의 식이 요구를 충족시키는데 통상적으로 사용되는 임의의 단백질-함유 유기 곡분일 수 있다. 이러한 단백질-함유 곡분은 통상적으로 옥수수, 콩 곡분 또는 옥수수/콩 곡분 믹스로 주로 구성되어 있다.

상기의 동물사료 첨가제는 침지, 분무 또는 혼합하여 상기 동물사료에 첨가하여 이용될 수 있다.

본 발명은 포유류, 가금 및 어류를 포함하는 다수의 동물 식이에 적용할 수 있다. 보다 상세하게, 식이는 상업상 중요한 포유류, 예를 들어 돼지, 소, 양, 염소, 실험용 설치 동물(랫트, 마우스, 햄스터 및 게르빌루스쥐), 모피 소유 동물 (예를 들어, 밍크 및 여우), 및 동물원 동물 (예를 들어, 원숭이 및 꼬리 없는 원숭이), 뿐만 아니라 가축 (예를 들어, 고양이 및 개)에게 사용할 수 있다. 통상적으로 상업상 중요한 가금에는 닭, 터키, 오리, 거위, 꿩 및 메추라기가 포함된다. 송어와 같은 상업적으로 사육되는 어류도 포함될 수 있다.

본 발명에 따른 추출물 또는 이로부터 분리된 화합물을 포함한 동물용 사료 배합 방법은, 오배자 추출물 또는 이로부터 분리된 화합물을 동물 사료에 건조 중량 기준으로 사료 1 ㎏당 약 1 g 내지 100 g의 양으로 혼입한다.

또한, 사료 혼합물은 완전히 혼합한 후, 성분들의 분쇄 정도에 따라 경점성의 조립 또는 과립 물질이 얻어진다. 이것을 매시로서 공급하거나, 또는 추가 가공 및 포장을 위해 원하는 분리된 형상으로 형성한다. 이 때, 저장 중에 분리되는 것을 방지하기 위해, 동물 사료에 물을 첨가하고, 이어서 통상의 펠릿화, 팽창화, 또는 압출 공정을 거치는 것이 바람직하다. 과잉의 물은 건조 제거될 수 있다.

상기에 언급한 바와 같이, 본 발명의 오배자 추출물 또는 이로부터 분리된 화합물은 돼지 호흡기 또는 소화기 질환에 대하여 뛰어난 항균 및 항바이러스 효과를 나타내어 돼지 호흡기 또는 소화기 질환의 예방 및 치료를 위한 수의학적 조성물 및 사료첨가제로 유용하게 이용될 수 있다.

이하, 본 발명을 하기의 실시예 및 실험예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예 및 실험예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 오배자 조추출물의 제조

1-1. 오배자 물 추출물의 제조

익산시 소재 대학한약국에서 구입한 건조된 오배자를 분쇄기를 이용하여 입자의 크기가 30메시(mesh) 이하가 되도록 분쇄하여 오배자 분말을 수득한 후, 상기에서 수득한 건조된 오배자(30 g) 질량의 10배에 해당하는 증류수를 가하여 100℃에서 2시간 동안 환류 냉각 추출하고 여과 및 동결건조하여 20.0 g의 오배자 물 추출물(이하 “G"라 명명함; 추출율 66.7%)을 수득하였다.

1-2. 오배자 에탄올 추출물의 제조

1-2-1. 70% 에탄올 추출물의 제조

익산시 소재 대학한약국에서 구입한 건조된 오배자를 분쇄기를 이용하여 입자의 크기가 30메시 이하가 되도록 분쇄하여 분말을 수득한 후, 상기에서 수득한 건조된 오배자(30 g) 질량의 10배에 해당하는 70% 수성 에탄올을 가하여 100℃에서 2시간 동안 환류 냉각 추출하고 여과 및 감압 농축 (EYELA사, N-1000, 일본)하여 22.4 g의 오배자 에탄올 추출물(이하 “GR"이라 명명함; 추출율 74.7%)을 수득하였다.

1-2-2. 30% 에탄올 추출물의 제조

추출용매로 30% 에탄올 추출용매를 사용하는 점만 달리하고 상기 제조공정과 동일하게 추출을 수행하여 오배자 30% 에탄올 추출물(추출율 67.9%)을 수득하였다.

1-2-3. 50% 에탄올 추출물의 제조

추출용매로 50% 에탄올 추출용매를 사용하는 점만 달리하고 상기 제조공정과 동일하게 추출을 수행하여 오배자 50% 에탄올 추출물(추출율 69.7%)을 수득하였다.

1-2-4. 100% 에탄올 추출물의 제조

추출용매로 100% 에탄올 추출용매를 사용하는 점만 달리하고 상기 제조공정과 동일하게 추출을 수행하여 오배자 100% 에탄올 추출물(추출율 53.3%)을 수득하였다.

실시예 2. 오배자 에탄올 추출물로부터 화합물의 분리

2-1. 수지에 의한 오배자 에탄올 추출물의 분획물 제조

상기 실시예 1-2-1 단계에서 얻은 GR 37.3 g을 앰버라이트 XAD-2 수지 컬럼에 걸고 각각 1 ℓ의 증류수, 50% 에탄올, 에탄올을 용출용매로 사용하여 크로마토그래피를 실시하여 증류수, 50% 에탄올 및 에탄올의 용출 분획을 얻었다.

2-2. 갈산의 분리 ( 화합물1 )

상기 실시예 2-1 단계에서 얻은 50% 에탄올 용출분획 2.5 g을 취하여 역상 YMC 컬럼에 걸고 메탄올:증류수 (3:7→5:5→10:0,v/v)을 용출용매로 사용하여 크로마토그래피를 실시하여 박층 크로마토그래피에서 동일한 양상을 나타내는 것들을 합하고 농축하여 7개의 분획 (A-G)으로 나누었으며, 이중 첫 번째 분획인 A (0.9 g)를 세파덱스 LH-20 컬럼에 걸고 클로로포름과 메탄올 (6:1→3:1→1:1,v/v)을 용출용매로 사용하여 크로마토그래피를 실시하여 3개의 이차 분획으로 소분획 (A1~A3)하였다. 이차분획 중 첫 번째 분획인 A1 (30 mg)을 클로로포름:메탄올:증류 수 (6:1:0.1, v/v)를 용출용매를 사용하여 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피를 실시하여 화합물1 (7 mg)을 수득하였고, 기기분석결과 하기 물성치를 갖는 갈산 (gallic acid)임을 확인하였다 (Cha et al., Kor . J. Pharmacogn ., 31, pp.185-189, 2000).

무색분말: (-)-ESI-MS m/z 169 [M-H]^-

¹H-NMR (acetone-d ₆, 500 MHz): 7.06 (2H, s, galloyl-2, 6).

2-3. 파라 디 갈산과 메타 디 갈산의 분리 ( 화합물2 )

상기 실시예 2-2 단계에서 얻은 2차 분획 중 두 번째 분획인 A2 (80 mg)를 클로로포름:메탄올:증류수 (4.5:1:0.1, v/v)를 사용하여 실리카겔 컬럼 크로마토그래피를 실시하여 화합물2 (50 mg)를 수득하였고, 기기분석결과 하기 물성치를 갖는 파라 다이 갈산과 이의 아이소머인 (isomer) 메타 다이 갈산 (p- and m-digallic acid) 복합물임을 확인하였다 (Nishizawa et al., J. Chem . Soc . Perkin Trans . I, pp.2963-2968, 1982).

무색분말: (-)-ESI-MS m/z 321 [M-H]^-

¹H-NMR (acetone-d ₆, 500 MHz): (p-digallic acid) 7.20 (2H, s, galloyl-2', 6'), 7.11 (2H, s, galloyl-2, 6); (m-digallic acid) 7.40 (1H, d, J = 1.8 Hz, galloyl-2), 7.23 (1H, d, J = 1.8 Hz, galloyl-6), 7.20 (2H, s, galloyl-2', 6').

¹³C-NMR (acetone-d ₆, 125 MHz): (p-digallic acid) 128.5 (C-1), 108.8 (C-2, 6), 150.4 (C-3,5), 131.3 (C-4), 168.0 (C=O), 119.4 (C-1'), 109.7 (C-2', 6'), 145.3 (C-3',5'), 138.8 (C-4'), 164.7 (C'=O); (m-digallic acid) 121.0 (C-1), 114.0 (C-2), 146.1 (C-3), 142.7 (C-4), 138.8 (C-5), 116.4 (C-6), 167.7 (C=O), 119.5 (C-1'), 109.8 (C-2', 6'), 145.4 (C-3',5'), 139.0 (C-4'), 164.22 (C'=O).

2-4. 팬타 오- 갈로일 글루코스의 분리 ( 화합물3 )

상기 실시예 2-2 단계에서 얻은 2차 분획 중 세 번째 분획인 A3 (460 mg)를 세파덱스 LH-20 컬럼에 걸고 메탄올을 용출용매로 사용하여 크로마토그래피를 실시하여 1개의 분획 (A31)으로 정제하였다. A31을 역상 YMC 컬럼에 걸고 메탄올:증류수 (4:6, v/v)을 용출용매로 사용하여 크로마토그래피를 실시하여 박층 크로마토그래피에서 동일한 양상을 나타내는 것들을 합하고 농축하여 4개의 분획 (A311-A314)으로 나누었으며, 이중 세 번째 분획인 A313 (146 mg)을 메탄올:증류수 (8:2→9:1→10:0, v/v)를 사용하여 세파덱스 LH-20 컬럼 크로마토그래피를 실시하여 화합물3 (42 mg)를 수득하였고, 기기분석결과 하기 물성치를 갖는 팬타 오-갈오일 글루코스 (penta-O-galloyl-β-D-glucopyranose)임을 확인하였다 (Khanbabaee and Lotzerich, Tetrahedron, 53, pp.10725-10732, 1997).

무색분말: (-)-ESI-MS m/z 939 [M-H]^-

¹H-NMR (CD₃OD, 500 MHz): 7.10, 7.04, 6.97, 6.94, 6.89 (each 2H, s, galloyl-2, 6), 6.23 (1H, d, J = 8.2 Hz, H-1), 5.90 (1H, t, J = 9.6 Hz, H-3), 5.61 (1H, t, J = 9.6 Hz, H-4), 5.58 (1H, t, J = 9.6 Hz, H-2), 4.35-4.51 (3H, m, H-5, 6).

¹³C-NMR (CD₃OD, 125 MHz): 92.5 (C-1), 70.8 (C-2), 72.7 (C-3), 68.4 (C-4), 73.1 (C-5), 61.8 (C-6), 118.4, 118.8, 118.9, 119.0, 119.6 (galloyl-1), 109.0, 109.1, 109.3 (galloy-2, 6), 144.8, 144.9, 145.0, 145.1, 145.2 (galloy-3, 5), 138.7, 138.8, 139.0, 139.1, 139.4 (galloy-4), 164.9, 165.6, 165.7, 165.9, 166.6 (C=O).

2-5. 에틸 갈레이트의 분리 ( 화합물4 )

상기 실시예 2-2 단계에서 얻은 분획 중 4 번째 분획인 D (430 mg)를 클로로포름:메탄올:증류수 (9:1:0.1, v/v)를 사용하여 실리카겔 컬럼 크로마토그래피를 실시하여 화합물4 (240 mg)를 수득하였고, 기기분석결과 하기 물성치를 갖는 에틸 갈레이트 (ethyl gallate)임을 확인하였다 (Redwane et al., J. Ethnopharmacol., 79, pp.261-263, 2002).

무색분말: (-)-ESI-MS m/z 197 [M-H]^-

¹H-NMR (acetone-d ₆, 500 MHz): 7.11 (2H, s, galloyl-2, 6), 4.23 (2H, q, J = 7.3 Hz, OCH₂), 1.30 (3H, t, J = 7.3 Hz, CH₃).

¹³C-NMR (acetone-d ₆, 125 MHz): 121.3 (C-1), 108.9 (C-2, 6), 145.2 (C-3, 5), 137.8 (C-4), 60.0 (OCH₂), 13.8 (CH₃), 165.9 (C=O).

2-6. 에틸 파라 디 갈레이트와 에틸 메타 디 갈레이트의 분리 ( 화합물5 )

상기 실시예 2-2단계에서 얻은 분획 중 6 번째 분획인 F (190 mg)를 역상 YMC 컬럼에 걸고 메탄올:증류수 (4:6, v/v)을 용출용매로 사용하여 크로마토그래피를 반복 실시하여 화합물5 (15.6 mg)를 수득하였고, 기기분석결과 하기 물성치를 갖는 에틸 파라 디 갈레이트와 이의 아이소머인 (isomer) 에틸 메타 디 갈레이트 (ethyl p- and m-digallate)혼합물임을 확인하였다 (Nishizawa et al., J. Chem . Soc . Perkin Trans. I, pp.2963-2968, 1982; Yang et al., Yaoxue Xuebao, 34, pp.457-462, 1999).

무색분말: (-)-ESI-MS m/z 349 [M-H]^-

¹H-NMR (acetone-d ₆, 500 MHz): (ethyl p-digallate) 7.25 (2H, s, galloyl-2', 6'), 7.17 (2H, s, galloyl-2, 6), 4.29 (2H, q, J = 7.3 Hz, OCH₂), 1.33 (3H, t, J = 7.3 Hz, CH₃); (ethyl m-digallate) 7.44 (1H, d, J = 1.8 Hz, galloyl-2), 7.33 (1H, d, J = 1.8 Hz, galloyl-6), 7.26 (2H, s, galloyl-2', 6'), 4.27 (2H, q, J = 7.3 Hz, OCH₂), 1.31 (3H, t, J = 7.3 Hz, CH₃).

¹³C-NMR (acetone-d ₆, 125 MHz): (ethyl p-digallate) 128.3 (C-1), 108.8 (C-2, 6), 150.4 (C-3,5), 131.5 (C-4), 165.5 (C=O), 119.9 (C-1'), 109.8 (C-2', 6'), 145.3 (C-3',5'), 139.0 (C-4'), 60.4 (OCH₂), 13.8 (CH₃), 164.1 (C'=O); (ethyl m-digallate) 121.1 (C-1), 113.6 (C-2), 146.1 (C-3), 142.5 (C-4), 138.5 (C-5), 116.4 (C-6), 165.3 (C=O), 120.0 (C-1'), 109.9 (C-2', 6'), 145.2 (C-3',5'), 138.7 (C-4'), 60.6 (OCH₂), 13.7 (CH₃), 163.4 (C'=O).

실험예 1. 조성물 분석( HPLC 크로마토그람 )

상기 실시예 1-2-1에서 수득한 GR 추출물을 하기의 HPLC 조건에 따라 성분을 분석하였다(표 1 참조).

기기	분석 조건
HPLC pump	Sykam S2100(독일)
검출기	Sykam S3205 UV/VIS detector(독일)
컬럼	Inertsil ODS-3,4.6 I.D.x150mm(GL Sciences Inc., 일본)
용출용매	0.2% 수성 아세토니트릴→10% 수성 아세토니트릴(30분)
시료 주입량	10 ㎕
유속	1.5 ml/min
검출	UV(254 nm)

실험 결과, 화합물들의 정체시간(retention time, R_t)은 하기 표 2와 같이 나타났고, 함유량의 비율은 화합물 1: 화합물 2: 화합물 4: 화합물 5 = 4.3: 1: 7.2: 16.3을 나타냄을 알 수 있었다(도 1 참조).

화합물	정체시간(retention time, Rt)
화합물 1	1.633 분
화합물 2	11.666 분
화합물 4	18.5 분
화합물 5	15.483 분

실험예 2. 항균력 시험( in vitro )

2-1. 공시 균주 및 배지와 균주배양

항균력 측정에 사용된 균주는 인체나 동물에서 분리 야외균주와 ATCC 표준균주이며, 표 3에 균주 목록을 나타내었다. 균주는 TSB(Tryptic Soy broth; Difco, 미국) 배지에 접종하여 37℃ 항온기에서 24시간동안 배양하여 실험에 사용하였으며 육안의 관찰을 위해서 뮬러-힌톤(Muller-Hinton; Difco, 미국) 한천 배지를 사용하였다.

균 주 명	기 원
Vibrio cholerae O1	JOL375
Vibrio cholerae O139	JOL376
E. coli O157	동물 분리주
MRSA	ATCC 700698
Shigella dysenteriae	ATCC 49557
Salmonella gallinarium	수과연표준균주
E. coli O157	ATCC 35150
Salmonella typhimurium	수과연표준균주 (Sal-13)
Salmonella enteritidis	수과연표준균주 (Sal-36)
E. coli K99	수과연표준균주 (E-125)
E. coli K88	수과연표준균주 (E-126)

2-2. 최소 억제 농도(Minimum inhibitory concentration, MIC) 측정

상기 표 3에 표시한 11종의 시험 균주에 대한 최소 억제 농도 측정을 위하여 TSB(Tryptic Soy broth; Difco, 미국)에 증균된 균을 같은 배지를 이용하여 재증균 후 590nm에서 흡광도를 측정하여 CFU(개/㎖)를 계산 후, 0.85% 생리식염수를 이용하여 1X 10⁵개/㎖로 희석하였다.

측정 농축물은 55~60℃의 뮬러-힌톤 브로스(broth)로 녹이고 희석된 균과 동량으로 넣어 37℃ 항온기에서 24시간 배양하였다. 배양된 균을 멸균된 증류수를 이용하여 100배 희석한 후, 뮬러-힌톤 한천배지에 100 ㎕ 희석액을 도말하여 37℃ 항온기에서 18시간 배양한 후, 육안으로 관찰하여 군집 수가 100개 미만인 농도를 최소 억제 농도로 결정하였다.

2-2-1. G와 GR의 항균력 측정

상기 실시예 1-1 내지 1-2-1로부터 얻은 G 및 GR의 항균력을 조사한 결과 하기 표 4에서 보여지는 바와 같이 GR이 G에 비하여 균주 11종에 대하여 2 내지 10배 이상의 강한 항균력을 나타냄을 알 수 있었다.

균 주 명	기 원	항균활성 (최소발육농도: μg/ml)
		G	GR	Penicillin Ga	Kanamycina
Vibrio cholerae O1	JOL375	100	50	10	10
Vibrio cholerae O139	JOL376	200	100	10	10
E. coli O157	동물 분리주	>500	200	25	100
MRSA	ATCC 700698	>500	>500	25	500
Shigella dysenteriae	ATCC 49557	>500	50	10	10
Salmonella gallinarium	수과연표준균주	100	50	10	10
E. coli O157	ATCC 35150	100	50	10	10
Salmonella typhimurium	수과연표준균주 (Sal-13)	100	50	10	10
Salmonella enteritidis	수과연표준균주 (Sal-36)	100	50	10	10
E. coli K99	수과연표준균주 (E-125)	100	50	10	10
E. coli K88	수과연표준균주 (E-126)	>500	100	10	10
a: 양성대조약물

2-2-2. GR로부터 분리된 화합물의 항균력 측정

상기 실시예 2에서 수득한 5종의 화합물(화합물1 내지 5)의 항균력을 조사한 결과 하기 표 5에서 보여지는 바와 같이 모든 화합물이 균주 11종에 대하여 항균력을 나타냈으며, 특히 화합물 3, 4, 및 5는 뛰어난 항균력을 나타내었다.

균 주 명	기 원	항균활성 (최소발육농도: μg/ml)
		화합물 1	화합물 2	화합물 3	화합물 4	화합물 5	Penicillin Ga	Kanamycina
Vibrio cholerae O1	JOL375	>200	>200	100	50	>200	10	10
Vibrio cholerae O139	JOL376	200	200	200	25	50	10	10
E. coli O157	동물 분리주	>200	>200	>200	200	>200	25	100
MRSA	ATCC 700698	>200	>200	>200	>200	>200	25	500
Shigella dysenteriae	ATCC 49557	>200	>200	>200	>200	>200	10	10
Salmonella gallinarium	수과연표준균주	>200	>200	100	100	200	10	10
E. coli O157	ATCC 35150	>200	>200	100	200	200	10	10
Salmonella typhimurium	수과연표준균주 (Sal-13)	>200	>200	100	200	200	10	10
Salmonella enteritidis	수과연표준균주 (Sal-36)	>200	>200	100	100	200	10	10
E. coli K99	수과연표준균주 (E-125)	>200	>200	100	100	200	10	10
E. coli K88	수과연표준균주 (E-126)	>200	>200	200	200	200	10	10
a: 양성대조약물

실험예 3. 항바이러스 실험( in vitro )

항바이러스 측정에 사용되는 균주는 PEDV (SNUVR-971496)이며, 김 등의 방법(Kim O, Chae C. Journal of Comparative Pathology. 129, pp.55-60, 2003; Veterinary Microbiology, 20, pp.131-142, 1989)을 이용하여 하기와 같이 실험을 수행하였다.

37℃에서 배양하여 80-90% 찬 베로 세포(vero cell)를 바이러스 배양 배지(MEM, 0.3% 트립토스 인산 브로스 (시그마), 10 ug/ml 트립신, 페니실린 및 스트렙토마이신)로 한 번 씻어준 후, PEDV를 감염시켰다. 이 때 화합물 5 uM 또는 100 uM을 같이 처리하였으며 감염기간 동안 실험군별로 화합물농도를 유지하도록 하였다. 감염시킨 후 37℃에서 두 시간 동안 매 15분마다 rocking하면서 배양한 후 상층액을 제거한 후 바이러스 배양 배지를 웰당 1 ml 씩 넣어주었다. 이때에도 실험군별로 화합물 농도를 유지하도록 화합물 5 uM 또는 100 uM을 다시 처리한 상태이다. 10시간이 더 지난 후에 바이러스배양배지로 방출된 바이러스를 얻었다. 화합물처리에 의해 바이러스방출이 감소되었는지를 플라크분석법으로 조사하였다.

베로 세포(vero cell)를 24웰 조직배양용 플레이트에 키워 24시간 후에 70% 되도록 세포를 접종하여 24시간 배양한 후에 세포를 바이러스배양배지로 두 번 씻어준다. 10 배씩 희석 (serial dilution)한 PEDV를 각 웰에 200 ul씩 넣어 감염시킨 후 37℃에서 2시간 배양한다. 2시간 후 바이러스를 제거한 후 바이러스 배양 배지로 씻어준다. 각 웰에 바이러스 배양 배지를 500 ul씩 넣어준 후 37℃에서 4시간 더 배양한다. 4시간 후 트립신의 작용을 없애기 위해 4% FBS가 첨가된 바이러스 배양 배지 500 ul를 넣어준다. 37℃에서 48시간동안 배양한 후에 바이러스배양배지를 제거하지 않고 4% 포름알데하이드 1 ml을 24웰 조직배양용 플레이트에 넣어준 뒤 1시간 동안 상온에서 고정시킨다. 배지 및 포름알데하이드를 제거한 뒤 0.5% 크리스탈 바이올렛으로 10 분동안 염색한 후 플레이트를 씻어준 뒤에 건조시킨 후, 형성된 플라크의 개수를 현미경으로 센다. 화합물 5 uM 또는 100 uM로 처리한 실험군과 처리하지 않은 대조군의 플라크 수를 세어 비교하였다.

시료	농도	PEDV(PFU/ml)
PEDV	5 μM	1.87x104
	100 μM	3.60x104
DMSO	5 μM	1.47x104
	100 μM	3.13x104
수침	100 ㎍/ml	2.0x101
70% 에탄올	100 ㎍/ml	0
화합물1	5 μM	1.63x103
	100 μM	2.92x102
화합물2	5 μM	8.0x103
	100 μM	2.32x102
화합물3	5 μM	1.75x103
	100 μM	5.0x101
화합물4	5 μM	3.0x103
	100 μM	2.52x102
화합물5	5 μM	1.0x103
	100 μM	3.45x102

실험예 4. 항균 실험( in vivo )

4-1. 실험준비

본 발명은 출생 10일령의 랜드레이스 교잡종 수컷 돼지를 전라축산(전북 익산시)에서 구입하여 사용하였고, 질병이 없고 외관상 건강한 돼지로 군 구성 시 체중 평균이 유사하게 분류하였다. 사료는 항생제를 첨가하지 않은 이유자돈용 분유(전라축산)를 급여하였다.

병원성 대장균 F44 균주(E. coli F44 strain, wild type)를 2x10¹⁰ CFU로 카테타를 이용하여 위내 접종하였으며, 하기 표 7에 나타낸 바와 같이 대장균을 접종하지 않은 음성대조군, 대장균을 접종한 양성대조군, GR 추출물을 고농도로 처리한 군 및 저농도로 처리한 군으로 나누어 투여하였다.

군	처 치	두수		두수
	E. coli	물 질	기 간
I	음성대조군l	X	-	7일
II	양성대조군	O	-	7일
III	고농도	O	GR 0.5%	7일
IV	저농도	O	GR 0.25%	7일

4-2. 체중변화 및 폐사율 관찰

상기 실험예 4-1에 기재된 바와 같이 4개의 군에 대한 체중변화 및 폐사율을 관찰하였다.

도입시 군간 체중의 평균은 유사하였으나, 대장균 접종 후 I군 음성대조군의 동물들에 비교하여 II군의 양성대조군의 동물들은 대장균 투여 후 3일에 체중의 감소를 보여 음성대조군과 유의한 차이를 보였다(p<0.01). 0.25% GR을 투여한 IV군의 동물들 또한 대장군 투여 후 3일에 체중이 감소하였다(p<0.01). 반면 0.5% GR 투여 동물인 III군의 동물들은 체중 값이 높게 측정되었다. 대장균 접종 후 5일 째 체중은 양성대조군인 II군의 체중 값만이 음성대조군 I군에 비교하여 유의하게 낮았다(p<0.01). 시험 진행 과정 동안에 폐사 여부를 관찰한 결과 시험 동물 전 군에서 폐사는 관찰되지 않았다.

군	0일째a	3일째	5일째
I	4.0±0.20b	4.2±0.25	4.3±0.31
II	4.0±0.21	3.4±0.25*	2.2± 0.26*
III	4.1±0.39	3.6± 0.41	3.8± 0.30
IV	3.9±0.33	3.6±0.26*	3.5±0.35
a: E. coli 접종 후 1일 b: 군내 동물들의 평균몸무게±표준편차 * 대조군과 비교하여 유의적 차이 보임(p<0.01)

4-3. 육안상태 관찰

상기 실험예 4-1에 기재된 바와 같이 4개의 군에 대한 시험 진행 과정 동안에 매일 육안 상태를 관찰하고 각 개체의 육안점수를 기록하고 각군의 평균 및 표준편차를 구하였다. 육안 점수는 “0; 건강, 1; 운동상태 감소 및 피부상태거침, 2; 침울 및 수척, 3; 폐사”로 하였다.

대장균 접종 후 II군의 개체들은 심한 설사와 운동감소, 침울 및 쇠약 등의 육안 소견이 관찰되었으며, I군, III군 및 IV군의 동물들 보다 육안점수가 높은 것을 알 수 있었다. 반면에, GR 0.5% 투여 동물과 0.25% 투여군은 양성대조군인 II군의 동물에 비교하여 육안점수가 낮은 것을 볼 수 있었다.

군	0일째a	1일째	2일째	3일째	4일째	5일째	6일째
I	0±0	0±0*	0±0*	0±0*	0±0*	0±0*	0±0*
II	0±0	1.0±0b	1.7±0.58	2.0±0	1.3±0.38	1.0±0	1.0±0
III	0±0	1.0±0	0.8±0.50	0.5±0.58*	0.3±0.50*	0.3±0.50*	0±0*
IV	0±0	1.0±0	1.3±0.50	1.0±0.00*	1.0±0.00	0.8±0.50	0.5±0.58
a: E. coli 접종 후 1일 * 양성대조군(II군)과 비교하여 유의적 차이 보임(p<0.01)

4-4. 분변상태 관찰

상기 실험예 4-1에 기재된 바와 같이 4개의 군에 대한 시험 진행 과정 동안에 매일 분변 상태를 관찰하고 각 개체의 분변점수를 기록하고 각군의 평균 및 표준편차를 구하였다. 분변점수는 “0; 정상, 1; 연변, 2; 설사, 3; 폐사”로 하였다. 대장균 F44 균주 접종 후 각 군의 분변점수의 평균 및 표준편차는 표 10과 같았다.

대장균 접종 후 II군의 개체들은 심한 설사를 보였다. 반면 추출물 투여군인 III군 및 IV군의 동물들의 분변 상태는 접종 후 1일에 연변 정도의 상태를 보였으나 점점 회복되어 분변의 상태가 점점 정상 상태와 가까워지는 것을 알 수 있었고 분변점수가 낮은 것을 알 수 있었다(p<0.01). 대장균 접종 후 2일째 이후 5일째까지 추출물 투여군인 III군과 IV군의 분변점수는 양성대조군 II군에 비교하여 유의하게 낮았다(도 2 참조).

군	0일째a	1일째	2일째	3일째	4일째	5일째	6일째
I	0±0	0±0*	0.3±0.58*	0.3±0.58*	0.0±0.00*	0.0±0*	0.0±0*
II	0±0	2.0±0.00	3.0±0.00	3.0±0.00	2.0±0.00	2.0±0	1.3±0.58
III	0±0	1.8±0.50	1.0±0*	0.3±0.50*	0.3±0.50*	0.3±0.50*	0.0±0*
IV	0±0	2.0±0	1.5±0.58*	0.8±0.50*	0.3±0.50*	0.3±0.50*	0.5±0.58
a: E. coli 접종 후 1일 * 양성대조군(II군)과 비교하여 유의적 차이 보임(p<0.01)

4-5. 혈액검사

상기 실험예 4-1에 기재된 바와 같이 4개의 군에 대한 대장균 접종 후 1주되는 시점에서 각 군의 개체들을 자일라진(xylazin, 바이엘동물약품, 한국)으로 마취한 후 혈액을 채혈하여 혈구수를 측정하고 각 군의 평균 및 표준편차를 구한 결과는 표 11와 같다.

WBC의 수치가 대장균 투여 양성 대조군의 경우 다른 군에 비교하여 높은 것을 알 수 있었다.

혈액검사	군
	I	II	III	IV
WBC(103/㎕)	9.6±0.45*	16.3±2.0	9.55±0.45*	10.2±0.00*
RBC(106/㎕)	6.1±0.66	6.7±0.76	6.6±0.52	6.5±0.29
HGB(g/dL)	12.1±0.73	12.6±0.88	13.1±1.00	12.5±0.43
HCT(%)	40.7±2.83	43.4±3.59	45.8±4.29	43.7±1.20
MCV(fL)	66.7±2.41	65.2±3.09	69.3±2.35	67.8±3.11
MCH(pg)	19.8±0.86	19.0±0.91	19.8±0.40	19.4±0.57
MCHC(g/dL)	29.7±0.26	29.2±0.58	28.6±0.57	28.6±0.52
PLT(103/㎕)	483.3±96.55	432.7±210.12	477.5±235.98	509.5±57.89

4-6. 병리조직 검사

상기 실험예 4-1에 기재된 바와 같이 4개의 군에 대한 각 개체들을 안락사한 후 부검하여 소장을 채취하여 절개한 후 10% 포르말린에 고정하고 병리조직 제작을 위한 통상적인 과정을 거쳐 각 조직의 헤마톡실린 및 에오신(Hematoxylin & eosin) 염색 슬라이드를 가지고 병리조직검사를 수행하였다. 병리조직검사는 샘플 위치에 따른 변수를 줄이고자 한 개체 당 9개 소장 부위를 각각 제작하여 검사하였다. 병리조직검사결과는 각 병변의 상태에 따라 점수화하여 6개 조직의 점수의 함으로 개체 점수를 매긴 후 각 군의 평균 및 표준편차를 구하였다. 병리조직 점수는 “0; 정상, 1; 장상피층에 염증세포 침윤, 2; 소장융모상피 괴사 및 궤양, 3; 폐사”로 하였다.

E. coli 접종 후 1주일 되는 시점에서 각 군의 개체들을 부검하여 소장을 채취하여 병리조직검사를 수행하고 각 개체 당 6개 조직의 병리조직점수의 합으로 개체 점수를 매긴 후 각 군의 평균 및 표준편차를 구한 값은 표 12과 같았다.

양성대조군 II군의 동물들의 병리조직 점수에 비교하여 0.5%와 0.25% GR을 투여한 III군과 IV군 동물들의 병리조직 점수가 더 낮은 것을 알 수 있었다(p<0.01). 병리조직 검사 결과 양성 대조군 II군의 동물들은 대장균 감염에 의하여 소장 점막 상피세포의 손상과 림프성 소낭(lymphoid follicle)의 증식이 관찰되었다. 반면 0.5%와 0.25% GR 투여한 III군과 IV군 동물들의 병리조직검사 결과 이러한 병변 소견은 그 정도가 감소되어 병변점수가 낮게 평가되었다(도 3 내지 5 참조).

군	병리조직 점수
I	0.7±0.58*
II	11.0±1.0
III	4.5±0.58*
IV	6.8±0.96*
* 양성대조군(II군)과 비교하여 유의적 차이 보임(p<0.01)

실험예 5. 항바이러스 실험( in vivo )

5-1. 실험준비

본 발명은 출생 10일령의 랜드레이스 교잡종 수컷 돼지를 전라축산(전북 익산시)에서 구입하여 사용하였고, 질병이 없고 외관상 건강한 돼지로 군 구성 시 체중 평균이 유사하게 분류하였다. 사료는 항생제를 첨가하지 않은 이유자돈용 분유(전라축산)을 급여하였다. PEDV (SNUVR-971496)를 베로세포(Vero cell)로 배양하여 10⁵ TCID₅₀/ml의 역가로 3 ml씩을 Ⅰ, Ⅲ, Ⅳ군의 동물들에 경구 접종하였고, Ⅱ군의 동물들에는 DMEM 배지를 3 ml씩 경구 접종하였다.

5-2. 체중변화 및 폐사율 관찰

상기 실험예 5-1에 기재된 바와 같이 4개의 군에 대한 체중변화 및 폐사율을 관찰하였다.

도입 시 군간 체중의 평균은 유사하였으나, 대장균 접종 후 I군 음성대조군의 동물들에 비교하여 II군의 양성대조군의 동물들은 PEDV 투여 후 3일에 체중의 감소를 보여 음성대조군과 유의한 차이를 보였다(p<0.01). 반면 0.5%와 0.25% GR 투여 동물인 III군의 동물들은 체중 값이 높게 측정되었다. 시험 진행 과정 동안에 폐사 여부를 관찰한 결과 시험 동물 전 군에서 폐사는 관찰되지 않았다.

군	0일째a	3일째	5일째
I	4.0±0.20b	4.2±0.25	4.3±0.31
II	3.8±0.35	2.8±0.29*	2.2±0.29*
III	4.0±0.30	3.8±0.28	3.7±0.30
IV	3.9±0.15	3.7±0.25	3.5±0.12*
a: PEDV 접종 후 1일 b: 군내 동물들의 평균몸무게±표준편차 * 대조군과 비교하여 유의적 차이 보임(p<0.01)

5-3. 육안상태 관찰

상기 실험예 5-1에 기재된 바와 같이 4개의 군에 대한 시험 진행 과정 동안에 매일 육안 상태를 관찰하고 각 개체의 육안점수를 기록하고 각군의 평균 및 표준편차를 구하였다. 육안 점수는 “0; 건강, 1; 운동상태 감소 및 피부상태거침, 2; 침울 및 수척, 3; 폐사”로 하였다.

PEDV 접종 후 각 군의 육안상태는 의 평균 및 표준편차는 표 14과 같았다. PEDV 접종 후 II군의 개체들은 심한 설사와 운동감소, 침울 및 쇠약 등의 육안 소견이 관찰되었으며, I군, III군 및 IV군의 동물들 보다 육안점수가 높은 것을 알 수 있었다. PEDV 접종 후 추출물 0.5% 투여군과 0.25% 투여군은 양성대조군인 II군의 동물에 비교하여 육안점수가 낮은 것을 볼 수 있었다.

군	0일째a	1일째	2일째	3일째	4일째	5일째	6일째
I	0±0	0±0*	0±0*	0±0*	0±0*	0±0*	0±0*
II	0±0	1.0±0b	1.7±0.58	2.0±0	1.3±0.38	1.0±0	1.0±0
III	0±0	1.0±0	0.8±0.50	0.5±0.58*	0.3±0.50*	0.3±0.50*	0±0*
IV	0±0	1.0±0	1.3±0.50	1.0±0.00*	1.0±0.00	0.8±0.50	0.5±0.58
a: PEDV 접종 후 1일 * 양성대조군(II군)과 비교하여 유의적 차이 보임(p<0.01)

5-4. 분변상태 관찰

상기 실험예 5-1에 기재된 바와 같이 4개의 군에 대한 시험 진행 과정 동안에 매일 분변 상태를 관찰하고 각 개체의 분변점수를 기록하고 각군의 평균 및 표준편차를 구하였다. 분변점수는 “0; 정상, 1; 연변, 2; 설사, 3; 폐사”로 하였다.

PEDV 접종 후 각 군의 분변점수의 평균 및 표준편차는 표 15과 같았다. PEDV 접종 후 II군의 개체들은 심한 설사를 보였다. 반면 추출물 투여군인 III군 및 IV군의 동물들의 분변 상태는 접종 후 1일에 연변 정도의 상태를 보였으나 점점 회복되어 분변의 상태가 점점 정상 상태와 가까워지는 것을 알 수 있었고 분변점수가 낮은 것을 알 수 있었다(p<0.01). PEDV 접종 후 6일째에 추출물 투여군인 III군과 IV군의 분변점수는 양성대조군 II군에 비교하여 유의하게 낮았다(도 6 참조).

군	0일째a	1일째	2일째	3일째	4일째	5일째	6일째
I	0±0	0±0*	0±0*	0±0**	0±0*	0±0*	0±0*
II	0±0	1.0±0	1.7±0.38	1.7±0.38	1.3±0.38	1.0±0	1.0±0
III	0±0	0.8±0.50	1.3±0.20	1.0±0	0.5±0.38	0.5±0.38*	0.3±0.20*
IV	0±0	1.0±0	1.3±0.20	1.3±0.20	1.0±0	0.8±0.20	0.5±0.38*
a: PEDV 접종 후 1일 * 양성대조군(II군)과 비교하여 유의적 차이 보임(p<0.01)

5-5. 병리조직 검사

상기 실험예 5-1에 기재된 바와 같이 4개의 군에 대한 각 개체들을 안락사한 후 부검하여 소장을 채취하여 절개한 후 10% 포르말린에 고정하고 병리조직 제작을 위한 통상적인 과정을 거쳐 각 조직의 헤마톡실린 및 에오신(Hematoxylin & eosin) 염색 슬라이드를 가지고 병리조직검사를 수행하였다. 병리조직검사는 샘플 위치에 따른 변수를 줄이고자 한 개체 당 9개 소장 부위를 각각 제작하여 검사하였다. 병리조직검사결과는 각 병변의 상태에 따라 점수화하여 6개 조직의 점수의 합으로 개체 점수를 매긴 후 각 군의 평균 및 표준편차를 구하였다. 병리조직 점수는 “0; 정상, 1; 장상피층에 염증세포 침윤, 2; 소장융모상피 괴사 및 궤양, 3; 폐사”로 하였다.

각 개체들을 안락사한 후 부검하여 소장을 채취하여 절개한 후 10% 포르말린에 고정하고 병리조직 제작을 위한 통상적인 과정을 거쳐 각 조직의 헤모톡실린 및 에오신(Hematoxylin & eosin) 염색 슬라이드를 가지고 병리조직검사를 수행하였다. 병리조직검사는 샘플 위치에 따른 변수를 줄이고자 한 개체 당 6개 소장 부위를 각각 제작하여 검사하였다. 병리조직검사결과 PEDV 접종 한 II군의 동물은 소장 상피의 현저한 위축과 상피세포에 공포변화를 보였다. 다른 특이 변화로 점막하직에 임파구증식 소견을 볼 수 있었다. 음성대조군으로 사용된 I군의 동물은 소장에서 이러한 변화들이 관찰되지 않았으며 소장 융모도 II군에 비교하여 현저하게 높은 것을 알 수 있었다(도 7 및 8 참조). 소장융모의 위축 여부는 빌리:크립트 비율(vili:crypt ratio)를 구하여 비교하였으며 그 결과는 도 3과 같았다. 0.5%와 0.25% 오배자 에탄올 추출물 투여군인 III, IV군의 빌리:크립트 비율(vili : crypt ratio)는 I군에 비교하여 유의하게 높았다.

5-6. 혈액검사

상기 실험예 5-1에 기재된 바와 같이 4개의 군에 대한 대장균 접종 후 1주되는 시점에서 각 군의 개체들을 자일라진(xylazin, 바이엘동물약품, 한국)으로 마취한 후 혈액을 채혈하여 혈구수를 측정하고 각 군의 평균 및 표준편차를 구한 결과는 표 16와 같다.

양성 대조군과 비교하여 유의한 변화는 관찰할 수 없었다. WBC의 경우에 대장균 접종한 개체들에서 증가를 관찰할 수 있었던 것과 다르게 PEDV 접종한 개체들에서는 WBC의 증가를 관찰할 수 없었다.

혈액검사	군
	I	II	III	IV
WBC(103/㎕)	9.6±0.45	8.4±2.60	11.3±0	9.0±0.00
RBC(106/㎕)	6.1±0.66	6.5±0.36	6.0±7.12	7.0±0.65
HGB(g/dL)	12.1±0.73	12.8±0.25	11.7±1.15	13.2±0.83
HCT(%)	40.7±2.83	43.6±1.28	40.7±4.73	45.7±3.22
MCV(fL)	66.7±2.41	67.0±2.52	68.1±1.0	65.6±3.26
MCH(pg)	19.8±0.86	19.8±0.90	19.6±6.9	19.0±1.07
MCHC(g/dL)	29.7±0.26	29.4±0.34	28.8±6.48	28.9±0.27
PLT(103/㎕)	483.3±96.55	355.3±168.75	393.0±60.84	369.3±140.47

본 발명의 추출물 또는 화합물을 함유하는 약학조성물의 제제예를 설명하나, 본 발명은 이를 한정하고자 함이 아닌 단지 구체적으로 설명하고자 함이다.

1. 사료조성물 예

GR 240g

부형제 (말분) 760g

상기의 성분을 가지고 대한약전 산제제법에 준하여 제조한다.

상기의 혼합물의 조성비는 비교적 사료조성물에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만, 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하며, 통상의 사료조성물 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 대한약전 산제제법에 준하여 제조에 사용할 수 있다.

도 1은 오배자 70% 에탄올 추출물을 HPLC 크로마토그람을 나타낸 도이며,

도 2은 병원성 대장균 F44균주 접종 3일 후 Ⅱ군(A) 및 Ⅲ군(B)의 분변을 나타낸 도이고,

도 3은 소장 융모의 빌리:크립트 길이 비율(vili-crypt length ratio)을 나타난 도이며,

도 4는 병원성 대장균 F44균주 접종 후 Ⅱ군(A) 및 Ⅲ군(B)의 소장을 나타낸 도이고,

도 5는 병원성 대장균 F44균주 접종 후 Ⅰ군(A), Ⅱ군(B), Ⅲ군(C) 및 Ⅳ군(D)의 소장을 채취하여 병리조직 검사(H&E stain, x200)를 나타낸 도이며,

도 6은 PEDV 접종 후 Ⅱ군(A) 및 Ⅲ군(B)의 분변을 나타낸 도이고,

도 7은 PEDV 접종 후 Ⅱ군(A) 및 Ⅲ군(B)의 소장을 나타낸 도이며,

도 8은 PEDV 접종 후 Ⅰ군(A), Ⅱ군(B), Ⅲ군(C) 및 Ⅳ군(D)의 소장을 채취하여 병리조직 검사(H&E stain, x200)를 나타낸 도이다.

Claims (18)

1. 건조된 오배자를 세절하여 건조 중량의 10 내지 20배의 70 내지 80% 에탄올 혼합용매로, 20 내지 100℃ 추출온도에서 2시간 내지 5시간동안 냉침추출, 열수추출, 초음파 추출, 또는 환류냉각 추출 방법을 이용하여 1 내지 5회 반복 추출한 후 감압 농축하는 단계의 제조방법으로부터 수득됨을 특징으로 하는 갈산(1), 파라 디 갈산과 메타 디 갈산의 복합물(2), 에틸 갈레이트(4) 및 에틸 파라 디 갈레이트와 에틸 메타 디 갈레이트의 복합물(5)의 함유비(4.3:1:7.2:16.3)로 구성되는 70 내지 80% 에탄올 혼합용매 추출물 또는 이로부터 분리된 팬타 오-갈로일 글루코스(penta-O-galloyl glucose), 에틸 갈레이트 (ethyl gallate) 또는 에틸 파라 디 갈레이트와 에틸 메타 디 갈레이트의 복합물 (a mixture of ethyl p-digallate and ethyl m-digallate)을 유효성분으로 함유하는 돼지의 소화기 질환의 예방 및 치료용 수의학적 조성물.
2. 삭제
3. 삭제
4. 삭제
5. 삭제
6. 삭제
7. 제 1항에 있어서, 상기 돼지 소화기 질환 원인균은 에르시니아 (yersinia), 하이오디센테리아 (hyodysenteriae), 캄필로박터(campylobacter), 콜로스트리듐, 살모넬라 (Salmonella spp.), 로소니아 인트라셀룰라리스(Lawsonia intracellularis), 브라키스피라 필로시콜리 (Brachyspira pilosicoli) 및 대장균 (E. coli)으로 구성된 군으로부터 선택된 균임을 특징으로 하는 수의학적 조성물.
8. 제 1항에 있어서, 상기 돼지 소화기 질환 원인 바이러스는 TGE ( Transmissible Gastroenteritis)바이러스, PEDV (Porcine epidemic diarrhea virus) 또는 코로나바이러스 (coronaviridae)로 구성된 군으로부터 선택된 바이러스임을 특징으로 하는 수의학적 조성물.
9. 삭제
10. 제 1항에 있어서, 상기 돼지 소화기 질환은 에르시니아 장염, 증식성 회장염, 결장염, 돈적리, 비감염성 결장염, 살모넬라성 장염, 대장균성 설사, TGE (Transmissible Gastroenteritis, 전염성 위장염) 및 PED (Porcine Epidemic Diarrhea, 돼지유행성설사)로 구성된 군으로부터 선택된 질환임을 특징으로 하는 수의학적 조성물.
11. 삭제
12. 건조된 오배자를 세절하여 건조 중량의 10 내지 20배의 70 내지 80% 에탄올 혼합용매로, 20 내지 100℃ 추출온도에서 2시간 내지 5시간동안 냉침추출, 열수추출, 초음파 추출, 또는 환류냉각 추출 방법을 이용하여 1 내지 5회 반복 추출한 후 감압 농축하는 단계의 제조방법으로부터 수득됨을 특징으로 하는 갈산(1), 파라 디 갈산과 메타 디 갈산의 복합물(2), 에틸 갈레이트(4) 및 에틸 파라 디 갈레이트와 에틸 메타 디 갈레이트의 복합물(5)의 함유비(4.3:1:7.2:16.3)로 구성되는 70 내지 80% 에탄올 혼합용매 추출물 또는 이로부터 분리된 팬타 오-갈로일 글루코스(penta-O-galloyl glucose), 에틸 갈레이트 (ethyl gallate) 또는 에틸 파라 디 갈레이트와 에틸 메타 디 갈레이트의 복합물 (a mixture of ethyl p-digallate and ethyl m-digallate)을 유효성분으로 함유하는 돼지 소화기 질환의 예방 및 개선용 동물사료 첨가제.
13. 삭제
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