KR100743862B1 - 솔잎 추출물을 함유하는 바이러스로 인한 동물 질환의치료 및 예방용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 솔잎 추출물을 함유하는 바이러스로 인한 동물 질환의 예방 및 치료를 위한 조성물에 관한 것으로, 본 발명에 의한 솔잎 추출물은 인플루엔자 A 바이러스 (influenza A viruses), 뉴캣슬병 바이러스 (newcastle disease virus), 닭 전염성기관지염 바이러스 (infectious broncheitis virus), 조류 뉴모 바이러스 (avian pneumovirus), 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스 (porcine reproductive and respiratory syndrome virus), 콕사키 바이러스 (coxsakie virus), 세망내피증 바이러스 (reticuloendotheliosis virus), 오제스키 바이러스 (aujeszky's disease virus) 및 아데노 바이러스 (adeno virus)의 감염 세포주를 이용한 시험관 내 (in vitro) 실험 및 상기 바이러스 감염 동물을 이용한 생체 내 (in vivo) 실험 에서 바이러스 증식 억제 및 살바이러스에 의한 항바이러스 효과가 탁월하므로, 상기 바이러스의 체내 감염으로 유발되는 동물 질환의 예방 및 치료에 유용한 수의학적 조성물, 사료첨가제 및 살바이러스 소독용 조성물에 이용할 수 있다.

바이러스, 솔잎, 수의학적 조성물, 사료첨가제, 소독용 조성물.

Description

솔잎 추출물을 함유하는 바이러스로 인한 동물 질환의 치료 및 예방용 조성물 {Composition comprising an extract of Pine needle for preventing and treating animal disease caused by viruses}

도 1은 솔잎 60% 에탄올 추출물의 인플루엔자 바이러스에 대한 플라크 감소분석 결과를 나타낸 도이며,

도 2는 솔잎 60% 에탄올 추출물의 PRRSU에 대한 세포내 항바이러스 효능을 나타낸 도이고,

도 3은 솔잎 비극성용매 가용추출물의 플라크 감소분석 결과를 나타낸 도이다.

본 발명은 솔잎 추출물을 함유하는 바이러스로 인한 동물 질환의 치료 및 예방용 조성물에 관한 것이다.

인플루엔자 바이러스 (Influenza virus)는 오르소믹소 계통 (Family Orthomyxoviridae)에 속하는 RNA 바이러스로서 혈청형은 A형, B형, C형 등 3가지로 구분된다. 그 중 B형과 C형은 사람에서만 감염이 확인되고 있으며, A형은 사람, 말, 돼지, 기타 포유류 그리고 다양한 종류의 가금과 야생조류에서 감염이 확인되고 있다 (Selmons et al., Avian Dis., 18(1), pp119-124, 1974; Turek R et al., Acta Virol., 27(6), pp523-527, 1983; Webster RG et al., Microbiol Rev., 56(1), pp152-179, 1992).

A형 인플루엔자 바이러스의 혈청형은 바이러스 표면의 두 가지 단백질인 햄어글루티닌 (Hemagglutinin: HA), 뉴라미니다제 (Neuraminidase: NA)의 종류에 따라 구분되며, 혈청형에 따라 144종류 (HA 단백질 16종과 NA 단백질 9종)로 분류할 수 있다. HA는 바이러스가 체세포에 부착하는 역할을 하며, NA는 바이러스가 세포 내로 침투할 수 있도록 한다. (Alexander DJ, Vet. Microbiol., 74(1-2), pp3-13, 2000).

A형 인플루엔자 바이러스의 정상적인 자연숙주는 오리, 갈매기 등과 같은 야생 물새류로 알려져 있으며, 전 세계적으로 야생조류에 대한 인플루엔자 감염 역학조사를 실시한 결과 현존하는 모든 16종의 HA형과 9종의 NA형 인플루엔자 바이러스가 야생조류에서 감염되고 있음이 확인되었다 (Selmons et al., Avian Dis., 18(1), pp119-124, 1974). A형으로 분류되는 조류인플루엔자 바이러스는 인수(人獸) 공통 전염병 바이러스로, 병원성에 따라 닭에 감염 시 가벼운 호흡기 증상을 유발하는 비병원성 조류 인플루엔자, 1∼30 % 내외의 폐사와 산란 저하를 유발하는 저병원성 조류 인플루엔자 (Low pathogenic avian influenza: LPAI) 그리고 95 % 이상의 높은 치사성을 보이고 “조류독감 (버드플루: Bird flu)”이라고도 불리는 고병원성 조류 인플루엔자 (Highly pathogenic avian influenza: HPAI)등 크게 3가지 병형으로 구분하고 있다 (Alexander DJ, Vet. Microbiol., 74(1-2), pp3-13, 2000). 이중 고병원성 조류 인플루엔자는 국제수역사무국 (OIE)에서 A 등급으로, 그리고 국내에서는 제1종 가축전염병으로 분류하고 있다.

고병원성 조류 인플루엔자 (HPAI)는 1980년도 이후 미국(1983년), 호주(1985, 1992, 1994, 1997년), 멕시코(1994년), 파키스탄(1994, 2004년), 홍콩(1997, 2001년), 이탈리아(1997, 1999년), 네덜란드(2003년), 벨기에(2003년), 독일(2003년), 캐나다(2004년) 등 전 세계적으로 발생이 확인되고 있다. 특히 2003년 12월 한국을 시작으로 2004년 베트남, 일본, 태국, 캄보디아, 라오스, 라오스, 인도네시아, 중국 등 동남아시아와 극동아시아 전 지역에서 거의 동시 다발적으로 혈청형 A/H5N1 고병원성 조류 인플루엔자가 발생되었다. 특히 베트남과 태국등지에서 발생한 고병원성 조류 인플루엔자는 그 당시 한국과 일본 등지에서 발생한 인체에 감염이 안되는 전통적인 고병원성 조류 인플루엔자와는 달리 감염조류와 접촉 시 인체 감염이 가능한 변이형 조류독감 (변이형 A/H5N1 HPAI) 바이러스로 2004년 3월까지 베트남에서는 감염조류와 접촉한 22명이 감염되어 그중 15명이 사망하였고, 인접국인 태국에서는 감염조류와 접촉한 11명이 감염되어 그중 8명이 사망하여 현재 전 세계가 우려의 목소리를 높이고 있는 실정이다. 최근 고병원성 조류 인플루엔자의 발생빈도가 과거에 비하여 10배 가량 증가된 셈이며, 특히 2001년도부터는 전 세계적으로 매년 발생되는 양상을 취하고 있어 고병원성 조류 인플루엔자를 효 과적으로 방제할 수 있는 보다 새로운 개념의 방제대책이 요구되고 있다 (Song CS et al., Korean J. Poult. Sci., 31(2), pp129-136, 2004).

사람 인플루엔자에 대한 최초의 기록은 기원전 412년으로 거슬러 올라가나, 인류 최초의 인플루엔자 대유행 (pandemic influenza) 기록은 1173년부터 1174년에 유럽 전역에서 발생한 것으로 추정하고 있다 (Grmek MD, Les Maladies a L'aube de la Civilization Accidentale, Payot, Paris, 1893; Hirsch A, Handbook of Geographical and Histological Pathology, New Syndenham Society, London, 1883). 20세기에 접어들면서 인플루엔자에 대한 기록이 보다 과학적으로 다루어지면서 남겨진 자료를 근거해 보면 20세기 이후 지금까지 사람에서 3번의 인플루엔자 대유행 있었다. 1918년부터 1920년 사이에 전 세계적으로 유행한 20세기 이후 1차 인플루엔자 대유행 (일명 스페인 독감)은 인류가 겪은 가장 큰 피해로 기록되고 있으며 그 기간 중 2천만 명에서 5천만 명의 사람이 사망하였다 (Walter JH, Bull. NY Acad. Med., 54, pp855-864, 1978). 스페인 독감의 원인 바이러스는 돼지 인플루엔자 바이러스와 매우 유사한 혈청형 A/H1N1으로 판명되었으며 지금도 매년 전 세계적으로 유행하고 있는 유행성 독감의 주된 유행주이다 (Taubenberger JK et al., Science, 275, pp1793-1796, 1997). 1957년부터 1958년 사이에 발생한 20세기이후 2차 인플루엔자 대유행은 중국에서 시작하여 6-7개월 사이에 해안을 따라 인근의 홍콩, 싱가포르, 일본, 대만 등지로 급속도로 전파되었다. 이 기간 중 전 세계 인구의 약 40- 50% 정도가 감염되었으며, 그중 25 % 정도가 임상증상을 보였으며, 주로 유아층이나 중장년층들만이 감염되어 사망하였으며, 그 기간 중 약 1백만 명의 사람이 사망하였다 (Potter CW, J. appl. Microbiol., 91, pp572-579, 2001). 원인 바이러스는 혈청형 A/H2N2 인플루엔자 바이러스로 확인되었다. 또한 1968부터 1969년 사이에 발생한 3차 인플루엔자 대유행은 홍콩에서 유래된 것으로 확인되었으며 대만, 필리핀, 싱가포르, 베트남 등지로 급속히 전파되었다. 원인 바이러스는 혈청형 A/H3N2 바이러스로서 이전의 혈청형 H2N2 바이러스와 HA형이 다른데, 이 HA형은 조류로부터 전달된 것으로 분석되고 있으며, 지금도 매년 전 세계적으로 유행하고 있는 유행성 독감의 주된 유행주이다 (Oxford JS, Rev. Med. Virol., 10(2), pp119-133, 2000).

조류에서 주로 문제시되고 있는 AIV 중 일부 혈청형은 사람에 감염되어 독감증세를 보이다가 사망을 유발하기도 한다. 현재까지 “홍콩조류독감”이라 불리고 있는 혈청형 A/H5N1을 포함하여 혈청형 A/H7N7, 그리고 혈청형 A/H9N2 등 총 3종의 조류 유래 조류독감 바이러스 중 일부의 변종 바이러스들이 인체에 감염될 가능성이 있는 것으로 추정되고 있다. 따라서 현재 이들 3종의 혈청형에서 유래된 변종 바이러스에 대한 연구가 전 세계적으로 진행되고 있는 실정이다 (Suarez DL et al., J. Virol., 72(8), pp6678-6688, 1998).

최근 베트남에서 보고되고 있는 조류 독감 바이러스 (혈청형 A/H5N1 조류 인플루엔자 바이러스)의 종속간의 장벽을 뛰어넘는 인체감염 사례는 20세기 이후 4차 사람 인플루엔자 대유행의 전주곡으로서 전 세계가 현재 이 인체감염이 가능한 변이 바이러스의 사람에서 사람으로의 직접전염 등 그 전파양상에 주목하고 있다. 이 변이 바이러스는 혈청형 A/H5N1이 속하는 조류 인플루엔자 바이러스이며, 이 바이 러스 역시 인류가 처음으로 경험하는 지금까지 조류에서만 유행하던 조류 인플루엔자 바이러스이기 때문이다.

인플루엔자 바이러스는 호흡기에 감염되어 전신증상을 일으키고, 주기적으로 모습을 바꿀 뿐 아니라, 숙주를 죽이지 않고 숙주가 죽기 전에 다른 숙주로 이동하기 때문에 과학자들은 인플루엔자 바이러스는 인류의 종말까지 살아남는 바이러스일 것으로 추측한다. 인류에게 가장 큰 경제적 손실을 가져오는 바이러스이며 예방백신이 개발되어 있기는 하지만 바이러스의 변이를 따라 잡지는 못하고 있는 실정이며, 아직 근본적인 바이러스 치료는 이루어지지 않고 있다.

조류 인플루엔자 예방백신 중 생바이러스 백신은 변이가 쉽게 되는 바이러스의 특성상 개발이 거의 불가능한 실정이며, 현재까지 개발된 백신은 크게 사독백신과 유전자재조합 백신으로 구분할 수 있다. 1999년도 이탈리아 그리고 2003년 홍콩에서는 고병원성 조류 인플루엔자 발생이 장기화되고 전국으로 확산되면서 조류 인플루엔자 예방백신을 선택적 살처분 정책과 병행하여 고병원성 조류 인플루엔자 퇴치의 수단으로 이용하였으며, 현재 이탈리아와 홍콩에서는 조류 인플루엔자 예방백신의 사용이 고병원성 조류 인플루엔자를 방제하는데 효과적이었다는 긍정적인 평가를 받고 있다 (Capua I et al., Avian Pathol., 32, pp47-55, 2003; Capua I and Marangon S, Avian Pathol., 32, pp335-343, 2003; Swayne DE et al., Avian Pathol., 28, pp245-255, 1999). 이탈리아 (혈청형 A/H7N1)와 홍콩 (혈청형 A/H5N1)에서 긍정적인 평가를 받은 백신은 모두 사독백신으로 HA형은 동일하나 NA형이 다른 이종 혈청형의 바이러스 (혈청형 A/H7N3, 혈청형 A/H5N2)로 사독백신을 제조하여 항체검사 시 야외감염과의 구별을 시도한 경우이다. 그러나 이 사독백신은 기존 A형 조류 인플루엔자 표준진단법인 한천겔 침강 (AGP, Agar Gel Precipitation) 검사법으로는 백신항체와 야외감염항체의 구분이 불가능하고 NA형을 감별하는 형광항체법은 대규모의 항체 모니터링 검사에 적합하지 않다는 점이 가장 큰 단점으로 지적되고 있다. 또한 현재 개발되어 있는 사독백신은 고병원성 조류 인플루엔자 감염시 분변으로 배출되는 바이러스의 양을 줄여줄 수는 있지만 완벽하게 질병의 확산을 막지는 못하는 것으로 평가되고 있다 (Capua I et al., Avian Pathol., 32, pp47-55, 2003; Capua I and Marangon S, Avian Pathol., 32, pp335-343, 2003; Swayne DE et al., Avian Pathol., 28, pp245-255, 1999).

멕시코의 경우, 1993년도 후반 혈청형 A/H5N2 저병원성 조류 인플루엔자 발생시 전국으로 확산된 바이러스가 고병원성으로 병원성이 증강되어 결국 살처분 정책을 포기하고, 처음에는 자국 내에서 분리된 바이러스를 이용하여 자가 사독오일백신을 생산하여 사용하다가, 백신접종계와 야외감염계의 구분을 위하여 첨단 유전자 재조합 백신접종으로 전환하여 현재까지 사용하고 있다. 멕시코에서 지금까지 사용되고 있는 백신은 계두 바이러스 (fowl pox virus)에 고병원성 조류 인플루엔자 바이러스의 표면 단백인 햄어글루티닌 (Hemagglutin) 유전자를 삽입하여 백신접종시 계두와 고병원성 조류 인플루엔자를 동시에 효과적으로 예방할 수 있는 첨단 유전자 재조합 바이러스 벡터 백신이나, 또 한편으로는 우리나라를 포함하여 계두 백신을 사용하는 국가에서는 기존의 계두백신 접종으로 유도된 항체의 간섭현상으로 인하여 바이러스 벡터 백신의 효과가 반감되는 단점도 있는 것으로 평가되고 있 다. 그 외 전염성 후두기관염 (Infectious Laryngotracheitis Virus: ILT)에 고병원성 조류 인플루엔자 바이러스의 표면 단백인 햄어글루티닌 (Hemagglutin) 유전자를 삽입하여 유전자 재조합 바이러스 백터백신이 개발되어 있으나 이것 역시 우리나라를 포함하여 전염성 후두기관염 백신을 사용하는 국가에서는 효과가 반감되며, 사용 가능 대상이 닭에만 국한된다는 단점이 있는 것으로 평가되고 있다 (Beard CW et al., Avian Dis., 35, pp356-359, 1991; Webster RG et al., Avian Dis., 40, pp461-465, 1996; Swayne DE et al., Avian Dis., 41, pp910-922, 1997; Swayne DE et al., Avian Dis., 44, pp132-137, 2000).

아만타딘 (amantadine)과 리만타딘 (rimantadine)은 인플루엔자 바이러스의 M2 이온채널 단백의 기능을 억제하는 물질로 생체 내 인플루엔자 바이러스의 증식을 억제하는 대표적인 항바이러스 제제들이다. 그러나 이들 두 가지 항바이러스 제제들은 혈청형 A형 인플루엔자 바이러스에만 효과적이며, M2 단백질이 없는 혈청형 B형 인플루엔자 바이러스에는 효과가 없는 것으로 확인되었다. 또한 아만타딘과 리만타딘은 사용 시 인플루엔자 바이러스 M2 단백의 이온채널기능에 영향을 미치지 못하는 변이 바이러스의 출현이 매우 쉽게 일어나는 단점이 있는 것으로 확인되고 있다. 이러한 단점을 보완하기 위하여 개발된 자나미비르 (zanamivir)와 오셀타미비르 (oseltamivir)는 인플루엔자 바이러스의 뉴라미니다제 (neuraminidase) 단백의 기능을 억제하는 물질로 생체 내 인플루엔자 바이러스의 증식을 억제하는 대표적인 항바이러스 제제들이다. 이들 두 가지 항바이러스제제들은 16종의 모든 혈청형 A형 인플루엔자 바이러스와 혈청형 B형 인플루엔자 바이러스에도 효과적인 것으 로 알려져 있다. 그러나 자나미비르는 흡입 및 정맥 투여해야 하는 단점이 있으며, 오셀타미비르는 경구투여가 가능하나 최근 내성 바이러스의 출현 보고와 경구투여 시 구토와 현기증 등의 부작용이 있어 단점으로 지적되고 있다 (Ward P et al., J. antimicrob. Chemother., 55(supp1), ppi5-i21, 2005).

뉴캣슬병 바이러스 (Newcastle disease virus)는 단일가닥 RNA 바이러스로 파라믹소바이러스과 (Paramyxoviridae) 아뷰라바이러스 속 (Avulavirus genus)에 속한다. 뉴캣슬병 바이러스는 외피를 가지고 있으며 외피에는 바이러스가 숙주세포에 결합할 수 있도록 해주는 HN (Haemaglutinin-Neuraminidase) 단백질 및 외피가 숙주 세포와 융합을 일으키도록 하는 F (Fusion) 단백질이 있다. F 단백질과 HN 단백질은 당단백질 (glycoprotein)로서 외피의 표면에 분포되어 있다(Alexander DJ, Disease of poultry, 10 th edn, pp541-569, 1997).

뉴캣슬병 (Newcastle disease)은 가금에서 치명적이고 전염성이 강한 제1종 가축전염병으로 백신을 접종하지 않은 닭에 감염될 때는 100% 폐사율을 초래하며, 적절한 백신을 하지 않는 경우 호흡기 및 소화기 증상과 산란계에서 산란율 저하로 경제적인 피해를 일으키는 치명적인 질병이다. 국내의 경우 매년 발생주의보를 방역당국에서 발표하고 있으나 발생이 계속 증가하고 전국적으로 발생되는 추세에 있으며 양계 농가에 큰 피해를 주고 있다. 뉴캣슬병의 주요증상은 처음에는 졸기 시작하여 콧물, 기침 등의 호흡기 증상이 나타나고 녹색설사를 하다 죽는다. 또한, 적절한 백신을 하지 않은 경우 백신항체가가 낮은 산란계나 종계는 산란율이 떨어지거나 중지되기도 하고 예방접종을 했다고 하더라도 접종 시기나 방법이 잘못되어 항체가가 높지 않은 닭에서는 다리와 목이 마비되는 신경증상이 나타나기도 한다(Song CS et al., Korean J. Vet. Res., 40(3), pp563-573, 2000).

한국은 일본의 연구자들에 의해 1920년대부터 뉴캣슬병 바이러스에 대해 연구를 하였고, 동남아시아 유래의 바이러스가 영국에 전파되어 서양에 처음으로 알려진 후 현재 전 세계적인 발병이 보고되고 있다. 1949, 1982-1984, 1988-1997, 1995-2002년도의 국내 뉴캣슬병 유행기에 분리된 뉴캣슬병 바이러스를 미국, 유럽, 일본, 대만과 중국 등지에서 보고된 뉴캣슬병 바이러스의 유전자와 비교분석한 결과, 한국분리주는 각각 유전자형 III, V, VI, VII 형에 속하는 것으로 확인되었다. 이와 같은 결과는 과거 다섯 번의 한국 뉴캣슬병 유행기에 분리된 바이러스의 유전형이 시대 순으로 차례대로 III, V, VI, VII 형으로 교체되어 왔음을 의미한다고 보고되고 있다. 뉴캣슬병 바이러스 한국분리주 중 유전자형 V형에 속하는 바이러스는 1970년대의 유럽 유행주와 관련성이 있는 반면, 1988년 이후 분리된 유전자형 VI형과 VII형의 바이러스는 일본, 대만, 중국과 같은 극동아시아의 뉴캣슬병 발생과 관련성이 높은 것으로 확인되었다. 따라서 최근에는 극동아시아 유래의 유전자형 VI형과 VII형이 한국분리주의 주류를 이루고 있는 것으로 보고되고 있다(Lee YJ et al., Avian Pathology, 33(5), pp1-10, 2004).

뉴캣슬병 백신은 크게 생독백신과 사독백신으로 구분된다. 생독백신은 백신주로 사용하는 바이러스의 잔여독력에 따라 크게 중간독주 (mesogenic strain), 약독주 (lentogenic strain), 비병원성주 (apathogenic strain) 등으로 분류 할 수 있다(Alexander DJ, Disease of poultry, 10 th edn, pp541-569, 1997). 약독주중 B1주와 La Sota주 (Clone주 포함)는 국내 뿐 만 아니라 전 세계적으로 가장 널리 사용되어 온 대표적인 뉴캣슬병 생독백신주이며 접종 시 주로 닭의 호흡기도에서 증식되는 특성이 있어 닭의 일령에 따라 정도의 차이는 있지만 일반적으로 백신접종 후 쉽게 감지될 정도의 백신접종반응을 유발하는 것으로 알려져 있다. 최근 생독백신 접종 시 나타나는 백신접종반응을 최소화시키기 위하여 소화기 점막에서 주로 증식되는 호흡기 비병원성 (장친화성) 백신주인 V4주, Ulster 2c주, VG/GA주 및 NDV-6/10주 등을 이용한 각종 생독백신들이 개발되어 있다. 그러나 이들 호흡기 비병원성 백신주들은 접종 시 백신접종반응이 거의 없다는 장점이 있는 반면에 상대적으로 B1주등 약독주들에 비하여 백신접종효능이 다소 떨어지며, 특히 최근 한국에서 유행하고 있는 유전자형 VII형에 속하는 내장성 강독 뉴캣슬병 바이러스의 방어에는 효과적이지 못한 단점이 있는 것으로 평가되고 있다. 뉴캣슬병 생독백신의 문제점은 최근 주로 동절기 육계농장에서 자주 확인이 되며, 특히 2-3회의 생독백신 접종에도 불구하고 뉴캣슬병이 발생하여 지역적으로 유행화되고 있어 문제시 되고 있다(Song CS et al., Korean J. Vet. Res., 40(3), pp563-573, 2000).

뉴캣슬병 사독백신은 겔백신과 오일백신으로 구분되는데 최근에는 뉴캣슬병, 닭전염성기관지염, 산란저하증 등 3종 이상의 질병을 동시에 예방 할 수 있는 다가혼합 사독오일백신이 개발되어 전 세계적으로 사용되고 있다. 다가혼합 사독오일백신의 개발은 1회 백신접종으로 3종의 이상의 질병이 동시에 예방되어 노동력과 인건비 절감효과가 있으나 산란계 농장의 경우 면역력 저하로 인한 뉴캣슬병 발생 피해사례가 늘어나고 있다. 특히 동절기 산란계 농장의 경우 뉴캣슬병 발생이 지역적 으로 유행화되어 산란저하 유발에 따른 경제적 피해를 가중 시키고 있다. 육계와는 달리 수차례의 생독백신과 사독백신을 접종함에도 불구하고, 폐사는 일어나지 않지만 산란율 저하피해는 매우 심각한 경우가 많은 것으로 보고되고 있다. 다가혼합 사독오일백신은 제조 시 사용되는 항원과 오일의 상대적인 비율이 뉴캣슬병 단미 오일백신에 비하여 뉴캣슬병 바이러스 항원량이 적어 백신의 면역능과 지속능 저하 등의 문제점이 있어 단점으로 지적되고 있다. 따라서 최근 유럽연합에서는 백신 권장접종량의 1/50의 함량을 숙주동물인 닭에 접종하여 생성되는 항체수준을 측정함으로써, 뉴캣슬병 백신의 바이러스 항원함량을 좀 더 정량적으로 평가하는 등 항원함량을 늘이기 위해 노력하고 있다. 또한 사독백신 제조용 뉴캣슬병 백신주가 최근 유행하고 있는 유전자형 VII형 뉴캣슬병 바이러스 유행주를 얼마나 효과적으로 방어할 수 있는가 하는 문제점이 지적되고 있다. 그러나 산란저하까지 완벽하게 막아줄 수 있는 뉴캣슬병 사독백신은 아직까지 전 세계적으로 개발되어 있지 못한 실정이다(Darrell R. Kapczynski et al., Vaccine, 23, pp3424-3433, 2005).

닭전염성기관지염 (Infectious Bronchitis: 이하 'IB'라 함)은 닭전염성기관지염 바이러스 (IBV)에 의해서 발생되는 닭의 급성 전염병으로서, 국내 뿐 만 아니라 전 세계적으로 양계산업에 많은 경제적 피해를 유발하고 있는 주요 생산성 저하 질병 중의 하나이다. IBV에 감염된 닭들은 일반적으로 크게 세 가지 병증을 유발한다. 첫째는 어린 병아리에 감염되어 콧물이나 기침 등의 호흡기 증상을 일으키는 병증으로 간혹 2차적인 호흡기 세균감염을 유도하여 높은 이병률과 함께 폐사를 일으키는 경우이다. 두번째는 산란장기에 손상을 주는 병증으로 산란율 저하와 함께 계란의 품질이나 난각질을 저하시킨다. 세번째는 신장에 심한 손상을 주어 많은 폐사를 일으키는 병증이다(King DJ et al., Disease of poultry, 9 th edn, pp471-484, 1991).

IBV는 코로나바이러스과 코로나바이러스 (Coronaviridae coronavirus)에 속하는 바이러스로, 서로 다른 IBV 간의 재조합으로 인하여 변이형 바이러스가 생긴다는 사실이 실험적으로 확인되었고, 앞으로도 계속해서 새로운 혈청형의 IBV들이 출현할 가능성이 있으며, 이들 각 혈청형에서 변이된 변이형 바이러스까지 포함하는 그 종류는 수십 종에 이를 것으로 추정되고 있다. 또한 이들 혈청형 간에는 상호 교차 반응이나 교차 면역이 잘 되지 않기 때문에 변이형 IBV에 대한 예방에는 많은 어려움이 따르게 된다(Lambrechts C. et al., Avian Pathology, 22, pp577-599, 1993).

현재까지 전 세계적인 발생을 보이고 있는 IBV 혈청형으로는 메사추세츠형과 793B 또는 4/91이라 불리우는 변이형 또는 지역별로 유행하고 있는 바이러스라 할 수 있다. 미국의 경우 1950년도부터 메사추세츠형 IBV가 유행하였고, 1957년도부터는 코네티컷형 IBV가 유행되었으며, 그 후 알칸사스, 플로리다, 델라웨어, 조오지아 변이주 등 매우 다양한 혈청형의 IBV가 유행하고 있다. 현재 미국에서는 다양한 혈청형에 광범위한 방어력을 보이는 메사추세츠형 백신을 기본으로 하여 미국 내 각 지역에서 유행하고 있는 코네티컷형과 알칸사스형 백신을 개발하여 병행 사용하고 있다.

영국에서는 UK6/82를 비롯하여 8가지의 혈청형의 IBV가 분리, 보고된 바 있 으며, 1991년 793/B형의 IBV가 확인되기 이전에는 메사추세츠형 IBV 백신만이 사용되어져 왔으나 현재는 793/B형 IBV 백신이 병행 사용되고 있다.

호주의 경우에는 미국이나 서유럽 국가들에서 유행하고 있는 IBV와는 전혀 다른 새로운 IBV의 유형이 주류를 이루고 있다. 즉, 혈청형 A (Vac1) ,B (Vic S), C, D, E, F, G, H, I, J, K, L, M, O 등으로 명명되고 있는 IBV가 유행중이며, 이중 혈청형 A와 B에서 유래된 Vac1 과 Vic S등 2종류의 백신이 사용되고 있다. 호주 유래 IBV는 바이러스의 S1 유전자 분석자료를 근거로 하여 그룹 I (신장형), 그룹 Ⅱ (호흡기형) 등 두 개의 유전그룹으로 호주 내 유행 IBV를 구분하고 있다.

국내의 경우에는 1986년도에 최초 IB 발생 확인보고가 있었으며 피해방지를 위하여 메사추세츠형 IBV로 제조된 생독 및 사독 오일백신이 사용되기 시작하였다. 그 당시에는 IBV 감염으로 인한 피해는 호흡기증상 유발 및 기형란을 동반하는 산란저하 피해가 주류를 이루었으며 메사추세츠형 IB 백신접종으로 야외 IBV 감염으로 인한 피해를 효과적으로 막을 수 있었다. 그러나 1990년도 이후 메사추세츠형 IBV 백신을 전국적으로 사용하고 있음에도 불구하고 산란계나 종계의 경우에는 다양한 산란저하 피해사례가 속출되었으며, 육계의 경우에는 육성중인 병아리에서 10% 내 외의 폐사와 함께 심한 신장염 등을 수반하는 변이형 IBV가 발생되어 현재까지도 피해가 이어지고 있다. 현재 국내에서 유행중인 IBV는 크게 Korean 1 그룹에 속하는 호흡기형 IBV와 Korean 2 그룹에 속하는 신장형 IBV (genotype III)로 대별할 수 있다(Rhee YO et al., Korean J. Vet. Res., 26, pp277-282, 1986; Song CS et al., Avian Pathology, 27, pp409-416, 1998; Song CS et al., Korean J. Poult. Sci ., 27(2), pp91-98, 2000).

전세계적으로 유행하고 있는 IBV의 혈청형은 수십종 이상으로 추정되고 있으며 혈청형간의 교차방어능은 인정되지 않는 경우도 많지만 그렇다고 매번 새로운 혈청형이 발견될 때마다 동종의 혈청형에 의한 백신을 개발하는 것은 불가능하다고 볼 수 있다. 야외에서 유행하고 있는 IBV들 중에는 어느 한 종의 혈청형이 다른 여러 혈청형의 IBV를 완벽하지는 못하지만 상당한 교차방어 효과를 유발하는 것도 있는 것으로 보고되고 있으며, 이렇게 광범위한 교차방어능을 보이는IBV 분리주들은 차세대IB 백신 개발에 주로 이용되고 있다.

현재 전세계적으로 사용되고 있는 IB 생독백신은 메사추세츠형 (H120, Ma5)으로 일종의 변이형인 신장형 IB 감염피해를 완벽하게 막아줄 수는 없지만 반복적으로 분무접종을 실시할 경우 어느정도 효과가 있는 것으로 분석되고 있다. 그러나 최근 한국을 비롯하여 아시아 지역에서 유럽지역으로 변이형 신장형 IB 감염으로 인한 피해사례가 증가되고 있으며, 특히 변이형 신장형 IB 감염으로 인한 호흡기와 복막염 발생피해는 전 세계 육계와 산란계 산업에 막대한 경제적 피해를 유발하고 있어 문제시 되고 있다. 비교적 다양한 종류의 IBV에 광범위한 면역원성이 있는 것으로 알려진 기존의 메사추세츠형 IB 생독백신도 변이형 신장형 IBV 감염 시 산란저하 뿐만 아니라 호흡기, 복막염 유발의 문제점이 있어 단점으로 지적되고 있다.

코로나바이러스는 사람에 감염 시 호흡기 증상을 유발하나 증상이 미미하여 사람 감염병으로는 주목 받지 못한 바이러스였다. 그러나 2002년말 중국 남부지방에서 발생한 중증급성호흡기증후군(Severe acute respiratory disease: SARS)가 전 세계적으로 확산되어 많은 인명 피해와 경제적 손실을 가져왔다. 2003년 2월 11일 세계복건기구(WHO) 전염병 감시 및 대응 조직 (CSR, Communicable disease surveillance and response)에서는 "중국 광동성 지방에서 원인이 밝혀지지 않은 중증급성호흡기증후군(SARS: 사스) 발생으로 300명의 환자와 5명의 사망자가 발견되어 중국 보건 당국에서 가검물 채취 및 역학 조사를 시행 중"이라는 내용을 발표하였다.

중국 광동성에서의 발생에 이어 베트남에서도 한명의 초발환자가 중국 상해, 홍콩을 방문한 후 급성호흡기증후군으로 입원 치료를 받던 중 20명의 병원 직원이 유사한 증상을 보임이 확인 되었다. 또한 홍콩의 한 공공병원에서 50명의 병원직원 중 23명이 급성호흡기 증상을 보여 8명이 폐렴 소견으로 입원한 기록이 있다. 사스 코로나 바이러스는 현재까지 사람에서의 재차 감염은 확인되지 않고 있으나 홍콩 소재 동굴에서 서식하는 박쥐에서 사스 코로나바이러스와 유산 유전 형질의 바이러스가 발견되어 주목받고 있다. 사스 코로나바이러스를 예방할 수 있는 백신은 개발 중이나 아직 상용화되지는 못하고 있으며, 효과적인 치료제 또한 개발 중이나 상용화되지 못한 상태이며, 바이러스의 특성 상 기존의 항바이러스제제에 내성을 갖는 변이주의 출현 가능성이 있어 문제시되고 있다(Henry LY et al., TRENDS in molecular medicine, 9(8), pp323-325, 2003; Kathryn VH et al., J. Clin . Invest, 111, pp1605-1609, 2003).

뉴모바이러스 (Avian Pneumovirus: 이하 'APV'라 함)는 파라믹소바이러스과 뉴모바이러스에 속하는 단일가락 RNA 바이러스이다. APV 감염증은 상부호흡기의 카 타르성 염증 및 포말성 결막염과 부비강염과 관련하여 유럽에서 타조의 비기관염 (Turkey rhinotracheitis, TRT)으로 알려져 왔다. 상부호흡기도 섬모의 감소와 운동성의 소실 등을 야기하여 이로 인한 기침, 재채기나 두부의 부종 증상을 나타내는 닭에서 두부종창증 (Swollen head syndrome: SHS)을 야기한다(Cook JKA, The Veterinary Journal, 160, pp118-125, 2000).

뉴모바이러스는 A형과 B형이 주로 닭에서 문제시되며, C형은 주로 칠면조에서 호흡기 질환을 유발한다. 닭에서의 임상증상은 대장균, 마이코플라즈마균, 보데텔라균 등 세균의 이차감염에 의해 심화되며, 상부호흡기도에서 닭전염성기관지염의 증식에 중요한 역할을 한다. 호흡기 질환과 함께 생식기관에 영향을 주어 기형란 및 산란저하를 유발한다. 임상증상이 나타나지 않아도 혈청검사 결과 항체가 검출되어 잠재적인 발병의 원인으로 작용할 수 있으며, 공기를 통한 전파를 통해 쉽게 이환되어 그 위험성이 크다(Cook JKA et al., Avian Pathology, 31, pp117-132, 2002).

최근 인수공통전염병이 사회적 문제로 크게 대두되고 있다. 최근에는 네덜란드에서 메타뉴모바이러스에 속하는 새로운 바이러스가 28 명의 어린이에서 분리되어 사회적으로 큰 주목을 받은바 있다. 이 새로운 바이러스는 사람 뉴모바이러스라고 불리며, 조류의 뉴모바이러스 C 형과 유사한 것으로 보고 되고 있다. 따라서 사람의 바이러스가 조류로, 또는 그 반대의 방식으로 감염이 이루어질 수 있는 가능성에 대한 평가가 이루어져야 된다는 의견이 지배적이다(Njenga MK et al., Virus Research, 91, pp163-169, 2003).

호흡기 감염에 대한 병원성 기전을 파악하기 위해 기존의 호흡기 친화성 바이러스와 세균 즉, 뉴캣슬병 (Newcastle disease), 전염성후두기관염 (Infectious laryngotracheitis), 계두 (Fowl pox), 마이코플라스마 감염증 (Mycoplasmosis), 파스튜렐라 (Pasteurellosis) 그리고 헤모필러스 감염증 (Hemophilus paragallinarum) 등에 대한 혼합감염의 기병론과 감별 진단에 대한 연구가 실시 되고 있다.

질병 방제를 위한 백신으로 사독오일 백신과 생독 백신이 개발되어 다양한 임상평가가 이루어 지고 있다. 뉴모바이러스 백신은 칠면조와 닭에서의 임상증상과 산란저하 등 생산성 저하방지에는 효과가 인정되고 있으나 뉴모바이러스 혈청형별 백신의 교차방어능에 대한 의문점이 아직 남아 있으며, 특히 백신접종이 뉴모바이러스 감염 자체를 막을 수는 없어 단점으로 지적되고 있다. 사람 뉴모바이러스에 대한 백신과 치료제는 아직 개발되어 상용화되어 있지 시급한 대책 마련이 요구되는 질병이다(Hampl H et al., J. Virol ., 52, pp583-590, 1984).

돼지 생식기 호흡기기 증후군 (Porcine reproductive and respiratory syndrome: PPRS)은 아르테리바이러스과 (arteriviridae)의 막이 있는 양성가닥 RNA 바이러스 (enveloped positive-stranded virus)인 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스 (PRRSV)에 의해서 유발된다. 대략 10~15년 전에 두 개의 다른 PRRSV 주 (strain)가 명백히 독립적으로 미국과 유럽에서 출현하였고, 현재 이 질병은 북미, 유럽 및 아시아의 많은 돼지 생산 국가에서 돼지의 생식능력 감소 및 호흡기 질환을 유발하고 있으며, 미국에서 감염의 유행은 70%에 이르는 것으로 추정된다 (Snijder EJ and Meulenberg JJ, J. Gen. Virol., 79, pp961-979, 1998). PRRSV는 호흡, 성취, 물린상처 또는 주사바늘에 의해서 감염되며, 점막, 폐 또는 국소부위의 대식세포의 체액, 혈액, 배설물, 소변 및 정액을 통해서 바이러스를 체외로 배출한다. 암퇘지에서의 임상학적 증상은 유산 또는 약하게 태어나는 돼지의 조산성 분만, 사산 돼지 및 자기 분해된 태아와 관련 있다. PRRSV는 전 세계적으로 발생하고 있으며, 축산산업에 있어 막대한 경제적 손실을 주고 있으나 적절한 대처방안이 없어 대책마련이 시급히 요구되고 있다.

PRRS는 양돈을 하는 대부분의 국가에서 발생하는 것으로 알려져 있으며, 이 질병이 처음 발생할 당시인 1989년에는 번식 및 분만시 손실이 가장 뚜렷했으나 상재화되면서 돼지호흡기복합감염증 또는 이유후전신소모성증후군을 유도하는 요인으로서도 매우 중요하게 인식되고 있다. PRRSV는 준임상형감염, 돈군 내 지속적 바이러스의 순환, 감수성 번식돈군의 계속적 유입, 변이주의 출현 등이 이 바이러스에 의한 피해예방을 어렵게 한다(Goyal SM et al., J. Vet. Diagn . Invest., 5, pp656-664, 1993).

국내에서는 1993년 PRRSV가 분리되었으나 혈청학적인 검사결과에 따르면 1980년대 중반에 양돈업의 급성장과 함께 미국 등지로부터 수입된 PRRS 감염 종돈에 의해 국내에 유입되었을 것으로 추정되고 있다(Kang JY et al., Korean J. Vet. Res., 39(2), pp294-300, 1999). 그 당시국내에서는 PRRS에 대한 이해가 부족해서 초동방역이 제대로 이루어지지 않아 감염종돈의 보급에 따라 질병이 쉽게 전국으로 확산되었을 것으로 추정되고 있다. PRRS는 바이러스 감염 시 지속감염되며, 동일한 농장에서도 유전적으로 혈청학적 형질이 다른 바이러스가 공존할 수 있으며, 수직-수평으로 바이러스가 전파하므로 돈군의 집단 면역을 안정적으로 지속시키기가 매우 어려운 것으로 보고되고 있다. 또한 현재 접종하고 있는 백신은 장기간 보호면역을 지속시키지 못하며, 정액이나 분뇨 등을 통한 바이러스 배출도 감소시키지 못하므로 백신에 의존한 질병방어는 확신할 수 없는 문제점이 있어 단점으로 지적되고 있다(Kwon CH et al., Korean J. Vet. Res., 34, pp77-83, 1994).

RNA 바이러스 가운데에서도 비교적 크기가 작은 바이러스들이 있다. 이들은 작다는 뜻의 pico'라는 말과 RNA를 합쳐 피코나바이러스라고 부르며, 여기에 속한 바이러스들을 통틀어 피코나바이러스과 (Piconaviridae)라고 부른다. 피코나바이러스과에 속하는 엔테로바이러스는 무균성 수막염, 수족구병, 포진성 구협염, 확장성 심근염, 급성 출열성 결막염 등의 다양한 임상증상을 일으키는 약 70가지 혈청형을 포함하고 있으며, 폴리오바이러스 (Poliovirus), 콕사키바이러스 (Cossackievirus) 및 에코바이러스 (Echovirus)와 기타 엔테로바이러스로 분류된다. 엔테로바이러스는 바이러스 입자의 직경이 20~30 나노미터 정도인 외가닥 RNA 바이러스이며, 콕사키바이러스 (Coxsackievirus, CXV)는 피코나바이러스과에 속하는 사람 엔테로바이러스 (human enterovirus)로서 크게 A형 (A type)과 B형 (B type)으로 구분된다(Pallansch MA and Roos RP, Fields Virology, 4 th edi, pp723-775, 2001).

또한 최근 세계 곳곳에서 고위험성 엔테로바이러스 및 변종 바이러스 (엔테로바이러스 71형, 콕사키바이러스 A24 변이주)가 새롭게 발견되어 유행되고 있어 이를 조기에 탐지하기 위한 국가 간 공동감시체계 구축이 요구되고 있다. 실제로 국내에서 2000년 엔테로바이러스 71형, 무균성 수막염이 크게 유행한 2002년에는 에코바이러스 13형, 전국적으로 급성출혈성 결막염이 폭발적으로 유행했던 2002년과 2003년에는 콕사키바이러스 A24형 변이주가 유행했음을 확인하고 이에 대한 대국민 홍보를 실시한 바 있다.

콕사키바이러스를 포함하는 엔테로바이러스는 척추동물의 소화기관을 비롯하여 호흡기관 및 중추신경계에까지 감염되어 다양한 임상증상을 유발하기 때문에 국가 차원의 대책 마련이 시급히 요구되고 있으나 바이러스의 종류와 혈청형이 매우 다양하여 효과적인 상용화 백신이나 치료제가 개발되어 있지 못한 실정이다.

세망내피증 (reticuloendotheliosis virus: RE)은 레트로바이러스과 (retroviridae)에 속하는 RNA 바이러스로서 주로 칠면조, 닭, 오리 등에서 발생하며 꿩과 메추리에서도 일부 발생된다. RE 바이러스 (REV)는 조류의 백혈병 바이러스 (avian leukosis/sarcoma virus)와 마찬가지로 RNA 의존성 역전사 효소 (reverse transcriptase)를 가지지만 항원적으로나 형태학적으로는 차이가 있다. REV에는 칠면조에서 분리된 T주 (strain T), 닭에서 분리된 닭 합포체 바이러스 (chicken syncytial virus: CSV), 오리에서 분리된 비장괴사증 바이러스 (spleen necrosis virus: SNV) 및 오리 전염성 빈혈 바이러스 (duck infectious anemia virus: DIAV) 등이 있으나 중화시험으로는 바이러스간의 차이점을 없는 것으로 알려져 있다. 이중 T주는 급성 종양을 유발할 수 있는 종양 유전자 (v-rel)를 갖고 있으나 스스로는 증식할 수 없는 증식결손바이러스 (replication defective virus: re-REV)와 종양 유전자는 가지고 있지 않으나 re-REV의 증식을 돕는 T주 헬퍼 바이 러스 (REV associated helper virus: REV-A)로 구성되어 있다(Witter RL and Fadly AM, Disease of poultry, 10 th edn, pp517-536, 1997).

세망내피증은 닭에서 선위염, 깃털의 이상, 증체율의 저하 및 면역저하를 나타내는 왜소병 증후군 (runting disease syndrome)이 나타나기도 하며 종양이나 백혈병 종양과 유사한 만성종양을 유발하기도 한다. 또한 REV에 감염된 닭들은 면역능력의 저하로 전염성후두기관염, 계두, 콕시듐증 및 살모넬라 등의 질병 감염에 대한 저항성이 크게 감소하며 마렉병이나 뉴캣슬병 등의 백신 면역이 저하되는 것으로 보고되고 있다. 닭에서의 세망내피증의 전파는 감염계로부터 동거계로의 수평감염도 쉽게 일어나지만 이 경우에는 질병으로 인한 피해가 나타나지 않는 경우가 대부분이며 질병으로 인한 피해는 감염된 모계로부터 후대 병아리에게로 수직 감염되거나 조기 감염될 경우에만 나타난다(Theilen GH et al., Journal of the National Cancer Institute, 37, pp731-743, 1966).

REV는 1본쇄 RNA로 되어 있으나 RNA 의존성 DNA 중합효소를 가지고 있어서 증식 중에는 2본쇄 DNA로 될 수 있으며 이러한 2본쇄 DNA는 세포의 염색체 DNA에 삽입되어 프로바이러스 (provirus) 형태로 존재할 수 있다(Fritsch E et al., Virology, 83, pp313-321, 1977). 이러한 REV의 감염 시 숙주 게놈에 유전자 형태로 남는 특성으로 인하여 세망내피증에 대한 생독백신은 개발 및 사용이 불가한 실정이며 사독백신 또한 바이러스의 중화항체를 생산하는 당단백 85 (glycoprotein 85: gp85)가 매우 불안정하여 백신 제조가 불가한 실정이다.

오제스키 바이러스 (aujeszky's disease virus: ADV) 허피스바이러스과 (herpesviridae)의 알파 허피스 바이러스 (alpha herpesvirus subfamily)에 속하는 DNA 바이러스로서 돼지를 자연숙주로 소, 개, 고양이, 토끼, 밍크, 마우스, 랫트, 기니픽 그리고 조류 까지 광범위한 숙주 영역을 갖는 바이러스 이다(Thowley DG et al., J. AM.Vet. Med . Assoc ., 176, pp1001-1003, 1980). 오제스키병은 가성광견병 (psedorabies)이라고도 하며, ADV로 인한 돼지질병은 타 질병에서 나타나는 특징적인 가려움증은 나타내지 않고 성돈의 심한 호흡기 증상과 성장저하 및 임신돈에서의 유사산 등 번식장애, 자돈의 높은 폐사율 등 양돈산업에 많은 경제적 피해를 유발하고 있다(Lee JB et al., Korean J. Vet. Res., 28(1), pp99-103, 1988).

오제스키병 감염으로 인한 경제적 손실을 줄이기 위하여 백신접종을 실시하고 있으나 감염 시 임상증상은 나타나지 않으나 감염 자체는 막아주지 못하며 잠복감염이 성립되게 되어 ADV의 근절에는 효과적이지 못한 단점이 있다. 따라서 야외 ADV 감염돈과 백신접종돈을 구별하기 위하여 유전자 결손 백신의 개발과 아울러 야외 ADV 감염을 감별진단 할 수 있는 항체검사킷트가 개발되어 사용되고 있으나 잠복감염에 의한 질병의 전파와 근절은 여전히 풀지 못한 숙제로 남아 있다.

아데노바이러스는 아데노바이러스과 (Adenoviridae)에 속하는 DNA 바이러스로서 소아 및 면역기능이 저하된 환자에서 다양한 호흡기 감염증과 위장관염을 주로 일으키며, 유행성 각결막염 (Epidemic keratoconjunctivitis), 출혈성 방광염 (Hemorrhagic cystitis) 및 뇌막염 (Meningitis) 등 다양한 질환을 야기하는 바이러스이다(Ruuskanen O et al., Clinical Virology, pp525-548, 1997). 아데노바이러스 감염은 감염된 사람의 분비물이 비말, 오염된 물건과의 접촉 등에 의해 전파 되며, 아데노바이러스 감염에 의한 사망은 물론 특정한 혈청형에 의한 감염이나 면역기능이 저하된 환자에서는 사망까지 초래할 수도 있는 것으로 알려져 있다.

아데노바이러스에 의해 야기되는 호흡기 질환에는 발열성 급성인두염 (Acute pharyngitis), 급성호흡기질환 (Acute respiratory disease: ARD) 및 폐렴 (Peumonia) 등이 있으며, 아데노바이러스 감염환자 중 4-18%는 폐렴의 형태로 나타나고 상기도 감염, 인후두염 및 후두염 등 다양한 감염양상을 나타내는 것으로 알려져 있다. 아데노바이러스의 호흡기 감염에 따른 폐 손상은 종종 매우 심각한 문제를 일으키기도 하는데, 폐렴환자의 경우 60-65%, 상기도감염 환자의 경우 10%가 폐쇄성 기관지염, 기관지 확장증 및 McLoed 증후군 등의 합병증을 포함한 다양한 폐손상을 유발하는 것으로 알려져 있다(Gold R et al., J. Can. Assoc . Radiol ., 20, pp218-224, 1969).

아데노바이러스 감염의 발생양상은 늦겨울, 봄, 초여름에 걸쳐 발생빈도가 높지만 연중 산발적으로 발생하며(Ahn KM et al., Korean Med . Sci ., 14, pp405-411, 1999), 대부분 영유아나 어린이, 노인 및 면역기능이 저하된 환자에게서 주로 나타나는 것으로 알려져 있으나 학교, 병원, 군대, 탁아소 등 집단시설에서 환자발생이 유행성으로 나타날 수도 있다 (Esteban RE et al., Rev. Clin . Esp ., 196, pp82-86, 1996).

호흡기 질환을 유발하는 인플루엔자 등 다른 바이러스의 경우에는 비교적 효과적인 다양한 백신이나 치료제가 개발되어 사용되고 있는데 반해 아데노바이러스에 대한 효과적인 백신은 아직 개발되어 있지 않은 상태이며, 치료법 또한 확립되 지 않은 상태이기 때문에 발열 시 적절한 수분 공급과 안정, 해열제 복용 등의 대증적인 (Symptomatic) 요법 이외에는 특별한 치료법이 없는 실정이다.

공중보건과 위생 모두의 궁극적인 목표는 질병의 예방이다. 질병은 병원체, 숙주, 환경에 영향을 받는데, 그 중 외부에서의 요인인 병원체는 소독 등의 방법에 의해서 예방이 가능하다 (한국수의공중보건학회, 수의공중보건학교육협의회편, 수의공중보건학, 문운당, pp1-2, 1996). 소독이란 직접적으로 병원미생물의 피해가 없도록 하는 것이다. 이와 같은 소독에는 멸균 또는 소독이라는 말을 쓰고 있으며, 이것은 용기나 물질에 오염된 병원미생물을 살균 처리하는데 있어 그 정도에 따라 구별한다. 멸균이라 하면 기물에 부착된 모든 미생물을 완전히 사멸시키는 것을 의미하고, 소독이라 하면 기물에 존재하는 어떤 목적의 병원 미생물을 살균하는 것을 의미하는 것이다.

소독은 사람이나 동물이 전염병에 감염될 위험성이 있는 병원체와 그 병원체를 전파하는 생물을 박멸하여 전염병에 의한 피해를 미연에 방지하는 하나의 수단이다. 전염병의 발생이나 만연을 방지하는 방법은 여러 가지가 있으나 그 중에서도 소독은 중요한 방법의 하나이다. 소독약으로 소독을 실시할 때에는 여러 가지 유리한 조건하에서 실시해야 하며, 이상적인 조건은 소독력이 강력하여 소량으로서 유효하고 물에 녹으며 보존을 오래할 수 있고 독성이 적고 소독 대상물을 손상하지 않으며 가격이 싸야할 것 등이다.

병원미생물의 종류에 따라 소독약에 대한 각각 다른 저항력을 가지고 있으므로 유효한 소독을 실시하려면 병원미생물의 저항성의 정도를 알고 적절한 소독약 및 소독방법 등을 선택하여야 한다. 병원미생물의 저항성이 가장 강한 것에 속하는 아포성(芽胞性)의 병원체 (탄저균, 기종저균, 파상풍균, 악성수종균 등의 아포를 형성하는 균 등)는 다른 균에 비하여 극히 저항력이 강하므로 이들은 일광소독이나 저온소독, 발효소독 등으로서는 소기의 목적을 달성할 수 없다.

강한 것에 속하는 미생물(결핵균, 포도상구균, 연쇄상구균, 아데노바이러스, 엔테로바이러스 등)은 간단한 일광소독, 건조소독, 발효소독으로서는 거의 사멸하지 않는다. 보통인 것에 속하는 미생물 (대장균, 돈단독균, 인플루엔자, 코로나바이러스, 뉴모바이러스, 구제역, 돼지콜레라, 뉴캣슬병, 광견병, 일본뇌염 등의 바이러스 등)은 발효작용 등을 이용하여 유효하게 소독할 수 있다. 약한 것에 속하는 것 (출혈성 패혈증균, 부르셀라균 등)은 발효 건조 등에 의하며 쉽게 소독할 수 있다.

이상과 같이 병원미생물의 저항력을 구별하나 이들의 병원미생물은 균체자체만일 때와 혈액이나 분뇨 등의 유기물중에 섞여 있을 경우 등에는 외계의 작용에 대하여 저항력에 변동이 생긴다. 이와 같이 유기물 등에 혼합할 때는 소독이 어려워지므로 여러 조건을 고려하여야 한다. 또 아포를 형성하고 강한 저항력을 가진 균들은 토양 중에 수십 년간 생존하여 쉽게 사멸하지 않으므로 특히 주의를 해야 한다.

소독약의 종류는 크게 염기제제, 산성제제, 알데히드제제, 산화제 등으로 구분할 수 있다. 염기제제는 탄산소다, 가성소다 등이 있으며 값이 저렴하여 대단위 소독에 적합하다. 유기물이 많은 환경에서도 소독효과가 좋기 때문에 오물이 많은 축사 내 외부, 뜰, 차량, 하수구, 쓰레기, 배설물 등의 소독에 이용한다. 또한 눈이나 피부에 직접 닿지 않도록 주의하여야 한다. 사용농도는 탄산소다(탄산나트륨, sodium carbonate) 4%, 가성소다(수산화나트륨, sodium hydroxide) 2% 이며 부식성이 강하여 차바퀴가 아닌 차체에 사용하면 도색이 벗겨질 우려가 있으며 알루미늄 계통에는 사용하지 말아야 한다.

산성제제는 구연산 (citric acid), 초산 (acetic acid) 용액 등으로서 보통 단일제제보다 복합제품으로 많이 판매되고 있다. 구연산 (citric acid) 용액은 0.2-2% 농도로 사용하며 사람과 의복에도 안전하다. 효력은 좋은 반면 침투력이 약하므로 유기물이 있을 경우에는 효과가 매우 낮아진다. 세정제 또는 계면활성제가 들어간 복합제로 사용하면 효과가 높아진다. 초산 (acetic acid) 용액은 2% (식초는 초산 4%에 상당)로 희석하여 사용하며 효과 및 주의사항은 구연산과 유사하다. 복합 산성제제는 복합염 및 산류로 구성된 소독제로서 단일제제보다는 복합제가 단일성분의 단점을 보완해 주므로 효력의 범위가 넓다.

알데히드제제는 글루타알데히드와 포름알데히드가 있으며, 독성이 있으므로 사람과 가축에는 직접 닿지 않도록 해야 한다. 글루타알데히드는 1-2%의 농도로 사용하며 유기물이 다소간 있더라도 소독효과가 좋다. 값이 비싼 편이어서 대량으로 사용하기에는 소독비용이 많이 든다. 포름알데히드는 포르말린(포름알데히드 40% 용액을 말함)을 8%의 농도로 하여 사용하며 글루타알데히드와 소독효과가 유사하다. 포르말린 훈증소독은 포르말린을 과망간산칼리와 일정 비율로 혼합하거나 시판되는 파라포르말린을 태워서 훈증가스를 발생시켜 소독하는 방법으로서 밀폐상태에 서 15-24시간 동안 처리하여야 충분한 소독효과를 기대할 수 있다. 가스 흡입시 생체에 매우 유독하고 자극성이 강하기 때문에 최근에는 사용을 금하고 있는 추세이므로 물기를 피해야 하는 전기·전자제품의 소독 외에는 가능하면 사용하지 않도록 한다. 포르말린 훈증소독 후에는 절대로 훈증가스를 흡입하지 말고 완전히 환기가 되도록 한다.

산화제는 산화작용으로 바이러스의 단백질 등을 파괴하는 소독제로서 주로 염소 또는 산소계 성분으로 구성된다. 염소계는 비전리형인 차아염소산 (HClO)을 발생시켜 살균력을 발휘하게 된다. 산성일수록 살균력은 증대되고 알칼리성에서는 살균력이 감퇴된다. 차아염소산제제는 차아염소산 (hypochlorite)은 pH 6-9 사이에서 차아염소산나트륨을 0.175% 이상의 농도로 사용했을 때 가장 높은 효과를 발휘한다. 그러나 유기물이 혼합된 상태에서는 소독효과가 낮아지며 15℃-20℃ 이상의 온도에서는 화학적으로 불안정하여 급속히 분해되기 때문에 소독약을 자주 갈아 주어야 한다. 호주 농무성 등에서 구제역바이러스에 대한 소독효과를 인정하고 있다. 이염화이소시안산나트륨 (Sodium Dichloroisocyanurate; NaDCC)제제는 산화제의 일종으로 정제나 산제의 형태로 시판되고 있으며 수용액상태에서 매우 불안정하므로 사용하기 직전에 물에 타서 사용해야 한다(Lee YO, Korean J. Vet. Res., 20(9), pp528-537, 1984).

상용화되어 사용되고 있는 대부분의 소독약들 중 산성제제를 제외한 염기제제, 알데히드제제, 산화제 들은 각종 병원성 바이러스나 세균에 대한 소독력은 우수하나 화학성분 자체의 독성이 매우 강해 사람이나 동물이 직접 접촉하거나 음용 할 수 없어 단점으로 지적되고 있다. 반면 산성제제는 구연산 (citric acid), 초산 (acetic acid) 등이 주성분으로 낮은 농도로 사용 시 사람 및 동물에 안전하나 이 경우 소독효과가 떨어져 단점으로 지적되고 있다(Han HR, Korean J. Vet. Res., 32(2), pp107-116, 1996).

소나무는 피너스 (Pinus)속으로 세계에 약 80-90종이 있으나 이들중 피너스 팔루스트리스 밀러 (P. palustris Miller : 북미), 피너스 피나스터에이톤 (P. pinaster Aiton : 프랑스), 피너스 실베스트리스 (P. sylvestris L. : 유럽전역), 피너스 라리시드 포이렛 (P. laricid Poiret : 오스트리아), 피너스 론기폴리아 룩스버그 (P. longifolia Rocvurgh : 인도), 피너스 덴시플로라 시엡 (P. densiflora Sieb. et Zucc. : 한국, 일본), 피너스 던베리 팔라토레 (P. thunberii Palatore : 해송, 일본)등에서 채취한 테르펜등이 주로 산업에 이용되고 있다.

솔잎의 주요성분은 테르펜틴 오일 (Terpentine oil), 시네올 (Cineole), 살리니그린 (Salinigrin), 코니페린 (Coniferin), 피-사이멘 (P-Cymen), 덴시피마릭산 (Densipimaric acid), 레텐 (Retene) 등과 엽록소, 단백질, 노지방, 인, 철분, 효소, 미네랄, 지용성 비타민 A 및 비타민 C 등이며, 주요성분은 종과 채취한 계절에 따라서 다소 차이가 있다.

피너스 덴시플로라 (Pinus densiflora Sieb. et Zucc.)의 잎(Needle)에서 얻은 정유에는 알파-피넨(α-Pinene), 베타-피넨(β-Pinene), 캄페네 (camphene), 펠란드렌 (phellandrene), 보르네올 (borneol), 보르닐아세테이트 (bornylacetate), 카리오필렌 (caryophyllene), 카디넨 디테르펜 (cadinene diterpene), 세스퀴테르 펜 (sesquiterpen), 세스퀴테르펜알콜 (sesquiterpenalcohol), 세릴알콜 (cerylalcohol), 밀납에는 쥬니퍼산 (juniperic acid), 사비니산 (sabinic acid), 헥사데칸디올 (hexadecane-diol), 프리아콘타놀 (triacontan-1-ol) 등이 함유되어 있으며, 그 외 마츄스테린 (matsusterin), 피토스테린 (phytosterin), 시닉산 (chinic acid), 시키믹산 (shikimic acid), 퀘르세틴 (quercetine), 캄페롤 (kaempferol) 등이 함유되어 있다 (赤松金芳 저, 신정 화한약, pp664-665, 1980 ).

우리나라에서 자생하고 있는 소나무과 중에서 잣나무 잎은 민간요법에서 임질과 매독의 치료약으로 사용되고 있으나 (御影雅幸 저, 日本生藥學雜誌, p 336, 1991), 솔잎의 여러 가지 약리작용에 대해서는 알려져 있지 않으며 단지 동상 및 피부의 타박상부위에 대해서 응혈된 피부를 빨리 원상으로 회복 시켜주는 효과가 있으며, 습진, 옴 및 땀띠 등을 치유하는 효과가 있는 것으로 알려지고 있다 (박종갑 저, 한방대의전, p134, 1984; 문화방송편저, 한국민간요법대전, p21, 1988). 또한 명의별록에는 모발이 희어지는 것을 방지하는 효과도 있다고 언급되어있으며, 목초강목에는 부스럼, 모발개선, 내장을 튼튼하게 하여주고 수명을 연장한다고 언급되어 있다. 소취효과, 불면증 치유효과 및 피부 미용효과등도 있으나, 상기 문헌 어디에도 솔잎이 항바이러스 효과를 가진다는 것에 대해서는 교시되거나 개시된 바가 없다.

이에, 본 발명자들은 상기 바이러스의 감염으로 인한 피해를 최소화 하고, 기존의 생독백신의 단점을 극복하고 이를 대체할 수 있는 안전하고 효과가 우수한 차세대 천연물 살바이러스제를 개발하기 위한 연구를 수행한 결과, 본 발명의 솔잎 추출물이 탁월한 바이러스 증식 억제 효과 및 살바이러스 효과를 가짐을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 탁월한 항바이러스 효과를 지닌 솔잎 추출물을 유효성분으로 함유한 바이러스로 인한 동물 질환의 예방 및 치료에 유용한 수의학적 조성물, 사료첨가제 및 살바이러스 소독용 조성물을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 솔잎 추출물을 유효성분으로 함유하는 인간을 제외한 동물의 바이러스로 인한 질환의 예방 및 치료용 수의학적 조성물을 제공한다.

본원에서 정의되는 추출물은 조추출물 또는 비극성용매 가용 추출물을 포함하며, 조추출물은 물, C₁ 내지 C₄의 저급알콜 또는 이들의 혼합용매로부터 선택되어진 극성용매, 바람직하게는 50 내지 70 % 물 및 C₁ 내지 C₄의 저급알콜의 혼합용매, 보다 바람직하게는 60 % 에탄올에 가용한 추출물을 포함하고, 비극성용매 가용추출물은 디클로로메탄, 클로로포름 또는 에틸 아세테이트로부터 선택된 비극성용매로, 바람직하게는 디클로로메탄에 가용한 추출물을 포함한다.

본원에서 정의되는 솔잎은 적송 (Pinus densiflora Sieb. et Zucc.), 해송 (Pinus thunbergii parlatore) 또는 잣나무 (Pinus koraiensis Sieb. et Zucc)의 잎을 포함한다.

본원에서 정의되는 바이러스는 RNA형 바이러스 또는 DNA형 바이러스를 포함한다.

본원에서 정의되는 RNA형 바이러스는 인플루엔자 바이러스 (influenza virus), 뉴캣슬병 바이러스 (newcastle disease virus), 전염성 기관지염 바이러스 (infectious broncheitis virus), 조류 뉴모바이러스 (avian pneumovirus) 돼지 생식기 및 호흡 증후군 바이러스 (porcine reproductive and respiratory syndrome virus), 콕사키 바이러스 (coxsakie virus) 또는 세망내피증 바이러스 (reticuloendotheliosis virus)를 포함한다.

본원에서 정의되는 인플루엔자 바이러스는 A/H1N1, H9N2 또는 H6N5의 혈청형을 가짐을 특징으로 한다.

본원에서 정의되는 DNA형 바이러스는 오제스키 바이러스 (aujeszky's disease virus) 또는 아데노 바이러스 (adeno virus)를 포함한다.

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본원에서 정의되는 인플루엔자 바이러스의 체내 감염으로 인해 유발되는 질환은 조류독감 또는 변이형 감염성 조류독감을 포함한다.

본원에서 정의되는 뉴캐슬병 바이러스의 체내 감염으로 인해 유발되는 질환은 조류 파라믹소바이러스 (Avian paramyxoovirus) 또는 개 디스템퍼(Canine distemper)를 포함한다.

본원에서 정의되는 닭 전염성 기관지염 바이러스의 체내 감염으로 인해 유발되는 질환은 칠면조 코로나 바이러스(Turkey coronavirus)를 포함한다.

본원에서 정의되는 콕사키 바이러스의 체내 감염으로 인해 유발되는 질환은 구제역 바이러스 (Foot-and-mouth disease)를 포함한다.

본원에서 정의되는 세망내피증 바이러스의 체내 감염으로 인해 유발되는 질환은 조류 백혈병 바이러스 (Avian leukosis virus)를 포함한다.

본원에서 정의되는 오제스키 바이러스의 체내 감염으로 인해 유발되는 질환은 닭 전염성후두기관염 바이러스 (Chicken infectious laryngotrachitis virus) 또는 마렉병 (Marek's disease)를 포함한다.

본원에서 정의되는 아데노 바이러스의 체내 감염으로 인해 유발되는 질환은 동물에서 아데노 바이러스 호흡기 감염증 또는 산란저하증 (Egg drop syndrome)을 유발하는 동물 아데노바이러스 감염증 바이러스를 포함한다.

또한, 본 발명은 솔잎 추출물을 유효성분으로 함유하는 바이러스로 인한 질환의 예방 및 개선용 동물사료 첨가제 및 이를 포함하는 사료를 제공한다.

또한, 본 발명은 솔잎 추출물을 유효성분으로 함유하는 살바이러스 소독용 조성물을 제공한다.

본 발명의 솔잎 추출물을 유효성분으로 함유하는 인간을 제외한 동물의 바이러스로 인한 질환의 예방 및 치료용 수의학적 조성물은, 조성물 총 중량에 대하여 상기 추출물을 0.1 ~ 50 중량% 포함한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명의 솔잎 추출물은 하기와 같이 수득될 수 있다.

본 발명의 솔잎를 채집하여, 물로 수세 후 음건한 후 잘게 마쇄하여 솔잎 시료 중량의 약 1 내지 30배, 바람직하게는 약 1 내지 15배에 달하는 부피의 물, 에탄올 및 메탄올 등과 같은 C₁ 내지 C₄의 저급알콜의 극성 용매 또는 이들의 약 1: 0.1 내지 1: 10의 혼합비를 갖는 혼합용매로, 바람직하게는 30 내지 100 %의 에탄올로 약 10 ℃ 내지 100 ℃에서 약 1시간 내지 1일, 바람직하게는 5시간 내지 20시간 동안 열수 추출, 환류 순환 추출 또는 가압추출, 초음파 추출 등의 추출방법을 사용하여, 바람직하게는 열수 추출 또는 환류 순환 추출하여 감압여과, 원심분리한 후 저급 알콜의 극성용매 또는 혼합용매로 추출한 상층액은 건열멸균기에 넣고 50- 150 ℃, 바람직하게는 60- 130 ℃에서 건조한 후 증류수에 정용한 후 동결건조하여 솔잎 추출물을 수득할 수 있다.

또한, 솔잎를 채집하여, 물로 수세 후 음건한 후 잘게 마쇄하여 솔잎 시료 중량의 약 1 내지 30배, 바람직하게는 약 1 내지 15배에 달하는 부피의 물, 에탄올 및 메탄올 등과 같은 C₁ 내지 C₄의 저급알콜의 극성 용매 또는 이들의 약 1: 0.1 내지 1: 10의 혼합비를 갖는 혼합용매로, 바람직하게는 30 내지 100 %의 에탄올로 약 10 ℃ 내지 100 ℃에서 약 1시간 내지 1일, 바람직하게는 5시간 내지 20시간 동안 열수 추출, 환류 순환 추출 또는 가압추출, 초음파 추출 등의 추출방법을 사용하여, 바람직하게는 열수 추출 또는 환류 순환 추출하여 감압여과, 원심분리한 후 상층액을 취하여 감압하에서 증발건조하여 수득한 솔잎 조추출물을 물에 현탁한 후, 디클로로메탄, 에틸아세테이트, n-부탄올 순으로 용매를 이용하여 추출하여 본 발명의 솔잎 비극성용매 가용추출물, 바람직하게는 에틸아세테이트 가용성 분획물을 수득할 수 있고, 더욱 구체적으로는 솔잎 60 % 에탄올 추출물에 동량의 디클로로메탄:물:메탄올을 일정 비율, 바람직하게는 10:9:1로 혼합하여 디클로로메탄 분획물 및 수가용성 분획물을 수득할 수 있고, 다시 상기 수가용성 분획물에 동량의 에틸아세테이트를 가하여 에틸아세테이트 가용성 분획물 및 수가용성 분획물을 수득할 수 있고, 마지막으로 상기 수가용성 분획물을 동량의 부탄올로 추출하여 부탄올 가용성 분획물과 수가용성 분획물을 수득할 수 있다.

본 발명은 상기의 제조공정으로 얻어진 솔잎 추출물을 유효성분으로 함유하는 바이러스로 인한 질환의 예방 및 치료용 수의학적 조성물을 제공한다.

본 발명에 따른 솔잎 추출물은 솔잎의 종류와는 상관없이 일정한 항바이러스 효과를 나타내었으며, 추출용매에 따른 항바이러스 효과는 극성용매 추출물 중에서는 60% 에탄올 추출물이, 비극성 용매 가용성 추출물 중에서는 디클로로메탄 추출 물의 항바이러스 효과가 탁월하였다.

또한, 본 발명에 따른 솔잎 극성용매 가용성 추출물을 인플루엔자 A 바이러스 (influenza A viruses), 뉴캣슬병 바이러스 (newcastle disease virus), 닭 전염성기관지염 바이러스 (infectious broncheitis virus), 조류 뉴모 바이러스 (avian pneumovirus), 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스 (porcine reproductive and respiratory syndrome virus), 콕사키 바이러스 (coxsakie virus), 세망내피증 바이러스 (reticuloendotheliosis virus), 오제스키 바이러스 (aujeszky's disease virus) 및 아데노 바이러스 (adeno virus)가 감염된 MDCK세포, 계태아세포, MARK-145 세포, Hep-2 세포 및 SPF 종란를 이용한 시험관 내 (in vitro) 항바이러스 효능시험에 처리하였을 때 살바이러스효과가 탁월하였으며, 솔잎 비극성용매 가용성 추출물을 인플루엔자 A 바이러스 및 뉴캣슬병 바이러스가 감염된 MDCK 세포 및 계태아 섬유아세포 를 이용한 시험관 내 (in vitro) 항바이러스 효능시험에 처리하였을 때 살바이러스효과가 탁월하였고, 또한 인플루엔자 A 바이러스가 감염된 마우스에 대하여 본 발명의 솔잎 추출물의 음수 및 위관 투여에 따른 치료효과가 탁월하였으며, 인플루엔자 A 바이러스 및 뉴캣슬병 바이러스가 감염된 SPF 닭에 대하여 본 발명의 솔잎 추출물의 투여에 따른 치료효과가 탁월하였고, 인플루엔자 A 바이러스가 감염된 오리에 대하여 본 발명의 솔잎 추출물의 투여에 따른 치료효과가 탁월함을 확인할 수 있었다.

본 발명의 솔잎 추출물은 독성 및 부작용이 거의 없으므로 예방 목적으로 장기간 투여 시에도 안심하고 사용할 수 있다.

본 발명의 솔잎 추출물을 포함하는 수의학적 조성물은 통상의 방법에 따른 적절한 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다.

본 발명의 솔잎 추출물을 포함하는 수의학적 조성물에 포함될 수 있는 부형제 및 희석제로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트, 세탄올, 스테아릴알콜, 유동파라핀, 솔비탄모노스테아레이트, 폴리소르베이트 60, 메칠파라벤, 프로필파라벤 및 광물유를 들 수 있다.

본 발명에 따른 솔잎 추출물을 포함하는 수의학적 조성물은 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향신료, 유화제, 방부제 등을 추가로 포함할 수 있는데, 본 발명에 의한 수의학적 조성물은 동물에 투여된 후 활성성분의 신속, 지속 또는 지연된 방출을 제공할 수 있도록 당업계에 잘 알려진 방법을 사용하여 제형화될 수 있고, 제형은 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 용액, 시럽, 에어로졸, 연질 또는 경질 젤라틴 캅셀, 좌제, 멸균 주사용액, 멸균 외용제 등의 형태일 수 있다.

본 발명에 의한 수의학적 조성물은 동물의 나이, 성별, 체중에 따라 달라질 수 있으나, 0.1 내지 100 mg/㎏의 양을 1일 1회 내지 수회 투여할 수 있다. 또한 그 솔잎 추출물의 투여량은 투여경로, 질병의 정도, 성별, 체중, 나이 등에 따라서 증감될 수 있다. 따라서, 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하 는 것은 아니다.

또한, 본 발명은 상기 방법으로 수득된 솔잎 추출물을 유효성분으로 함유하는 바이러스로 인한 질환의 예방 및 개선에 유용한 동물사료 첨가제 및 이를 포함하는 사료를 제공한다.

상기의 동물사료 첨가제용 솔잎 추출물은 20 내지 90 % 고농축액이거나 분말 또는 과립형태일 수 있다.

본 발명의 동물사료 첨가제용 솔잎 추출물은 구연산, 후말산, 아디픽산, 젖산, 사과산 등의 유기산이나 인산나트륨, 인산칼륨, 산성피로인산염, 폴리인산염(중합인산염) 등의 인산염이나 폴리페놀, 카테킨(catechin), 알파-토코페롤, 로즈메리 추출물(rosemary extract), 비타민 C, 녹차 추출물, 감초 추출물, 키토산, 탄닌산, 피틴산 등의 천연 항산화제 중 어느 하나 또는 하나 이상을 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 솔잎 추출물을 함유하는 동물사료 첨가제 및 이를 포함하는 사료는 보조성분으로 아미노산, 무기염류, 비타민, 항생물질, 항균물질, 항산화, 항곰팡이 효소, 살아있는 미생물 제제 등과 같은 각종보조제가 곡물, 예를 들면 분쇄 또는 파쇄된 밀, 귀리, 보리, 옥수수 및 쌀; 식물성 단백질 사료, 예를 들면 평지, 콩 및 해바라기를 주성분으로 하는 것; 동물성 단백질 사료, 예를 들면 혈분, 육분, 골분 및 생선분; 당분 및 유제품, 예를 들면 각종 분유 및 유장 분말로 이루어지는 건조 성분, 건조 첨가제를 모두 혼합한 후, 액체 성분과, 가열 후에 액체가 되는 성분, 즉, 지질, 예를 들면 가열에 의해 임의로 액화시킨 동물성 지방 및 식 물성 지방 등과 같은 주성분 이외에 영양보충제, 소화 및 흡수향상제, 성장촉진제, 질병예방제 등과 같은 물질과 함께 사용될 수 있다.

상기 동물사료 첨가제용 솔잎 추출물은 동물에게 단독으로 식용 담체 중에서 다른 사료 첨가제와 조합되어 투여될 수 있다.

또한, 상기 동물사료 첨가제용 솔잎 추출물은 탑 드레싱으로서 또는 이들을 동물 사료에 직접 혼합하거나 또는 사료와 별도로, 별도의 경구 제형으로, 주사 또는 경피로 또는 다른 성분과 조합하여 쉽게 투여할 수 있다. 통상적으로, 당 업계에 잘 알려진 바와 같이 단독 일일 투여량 또는 분할 일일 투여량을 사용할 수 있다.

상기 동물사료 첨가제용 솔잎 추출물을 동물 사료와 별도로 투여할 경우, 당 업계에 잘 알려진 바와 같이 추출물의 투여 형태는 이들을 비-독성 제약상 허용 가능한 식용 담체와 조합하여 즉석 방출 또는 서방성 제형으로 제조할 수 있다. 이러한 식용 담체는 고체 또는 액체, 예를 들어 옥수수 전분, 락토스, 수크로스, 콩 플레이크, 땅콩유, 올리브유, 참깨유 및 프로필렌 글리콜일 수 있다. 고체 담체가 사용될 경우, 추출물의 투여형은 정제, 캡슐제, 산제, 토로키제 또는 함당정제 또는 미분산성 형태의 탑 드레싱일 수 있다. 액체 담체가 사용될 경우, 연 젤라틴 캡슐제, 또는 시럽제 또는 액체 현탁액제, 에멀젼제 또는 용액제의 투여 형태일 수 있다. 또한, 투여 형태는 보조제, 예를 들어 보존제, 안정화제, 습윤제 또는 유화제, 용액 촉진제 등을 함유할 수 있다. 또한 이들은 바이러스로 인한 질환의 개선 및 예방상 유용한 다른 물질을 함유할 수 있다.

또한, 솔잎 추출물이 동물사료 첨가제로 포함되는 동물사료는 동물의 식이 요구를 충족시키는데 통상적으로 사용되는 임의의 단백질-함유 유기 곡분일 수 있다. 이러한 단백질-함유 곡분은 통상적으로 옥수수, 콩 곡분 또는 옥수수/콩 곡분 믹스로 주로 구성되어 있다.

상기의 동물사료 첨가제는 침지, 분무 또는 혼합하여 상기 동물사료에 첨가하여 이용될 수 있다.

본 발명은 포유류, 가금 및 어류를 포함하는 다수의 동물 식이에 적용할 수 있다. 보다 상세하게, 식이는 상업상 중요한 포유류, 예를 들어 돼지, 소, 양, 염소, 실험용 설치 동물 (랫트, 마우스, 햄스터 및 게르빌루스쥐), 모피 소유 동물 (예, 밍크 및 여우), 및 동물원 동물 (예, 원숭이 및 꼬리 없는 원숭이), 뿐만 아니라 가축 (예, 고양이 및 개)에게 사용할 수 있다. 통상적으로 상업상 중요한 가금에는 닭, 터키, 오리, 거위, 꿩 및 메추라기가 포함된다. 송어와 같은 상업적으로 사육되는 어류도 포함될 수 있다

본 발명에 따른 추출물을 포함한 동물용 사료 배합 방법은, 솔잎 추출물을 동물 사료에 건조 중량 기준으로 사료 1 ㎏당 약 1 g 내지 100 g의 양으로 혼입한다.

또한, 사료 혼합물은 완전히 혼합한 후, 성분들의 분쇄 정도에 따라 경점성의 조립 또는 과립 물질이 얻어진다. 이것을 매시로서 공급하거나, 또는 추가 가공 및 포장을 위해 원하는 분리된 형상으로 형성한다. 이 때, 저장 중에 분리되는 것을 방지하기 위해, 동물 사료에 물을 첨가하고, 이어서 통상의 펠릿화, 팽창화, 또 는 압출 공정을 거치는 것이 바람직하다. 과잉의 물은 건조 제거될 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 방법으로 수득된 솔잎 추출물을 유효성분으로 함유하는 살바이러스 소독용 조성물을 제공한다.

본 발명의 살바이러스 소독용 조성물은 제제에 따라 살바이러스에 첨가가 가능한 공지의 첨가물을 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 살바이러스 소독용 조성물은 액제 또는 정제로 제조가 가능하며, 액제의 경우 동물 관련 시설 및 동물에 직접 분사용 살바이러스 소독제로서 뿐만 아니라 방제용 약제로서 제공될 수 있으며, 타블렛의 경우 동물 관련 시설 또는 위생을 요하는 접객 업소 등에서 손 및 기구 등의 세척을 위한 살바이러스 소독제로서 제공될 수 있다.

본 발명의 조성물에 첨가 가능한 공지의 첨가제의 예를 들면 액상 배합의 경우 에탄올 또는 이소프로필 알콜이 있다. 특히 에탄올 또는 이소프로필 알콜은 자체적으로 소독력을 가지며 인체에 무해하며, 특히 상기 약리 작용을 가지는 천연 추출물의 균일한 분산을 목적으로 첨가될 수 있다. 이들 알콜의 유효첨가량으로는 1.0 중량% 내지 40.0 중량%, 바람직하게는 5.0 중량% 내지 30.0 중량%이다.

본 발명의 조성물 중 액상 배합의 경우 살바이러스 소독제를 용해 및 분산시킬 목적으로 바람직하게는 정제수를 사용한다. 정제수의 함량은 첨가되는 성분의 함량이 정해지고 난 이후의 잔여량으로 한다.

이하, 본 발명을 하기의 참고예, 실시예 및 실험예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 참고예, 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 참고예, 실시예 및 실험예에 의해 한정되는 것은 아니다.

참고예 1. 솔잎 분말 수득

국내 야산 (경기도 화성군)에서 자생하는 (1)적송 (Pinus denstifora Sieb. et Zucc.), (2)해송 (Pinus thunbergii parlatore) 및 (3)잣나무 (Pinus koraiensis Sieb. et Zucc.)에서 잎을 채취하여 물로 수세 후 표면의 물기를 제거하고 음건한 후 분쇄기 (ball mill, 정신기업사, 한국)로 미세하게 분쇄하여 건조 분말화 하였다.

참고예 2. RNA 바이러스 준비

RNA 바이러스로는 인플루엔자 A 바이러스 (Influencza A virus), 뉴캣슬병 바이러스 (Newcastle disease virus), 닭 전염성 기관지염 바이러스 (Infectious broncheitis virus), 조류독감 바이러스 (Avian pneumovirus), 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스 (Porcine reproductive and respiratory syndrome virus), 콕사키 바이러스 (Coxsakie virus: CXV), 세망내피증 바이러스 (reticuloendotheliosis virus)를 준비하였다.

2-1. 인플루엔자 A 바이러스 (Influencza A virus)

2-1-1. A/PR/8/34 (H1N1)

공시 바이러스인 인플루엔자 바이러스 A/PR/8/34 (H1N1)는 북해도대학에서 분양받았으며, in vitro 및 in vivo 실험을 위하여 10일령 SPF 종란에서 48시간 증식하여 -80 ℃에 보관하면서 사용하였다.

2-1-2. A/HS/K5/01 (H9N2-1), A/HS/MS96/96 (H9N2-2)

국내 분리주인 A/HS/K5/01는 건국대학교 수의과대학에서 조류인플루엔자 증상을 보이는 국내 계군에서 분리하였고, A/HS/MS96/96는 국립수의과학검역원에서 분양받았으며, in vitro 및 in vivo 실험을 위하여 10일령 SPF 종란에서 48시간 증식하여 -80 ℃에 보관하면서 사용하였다.

2-1-3. A/CSM/D2/05 (H6N5)

A/CSM/D2/05 (H6N5)는 천수만 지역에서 채취한 철새 분변시료를 통하여 건국대학교 수의과대학에서 자체 분리하였으며, in vitro 및 in vivo 실험을 위하여 10일령 SPF 종란에서 48시간 증식하여 -80 ℃에 보관하면서 사용하였다.

2-2. 뉴캣슬병 바이러스 (Newcastle disease virus: NDV)

국내 분리주인 Kr-005/00 및 교정원 주 (KJW strain)는 국립수의과학검역원에서 분양받았으며, in vitro 및 in vivo 실험을 위하여 10일령 SPF 종란에서 48시간 증식하여 -80 ℃에 보관하면서 사용하였다.

2-3. 전염성 기관지염 바이러스 (Infectious broncheitis virus: IBV)

M41주는 국립수의과학검역원에서 분양받았으며, in vitro 실험을 위하여 10일령 SPF 종란에서 48시간 증식하여 -80 ℃에 보관하면서 사용하였다.

2-4. 뉴모 바이러스 (Avian pneumovirus: APV)

뉴모 바이러스 A형 (APV A type) 생독백신인 Poulvac® SHS vaccine (Fort Dodge Animal Health, UK)를 사용하였다.

2-5. 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스 (Porcine reproductive and respiratory syndrome virus: PRRSV )

돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스 생독백신인 Ingelvac® PRRS의 모바이러스주 (ATCC VR-2332)를 국립수의과학검역원에서 분양받았으며 MARK-145 세포에서 증식하여 -80 ℃ 보관하면서 사용하였다.

2-6. 콕사키 바이러스 (Coxsakie virus: CXV)

콕사키 바이러스는 국립보건연구원에서 분양받았으며, Hep-2 세포에서 증식하여 -80 ℃ 보관하면서 사용하였다.

2-7. 세망내피증 바이러스 (reticuloendotheliosis virus: REV)

세망내피증 바이러스는 닭 합포체 바이러스 (chicken syncytial virus: CSV) 를 ATCC에서 분양받았으며, 계태아섬유아세포에서 증식하여 -80 ℃ 보관하면서 사용하였다.

참고예 3. DNA 바이러스 준비

DNA 바이러스로는 오제스키 바이러스 (aujeszky's disease virus), 아데노바이러스 (Adeno virus)를 준비하였다.

3-1. 오제스키 바이러스 (aujeszky's disease virus: ADV)

오제스키 바이러스는 국립수의과학검역원에서 분양받았으며, MDCK 세포에서 증식하여 -80 ℃ 보관하면서 사용하였다.

3-2. 아데노 바이러스 (Adeno virus :ADV)

아데노 바이러스는 국립보건연구원에서 분양받았으며, Hep-2 세포에서 증식하여 -80 ℃ 보관하면서 사용하였다.

참고예 4. 세포배양

4-1. MDCK (Madin Darby Canine Kidney) 세포

MDCK 세포는 American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA)에서 구입하였으며, 10 % 우태아혈청 (fetal bovine serum, Gibco, USA)을 첨가한 이글 엠 이엠 (Eagle's minimum essential medium: EMEM) 배지를 사용하여, 37℃ 및 5% CO₂ 배양조건에서 세포를 유지하였다. 항바이러스 효능 스크리닝 시에는 트립신 5 ㎍/㎖, 0.22 % 중조 (NaHCO₃), 겐타마이신 (gentamycin) 40 ㎍/㎖를 MEM 배지에 첨가하여 사용하였다.

4-2. Hep-2 세포

Hep-2 세포는 한국화학연구소에서 분양 받았으며 5% 우태아혈청 (fetal bovine serum, Gibco, USA)을 첨가한 엠이엠 (Minimum essential medium: MEM) 배지를 사용하여, 37℃ 및 5% CO₂ 배양조건에서 세포를 유지하였다.

4-3. 계태아 섬유아세포 (Chicken embryo fibroblast cell)

10일령 SPF 계태아 (chicken embryo)의 내부장기를 무균적으로 제거한 뒤 트립신으로 소화하여 10% TPB (Tryptose phosphate broth), 8% 송아지혈청 (Calf serum, Gibco, USA)이 함유된 M199 배지(5%) + HAM's F10배지(5%) (Gibco, USA)를 사용하여, 37℃ 및 5% CO₂ 배양조건에서 세포를 유지하였다.

4-4. MARK-145 세포

MARK-145 세포는 국립수의과학검역원에서 분양 받았으며 5% 우태아혈청 (fetal bovine serum, Gibco, USA)을 첨가한 엠이엠 (Minimum essential medium: MEM) 배지를 사용하여, 37℃ 및 5% CO₂ 배양조건에서 세포를 유지하였다.

참고예 5. 시험관내 바이러스 소독효능 시험 (Quantitative suspension test with viruses)

바이러스 소독효능 시험은 국립수의과학검역원 예규 제30호(2003.1.27) 소독제 효력시험 지침에 의거 수행되었다. 시료의 시험관내 살바이러스 효능 (Virucidal activity)을 시험하기 위하여 시료를 증류수로 100배 희석한 것을 기준으로 하여 1000배, 2000배, 4000배, 8000배, 16000배, 32000배 희석하였다. 4 ℃ 상태의 시료 희석액 2.5 ㎖이 들어있는 시험관에 1분 간격으로 준비된 바이러스액 2.5 ㎖을 시험관에 넣고 혼합한 다음 4 ℃에서 정확히 30분 동안 반응시키며 도중에 10분마다 잘 흔들어주었다. 대조군은 희석된 시료 대신 증류수를 사용하는 점만 다르게 실험하였다. 상기의 희석된 시료와 바이러스를 섞은 혼합액을 세포 배양용 배지를 사용하여 희석배수를 원액, 10^-1, 10^-2, 10^-3, 10^-4, 10^-5으로 하여 세포를 단층으로 배양한 96 웰 조직 배양 플레이트 (greiner사, 독일)에 8 웰(well)/희석배수로 적용하여 혼합액을 25 ㎕씩 접종한 후, 30분 흡착시킨 후 배지를 갈아주었다. 인플루엔자 바이러스 시험의 경우에는 세포변성효과(CPE, cytophatic effect)를 유발하기 위하여 5ug/ml 트립신(trypsin)이 함유된 배지로 갈아주었다. 접종 후 37 ℃의 CO₂ 배양기에서 4일 동안 배양하며, 매일 현미경으로 세포변성효과 여부를 관찰하고 최종적으로 접종 3-4일 후 CPE를 해석 (reading)하여 바이러스 존재 여부를 판단하였다. 사용된 바이러스에 따라 접종에 사용한 세포는 적절하게 치환되었으며, 세포에서 CPE를 나타내지 않는 바이러스 (H9N2 및 IBV)의 경우 희석배수별 시료와 각각의 바이러스 반응액을 10일령 SPF 종란에 0.2 ㎖ 씩 접종하여 접종 3일 후 혈구 응집반응 및 도트 면역분석법 (Dot immunoassay)를 통하여 바이러스의 존재 여부를 판단하였다(Song CS et al., Avian Diseases, 42(92), pp92-100, 1998). 바이러스 함유량 계산은 캐버 방법 (Karber method) 을 이용하여 산출하였다 (Payment P et al., Methods and Techniques in Virology, p33, 1993).

참고예 6. 플라크 억제효과 분석 (Plaque reduction assay)

MDCK 세포를 6-웰 조직배양용 플레이트에 6 X 10⁵ 세포수/웰의 농도로 넣고 배양하여 단층 (monolayer)이 형성되면 배지를 제거하고 400 pfu/㎖의 바이러스를 0.1 ㎖ 씩 접종한 뒤 1시간 동안 37℃, 5% CO₂ 배양기에서 바이러스를 흡착시켰다. 농도가 1000, 500, 250, 125, 62.5, 31.25 ㎍/㎖ 이 되도록 MEM 배지에 희석된 시료를 1% 아가로즈 (agarose)와 동량 희석하여 바이러스가 접종된 세포에 중층 (double-layer) 하였다. 아가로즈가 굳은 후 37℃, 5% CO₂ 조건에서 2-3일간 배양한 뒤 플라크의 수를 측정하였다.

참고예 7. 뉴트럴 레드 비색분석 (Neutral red colorimetric assay)

[Microtiter Neutral Red Assay for Antiviral or Cytotoxicity Activity: Neutral red colorimetric assay]

솔잎 종류별 추출물의 바이러스 증식억제 효과를 시험하기 위하여 상기 실험방법에서 제조한 60 % 솔잎 에탄올 추출물 및 분획을 최종농도가 1000, 320, 100, 32, 10, 3.2, 1, 0.1 ug/ml 되도록 증류수에 희석하여 실험하였다. 96 웰 조직 배양 플레이트 (greiner사, 독일)를 사용하여 한 플레이트 당 두 가지 분획의 유효농도와 세포독성을 세 반복 되게 측정할 수 있도록 하였다. 먼저 유효농도 측정법은 배양세포를 단층으로 배양한 96 웰 조직 배양 플레이트에 시험 할 분획의 희석농도를 3 웰(well)/희석농도로 적용하여 증식억제 시험용 바이러스를 100 TCID₅₀/100ul/well 로 접종한 후, 30분 흡착시킨 후 각 희석 배수별 분획을 100ul씩 첨가 하였다. 대조군은 희석된 솔잎 추출물 대신 증류수를 사용하는 점만 다르게 하여 양성 대조군과 음성 대조군을 모두 두었으며 96 웰 조직 플레이트의 정중앙 6개 웰 (well)은 증류수만 첨가하여 blank로 두었다. 접종 후 37 ℃의 CO₂ 배양기에서 3-4일 동안 배양하며, 매일 현미경으로 세포 변성 효과 (CPE, cytophatic effect) 여부를 관찰하고 접종 4일에 뉴트럴 레드분석(neutral red assay)을 실시하였다. 뉴트럴 레드분석은 세포가 있는 플레이트에 0.034% 의 뉴트럴 레드를 100ul/well 로 첨가 후 호일 등으로 빛을 차단하여 살아있는 세포가 염색액(neutral red)을 흡수할 수 있도록 37℃에서 2시간 동안 반응 후 세포를 PBS로 2회 세척한다. 세포를 완전히 건조시킨 후 100% 에탄올과 소렌슨 시트레이트 버퍼(Sorensen citrate buffer)가 동량 희석된 용액을 200ul/well 되도록 첨가하고 540nm의 파장으로 분광광도계(spectrophotometer, SUNRISE, Tecan, 오스트리아)에서 흡광도값 (Optical density value: OD value)을 측정하였다. 세포독성 측정법은 바이러스 접종 없이 희석농도별 분획만을 첨가하여 유효농도 측정법과 같은 플레이트 내에서 실험하였으며 이 후 실험법은 유효농도 측정법과 동일하게 진행하였다(Donald FS et al., Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 45(3), pp743-748, 2001).

실시예 1. 솔잎 극성용매 추출물의 제조

1-1. 솔잎 물추출물의 제조

상기에서 수득한 각 솔잎 분말 80 g을 증류수 800 ㎖에 현탁시킨 후 열수추출기에 넣고 90 ℃에서 4시간 동안 추출하여 여과한 후, 10,000×g에서 30분간 원심분리한 후 상층액을 취하여 동결건조기 (ModulyoD, ThermoSavant, USA)에 넣고 건조하여 적송잎 열수추출물 분말 5g, 해송잎 열수추출물 분말 6 g, 잣나무잎 열수추출물 분말 8 g을 수득하였으며, 4 ℃ 냉장고에 보관하면서 실험에 사용하였다.

1-2. 솔잎 에탄올 추출물의 제조

상기에서 수득한 각 솔잎 분말 80 g을 30 %, 60 % 및 100 % 에탄올 800 ㎖에 각각 현탁시킨 후 실온에서 18시간 환류추출하여 여과한 후, 10,000×g에서 30분간 원심분리하여 침전물을 제거하고 상층액을 취하여 감압하에서 증발건조 (Evaporate or, BUCHI, 스위스)시켜 에탄올 성분을 완전히 제거하였으며, 시료별로 각각 증류 수 200 ㎖을 적용한 후 동결건조기 (ModulyoD, ThermoSavant, USA)로 건조하여 적송잎 에탄올 추출물 분말 (30% 9 g, 60 % 20 g, 100 % 20 g), 해송잎 에탄올 추출물 분말 (30% 9 g, 60 % 21 g, 100 % 21 g), 잣나무잎 에탄올 추출물 분말 (30% 9 g, 60 % 22 g, 100 % 22 g)을 수득하여 4 ℃ 냉장고에 보관하면서 실험에 사용하였다.

1-3. 솔잎 메탄올 추출물의 제조

상기에서 수득한 각 솔잎 분말 80 g을 100 % 메탄올 800 ㎖에 각각 현탁시킨 후 실온에서 18시간 환류추출하여 여과한 후, 10,000×g에서 30분간 원심분리하여 침전물을 제거하고 상층액을 취하여 감압하에서 증발건조 (Evaporate or, BUCHI, 스위스)시켜 메탄올 성분을 완전히 제거하였으며, 시료별로 각각 증류수 200 ㎖을 적용한 후 동결건조기 (ModulyoD, ThermoSavant, USA)로 건조하여 적송잎 메탄올 추출물 분말 (20 g), 해송잎 메탄올 추출물 분말 (21 g), 잣나무잎 메탄올 추출물 분말 (22 g)을 수득하여 4 ℃ 냉장고에 보관하면서 실험에 사용하였다.

상기 실시예에서 준비된 솔잎 추출물의 회수율은 적송잎을 기준으로 하여 하기 표 1에 나타낸 바와 같이, 60% 및 100% 에탄올로 추출하였을 때 가장 회수율이 높았다.

용매	사용된 솔잎분말 (g)	추출 후 회수된 양 (g)	회수율 (%)
물	80	5	6.25
30% 에탄올	80	9	11.25
60% 에탄올	80	20	25
100% 에탄올	80	20	25
100% 메탄올	80	20	25

실시예 2. 솔잎 비극성용매 추출물의 제조

2-1. 디클로로메탄 가용추출물의 제조

상기에서 수득한 적송잎 분말 800 g을 60% 에탄올 8L에 현탁시킨 후 42℃에서 환류추출하여 여과한 후, 10,000ㅧg에서 30분간 원심분리하여 침전물을 제거하고 상층액을 취하여 감압하에서 증발건조 (Evaporate or, BUCHI, 스위스)시켜 제조한 적송잎 추출물을 다시 증류수 800 ml로 현탁한 것에 디클로로메탄 (CH₂Cl₂) 800 ml을 가하여 혼합한 후 분획하여 수가용성 분획층 800 ml 및 디클로로메탄 가용성 분획물 800 ml를 얻은 후, 이 디클로로메탄 가용성 분획물을 감압하에서 증발 건조하여 디클로로메탄 가용추출물 4.97 g을 수득하였다.

2-2. 솔잎 에틸아세테이트 가용추출물의 제조

상기 실시예 2에서 수득한 수가용성 분획층 800 ml에 에틸아세테이트 (EtOAc) 800 ml을 가하여 혼합한 후 분획하여 수가용성 분획층 800 ml 및 에틸아세테이트 가용성 분획물 800 ml를 얻은 후, 이 에틸아세테이트 가용성 분획물을 감압하에서 증발 건조하여 디클로로메탄 가용추출물 7.534 g을 수득하였다.

2-3. 솔잎 부탄올 가용추출물의 제조

상기 실시예 3에서 수득한 수가용성 분획층 800 ml에 부탄올 (n-BuOH) 800 ml을 가하여 혼합한 후 분획하여 수가용성 분획층 800 ml 및 부탄올 가용성 분획물 800 ml를 얻은 후, 이 부탄올 가용성 분획물 및 수가용성 분획물을 감압하에서 증발 건조하여 부탄올 가용추출물 17.23 g 및 수가용성 추출물 47.1g을 수득하였다.

실험예 1. 솔잎 종류별 추출물의 시험관내 살바이러스 효능 스크리닝

솔잎 종류별 추출물의 시험관내 살바이러스 효능을 시험하기 위하여 상기 실시예 1-2에서 제조한 60 % 솔잎 에탄올 추출물을 각각 증류수로 500배 희석하였다. 준비된 인플루엔자 H1N1 바이러스액 2.5 ㎖을 4 ℃ 상태의 동량의 상기 희석된 솔잎 추출물이 들어있는 시험관에 넣고 혼합한 다음 4 ℃에서 정확히 30분 동안 반응시키며 도중에 10분마다 잘 흔들어주었다. 대조군은 희석된 솔잎 추출물 대신 증류수를 사용하는 점만 다르게 실험하였다. 상기의 희석된 솔잎 추출물과 바이러스를 섞은 혼합액을 MDCK 세포 배양용 배지를 사용하여 희석배수를 원액, 10^-1, 10^-2, 10^-3, 10^-4, 10^-5, 10^-6으로 하여 MDCK를 단층으로 배양한 96 웰 조직 배양 플레이트 (greiner사, 독일)에 8개 웰(well)/희석배수로 적용하여 혼합액을 25 ㎕씩 접종한 후, 30분 흡착시킨 후 배지를 갈아주었다. 접종 후 37 ℃의 CO₂ 배양기에서 3-4일 동안 배양하며, 매일 현미경으로 세포 변성 효과 (CPE, cytophatic effect) 여부를 관찰하였으며, 최종적으로 관찰한 CPE의 정도 여부로 바이러스 존재 여부를 판단하였다. 참고예 4에 준하여 사용된 바이러스에 따라 사용한 세포를 바꿔주었으며 세포에서 CPE를 나타내지 않는 바이러스 (H9N2 인플루엔자 바이러스 및 Infectious broncheitis 바이러스)의 경우에는 희석배수별 솔잎 추출물과 각각의 바이러스 반응액을 10일령 SPF 종란에 0.2ml 씩 접종하여 접종 3일 후 혈구 응집반응 및 도트 면역분석 (Dot immunoassay)를 통하여 바이러스의 존재 여부를 판단하였다. 바이러스 함유량 계산은 캐버 방법 (Kㅴrber method)을 이용하여 하기 표 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8에 나타내었다 (Payment P et al., Methods and Techniques in Virology, p33, 1993).

구분	시험관내 살바이러스 효능
	완전감소	104 감소	102 감소
적송잎 추출물	500배 희석 (500 ㎍/㎖)	500배 희석 (500 ㎍/㎖)	500배 희석 (500 ㎍/㎖)
해송잎 추출물	500배 희석 (500 ㎍/㎖)	500배 희석 (500 ㎍/㎖)	500배 희석 (500 ㎍/㎖)
잣나무잎 추출물	500배 희석 (500 ㎍/㎖)	500배 희석 (500 ㎍/㎖)	500배 희석 (500 ㎍/㎖)
* 처리 바이러스: Influenza virus H1N1 (105.6 TCID50/㎖) * 처리 추출물 및 처리조건: 60 % 에탄올 추출물, 4 ℃, 30분

상기 표 2에 나타낸 바와 같이, 500배 희석 (500 ㎍/㎖)된 적송잎, 해송잎, 잣나무잎 추출물 각각에 바이러스를 2시간 반응시킨 결과 10^5.6 TCID₅₀/㎖ 의 인플루엔자 바이러스 H1N1이 10², 10⁴ 및 완전 감소되었으며, 이는 국내 자생 소나무인 적송, 해송 및 잣나무 유래 솔잎 추출물이 모두 시험관내 살바이러스 효능이 있음을 나타낸다.

구분	시험관내 살바이러스 효능
	완전감소	104 감소	102 감소
적송잎 추출물	500배 희석 (500 ㎍/㎖)	500배 희석 (500 ㎍/㎖)	500배 희석 (500 ㎍/㎖)
해송잎 추출물	500배 희석 (500 ㎍/㎖)	500배 희석 (500 ㎍/㎖)	500배 희석 (500 ㎍/㎖)
잣나무잎 추출물	500배 희석 (500 ㎍/㎖)	500배 희석 (500 ㎍/㎖)	500배 희석 (500 ㎍/㎖)
* 처리 바이러스: Newcastle disease virus (105.6 TCID50/㎖) * 처리 추출물 및 처리조건: 60 % 에탄올 추출물, 4 ℃, 30분

상기 표 3에 나타낸 바와 같이, 500배 희석 (500 ㎍/㎖)된 적송잎, 해송잎, 잣나무잎 추출물 각각에 바이러스를 2시간 반응시킨 결과 10^5.6 TCID₅₀/㎖ 의 뉴캣슬병 바이러스가 10², 10⁴ 및 완전 감소되었으며, 이는 국내 자생 소나무인 적송, 해송 및 잣나무 유래 솔잎 추출물이 모두 시험관내 살바이러스 효능이 있음을 나타낸다.

구분	시험관내 살바이러스 효능
	완전감소	104 감소	102 감소
적송잎 추출물	500배 희석 (500 ㎍/㎖)	500배 희석 (500 ㎍/㎖)	500배 희석 (500 ㎍/㎖)
해송잎 추출물	500배 희석 (500 ㎍/㎖)	500배 희석 (500 ㎍/㎖)	500배 희석 (500 ㎍/㎖)
잣나무잎 추출물	500배 희석 (500 ㎍/㎖)	500배 희석 (500 ㎍/㎖)	500배 희석 (500 ㎍/㎖)
* 처리 바이러스: Infectious bronchitis virus (105.6 TCID50/㎖) * 처리 추출물 및 처리조건: 60 % 에탄올 추출물, 4 ℃, 30분

상기 표 4에 나타낸 바와 같이, 500배 희석 (500 ㎍/㎖)된 적송잎, 해송잎, 잣나무잎 추출물 각각에 바이러스를 2시간 반응시킨 결과 10^5.6 TCID₅₀/㎖ 의 닭전염성기관지염 바이러스가 10², 10⁴ 및 완전 감소되었으며, 이는 국내 자생 소나무인 적송, 해송 및 잣나무 유래 솔잎 추출물이 모두 시험관내 살바이러스 효능이 있음을 나타낸다.

구분	시험관내 살바이러스 효능
	완전감소	104 감소	102 감소
적송잎 추출물	500배 희석 (500 ㎍/㎖)	500배 희석 (500 ㎍/㎖)	500배 희석 (500 ㎍/㎖)
해송잎 추출물	500배 희석 (500 ㎍/㎖)	500배 희석 (500 ㎍/㎖)	500배 희석 (500 ㎍/㎖)
잣나무잎 추출물	500배 희석 (500 ㎍/㎖)	500배 희석 (500 ㎍/㎖)	500배 희석 (500 ㎍/㎖)
* 처리 바이러스: Avian pneumovirus (105.6 TCID50/㎖) * 처리 추출물 및 처리조건: 60 % 에탄올 추출물, 4 ℃, 30분

상기 표 5에 나타낸 바와 같이, 500배 희석 (500 ㎍/㎖)된 적송잎, 해송잎, 잣나무잎 추출물 각각에 바이러스를 2시간 반응시킨 결과 10^5.6 TCID₅₀/㎖ 의 뉴모바이러스가 10², 10⁴ 및 완전 감소되었으며, 이는 국내 자생 소나무인 적송, 해송 및 잣나무 유래 솔잎 추출물이 모두 시험관내 살바이러스 효능이 있음을 나타낸다.

구분	시험관내 살바이러스 효능
	완전감소	104 감소	102 감소
적송잎 추출물	500배 희석 (500 ㎍/㎖)	500배 희석 (500 ㎍/㎖)	500배 희석 (500 ㎍/㎖)
해송잎 추출물	500배 희석 (500 ㎍/㎖)	500배 희석 (500 ㎍/㎖)	500배 희석 (500 ㎍/㎖)
잣나무잎 추출물	500배 희석 (500 ㎍/㎖)	500배 희석 (500 ㎍/㎖)	500배 희석 (500 ㎍/㎖)
* 처리 바이러스: PRRS virus (105.6 TCID50/㎖) * 처리 추출물 및 처리조건: 60 % 에탄올 추출물, 4 ℃, 30분

상기 표 6에 나타낸 바와 같이, 500배 희석 (500 ㎍/㎖)된 적송잎, 해송잎, 잣나무잎 추출물 각각에 바이러스를 2시간 반응시킨 결과 10^5.6 TCID₅₀/㎖ 의 돼지생식기호흡기증후군 바이러스가 10², 10⁴ 및 완전 감소되었으며, 이는 국내 자생 소나무인 적송, 해송 및 잣나무 유래 솔잎 추출물이 모두 시험관내 살바이러스 효능이 있음을 나타낸다.

구분	시험관내 살바이러스 효능
	완전감소	104 감소	102 감소
적송잎 추출물	500배 희석 (500 ㎍/㎖)	500배 희석 (500 ㎍/㎖)	500배 희석 (500 ㎍/㎖)
해송잎 추출물	500배 희석 (500 ㎍/㎖)	500배 희석 (500 ㎍/㎖)	500배 희석 (500 ㎍/㎖)
잣나무잎 추출물	500배 희석 (500 ㎍/㎖)	500배 희석 (500 ㎍/㎖)	500배 희석 (500 ㎍/㎖)
* 처리 바이러스: Coxsakie virus (105.6 TCID50/㎖) * 처리 추출물 및 처리조건: 60 % 에탄올 추출물, 4 ℃, 30분

상기 표 7에 나타낸 바와 같이, 500배 희석 (500 ㎍/㎖)된 적송잎, 해송잎, 잣나무잎 추출물 각각에 바이러스를 2시간 반응시킨 결과 10^5.6 TCID₅₀/㎖ 의 콕사키 바이러스가 10², 10⁴ 및 완전 감소되었으며, 이는 국내 자생 소나무인 적송, 해송 및 잣나무 유래 솔잎 추출물이 모두 시험관내 살바이러스 효능이 있음을 나타낸다.

구분	시험관내 살바이러스 효능
	완전감소	104 감소	102 감소
적송잎 추출물	500배 희석 (500 ㎍/㎖)	500배 희석 (500 ㎍/㎖)	500배 희석 (500 ㎍/㎖)
해송잎 추출물	500배 희석 (500 ㎍/㎖)	500배 희석 (500 ㎍/㎖)	500배 희석 (500 ㎍/㎖)
잣나무잎 추출물	500배 희석 (500 ㎍/㎖)	500배 희석 (500 ㎍/㎖)	500배 희석 (500 ㎍/㎖)
* 처리 바이러스: Reticuloendotheliosis virus (105.6 TCID50/㎖) * 처리 추출물 및 처리조건: 60 % 에탄올 추출물, 4 ℃, 30분

상기 표 8에 나타낸 바와 같이, 500배 희석 (500 ㎍/㎖)된 적송잎, 해송잎, 잣나무잎 추출물 각각에 바이러스를 2시간 반응시킨 결과 10^5.6 TCID₅₀/㎖ 의 세망내피증 바이러스가 10², 10⁴ 및 완전 감소되었으며, 이는 국내 자생 소나무인 적송, 해송 및 잣나무 유래 솔잎 추출물이 모두 시험관내 살바이러스 효능이 있음을 나타낸다.

구분	시험관내 살바이러스 효능
	완전감소	104 감소	102 감소
적송잎 추출물	500배 희석 (500 ㎍/㎖)	500배 희석 (500 ㎍/㎖)	500배 희석 (500 ㎍/㎖)
해송잎 추출물	500배 희석 (500 ㎍/㎖)	500배 희석 (500 ㎍/㎖)	500배 희석 (500 ㎍/㎖)
잣나무잎 추출물	500배 희석 (500 ㎍/㎖)	500배 희석 (500 ㎍/㎖)	500배 희석 (500 ㎍/㎖)
* 처리 바이러스: Aujeszky's disease virus (105.6 TCID50/㎖) * 처리 추출물 및 처리조건: 60 % 에탄올 추출물, 4 ℃, 30분

상기 표 9에 나타낸 바와 같이, 500배 희석 (500 ㎍/㎖)된 적송잎, 해송잎, 잣나무잎 추출물 각각에 바이러스를 2시간 반응시킨 결과 10^5.6 TCID₅₀/㎖ 의 오제스키 바이러스가 10², 10⁴ 및 완전 감소되었으며, 이는 국내 자생 소나무인 적송, 해송 및 잣나무 유래 솔잎 추출물이 모두 시험관내 살바이러스 효능이 있음을 나타낸다.

구분	시험관내 살바이러스 효능
	완전감소	104 감소	102 감소
적송잎 추출물	500배 희석 (500 ㎍/㎖)	500배 희석 (500 ㎍/㎖)	500배 희석 (500 ㎍/㎖)
해송잎 추출물	500배 희석 (500 ㎍/㎖)	500배 희석 (500 ㎍/㎖)	500배 희석 (500 ㎍/㎖)
잣나무잎 추출물	500배 희석 (500 ㎍/㎖)	500배 희석 (500 ㎍/㎖)	500배 희석 (500 ㎍/㎖)
* 처리 바이러스: Adeno virus (105.6 TCID50/㎖) * 처리 추출물 및 처리조건: 60 % 에탄올 추출물, 4 ℃, 30분

상기 표 10에 나타낸 바와 같이, 500배 희석 (500 ㎍/㎖)된 적송잎, 해송잎, 잣나무잎 추출물 각각에 바이러스를 2시간 반응시킨 결과 10^5.6 TCID₅₀/㎖ 의 아데노 바이러스가 10², 10⁴ 및 완전 감소되었으며, 이는 국내 자생 소나무인 적송, 해송 및 잣나무 유래 솔잎 추출물이 모두 시험관내 살바이러스 효능이 있음을 나타낸다.

실험예 2. 추출방법별 솔잎 추출물의 시험관 내 살바이러스 효능 측정

추출방법별 솔잎 추출물의 시험관내 살바이러스 효능을 시험하기 위하여 상기 실시예 1에서 제조한 적송잎 열수, 30 %, 60 % 및 100 % 에탄올 추출물을 증류수로 100배 희석한 것을 기준으로 하여 1000배, 2000배, 4000배, 8000배, 16000배, 32000배 희석하여 참고예 4의 방법에 의해 바이러스 증식억제 효과를 측정하였다. 각각의 4 ℃ 상태의 솔잎 추출물 희석액 2.5 ㎖가 들어있는 시험관에 1분 간격으로 준비된 바이러스액 2.5 ㎖를 시험관에 넣고 혼합한 다음 4 ℃에서 정확히 30분 동안 반응시키며 도중에 10분마다 잘 흔들어주었다. 대조군은 희석된 솔잎 추출물 대신 증류수를 사용하는 점만 다르게 실험하였다. 상기의 희석된 솔잎 추출물과 바이러스를 섞은 혼합액을 MDCK 세포 배양용 배지를 사용하여 희석배수를 원액, 10^-1, 10^-2, 10^-3, 10^-4, 10^-5, 10^-6으로 하여 MDCK를 단층으로 배양한 96-웰 조직 배양 플레이트 (96 well tissue culture plate)에 8 웰(well)/희석배수로 적용하여 혼합액을 25 ㎕씩 접종한 후, 30분 흡착시킨 후 배지를 갈아주었다. 인플루엔자 바이러스 시험의 경우에는 세포변성효과(CPE, cytophatic effect)를 유발하기 위하여 5ug/ml 트립신(trypsin)이 함유된 배지로 갈아주었다. 접종 후 37 ℃의 CO₂ 배양기에서 4일동안 배양하며, 매일 현미경으로 세포 변성 효과 (CPE, cytophatic effect) 여부를 관찰하고 최종적으로 접종 3-4일 후 CPE를 해석 (reading)하여 바이러스 존재 여부를 판단하였다. 사용된 바이러스에 따라 접종에 사용한 세포는 적절하게 치환되었으며, 세포에서 CPE를 나타내지 않는 바이러스 (H9N2 및 IBV)의 경우 희석배수별 시료와 각각의 바이러스 반응액을 10일령 SPF 종란에 0.2 ㎖ 씩 접종하여 접종 3일 후 혈구 응집반응 및 도트 면역분석법 (Dot immunoassay)를 통하여 바이러스의 존재 여부를 판단하였다(Song CS et al., Avian Diseases, 42(92), pp92-100, 1998) . 바이러스 함유량 계산은 캐버 방법 (Karber method) 을 이용하여 산출하였다 (Payment P et al., Methods and Techniques in Virology, p33, 1993).

구분	시험관내 살바이러스 효능
	완전감소				102 감소
추출 용매별 추출물	100 % 에탄올 추출물	60 % 에탄올 추출물	30 % 에탄올 추출물	열수 추출물	100 % 에탄올 추출물	60 % 에탄올 추출물	30 % 에탄올 추출물	열수 추출물
추출물 처리 농도	2000배 희석 (500 ㎍)	16000배 희석 (62.5 ㎍)	4000배 희석 (250 ㎍)	1000배 희석 (1 ㎎)	8000배 희석 (125 ㎍)	32000배 희석 (31.25 ㎍)	16000배 희석 (62.5 ㎍)	2000배 희석 (500 ㎍)
* 처리 바이러스: Influenza virus H1N1 (105.6 TCID50/㎖) * 처리조건: 4 ℃, 30분

상기 표 11에 나타낸 바와 같이, 2000배 희석된 솔잎 100 % 에탄올추출물 (500 ㎍), 16000배 희석된 60 % 에탄올추출물 (62.5 ㎍), 4000배 희석된 솔잎 30 % 에탄올 추출물 (250 ㎍) 및 1000배 희석된 솔잎 물추출물 (1 ㎎)에 바이러스를 30분 반응시킨 결과 10^5.6 TCID₅₀/㎖ 의 인플루엔자 바이러스 A/H1N1이 완전 감소되었으며, 8000배 희석된 솔잎 100 % 에탄올추출물 (125㎍), 32000배 희석된 60 % 에탄올추출물 (31.25 ㎍), 16000배 희석된 솔잎 30 % 에탄올 추출물 (62.5 ㎍) 및 2000배 희석된 솔잎 물추출물 (500 ㎍)에 바이러스를 30분 반응시킨 결과 10^5.6 TCID₅₀/㎖ 의 인플루엔자 바이러스 A/H1N1이 10² 감소되었다. 상기 실험 결과 60 % 에탄올 추출물의 살바이러스 효능이 가장 탁월하였다.

솔잎은 60% 에탄올 추출법 적용시 인플루엔자 바이러스에 대한 살바이러스 효능이 가장 탁월하게 조사되어 뉴캣슬병 바이러스, 닭전염성기관지염 바이러스, 뉴모바이러스 바이러스, 돼지생식기호흡기증후군 바이러스, 콕사키바이러스, 세망내피증 바이러스, 오제스키 바이러스, 아데노바이러스 등에 대한 살바이러스 효능시험에도 60% 에탈올 추출법으로 추출된 솔잎 추출물을 사용하였다.

실험예 3. 솔잎 추출물의 시험관 내 살바이러스 효능 스크리닝

3-1. RNA 바이러스

3-1-1. MDCK 세포에서의 시험관내 살 A/PR/8/34 (H1N1) 인플루엔자 바이러스 효능

MDCK 세포에서의 시험관 내 살 A/PR/8/34 (H1N1) 인플루엔자 바이러스 효능을 측정하기 위해 적송잎 60 % 에탄올 추출물을 증류수로 100배 희석한 것을 기준으로 하여 1000배, 2000배, 4000배, 8000배, 16000배, 32000배 희석하여 참고예 4의 방법에 의해 시험관내 살바이러스 효능을 측정하여 하기 표 4에 그 결과를 나타내었다.

또한, 참고예 5의 플라크 감소 분석법을 이용하여 A/PR/8/34 (H1N1) 인플루엔자 바이러스에 대한 세포내 바이러스 증식억제 효능을 측정하여 하기 도 1에 그 결과를 나타내었다.

구분	시험관내 살바이러스 효능
60% 에탄올 솔잎 추출물 처리농도	완전감소	102 감소
	16000배 희석 (62.5㎍)	32000배 희석 (31.25㎍)
* 처리 바이러스: Influenza virus H1N1 (105.6 TCID50/㎖) * 처리조건: 4 ℃, 30분

상기 표 12에 나타낸 바와 같이, 16000배 희석된 솔잎 60 % 에탄올추출물 (62.5 ㎍)에 바이러스를 30분 반응시킨 결과 10^5.6 TCID₅₀/㎖ 의 인플루엔자 바이러스 A/PR/8/34 (H1N1)이 완전 감소되었으며, 32000배 희석된 솔잎 60 % 에탄올 추출물 (31.25 ㎍)에 바이러스를 30분 반응시킨 결과 10^5.6 TCID₅₀/㎖ 의 인플루엔자 바이러스 A/PR/8/34 (H1N1)이 10² 감소되었다.

또한, 도 1에 나타낸 바와 같이, 플라크 감소 분석 결과 본 발명의 솔잎 추출물의 바이러스를 50% 억제하는 유효농도 (50% Inhibitory concentration : IC₅₀)가 31.25 ㎍으로 상기 관 실험의 결과와 일치하는 경향을 나타내었다.

상기 실험 결과 솔잎 60 % 에탄올 추출물은 A/PR/8/34 (H1N1) 인플루엔자 바이러스에 대한 시험관내 살바이러스 효능 (Virucidal activity)와 세포내 바이러스

3-1-2. SPF 종란에서의 시험관내 살 A/HS/ MS96 /96 ( H9N2 ) 인플루엔자 바이러스 효능

SPF 종란에서의 시험관 내 살 A/HS/MS96/96 (H9N2) 인플루엔자 바이러스 효능을 측정하기 위해 적송잎 60 % 에탄올 추출물을 증류수로 100배 희석한 것을 기준으로 하여 1000배, 2000배, 4000배, 8000배, 16000배, 32000배 희석하여 참고예 4의 방법에 의해 시험관내 살바이러스 효능을 측정하여 하기 표 13에 그 결과를 나타내었다.

구분	시험관내 살바이러스 효능
60% 에탄올 솔잎 추출물 처리농도	완전감소	102 감소
	16000배 희석 (62.5㎍)	32000배 희석 (31.25㎍)
* 처리 바이러스: Avian Influenza virus H9N2 (105.6 TCID50/㎖) * 처리조건: 4 ℃, 30분

상기 표 13에 나타낸 바와 같이, 16000배 희석된 솔잎 60 % 에탄올추출물 (62.5 ㎍)에 바이러스를 30분 반응시킨 결과 10^5.6 EID₅₀/㎖ 의 조류 인플루엔자 바이러스 A/HS/MS96/96 (H9N2)이 완전 감소되었으며, 32000배 희석된 솔잎 60 % 에탄올추출물 (31.25 ㎍)에 바이러스를 30분 반응시킨 결과 10^5.6 EID₅₀/㎖ 의 인플루엔자 바이러스 A/HS/MS96/96 (H9N2)이 10² 감소되었다. 상기 실험 결과 솔잎 60 % 에탄올 추출물은 A/HS/MS96/96 (H9N2) 인플루엔자 바이러스에 대한 시험관내 살바이러스 효능이 탁월하였다.

3-1-3. 계태아 섬유아세포에서의 시험관내 살 뉴캣슬병 바이러스 효능

계태아 섬유아세포에서의 시험관 내 살 뉴캣슬병 바이러스 (NDV) 효능을 측정하기 위해 적송잎 60 % 에탄올 추출물을 증류수로 100배 희석한 것을 기준으로 하여 1000배, 2000배, 4000배, 8000배, 16000배, 32000배 희석하여 참고예 4의 방법에 의해 NDV의 한 종류인 교정원 주 (KJW strain)를 이용한 시험관내 살바이러스 효능을 측정하여 하기 표 14에 그 결과를 나타내었다.

구분	시험관내 살바이러스 효능
60% 에탄올 솔잎 추출물 처리농도	완전감소	102 감소
	4000배 희석 (250㎍)	8000배 희석 (125㎍)
* 처리 바이러스: Newcastle disease virus KJW strain (105.6 TCID50/㎖) * 처리조건: 4 ℃, 30분

상기 표 14에 나타낸 바와 같이, 4000배 희석된 솔잎 60 % 에탄올추출물 (250 ㎍)에 바이러스를 30분 반응시킨 결과 10^5.6 TCID₅₀/㎖ 의 뉴캣슬병 바이러스 교정원 주가 완전 감소되었으며, 8000배 희석된 솔잎 60 % 에탄올추출물 (125 ㎍)에 바이러스를 30분 반응시킨 결과 10^5.6 TCID₅₀/㎖ 의 뉴캣슬병 바이러스 교정원 주가 10² 감소되었다. 상기 실험 결과 솔잎 60 % 에탄올 추출물은 뉴캣슬병 바이러스에 대한 시험관내 살바이러스 효능이 탁월하였다.

3-1-4. SPF 종란에서의 시험관내 살 닭 전염성 기관지염 바이러스 효능

SPF 종란에서의 시험관 내 살 전염성 기관지염 바이러스 (IBV) 효능을 측정하기 위해 적송잎 60 % 에탄올 추출물을 증류수로 100배 희석한 것을 기준으로 하여 1000배, 2000배, 4000배, 8000배, 16000배, 32000배 희석하여 참고예 4의 방법에 의해 시험관내 살바이러스 효능을 측정하여 하기 표 15에 그 결과를 나타내었다.

구분	시험관내 살바이러스 효능
60% 에탄올 솔잎 추출물 처리농도	완전감소	102 감소
	4000배 희석 (250㎍)	-
* 처리 바이러스: IBV M41 strain (105.6 TCID50/㎖) * 처리조건: 4 ℃, 30분

상기 표 15에 나타낸 바와 같이, 4000배 희석된 솔잎 60 % 에탄올추출물 (250 ㎍)에 바이러스를 30분 반응시킨 결과 10^5.6 EID₅₀/㎖의 전염성 기관지염 바이러스 M41 주가 완전 감소되었다. 상기 실험 결과 솔잎 60 % 에탄올 추출물은 전염성 기관지염 바이러스에 대한 시험관내 살바이러스 효능이 탁월하였다.

3-1-5. 계태아 섬유아세포에서의 시험관내 살 조류 뉴모바이러스 효능

계태아 섬유아세포에서의 시험관 내 살 조류 뉴모바이러스 (APV) 효능을 측정하기 위해 60 % 에탄올 적송잎 추출물을 증류수로 100배 희석한 것을 기준으로 하여 1000배, 2000배, 4000배, 8000배, 16000배, 32000배 희석하여 참고예 4의 방법에 의해 시험관내 살바이러스 효능을 측정하여 하기 표 16에 그 결과를 나타내었다.

구분	시험관내 살바이러스 효능
60% 에탄올 솔잎 추출물 처리농도	완전감소	102 감소
	500배 희석 (2㎎)	2000배 희석 (500㎍)
* 처리 바이러스: Avian pneumovirus (105.6 TCID50/㎖) * 처리조건: 4 ℃, 30분

상기 표 16에 나타낸 바와 같이, 500배 희석된 솔잎 60 % 에탄올추출물 (2 ㎎)에 바이러스를 30분 반응시킨 결과 10^5.6 EID₅₀/㎖의 조류 뉴모 바이러스가 완전 감소되었으며, 2000배 희석된 솔잎 60 % 에탄올추출물 (500 ㎍)에 바이러스를 30분 반응시킨 결과 10^5.6 TCID₅₀/㎖ 의 조류 뉴모 바이러스가 10² 감소되었다. 상기 실험 결과 솔잎 60 % 에탄올 추출물은 조류 뉴모 바이러스에 대한 시험관내 살바이러스 효능이 탁월하였다.

3-1-6. MARK-145 세포에서의 항 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스 효능

MARK-145 세포에서의 항 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스 (PRRSV) 효능을 측정하기 위해 적송잎 60 % 에탄올 추출물을 증류수로 100배 희석한 것을 기준으로 하여 1000배, 2000배, 4000배, 8000배, 16000배, 32000배 희석하여 참고예 6의 방법에 의한 NR 분석을 이용하여 바이러스 증식억제 효과를 측정하여 하기 도 2에 그 결과를 나타내었다.

도 2에 나타난 바와 같이, 솔잎 60% 에탄올 추출물의 PRRSV에 대한 EC₅₀ (바이러스를 50% 억제하는 유효농도: 50% Effective concentration)은 121.25 ㎍이었다. 상기 실험 결과 솔잎 60 % 에탄올 추출물은 PRRSV에 대한 세포내 항바이러스 효능이 탁월하였다.

3-1-7. Hep-2 세포에서의 시험관내 살 콕사키 바이러스 효능

Hep-2 세포에서의 시험관 내 살 콕사키 바이러스 (CXV) 효능을 측정하기 위해 60 % 에탄올 적송잎 추출물을 증류수로 100배 희석한 것을 기준으로 하여 1000배, 2000배, 4000배, 8000배, 16000배, 32000배 희석하여 참고예 4의 방법에 의해 시험관내 살바이러스 효능을 측정하여 하기 표 17에 그 결과를 나타내었다.

구분	시험관내 살바이러스 효능
60% 에탄올 솔잎 추출물 처리농도	완전감소	102 감소
	500배 희석 (2㎎/㎖)	2000배 희석 (500㎍/㎖)
* 처리 바이러스: Coxsakie virus (105.6 TCID50/㎖) * 처리조건: 4 ℃, 30분

상기 표 17에 나타낸 바와 같이, 500배 희석된 솔잎 60 % 에탄올추출물 (2 ㎎)에 바이러스를 30분 반응시킨 결과 10^5.6 TCID₅₀/㎖의 CXV가 완전 감소되었으며, 2000배 희석된 솔잎 60 % 에탄올추출물 (500 ㎍)에 바이러스를 30분 반응시킨 결과 10^5.6 TCID₅₀/㎖의 CSV가 10² 감소되었다. 상기 실험 결과 솔잎 60 % 에탄올 추출물은 CXV에 대한 시험관내 살바이러스 효능이 탁월하였다.

3-1-8. 계태아섬유아 세포에서의 시험관내 살 세망내피증 바이러스 효능

Hep-2 세포에서의 시험관 내 살 세망내피증 바이러스 (REV) 효능을 측정하기 위해 60 % 에탄올 적송잎 추출물을 증류수로 100배 희석한 것을 기준으로 하여 1000배, 2000배, 4000배, 8000배, 16000배, 32000배 희석하여 참고예 4의 방법에 의해 시험관내 살바이러스 효능을 측정하여 하기 표 18에 그 결과를 나타내었다.

구분	시험관내 살바이러스 효능
60% 에탄올 솔잎 추출물 처리농도	완전감소	102 감소
	4000배 희석 (250㎍/㎖)	8000배 희석 (125㎍/㎖)
* 처리 바이러스: Reticuloendotheliosis virus (105.6 TCID50/㎖) * 처리조건: 4 ℃, 30분

상기 표 18에 나타낸 바와 같이, 4000배 희석된 솔잎 60 % 에탄올추출물 (250㎍)에 바이러스를 30분 반응시킨 결과 10^5.6 TCID₅₀/㎖의 REV가 완전 감소되었으며, 8000배 희석된 솔잎 60 % 에탄올추출물 (125 ㎍)에 REV 바이러스를 30분 반응시킨 결과 10^5.6 TCID₅₀/㎖의 REV가 10² 감소되었다. 상기 실험 결과 솔잎 60 % 에탄올 추출물은 REV에 대한 시험관내 살바이러스 효능이 탁월하였다.

3-2. DNA 바이러스

3-2-1. MDCK 세포에서의 시험관내 살 오제스키 바이러스 효능

Hep-2 세포에서의 시험관 내 살 오제스키 바이러스 (ADV) 효능을 측정하기 위해 60 % 에탄올 적송잎 추출물을 증류수로 100배 희석한 것을 기준으로 하여 1000배, 2000배, 4000배, 8000배, 16000배, 32000배 희석하여 참고예 4의 방법에 의해 시험관내 살바이러스 효능을 측정하여 하기 표 19에 그 결과를 나타내었다.

구분	시험관내 살바이러스 효능
60% 에탄올 솔잎 추출물 처리농도	완전감소	102 감소
	4000배 희석 (250㎍/㎖)	8000배 희석 (125㎍/㎖)
* 처리 바이러스: Aujeszky's disease virus (105.6 TCID50/㎖) * 처리조건: 4 ℃, 30분

상기 표 19에 나타낸 바와 같이, 4000배 희석된 솔잎 60 % 에탄올추출물 (250㎍)에 바이러스를 30분 반응시킨 결과 10^5.6 TCID₅₀/㎖의 ADV가 완전 감소되었으며, 8000배 희석된 솔잎 60 % 에탄올추출물 (125 ㎍)에 ADV 바이러스를 30분 반응시킨 결과 10^5.6 TCID₅₀/㎖의 REV가 10² 감소되었다. 상기 실험 결과 솔잎 60 % 에탄올 추출물은 ADV에 대한 시험관내 살바이러스 효능이 탁월하였다.

3-2-2. Hep-2 세포에서의 시험관내 살 아데노 바이러스 효능

Hep-2 세포에서의 시험관 내 살 아데노 바이러스 (ADV) 효능을 측정하기 위해 60 % 에탄올 적송잎 추출물을 증류수로 100배 희석한 것을 기준으로 하여 1000배, 2000배, 4000배, 8000배, 16000배, 32000배 희석하여 참고예 4의 방법에 의해 시험관내 살바이러스 효능을 측정하여 하기 표 20에 그 결과를 나타내었다.

구분	시험관내 살바이러스 효능
60% 에탄올 솔잎 추출물 처리농도	완전감소	102 감소
	100배 희석 (10㎎/㎖)	-
* 처리 바이러스: Adeno virus (105.6 TCID50/㎖) * 처리조건: 4 ℃, 30분

상기 표 20에 나타낸 바와 같이, 100배 희석된 솔잎 60 % 에탄올추출물 (10㎎/㎖)에 바이러스를 30분 반응시킨 결과 10^5.6 TCID₅₀/㎖의 아데노 바이러스가 완전 감소되었다.

실험예 4. 솔잎 비극성용매 가용 추출물의 시험관 내 살바이러스 효능 측정

4-1. MDCK 세포에서의 시험관내 살 A/PR/8/34 (H1N1) 인플루엔자 바이러스 효능

MDCK 세포에서의 시험관내 살 인플루엔자 바이러스 효능을 측정하기 위해 상기 실시예 2의 솔잎 비극성용매 가용 추출물들을 증류수로 100배 희석한 것을 기준으로 하여 1000배, 2000배, 4000배, 8000배, 16000배, 32000배 희석하여 참고예 4의 방법에 의해 시험관내 살바이러스 효능을 측정하여 하기 표 21에 그 결과를 나타내었다.

또한, 참고예 5의 플라크 감소 분석법을 이용하여 A/PR/8/34 (H1N1) 인플루엔자 바이러스에 대한 솔잎 비극성용매 가용 추출물들의 세포내 바이러스 증식억제 효과를 측정하여 하기 도 3에 그 결과를 나타내었다.

솔잎추출물 분획	시험관내 살바이러스 효능
	완전감소	102 감소
디클로로메탄 (CH2Cl2) 가용성 추출물	16000배 희석 (62.5㎍/㎖)	32000배 희석 (31.25㎍/㎖l)
에틸아세테이트 (EtOAc) 가용성 추출물	1000배 희석 (1㎎/㎖)	2000배 희석 (500㎍/㎖)
부탄올 (n-BuOH) 가용성 추출물	8000배 희석 (125㎍/㎖)	-
수 (H2O) 가용성 추출물	32000배 희석 (31.25㎍/㎖)	-
솔잎분말 60% 에탄올 추출물	16000배 희석 (62.5㎍/㎖)	32000배 희석 (31.25㎍/㎖)
* 처리 바이러스: Influenza virus H1N1 (105.6 TCID50/㎖) * 처리조건: 4 ℃, 30분

상기 표 21에 나타낸 바와 같이, 디클로로메탄 가용성 추출물 62.5 ㎍/㎖, 에틸아세테이트 가용성 추출물 1 ㎎/㎖, 부탄올 가용성 추출물 125 ㎍/㎖, 수가용성 추출물 31.25 ㎍/㎖ 농도에서 완전 감소하였다.

또한, 도 3에 나타낸 바와 같이, 플라크 감소 분석 결과 본 발명의 솔잎 비극성 용매 가용 추출물 각각의 농도가 50 ㎍/㎖일 때, 바이러스의 억제%는 각각 디클로로메탄 가용성 추출물 47.5%, 에틸아세테이트 가용성 추출물 13 %, 부탄올 가용성 추출물 28.4 % 및 수가용성 추출물 86.5 % 로 상기 관 실험의 결과와 일치하는 경향을 나타내었다.

상기 실험 결과 솔잎 비극성용매 가용성 추출물 중 디클로로메탄 가용성 추출물 및 수가용성 추출물이 인플루엔자 바이러스에 대한 시험관내 살바이러스 효능 (Virucidal activity)와 세포내 바이러스 증식억제 효능 (Antiviral activity)이 탁월하였다.

4-2. 계태아 섬유아세포에서의 시험관내 살 뉴캣슬병 바이러스 효능

계태아 섬유아세포에서의 시험관 내 살 뉴캣슬병 바이러스 (NDV) 효능을 측정하기 위해 상기 실시예 2의 솔잎 비극성용매 가용 추출물들을 증류수로 100배 희석한 것을 기준으로 하여 1000배, 2000배, 4000배, 8000배, 16000배, 32000배 희석하여 참고예 4의 방법에 의해 시험관내 살바이러스 효능을 측정하여 하기 표 22에 그 결과를 나타내었다.

솔잎추출물 분획	시험관내 살바이러스 효능
	완전감소	102 감소
디클로로메탄 (CH2Cl2) 가용성 추출물	500배 희석 (2㎎/㎖)	4000배 희석 (250㎍/㎖l)
에틸아세테이트 (EtOAc) 가용성 추출물	효과없음	효과없음
부탄올 (n-BuOH) 가용성 추출물	효과없음	100배 (10㎎/㎖)
수 (H2O) 가용성 추출물	2000배 희석 (500㎍/㎖)	4000배 희석 (250㎍/㎖l)
솔잎분말 60% 에탄올 추출물	4000배 희석 (250㎍/㎖l)	8000배 희석 (125㎍/㎖l)
* 처리 바이러스: Newcastle disease virus KJW strain (105.6 TCID50/㎖) * 처리조건: 4 ℃, 30분

상기 표 22에 나타낸 바와 같이, 디클로로메탄 가용성 추출물 2 ㎎/㎖ 및 수가용성 추출물 500 ㎍/㎖ 농도에서 완전 감소하여 시험관내 탁월한 살바이러스 효능을 나타내었다.

실험예 5. 동물실험을 통한 솔잎 추출물의 항바이러스 효과 실험

5-1. 마우스에서의 솔잎 추출물의 항바이러스 효과

5-1-1. 인플루엔자 바이러스 공격접종에 대한 솔잎 추출물의 음수 투여에 의한 치료효과

솔잎 추출물의 인플루엔자 바이러스 감염 마우스에 대한 치료효과를 시험하기 위하여 상기에서 제조한 적송잎 60 % 에탄올 추출물을 증류수로 5000배 희석하여 솔잎 추출물의 농도를 0.2 ㎎/㎖ 되도록 제조하였다. 시험군은 바이러스 공격접종 후 솔잎 추출물로 치료를 실시하는 실험군과 바이러스 공격접종 후 치료를 실시하지 않는 양성대조군 그리고 바이러스 공격접종을 실시하지 않은 음성대조군 등 3가지 시험군으로 구분하였다.

마우스는 6주령 자성 SPF ICR 마우스 (오리엔트, 한국)를 사용하였으며, 공격접종 바이러스는 감염 시 마우스에서 뚜렷한 임상증상과 높은 폐사율을 유발하는 사람유래 마우스 적응주인 인플루엔자 바이러스 A/PR/8/34 (H1N1)를 사용하였다. 바이러스 공격접종 시 마우스는 흡입마취 후 역가 10^8.0 TCID₅₀/㎖의 바이러스액을 50 ㎕/마리로 비강 접종하였다. 공격접종 후 접종동물은 2주간 사료소비량과 음수량을 매일 측정하고 또한 임상증상 및 폐사 마리수 등을 매일 관찰하여 병변지수 (Pathogenic index : PI)를 산출하였다. 음성대조군에 사용한 동물이 80 % 이상 살아남지 못할 경우 재시험을 실시하였다. 음수투여에 따른 마우스 치료효과를 하기 표 23에, 일일사료 소비량 및 음수소비량 측정결과를 표 24에 각각 나타내었다.

동물군	접종 두수	체중(g) (mean ± SD)		공격접종 결과A)				PI14 F )
				임상증상B)		폐사C)
		접종전	접종후	Sick	MTOD )	Dead	MDTE )
솔잎추출물 처리군 5000배 희석 (0.2 ㎎/㎖)	10	29.533 ±1.9802	28.54 ±3.4852	7/10	4.85	4/10	5.5	1.1
양성 대조군	10	29.523 ±1.6428	31.14 ±4.5208	10/10	4.7	7/10	5.9	1.7
음성 대조군	10	29.418 ±1.9398	28.09 ±4.4156	0/10	-	0/10	-	0
A) 공격접종주 및 접종량 : 인플루엔자바이러스, IN=106.5 TCID50/dose/50 ㎕ B) 임상증상두수/접종두수 C) 폐사두수/접종두수 D) Mean time of onset clinical signs (day) E) Mean death time (day) F) Pathgenicity index : the mean score per mouse per observation over a 14 day period when each day, mouse are scored 0 if normal, 1 if sick (열, 눈꺼풀, 털, 호흡, 구부린 자세 이상, 위축), 2 if dead

DPI 처리구		1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11	12	13	14
솔잎추출물 처리군 5000배 (0.2mg/mL)	사료	2.66	1.12	1.33	1.44	1.38	1.13	1.02	1.83	2.67	3.5	3.50	4.83	4.67	3.25
	음수	4.54	1.52	3.33	1.67	2.5	2.5	3.33	5.21	5.34	5.33	5.83	6.67	6.67	6.67
양성대조군	사료	2.25	0.95	0.72	0.88	0.63	0.67	1.08	1.33	2.23	3.67	4.30	5.33	4.67	4.30
	음수	2.53	1.00	1.00	0.63	0.63	0.17	0.33	2.67	3.33	3.33	6.67	6.67	6.67	6.67
음성대조군	사료	3,56	3.65	3.21	3.78	2.89	4.55	3.82	3.91	3.69	4.31	3.42	3.61	3.78	3.99
	음수	5.21	5.43	5.12	5.56	5.67	5.32	5.65	5.43	5.87	5.78	5.89	5.45	5.65	5.92

표 23 및 표 24에 나타난 바와 같이, 5000배 희석된 60 % 에탄올 솔잎 추출물 (0.2 ㎎/㎖)을 시험군에 적용한 결과 추출물을 섭취하지 못한 양성대조군과 비교하여 바이러스 공격접종 후 2일부터 10일까지 음수 및 사료소비량에 뚜렷한 차이를 나타냈으며, 솔잎추출물 처리군은 양성대조군에 비하여 바이러스 공격접종 후 임상증상, 폐사율 및 병변지수가 탁월하게 낮아지는 효과 또한 나타냈다.

5-1-2. 인플루엔자 바이러스 공격접종에 대한 솔잎 추출물의 위관(존데) 투여에 의한 치료효과

솔잎 추출물의 인플루엔자 바이러스 감염 마우스에 대한 치료효과를 시험하기 위하여 상기에서 제조한 적송잎 60 % 에탄올 추출물을 증류수로 희석하여 솔잎 추출물을 제조하였다. 시험군은 바이러스 공격접종 후 솔잎 추출물로 치료를 실시하는 실험군과 바이러스 공격접종 후 치료를 실시하지 않은 음성대조군 등 2가지 시험군으로 구분하였다.

마우스는 체중 18~21g의 자성 SPF BALB/c 마우스 (오리엔트, 한국)를 사용하였으며, 공격접종 바이러스는 감염 시 마우스에서 뚜렷한 임상증상과 높은 폐사율을 유발하는 사람유래 마우스 적응주인 인플루엔자 바이러스 A/PR/34 (H1N1)을 사용하였다. 바이러스 공격접종 시 마우스는 흡입마취 후 역가 10^3.0 TCID₅₀/㎖의 바이러스액을 각 50 ㎕/마리로 비강 접종하였다. 치료는 공격접종 4시간 전 투여를 시작으로 하여 5일간 위관삽입법으로 솔잎 추출물이 10 mg/kg/day의 용량이 되도록 2회/day 치료하였다. 또한, 음성대조군은 치료제 대신 생리식염수를 1일 2회 위관삽입 하였다. 공격접종 후 접종동물은 2주간 사료소비량과 음수량을 매일 측정하고 또한 임상증상 및 폐사 마리수 등을 매일 관찰하여 치료효과를 산출하였다. 또한, 솔잎 추출물 치료로 인한 바이러스 감소효과를 판정하기 위하여 각 그룹 당 5마리의 마우스로부터 공격접종 후 3일과 6일에 폐를 적출하여 폐경화도, 폐 무게 및 폐내 바이러스 함량을 측정하였다(Sidwell RW et al., Antiviral Research, 51, pp179-187, 2001). 위관 삽입 투여에 따른 마우스 치료효과는 하기 표 25 및 표 26 에 나타내었다.

투여물	조성(mg/kg/day)	공격접종 역가(CCID50/ml)	체중(g) (mean±SD)		공격접종 결과
					생존율A
			접종전	접종후	폐사수/총두수	MDTB±SD
솔잎추출물	10	103.0	21.1±1.4	13.1±1.0	3/10*	8.7±0.6
식염수	-		20.7±0.8	14.6±1.2	14/20	11.8±3.0
A 생존두수/접종두수 B Mean death time(day) *P<0.05 by Fisher's exact test(식염수 처리군 대비)

투여물 및 조성(mg/kg/day)		공격접종 역가(CCID50/ml)	평균병변지수(Mean lung parameters)
			Day 3			Day 6
			경화도A ±S.D	무게 (mg±S.D.)	바이러스역가(log10/g±S.D.)	경화도A±S.D	무게(mg±S.D.)	바이러스역가(log10/g±S.D.)
솔잎추출물	10	103.0	0.1±0.1	140±9*	4.7±0.5***	1.0±0.0**	209±0	4.4±0.8*
식염수	-		0.0±0.0	159±7	6.8±0.2	2.5±0.5	212±0	5.6±0.4
A 경화도(consolidation); 0(정상) - 4(짙은 보라색) *P<0.05; **P<0.01; ***P<0.001 by Fisher's exact test(식염수 처리군 대비)

표 25 에 나타난 바와 같이 솔잎 추출물을 치료목적으로 시험군에 처리한 결과 솔잎 추출물을 처리하지 않은 음성대조군과 비교하여 인플루엔자 바이러스 10^3.0 TCID₅₀/ml 공격접종 시 통계학적으로 유의성 있는 (P<0.05) 폐사율의 감소 효과가 뚜렷하게 나타났다. 또한 표 26에 나타난 바와 같이 인플루엔자 바이러스 공격접종 후 3일과 6일 후 솔잎 추출물을 처리한 시험군은 음성대조군에 비하여 폐내 바이러스 함량이 통계학적으로 유의성 있게 감소되었으며 (P<0.05 이상), 공격접종 후 솔잎 추출물 처리군은 음성대조군에 비하여 폐경화도 (6일 후)와 폐무게 (3일 후)가 각각 통계학적으로 유의성 있게 낮아지는 효과를 나타냈다.

5-2. SPF 닭에서의 솔잎 추출물의 항바이러스 효과

5-2-1. 솔잎 추출물의 항 조류인플루엔자 바이러스 효과

솔잎 추출물의 조류인플루엔자 바이러스 감염 SPF 닭에 대한 치료효과를 시험하기 위하여, 상기에서 제조한 적송잎 60 % 에탄올 추출물 분말을 각각 1%, 0.4%, 0.1% (w/w) 되도록 닭 사료에 혼합하여 제조하였다. 시험군은 바이러스 공격접종 후 솔잎 추출물로 치료를 실시하는 실험군과 바이러스 공격접종 후 바이러스 공격접종 후 치료를 실시하지 않는 음성 대조군 등 2가지 시험군으로 구분하였고, 실험군의 경우 치료제 농도를 세분화 하여 농도별 영향을 평가하고자 하였다.

실험동물은 6주령의 SPF 닭 (남덕세니텍, 한국)을 사용하였으며 공격접종 바이러스는 닭에서 1∼30 % 내외의 폐사와 산란 저하를 유발하는 저병원성 조류 인플루엔자 (Low Pathogenic Avian Influenza: LPAI) 바이러스의 국내 분리주인 A/HS/K5/01(H9N2)를 사용하였다. 바이러스 공격접종 시 역가 10⁷ EID₅₀/ml의 바이러스를 100 ul씩 비강으로 공격접종 하였다. 치료는 공격접종 4시간 전부터 투여 농도별로 솔잎 추출물이 혼합된 사료를 공급하기 시작하였고 시험군이 자유로이 먹을 수 있도록 자유급이하는 방식으로 총 5일간 연속해서 사료로 투여하였다. 공격접종 후 5일째 실험군과 음성대조군 모두로부터 기도와 맹장편도를 채취하여 유제액을 10일령 계태아에 접종하는 방법으로 바이러스를 재분리하고 그 역가를 산정하였다. 바이러스 공격접종에 따른 기관별 바이러스 재분리율과 바이러스 역가를 산정하여 확인한 치료효과는 표 27에 나타내었다.

투여물	사료 내 농도 (%, w/w)	공격 접종 후 변화
		바이러스 재분리율 (양성수수/접종수수)		바이러스 역가 (log10EID50/g± S.D.)
		기도	맹장편도	기도	맹장편도
솔잎추출물	1.0	1/8**	1/8**	2.1± 0.4**	3.9± 0.3**
솔잎추출물	0.4	3/8*	3/8*	2.6± 0.4**	4.6± 0.7**
솔잎추출물	0.1	4/8	5/8	3.2± 1.1	5.0± 0.9
증류수	-	8/8	8/8	4.1± 0.5	7.5± 1.1
* P < 0.05 by Fisher’s exact test ** P < 0.01 by Fisher’s exact test

표 27에 나타난 바와 같이, 공격접종 5일 후 바이러스 재분리율과 기도 및 맹장편도내 바이러스 역가는 솔잎 추출물 1 % 및 0.4% 처리군에서 모두 음성대조군에 비하여 통계학적으로 유의성 있게 감소하였다 (P < 0.05 이상).

5-2-2. 솔잎 추출물의 항 뉴캣슬병 바이러스 효과

솔잎 추출물의 뉴캣슬병 바이러스 감염 SPF 닭에 대한 치료효과를 시험하기 위하여, 상기에서 제조한 적송잎 60 % 에탄올 추출물을 증류수로 희석하여 각각 500 ug/ml, 250 ug/ml, 125 ug/ml 되도록 제조하였다. 시험군은 바이러스 공격접종 후 솔잎 추출물로 치료를 실시하는 실험군 및 바이러스 공격접종 후 치료를 실시하지 않는 음성대조군으로 구분하였다.

13주령 SPF 닭에 뉴캣슬병 바이러스 사독 오일 백신을 0.2 ml씩 근육접종하고 7일 후 채혈하여 뉴캣슬병 바이러스에 대한 항체가를 측정한 후 Kr-005/00 주를 10^5.5 EID₅₀/30ul 로 점안하여 공격접종 하였다. 치료는 공격접종 4시간 전부터 투여 농도별로 솔잎 추출물이 혼입된 증류수를 공급하기 시작하였고 시험군이 자유로이 먹을 수 있도록 자유급수하는 방식으로 총 5일간 연속해서 음수 투여하였다. 공격 접종 6일째 구강과 총배설강 표면을 면봉으로 긁어내어 바이러스 배출량을 계태아 섬유아세포에서 측정하였다.

	바이러스 시료 채취부위	솔잎 추출물 투여 농도			증류수투여군
		500ug/ml	250ug/ml	125ug/ml
배출된 바이러스 역가 (log10TCID50/ml ± S.D)	구강	0	0	0	1.12±1.2
	총배설강	2.34±0.6**	2.98±0.9*	3.08±1.1	4.17±0.8

^* P < 0.05 by Fisher's exact test

^** P < 0.01 by Fisher's exact test

솔잎 추출물을 500, 250, 125 ug/ml의 농도로 연속 음수 투여한 결과 모든 농도에서 약 10¹ TCID₅₀/ml 이상의 의 뉴캣슬병 바이러스의 배출량이 감소하는 결과를 보였다. 특히 500 ug/ml과 250ug/ml을 투여한 군에서는 각각각 10^2.34 TCID₅₀/ml 과 10^2.98 TCID₅₀/ml의 바이러스를 배출하여 대조군인 증류수 투여군의 10^4.17 TCID₅₀/ml 에 비하여 통계학적으로 유의성 있게 (P < 0.01 이상) 바이러스 배출량이 감소되었다.

5-3. 오리에서의 솔잎 추출물의 항 인플루엔자 바이러스 효과

솔잎 추출물의 인플루엔자 바이러스 감염 오리에 대한 치료효과를 시험하기 위하여 상기에서 제조한 적송잎 60 % 에탄올 추출물 분말을 각각 1%, 0.4%, 0.1% (w/w) 되도록 오리 사료에 혼합하여 제조하였다. 시험군은 바이러스 공격접종 후 솔잎 추출물로 치료를 실시하는 실험군과 바이러스 공격접종 후 치료를 실시하지 않는 음성 대조군 등 3가지 시험군으로 구분하였고, 실험군의 경우 치료제 농도를 세분화 하여 농도별 영향을 평가하고자 하였다.

실험동물은 3주령의 북경오리 (양성농장, 한국)를 사용하였으며 공격접종 바이러스는 국내 야생 물오리에서 분리한 저병원성 조류 인플루엔자바이러스인 A/CSM/D2/05 (H6N5)를 사용하였다. 바이러스 공격접종 시 역가 10^7.7 EID₅₀/ml의 바이러스를 50 ul씩 기도와 비강으로 각각 접종하여 총 0.1 ml의 바이러스를 공격접종 하였다. 치료는 공격접종 4시간 전부터 투여 농도별로 솔잎 추출물이 혼합된 사료를 공급하기 시작하였고 시험군이 자유로이 먹을 수 있도록 자유급이하는 방식으로 총 5일간 연속해서 사료로 투여하였다. 공격접종 후 3일과 6일 2회에 걸쳐 실험군과 음성대조군 모두로부터 기도와 맹장편도를 채취하여 유제액을 10일령 계태아에 접종하는 방법으로 바이러스를 재분리하고 그 역가를 산정하였다. 바이러스 공격접종에 따른 기관별 바이러스 재분리율과 바이러스 역가를 산정하여 확인한 치료효과는 표 29에 나타내었다.

투여물	사료 내 농도 (%, w/w)	공격접종 후 3일				공격접종 후 6일
		바이러스 재분리율 (양성수수/접종수수)		바이러스 역가 (log10EID50/g)		바이러스 재분리율 (양성수수/접종수수)		바이러스 역가 (log10EID50/g)
		기도	맹장편도	기도	맹장편도	기도	맹장편도	기도	맹장편도
솔잎추출물	1.0	2/8*	0/8	2.3**	0	0/8	1/8**	0	2.1**
솔잎추출물	0.4	4/8	0/8	3.3*	0	0/8	2/8*	0	2.1**
솔잎추출물	0.1	4/8	0/8	3.8	0	0/8	2/8*	0	2.7*
증류수	-	7/8	0/8	5.6	0	0/8	7/8	0	4.1
* P < 0.05 by Fisher’s exact test ** P < 0.01 by Fisher’s exact test

표 29에 나타난 바와 같이, 공격접종 3일 후에는 바이러스 재분리율은 솔잎 추출물을 1 % 처리군에서 그리고 기도내 바이러스 역가는 솔잎 추출물을 1 % 및 0.4% 처리군에서 음성대조군에 비하여 통계학적으로 유의성 있게 감소하였다 (P < 0.05 이상). 또한 공격접종 6일 후에는 바이러스 재분리율과 맹장편도내 바이러스 역가가 솔잎 추출물 1 %, 0.4% 및 0.1% 처리군에서 모두 음성대조군에 비하여 통계학적으로 유의성 있게 감소하였다 (P < 0.05 이상).

1. 사료조성물 예

솔잎 60% 에탄올 추출물................................240g

부형제 (말분).........................................760g

상기의 성분을 가지고 대한약전 산제제법에 준하여 제조한다.

상기의 혼합물의 조성비는 비교적 사료조성물에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만, 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하며, 통상의 사료조성물 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 대한약전 산제제법에 준하여 제조에 사용할 수 있다.

2. 소독조성물 예

솔잎 60% 에탄올 추출물............................3.0g

과산화수소..........................................7g

티몰..............................................1.0g

에틸 파라벤.......................................0.4g

글루타르알데하이드................................0.8g

유제놀 ...........................................0.5g

상기 조성물은 유럽 규격 위원회의 prEN 1276 시험(0.03% 알부민/경수)을 통과하였다. 여기에 물 및 pH가 4.0이 되도록 하는 소량의 H₂SO₄를 가하여 전체 100ml에 맞추었다. 상기의 혼합물의 조성비는 비교적 소독조성물에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만, 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하다.

본 발명의 솔잎 추출물은 인플루엔자 A 바이러스 (influenza A viruses), 뉴캣슬병 바이러스 (newcastle disease virus), 닭 전염성기관지염 바이러스 (infectious broncheitis virus), 조류 뉴모 바이러스 (avian pneumovirus), 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스 (porcine reproductive and respiratory syndrome virus), 콕사키 바이러스 (coxsakie virus), 세망내피증 바이러스 (reticuloendotheliosis virus), 오제스키 바이러스 (aujeszky's disease virus) 및 아데노 바이러스 (adeno virus)의 감염 세포주를 이용한 시험관 내 (in vitro) 실험 및 상기 바이러스 감염 동물을 이용한 생체 내 (in vivo) 실험 에서 바이러스 증식 억제 및 살바이러스에 의한 항바이러스 효과가 탁월하므로, 상기 바이러스의 체내 감염으로 유발되는 동물 질환의 예방 및 치료용 수의학적 조성물, 사료첨가제 및 살바이러스 소독용 조성물에 이용할 수 있다.

Claims (48)

1. 적송 (Pinus densiflora Sieb. et Zucc.), 해송 (Pinus thunbergii parlatore) 또는 잣나무 (Pinus koraiensis Sieb. et Zucc) 잎의 에탄올, 디클로로메탄 또는 에틸 아세테이트 가용 추출물을 유효성분으로 함유하는 인간을 제외한 동물의 H1N1, H9N2 또는 H6N5의 혈청형을 가진 인플루엔자 바이러스 (influenza virus)로 인한 조류독감 또는 변이형 감염성 조류독감, 뉴캣슬병 바이러스 (newcastle disease virus)로 인한 조류 파라믹소바이러스 (Avian paramyxoovirus)감염증 또는 개 디스템퍼(Canine distemper), 닭 전염성 기관지염 바이러스 (infectious broncheitis virus)로 인한 칠면조 코로나 바이러스(Turkey coronavirus)감염증, 조류 뉴모바이러스 (avian pneumovirus)로 인한 조류 뉴모바이러스 감염증, 돼지 생식기 및 호흡 증후군 바이러스 (porcine reproductive and respiratory syndrome virus)로 인한 돼지 생식기 및 호흡 증후군 바이러스 감염증, 콕사키 바이러스 (coxsakie virus)로 인한 구제역 (Foot-and-mouth disease), 세망내피증 바이러스 (reticuloendotheliosis virus)로 인한 조류 백혈병 (Avian leukosis), 오제스키 바이러스 (aujeszky's disease virus)로 인한 닭 전염성후두기관염(Chicken infectious laryngotrachitis) 또는 마렉병 (Marek's disease), 또는 아데노 바이러스 (adeno virus)로 인한 호흡기 감염증 또는 산란저하증 (Egg drop syndrome)을 유발하는 동물 아데노바이러스 감염증의 예방 및 치료용 수의학적 조성물.
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20. 제 1항의 적송 (Pinus densiflora Sieb. et Zucc.), 해송 (Pinus thunbergii parlatore) 또는 잣나무 (Pinus koraiensis Sieb. et Zucc) 잎의 에탄올, 디클로로메탄 또는 에틸 아세테이트 가용 추출물을 유효성분으로 함유하는 인간을 제외한 동물의 H1N1, H9N2 또는 H6N5의 혈청형을 가진 인플루엔자 바이러스 (influenza virus)로 인한 조류독감 또는 변이형 감염성 조류독감, 뉴캣슬병 바이러스 (newcastle disease virus)로 인한 조류 파라믹소바이러스 (Avian paramyxoovirus)감염증 또는 개 디스템퍼(Canine distemper), 닭 전염성 기관지염 바이러스 (infectious broncheitis virus)로 인한 칠면조 코로나 바이러스(Turkey coronavirus)감염증, 조류 뉴모바이러스 (avian pneumovirus)로 인한 조류 뉴모바이러스 감염증, 돼지 생식기 및 호흡 증후군 바이러스 (porcine reproductive and respiratory syndrome virus)로 인한 돼지 생식기 및 호흡 증후군 바이러스 감염증, 콕사키 바이러스 (coxsakie virus)로 인한 구제역 (Foot-and-mouth disease), 세망내피증 바이러스 (reticuloendotheliosis virus)로 인한 조류 백혈병 (Avian leukosis), 오제스키 바이러스 (aujeszky's disease virus)로 인한 닭 전염성후두기관염(Chicken infectious laryngotrachitis) 또는 마렉병 (Marek's disease), 또는 아데노 바이러스 (adeno virus)로 인한 호흡기 감염증 또는 산란저하증 (Egg drop syndrome)을 유발하는 동물 아데노바이러스 감염증의 예방 및 개선용 동물사료 첨가제.
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38. 제 20항의 동물사료 첨가제를 첨가하는 것을 특징으로 하는 사료.
39. 제 1항의 적송 (Pinus densiflora Sieb. et Zucc.), 해송 (Pinus thunbergii parlatore) 또는 잣나무 (Pinus koraiensis Sieb. et Zucc) 잎의 에탄올, 디클로로메탄 또는 에틸 아세테이트 가용 추출물을 유효성분으로 함유하는 인간을 제외한 동물의 H1N1, H9N2 또는 H6N5의 혈청형을 가진 인플루엔자 바이러스 (influenza virus)로 인한 조류독감 또는 변이형 감염성 조류독감, 뉴캣슬병 바이러스 (newcastle disease virus)로 인한 조류 파라믹소바이러스 (Avian paramyxoovirus)감염증 또는 개 디스템퍼(Canine distemper), 닭 전염성 기관지염 바이러스 (infectious broncheitis virus)로 인한 칠면조 코로나 바이러스(Turkey coronavirus)감염증, 조류 뉴모바이러스 (avian pneumovirus)로 인한 조류 뉴모바이러스 감염증, 돼지 생식기 및 호흡 증후군 바이러스 (porcine reproductive and respiratory syndrome virus)로 인한 돼지 생식기 및 호흡 증후군 바이러스 감염증, 콕사키 바이러스 (coxsakie virus)로 인한 구제역 (Foot-and-mouth disease), 세망내피증 바이러스 (reticuloendotheliosis virus)로 인한 조류 백혈병 (Avian leukosis), 오제스키 바이러스 (aujeszky's disease virus)로 인한 닭 전염성후두기관염(Chicken infectious laryngotrachitis) 또는 마렉병 (Marek's disease), 또는 아데노 바이러스 (adeno virus)로 인한 호흡기 감염증 또는 산란저하증 (Egg drop syndrome)을 유발하는 동물 아데노바이러스 감염증의 예방 및 개선용 소독용 조성물.
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