KR101338319B1 - 녹차 부산물의 추출물을 함유하는 인플루엔자 바이러스로 인한 동물 질환의치료 및 예방용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 녹차 부산물의 추출물을 함유하는 인플루엔자 바이러스로 인한 동물 질환의 예방 및 치료를 위한 조성물에 관한 것으로, 본 발명에 의한 녹차 부산물의 추출물은 인플루엔자 A 바이러스 (influenza A viruses)를 이용한 시험관 내 (in vitro) 실험 및 상기 바이러스 감염 동물을 이용한 생체 내 (in vivo) 실험 에서 바이러스 증식 억제에 의한 항바이러스 효과가 탁월하므로, 상기 바이러스의 체내 감염으로 유발되는 동물 질환의 예방 및 치료에 유용한 수의학적 조성물, 사료첨가제 및 살바이러스 소독용 조성물에 이용할 수 있다.

Description

녹차 부산물의 추출물을 함유하는 인플루엔자 바이러스로 인한 동물 질환의치료 및 예방용 조성물{Composition for preventing and treating disease caused by influenza virus comprising extract from green tea by product}

본 발명은 녹차 부산물을 함유하는 인플루엔자 바이러스로 인한 동물 질환의 치료 및 예방용 조성물에 관한 것이다.

인플루엔자 바이러스 (Influenza virus)는 오르소믹소 계통 (Family Orthomyxoviridae)에 속하는 RNA 바이러스로서 혈청형은 A형, B형, C형 등 3가지로 구분된다. 그 중 B형과 C형은 사람에서만 감염이 확인되고 있으며, A형은 사람, 말, 돼지, 기타 포유류 그리고 다양한 종류의 가금과 야생조류에서 감염이 확인되고 있다(Selmons et al., Avian Dis., 18(1), pp119-124, 1974; Turek R et al., Acta Virol., 27(6), pp523-527, 1983; Webster RG et al., Microbiol Rev., 56(1), pp152-179, 1992).

A형 인플루엔자 바이러스의 정상적인 자연숙주는 오리, 갈매기 등과 같은 야생 물새류로 알려져 있으며, 전 세계적으로 야생조류에 대한 인플루엔자 감염 역학조사를 실시한 결과 현존하는 모든 16종의 HA형과 9종의 NA형 인플루엔자 바이러스가 야생조류에서 감염되고 있음이 확인되었다 (Selmons et al., Avian Dis., 18(1), pp119-124, 1974). A형으로 분류되는 조류인플루엔자 바이러스는 인수(人獸) 공통 전염병 바이러스로, 병원성에 따라 닭에 감염 시 가벼운 호흡기 증상을유발하는 비병원성 조류 인플루엔자, 1∼30 % 내외의 폐사와 산란 저하를 유발하는 저병원성 조류 인플루엔자 (Low pathogenic avian influenza: LPAI) 그리고 95 % 이상의 높은 치사성을 보이고 “조류독감 (버드플루: Bird flu)”이라고도 불리는 고병원성 조류 인플루엔자 (Highly pathogenic avian influenza: HPAI)등 크게 3가지 병형으로 구분하고 있다 (Alexander DJ, Vet. Microbiol., 74(1-2), pp3-13, 2000). 이중 고병원성 조류 인플루엔자는 국제수역사무국 (OIE)에서 A 등급으로, 그리고 국내에서는 제1종 가축전염병으로 분류하고 있다.

사람은 A, B 및 C형 인플루엔자 바이러스의 숙주이다. 역사에는 혈청형 H1N1, H2N2 그리고 H3N2형에 의한 3번의 인플루엔자 대유행이 기록되어 있다. 그 중 첫번째 인플루엔자 대유행이었던 스페인 독감은 인류가 겪은 가장 큰 피해로 기록되고 있으며 그 기간 중 2천만 명에서 5천만 명의 사람이 사망하였다 (Walter JH, Bull. NY Acad. Med., 54, pp855-864, 1978). 스페인 독감의 원인 바이러스는 돼지 인플루엔자 바이러스와 매우 유사한 혈청형 A/H1N1으로 판명되어 돼지 인플루엔자 바이러스가 변이되어 사람에게 피해를 준 것으로 추측된다. 3번째 인플루엔자 대유행의 경우에도 원인바이러스가 조류로부터 유래하여 피해를 유발하였고 최근의 2009년 신종 인플루엔자의 경우, 돼지로부터 유래한 바이러스가 100개 이상의 국가에서 13만 명 이상의 감염자 및 800명 이상의 사망자를 유발하였다. 상기의 경우와 같이 동물로부터 유래한 인플루엔자 바이러스가 사람에게 감염력을 가질 경우 막대한 피해를 유발할 가능성이 매우 높다고 판단된다. 따라서 인플루엔자 바이러스의 통제는 동물 감염되는 인플루엔자 바이러스에 대한 통제와도 직, 간접적으로 관련이 있다.

위와 같은 피해를 예방하기 위하여 백신 및 치료제의 개발이 전세계적으로 활발하게 이루어지고 있고, 실제로 상용화되어 사람과 동물에게 적용되고 있다. 백신은 사독백신과 유전자재조합 백신으로 개발되어 사용되고 있지만, 변이가 쉽게 되는 인플루엔자 바이러스의 특성상 과거에 분리된 균주로는 최근의 균주에 대한 방어능이 감소한다는 단점이 있다. 치료제로서는 아만타딘 (amantadine)과 리만타딘 (rimantadine), 자나미비르 (zanamivir) 그리고 오셀타미비르 (oseltamivir)가 사용되고 있지만 내성균주의 출현, 구토와 현기증 등의 부작용이 있어 새로운 항바이러스제제의 개발이 요구된다.

녹차는 차나무과(Theaceae)에 속하는 상록관목인 차나무(Thea sinensis L. =Camellia sinensis)의 잎 또는 그 재배 변종의 잎을 가공하여 사용하며 caffeine의 제조 원료, 기호성 음료, 각종식품 등에 사용되고 한방에서 강심, 이뇨, 흥분, 수렴약으로 사용한다.

녹차의 성분으로는 phenolic compound인 (+)-catechin,(-)-epicatechin, (-)-epicatechin gallate,(-)-epigallocatechin gallate,(-)-epigallocatechin, theaflavin 등이, 그리고 purine alkaloid 인 caffeine, xanthine, theophylline 등이 보고되었다.

녹차의 생리활성으로는 항염증, 항산화, 항암작용, 신경흥분, 강심, 이뇨작용을 나타내고 주성분인 catechin류는 항암작용, 혈관신생억제작용 및 항인플루엔자작용 등이 보고되었다.

녹차 부산물은 녹차의 열수 추출후 남은 잔사로 경제적인 이용가치가 낮아 가격이 저렴하므로 원료물질로서 적당하다. 녹차 부산물을 저급(C1~C4)알콜 또는 저극성용매로 추출하여 유기용매 분획할 경우 catechin성분은 적으면서 상대적으로 지용성 분획의 함량이 높다. 주성분인 catechin성분에 대한 연구는 다수가 보고되었으나 지용성 분획으로부터 분리된 비 catechin성분의 항인플루엔자효과에 대해서는 연구되지 않았다.

본 발명은 상기의 문제점을 해결하고 상기의 필요성에 의하여 안출된 것으로서 본 발명의 목적은 녹차의 부산물 추출물을 포함하는 항바이러스 제제를 제공하는 것이다.

상기의 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 (카테킨이 제거된) 녹차 부산물의 추출물을 유효성분으로 함유하는 인간을 제외한 동물의 바이러스로 인한 질환의 예방 및 치료용 수의학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 질환은 오르소믹소 바이러스과 (influenza virus family) 바이러스의 체내 감염으로 인해 유발되는 질환이며, 상기 질환은 조류독감 또는 변이형 감염성 조류독감을 포함하나 이에 한정되지 아니한다.

또한, 본 발명은 녹차 부산물의 추출물을 유효성분으로 함유하는 바이러스로 인한 질환의 예방 및 개선용 동물사료 첨가제 및 이를 포함하는 사료를 제공한다.

또한, 본 발명은 녹차 부산물의 추출물을 유효성분으로 함유하는 인간을 제외한 동물의 항 인플루엔자 바이러스로 인한 질환의 예방 및 치료용 수의학적 조성물은, 조성물 총 중량에 대하여 상기 추출물을 0.1 ~ 50 중량% 포함한다.

본 발명은 카테킨이 제거된 녹차 부산물의 추출물을 유효성분으로 함유하는 인간을 제외한 동물의 바이러스로 인한 질환의 예방 및 치료용 수의학적 조성물을 제공한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명의 녹차 부산물의 추출물은 독성 및 부작용이 거의 없으므로 예방 목적으로 장기간 투여 시에도 안심하고 사용할 수 있다. 본 발명의 녹차 추출물을 포함하는 수의학적 조성물은 통상의 방법에 따른 적절한 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다.

본 발명의 녹차 부산물의 추출물을 포함하는 수의학적 조성물에 포함될 수 있는 부형제 및 희석제로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트, 세탄올, 스테아릴알콜, 유동파라핀, 솔비탄모노스테아레이트, 폴리소르베이트60, 메칠파라벤, 프로필파라벤 및 광물유를 들 수 있다.

본 발명에 따른 녹차 부산물의 추출물을 포함하는 수의학적 조성물은 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향신료, 유화제, 방부제 등을 추가로 포함할 수 있는데, 본 발명에 의한 수의학적 조성물은 동물에 투여된 후 활성성분의 신속, 지속 또는 지연된 방출을 제공할 수 있도록 당업계에 잘 알려진 방법을 사용하여 제형화될 수 있고, 제형은 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액 에멀젼, 용액, 시럽, 에어로졸, 연질 또는 경질 젤라틴 캅셀, 좌제, 멸균 주사용액, 멸균 외용제 등의 형태일 수 있다.

본 발명에 의한 수의학적 조성물은 동물의 나이, 성별, 체중에 따라 달라질 수 있으나, 0.1 내지 100 mg/㎏의 양을 1일 1회 내지 수회 투여할 수 있다. 또한 그 녹차 부산물의 추출물의 투여량은 투여경로, 질병의 정도, 성별, 체중, 나이 등에 따라서 증감될 수 있다. 따라서, 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

또한, 본 발명은 상기 방법으로 수득된 녹차 부산물의 추출물을 유효성분으로 함유하는 바이러스로 인한 질환의 예방 및 개선에 유용한 동물사료 첨가제 및 이를 포함하는 사료를 제공한다.

상기의 동물사료 첨가제용 녹차 부산물의 추출물은 20 내지 90 % 고농축액이거나 분말 또는 과립형태일 수 있다.

본 발명의 동물사료 첨가제용 녹차 부산물의 추출물은 구연산, 후말산, 아디픽산, 젖산, 사과산 등의 유기산이나 인산나트륨, 인산칼륨, 산성피로인산염, 폴리인산염(중합인산염) 등의 인산염이나 폴리페놀, 카테킨(catechin), 알파-토코페롤, 로즈메리 추출물(rosemary extract), 비타민 C, 솔잎 추출물, 감초 추출물, 키토산, 탄닌산, 피틴산 등의 천연 항산화제 중 어느 하나 또는 하나 이상을 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 녹차 부산물의 추출물을 함유하는 동물사료 첨가제 및 이를 포함하는 사료는 보조성분으로 아미노산, 무기염류, 비타민, 항생물질, 항균물질, 항산화, 항곰팡이 효소, 살아있는 미생물 제제 등과 같은 각종보조제가 곡물, 예를 들면 분쇄 또는 파쇄된 밀, 귀리, 보리, 옥수수 및 쌀; 식물성 단백질 사료, 예를 들면 평지, 콩 및 해바라기를 주성분으로 하는 것; 동물성 단백질 사료, 예를 들면 혈분, 육분, 골분 및 생선분; 당분 및 유제품, 예를 들면 각종 분유 및 유장 분말로 이루어지는 건조 성분, 건조 첨가제를 모두 혼합한 후, 액체 성분과, 가열 후에 액체가 되는 성분, 즉, 지질, 예를 들면 가열에 의해 임의로 액화시킨 동물성 지방 및 식물성 지방 등과 같은 주성분 이외에 영양보충제, 소화 및 흡수향상제, 성장촉진제, 질병예방제 등과 같은 물질과 함께 사용될 수 있다.

상기 동물사료 첨가제용 녹차 부산물의 추출물은 동물에게 단독으로 식용 담체 중에서 다른 사료 첨가제와 조합되어 투여될 수 있다.

또한, 상기 동물사료 첨가제용 녹차 부산물의 추출물은 탑 드레싱으로서 또는 이들을 동물 사료에 직접 혼합하거나 또는 사료와 별도로, 별도의 경구 제형으로, 주사 또는 경피로 또는 다른 성분과 조합하여 쉽게 투여할 수 있다. 통상적으로, 당 업계에 잘 알려진 바와 같이 단독 일일 투여량 또는 분할 일일 투여량을 사용할 수 있다.

상기 동물사료 첨가제용 녹차 부산물의 추출물을 동물 사료와 별도로 투여할 경우, 당 업계에 잘 알려진 바와 같이 추출물의 투여 형태는 이들을 비-독성 제약상 허용 가능한 식용 담체와 조합하여 즉석 방출 또는 서방성 제형으로 제조할 수 있다. 이러한 식용 담체는 고체 또는 액체, 예를 들어 옥수수 전분, 락토스, 수크로스, 콩 플레이크, 땅콩유, 올리브유, 참깨유 및 프로필렌 글리콜일 수 있다. 고체 담체가 사용될 경우, 추출물의 투여형은 정제, 캡슐제, 산제, 토로키제 또는 함당정제 또는 미분산성 형태의 탑 드레싱일 수 있다. 액체 담체가 사용될 경우, 연 젤라틴 캡슐제, 또는 시럽제 또는 액체 현탁액제, 에멀젼제 또는 용액제의 투여 형태일 수 있다. 또한, 투여 형태는 보조제, 예를 들어 보존제, 안정화제, 습윤제 또는 유화제, 용액 촉진제 등을 함유할 수 있다. 또한 이들은 바이러스로 인한 질환의 개선 및 예방상 유용한 다른 물질을 함유할 수 있다.

또한, 녹차 부산물의 추출물이 동물사료 첨가제로 포함되는 동물사료는 동물의 식이 요구를 충족시키는데 통상적으로 사용되는 임의의 단백질-함유 유기 곡분일 수 있다. 이러한 단백질-함유 곡분은 통상적으로 옥수수, 콩 곡분 또는 옥수수/콩 곡분 믹스로 주로 구성되어 있다.

상기의 동물사료 첨가제는 침지, 분무 또는 혼합하여 상기 동물사료에 첨가하여 이용될 수 있다.

본 발명은 포유류, 가금 및 어류를 포함하는 다수의 동물 식이에 적용할 수 있다. 보다 상세하게, 식이는 상업상 중요한 포유류, 예를 들어 돼지, 소, 양, 염소, 실험용 설치 동물 (랫트, 마우스, 햄스터 및 게르빌루스쥐), 모피 소유 동물 (예, 밍크 및 여우), 및 동물원 동물 (예, 원숭이 및 꼬리 없는 원숭이), 뿐만 아니라 가축 (예, 고양이 및 개)에게 사용할 수 있다. 통상적으로 상업상 중요한 가금에는 닭, 터키, 오리, 거위, 꿩 및 메추라기가 포함된다. 송어와 같은 상업적으로 사육되는 어류도 포함될 수 있다

본 발명에 따른 녹차 부산물의 추출물을 포함한 동물용 사료 배합 방법은, 녹차 추출물을 동물 사료에 건조 중량 기준으로 사료 1 ㎏당 약 1 g 내지 100 g의 양으로 혼입한다.

또한, 사료 혼합물은 완전히 혼합한 후, 성분들의 분쇄 정도에 따라 경점성의 조립 또는 과립 물질이 얻어진다. 이것을 매시로서 공급하거나, 또는 추가 가공 및 포장을 위해 원하는 분리된 형상으로 형성한다. 이 때, 저장 중에 분리되는 것을 방지하기 위해, 동물 사료에 물을 첨가하고, 이어서 통상의 펠릿화, 팽창화, 또는 압출 공정을 거치는 것이 바람직하다. 과잉의 물은 건조 제거될 수 있다.

본 발명의 녹차 부산물의 추출물은 인플루엔자 A 바이러스 (influenza A viruses)를 이용한 시험관 내 (in vitro) 실험 및 상기 바이러스 감염 동물을 이용한 생체 내 (in vivo) 실험에서 바이러스 증식 억제 및 살바이러스에 의한 항바이러스 효과가 탁월하므로, 상기 바이러스의 체내 감염으로 유발 되는 동물 질환의 예방 및 치료용 수의학적 조성물, 사료첨가제 및 살바이러스 소독용 조성물에 이용할 수 있다.

도 1은 뉴트럴레드 비색분석법을 사용한 녹차 및 녹차부산물 추출물의 시험관내 효능 시험결과를 나타낸 표이다.
도 2는 BALB/c 마우스에 녹차 및 녹차부산물 추출물 투여 시 폐내 바이러스 증식억제 효과를 나타낸 표이다.
도 3은 SPF 닭에 녹차부산물 치료목적 투여 시 바이러스 재분리 결과를 나타낸 표이다.
도 4는 뉴트럴레드 비색분석법을 이용한 녹차 부산물 카테킨 분획물 및 비카테킨 분획물의 항인플루엔자 선택도 지수를 나타낸 표이다.
도 5는 녹차부산물의 카테킨층 및 비카테킨층 분획 1, 및 2의 농도별 neuraminidase inhibition assay 결과 그래프이다.
도 6은 녹차 부산물의 추출 및 유기용매 분획과정 모식도이다.

이하, 비한정적인 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다. 단 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 의도로 기재된 것으로서 본 발명의 범위는 하기 실시예에 의하여 제한되는 것으로 해석되지 아니한다.

제조예 :녹차 부산물의 추출물 제조

녹차 2kg을 90~100℃ 수욕 상에서 증류수 20L로 2회 열추출하고 여과하여 열수추출물을 제거한다. 열수 추출후 남은 식물체를 건조하고 메탄올 7.5L 로 3회 50~100℃에서 환류 하에서 추출하고 농축하여 녹차부산물의 메탄올 추출물을 얻었다.

실시예 1: 녹차 부산물 추출물로부터 비카테킨 및 카테킨 분획의 제조방법

녹차 각 2kg을 90℃ 수욕 상에서 증류수 20L로 2회 열추출하고 농축하여 물 추출물을 얻었다. 열수 추출한 식물체를 건조한 후 메탄올 7.5L 로 3회 55℃에서 추출하고 농축하여 녹차부산물의 메탄올 추출물을 얻었다. 메탄올 추출물 143g 을 90% 메탄올 에 현탁한 후 동량의 헥산으로 3회 분배하여 비카테킨 분획 1인 헥산층을 얻었다. 남은 90%메탄올층은 농축하고 다시 70% 메탄올 1.4L에 현탁, 디클로로메탄으로 3회 분배하여 두 번째 비카테킨 층인 디클로로메탄 분획을 얻었다. 70% 메탄올 층은 농축한 후 다시 증류수 1.4L에 현탁하고 에칠아세테이트로 3회 분배하여 주된 카테킨 분획인 에칠아세테이트 층을 얻었다.(도 6)

실시예 2: 녹차추출물과 녹차 부산물의 시험관내 항인플루엔자효능 시험

녹차추출물의 주성분인 카테킨의 항인플루엔자 효능은 이미 알려져있다. 녹차 추출물과 녹차부산물 추출물의 시험관내 항인플루엔자 효능을 비교하여 녹차 부산물의 항인플루엔자효능을 증명하기 위해 뉴트럴레드 비색분석을 실시하였다. 녹차 및 녹차 부산물 추출물의 시험결과, 녹차 추출물과 녹차부산물 추출물은 유사한 선택지수를 나타내 녹차내 유효 성분이 녹차 부산물에도 대다수 잔류함을 간접적으로 확인하였다.(도 1)

일반적으로 대조군에 비해 바이러스 방출이 50% 감소되는 농도가 EC50(50% effective concentration), 세포의 생존이 50% 감소되는 농도가 CC50(50% cytotoxic concentration)다. SI(selectivity index, 선택지수)는 CC50/EC50로서 SI 값이 클수록 바이러스 증식억제 효과가 크다.

실시예 3: 마우스모델을 이용한 녹차부산물의 항인플루엔자 효능시험

녹차 추출물과 녹차부산물 추출물의 시험관내 항인플루엔자 효능을 비교하여 녹차 부산물의 항인플루엔자효능을 증명하기 위해 마우스를 이용한 동물시험을 진행하였다. 녹차부산물 추출물을 바이러스 감염 BALB/c 마우스에 투여한 결과 추출물을 투여하지 않은 음성대조군과 비교하여 공격접종 3일 후 폐내 바이러스 함량이 유의성 있게 감소한 것을 확인하였다.(도 2)

실시예 4: SPF 닭 모델을 이용한 녹차부산물의 항인플루엔자 효능시험

녹차 추출물과 녹차부산물 추출물의 시험관내 항인플루엔자 효능을 비교하여 녹차 부산물의 항인플루엔자효능을 증명하기 위해 SPF 닭을 이용한 동물시험을 진행하였다. 녹차부산물 추출물을 사료첨가제 혹은 음수첨가제로 투여하여 모든 농도에서 기관 및 맹장편도내 바이러스 재분리율이 감소하였으며 재분리된 바이러스의 역가가 유의성있게 감소하여 녹차부산물의 항인플루엔자 효능을 확인하였다. 특히 인플루엔자 감염 닭이 분변을 통해 배출하는 고역가의 바이러스가 인플루엔자의 전파에 중요한 역할을 한다는 점을 감안할 때 녹차 부산물의 바이러스 배출 억제효능은 산업적 이용 가치가 매우 높다고 판단된다.(도 3)

실시예 5: 뉴트럴 레드 비색분석법을 이용한 녹차 부산물 카테킨층 및 비카테킨층의 항인플루엔자 효능 시험 결과

녹차 부산물 내에 존재하는 유효성분의 규명 및 기전 연구를 위하여 녹차 부산물 분획물을 배지에 첨가한 MDCK 세포에 인플루엔자 바이러스를 감염시킬 때 세포변성효과(CPE, Cytopathic effect) 관찰과 뉴트럴 레드 비색 분석(Neutral red assay) 실시를 통해 평균 세포독성 농도(CC50, 50% cytotoxic cencentration)와 평균 유효농도(EC50, 50% effective concentration), 선택도 지수(SI, Selective Index)를 산출하여 이미 항인플루엔자 효능이 입증된 카테킨층 외 녹차 부산물의 비카테킨층의 항인플루엔자 효능과 안정성을 분석한 결과 녹차 부산물의 카테킨층에서 SI 6.85 (CC50: 54.63 ㎍/㎖; EC50: 7.98 ㎍/㎖), 그 외 비카테킨층에서도 GT(BS)-NC(H) 층이 SI 5.21 (CC50: 43.47 ㎍/㎖; EC50: 8.34 ㎍/㎖), GT(BS)-NC(M) 층이 SI 11.13 (CC50: 662.99 ㎍/㎖; EC50: 59.59 ㎍/㎖)의 높은 항인플루엔자 효능을 나타냄을 확인하였다. 본 연구결과를 통해 녹차 부산물의 카테킨층 외 비카테킨층에서도 높은 항인플루엔자 효능을 확인함으로써 이미 항인플루엔자 효능이 규명된 카테킨 성분 외에도 항인플루엔자 효능을 보유하고 있는 성분이 녹차 부산물에 존재함을 증명하였다. 특히 비카테킨층 중 GT(BS)-NC(M)층의 경우 카테킨층보다 높은 SI값을 보유함으로써 카테킨외 성분의 높은 항인플루엔자 효능을 입증하였다. (도 4)

실시예 6: 녹차부산물 추출액과 분획물에 대한 인플루엔자 바이러스의 증식억제 작용기전 규명

실시예 6-1: 녹차부산물 추출액과 분획물에 대한 heamagglutiniation inhibition assay

본 연구는 바이러스의 증식 단계 중 host cell에 침투하기 위한 첫 번째 단계에서 녹차부산물 추출액 및 분획물의 항바이러스 효력을 확인하는 실험이다.

녹차부산물 비카테킨층 fraction 2 [GT(BS)-NC(M)] 샘플들을 PBS (phosphate buffer saline)에 1/10부터 1/12800까지 2배씩 희석하여 HI assay를 진행하였다.

시험결과, 원액의 1/100 희석농도 즉 1000ug/ml에서 명확한 hemagglutination inhibition 효력을 확인할 수 있었다. 이번 시험결과는 일반적으로 항체를 이용한 HI assay결과와 거의 유사한 시험결과를 나타내었으며, hemagglutination inhibition titer역시 높은 값을 보여 녹차의 카테킨층 이외 다른 부산물이 항인플루엔자 효력을 갖고 있음을 기해할 수 있다고 판단된다.

실시예 6-2 Neuraminidase inhibition assay ( NAI )

본 연구는 바이러스의 증식 단계 중 후기 단계에서 항바이러스 예방 소재의 억제 작용 발현 유무를 확인하는 실험이다.

녹차 부산물의 항인플루엔자 바이러스 효능 중 virus budding 저해 여부를 확인하기 위하여 녹차부산물 카테킨층 [GT(BS)-C], 녹차부산물 비카테킨층 fraction 1 [GT(BS)-NC(H)], 녹차부산물 비카테킨층 fraction 2 [GT(BS)-NC(M)]을 10000㎍/㎖부터 1㎍/㎖까지 10배씩 희석한 뒤 인플루엔자 바이러스인 A/NWS/33 (H1N1)을 대상으로 실험을 진행하였다. 우선 virus budding out에 필수적인, 효소 활성을 지닌 neuraminidase activity를 형광 검출법에 의하여 확인을 하였고 이 결과를 이용하여 저해 실험을 진행하였다. (도 5)

본 발명에서 비카테킨층 분획 1 [GT(BS)-NC(H)]은 헥산 분획이고 비카테킨 분획 2 [GT(BS)-NC(M)]는 디클로로메탄층이며 비카테킨 분획 1이 비카테킨 분획 2 보다 더 저극성의 물질이다.

후보물질을 처리하지 않은 well을 음성 대조군(100%)로 설정하여 후보 물질의 농도별 처리 시 어느 정도 neuraminidase activity가 나오는지 확인하였다. 그 결과 녹차 부산물의 카테킨 및 비카테킨층은 인플루엔자 바이러스 neuramindase에 대한 저해효과는 비교적 높은 농도에서 발현되는 것으로 확인되었다. 또한 카테킨 및 비카테킨층 모두가 거의 유사한 neuraminidase activity를 발현함을 확인함으로써 카테킨 외 비카테킨 성분이 항인플루엔자 효능을 보유하고 있음을 다시 한 번 입증하였다.

실시예 7: MDCK ( Madin Darby Canine Kidney ) 세포배양

MDCK 세포는 American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA)에서 구입하였으며, 10 % 우태아혈청 (fetal bovine serum, Gibco, USA)을 첨가한 이글 엠이엠 (Eagle's minimum essential medium: EMEM) 배지를 사용하여, 37℃ 및 5% CO2 배양조건에서 세포를 유지하였다. 항바이러스 효능 스크리닝 시에는 트립신 5 ㎍/㎖, 0.22 % 중조 (NaHCO3), 겐타마이신 (gentamycin) 40 ㎍/㎖를 MEM 배지에 첨가하여 사용하였다.

실시예 8: 뉴트럴 레드 비색분석 ( Neutral red colorimetric assay )

녹차 종류별 추출물의 바이러스 증식억제 효과를 시험하기 위하여 상기 실험방법에서 제조한 60 % 녹차 에탄올 추출물 및 분획을 최종농도가 1000, 320, 100, 32, 10, 3.2, 1, 0.1 ug/ml 되도록 증류수에 희석하여 실험하였다.

96 웰 조직 배양 플레이트 (greiner사, 독일)를 사용하여 한 플레이트 당 두 가지 분획의 유효농도와 세포독성을 세 반복 되게 측정할 수 있도록 하였다. 먼저 유효농도 측정법은 배양세포를 단층으로 배양한 96 웰 조직 배양 플레이트에 시험 할 분획의 희석농도를 3 웰(well)/희석농도로 적용하여 증식억제 시험용 바이러스를 100 TCID50/100ul/well 로 접종한 후, 30분 흡착시킨 후 각 희석 배수별 분획을 100ul씩 첨가 하였다. 대조군은 희석된 녹차 추출물 대신 증류수를 사용하는 점만 다르게 하여 양성 대조군과 음성 대조군을 모두 두었으며 96 웰 조직 플레이트의 정중앙 6개 웰 (well)은 증류수만 첨가하여 blank로 두었다. 접종 후 37 ℃의 CO2 배양기에서 3-4일 동안 배양하며, 매일 현미경으로 세포 변성 효과 (CPE, cytophatic effect) 여부를 관찰하고 접종 4일에 뉴트럴 레드분석(neutral red assay)을 실시하였다.

뉴트럴 레드분석은 세포가 있는 플레이트에 0.034% 의 뉴트럴 레드를 100ul/well 로 첨가 후 호일 등으로 빛을 차단하여 살아있는 세포가 염색액(neutral red)을 흡수할 수 있도록 37℃에서 2시간 동안 반응 후 세포를 PBS로 2회 세척한다. 세포를 완전히 건조시킨 후 100% 에탄올과 소렌슨 시트레이트 버퍼(Sorensen citrate buffer)가 동량 희석된 용액을 200ul/well 되도록 첨가하고 540nm의 파장으로 분광광도계(spectrophotometer, SUNRISE, Tecan, 오스트리아)에서 흡광도값 (Optical density value: OD value)을 측정하였다.

세포독성 측정법은 바이러스 접종 없이 희석농도별 분획만을 첨가하여 유효농도 측정법과 같은 플레이트 내에서 실험하였으며 이 후 실험법은 유효농도 측정법과 동일하게 진행하였다(Donald FS et al., Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 45(3), pp743-748, 2001).

Claims (10)

1. 녹차를 열수 추출하고 남은 녹차 부산물을 메탄올로 추출한 메탄올 추출물을 헥산을 처리하여 헥산층을 얻고 남은 메탄올층을 디클로로메탄을 처리하여 얻어진 디클로로메탄 분획을 유효성분으로 함유하는 인간을 제외한 동물의 인플루엔자 바이러스로 인한 질환의 예방 및 치료용 수의학적 조성물.
2. 삭제
3. 제 1항에 있어서, 상기 질환은 조류독감 또는 변이형 감염성 조류독감인 수의학적 조성물.
4. 녹차를 열수 추출하고 남은 녹차 부산물을 메탄올로 추출한 메탄올 추출물을 헥산을 처리하여 헥산층을 얻고 남은 메탄올층을 디클로로메탄을 처리하여 얻어진 디클로로메탄 분획을 유효성분으로 포함하는 인플루엔자 바이러스로 인한 질환 예방 및 개선용 사료 첨가제.
5. 삭제
6. 제 4항에 있어서, 상기 질환은 조류독감 또는 변이형 감염성 조류독감인 사료 첨가제.
7. 삭제
8. 삭제
9. 녹차를 열수 추출하고 남은 녹차 부산물을 메탄올로 추출한 메탄올 추출물을 헥산을 처리하여 헥산층을 얻고 남은 메탄올층을 디클로로메탄을 처리하여 얻어진 디클로로메탄 분획을 유효성분으로 포함하는 조류독감 또는 변이형 감염성 조류독감 바이러스로 인한 질환의 예방 및 개선용 사료 조성물.
10. 녹차를 열수 추출하고 남은 녹차 부산물을 메탄올로 추출한 메탄올 추출물을 헥산을 처리하여 헥산층을 얻고 남은 메탄올층을 디클로로메탄을 처리하여 얻어진 디클로로메탄 분획을 유효성분으로 함유하는 조류독감 또는 변이형 감염성 조류독감 바이러스로 인한 질환의 예방 및 치료용 약학 조성물.

Images