KR20210003613A - 보리잎 유래 다당 분획물을 유효성분으로 함유하는 인플루엔자 바이러스 감염 질환의 개선, 예방 또는 치료용 조성물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 인플루엔자 바이러스 감염 질환의 개선, 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것으로, 보리잎 유래 다당 분획물을 유효성분으로 함유함으로써 인플루엔자 바이러스 감염 질환을 예방하거나 치료하는 효과가 우수하므로, 인플루엔자 바이러스 감염 질환의 예방 또는 치료를 위한 약학적 조성물 및 식품 등으로 유용하게 활용할 수 있다.

Description

보리잎 유래 다당 분획물을 유효성분으로 함유하는 인플루엔자 바이러스 감염 질환의 개선, 예방 또는 치료용 조성물{A composition for the improving, preventing and treating of influenza virus infection comprising polysaccharide fraction isolated from barley leaf}
본 발명은 보리잎 유래 다당 분획물을 유효성분으로 함유함으로써 인플루엔자 바이러스 감염 질환을 개선, 예방하거나 치료하는 효과가 우수한 조성물에 관한 것이다.
인플루엔자 바이러스는 급성 호흡기 감염질환인 독감의 원인체로 공중보건학적으로 매우 중요하게 여겨지는 병원체 중의 하나이다.
H1N1과 H3N2 아형의 A형 인플루엔자 바이러스와 Victoria와 Yamagata lineage의 B형 인플루엔자 바이러스로 구성되는 계절성 인플루엔자 바이러스(seasonal influenza virus)는 매년 겨울철 유행하며 사람들에게 큰 피해를 입히고 있다. 세계보건기구(WHO)에 따르면, 매년 전세계적으로 약 3백만~5백만 명의 사람들이 계절성 인플루엔자 바이러스에 감염되어 심각한 병증을 겪고, 그 중 약 25만~50만 명의 사람들이 사망하는 것으로 알려져 있다.
인플루엔자 바이러스의 대유행(pandemic)은 더욱 큰 피해를 초래한다. 1918년 발생한 인플루엔자 바이러스 대유행 시 약 5천만 명의 사람이 사망하였으며 1957년과 1968년에 발생한 인플루엔자 바이러스 대유행 시에는 의해 약 백만명의 사람이 사망한 것으로 알려져 있다. 인류는 지난 2009년 신종 인플루엔자 바이러스에 의해 발생한 대유행 시에도 심각한 인적 피해와 경제적 피해 그리고 사회적 혼란을 경험한 바 있었다.
조류인플루엔자 바이러스(avian influenza virus) 역시 심각한 위협으로 여겨지고 있다. 현재까지도 조류인플루엔자 바이러스의 지속적인 사람감염 사례가 보고되고 있다. 특히, 고병원성 H5N1 조류인플루엔자 바이러스의 경우 약 59%, H7N9 조류인플루엔자 바이러스의 경우 약 32%의 높은 치사율을 나타내는 것으로 분석되고 있어 WHO에서 예의주시하고 있는 상황이다.
이러한 인플루엔자 바이러스를 예방하기 위한 가장 효과적인 방법은 백신접종으로 알려져 있지만 백신만으로 인플루엔자 바이러스에 의한 피해를 조절하기에는 한계가 있다. 현재 계절성 인플루엔자 바이러스에 대한 백신을 접종하고 있음에도 불구하고 전세계적으로 매년 25만~50만 명의 사망자가 발행하고 있다.
인플루엔자 백신의 경우, 인플루엔자 바이러스가 갖는 항원성 변이 특성 때문에 그 해 겨울에 유행할 바이러스를 연초에 예측한 뒤 이에 대한 백신을 생산하는 생산체계에 따라 제작된다. 따라서 제작된 백신이 그 해 겨울 유행하는 인플루엔자 바이러스의 항원과 일치하지 않는 상황이 발생 할 수 있으며, 이러한 경우 사람을 인플루엔자 바이러스 감염으로부터 효과적으로 보호하지 못할 수도 있다. 또한 예측하지 못한 시기에 신종인플루엔자 바이러스가 갑작스럽게 유행 할 경우 백신으로는 신속한 초기대응이 어렵다.
항바이러스제의 사용은 이러한 백신의 한계점을 극복할 수 있었다. 실제로 지난 2009년 발생한 신종인플루엔자 바이러스 대유행 시, 충분한 도즈(dose)의 백신이 준비되기 전, 인플루엔자 바이러스 표면 당단백질 중 하나인 neuraminidase (NA)를 억제하는 항바이러스제 (NA inhibitor, NAI)인 oseltamivir (상품명 Tamiflu®)가 효과적인 신종 인플루엔자 바이러스 조절 수단으로 널리 처방되었다. 최근 연구에 따르면, 2009년 당시 oseltamivir의 처방은 신종인플루엔자 바이러스로부터 효과적으로 사람들을 보호한 것으로 분석되었다.
우리나라 역시 국내 기술로 새로운 항바이러스제를 개발해야 할 필요성이 매우 높게 요구되고 있으며, 항바이러스제 개발에 대한 국내 고유의 기술을 축적하고 해외 의존도를 낮추기 위해서 우리나라만의 전통 약제나 식품에서 새로운 항바이러스제 후보물질을 탐색ㆍ발굴하는 연구가 시급히 요구되고 있다.
대한민국 등록특허 제1338319호 대한민국 등록특허 제1077920호
본 발명의 목적은 보리잎 유래 다당 분획물을 유효성분으로 함유하는 인플루엔자 바이러스 감염 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는데 있다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 보리잎 유래 다당 분획물을 유효성분으로 함유하는 인플루엔자 바이러스 감염 질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공하는데 있다.
또한, 본 발명의 또 다른 목적은 감잎 유래 다당 분획물을 유효성분으로 함유하는 인플루엔자 바이러스 감염 질환의 예방 또는 치료를 위한 인간을 제외한 동물용 약학 조성물을 제공하는데 있다.
또한, 본 발명의 또 다른 목적은 보리잎 유래 다당 분획물을 유효성분으로 함유하는 인플루엔자 바이러스 감염 질환의 예방 또는 개선용 사료 조성물을 제공하는데 있다.
또한, 본 발명의 또 다른 목적은 보리잎 유래 다당 분획물을 유효성분으로 함유하는 인플루엔자 바이러스 감염 질환의 예방 또는 개선용 사료 첨가제 조성물을 제공하는데 있다.
상기한 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 인플루엔자 바이러스 감염 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물은 보리잎 유래 다당 분획물을 유효성분으로 함유할 수 있다.
상기 보리잎 유래 다당 분획물은 전체 다당 분획물 대비 중성 다당(neutral sugar) 65 내지 85 중량%, 우론산(uronic acid) 5 내지 30 중량%, KDO(2-keto-3-deoxy-D-manno-octulosonic acid)로 이루어진 KDO 유사 물질 0.5 내지 10 중량%을 포함할 수 있다.
상기 보리잎 유래 다당 분획물은 단백질 0.5 내지 20 중량%를 더 포함할 수 있다.
상기 우론산은 갈락투로닉산(galacturonic acid) 및 글루쿠로닉산(glucuronic acid)으로 이루어진 것이며; 상기 중성 다당은 람노오스, 푸코오스, 아라비노오스, 자일로스, 만노오스, 갈락토오스 및 글루코오스를 포함할 수 있다.
상기 약학적 조성물은 뉴라미니다아제, 바람직하게는 H1N1, H3N2, H4N2, H5N2, H6N2 및 H7N2 뉴라미니다아제 활성을 억제할 수 있다.
상기 인플루엔자 바이러스 감염으로 인한 질환은 독감, 감기, 인후염, 기관지염 및 폐렴으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다.
상기 독감은 조류독감, 돼지독감 및 신종 플루로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다.
상기 다당 분획물은 (a) 보리잎 분말에 펙틴 가수분해 효소를 처리 하는 단계; 및 (b) 상기 효소 처리된 보리잎 분말을 C1 내지 C4의 알코올로 침전시켜 분획물을 회수하는 단계;를 포함하는 제조방법에 의해 제조된 것일 수 있다.
상기 제조방법은 (c) 상기 (b) 단계의 다당 분획물에서 분자량이 30 kDa 이상의 분획물을 회수하는 단계;를 추가로 포함할 수 있다.
또한, 상기한 다른 목적을 달성하기 위한 본 발명의 인플루엔자 바이러스 감염 질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물은 보리잎 유래 다당 분획물을 유효성분으로 함유할 수 있다.
또한, 상기한 또 다른 목적을 달성하기 위한 본 발명의 인플루엔자 바이러스 감염 질환의 예방 또는 치료를 위한 인간을 제외한 동물용 약학 조성물은 보리잎 유래 다당 분획물을 유효성분으로 함유할 수 있다.
상기 동물용 인플루엔자 바이러스 감염 질환은 변이형 감염성 조류독감, 뉴캣슬병 바이러스(newcastle disease virus)로 인한 조류 파라믹소바이러스(Avian paramyxoovirus) 감염증, 개 디스템퍼(Canine distemper) 감염증, 닭 전염성 기관지염 바이러스(infectious broncheitis virus)로 인한 칠면조 코로나 바이러스(Turkey coronavirus) 감염증, 조류 뉴모바이러스(avian pneumovirus)로 인한 조류 뉴모바이러스 감염증, 돼지 생식기 및 호흡 증후군 바이러스(porcine reproductive and respiratory syndrome virus)로 인한 돼지 생식기 및 호흡 증후군 바이러스 감염증, 콕사키 바이러스(coxsakie virus)로 인한 구제역 (Foot-and-mouth disease), 세망내피증 바이러스(reticuloendotheliosis virus)로 인한 조류 백혈병(Avian leukosis), 오제스키 바이러스(aujeszky's disease virus)로 인한 닭 전염성후두기관염(Chicken infectious laryngotrachitis), 아데노 바이러스(adeno virus)로 인한 호흡기 감염증 및 산란저하증(Egg drop syndrome)을 유발하는 동물 아데노바이러스 감염증으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다.
또한, 상기한 다른 목적을 달성하기 위한 본 발명의 인플루엔자 바이러스 감염 질환의 예방 또는 개선용 사료 조성물은 보리잎 유래 다당 분획물을 유효성분으로 함유할 수 있다.
또한, 상기한 다른 목적을 달성하기 위한 본 발명의 인플루엔자 바이러스 감염 질환의 예방 또는 개선용 사료 첨가제 조성물은 보리잎 유래 다당 분획물을 유효성분으로 함유할 수 있다.
본 발명의 보리잎 유래 다당 분획물을 함유하는 인플루엔자 바이러스 감염 질환의 개선, 예방 또는 치료용 조성물은 인플루엔자 바이러스의 뉴라미니다아제 효소 활성을 억제함으로써 인플루엔자 바이러스 감염을 개선, 예방 또는 치료하는 효과가 우수하므로, 인플루엔자 바이러스 감염 질환의 개선, 예방 또는 치료를 위한 약학적 조성물, 식품, 사료 조성물, 사료 첨가제 조성물 등으로 유용하게 활용할 수 있다.
도 1은 실시예 1에 따라 제조된 효소처리 조다당 분획물(BLE-0)의 인플루엔자 바이러스(H1N1) 뉴라미니다아제(Neuraminidase) 활성 억제 시험에 대한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 2는 본 발명의 실시예 1에 따라 제조된 효소처리 조다당 분획물(BLE-0)의 동물 및 사람에서 유래한 다양한 아형의 인플루엔자 바이러스(H3N2, H4N2, H5N2, H6N2, H7N2)에 대한 뉴라미니다아제 활성억제를 나타낸 도면이다.
도 3은 각 그룹별 마우스의 조직에 잔존하는 바이러스의 함량을 역가로 나타낸 그래프이다.
본 발명은 보리잎 유래 다당 분획물을 유효성분으로 함유함으로써 인플루엔자 바이러스 감염 질환을 개선, 예방하거나 치료하는 효과가 우수한 조성물에 관한 것이다.
이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.
본 발명의 인플루엔자 바이러스에 대한 감염을 개선, 예방 또는 치료할 수 있는 조성물은 보리잎 유래 다당 분획물을 유효성분으로 함유한다.
본 발명의 보리잎 유래 다당 분획물은 전체 다당 분획물 대비 중성 다당(neutral sugar)은 65 내지 85 중량%, 우론산(uronic acid)은 5 내지 30 중량%, KDO(2-keto-3-deoxy-D-manno-octulosonic acid)로 이루어진 KDO 유사 물질은 0.5 내지 10 중량%을 포함한다. 또한, 단백질 0.5 내지 20 중량%를 더 포함할 수 있다.
상기 우론산은 갈락투로닉산(galacturonic acid) 및 글루쿠로닉산(glucuronic acid)으로 이루어지며; 상기 중성 다당은 람노오스, 푸코오스, 아라비노오스, 자일로스, 만노오스, 갈락토오스 및 글루코오스를 포함할 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
바람직하게, 상기 중성 다당은 상기 보리잎 유래 다당분획물을 구성하는 전체 중성 다당 대비 자일로스 30 내지 50 mole%, 아라비노오스 10 내지 30 mole%, 갈락토오스 1 내지 20 mole%, 글루코오스 1 내지 10 mole%, 람노오스 1 내지 10 mole%, 만노오스 0.4 내지 10 mole%, 푸코오스 0.1 내지 7 mole%인 중성당류을 포함한다.
본 발명의 보리잎 유래 다당 분획물은 (a) 보리잎 분말에 펙틴 가수분해 효소를 처리 하는 단계; 및 (b) 상기 효소 처리된 보리잎 분말을 C1 내지 C4의 알코올로 침전시켜 분획물을 회수하는 단계;를 포함하는 제조방법에 의해 제조된다.
먼저, 상기 (a) 단계에서는 보리잎 분말에 펙틴 가수분해 효소를 처리한다. 펙틴 가수분해 효소는 보리잎 분말 중량 대비 1 내지 4 중량%로 첨가되고, 바람직하게는 1 내지 3 중량%로 첨가되고, 더욱 바람직하게는 1.5 내지 2.5 중량%로 첨가될 수 있다.
본 발명에서 보리잎은 건조되지 않은 것 또는 건조된 것을 사용할 수 있으며, 분쇄된 것 또는 분말화된 것을 사용할 수 있다. 바람직하게 효소를 처리하는 상기 보리잎 분말은 증류수로 10배 내지 30배(w/v) 정도로 현탁하여 사용할 수 있다.
상기 가수분해 효소 처리는 1 내지 4일 동안 처리하는 것이 바람직하고, 더 바람직하게는 2 내지 3일 일 수 있다.
상기 (a) 단계는 효소 처리 후에 잔존 펙틴 가수분해 효소를 90 내지 100 ℃에서 10 내지 60분 동안 가열하여 효소를 불활성화시키는 공정을 추가로 수행할 수 있다. 상기 가열로 인해 가용성 다당 성분의 용출을 증가시키며, 일부 불순물로 포함되어 있는 고분자 단백질을 변성 및 침전시킴으로써 원심분리에 의한 다당 추출물 획득 및 순도를 증진시킨다.
상기 (a) 단계를 거쳐 수득한 보리잎 추출물은 가수분해 효소 처리하는 과정을 거치기 때문에 보리잎을 그대로 열수추출한 추출물과 비교해 중성다당의 비율이 현저하게 높다. 즉, 상기 방법에 따라 추출된 보리잎 추출물은 다당 분획물을 다량 포함하고 있다.
또한, 상기 (a) 단계 이후에, 가수분해된 보리잎 추출물에서 잔사를 제거하는 단계를 추가로 수행할 수 있다. 상기 잔사를 제거하는 방법은 원심분리, filtration 등 공지의 혼합물로부터 고형분을 제거하는 방법에 의할 수 있으며, 바람직하게는 원심분리에 의할 수 있다.
다음으로, 상기 (b) 단계에서는 상기 효소 처리된 보리잎 가수분해물에 유기용매를 넣어 침전된 다당을 수득한다. 상기 유기용매는 C1 내지 C4의 알코올일 수 있다. 알코올 침전은 공지의 에탄올 침전법에 의할 수 있으며, 상기 에탄올 침전에 사용되는 에탄올은 물과 혼합하여 70% 내지 95%(v/v)의 농도를 가지는 에탄올이 바람직하다.
상기 제조방법은, (c) 상기 (b) 단계 이후에 한외여과 또는 겔 여과 크로마토그래피(gel filtration chromatography)를 이용하여 분자량 30 kDa 이상의 분획물을 회수하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
상기 분획물을 수득하는 방법은 분자량을 기준으로 정제하는 방법이라면 특별히 한정되지 않지만, 바람직하게는 한외여과 또는 겔 여과 크로마토그래피이고, 더욱 바람직하게는 겔 여과 크로마토그래피이다. 또한, 최종 다당 분획물의 형태는 추출물, 농축물, 분말 등일 수 있다.
상기 최종 다당 분획물에 50~100%의 탄소수 1 내지 4의 알코올을 첨가하여 저분자 물질 및 불순물을 제거하여 다당을 정제하는 단계를 추가로 실시할 수 있다.
구제척으로, 본 발명은 상기 펙티나아제(Pectinase)로 처리하고, 탄소수 1 내지 4의 알코올 침전시켜 얻은 보리잎 유래 분획물을 상기와 같은 방법을 이용하여 분자량 30 kDa 이상인 보리잎 유래 조다당 분획물(BLE-0)을 수득하였다.
상기 수득된 보리잎 유래 조다당 분획물(BLE-0)의 구성당을 기체 크로마토그래피로 분석한 결과, 전체 다당 대비 중성다당 74.77 중량%, 우론산 19.37 중량%, 단백질 3.66 중량%, KDO 유사 물질 2.19 중량%이며; 상기 중성 다당의 성분을 분석한 결과, 전체 중성 다당 대비 람노오스 3.84 mole%, 푸코오스 0.6 mole%, 아라비노오스 16.56 mole%, 자일로스 37.27 mole%, 만노오스 1.15 mole%, 갈락토오스 11.10 mole%, 글루코오스 4.25 mole% 인 것을 확인하였다([표 2] 참조).
상기 보리잎 유래 다당 분획물을 유효성분으로 함유하는 조성물로는 인플루엔자 바이러스 감염 질환을 예방 또는 치료할 수 있는 약학 조성물, 인플루엔자 바이러스 감염 질환을 예방 또는 개선할 수 있는 식품 조성물, 인플루엔자 바이러스 감염 질환의 예방 또는 치료를 위한 인간을 제외한 동물용 약학 조성물, 사료 조성물 또는 사료 첨가제 조성물일 수 있다. 상기 조성물은 뉴라미니다아제 억제활성을 갖는 인플루엔자 바이러스의 혈청형에서는 H1N1, H3N2 또는 H5N1이 포함되며, 바람직하게는 H1N1이나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 상기 인플루엔자 바이러스 감염으로 인한 질환은 독감, 감기, 인후염, 기관지염 및 폐렴으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 들 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 구체적으로 상기 독감으로는 조류독감, 돼지독감 및 신종 플루로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 들 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 명세서에서 보리잎을 언급하면서 사용되는 용어 ‘분획물’은 추출용매를 처리하여 얻은 분획물뿐만 아니라 보리잎 유래 다당 분획물의 가공물도 포함한다. 예를 들어, 보리잎 유래 다당 분획물은 감압 증류 및 동결 건조 또는 분무 건조 등과 같은 추가적인 과정에 의해 분말 상태로 제조될 수 있다.
또한, 본 발명의 보리잎 유래 다당 분획물은 광의로는 보리잎을 동물에게 투여할 수 있도록 제형화된 보리잎의 다당 가공물, 예컨대, 보리잎 다당 분말도 포함하는 의미를 갖는다. 비록 본 발명에서 보리잎 유래 다당 분획물로 실험을 진행하긴 하였으나, 보리잎 다당 가공물과 같은 형태로도 목적하는 효과를 달성할 수 있음은 당업자라면 예상 가능할 것이다.
한편, 본 명세서에서 용어‘유효성분으로 함유하는’이란 보리잎 유래 다당 분획물의 효능 또는 활성을 달성하는 데 충분한 양을 포함하는 것을 의미한다. 일예로, 상기 보리잎 유래 다당 분획물은 1 내지 30 mg/kg 바람직하게는 3 내지 20 mg/kg의 농도로 사용된다. 보리잎 유래 다당 분획물은 천연물로서 과량 투여하여도 인체에 부작용이 없으므로 본 발명의 조성물 내에 포함되는 보리잎 유래 다당 분획물의 양적 상한은 당업자가 적절한 범위 내에서 선택하여 실시할 수 있다.
본 발명의 약학 조성물 또는 동물용 약학 조성물은 상기 유효 성분 이외에 약제학적으로 적합하고 생리학적으로 허용되는 보조제를 사용하여 제조될 수 있으며, 상기 보조제로는 부형제, 붕해제, 감미제, 결합제, 피복제, 팽창제, 윤활제, 활택제 또는 향미제 등을 사용할 수 있다.
상기 약학 조성물 또는 동물용 약학 조성물은 투여를 위해서 상기 기재한 유효 성분 이외에 추가로 약제학적으로 허용 가능한 담체를 1종 이상 포함하여 약제학적 조성물로 바람직하게 제제화할 수 있다.
상기 약학 조성물의 제제 형태는 과립제, 산제, 정제, 피복정, 캡슐제, 좌제, 액제, 시럽, 즙, 현탁제, 유제, 점적제 또는 주사 가능한 액제 등이 될 수 있다. 예를 들어, 정제 또는 캡슐제의 형태로의 제제화를 위해, 유효 성분은 에탄올, 글리세롤, 물 등과 같은 경구, 무독성의 약제학적으로 허용 가능한 불활성 담체와 결합될 수 있다. 또한, 원하거나 필요한 경우, 적합한 결합제, 윤활제, 붕해제 및 발색제 또한 혼합물로 포함될 수 있다. 적합한 결합제는 이에 제한되는 것은 아니나, 녹말, 젤라틴, 글루코스 또는 베타-락토오스와 같은 천연 당, 옥수수 감미제, 아카시아, 트래커캔스 또는 소듐올레이트와 같은 천연 및 합성 검, 소듐 스테아레이트, 마그네슘 스테아레이트, 소듐 벤조에이트, 소듐 아세테이트, 소듐 클로라이드 등을 포함한다. 붕해제는 이에 제한되는 것은 아니나, 녹말, 메틸 셀룰로스, 아가, 벤토니트, 잔탄 검 등을 포함한다.
액상 용액으로 제제화되는 조성물에 있어서 허용 가능한 약제학적 담체로는, 멸균 및 생체에 적합한 것으로서, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 알부민 주사용액, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다.
더 나아가 해당분야의 적절한 방법으로 Remington's Pharmaceutical Science, Mack Publishing Company, Easton PA에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화할 수 있다.
본 발명의 약학 조성물 또는 동물용 약학 조성물은 경구 또는 비경구로 투여할 수 있고, 비경구 투여인 경우에는 정맥내 주입, 피하 주입, 근육 주입, 복강 주입, 경피 투여 등으로 투여할 수 있으며, 바람직하게는 경구 투여이다.
본 발명의 약학 조성물 또는 동물용 약학 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자(또는 치료 대상 동물)의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하며, 보통으로 숙련된 의사는 소망하는 치료 또는 예방에 효과적인 투여량을 용이하게 결정 및 처방할 수 있다. 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 약제학적 조성물의 1일 투여량은 0.001-10 g/㎏이다.
본 발명의 약학 조성물 또는 동물용 약학 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.
또한, 본 발명은 보리잎 유래 다당 분획물을 유효성분으로 함유하는 인플루엔자 바이러스 감염 질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 식품 조성물은 상기 약제학적 조성물과 동일한 방식으로 제제화되어 기능성 식품으로 이용하거나, 각종 식품에 첨가할 수 있다. 본 발명의 조성물을 첨가할 수 있는 식품으로는 예를 들어, 음료류, 알코올 음료류, 과자류, 다이어트바, 유제품, 육류, 초코렛, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류, 비타민 복합제, 건강보조식품류 등이 있다.
본 발명의 식품 조성물은 유효성분으로서 보리잎 유래 다당 분획물뿐만 아니라, 식품 제조 시에 통상적으로 첨가되는 성분을 포함할 수 있으며, 예를 들어, 단백질, 탄수화물, 지방, 영양소, 조미제 및 향미제를 포함한다. 상술한 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스, 올리고당 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 사이클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 향미제로서 천연 향미제 [타우마틴, 스테비아 추출물 (예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등)] 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 사용할 수 있다. 예컨대, 본 발명의 식품 조성물이 드링크제와 음료류로 제조되는 경우에는 본 발명의 보리잎 유래 다당 분획물 이외에 구연산, 액상과당, 설탕, 포도당, 초산, 사과산, 과즙, 및 각종 식물 추출액 등을 추가로 포함시킬 수 있다.
본 발명은 상기 보리잎 유래 다당 분획물을 유효성분으로 포함하는 식품 조성물이 함유된 건강기능식품을 제공한다. 건강기능식품이란, 보리잎 유래 다당 분획물을 음료, 차류, 향신료, 껌, 과자류 등의 식품소재에 첨가하거나, 캡슐화, 분말화, 현탁액 등으로 제조한 식품으로, 이를 섭취할 경우 건강상 특정한 효과를 가져오는 것을 의미하나, 일반 약품과는 달리 식품을 원료로 하여 약품의 장기 복용시 발생할 수 있는 부작용 등이 없는 장점이 있다. 이와 같이 하여 얻어지는 본 발명의 건강기능식품은, 일상적으로 섭취하는 것이 가능하기 때문에 매우 유용하다. 이와 같은 건강기능식품에 있어서의 보리잎 유래 다당 분획물의 첨가량은, 대상인 건강기능식품의 종류에 따라 달라 일률적으로 규정할 수 없지만, 식품 본래의 맛을 손상시키지 않는 범위에서 첨가하면 되며, 대상 식품에 대하여 통상 0.01 내지 50 중량%, 바람직하기로는 0.1 내지 20 중량%의 범위이다. 또한, 환제, 과립제, 정제 또는 캡슐제 형태의 건강기능식품의 경우에는 통상 0.1 내지 100 중량% 바람직하기로는 0.5 내지 80 중량%의 범위에서 첨가하면 된다. 한 구체예에서, 본 발명의 건강기능식품은 환제, 정제, 캡슐제 또는 음료의 형태일 수 있다.
또한, 본 발명은 보리잎 유래 다당 분획물을 유효성분으로 함유하는 인플루엔자 바이러스 감염 질환의 예방 또는 개선용 사료 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 보리잎 유래 다당 분획물을 유효성분으로 함유하는 인플루엔자 바이러스 감염 질환의 예방 또는 개선용 사료 첨가제 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 인플루엔자 바이러스 감염 질환의 개선, 예방 또는 치료용 의약 또는 식품의 제조를 위한 보리잎 유래 다당 분획물의 용도를 제공한다. 상기한 바와 같이 보리잎 유래 다당 분획물은 인플루엔자 바이러스 감염 질환의 개선, 예방 또는 치료를 위한 용도로 이용될 수 있다.
또한, 본 발명은 포유동물에게 유효량의 보리잎 유래 다당 분획물을 투여하는 것을 포함하는 인플루엔자 바이러스 감염 질환의 개선, 예방 또는 치료방법을 제공한다.
여기서 사용된 용어 “포유동물”은 치료, 관찰 또는 실험의 대상인 포유동물을 말하며, 바람직하게는 인간을 말한다.
또한, 상기 ‘인간을 제외한 동물’은 돼지, 소, 염소 등의 포유류: 잉어, 금붕어 등의 어류: 및 꿩, 닭, 오리, 칠면조 등의 가금류를 포함한다.
본 발명은 보리잎 유래 다당 분획물을 유효성분으로 포함하는 인플루엔자 바이러스 감염 질환의 예방 또는 개선용 사료 조성물을 제공한다.
상기 ‘사료 조성물’은 유효성분으로 보리잎 유래 다당 분획물 이외에, 식품의 기준 및 규격(‘식품공전’)에 기재된 식품으로 사용가능한 식품 원료, 식품첨가물 공전에 기재된 식품첨가물을 사용할 수 있고, 식품으로 사용가능한 식품 원료 또는 식품첨가물이 아니더라도 ‘사료 등의 기준 및 규격’ 별표 1의 단미사료의 범위에 해당하는 원료, 별표 2의 보조사료의 범위에 해당하는 원료를 사용할 수 있다.
상기 ‘사료 조성물’은 ‘사료 등의 기준 및 규격’에 따른 보조사료 중 추출제일 수 있고, 상기 보조사료를 포함하는 배합사료일 수 있다.
상기 보리잎 유래 다당 분획물을 유효성분으로 사료 조성물을 제조하는 경우 보리잎 유래 다당 분획물은 인플루엔자 바이러스 감염 질환의 예방 또는 개선 효능을 나타내는 함량이면 특별히 한정할 필요는 없으나, 예를 들어 0.1 내지 99 중량%, 0.5 내지 95 중량%, 1 내지 90 중량%, 2 내지 80 중량%, 3 내지 70 중량%, 4 내지 60 중량%, 5 내지 50 중량%로 포함될 수 있다.
상기 사료 조성물에서 유효성분인 보리잎 유래 다당 분획물은 섭취 동물의 상태, 체중, 질병의 유무나 정도 및 기간에 따라 다르지만, 통상의 기술자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 예들 들어 1일 투여량을 기준으로 1 내지 5,000 mg, 바람직하게는 5 내지 2,000 mg, 더욱 바람직하게는 10 내지 1,000 mg, 더더욱 바람직하게는 20 내지 800 mg, 가장 바람직하게는 50 내지 500 mg일 수 있고, 투여 횟수는 특별히 한정할 필요는 없으나 1일 3회 내지 1주일에 1회의 범위 내에서 통상의 기술자가 조절할 수 있다. 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 범위 이하일 수 있다.
여기에서 사용된 용어 “유효량”은 연구자, 수의사, 의사 또는 기타 임상의에 의해 생각되는 조직계, 동물 또는 인간에서 생물학적 또는 의학적 반응을 유도하는 유효 성분 또는 약학적 조성물의 양을 의미하는 것으로, 이는 해당 질환 또는 장애의 증상의 완화를 유도하는 양을 포함한다. 본 발명의 유효 성분에 대한 유효량 및 투여횟수는 원하는 효과에 따라 변화될 수 있다. 그러므로 투여될 최적의 투여량은 당업자에 의해 쉽게 결정될 수 있으며, 질환의 종류, 질환의 중증도, 조성물에 함유된 유효성분 및 다른 성분의 함량, 제형의 종류, 및 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로 및 조성물의 분비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자에 따라 조절될 수 있다. 본 발명의 예방, 치료 또는 개선 방법에 있어서, 성인의 경우, 보리잎 유래 다당 분획물을 1일 1회 내지 수회 투여 시, 0.001 g/kg 내지 10 g/kg의 용량으로 투여하는 것이 바람직하다.
본 발명의 치료방법에서 보리잎 유래 다당 분획물을 유효 성분으로 포함하는 조성물은 경구, 직장, 정맥내, 동맥내, 복강내, 근육내, 흉골내, 경피, 국소, 안구내 또는 피내 경로를 통해 통상적인 방식으로 투여할 수 있다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시하나, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범주 및 기술사상 범위 내에서 다양한 변경 및 수정이 가능함은 당업자에게 있어서 명백한 것이며, 이러한 변형 및 수정이 첨부된 특허청구범위에 속하는 것도 당연한 것이다.
실시예 1. 보리잎 유래 조다당 분획물(BLE-0)
보리(Barley grass)는 전남 영광에서 생산된 것으로 ㈜새뜸원에서 구입하여 사용하였다.
분말 보리를 증류수 20~30배(w/v) (pH 4) 에 현탁하여, pectinase(Rapidase C80MAX, 비전비이오켐)를 원료당 1~3%로 첨가한 후, 50 ℃ 순환 또는 교반반응기r에서 3일간 효소 처리하였다. 그 후 상기 효소 처리 반응액을 90~100℃에서 30~60분간 가열처리하여 잔존 pectinase를 불활성화시켰다.
상기 효소 처리를 마친 상기 시료를 4 ℃, 6,500×g, 15분 원심분리하여 잔사를 제거하고, 여기에 4배 부피(v/v)의 에탄올을 가하여 4시간 동안 정치하면서 다당을 침전시켰다. 침전된 다당을 회수하였고, 이후 침전된 다당을 소량의 증류수에 용해시킨 후 투석막(MWCO 6000~8000)을 이용하여 저분자 물질들을 제거한 뒤, 효소처리 다당 분획물(BLE-0)을 얻었다.
비교예 1. 보리잎 유래 조다당 분획물(BLW-0)_비효소처리(열수추출)
분말 보리를 증류수 20~30배(w/v)에 현탁하여 100 ℃에서 3시간동안 가열처리하였다. 열수추출액을 4 ℃, 6,500×g, 15분으로 원심분리 후, 상등액을 분리하여 상등액의 4배 부피(v/v)의 에탄올을 가하여 4시간동안 정치하면서 다당을 침전시켰다. 침전된 다당에 투석(MWCO 6,000~8,000)을 행하여 열수추출 조다당 분획물(BLW-0)을 수득하였다.
<시험예>
시험예 1. 분획물의 구성당 분석
구성당 분석은 Albersheim 등의 방법을 일부 변형하여 가수분해 후 각 구성당을 알디톨 아세테이트(alditol acetate)와 aldonolactone로 유도체화 하여 GC(Gas Chromatography ACME-6100, Young-Lin Co. Ltd. Anyang, Korea)를 이용하여 분석하였다. 다당 시료를 2 M TFA(trifluroacetic acid) 중에서 121 ℃, 1.5 hr 반응시켜 가수분해한 후, 1 ㎖의 1 M NH4OH (ammonia solution)에 용해하여 10 ㎎의 NaBH4로 4 hr 환원시켰다. Acetic acid를 적당량 가하여 잔존 NaBH4를 제거한 후, 메탄올을 가하며 반복 건조함으로써 과량으로 가해진 아세트산을 제거하여 각 구성당에 상당하는 알디톨(alditol)로 전환하였다. 중성당의 구성을 알기 위해 각각의 알디톨(alditol)에 1 ㎖의 아세트산 무수물(acetic anhydride)을 가하여 121 ℃에서 30 min 동안 반응시켜 알디톨 아세테이트(alditol acetate)로 전환시켰으며 이를 클로로포름/H2O 2상 용매계로 분리하여 추출하고, 추출물은 건조 후 소량의 아세톤에 용해하여 GC 분석용 시료로 사용하였다.
또 산성당의 구성을 분석하기 위하여 전환된 알디톨(alditol)을 증류수에 녹인 뒤, Sep-pak QMA Cartridge(Waters, Milford, MA, USA)에 전개하고 1 M HCl로 aldonic acid를 분리하였다. 분리한 용액에 2 M TFA를 가하여 100 ℃에서 5 min간 반응시켜 aldonolactone으로 전환시켰다. 그 후 클로로포름/H2O 2상 용매계로 분리하여 추출하고, 건조하여 GC 분석 시료로 사용하였으며, GC column은 SP-2380 capillary column(0.25 ㎜×30 m, 0.2 ㎛ film thickness, Supelco, Bellefonte, PA, USA)을, detector는 Flame ionization detector(FID, Young-Lin Co. Ltd.)를 사용하였고, carrier gas로서 N2를 1.5 ㎖/min 으로 흘렸다. Injection 온도 250 ℃, detector 온도 270 ℃, Column 온도는 60 ℃에서 220 ℃까지 30 ℃/min, 220 ℃에서 250 ℃까지 8 ℃/ min의 조건하에서 실험하였다([표 1] 참조). 각 구성당의 mole%는 각 유도체의 피크(peak) 면적비, flame ionization detector(FID)에 대한 반응계수 및 각 구성당의 알디톨 아세테이트(alditol acetate) 유도체의 분자량으로부터 계산하였다.
Apparatus GC ACME - 6100 (Young - Lin Co. Ltd., Anyang, Korea)
Detector Flame ionization detector(FID) (Young - Lin Co. Ltd., Anyang, Korea)
Column SP-2380 capillary column (Supelco, Bellefonte, USA)
Column size 0.25mm × 30m, 0.2m film thickness
Oven temp. 60℃(1min) → 220℃(12min) → 250℃(15min) 30℃/min 8℃/min
Injector temp. 250℃
Detector temp. 270℃
Carrier gas N2(1.5mL/min)
그 결과, 보리잎으로부터 열수추출 다당분획물(BLW-O)과 RAPIDASE C80MAX(Pectinase) 효소처리 다당분획물(BLE-0)의 주요성분 함량과 구성당 조성 등의 이화학적 특성을 분석한 결과 하기 표 2와 같았다.
Chemical composition
(단위: 중량%)		 실시예 1(BLE-0) 비교예 1 (BLW-0)
Neutral sugar 74.77 ± 5.07 42.22 ± 4.60
Uronic acid 19.37 ± 0.47 44.64 ± 2.27
Protein 3.66 ± 0.53 11.54 ± 0.76
KDO - liked material 2.19 ± 0.22 1.60 ± 0.11
Composition of Sugar (단위: mole%)
Rhamnose 3.84 ± 0.04 2.60 ± 0.05
Fucose 0.60 ± 0.02 -
Arabinose 16.56 ± 0.13 15.71 ± 0.20
Xylose 37.27 ± 0.07 5.39 ± 0.06
Mannose 1.15 ± 0.05 -
Galactose 11.10 ± 0.11 14.78 ± 0.09
Glucose 4.25 ± 0.07 3.75 ± 0.13
GalA+GlcA 19.37 ± 0.47 44.64 ± 2.27
* 상기 표에서 KDO는 2-keto-3-deoxy-D-manno-octulosonic acid를 의미하며 “GalA+GlcA”는 galaturonic acid와 glucuronic acid의 합을 의미하는 것으로 상기 우론산(Uronic acid)을 구성한다.
* 상기 표에서 당 구성(sugar composition)은 alditol acetates derivative 방법을 이용하여 분석하였다.
* 상기 chemical component의 함량비(%)는 건조 샘플 내의 비율을 나타낸 것이다.
* 상기 mole%는 검출된 총 중성당의 양으로부터 계산한 것이다.
다당분획들의 일반구성 및 구성당 분석결과, 효소처리되지 않은 고분자 다당분획인 비교예 1(BLW-0)는 중성당(42.22%)과 산성당(44.64%)이 거의 1:1로 존재하는 산성다당분획으로 나타났으나, 효소처리된 고분자 다당분획인 실시예 1(BLE-0)는 산성당(19.37%)과 함께 단백질(3.66%)의 함량이 급격히 감소된 중성다당 분획으로 분석되었다(표 2).
이는 pectinase가 주된 활성인 시판 RapidaseTM 의 효소작용을 받아 보리잎 유래 고분자 다당 분획 중에서 주로 homogalacturonan(HG)을 구성하고 있는 polygalacturonan[(α-D-galacturonic acid)n]이 분해되어 투석과정으로 제거되었을 것으로 사료되며, 또한 구성당의 조성에서도 실시예 1(BLE-0)는 주로 xylose, arabinose 및 galactose(36.09, 16.04 및 10.74%)를 비롯하여 소량의 rhamnose를 포함하고 있어 pectin류의 rhamnogalacturonan I(RG-I)을 구성하고 있는 arabinogalactan 외에도 hemicellulose류로 구분되는 arabinoxylan의 존재 가능성을 강하게 추론해 볼 수 있었다.
시험예 2. in vitro 항인플루엔자 효능 시험
인플루엔자 바이러스 H1N1에 대한 항바이러스 효과를 측정하기 위해 개의 신장세포주인 MDCK(Madin-Darby canine kidney, ATCC: CCL-34)를 이용하여 다음과 같은 in vitro 실험을 수행하였다. 96 well microplate에 MDCK 세포를 각 well 당 1×105/well이 되도록 넣고 배지 EMEM(penicillin 100 units, streptomycin 100 ㎍, 10% FBS)로 배양하였다. MDCK 세포가 monolayer가 되면 항생제만 포함된 EMEM 배지로 2회 세척하였다. H1N1주를 100TCID50이 되도록 희석하여 EP 튜브에 담아 두고, 여기에 희석한 다당소재 물질을 농도별로 각 튜브에 넣은 후 4 ℃에서 1시간 동안 반응 시켰다. 1시간 후 상기 반응액을 미리 세척한 MDCK 세포에 한 농도 당 3 well씩 각각 접종하여 35 ℃에서 1시간 동안 배양하였다. 1시간 후 플레이트의 배지를 모두 제거하고 PBS로 1회 세척 후, 항생제와 10 ㎍/mL 트립신이 첨가된 EMEM 배지를 각 well에 100 ㎕씩 분할하고 37℃에서 48~72시간 배양하였다. 감염+비투여 대조군에서 완전히 세포변성효과(Cytopathic effect, CPE)가 나올 때까지 48~72시간 배양하였고, 도립현미경으로 매일 세포 상태를 관찰하였다. 일반적으로 대조군에 비해 바이러스 방출이 50% 감소되는 농도는 EC50(50% effective concentration), 세포의 생존이 50% 감소되는 농도는 CC50(50% cytotoxic concentration)이다. SI(selectivity index, 선택지수)는 CC50/EC50로서 SI 값이 클수록 바이러스 증식억제 효과가 크다.
구분 CC50(㎎/㎖)a EC50(㎎/㎖)b SIc
실시예 1 4.69±1.10 4.69±2.87 1
비교예 9.32±2.10 15.69±1.79 0.59
위 표 3에 나타난 바와 같이, 본 발명의 실시예 1에 따라 제조된 효소처리 조다당 분획물(BLE-0)은 비교예1의 열수추출 조다당 분획물(BLW-0)에 비하여 큰 SI 값을 가져 바이러스 증식 억제효과가 있음을 확인하였다.
시험예 3. 뉴라미니다아제(Neuraminidase) 저해활성 측정
효소처리 조다당 분획물(BLE-0)의 인플루엔자 억제효능을 나타내는 기전을 연구하였다. Neuraminidase 활성억제시험은 인플루엔자 바이러스와 같이 바이러스의 증식에 바이러스 표면의 Neuraminidase(NA) 단백질 시스템을 이용하는 바이러스들에 대한 항바이러스 활성을 측정하는 한 가지의 지표로써 사용된다. Neuraminidase 활성억제시험은 WHO (Standard operating procedure WHO-025)에서 추천하는 방법에 준하여 실시하였다.
본 실험에서 사용할 바이러스는 사람 유래 바이러스(H1N1)의 IC50으로 사용하여 농도별로 효소억제활성을 조사하였다. 농도별 시료액와 바이러스액과 실온에서 45분간 반응한 후 MUNANA 기질(Methylumbellifery1)-α-D-N-acetylneuraminic acid; sigma)을 첨가한 후 37 ℃, 1시간 반응시킨 다음, 정지액을 첨가한 후 spectrofluorophotometer(ABI/Perkin Elmer Biosystems)로 Ex. 360nm/Em. 440nm에서 fluorescence를 측정하여 효소활성억제 여부를 조사하였다. 시료를 첨가하지 않은 대조군으로 측정한 fluorescence 값을 100%로 산정하였다.
[수학식 1]
저해활성 (%) = [샘플 + 바이러스 처리군(O.D) 값 - 샘플 + 바이러스 비처리군(O.D) 값] / 샘플 + 바이러스 비처리군(O.D) 값 - 샘플 비처리 + 바이러스 비처리군(blank O.D) 값] × 100
구분 실시예 1(BLE-O) 비교예 1(BLW-O)
저해활성
(%)		 0.01 mg/ml 10.0 2.7
0.1 mg/ml 20.7 12.0
1 mg/ml 30.9 21.2
10 mg/ml 81.2 30.5
위 표 4 및 도 1에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 실시예 1에 따라 제조된 조다당 분획물은 비교예 1의 조다당 분획물에 비하여 우수한 뉴라미니다아제 효소 저해활성을 나타냄을 확인하였다.
이는 본 발명 실시예 1의 보리잎 조다당 분획물이 인플루엔자 바이러스의 활성을 억제함으로써 인플루엔자 바이러스 감염 질환의 예방 또는 치료에 사용될 수 있음을 의미한다.
도 2는 본 발명의 실시예 1에 따라 제조된 조다당 분획물의 동물 및 사람에서 유래한 다양한 아형의 인플루엔자 바이러스(H3N2, H4N2, H5N2, H6N2, H7N2)에 대한 뉴라미니다아제 활성억제를 나타낸 도면이다.
상기 도 2에 나타난 바와 같이, 본 발명의 실시예 1에 따라 제조된 조다당 분획물은 농도 의존적으로 모든 인플루엔자 바이러스(H3N2, H4N2, H5N2, H6N2, H7N2)에 대한 뉴라미니다아제 활성억제를 나타냄을 확인하였다.
시험예 4. 동물실험
실험동물
Balb/c 마우스 7주령 암컷을 사용하였고, 투여된 바이러스의 경우 안전성이 확보되어 있으나, 다른 설치류의 감염을 우려하여 네거티브(negative) 사육 시스템을 사용해 다른 동물과의 접촉을 차단하였다. 바이러스의 분리, 동정, 역가계산 및 투여는 그 안전성을 확보하기 위하여 준비된 특수 클린벤치(clean bench)에서 실시하였으며, 바이러스 소독을 위한 특수 소독제를 이용하여 실험 전후 소독을 실시하였다. 체중에 직접적인 영향을 줄 수 있는 사료급여 관리는 매일 사료의 양을 판단하여 급여함으로써 급식에 제한이 발생하지 않도록 하였다. 체중에 영향을 줄 수 있는 요소를 최대한 통제한 상태에서 주단위로 일정한 시간에 개체별 체중을 측정하였다. 측정된 개체별 결과의 비교를 통한 처리군별 증체에 미치는 효과 판단은 처리군별 평균값을 대상으로 실시하였다. 조명은 12시간 주기로 교체하였고, 물과 사료를 자유롭게 먹도록 하였다. 기타 동물 사육과 관련되는 사항은 전북대학교 동물실험 윤리위원회(National Association of Laboratory Animal Care) 규정에 의거하여 동물실험을 수행하였다.
실시예 1의 항인플루엔자 효능을 평가하기 위해서 실시예 1의 분획물을 농도별(50 mg/kg/d, 100 mg/kg/d 및 200 mg/kg/d)로 14일간 경구로 투여하였다. 인플루엔자 바이러스 공격접종은 에테르를 이용하여 마취를 한 뒤, 인플루엔자 바이러스 H1N1을 비치사량 감염모델 (LD0 : 임상증상 100%, 폐사율 0%)로 비강을 통해 접종을 실시하였다. 본 실험에서 사용된 음성 대조군(negative control)은 phosphate-buffered saline (PBS) 투여 + H1N1 비감염 그룹이고, 바이러스 대조군(virus control)은 phosphate-buffered saline (PBS) 투여 + H1N1 감염 그룹이다.
-5개 군의 마우스-
1군(음성 대조군): PBS 투여 + H1N1 바이러스 비감염
2군(바이러스 대조군): PBS 투여 + H1N1 바이러스 감염
3군(BLE0-50): 조다당 분획물(BLE-0) 50 mg/kg 투여 + H1N1 바이러스 감염
4군(BLE0-100): 조다당 분획물(BLE-0) 100 mg/kg 투여 + H1N1 바이러스 감염
5군(BLE0-200): 조다당 분획물(BLE-0) 200 mg/kg 투여 + H1N1 바이러스 감염
시험예 4-1. 폐내 바이러스 역가
마우스를 희생시킨 후 마우스의 폐내에 잔존하는 바이러스의 함량을 측정하였다. 마우스의 폐조직을 분리하여 PBS로 첨가하여 조직유제를 한 후 유제액을 10일령 SPF 종란의 요막강 내로 계란당 0.1 ml씩 접종한 후, 37 ℃ 부란기에서 넣고 48시간과 72시간 동안 배양하였다. 희석액당 최소 5개 종란에 접종하여 48시간과 72시간 동안 배양한 후 바이러스의 감염 역가는 종란 계태아의 50%를 감염시키는 바이러스액 희석배수의 역수(Embryo infective dose; EID50)로 표시하였으며, Reed & Muench의 방법에 따라 산출하였다 (참조 문헌 : Reed, L, J,. Muench, H. : A simple method of estimating fifty per cent endpoints. Am. J. Hyg. 27, 493-497(1938)).
도 3에 도시된 바와 같이, virus control 군은 negative control 군에 비해 EID50이 현저하게 상승한 것을 확인하였다. 효소처리 조다당 분획물(BLE-0)을 200 ㎎/㎏을 투여한 군의 경우 EID50이 negative control군과 유사한 수준으로 감소하였음을 확인하였다.
시험예 5. 복귀돌연변이 독성시험
상기 실시예 1에 따라 제조된 조다당 분획물(BLE-0)의 복귀돌연변이 시험에 의한 독성을 확인하기 위하여 하기와 같이 문헌에 기재된 Maron과 Ames(1983)이 제시한 방법을 일부 수정하여 실험하였다(Maron, D.M. and Ames B.N. (1983) Revised methods for the Salmonella mutagenicity test, Mutat. Res. 113: 173-215).
특정성분들에 대한 돌연변이 유발성 검색을 위해서 균주(Salmonella typhimurium) TA98, TA100, TA1535, TA1537 균주를 사용하였다. 시험물질의 처리는 대사활성 효소계(S-9 mix)가 적용 또는 미적용된 직접 플레이트 삽입(direct plate incorporation) 방법으로 하였다. 복귀돌연변이 시험에 사용한 Salmonella typhimurium TA98 균주는 Molecular Toxicology Inc.(USA)에서 구입하였다. 균주는 냉동 보관 되어있는 시험균주 용액 50 μL를 25 mL의 액체배지(2.5% Oxoid Nutrient broth No. 2)에 접종해 진탕 배양기(shaking incubator, VS-8480SFN, (주) 비젼과학)를 이용하여 37 ℃에서 약 10 시간 배양한 후 사용하였다. 최소배지 (minimal glucose agar plate)는 1.5% Bacto agar(214010, BD Difco)와 Vogel-Bonner medium E 및 2% glucose를 함유해서 만들었고 톱 아가(top agar)는 0.6% agar와 0.5% NaCl로 조제하였으며, 톱 아가(top agar)에는 0.05 mM의 histidine(43011, Fluka)-biotin(47868, Supelco)을 첨가하였다.
고압증기 멸균한 톱 아가(top agar)를 건조 배쓰(dry bath, 11-718-4, Fisher Scientific)에서 45 ℃로 예열한 멸균 tube에 2 mL 씩 분주한 다음, 시험물질 용액 0.1 mL과 균배양액 0.1 mL을 톱 아가에 혼합하고 즉시 진탕 혼합기(vortex mixer, 37600, Thermolyne)로 2~3초간 진탕하여 최소배지(minimal glucose agar plate)에 부어 여러 방향으로 기울여 고루 퍼지게 하여 굳게 하였다. 부형제군(음성대조군)은 시험물질 용액 대신 부형제 0.1 mL을, 양성대조군은 양성대조물질 용액(2-Aminoanthracene (2AA), 규격 : Sigma A1381)을 같은 방법으로 가하여 실시하였다. 톱 아가가 굳은 후 플레이트 뚜껑을 닫은 상태에서 플레이트를 뒤집어 37 ℃에서 약 48 시간 배양 후 집락을 계수하였다.
균주 대사활성
효소계		 복귀돌연변이 균수/plate
0 μg/plate 500 μg/plate 1000 μg/plate
TA98 -S9 20±1 23±0 18±4
+S9 24±3 24±1 21±0
TA100 -S9 135±6 140±8 121±6
+S9 145±4 134±5 142±6
TA1535 -S9 12±1 9±1 13±3
+S9 12±1 11±1 12±1
TA1537 -S9 12±1 10±1 11±1
+S9 14±1 9±1 11±2
위 표 3에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 실시예 1에 따라 제조된 조다당 분획물(BLE-0)은 본 시험 조건하에서 사용한 균주에 대해 복귀돌연변이를 유발하지 않는 것으로 확인되었다.
시험예 6. Chinese Hamster Lung(CHL) 세포를 이용한 체외 염색이상시험
상기 실시예 1에 따라 제조된 조다당 분획물(BLE-0)이 배양한 Chinese Hamster Lung(CHL) 세포의 염색체에 구조적 혹은 수적 이상을 유발하는지 확인하는 실험으로서, Chinese hamster lung (CHL) 세포를 이용하여 대사활성계 적용 및 비적용 하에 염색체이상시험을 수행하였다. 대사활성계로는 Aroclor-1254로 유도한 랫드의 간균질액에 보효소(cofactor)를 첨가한 것을 사용하였다.
시험물질은 생리식염 주사액에 현탁하여 처리하였다. 최고농도는 Relative Increased Cell Count(RICC)를 세포독성의 지표로 하여 결정하였다. 음성(부형제)대조군 및 양성대조군을 포함하여 다음 표와 같이 농도군을 설정하였으며, 농도군당 1 개의 플라스크를 사용하였다.
활발히 증식 중인 세포를 분리하여, 배양면적 25 cm2의 플라스크에 5 x 104 세포를 5 mL의 배양액에 파종하여 약 3 일간 배양한 후 시험물질을 처리하였다. 처리개시로부터 24 시간 후에 염색체 검체를 제작하여, 농도군당 150 개의 중기상으로부터 염색체이상을 계수하였다.
대사활성계 적용 6시간 처리
플라스크로부터 세포를 분리, 계수하여 얻은 세포 수로 다음 수식에 의해 Relative Increased Cell Count (RICC)를 산출하여 세포독성의 지표로 하였다.
[수학식 1]
Figure pat00001
S9 농도
(μg/mL)		 세포수 RICC(%) 이상중기상
(%)		 PP+ER(%)
+ 0 6388±123 100 0.00 0.00
31.25 6224±50 96 0.00 0.00
62.5 6297±139 98 0.00 0.00
125 5932±33 89 0.00 0.00
250 5943±17 89 0.00 0.00
500 6086±11 93 0.00 0.00
1000 5675±68 83 0.00 0.00
Benzo[a]pyrene 4418±246 52 34.00 0.00
시험물질 500 μg/mL 이상 농도군에서 혼탁이 관찰되었다.위 표 4에 나타낸 바와 같이, 구조적 이상중기상의 빈도(이하 gap 제외)는 음성대조군, 시험물질 31.25, 62.5, 125, 250, 500 및 1000 μg/mL 순으로 0.00, 0.00, 0.00, 0.00, 0.00, 0.00, 및 0.00%로, 시험물질을 처리한 모든 농도군에서 음성대조군에 비해 통계학적으로 유의한 증가를 나타내지 않았고, 용량상관성이 없었다. 수적이상을 가진 중기상의 빈도는 음성대조군 및 모든 시험물질 처리군에서 모두 0.00%로, 시험물질을 처리한 모든 농도군에서 음성대조군에 비해 통계학적으로 유의한 증가를 나타내지 않았고, 용량상관성이 없었다.
양성대조군에서는 구조적 이상을 가진 중기상의 빈도(34.00%)에서 통계학적으로 유의한 증가가 관찰되었다(P<0.01).
대사활성계 비적용 6시간 처리
S9 농도
(μg/mL)		 세포수 RICC(%) 이상중기상
(%)		 PP+ER(%)
- 0 8694±16 100 0.00 0.00
31.25 7894±55 88 0.00 0.00
62.5 7882±109 87 0.00 0.00
125 8097±7 91 0.00 0.00
250 8043±57 90 0.00 0.00
500 7963±109 89 0.00 0.00
1000 7206±3 77 0.00 0.00
4-Nitroquinoline-1-oxide 0.4 7306±26 78 12.00 0.00
위 표 5에 나타낸 바와 같이, 구조적 이상중기상의 빈도는 음성대조군, 시험물질 31.25, 62.5, 125, 250, 500 및 1000 μg/mL 순으로 0.00, 0.00, 0.00, 0.00, 0.00, 0.00 및 0.00% 로서, 시험물질을 처리한 모든 농도군에서 음성대조군에 비해 통계학적으로 유의한 증가를 나타내지 않았고, 용량상관성이 없었다. 수적이상을 가진 중기상의 빈도는 음성대조군 및 모든 시험물질 처리군에서 모두 0.00%로서, 시험물질을 처리한 모든 농도군에서 음성대조군에 비해 통계학적으로 유의한 증가를 나타내지 않았고, 용량상관성이 없었다.
양성대조군에서는 구조적 이상을 가진 중기상의 빈도(12.00%)에서 통계학적으로 유의한 증가가 관찰되었다(P<0.01).
대사활성계 비적용 24시간 처리
S9 농도
(μg/mL)		 세포수 RICC(%) 이상중기상
(%)		 PP+ER(%)
- 0 7642±51 100 0.00 0.00
31.25 7758±6 102 0.00 0.00
62.5 7527±3 98 0.00 0.00
125 7598±52 99 0.00 0.00
250 7227±44 92 0.00 0.00
500 6238±29 74 0.00 0.00
1000 5941±50 68 0.00 0.00
4-Nitroquinoline-1-oxide 0.4 6951±30 87 13.33 0.00
위 표 6에 나타낸 바와 같이, 구조적 이상중기상의 빈도는 음성대조군, 시험물질 31.25, 62.5, 125, 250, 500 및 1000 μg/mL 순으로 0.00, 0.00, 0.00, 0.00, 0.00, 0.00 및 0.00% 로서, 시험물질을 처리한 모든 농도군에서 음성대조군에 비해 통계학적으로 유의한 증가를 나타내지 않았고, 용량상관성이 없었다. 수적이상을 가진 중기상의 빈도는 음성대조군 및 모든 시험물질 처리군에서 모두 0.00%로서, 시험물질을 처리한 모든 농도군에서 음성대조군에 비해 통계학적으로 유의한 증가를 나타내지 않았고, 용량상관성이 없었다.
양성대조군에서는 구조적 이상을 가진 중기상의 빈도(13.33%)에서 통계학적으로 유의한 증가가 관찰되었다(P<0.01).
염색체이상을 계수한 결과, 처리 방법에 상관없이 모든 시험물질 처리군에서 염색체의 이상을 가진 중기상의 출현빈도가 음성대조군에 비해 증가하지 않았으며, 이 결과는 양성판정 기준을 만족시키지 못하였다.
따라서, 시험물질인 조다당 분획물(BLE-O)는 본 시험 조건 하에서 CHL 세포에 염색체이상을 유발하지 않는 것을 확인하였다.
하기에 본 발명의 분말을 함유하는 조성물의 제제예를 설명하나, 본 발명은 이를 한정하고자 함이 아닌 단지 구체적으로 설명하고자 함이다.
제제예 1. 산제의 제조
실시예 1에서 얻은 보리잎 유래 조다당 분획물 500 mg
유당 100 mg
탈크 10 mg
상기의 성분들을 혼합하고 기밀포에 충진하여 산제를 제조한다.
제제예 2. 정제의 제조
실시예 1에서 얻은 보리잎 유래 조다당 분획물 300 mg
옥수수전분 100 mg
유당 100 mg
스테아린산 마그네슘 2 mg
상기의 성분들을 혼합한 후 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조한다.
제제예 3. 캅셀제의 제조
실시예 1에서 얻은 보리잎 유래 조다당 분획물 200 mg
결정성 셀룰로오스 3 mg
락토오스 14.8 mg
마그네슘 스테아레이트 0.2 mg
통상의 캡슐제 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합하고 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조한다.
제제예 4. 주사제의 제조
실시예 1에서 얻은 보리잎 유래 조다당 분획물 600 mg
만니톨 180 mg
주사용 멸균 증류수 2974 mg
Na2HPO4,12H2O 26 mg
통상의 주사제의 제조방법에 따라 1 앰플 당 상기의 성분 함량으로 제조한다.
제제예 5. 액제의 제조
실시예 1에서 얻은 보리잎 유래 조다당 분획물 4 g
이성화당 10 g
만니톨 5 g
정제수 적량
통상의 액제의 제조방법에 따라 정제수에 각각의 성분을 가하여 용해시키고 레몬향을 적량 가한 다음 상기의 성분을 혼합한 다음 정제수를 가하여 전체를 정제수를 가하여 전체 100g으로 조절한 후 갈색병에 충진하여 멸균시켜 액제를 제조한다.
제제예 6. 과립제의 제조
실시예 1에서 얻은 보리잎 유래 조다당 분획물 1,000 mg
비타민 혼합물 적량
비타민 A 아세테이트 70 ㎍
비타민 E 1.0 mg
비타민 B1 0.13 mg
비타민 B2 0.15 mg
비타민 B6 0.5 mg
비타민 B12 0.2 ㎍
비타민 C 10 mg
비오틴 10 ㎍
니코틴산아미드 1.7 mg
엽산 50 ㎍
판토텐산 칼슘 0.5 mg
무기질 혼합물 적량
황산제1철 1.75 mg
산화아연 0.82 mg
탄산마그네슘 25.3 mg
제1인산칼륨 15 mg
제2인산칼슘 55 mg
구연산칼륨 90 mg
탄산칼슘 100 mg
염화마그네슘 24.8 mg
상기의 비타민 및 미네랄 혼합물의 조성비는 비교적 과립제에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만, 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하며, 통상의 과립제 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 과립을 제조하고, 통상의 방법에 따라 건강기능식품 조성물 제조에 사용할 수 있다.
제제예 7. 기능성 음료의 제조
실시예 1에서 얻은 보리잎 유래 조다당 분획물 1,000 mg
구연산 1,000 mg
올리고당 100 g
매실농축액 2 g
타우린 1 g
정제수를 가하여 전체 900 mL
통상의 건강음료 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 약 1 시간 동안 85 ℃에서 교반 가열한 후, 만들어진 용액을 여과하여 멸균된 2 L 용기에 취득하여 밀봉 멸균한 뒤 냉장 보관한 다음 본 발명의 기능성 음료 조성물 제조에 사용한다.
상기 조성비는 비교적 기호음료에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만, 수요계층, 수요국가, 사용용도 등 지역적, 민족적 기호도에 따라서 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하다.

Claims (19)

  1. 보리잎 유래 다당 분획물을 유효성분으로 함유하는 인플루엔자 바이러스 감염 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 보리잎 유래 다당 분획물은 전체 다당 분획물 대비 중성 다당(neutral sugar) 65 내지 85 중량%, 우론산(uronic acid) 5 내지 30 중량%, KDO(2-keto-3-deoxy-D-manno-octulosonic acid)로 이루어진 KDO 유사 물질 0.5 내지 10 중량%을 포함하는 것을 특징으로 하는 인플루엔자 바이러스 감염 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  3. 제2항에 있어서, 상기 보리잎 유래 다당 분획물은 단백질 0.5 내지 20 중량%를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 인플루엔자 바이러스 감염 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  4. 제2항에 있어서, 상기 우론산은 갈락투로닉산(galacturonic acid) 및 글루쿠로닉산(glucuronic acid)으로 이루어진 것을 특징으로 하는 인플루엔자 바이러스 감염 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  5. 제2항에 있어서, 상기 중성 다당은 람노오스, 푸코오스, 아라비노오스, 자일로스, 만노오스, 갈락토오스 및 글루코오스를 포함하는 것을 특징으로 하는 인플루엔자 바이러스 감염 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  6. 제1항에 있어서, 상기 약학적 조성물은 뉴라미니다아제 활성을 억제하는 것을 특징으로 하는 인플루엔자 바이러스 감염 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  7. 제1항에 있어서, 상기 약학적 조성물은 H1N1, H3N2, H4N2, H5N2, H6N2 및 H7N2에 대한 뉴라미니다아제 활성을 억제하는 것을 특징으로 하는 인플루엔자 바이러스 감염 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  8. 제1항에 있어서, 상기 인플루엔자 바이러스 감염으로 인한 질환은 독감, 감기, 인후염, 기관지염 및 폐렴으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는 인플루엔자 바이러스 감염 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  9. 제8항에 있어서, 상기 독감은 조류독감, 돼지독감 및 신종 플루로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는 인플루엔자 바이러스 감염 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  10. 제1항에 있어서, 상기 다당 분획물은 (a) 보리잎 분말에 펙틴 가수분해 효소를 처리 하는 단계; 및
    (b) 상기 효소 처리된 보리잎 분말을 C1 내지 C4의 알코올로 침전시켜 분획물을 회수하는 단계;를 포함하는 제조방법에 의해 제조된 것을 특징으로 하는 인플루엔자 바이러스 감염 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  11. 제10항에 있어서, (c) 상기 (b) 단계의 다당 분획물에서 분자량이 30 kDa 이상의 분획물을 회수하는 단계;를 추가로 포함하는 제조방법에 의해 제조된 것을 특징으로 하는 인플루엔자 바이러스 감염 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  12. 보리잎 유래 다당 분획물을 유효성분으로 함유하는 인플루엔자 바이러스 감염 질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물.
  13. 제12항에 있어서, 상기 보리잎 유래 다당 분획물은 전체 다당 분획물 대비 중성 다당(neutral sugar) 65 내지 85 중량%, 우론산(uronic acid) 5 내지 30 중량%, KDO(2-keto-3-deoxy-D-manno-octulosonic acid)로 이루어진 KDO 유사 물질 0.5 내지 10 중량%을 포함하는 것을 특징으로 하는 인플루엔자 바이러스 감염 질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물.
  14. 제12항에 있어서, 상기 식품 조성물은 뉴라미니다아제 활성을 억제하는 것을 특징으로 하는 인플루엔자 바이러스 감염 질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물.
  15. 제12항에 있어서, 상기 식품 조성물은 H1N1, H3N2, H4N2, H5N2, H6N2 및 H7N2에 대한 뉴라미니다아제 활성을 억제하는 것을 특징으로 하는 인플루엔자 바이러스 감염 질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물.
  16. 보리잎 유래 다당 분획물을 유효성분으로 함유하는 인플루엔자 바이러스 감염 질환의 예방 또는 치료를 위한 인간을 제외한 동물용 약학 조성물.
  17. 제16항에 있어서, 상기 동물용 인플루엔자 바이러스 감염 질환은 변이형 감염성 조류독감, 뉴캣슬병 바이러스(newcastle disease virus)로 인한 조류 파라믹소바이러스(Avian paramyxoovirus) 감염증, 개 디스템퍼(Canine distemper) 감염증, 닭 전염성 기관지염 바이러스(infectious broncheitis virus)로 인한 칠면조 코로나 바이러스(Turkey coronavirus) 감염증, 조류 뉴모바이러스(avian pneumovirus)로 인한 조류 뉴모바이러스 감염증, 돼지 생식기 및 호흡 증후군 바이러스(porcine reproductive and respiratory syndrome virus)로 인한 돼지 생식기 및 호흡 증후군 바이러스 감염증, 콕사키 바이러스(coxsakie virus)로 인한 구제역 (Foot-and-mouth disease), 세망내피증 바이러스(reticuloendotheliosis virus)로 인한 조류 백혈병(Avian leukosis), 오제스키 바이러스(aujeszky's disease virus)로 인한 닭 전염성후두기관염(Chicken infectious laryngotrachitis), 아데노 바이러스(adeno virus)로 인한 호흡기 감염증 및 산란저하증(Egg drop syndrome)을 유발하는 동물 아데노바이러스 감염증으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는 인플루엔자 바이러스 감염 질환의 예방 또는 치료를 위한 인간을 제외한 동물용 약학 조성물.
  18. 보리잎 유래 다당 분획물을 유효성분으로 함유하는 인플루엔자 바이러스 감염 질환의 예방 또는 개선용 사료 조성물.
  19. 보리잎 유래 다당 분획물을 유효성분으로 함유하는 인플루엔자 바이러스 감염 질환의 예방 또는 개선용 사료 첨가제 조성물.
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