KR20120102473A - 새싹보리 추출물을 포함하는 뉴라미니데이즈 활성 억제용 조성물 및 인플루엔자 바이러스 감염 질환의 예방 및 치료용 약학적 조성물 - Google Patents

새싹보리 추출물을 포함하는 뉴라미니데이즈 활성 억제용 조성물 및 인플루엔자 바이러스 감염 질환의 예방 및 치료용 약학적 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 뉴라미니데이즈 억제활성을 가지는 새싹보리 추출물 및 폴리페놀계 화합물에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 새싹보리 유래 폴리페놀계 화합물을 추출하여 분리하고, 이의 뉴라미니데이즈 억제 활성을 확인하여 인플루엔자 바이러스의 예방, 치료 등에 적용할 수 있는 조성물에 관한 것이다.
본 발명은 인플루엔자 바이러스 표면 항원인 동시에 새로 생성된 바이러스를 세포밖으로 방출하는데 중요한 역할을 담당하는 효소인 뉴라미니데이즈에 대하여 새싹보리의 폴리페놀계 화합물들이 강한 억제효과가 있음을 확인함으로써 생물의약, 건강기능 식품산업과 식?의약분야 및 가축 사료 첨가제 분야에서 새싹보리의 활용성을 증진시킬 수 있을 것으로 기대된다.

Description

새싹보리 추출물을 포함하는 뉴라미니데이즈 활성 억제용 조성물 및 인플루엔자 바이러스 감염 질환의 예방 및 치료용 약학적 조성물{Composition for inhibiting the activity of neuraminidase and pharmaceutical composition for prevention and treatment of influenza viral diseases comprising extracts of young barley leaves}
본 발명은 뉴라미니데이즈 억제활성을 가지는 새싹보리 추출물 및 폴리페놀계 화합물에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 새싹보리 유래 폴리페놀계 화합물을 추출하여 분리하고, 이의 뉴라미니데이즈 억제 활성을 확인하여 인플루엔자 바이러스의 예방, 치료 등에 적용할 수 있는 조성물에 관한 것이다.
보리는 우리민족과 삶을 같이해온 귀중한 우리나라 식량이자 자원으로 인류가 보리를 재배하기 시작한 것은 기원전 7천년 ~ 1만년경으로 알려져 있으며, 우리나라는 약 3,000년 전에 중국으로부터 전래되어 재배가 시작된 것으로 보고되고 있다. 최근에는 보리에 함유되어 있는 우수한 영양성분과 건강 기능성물질의 다이어트 균형식, 체질개선 등에 대한 효과가 알려지면서 건강 기능성 원료작물로서의 관심이 증대되고 있으며, 가축 사료용 등으로도 우수한 평가를 받고 있다. 그러나 연간 보리 소비량감소에 따른 보리 재고량이 증가하고 있는 실정이며, 2012년부터 보리수매가 전면 중단됨에 따라 보리 소비촉진을 위해서 새로운 수요를 창출하고, 생산자의 소득이 적절하게 보장될 수 있는 녹색기술의 개발이 무엇보다 시급한 실정이다. 보리 유식물을 이용한 "새싹보리"는 호주, 일본 등 외국에서는 영양성과 기능성을 일찍 확인하여 보리 유식물을 이용한 선식 및 항산화 건강식품 등을 개발하여 산업화하고 있는 실정이다. 따라서 국내 보리의 부가가치 향상과 산업화 가능한 기능성 신소재로 개발하기 위해 새싹보리의 새로운 기능성 생리활성물질을 분리?정제하고 과학적으로 증명하여 농업적, 산업적으로 활용가치가 높일 필요가 있다.
최근까지 발표된 보리순과 관련된 연구로는 보리순을 이용한 보리순환 제조 방법(한국공개특허 제2006-0115675호), 보리순을 주재료로 하는 건강음료용 조성물(한국공개특허 제2005-0107981호), 밀순 또는 보리순 차의 제조방법(한국공개특허 제2006-0072848호), 원적외선 방사를 이용한 식이섬유가 향상된 보리순차(한국공개특허 제2009-0064521호), 당뇨환자용 음료수(한국공개특허 제2006-0089639호) 등이 알려져 있다.
또한 보리잎과 관련된 연구로는 음건한 보리잎 추출액을 이용한 보리잎 분말제조방법(한국등록특허 제460,730호), 보리잎의 수용성 페놀화합물의 분석(Ferreres; 2009), 보리잎 분말을 함유한 두부 등이 있다.
특히 어린 보리잎을 이용한 연구로는 보리 어린잎 분말과 즙을 이용한 과립제조(한국공개특허 제1997-0005123호), 천연염료의 제조방법(한국공개특허 제 2009-0055787호) 등이 있으며, 보리잎 추출물의 항산화 활성을 검정한 연구로는, 보리잎을 가열 물 조추출물의 항산화활성을 검정(김, 2003), 보리어린잎 항산화물질인 사포나린과 이소베텍신의 메탄올 추출 및 활성검정(류, 2002; 한국공개특허 제2005-0091334호), 열수 추출물의 활성 검정 및 LC에 의한 사포나린과 루토나린의 확인(Benedet, 2007) 등이 보고되어 있다.
한편, 인플루엔자 바이러스는 상기도에 침입하여 바이러스 감염증을 일으키는 호흡기 질환으로 한기, 두통, 고열, 관절통, 근육통 및 비색, 콧물 등 호흡기 증세를 유발한다. 또한 성인 폐렴의 약 10%가 인플루엔자 바이러스와 연관이 있다고 알려져 있다. 인플루엔자 바이러스는 크게 A, B, C형으로 분류된다. A형은 사람에게 주로 감염이 확인되며 B, C형에 비하여 돼지, 기타 포유류 및 다양한 야생조류에서 감염이 확인되고 있는 바이러스이다. 최근, 전 세계적으로 문제가 되고 있는 조류 인플루엔자(Avian influenza), 돼지 인플루엔자(Swine influenza) 및 신종플루(Novel flu) 등은 모두 A형 바이러스에 속한다. 인플루엔자 A형은 바이러스 표면 단백질인 헤마글루티닌 (hemagglutinin: HA)과 뉴라미니데이즈 (neuraminidase: NA)의 종류에 따라 여러 가지 종류가 존재하며, HA의 변이 양상에 따라서 H1~H15형으로, NA 변이에 따라서 N1~N9형으로 분류되고 있으므로 15ㅧ9=144 종류의 인플루엔자 바이러스가 발생할 수 있다. 조류에서의 인플루엔자 감염은 주로 H5형이나 H7형 및 H9형에 관련되며, 3종류의 헤마글루티닌(H1, H2, H3)과 2가지 형태의 뉴라미니데이즈(N1과 N2)만이 인간에서 인플루엔자 감염을 일으키므로 원칙적으로 인간은 조류인플루엔자에 감염되지 않았다. 그러나 최근에는 조류 인플루엔자 바이러스가 유전자 재조합 과정을 거치지 않고 직접 사람에게 전파된 예도 발생하고 있다. 인플루엔자 바이러스 B형은 A형에 비하여 증상이 약하고, 인플루엔자 바이러스 C형에 의한 인체 감염은 드문 것으로 알려져 있다. 하지만 최근 조류에서 나타나는 HA항원과 NA항원은 보통 사람에게는 병을 일으키지 않지만, 바이러스 내에서 유전자 돌연변이가 일어나거나 사람에게 병을 일으키는 종류의 항원과 유전자를 교환하면 사람에게도 쉽게 병을 일으키는 형태로 변할 수 있어 국제적 사회적 문제로 대두되고 있다. 특히 2009년 멕시코에서 처음 발병하여 전 세계로 퍼지고 있는 신종플루(Novel flu)는 돼지 인플루엔자 바이러스인 H1N1이 돼지에게 감염되어 인간에게 전염이 가능한 질환으로 변이된 것으로 추정된다. 신종플루는 현재 상태보다 인간에게 치명적인 바이러스로 변할 가능성이 존재한다. 신종플루의 일반적인 증상은 일반 독감과 구별하기가 매우 어렵다. 신종플루는 일반 독감과 비슷하게 발열, 인후통, 기침, 콧물 또는 코막힘의 증상을 보이고 있으며, 최근의 신종플루 관련 보고에 의하면 일반독감보다 심한 치명적인 폐 손상을 유발하는 특징을 보이고 있으므로 신종플루의 예방 및 치료는 매우 중요한 문제이다. 따라서 신종플루를 예방하기 위하여 백신을 생산하여 국가적으로 접종할 필요가 있다. 그러나, 예방적 차원의 국가적 백신 대책으로 매번 항원변이가 일어나는 RNA 바이러스를 모두 예방하는 백신을 만드는 것은 불가능에 가깝다. 따라서 조류 및 돼지 인플루엔자, 신종플루 또는 최악의 발병 가능성인 조류 인플루엔자와 신종플루가 섞인 새로운 병원체의 발생에 대비하기 위하여 이를 예방하고 치료할 수 있는 치료제의 개발은 필수적이다. 현재 조류 및 돼지 인플루엔자, 신종플루의 유일한 치료제는 바이러스 기원의 뉴라미니데이즈에 선택적인 저해물질로 개발된 경구용 치료제인 타미플루(oseltamivir phosphate)와 흡입형인 리렌자(zanamivir) 등이다. 경구용 치료제로서 많이 사용하고 있는 타미플루의 부작용으로는 오심, 구토, 신경계나 정신계의 이상 등 부작용을 갖고 있다. 또한, 경구용 치료제로 사용되고 있는 타미플루에 대한 내성 바이러스가 발병할 경우를 대비하여야 한다. 최근에 이미 신종플루의 확산에 치명적인 타미플루에 대한 내성 바이러스의 출현이 보고되고 있으며, 타미플루 내성 바이러스의 인간 대 인간 전염조차도 발견되고 있는 실정이다. 따라서 조류 및 돼지 인플루엔자와 신종플루에 대한 바이러스 치료제의 개발은 인간의 보건안전에 필수적인 사항이며, 특히 대유행을 앞두고 있는 조류 및 돼지 인플루엔자와 신종플루와의 전쟁에 있어서 더욱 필요하다. 본 발명에서는 조류 및 돼지 인플루엔자와 신종플루의 방어대책에 대한 시급성을 감안하여 효과가 확인되면 바로 적응이 가능한 식품 및 약용식물을 대상으로 하여 조류 및 돼지 인플루엔자와 신종플루에 대한 뉴라미니데이즈 저해물질을 탐색하였다. 일반적으로 새로운 성분의 약제를 개발하기 위해 기존 약제를 실험적으로 변형시키는 것보다는 전통의학에서 사용되고 있는 작물 및 천연물 약제들로부터 새로운 활성 성분을 찾는 것이 여러가지 면에서 장점이 많다. 특히 이러한 활성 성분들은 오랫동안 먹어 왔기 때문에 약물들에 의한 독성 염려가 적다. 이러한 사실은 신종플루 치료제로서 사용되는 타미플루도 출발물질은 중국의 토착식물인 '스타아니스' 열매를 주원료로 개발한 것에서 확인할 수 있다.
이에 본 발명자들은, 새싹보리 유래 뉴라미니데이즈 활성 억제 물질을 찾아내기 위하여 연구, 노력한 결과 새싹보리로부터 뉴라미니데이즈 활성 억제 물질을 분리하여 구조 동정하여 기존 새싹보리 추출물에서는 보고되지 않은 물질을 최초로 발견하고, 이의 추출방법을 발견함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서 본 발명은 뉴라미니데이즈 억제 활성을 나타내어, 인플루엔자 감염 질환의 예방 또는 치료 효과를 나타내는 새싹보리 추출물, 이로부터 분리된 폴리페놀 화합물 및 이들의 제조방법을 제공하는데 그 목적이 있다.
본 발명은 새싹보리 추출물을 유효성분으로 포함하여, 뉴라미니데이즈 억제 활성을 가지는 인플루엔자 바이러스의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 그 특징으로 한다.
또한, 본 발명은 하기 화학식 1 내지 7 로 표시되는 화합물 중에서 선택된 1종 또는 2종 이상의 화합물을 포함하여 뉴라미니데이즈 억제 활성을 가지는 인플루엔자 바이러스의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 또 다른 특징으로 한다.
Figure pat00001
Figure pat00002
Figure pat00003
Figure pat00004
Figure pat00005
Figure pat00006
Figure pat00007
또한, 본 발명은
새싹보리를 동결건조하여 분말을 얻은 뒤 이를 탄소수 1 ~ 4의 알코올을 사용하여 추출물을 얻는 단계;
상기 추출물에 물을 넣어 현탁시키고, 유기 용매를 가하여 각각의 분획물을 얻는 단계; 및
상기 분획물을 실리카겔 컬럼에서 용출시켜 분획물을 얻는 단계
를 포함하는 상기 화학식 1 내지 7로 표시되는 화합물의 제조방법을 또 다른 특징으로 한다.
본 발명은 인플루엔자 바이러스 표면 항원인 동시에 새로 생성된 바이러스를 세포밖으로 방출하는데 중요한 역할을 담당하는 효소인 뉴라미니데이즈에 대하여 새싹보리의 폴리페놀계 화합물들이 강한 억제효과가 있음을 확인함으로써 생물의약, 건강기능 식품산업과 식?의약분야 및 가축 사료 첨가제 분야에서 새싹보리의 활용성을 증진시킬 수 있을 것으로 기대된다.
도 1은 새싹보리 추출물에서 분리한 활성 단일 성분에 대한 TLC 전개 사진이다.
도 2는 새싹보리 추출물에서 분리된 이소비텍신-7-O-글루코사이드(사포나린)의 1H-NMR 스펙트럼이다.
도 3은 새싹보리 추출물에서 분리된 이소비텍신-7-O-글루코사이드(사포나린)의 13C-NMR 스펙트럼이다.
도 4는 새싹보리 추출물에서 분리된 루테오린-6-C-글루코사이드(호모오리엔틴)의 1H-NMR 스펙트럼이다.
도 5은 새싹보리 추출물에서 분리된 루테오린-6-C-글루코사이드(호모오리엔틴)의 13C-NMR 스펙트럼이다.
도 6는 새싹보리 유래 폴리페놀계 화합물의 농도에 따른 뉴라미니데이즈 활성 저해 효과를 나타낸 그래프이다.
도 7는 뉴라미니데이즈 활성을 50% 저해하는 새싹보리 유래 폴리페놀계 화합물의 농도(IC50)를 확인한 것이다.
도 8는 새싹보리 에탄올 추출물의 에탄올 농도별 HPLC 스펙트럼이다.
도 9은 새싹보리 에탄올 추출물에서 에탄올 농도별 사포나린과 루토나린의 함량을 정량하여 나타낸 그래프이다.
이와 같은 본 발명을 더욱 상세히 설명하면 다음과 같다.
본 발명은 뉴라미니데이즈 억제활성을 가지는 새싹보리 유래 추출물 및 폴리페놀계 화합물에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 새싹보리 유래 폴리페놀계 화합물을 추출하여 분리하고, 이의 뉴라미니데이즈 억제 활성을 확인하여 인플루엔자 바이러스의 예방, 치료 등에 적용할 수 있는 새싹보리 추출물에 관한 것이다.
본 발명은 새싹보리의 동결 건조물을 분쇄하고 이를 유기 용매에 침지시켜 반복 추출하고 농축한 추출물을 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하며, 상기 추출물은 뉴라미니데이즈 억제 활성을 가지는 루테올린, 이소비텍신, 호모오리엔틴, 페루릭산, 사포나린, 루토나린, 클로로제닉산과 같은 폴리페놀계 화합물을 포함한다.
상기 유기 용매로는 탄소수 1 ~ 4의 저급 알코올, 헥산, 에틸아세테이트, DMF(Dimethyl formamide), THF(Tetrahydrofuran), 클로로포름, 디에틸에테르 등이 사용가능하나, 바람직하게는 탄소수 1 ~ 4의 알코올을 사용하는 것이 좋다. 더욱 바람직하게는 70 ~ 90 중량% 의 에탄올 수용액을 사용하는 경우, 폴리페놀계 화합물의 추출이 최대로 이루어져 우수한 항바이러스 활성을 나타내도록 할 수 있다.
상기 새싹보리는 상온에서 육묘용 상자를 이용하여 상토에 보리종자를 골고루 뿌리고 상토를 덮은 후, 상토가 마르지 않게 물을 뿌리면서 보리를 키우고, 싹이 튼 지 5 ~15 일 지난후 새싹보리의 길이가 10 ~ 20 cm 정도로 자란 것을 수확하여 사용하며, 바람직하게는 상기 새싹보리를 세척하고 동결 건조시킨 뒤 이를 분쇄한 분말상태를 사용하는 것이 좋다.
상기 새싹보리 추출물을 포함하는 본 발명의 약학 조성물은 인플루엔자 바이러스 표면 항원인 동시에 새로 생성된 바이러스를 세포 밖으로 방출하는데 중요한 역할을 담당하는 뉴라미니데이즈 효소의 활성을 억제하여 인플루엔자 바이러스의 예방 또는 치료에 효과적이다.
본 발명에 따른 약학 조성물은 유효성분 외에 약제학적으로 허용 가능한 담체, 부형제 또는 희석제를 포함할 수 있다.
본 발명의 조성물은 경구 또는 비경구의 여러 가지 제형일 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구 투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 하나 이상의 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로오스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한, 단순한 부형제 이외에 스테아린산 마그네슘, 탈크 등과 같은 윤활제들도 사용된다. 경구 투여를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다.
본 발명의 조성물은 경구 또는 비경구로 투여될 수 있으며, 비경구 투여 시 드레싱제, 패취제, 밴드, 연고제 등의 피부외용제 또는 주사제로 가능하다.
본 발명의 조성물의 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율 및 질환의 중증도에 따라 그 범위가 다양하며, 일일 투여량은 0.1 내지 100 mg/kg이고, 바람직하게는 30 내지 80 mg/kg이고, 더욱 바람직하게는 50 내지 60 mg/kg이며, 하루 1 ~ 6 회 투여될 수 있다.
또한 본 발명은 하기 화학식 1 내지 7 로 표시되는 화합물 중에서 선택된 1종 또는 2종 이상의 화합물을 포함하여 뉴라미니데이즈 억제 활성을 가지는 인플루엔자 바이러스의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 또다른 특징으로 한다.
[화학식 1]
Figure pat00008

[화학식 2]
Figure pat00009

[화학식 3]
Figure pat00010

[화학식 4]
Figure pat00011

[화학식 5]
Figure pat00012

[화학식 6]
Figure pat00013

[화학식 7]
Figure pat00014

상기 화합물은 새싹보리 추출물로부터 분리될 수 있으며, 새싹보리 추출물과 비교하여 보다 우수한 뉴라미니데이즈의 억제 활성을 나타낸다.
또한 본 발명은
새싹보리를 동결건조하여 분말을 얻은 뒤 이를 탄소수 1 ~ 4의 알코올을 사용하여 추출물을 얻는 단계;
상기 추출물에 물을 넣어 현탁시키고, 유기 용매를 가하여 각각의 분획물을 얻는 단계; 및
상기 분획물을 실리카겔 컬럼에서 용출시켜 분획물을 얻는 단계
를 포함하는 상기 화학식 1 내지 7로 표시되는 화합물의 제조방법을 또다른 특징으로 한다.
상기 분획물을 얻기 위하여 사용되는 유기 용매는 n-헥산, 에틸아세테이트, 클로로포름, 부탄올 중에서 선택된 1종 또는 2종 이상의 용매를 사용하는 것이 바람직하며, 가장 바람직하게는 n-헥산, 에틸아세테이트, 부탄올 순으로 용매를 가하여 각각의 분획물을 얻는 것이 좋다. 이때 부탄올 분획물을 실리카겔 컬럼에서 용출시키면 상기 화학식 1 내지 4로 표시되는 화합물을 얻을 수 있다. 또한 물 분획물을 실리카겔 컬럼에서 용출시키면 상기 화학식 5 내지 7로 표시되는 화합물을 얻을 수 있다.
이하, 본 발명은 다음 실시예에 의거하여 구체적으로 설명하겠는 바, 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1 : 새싹보리로부터 폴리페놀계 화합물의 추출, 분리 및 정제
상온에서 자루에 담긴 보리종자의 균일한 발아를 위해 6시간동안 물에 침종시킨 후 꺼내어 공기 중에서 6시간 동안 물이 빠지도록 한 후, 육묘용 상자를 이용하여 상토에 보리종자를 골고루 뿌리고 상토를 덮었고, 상토가 마르지 않게 주기적으로 물을 주면서 보리를 상온에서 키웠다. 종자가 싹이 튼 후 10일 경과하면 새싹보리의 길이가 약 15cm 전후 정도 자라게 되었고, 이 때 새싹보리의 지상부를 수확하였다. 수확한 새싹보리를 물로 세척 후 물기를 제거하였으며, 동결건조기에서 3일 건조하였다. 동결건조된 새싹보리는 분쇄기를 이용하여 분쇄하였으며, 이를 통해 얻은 새싹보리 분말 500g을 추출용기에 넣고 80% 주정에탄올 수용액 (3ℓ)으로 상온에서 2일 동안 왕복 진탕 추출한다. 추출한 시료는 여과지로 여과한 다음, 감압하에서 농축하여 청녹색 추출물(100g)을 얻었다.
여기에 정제수 500㎖을 넣어 현탁시키고, n-헥산, 에틸아세테이트, 부탄올 순으로 분획하여 n-헥산 분획물(10g), 에틸아세테이트 분획물(23g), 부탄올 분획물 (30g) 및 물 분획물(32g)을 각각 얻었다. 상기 부탄올 분획물(30g)로부터 실리카겔 컬럼크로마토그래피(500g, 70 ~ 230 메쉬, Merk)를 사용하여, 이동상 용매로는 클로로포름:메탄올 (50:1 ~ 1:20 혼합비) 혼합 용매 및 메탄올을 순차적으로 사용하여 5개의 분획 (Fr.B1 ~Fr.B5)을 얻었다.
Fr.B3 분획물(1.5g)을 실리카겔 (3g, 70 ~ 230 메쉬)에 흡착시킨 후, 실리카겔 컬럼크로마토그래피 (30g, 230 ~ 400 메쉬)를 수행하였고, 이때 이동상 용매는 클로로포름:메탄올 혼합용매를 사용하여 미황색 침전물을 얻었으며, 이를 정제하여 화합물 1(45mg)을 얻었다. 또한, Fr.B4 분획물(2g)을 실리카겔(4g, 70 ~ 230 메쉬)에 흡착시킨 후, 실리카겔 컬럼크로마토그래피(30g, 230~400 메쉬)를 수행하였고, 이때 이동상 용매는 클로로포럼:메탄올(50:1 ~ 1:20 혼합비) 혼합 용매를 사용하여 미황색 침전물을 얻었으며, 이를 정제하여 화합물 2(30mg)와 화합물 3(41mg)을 얻었다. 또한, Fr.B5(1.8g)을 실리카겔(3.5g, 70 ~ 230 메쉬)에 흡착시킨 후, 실리카겔 컬럼크로마토그래피(25g, 230~400 메쉬)를 수행하였고, 이때 이동상 용매는 클로로포름:메탄올(50:1 ~ 1:20 혼합비) 혼합 용매를 사용하여 흰색 침전물을 얻었으며 이를 정제하여 화합물 4(50mg)를 얻었다.
그리고 상기 물 분획물(32 g)로 역상 실리카겔 컬럼크로마토그래피(500g, 230 ~ 400 메쉬, Merk)를 수행하였으며, 이동상 용매로는 물:메탄올(20:1 ~ 1:10 혼합비) 혼합 용매 및 메탄올을 순차적으로 사용하여 5개의 분획(Fr.H1 ~ Fr.H5)을 얻었다. Fr.H3 분획물(5g)을 역상 실리카겔 컬럼크로마토그래피(100g, 230 ~ 400 메쉬)를 수행하였고, 이때 이동상 용매는 물:메탄올(30:1 ~ 1:5 혼합비) 혼합 용매를 사용하여 연노란색 침전물을 얻었으며, 이를 정제하여 화합물 5(80mg)와 화합물 6(20mg)을 얻었다. 또한, Fr.H4 분획물(3g)을 역상 실리카겔 컬럼크로마토그래피(60g, 230 ~ 400 메쉬)를 수행하였고, 이때 이동상 용매는 물:메탄올 (20:1 ~ 1:10 혼합비) 혼합 용매를 사용하여 또 다른 흰색 침전물을 얻었으며, 이를 정제하여 화합물 7(30mg)을 얻었다. 분리한 폴리페놀계 화합물의 실리카겔 박막크로마토그래피(Thin Layer Chromatography, TLC)를 수행하였으며, 이에 따른 TLC 패턴은 도 1에 나타내었다.
실시예 2 : 새싹보리로부터 분리된 폴리페놀계 화합물의 구조 분석
상기 실시예 1에서 얻은 화합물을 HPLC-MS 분석기 (High-performance liquid chromatography mass chromatography)를 사용하여 분자랑 및 분자식을 결정하였으며, 화합물의 구조 동정은 핵자기공명분석 (Bruker AMX 500)을 통하여 1H NMR, 13C-NMR, 호모코지 (HOMO-COSY), HMQC (1H-Detected heteronuclear Multiple-Quantum Coherence), HMBC (Heteronuclear Multiple-Bond Coherence), DEPT (Distortionless Enhancement by Polarization) 스펙트럼을 분석함으로써 이루어졌다.
그 결과, 화합물 1은 3′,4′,5,7-테드라하이드록시플라본 (3′,4′, 5,7-tetrahydroxyflavone; 루테오린), 화합물 2은 에피게닌-6-C-글루코사이드 (apigenin-6-C- glucoside; 이소비텍신), 화합물 3은 루테오린-6-C-글루코사이드(luteolin-6-C-glucoside; 호모오리엔틴), 화합물 4는 3-(4-하이드록시-3-메톡시페닐)-2-프로페노익산(3-(4-hydroxy-3-methoxyphenil)-2-profenoic acid; 페루릭산), 화합물 5는 이소비텍신-7-O-글루코사이드(isovitexin-7-O-glucoside; 사포나린), 화합물 6은 이소오리엔틴-7-O-글루코사이드(isoorientin-7-O-glucoside; 루토나린), 그리고 화합물 7은 3-(3,4-디하이드록시신나모일)퀴닉산 (3-(3,4-Dihydroxycinnamoyl) quinic acid; 클로로제닉 산)으로 동정하였다.
분리한 폴리페놀계 화합물의 구조는 하기 표 1 및 2에 나타내었으며, 각 화합물의 구조적 특징은 하기와 같다.
Figure pat00015
Figure pat00016
[화합물 1] 3′,4′,5,7-테트라하이드록시플라본(루테오린)
1) 물성 : 미황색 무정형 결정
2) 분자량 : 360
3) 분자식 : C15H10O6
4) 1H-NMR (500MHz, DMSO-d 6) δ 7.42(1H, dd, J=8.1, 2.3 Hz), 7.40(1H, d, J=2.3 Hz, ), 6.90(1H, d, J=8.1 Hz), 6.66(1H, s), 6.45(1H, d, J=2.1 Hz), 6.20(1H, d, J=2.1 Hz)
5) 13C-NMR (125MHz, DMSO-d 6) δ 182.0, 164.5, 164.3, 161.9, 157.7, 150.1, 146.1, 121.9, 119.3, 116.4, 113.8, 104.1, 103.2, 99.2, 94.2
[화합물 2] 에피게닌-6-C-글루코사이드(이소비텍신)
1) 물성 : 미황색 무정형 결정
2) 분자량 : 432
3) 분자식 : C21H20O10
4) 1H-NMR (500MHz, DMSO-d 6) δ 13.55(1H, s), 7.93(2H, d, J=8.8 Hz), 6.92(2H, d, J=8.8 Hz), 6.78(1H, s), 6.50(1H, s), 4.58(1H, d, J=9.8 Hz), 3.86~3.33(7H, m, C-glucose)
5) 13C-NMR (125MHz, DMSO-d 6) δ 182.0, 163.5, 163.1, 161.2, 160.7, 156.2, 128.5, 121.1, 116.0, 108.9, 103.4, 102.8, 93.6, 81.6, 79.0, 73.1, 70.6, 70.2, 61.5
[화합물 3] 루테오린-6-C-글루코사이드(호모오리엔틴)
1) 물성 : 미황색 무정형 결정
2) 분자량 : 448
3) 분자식 : C21H20O11
4) 1H-NMR (500MHz, DMSO-d 6) δ 13.56 (1H, s), 7.43(1H, dd, J = 2.0, 8.0 Hz), 7.42 (1H, d, J = 2.0 Hz), 6.89 (1H, d, J = 8.0 Hz), 6.67 (1H, d, J = 2.0 Hz), 6.47 (1H, d, J = 2.0 Hz), 4.59 (1H, d, J = 10.0 Hz), 3.79~3.40 (7H, m, C-glucose)
5) 13C-NMR (125MHz, DMSO-d 6) δ 182.6, 164.6, 164.0, 161.4, 156.8, 150.4, 146.4, 122.7, 120.7, 116.3, 114.0, 110.0, 104.1, 103.5, 94.2, 82.3, 80.0, 73.7, 71.3, 70.9, 62.2
[화합물 4] 3-(4-하이드록시-3-메톡시페닐)-2-프로페노익산(페루릭산)
1) 물성 : 노란색 무정형 결정
2) 분자량 : 194
3) 분자식 : C10H10O4
4) 1H-NMR (500MHz, Methanol-d 4) δ 7.61 (1H, d, J = 15.8 Hz), 7.17 (1H, s), 7.06 (1H, d, J = 10.1 Hz), 6.82 (1H, d, J = 8.2 Hz), 6.32(1H, d, J=15.8 Hz), 3.89(3H, s).
5) 13C-NMR (125MHz, Methanol-d 4) δ 171.4, 150.9, 149.8, 147.4, 128.2, 124.4, 116.9, 116.3, 112.1, 56.8
[화합물 5] 이소비텍신-7-O-글루코사이드(사포나린)
1) 물성 : 연노랑색 무정형 결정
2) 분자량 : 594
3) 분자식 : C27H30O15
4) 1H-NMR (500MHz, DMSO-d 6 ) δ 7.95 (2H, d, J = 14.7 Hz) , 6.88 (4H, m), 4.96 (1H, d, J = 10.2 Hz), 4.65 (1H, dd, J1 = 8.1 Hz, J2 = 16.3 Hz), 3.55-3.91 (7H, m, O-glucose), 3.15-3.34 (7H, m, C-glucose)
5) 13C-NMR (125MHz, DMSO-d 6 ) δ 182.6, 164.6, 162.9, 159.8, 156.6, 149.9, 145.7, 129.1, 121.1, 116.5, 113.4, 110.5, 104.8, 103.1, 101.1, 92.7, 80.1, 78.5, 77.8, 75.6, 74.8, 73.2, 72.8, 70.8, 70.3, 69.8, 60.7
[화합물 6] 이소오리엔틴-7-글구코사이드(루토나린)
1) 물성 : 연노랑색 무정형 결정
2) 분자량 : 610
3) 분자식 : C27H30O16
4) 1H-NMR (500MHz, DMSO-d 6 ) δ 9.58 (1H, s), 7.47 (2H, dd, J = 2.8 Hz/8.5 Hz), 6.92 (1H, d, J = 8.5 Hz), 6.83 (1H, s), 6.70 (1H, s), 5.00 (7H, m, O-glucose), 4.66 (7H, m, C-glucose).
5) 13C-NMR (125MHz, DMSO-d 6 ) δ 181.8, 164.2, 162.3, 159.2, 156.3, 149.9, 145.7, 121.1, 119.1, 115.9, 113.4, 110.5, 104.8, 103.1, 101.1, 93.5, 80.9, 78.9, 77.2, 75.6, 73.8, 73.0, 72.6, 70.8, 69.5, 60.7, 60.3
[화합물 7] 3-(3,4-디하이드록시신나모일)퀴닉산(클로로제닉 산)
1) 물성 : 흰색 무정형 결정
2) 분자량 : 354
3) 분자식 : C16H13O9
4) 1H-NMR (500MHz, D2O) δ 9.62 (1H, s,), 9.19(1H, s), 7.42 (1H, d, J = 16.0 Hz), 7.03 (1H, brs), 6.98 (1H, dd, J = 8.0, 2.0 Hz), 6.76 (1H, d, J = 8.0 Hz), 6.15 (1H, d, J = 16.0 Hz), 5.06 (1H, ddd, J = 10.0, 6.0 Hz), 3.92 (1H, brs), 3.42 (1H, brs), 2.03 - 1.77 (4H, m)
5) 13C-NMR (125MHz, DMSO-d 6 ) δ 175.0, 165.8, 148.4, 145.6, 145.0, 125.6, 121.4, 115.8, 114.8, 114.3, 73.5, 70.9, 70.3, 68.0, 37.2, 36.2.
하기 실시예 3에서와 같이 뉴라미니데이즈에 대한 억제 활성이 우수하면서 추출물 내 함량이 가장 높게 나타난 화합물 5(이소비텍신-7-O-글루코사이드)의 1H-NMR 및 13C-NMR 스펙트럼을 도 2 및 3에 각각 나타내었다. 그리고 뉴라미니데이즈에 대한 억제 활성이 가장 우수한 화합물 3(루테오린-6-C-글루코사이드)의 1H-NMR 및 13C-NMR 스펙트럼을 도 4 및 5에 각각 나타내었다.
실시예 3 : 새싹보리로부터 분리된 폴리페놀계 화합물의 항산화 활성 비교
본 발명의 새싹보리 추출물 또는 이로부터 분리된 폴리페놀계 화합물의 바이러스 뉴라미니데이즈에 대한 억제 활성을 알아보기 위하여 하기와 같은 실험을 수행하였다.
뉴라미니데이즈는 인플루엔자 바이러스 표면 항원인 동시에 새로 생성된 바이러스를 세포밖으로 방출하는데 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있으며, 기존 인플루엔자 바이러스 치료제 개발을 위한 주요 타겟으로 이용되고 있다.
이에 바이러스유래 H1N1 뉴라미니데이즈를 R&D Systems사로부터 구입하였고, 기질인 2′-(4-메칠움베리페릴)-알파-d-n-아세틸뉴라미닉에시드(2′-(4-methylumbellifery)-α-D-N-acetylneuraminic acid)는 Sigma사에서 구입하여 사용하였다.
먼저 새싹보리 추출물 또는 이로부터 분리된 상기 화학식 1 내지 7로 표시되는 폴리페놀계 화합물을 일정 농도별로 희석하여 준비하였다. 　　　　준비된 시료와 H1N1 뉴라미니데이즈를 3mL 큐벳에 넣은 뒤, 50 mM Tris 버퍼 (pH 7.5, 5mM CaCl2, 200mM NaCl포함)를 가하여 잘 혼합한 후, 37℃에서 10분간 인큐베이션 시켰다. 그리고, 기질인 2′-(4-메칠움베리페릴)-알파-d-n-아세틸뉴라미닉에시드를 가하여 형광광도계인 SpectraMax M2e(Molecular Divices, USA)로 여기(excitation) 파장 365nm 및 방출(emission) 파장 445nm로 분석하였다. 　　　　실험에 사용된 H1N1 뉴라미니데이즈의 최종 농도는 2.5 ng, 기질의 최종 농도는 200 μM이며, 반응온도는 37℃ 이다.
추출물 대신 에탄올을 넣어준 반응액과의 형광광도 차이로부터 저해율을 계산하여 그 결과를 하기 도 6에 나타내었다. 　　　　한편, 효소의 활성 평가에 적용된 수학식 1은 다음과 같다.
[수학식 1]
뉴라미니데이즈 억제율(%) = (A-B)/Aㅧ100
A : 저해제가 첨가되지 않은 것의 형광광도 값
B : 저해제가 첨가된 것의 형광광도 값
또한 뉴라미니데이즈 활성을 50% 저해하는 추출물 및 화합물의 농도(IC50)를 확인하여 하기 표 3 및 도 7에 나타내었다.
시료 화합물 명 IC50 (μM)
새싹보리 추출물 80% 주정에탄올 추출물 245μg/mL
폴리페놀계
화합물		 1 3′,4′,5,7-테드라하이드록시 플라본; 루테오린 11.5±0.6
2 에피게닌-6-C-글루코사이드; 이소비텍신 15.8±0.9
3 루테오린-6-C-글루코사이드; 호모오리엔틴 9.8±0.5
4 3-(4-하이드록시-3-메톡시페닐)-2-프로페노익산; 페루릭산 >200*
5 이소비텍신-7-O-글루코사이드; 사포나린 17.8±1.0
6 이소오리엔틴-7-O-글루코사이드; 루토나린 15.5±0.8
7 3-(3,4-디하이드록시신나모일) 퀴닉산; 클로로제닉산 61.0±3.3
* 50% 억제농도가 200 μM이상
상기 표 3에 나타난 바와 같이, 본 발명의 새싹보리 추출물 또는 이로부터 분리된 폴리페놀계 화합물이 바이러스 H1N1 뉴라미니데이즈의 활성을 억제할 수 있음을 확인할 수 있었다. 특히, 화합물 3의 루테오린-6-C-글루코사이드(호모오리엔틴)가 가장 우수한 뉴라미니데이즈 억제 활성을 나타내었다.
실시예 4 : 사포나린과 루토나린의 최적 추출 확인
상기 실시예 1에서의 새싹보리 분말 1g에 에탄올 수용액의 농도(0 ~ 100 중량%)를 달리하여 20㎖을 첨가하고, 30℃에서 12시간 동안 추출한 다음 원심분리기(10,000rpm, 4℃)로 상층액만 분리한 후, 0.45㎛ 필터(Advantec MFS, Inc. CA, USA)로 여과하였다. 상기 여과된 시료를 HPLC 시스템(Waters)에 20 ㎕ 주입하였으며, 컬럼은 XBridgeTM C18 (3.5 μm, 4.6 × 150mm, Waters)을 이용하였다. 이동상은 0.1% formic acid(A)와 acetonitrile(B)을 A-B (0 min 80:20, 50 min 0:100, 60 min 80: 20, v/v)의 비율로 순차적으로 분당 1.0 ㎖의 유속으로 전개하였으며, 검출은 340 nm에서 실시하였다. 사포나린과 루토나린을 정량하기 위하여 농도를 달리하여 위와 동일한 방법으로 HPLC 시스템에 주입하여 하기 표 4과 같은 같은 표준검량곡선을 구하였다.
화합물 표준검량곡선
사포나린 y=38,927x-1,946,146 R 2 =0.999
루토나린 y=37,254x-1,015,250 R 2 =0.998
에탄올 추출물의 에탄올 농도별 HPLC 스펙트럼은 도 5에 나타내었으며, 사포나린과 루토나린을 정량한 결과는 도 6에 나타내었다.
상기 도 8 및 9에서 보는 바와 같이, 사포나린은 50 중량% 에탄올 수용액으로의 추출시 최고로 추출됨을 보였고, 이 때 사포나린과 루토나린의 중량비는 75 : 15로 나타났다. 반면 루토나린은 80 ~ 90중량% 에탄올 수용액으로의 추출에서 최고로 추출됨을 보였고, 이 때 사포나린과 루토나린의 추출량에 따른 중량비는 60 : 40으로 나타났다.
따라서 이를 모두 고려할 때 약 70 ~ 90 중량% 에탄올 수용액에서 추출물의 항바이러스 활성이 가장 높게 나타날 것으로 예상된다

Claims (9)

  1. 새싹보리 추출물을 유효성분으로 포함하여, 뉴라미니데이즈 억제 활성을 가지는 것을 특징으로 하는 인플루엔자 바이러스의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  2. 제 1 항에 있어서, 하기 화학식 1 내지 7 로 표시되는 화합물 중에서 선택된 화합물을 포함하는 것을 특징으로 하는 인플루엔자 바이러스의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
    [화학식 1]
    Figure pat00017


    [화학식 2]
    Figure pat00018


    [화학식 3]
    Figure pat00019


    [화학식 4]
    Figure pat00020


    [화학식 5]
    Figure pat00021


    [화학식 6]
    Figure pat00022


    [화학식 7]
    Figure pat00023

  3. 제 1 항에 있어서, 상기 새싹보리 추출물은 탄소수 1 ~ 4의 알코올을 용매로 추출된 것을 특징으로 하는 인플루엔자 바이러스의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  4. 제 3 항에 있어서, 상기 용매는 70 ~ 90 중량% 농도의 에탄올 수용액인 것을 특징으로 하는 인플루엔자 바이러스의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  5. 제 1 항에 있어서, 상기 새싹보리는 상온에서 싹이 튼 지 5 ~ 15일이 지난 후, 길이가 10 ~ 20 cm 로 자란 것을 수확하여 동결 건조한 것을 특징으로 하는 인플루엔자 바이러스의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  6. 하기 화학식 1 내지 7 로 표시되는 화합물 중에서 선택된 1종 또는 2종 이상의 화합물을 포함하여 뉴라미니데이즈 억제 활성을 가지는 것을 특징으로 하는 인플루엔자 바이러스의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
    [화학식 1]
    Figure pat00024


    [화학식 2]
    Figure pat00025

    [화학식 3]
    Figure pat00026


    [화학식 4]
    Figure pat00027


    [화학식 5]
    Figure pat00028


    [화학식 6]
    Figure pat00029


    [화학식 7]
    Figure pat00030

  7. 제 6 항에 있어서, 상기 화합물은 새싹보리 추출물로부터 분리한 것을 특징으로 하는 인플루엔자 바이러스의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  8. 새싹보리를 동결건조하여 분말을 얻은 뒤 이를 탄소수 1 ~ 4의 알코올을 사용하여 추출물을 얻는 단계;
    상기 추출물에 물을 넣어 현탁시키고, 유기 용매를 가하여 각각의 분획물을 얻는 단계; 및
    상기 분획물을 실리카겔 컬럼에서 용출시켜 분획물을 얻는 단계
    를 포함하는 것을 특징으로 하는 하기 화학식 1 내지 7로 표시되는 화합물의 제조방법.
    [화학식 1]
    Figure pat00031


    [화학식 2]
    Figure pat00032


    [화학식 3]
    Figure pat00033


    [화학식 4]
    Figure pat00034


    [화학식 5]
    Figure pat00035


    [화학식 6]
    Figure pat00036


    [화학식 7]
    Figure pat00037

  9. 제 8 항에 있어서, 상기 유기 용매는 n-헥산, 에틸아세테이트, 클로로포름 및 부탄올 중에서 선택된 1종 또는 2종 이상의 용매인 것을 특징으로 하는 제조방법.
KR1020110020660A 2011-03-08 2011-03-08 새싹보리 추출물을 포함하는 뉴라미니데이즈 활성 억제용 조성물 및 인플루엔자 바이러스 감염 질환의 예방 및 치료용 약학적 조성물 KR101376231B1 (ko)

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